CN118141925A - p55γ基因和/或蛋白作为靶点在维持心脏铁稳态及治疗相关病症中的应用 - Google Patents
p55γ基因和/或蛋白作为靶点在维持心脏铁稳态及治疗相关病症中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN118141925A CN118141925A CN202410251028.6A CN202410251028A CN118141925A CN 118141925 A CN118141925 A CN 118141925A CN 202410251028 A CN202410251028 A CN 202410251028A CN 118141925 A CN118141925 A CN 118141925A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gamma
- iron
- protein
- irp2
- injury
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 241
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 title claims abstract description 122
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 43
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 31
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 title claims abstract description 27
- 201000010099 disease Diseases 0.000 title claims abstract description 19
- 101150034785 gamma gene Proteins 0.000 title claims abstract description 17
- 102000004902 Iron regulatory protein 2 Human genes 0.000 claims abstract description 77
- 108090001028 Iron regulatory protein 2 Proteins 0.000 claims abstract description 77
- 230000034994 death Effects 0.000 claims abstract description 69
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 claims abstract description 38
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 claims abstract description 35
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 claims abstract description 29
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 25
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 24
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 claims abstract description 12
- 210000004413 cardiac myocyte Anatomy 0.000 claims description 60
- 102100022012 Transcription intermediary factor 1-beta Human genes 0.000 claims description 32
- 101710177718 Transcription intermediary factor 1-beta Proteins 0.000 claims description 32
- 230000034512 ubiquitination Effects 0.000 claims description 30
- 238000010798 ubiquitination Methods 0.000 claims description 30
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 22
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 21
- 229960000989 perhexiline Drugs 0.000 claims description 19
- CYXKNKQEMFBLER-UHFFFAOYSA-N perhexiline Chemical compound C1CCCNC1CC(C1CCCCC1)C1CCCCC1 CYXKNKQEMFBLER-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 230000014725 late viral mRNA transcription Effects 0.000 claims description 16
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 claims description 12
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 claims description 12
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 claims description 7
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 claims description 7
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 5
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 abstract description 40
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 abstract description 39
- 208000014674 injury Diseases 0.000 abstract description 39
- 230000002107 myocardial effect Effects 0.000 abstract description 22
- 206010063837 Reperfusion injury Diseases 0.000 abstract description 11
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 abstract description 11
- 230000002222 downregulating effect Effects 0.000 abstract description 6
- 230000004217 heart function Effects 0.000 abstract description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 3
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 abstract description 2
- 230000030833 cell death Effects 0.000 abstract description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 abstract description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 abstract 1
