CN118139967A - 用于细胞培养物的稳健长期电测量和/或刺激的微流体系统 - Google Patents

Abstract

一种用于在空气‑液体界面上维持细胞培养物(例如神经元细胞培养物)存活并对其进行控制的微流体系统，其用于在中长期内防止全自动24/7操作中形成气泡和液体溢出。借助于微流体通道出口的几何布置和可选的入口相对于空气‑液体界面的多孔膜的放置，泵送装置适于推动液体通过微流体通道(130)的入口(131)，然后通过微流体通道在空气‑液体界面下方的区域，然后通过微流体通道的出口(132)。可以根据用计算机视觉系统和/或电生理信号处理系统检测到的细胞培养特征和事件，用不同的流速、流动方向和流动持续时间对泵送装置进行编程，以使泵送装置的参数自动适应空气‑液体界面上细胞培养物(100)的当前状态。

Description

用于细胞培养物的稳健长期电测量和/或刺激的微流体系统

技术领域

本公开总体上涉及细胞培养物装置领域，更具体地涉及用于细胞培养物、细胞活性控制和监测的流体流动组件布置。

背景技术

作为传统软件和硬件信息技术的替代方案，基于生物部件(如培养细胞而非晶体管)的湿件解决方案正在出现。一种新兴的替代方法是使用生物神经网络，而不是使用基于硅的数字计算用AI复制高级认知过程。生物技术的最新进展现在促进了胚胎干细胞(如大鼠胚胎干细胞)以及分化的人类诱导多能干细胞(Induced Pluripotent Stem cell，IPSc)的生物神经网络的培养和组装。然后可以刺激培养的生物神经元网络(BiologicalNeuronal Network，BNN)，并使用多电极阵列(Multi-Electrode Array，MEA)记录它们的活动。到目前为止，用MEA记录的BNN用于药理学研究、药物测试和毒理学研究等，以及用于更好地了解常见脑部疾病如阿尔茨海默病和帕金森病的研究。在过去几年中，还提出了其他工业应用。例如，DeMarse等人于2005年在IEEE International Joint Conference onNeural Networks提出了BNN在飞行器控制中的应用。美国海军的美国专利7947626公开了可用于检测和/或定量各种生物或化学毒素的传代祖细胞衍生的神经网络MEA。同样，Koniku(www.Koniku.com)是第一家开发“湿芯片”作为基于培养神经细胞的计算芯片的公司，自2017年以来一直在将高度专业化的产品商业化，用于检测安全、军事和农业/食品市场中的气味化合物。如在他们的专利申请WO 2018/081657中所述，可以通过各种生物技术过程(例如基因编辑、甲基化编辑等)来修饰神经元细胞，以表达具有细胞表面受体的独特气味受体谱，如从生物学现有技术中所知。神经元细胞可以通过现有技术的神经生理学接口(例如多电极阵列电极，MEA)与计算机连接。这种方法的一个主要限制是它仅限于使用在MEA上生长的粘附的2D游离神经元培养物。如US2017/015964和US2021/261898中所述，使用水凝胶和生物相容性聚合物排列将这种培养物排列在通过微通道互连的微孔或腔室的阵列中。

Baker Hughes的美国专利申请US20140279772公开了在用于处理井下信号的设备中使用培养的生物神经网络，该信号在容器中通过钻孔传送到地层中。生物神经网络放置在容器中并与MEA电极连接，以接收来自传感器的输入信号并将测量结果输出到神经网络。所提出的BNN系统还包括环境控制部件，如大气再循环器、二氧化碳洗涤器和氧气供应器。虽然本公开提到了BNN在具有挑战性的环境中在并行计算能力、对振动和电噪声的鲁棒以及自愈能力方面优于传统计算系统的优点，但是它高度专业化于特定应用，其中预处理学习可以作为离线准备过程来应用。

这些现有技术的方法和系统不容易适应3D神经球或类大脑器官的长期24/7培养物(long-term 24/7culture)、记录和刺激。Giandomenico等人(2019,Nat.Neurosci.22(4)669-679)观察到空气-液体界面类大脑器官(air-liquid interface cerebralorganoids，ALI-CO)促进了体外类大脑器官的长期研究，而无需设计具有鲁棒性的自动化血管化系统。他们证明了空气-液体界面系统促进了连续的营养供应，这是类大脑器官长期生存所必需的。特别是，他们报告说他们已经测试了ALI-CO长达一年的存活率。

US6130056描述了一种适用于3D细胞培养物的电生理学监测的ALI装置，其包括多孔膜以供给细胞(液体界面)同时提供足够的氧合和CO₂扩散(空气界面)。培养基通过毛细作用穿过膜，并用营养液膜覆盖3D组织。在自动注射驱动器的控制下，可以利用微流体系统通过管子以通常0.1-2μl/min的流速灌注营养培养基。

US6689594进一步描述了后一种系统的改进，以便于利用直接在营养微流体腔室顶部的透明多孔膜上制造的电极来连续电记录和/或刺激3D培养物。膜可以由聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)或聚碳酸酯制成。电极布置在细胞培养物下方，这带来了两个优点：1)细胞培养物可以被视觉监控而不需要移动该布置的任何元件，以及2)细胞在它们上面的营养膜的重量下被压靠在电极上。特别地，这自然地避免了进一步的机械操作，否则可能需要将活细胞与电生理学测量硬件紧密接触。该装置通常是一次性装置，每次分析后丢弃。