- 102100036089 Fascin Human genes 0.000 description 89
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 43
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 33
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 32
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 25
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 24
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 16
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 13
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 12
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 description 11
- BKQFRNYHFIQEKN-UHFFFAOYSA-N erastin Chemical compound CCOC1=CC=CC=C1N1C(=O)C2=CC=CC=C2N=C1C(C)N1CCN(C(=O)COC=2C=CC(Cl)=CC=2)CC1 BKQFRNYHFIQEKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 8
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 8
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 7
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 7
- 238000003559 RNA-seq method Methods 0.000 description 7
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 7
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- BMKDZUISNHGIBY-ZETCQYMHSA-N (+)-dexrazoxane Chemical compound C([C@H](C)N1CC(=O)NC(=O)C1)N1CC(=O)NC(=O)C1 BMKDZUISNHGIBY-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 6
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 6
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 6
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 6
- 229960000605 dexrazoxane Drugs 0.000 description 6
- 102100026144 Transferrin receptor protein 1 Human genes 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 5
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 5
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 5
- UJHBVMHOBZBWMX-UHFFFAOYSA-N ferrostatin-1 Chemical compound NC1=CC(C(=O)OCC)=CC=C1NC1CCCCC1 UJHBVMHOBZBWMX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 5
- 206010061216 Infarction Diseases 0.000 description 4
- 102000006275 Ubiquitin-Protein Ligases Human genes 0.000 description 4
- 108010083111 Ubiquitin-Protein Ligases Proteins 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 238000003197 gene knockdown Methods 0.000 description 4
- 230000007574 infarction Effects 0.000 description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 4
- 230000010438 iron metabolism Effects 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 4
- TXJZRSRTYPUYRW-NQIIRXRSSA-N methyl (1s,3r)-2-(2-chloroacetyl)-1-(4-methoxycarbonylphenyl)-1,3,4,9-tetrahydropyrido[3,4-b]indole-3-carboxylate Chemical compound C1([C@H]2C3=C(C4=CC=CC=C4N3)C[C@@H](N2C(=O)CCl)C(=O)OC)=CC=C(C(=O)OC)C=C1 TXJZRSRTYPUYRW-NQIIRXRSSA-N 0.000 description 4
- 238000003032 molecular docking Methods 0.000 description 4
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 4
- 208000037891 myocardial injury Diseases 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 108010033576 Transferrin Receptors Proteins 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 238000000749 co-immunoprecipitation Methods 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 238000012001 immunoprecipitation mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 3
- -1 iron ions Chemical class 0.000 description 3
- 230000003859 lipid peroxidation Effects 0.000 description 3
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 3
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 208000031225 myocardial ischemia Diseases 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 101100173542 Caenorhabditis elegans fer-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 102000018434 Iron-Regulatory Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010066420 Iron-Regulatory Proteins Proteins 0.000 description 2
- 101150074235 Pik3r3 gene Proteins 0.000 description 2
- 229940045835 RSL3 Drugs 0.000 description 2
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 2
- 102000011408 Tripartite Motif Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010023649 Tripartite Motif Proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N actinomycin D Natural products CC1OC(=O)C(C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)C2CCCN2C(=O)C(C(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)NC4C(=O)NC(C(N5CCCC5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)C(C(C)C)C(=O)OC4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 2
- 238000003782 apoptosis assay Methods 0.000 description 2
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N beta-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 2
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 101150017459 fer1 gene Proteins 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 210000005003 heart tissue Anatomy 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 238000001294 liquid chromatography-tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 2
- 238000005502 peroxidation Methods 0.000 description 2
- 235000020777 polyunsaturated fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 230000005522 programmed cell death Effects 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- ZNHVWPKMFKADKW-UHFFFAOYSA-N 12-HETE Chemical compound CCCCCC=CCC(O)C=CC=CCC=CCCCC(O)=O ZNHVWPKMFKADKW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZNHVWPKMFKADKW-ZYBDYUKJSA-N 12-HETE Natural products CCCCC\C=C/C[C@@H](O)\C=C\C=C/C\C=C/CCCC(O)=O ZNHVWPKMFKADKW-ZYBDYUKJSA-N 0.000 description 1
- JSFATNQSLKRBCI-VAEKSGALSA-N 15-HETE Natural products CCCCC[C@H](O)\C=C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(O)=O JSFATNQSLKRBCI-VAEKSGALSA-N 0.000 description 1
- JSFATNQSLKRBCI-UHFFFAOYSA-N 15-Hydroxyeicosatetraenoic acid Chemical compound CCCCCC(O)C=CC=CCC=CCC=CCCCC(O)=O JSFATNQSLKRBCI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XFUXZHQUWPFWPR-TWVHMNNTSA-N 19-HETE Chemical compound CC(O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(O)=O XFUXZHQUWPFWPR-TWVHMNNTSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- KATOYYZUTNAWSA-DLJQHUEDSA-N 9-hydroxy-5E,7Z,11Z,14Z-eicosatetraenoic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/CC(O)\C=C/C=C/CCCC(O)=O KATOYYZUTNAWSA-DLJQHUEDSA-N 0.000 description 1
- 241000649044 Adeno-associated virus 9 Species 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010092160 Dactinomycin Proteins 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 208000032781 Diabetic cardiomyopathy Diseases 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 102000008857 Ferritin Human genes 0.000 description 1
- 108050000784 Ferritin Proteins 0.000 description 1
- 238000008416 Ferritin Methods 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 101000835093 Homo sapiens Transferrin receptor protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 108091006975 Iron transporters Proteins 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 206010028851 Necrosis Diseases 0.000 description 1
- 208000034827 Neointima Diseases 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108700005081 Overlapping Genes Proteins 0.000 description 1
- 108091007960 PI3Ks Proteins 0.000 description 1
- 101150000187 PTGS2 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000003993 Phosphatidylinositol 3-kinases Human genes 0.000 description 1