在“Mass generation,neuron labeling,and 3D imaging of minibrains”,Front.Bioeng.Biotechnol.(2021)，Govindan等人描述了一种分步方法来生成人类迷你大脑托管所(minibrain nursery)，培养它们并通过将其放置在具有多孔膜的气液MEA生物芯片的顶部进行研究。迷你大脑是一种脑球体模型，包括各种类型的兴奋性和抑制性神经元以及神经胶质细胞，其尺寸大小约为500vm至600vm，在适当的培养条件下寿命至少为15个月。

后一种ALI布置还被集成在一种小型化的“芯片实验室”设备中，以促进对化学物质对人脑组织模型的功能影响和潜在神经毒性的体外研究(Wertenbroek等人，2021,IEEETransactions on Biomedical Circuits and Systems 15(4),743-755)。图1示出了Wertenbroek等人的神经元细胞培养监控系统的微流体和生物芯片部分的a)总体视图b)俯视图和c)摘要(abstract)视图。这种系统包括：

·从重编程的iPS细胞生长的人类神经组织的3D细胞培养物100，例如使用Govindan等人的方案，并放置在第一多孔膜120上的受控腔室110中，该第一多孔膜120布置成集成MEA电极125以形成MEA生物芯片。多孔膜120由聚酰亚胺制成，并通过在膜上蚀刻的孔栅格布置成10％的多孔来促进空气-液体界面。在图1的MEA生物芯片上，可以在多孔膜120上彼此独立地平行培养和监测多达四个神经球。

·运送培养基液体的微流体通道130，其内置于多层PPMA(聚甲基丙烯酸甲酯塑料)140中，通过由第二多孔疏水膜制成的支撑层150与MEA生物芯片分离。多孔疏水支撑层膜可以由带有穿孔的PTFE(聚四氟乙烯)或PET(聚对苯二甲酸乙二醇酯)制成。流体通道将液体流从入口131运送到出口132，特别是在空气-液体界面多孔膜120、150下方，以通过灌注到达细胞培养物100。入口131和出口132适于便于连接到具有标准鲁尔锁(Luer lock)连接器的各种导管和微流体系统；例如，在图1a)的照片中，在入口131上可以看到兼容鲁尔锁的附件134，而在出口132上没有。为了更具鲁棒性的布置，这些入口131、132优选垂直地构建在流体通道PMMA塑料层水平面上，但是其他布置也是可能的。

·用于流体灌注系统的自动控制的流体模块(未示出)，包括蠕动泵和电磁阀，以将营养培养基通过流体通道130灌注到3D细胞培养生物芯片上。或者，可以使用注射驱动装置来代替蠕动泵。例如，可以使用汉密尔顿注射器(Hamilton syringe，https://www.hamiltoncompany.com/automated-liquid-handling)。流动方向(通常，是从细胞培养物向废物收集器的抽吸)、流速以及操作的时间和周期可由射流模块软件配置，以实现全自动操作模式下的不同程序操作。例如，Govindan等人的方案建议定期使用间歇抽吸来替换液体营养物。需要注意的是，对于特定的神经毒性评估应用，可将额外的蠕动泵和电磁阀用于受试物质分配系统，并对其进行参数化。

·定制的视觉模块(未示出)用于3D神经组织的光学跟踪，包括照相机、透镜和光源。视觉模块可以由采用不同软件方法的本地或远程计算机控制，例如采用OpenCV开源图像处理软件、Imaris交互式显微镜成像软件和/或定制编程的机器学习工具如人工神经网络(artificial neural network，ANN)算法的计算机，以通过图案识别、边缘检测、颜色检测、纹理检测、细胞膜检测、细胞尺寸测量、细胞形状检测、细胞计数等促进对细胞培养物健康的24/7图像处理监控。

·神经元尖峰信号记录和分析模块，包括与MEA生物芯片(部分显示为图1a中的黑色组件)连接的硬件板，并结合本地或远程计算机，该计算机适用于不同的软件方法来分析细胞培养物电生理学信号。Wertenbroek等人的示例性设置的硬件板包括用于管理信号通信和记录的微处理器以及用于控制和处理来自MEA生物芯片(能够记录和刺激3D神经元细胞培养物)的多达256个电极的信号的FPGA。MEA信号处理硬件模块可以由采用不同软件方法的本地或远程计算机控制，例如采用尖峰分析算法的计算机，以便于通过图案识别、尖峰检测、时间和/或频率分析等来研究细胞培养物电活动。负责电生理信号监控的本地或远程计算机可以与负责视觉模块图像监控的本地或远程计算机相同或不同。

有待解决的问题

Wertenbroek等人的示例性现有技术神经元培养监控系统因此在理论上可以适于为人工智能和认知湿系统提供生物神经元网络处理单元的长期24/7连续操作，例如WO2020/049182中所描述的。然而，初步实验表明，由于微流体系统中不同扰动的随机发展，当在全自动操作中进行长期测试时，它仍然受到实际限制。一般来说，空气-液体界面上的任何细胞培养物的完整性对于细胞存活都是重要的，与细胞培养物接触的液体量相关的任何破坏都可能是有害的。这包括由于到达细胞的营养液的过度变化而导致的细胞电活动的中断。特别地，应避免任何液