- 108090000430 Phosphatidylinositol 3-kinases Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010058156 Reperfusion arrhythmia Diseases 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108050003222 Transferrin receptor protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N actinomycin D Chemical compound C[C@H]1OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)N[C@@H]4C(=O)N[C@@H](C(N5CCC[C@H]5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)[C@@H](C(C)C)C(=O)O[C@@H]4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000006793 arrhythmia Effects 0.000 description 1
- 230000004900 autophagic degradation Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000007622 bioinformatic analysis Methods 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 229960000640 dactinomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 201000006549 dyspepsia Diseases 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000010201 enrichment analysis Methods 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 208000024798 heartburn Diseases 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 239000012133 immunoprecipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 230000037356 lipid metabolism Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000008692 neointimal formation Effects 0.000 description 1
- 230000001991 pathophysiological effect Effects 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 238000000575 proteomic method Methods 0.000 description 1
- 208000024981 pyrosis Diseases 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000008844 regulatory mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000010410 reperfusion Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000250 revascularization Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 229940126586 small molecule drug Drugs 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000012453 solvate Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 1
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 230000005748 tumor development Effects 0.000 description 1
- 230000006663 ubiquitin-proteasome pathway Effects 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- 210000004509 vascular smooth muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002861 ventricular Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
本发明提供了p55γ基因和/或蛋白作为靶点在维持心脏铁稳态及治疗相关病症中的应用,属于生物医药技术领域。本发明利用p55γ转基因以及体内体外的缺血/再灌注损伤模型,提出p55γ基因过表达可以改善I/R损伤诱导的心脏铁死亡,保护心功能。并且发现p55γ过表达通过下调IRP2进而导致Tfr1下调,从而维持心脏的铁稳态,对抗心肌I/R损伤。由此表明p55γ作为I/R损伤诱导的心肌细胞死亡的关键调节因子的潜力,为维持心脏铁稳态及相关病症新治疗途径的开发提供新的靶点。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域,具体涉及p55γ基因和/或蛋白作为靶点在维持心脏铁稳态及治疗相关病症中的应用。
背景技术
铁稳态的正常维持对于心功能具有重要意义。铁死亡是一种铁依赖的磷脂过氧化引起的程序性细胞死亡形式。研究表明铁代谢、谷胱甘肽代谢和脂质代谢在铁死亡中具有关键作用。铁代谢包括铁的吸收、排出、储存和利用。铁调节蛋白家族(IRPs)通过与铁反应元件(IREs)结合,诱导转铁蛋白受体(TfR)表达上调,铁蛋白和铁转运蛋白(FPN)表达下调,从而保证细胞铁稳态的维持。多种心血管疾病伴随着铁稳态的失衡,包括动脉粥样硬化、心肌缺血再灌注损伤、心律失常和糖尿病心肌病等。虽然心肌损伤时,心脏中会有过量的铁离子累积,铁稳态破坏和铁稳态相关蛋白异常表达,但其中涉及的铁代谢和调节机制仍不清楚。因此,深入了解心脏中铁代谢和铁死亡的调控机制对于疾病的治疗意义重大。
缺血性心脏病是心血管疾病死亡的首要原因。早期和及时的血运重建术是缺血性心脏病的常用治疗方法,但可能会引起额外的心肌损伤-缺血/再灌注(I/R)损伤,从而导致相当一部分患者死亡。I/R损伤的分子机制包括冠状动脉微血管损伤和心肌细胞死亡。尽管对I/R损伤的分子机制开展了广泛的研究,但目前没有被批准的药理干预措施来治疗I/R损伤。程序性细胞死亡,包括坏死、凋亡、自噬、坏死性凋亡、焦亡和铁死亡,已被认为是心肌I/R损伤发生和进展的重要机制。然而,调控I/R损伤期间各种细胞死亡的分子机制尚不完全清楚。
p55γ作为磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)的调控亚基,由Pik3r3基因编码。既往研究表明,p55γ通过调控细胞增殖、细胞周期、细胞存活等方式影响肿瘤的发生发展。与其在肿瘤中的功能相反,p55γ抑制血管平滑肌细胞增殖,从而抑制球囊损伤诱导的动脉新内膜形成。这些发现提示p55γ的病理生理功能是细胞类型特异性的,但其对I/R诱导的心肌铁死亡以及维持心脏铁稳态和相关病症的作用并未见相关报道。
发明内容
本发明提供了p55γ基因和/或蛋白作为靶点在维持心脏铁稳态及治疗相关病症中的应用,p55γ基因过表达可有效维持心脏的铁稳态,对抗心肌I/R损伤,靶向p55γ有望成为治疗铁稳态失衡相关心血管疾病的新策略。
本发明提供了以下技术方案:
本发明提供了p55γ基因和/或蛋白作为靶点在制备维持心脏铁稳态及治疗相关病症药物中的应用。
优选的,促进p55γ蛋白活性或促进p55γ基因表达可维持心脏铁稳态及治疗相关病症。
优选的,通过转染过表达p55γ腺病毒可维持心脏铁稳态及治疗相关病症。
优选的,p55γ过表达通过IRP2转录后系统导致Tfr1下调,进而达到维持心脏铁稳态及治疗相关病症的作用。
优选的,通过与TRIM28结合,p55γ增加了IRP2的泛素化和随后的降解,从而有助于下调Tfr1的表达,最终抑制了铁死亡,达到了维持心脏铁稳态及治疗相关病症的效果。
本发明还提供了p55γ蛋白在制备维持心脏铁稳态及治疗相关病症药物中的应用,所述p55γ蛋白可抑制心肌细胞铁死亡。
本发明还提供了p55γ基因和/或蛋白作为靶点在筛选用于维持心脏铁稳态及治疗相关病症药物中的应用,当所述药物促进p55γ基因表达和/或促进p55γ蛋白活性,所述药物能维持心脏铁稳态及相关病症。
优选的,所述药物包括哌克昔林。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
(1)本发明首次提出p55γ基因过表达可以改善I/R损伤诱导的心脏铁死亡,保护心功能;还提出了p55γ过表达通过下调IRP2进而导致Tfr1下调,从而维持心脏的铁稳态,对抗心肌I/R损伤。本发明将p55γ通过与TRIM28结合,增加了IRP2的泛素化和随后的降解,从而下调Tfr1的表达,最终抑制铁死亡。这些提出表明p55γ对于维持心脏铁稳态的重要性,以及是I/R损伤期间心肌细胞铁死亡的一种新的抑制因子,靶向p55γ有望成为治疗铁稳态失衡相关心血管疾病的新策略。
(2)本发明还提出p55γ是心肌细胞铁死亡的一种新的抑制因子,实施p55γ蛋白可抑制心肌细胞铁死亡,进而达到维持心脏铁稳态及治疗相关病症的效果。
附图说明
图1p55γ在铁死亡诱导剂诱导的心肌铁死亡中表达下调且抑制erastin诱导的心肌铁死亡。(A)RNA-seq的KEGG分析。(B)环形图表明三条通路的重叠的差异基因。(C)图中重叠的差异基因与铁死亡的相关性分析。(D)erastin处理NRVMs后,心肌细胞中p55γ的mRNA水平(n=11)。(E)erastin处理NRVMs后,心肌细胞中p55γ的代表性western blot和平均数据(n=10)。(F)RSL3处理NRVMs后,心肌细胞中p55γ的mRNA水平(n=10)。(G)RSL3处理NRVMs后,心肌细胞中p55γ的代表性westernblot和平均数据(n=8)。(H)感染Ad-p55γ48小时的心肌细胞中p55γ的代表性westernblots。(I)erastin损伤后感染Ad-p55γ的心肌细胞的细胞活力(n=12),ptgs2 mRNA水平(n=12)和胞内MDA的含量(n=13)。数据以3-4次独立实验的平均值±标准差表示。
图2p55γ抑制缺血/再灌注损伤诱导的心脏铁死亡。(A)RNA-seq的KEGG分析。(B)热图代表铁死亡通路相关基因的表达。(C)I/R损伤后WT小鼠、Fer1和DXZ治疗的小鼠以及p55γh-TG小鼠心脏梗死面积(IF)和危险面积(AAR)(n=10)。(D)I/R损伤后WT小鼠、Fer1和DXZ治疗的小鼠以及p55γh-TG小鼠心脏的MDA的含量(n=10)。(E)I/R损伤后WT小鼠和p55γh-TG小鼠心脏的氧化脂质的含量(n=5)。数据以3-4次独立实验的平均值±标准差表示。
图3p55γ通过下调Tfr1的表达抑制缺血/再灌注损伤诱导的心脏铁死亡。(A)RNA-seq的火山图。(B)WT和p55γh-TG小鼠心脏中Tfr1的mRNA水平(n=10)。(C)WT和p55γh-TG小鼠心脏中Tfr1的代表性westernblots和平均数据(n=5)。(D)Ad-p55γ感染心肌细胞48小时后,心肌细胞中Tfr1的mRNA水平(n=8)。(E)Ad-p55γ感染心肌细胞48小时后,心肌细胞中Tfr1的代表性westernblots和平均数据(n=10)。(F)p55γsiRNA感染心肌细胞72小时后,心肌细胞中Tfr1的mRNA水平(n=8)。(G)p55γsiRNA感染心肌细胞72小时后,心肌细胞中Tfr1的代表性westernblots和平均数据(n=10)。(H)AAV9-Tfr1感染心脏4周之后,心脏中Tfr1的代表性westernblots和平均数据(n=8)。(I)I/R损伤后WT小鼠和p55γh-TG小鼠感染或未感染AAV9-Tfr1的心脏梗死面积(IF)和危险面积(AAR)(n=10)。(J)I/R损伤后WT小鼠和p55γh-TG小鼠感染或未感染AAV9-Tfr1的心脏的ptgs2 mRNA水平、MDA的含量和铁离子的含量(ptgs2 mRNA检测n=9,MDA含量检测n=9,铁离子的含量检测n=6)。数据以3-4次独立实验的平均值±标准差表示。
图4p55γ过表达通过IRP2转录后系统下调Tfr1。(A)Tfr1的mRNA稳定性。(B)Ad-p55γ感染心肌细胞48小时后,心肌细胞中IRP2的mRNA水平(n=12)。(C)Ad-p55γ感染心肌细胞48小时后,心肌细胞中IRP2的代表性westernblots和平均数据(n=8)。(D)p55γsiRNA感染心肌细胞72小时后,心肌细胞中IRP2的mRNA水平(n=10)。(E)p55γsiRNA感染心肌细胞72小时后,心肌细胞中IRP2的代表性westernblots和平均数据(n=8)。(F)Ad-p55γ感染的心肌细胞,用MG132处理后的IRP2的代表性westernblots和平均数据(n=8)。(G)HEK293T细胞质粒转染后的IRP2的泛素化代表性westernblots(n=3)。(H)Ad-IRP2感染心肌细胞后的IRP2的代表性western blots。(I)Ad-p55γ和/或Ad-IRP2感染心肌细胞48小时后,心肌细胞中Tfr1的代表性westernblots和平均数据(n=8)。(J)H/R损伤后感染Ad-p55γ和/或Ad-IRP2的心肌细胞的ptgs2 mRNA水平和细胞活力(n=12)。数据以3-4次独立实验的平均值±标准差表示。
图5p55γ通过促进TRIM28介导的IRP2泛素化降解抑制心肌铁死亡。(A)将HA标记的IRP2转染心肌细胞,用HA抗体去纯化含有IRP2的复合体,对其进行质谱分析的结果与UbiBrowser 2.0鉴定为泛素连接酶E3的蛋白进行交集。表格为交集到的蛋白的质谱信息。(B)IRP2与TRIM28在心肌细胞内的免疫共沉淀(n=3)。(C)p55γ与TRIM28在心肌细胞内的免疫共沉淀(n=3)。(D)纯化的TRIM28蛋白与纯化的IRP2蛋白以及p55γ蛋白的免疫沉淀(n=3)。(E)HEK293T细胞的IRP2的泛素化代表性westernblots(n=3)。(F)TRIM28的siRNA处理转染Ad-p55γ的IRP2和Tfr1的代表性western blots和平均数据(IRP2检测n=8;Tfr1检测n=6)。数据以3-4次独立实验的平均值±标准差表示。
图6TRIM28促进IRP2在K877位点的K48链的多聚泛素化。(A)HEK293T细胞的IRP2的泛素化代表性westernblots(n=3)。(B)HEK293T细胞的IRP2的泛素化代表性westernblots(n=3)。(C)HEK293T细胞的IRP2的泛素化代表性westernblots(n=3)。
图7p55γ激活剂-Perhexiline抑制缺血/再灌注损伤诱导的心脏铁死亡。(A)p55γ与Perhexiline的分子对接模式图。(B)Perhexiline处理心肌细胞24小时后的Tfr1和IRP2的代表性westernblot图和平均数据(IRP2,n=6;Tfr1,n=7)。(C)IRP2腺病毒转染NRVMs,有或/没有Perhexiline的处理,构建H/R损伤模型后心肌细胞的细胞活性(n=12)和心肌细胞的ptgs2 mRNA水平(n=5)。(D)腹腔注射Perhexiline的小鼠构建I/R损伤模型后的TTC染色的代表性图片和平均数据(n=10)。(E)腹腔注射Perhexiline的小鼠构建I/R损伤模型后的心脏MDA含量(n=5)。数据以3-4次独立实验的平均值±标准差表示。
具体实施方式
本发明提供了p55γ基因和/或蛋白作为靶点在制备维持心脏铁稳态及治疗相关病症药物中的应用。本发明利用p55γ转基因以及体内体外的缺血/再灌注损伤模型,提出p55γ基因过表达可以改善I/R损伤诱导的心脏铁死亡,保护心功能。本发明还提出p55γ过表达通过下调IRP2进而导致Tfr1下调,从而维持心脏的铁稳态,对抗心肌I/R损伤。本发明还提出TRIM28是IRP2的一个新的E3连接酶,p55γ通过与TRIM28结合,增加了IRP2的泛素化和随后的降解,从而下调Tfr1的表达,最终抑制铁死亡,达到维持心脏铁稳态和治疗相关疾病的目的。
在本发明中,通过转染过表达p55γ腺病毒可维持心脏铁稳态及治疗相关病症。本发明所述过表达p55γ腺病毒基于NCBI的NM_003629.4序列至pcDNA3.1(+)载体的EcoRI/XhoI位点制备而成。
本发明还提供p55γ蛋白在制备维持心脏铁稳态及治疗相关病症药物中的应用,所述p55γ蛋白可抑制心肌细胞铁死亡。本发明所述p55γ蛋白可通过常规商业渠道购买或常规制备方法获得。本发明所述p55γ蛋白抑制了心肌细胞铁死亡,进而维持了心脏铁稳态以及治疗了相关病症。本发明所述病症包括铁稳态失衡相关心血管疾病。
本发明还提供了p55γ基因和/或蛋白作为靶点在制备用于维持心脏铁稳态及治疗相关病症药物中的应用,当所述药物促进p55γ基因表达和/或促进p55γ蛋白活性,所述药物能维持心脏铁稳态及相关病症。本发明所述药物包括哌克昔林。
本发明还提供一种用于制备维持心脏铁稳态及治疗相关病症的药物的策略,所述药物含有以下一种:(1)针对p55γ蛋白的抗体;(2)针对p55γ蛋白的激动剂或其药学上可接受的盐、溶剂合物或水合物的药物制剂;(3)促进p55γ蛋白表达或转录的DNA或RNA。本发明所述药物进一步优选为哌克昔林。本发明所述药物还含有上述化合物药学上可接受的载体。本发明所述药物的剂型包括射剂、粉针剂、丸剂、散剂、片剂、贴剂、栓剂、乳剂、霜剂、凝胶剂、颗粒剂、胶囊剂、气雾剂、喷雾剂、粉雾剂、缓释剂和控释剂。
在本发明中,若无特殊说明,所有的组分或试剂均为本领域技术人员熟知的市售商品。
下面将结合本发明中的实施例,对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例1
1、RNA-seq分析心肌细胞铁死亡时基因表达情况
培养新生大鼠心室心肌细胞(NRVMs),并用铁死亡诱导剂(erastin)处理NRVMs诱导心肌细胞发生铁死亡,进行转录组测序技术(RNA-seq)分析。经KEGG通路富集分析揭示了10条与心血管疾病密切相关的通路被显著富集(图1A)。通过对排名前三的三条通路中的差异表达基因取交集,发现有12个重叠的基因(图1B)。将这些基因与铁死亡进行了相关分析,结果显示Pik3r3与铁死亡的相关性最强(图1C)。这些生物信息学分析结果表明p55γ可能在心肌细胞铁死亡中起重要作用。
2、心肌细胞铁死亡时p55γ的mRNA和蛋白水平
将培养的心肌细胞分为:erastin组和vehicle组,erastin组中用erastin处理NRVMs心肌细胞,vehicle组中对心肌细胞未进行任何处理。采用常规qPCR和western blot方法检测两组心肌细胞中p55γ的mRNA水平和蛋白水平。结果发现,在erastin处理的NRVMs中,p55γ的mRNA和蛋白水平显著降低(图1D和1E),与转录组测序分析结果一致。
将培养的心肌细胞分为:RSL3组和vehicle组,RSL3组为另一种经典的铁死亡诱导剂(RSL3)处理NRVMs,vehicle组中对心肌细胞未进行任何处理。采用常规qPCR和westernblot方法检测两组心肌细胞中p55γ的mRNA水平和蛋白水平。结果发现,另一种经典的铁死亡诱导剂-RSL3处理的NRVMs中,p55γ的mRNA和蛋白水平同样下调(图1F和1G)。这些数据表明心肌细胞铁死亡的发生与p55γ的表达下调密切相关。
3、过表达p55γ对心肌细胞铁死亡的影响
将p55γ腺病毒(Ad-p55γ-flag)置于冰上化冻,取出新生大鼠心肌细胞,使用抽吸泵吸去原有的培养基,加入无血清的DMEM培养基,将病毒稀释后加入培养皿或孔板中,混匀,放入CO2孵箱培养48h。得到Ad-p55γ-flag转染的新生大鼠心肌细胞。采用常规westernblot方法检测感染Ad-p55γ48小时心肌细胞中p55γ的蛋白水平。westernblot分析显示p55γ蛋白水平显著升高(图1H)。在心肌细胞过表达p55γ和β-gal后,进行erastin损伤处理,分别设置对照组、β-gal实验组以及p55γ过表达组。使用细胞ATP含量方法检测erastin损伤后感染Ad-p55γ的心肌细胞活力,qPCR方法检测ptgs2的mRNA水,胞内MDA含量方法检测细胞的脂质过氧化。结果发现,与对照载体相比,p55γ过表达可抑制erastin诱导的细胞活力下降、ptgs2的mRNA水平升高和MDA的含量升高(图1I)。
这些数据表明p55γ过表达可以保护心肌细胞免受erastin诱导的心肌细胞铁死亡。
实施例2p55γ在I/R损伤引起的心脏铁死亡中的作用
按照本领域常规方法建立p55γ转基因(p55γh-TG)小鼠。选用8~12周龄的雄性野生型C57小鼠(WT)、p55γh-TG小鼠分别设置假手术对照组和实验组,进行缺血/再灌注损伤模型构建。按照本领域常规方法进行TTC染色,MDA检测以及氧化脂质检测。首先,对有无I/R损伤的心脏特异性p55γ转基因(p55γh-TG)小鼠和WT小鼠的心脏进行了RNA-seq分析。与WT-Sham对照组相比,WT-I/R的小鼠心脏中铁死亡相关通路被显著上调或下调。而p55γh-TG可以逆转这些通路的富集方向(图2A)。此外,经KEGG网站鉴定的铁死亡通路的相关基因在WT-I/R的小鼠心脏中大部分被上调,而p55γh-TG可以逆转这些基因的变化趋势(图2B)。
为了确定p55γ是否抑制I/R损伤诱导得心脏铁死亡,将实验及进行如下分组:使用生理盐水小鼠组,Ferrostatin-1(Fer-1)和Dexrazoxane(DXZ)治疗小鼠组,p55γh-TG小鼠组。经常规TTC染色法对小鼠心脏梗死面积检测,结果显示,p55γh-TG小鼠组减少了I/R诱导的心肌梗死面积,与已知的铁死亡抑制剂Fer-1和DXZ治疗相当(图2C)。此外,胞内MDA含量方法检测各组小鼠心脏的脂质过氧化,结果显示,与Fer-1和DXZ治疗一样,和WT小鼠相比,p55γh-TG小鼠MDA含量(脂质过氧化最常见的副产物)显著降低(图2D)。
考虑到多不饱和脂肪酸(PUFAs)的过氧化是铁死亡的重要步骤,为了进一步明确p55γ在铁死亡中的作用,采用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法测定了p55γh-TG-I/R组和WT-I/R组小鼠心脏氧化脂质类物质。结果显示,p55γh-TG组表现出9-HETE、12-HETE、15-HETE和19-HETE水平降低(图2E)。
综上所述,这些数据表明p55γ过表达可保护心脏免受I/R诱导的铁死亡。
实施例3p55γ对抗铁死亡作用的潜在机制研究
1、对WT和p55γh-TG小鼠心脏组织进行RNA-seq分析。结果显示,转铁蛋白受体(TFRC,也称为转铁蛋白受体蛋白1,Tfr1),一种特定的铁死亡标记,被发现是最显著的下调基因(图3A)。
2、采用qPCR和westernblots检测WT和p55γh-TG小鼠心脏组织,结果显示p55γh-TG小鼠心脏中Tfr1 mRNA和蛋白水平降低(图3B和3C)。
3、采用qPCR和westernblots检测Ad-p55γ感染48小时和72小时的心肌细胞中Tfr1的mRNA和蛋白水平。结果显示,p55γ过表达会下调Tfr1,而p55γ敲低会在mRNA和蛋白水平上调Tfr1(图3D-3G)。这些结果表明,Tfr1可能在p55γ对抗铁死亡中起关键作用。
4、构建腺相关病毒9(AAV9)过表达系统,在小鼠中实现心脏特异性过表达Tfr1,对AAV9-Tfr1感染4周后的心脏采用westernblots检测,结果表明对小鼠的上述处理实现了Tfr1的心脏特异性过表达(图3H)。
5、对WT小鼠和p55γh-TG小鼠感染或未感染AAV9-Tfr1的进行I/R损伤处理,统计上述小鼠的心脏梗死面积和危险面积。结果显示,与注射对照病毒的p55γh-TG小鼠相比,注射AAV9-Tfr1的p55γh-TG小鼠的I/R损伤没有减少(图3I)。为了确定Tfr1是否介导p55γ对抗铁死亡的作用,评估了铁死亡的几个参数,包括WT小鼠和p55γh-TG小鼠感染或未感染AAV9-Tfr1进行I/R损伤后的心脏的ptgs2 mRNA水平、MDA生成和铁含量(图3J),结果发现Tfr1的心脏过表达阻断了p55γ对抗铁死亡的作用。
上述这些发现表明p55γ对抗铁死亡的作用可能归因于Tfr1的下调。
实施例4p55γ通过影响Tfr1 mRNA稳定性来影响其表达
为了进一步探究p55γ下调Tfr1的具体分子机制,先用p55γ腺病毒(Ad-p55γ-flag)和对照病毒(Ad-β-gal)转染心肌细胞,然后添加放线菌素D抑制各组细胞的转录,再比较两组的Tfr1的mRNA的稳定性。结果发现:p55γ的过表达导致Tfr1 mRNA稳定性下降(图4A)。
为了阐明p55γ是否通过IRPs-IRE系统调控Tfr1的mRNA稳定性,评估了NRVMs中IRP2的表达。用Ad-p55γ感染心肌细胞,采用qPCR和western blots检测Ad-p55γ感染48小时的心肌细胞,结果显示,p55γ过表达导致IRP2蛋白水平降低,而其mRNA水平保持不变(图4B和4C)。此外,针对p55γ的编码区设计两条小干扰RNA来特异性敲低p55γ的表达水平,称为p55γ-si1和p55γ-si2,序列为:p55γ-si1(5’-3’)正义连GAAACAGUCCUUCAUUCCGTT(SEQID NO:1);反义链CGGAAUGAAGGACUGUUUCGU(SEQ ID NO:2);p55γ-si2(5’-3’)正义连GAGACAUUUCCAGGGAAGAGGUAAA(SEQ ID NO:3);反义链UUUACCUCUUCCCUGGAAAUGUCUC(SEQ IDNO:4)。非特异性序列的双链RNA-negative control(称为Scrambled)作为对照,利用RNAimax转染新生大鼠心肌细胞,分别设置对照组和p55γ敲低组。采用qPCR和westernblot检测p55γsiRNA感染72小时的心肌细胞,结果显示,p55γ的敲低导致IRP2蛋白水平升高,但不改变其mRNA水平(图4D和4E)。这些结果表明,p55γ过表达导致IRP2在翻译后水平下调。
对Ad-p55γ感染的心肌细胞用MG132处理。采用westernblot检测IRP2蛋白水平,结果显示MG132有效地消除了p55γ介导的IRP2蛋白的下降(图4F)。为了进一步研究p55γ是否促进IRP2的泛素化降解,在NCBI中找到p55γ、IRP2以及UB的目的基因序列,使用pcDNA3.1(+)载体,用序列分析软件找出目的序列中存在的限制性内切酶酶切位点,构建了p55γ、IRP2以及UB的质粒,将质粒转染进HEK293T细胞中,24小时后收集细胞及进行IRP2的泛素化检测。采用western blot检测IRP2的泛素化水平,结果显示p55γ过表达增加了HEK293T细胞中IRP2的泛素化(图4G),提示p55γ过表达通过泛素-蛋白酶体途径下调了IRP2。
对Ad-p55γ和/或Ad-IRP2感染的心肌细胞,采用westernblots检测IRP2或Tfr1蛋白水平;同时对H/R损伤后感染Ad-p55γ和/或Ad-IRP2的心肌细胞检测ptgs2 mRNA水平和细胞活力。结果显示,IRP2过表达抵消了p55γ过表达诱导的Tfr1下调和H/R诱导的心肌细胞铁死亡的抑制(图4H至4K)。
总的来说,这些数据表明p55γ通过促进泛素化介导的IRP2降解来对抗铁死亡。
实施例5TRIM28与p55γ过表达诱导IRP2降解和对抗铁死亡的相互作用
为了进一步探索p55γ下调IRP2的机制,将HA标记的IRP2转染心肌细胞,用HA抗体去纯化含有IRP2的复合体,对其进行了免疫沉淀-质谱(IP-MS)分析,将IP-MS获得的潜在结合蛋白与UbiBrowser 2.0鉴定为泛素连接酶E3的蛋白进行交集。分析显示TRIM28是IRP2潜在的E3ligase(图5A)。
为了研究TRIM28对于IRP2泛素化降解的作用以及TRIM28如何调节IRP2,使用HA标记的IRP2进行了免疫共沉淀实验,实验结果表明,IRP2和TRIM28存在相互作用,形成复合体(图5B)。此外,通过免疫共沉淀实验还观察到了内源性p55γ与TRIM28的相互作用(图5C)。使用纯化的重组蛋白进一步证实了TRIM28与IRP2以及p55γ的直接相互作用(图5D)。接下来,我们的研究试图确定TRIM28参与IRP2的降解是否依赖于p55γ。正如预期的那样,p55γ过表达诱导IRP2泛素化增强,而敲除TRIM28可以抑制p55γ过表达诱导的IRP2泛素化的增强(图5E),并阻断了p55γ过表达诱导的IRP2和Tfr1蛋白水平的降低(图5F)。
这些结果表明TRIM28是p55γ过表达诱导IRP2降解和对抗铁死亡所必需的分子。
实施例6
为了进一步揭示TRIM28对IRP2的泛素修饰作用,在HEK293细胞中共转染了myc标记的TRIM28、HA标记的IRP2和Flag标记的泛素质粒。我们发现,在WT泛素链和K48泛素链存在的情况下,TRIM28显著提高了IRP2的泛素化水平,而对IRP2的K63链泛素化没有影响(图6A),这表明TRIM28特异性促进了IRP2的K48链泛素化,而不是K63链。
定量泛素化修饰的蛋白质组学分析显示IRP2的三个赖氨酸残基K108、K769和K877存在泛素化。为了确定IRP2的哪个赖氨酸位点负责TRIM28的泛素化,通过位点定向诱变产生IRP2的突变质粒(K108R,K769R和K877R),将特定位点的赖氨酸残基替换为精氨酸残基。在HEK293细胞中,将IRP2突变体与MYC标记的TRIM28和Flag标记的泛素共转染后,观察到TRIM28在K877R突变体中失去了泛素化功能,这表明K877是TRIM28修饰IRP2泛素化的特异性位点(图6B)。这些发现表明TRIM28促进了IRP2的K877位点的K48多泛素化。
为了进一步确定TRIM28负责IRP2泛素化的特定氨基酸位点,构建了一个全长TRIM28(FL-TRIM28)质粒,以及两个突变质粒:一个缺失RING结构域(ΔRing),另一个将67位的半胱氨酸突变成精氨酸(C67A)。结果显示ΔRing和C67A突变体均未能诱导IRP2泛素化(图6C)。这些数据共同表明,TRIM28通过以RING结构域依赖的方式促进IRP2的泛素降解,从而对I/R诱导的心肌铁死亡发挥抑制作用。
实施例7
鉴于p55γ在对抗铁死亡中的重要作用,因此寻找p55γ的潜在激活剂用于治疗I/R损伤显得尤为重要。因此,利用已有的小分子药物库预测了p55γ的潜在激活剂。随后,根据p55γ的晶体结构进行了分子对接分析。根据对接分析的结果,发现派克昔林(perhexiline)与p55γ显示出显著的结合亲和力,对接结果显示perhexiline与p55γ中的Trp67和Asp69氨基酸残基建立了分子间氢键(图7A)。为了确定派克昔林在心肌细胞铁死亡中的潜在作用,首先在心肌细胞中进行了实验。Westernblot实验结果显示:perhexiline处理心肌细胞24小时后,Tfr1和IRP2的蛋白水平被显著下调(图7B)。进一步在H/R损伤模型的情况下,检测perhexiline的作用,结果表明:perhexiline的处理明显阻断H/R损伤诱导的细胞活性的下降以及ptgs2 mRNA水平的增加,而IRP2的过表达可以阻断perhexiline抑制H/R损伤诱导的细胞活性的下降以及ptgs2 mRNA水平的增加的作用(图7C)。
按照本领域常规方法建立p55γ敲除(p55γ-/-)小鼠。选用8~12周龄的雄性野生型C57小鼠(WT)、p55γ-/-小鼠分别设置假手术对照组和实验组,进行缺血/再灌注损伤模型构建前24小时和前2小时,给予小鼠腹腔注射perhexiline。按照本领域常规方法进行TTC染色和MDA检测。TTC染色和MDA检测的结果表明:perhexiline预处理能显著缩小小鼠心肌梗死面积,降低小鼠心脏MDA水平(图7D和E),而这种心肌保护作用在p55γ-/-小鼠中消失了(图7D和E)。
综合上述实验,本发明阐明了p55γ是心肌细胞铁死亡的一种新的抑制因子。本发明提出p55γ过表达通过IRP2转录后系统导致Tfr1下调。本发明还提出TRIM28是IRP2的一个新的E3连接酶,通过与TRIM28结合,p55γ增加了IRP2的泛素化和随后的降解,从而有助于下调Tfr1的表达,最终抑制铁死亡。
多种心血管疾病伴随着铁稳态的失衡,心肌损伤时,心脏中会有过量的铁离子累积,铁稳态破坏和铁稳态相关蛋白异常表达,而缺血/再灌注损伤亦是一种最常见的心肌损伤方式之一。本发明提出p55γ是心脏铁稳态的重要调控因子,可以对抗缺血/再灌注损伤诱导的心脏铁死亡。因此,本发明强调了p55γ作为I/R损伤诱导的心肌细胞死亡的关键调节因子的潜力,并表明靶向p55γ在维持心脏铁稳态及相关病症中的潜在应用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.p55γ基因和/或蛋白作为靶点在制备维持心脏铁稳态及治疗相关病症药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用,其特征在于,促进p55γ蛋白活性或促进p55γ基因表达可维持心脏铁稳态及治疗相关病症。
3.如权利要求1所述的应用,其特征在于,通过转染过表达p55γ腺病毒可维持心脏铁稳态及治疗相关病症。
4.如权利要求1所述的应用,其特征在于,p55γ过表达通过IRP2转录后系统导致Tfr1下调,进而达到维持心脏铁稳态及治疗相关病症的作用。
5.如权利要求1所述的应用,其特征在于,通过与TRIM28结合,p55γ增加了IRP2的泛素化和随后的降解,从而有助于下调Tfr1的表达,最终抑制了铁死亡,达到了维持心脏铁稳态及治疗相关病症的效果。
6.p55γ蛋白在制备维持心脏铁稳态及治疗相关病症药物中的应用,其特征在于,所述p55γ蛋白可抑制心肌细胞铁死亡。
7.p55γ基因和/或蛋白作为靶点在筛选用于维持心脏铁稳态及治疗相关病症药物中的应用,其特征在于,当所述药物促进p55γ基因表达和/或促进p55γ蛋白活性,所述药物能维持心脏铁稳态及治疗相关病症。
8.如权利要求7所述的应用,其特征在于,所述药物包括哌克昔林。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202410251028.6A CN118141925A (zh) | 2024-03-05 | 2024-03-05 | p55γ基因和/或蛋白作为靶点在维持心脏铁稳态及治疗相关病症中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202410251028.6A CN118141925A (zh) | 2024-03-05 | 2024-03-05 | p55γ基因和/或蛋白作为靶点在维持心脏铁稳态及治疗相关病症中的应用 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN118141925A true CN118141925A (zh) | 2024-06-07 |
Family
ID=91299492
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202410251028.6A Pending CN118141925A (zh) | 2024-03-05 | 2024-03-05 | p55γ基因和/或蛋白作为靶点在维持心脏铁稳态及治疗相关病症中的应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN118141925A (zh) |
-
2024
- 2024-03-05 CN CN202410251028.6A patent/CN118141925A/zh active Pending
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Apostolatos et al. | Insulin promotes neuronal survival via the alternatively spliced protein kinase CδII isoform | |
US9683995B2 (en) | Method of treatment of SETDB1 expressing cancer | |
Zhu et al. | MyD88 and NOS2 are essential for toll-like receptor 4-mediated survival effect in cardiomyocytes | |
Pathak et al. | Dichotomous role of the human mitochondrial Na+/Ca2+/Li+ exchanger NCLX in colorectal cancer growth and metastasis | |
Zhong et al. | Energy stress modulation of AMPK/FoxO3 signaling inhibits mitochondria-associated ferroptosis | |
Mao et al. | mir-193 targets ALDH2 and contributes to toxic aldehyde accumulation and tyrosine hydroxylase dysfunction in cerebral ischemia/reperfusion injury | |
WO2020226919A1 (en) | Use of inhibitors of yap/taz for the treatment of cancer | |
Benichou et al. | The transcription factor ChREBP Orchestrates liver carcinogenesis by coordinating the PI3K/AKT signaling and cancer metabolism | |
Gong et al. | CircRREB1 mediates lipid metabolism related senescent phenotypes in chondrocytes through FASN post-translational modifications | |
Sheng et al. | P2RX7 promotes osteosarcoma progression and glucose metabolism by enhancing c-Myc stabilization | |
CN115054605B (zh) | G9a抑制剂在制备治疗葡萄膜黑色素瘤的药物中的应用 | |
EP3658157B1 (en) | Treatment of heart disease by inhibition of the action of muscle a-kinase anchoring protein (makap) | |
Lozano et al. | Targeting the mitochondrial Ca2+ uniporter complex in cardiovascular disease | |
CN118141925A (zh) | p55γ基因和/或蛋白作为靶点在维持心脏铁稳态及治疗相关病症中的应用 | |
US9393254B2 (en) | Compositions of A-8R peptide | |
Hu et al. | Crtc1 Deficiency causes obesity potentially via regulating PPARγ pathway in White Adipose | |
CN116019916A (zh) | 非小细胞肺癌靶点arid1a及其抑制剂在制备肺癌治疗药物中的用途 | |
US20150031742A1 (en) | Treatment of uterine leiomyomata | |
TW200831898A (en) | Treatment of insulin resistance | |
US20200225249A1 (en) | Compositions and methods for the diagnosis and treatment of diseases of the liver | |
Liu et al. | E3 ubiquitin ligase NEDD4L negatively regulates skin tumorigenesis by inhibiting IL-6/GP130 signaling pathway | |
US9200333B2 (en) | Methods for identifying modulators of murine double minute 2 | |
WO2024131547A1 (zh) | Pdk4作为细胞衰老干预靶点及其在化疗抗癌中的应用 | |
US20230025176A1 (en) | Pharmaceutical composition for treating non-alcoholic fatty liver, non-alcoholic steatohepatitis, or hepatic fibrosis using ssu72 protein or a polynucleotide encoding the same | |
Ghosalkar et al. | Prostate apoptosis response-4: A therapeutic target for malignant gliomas |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |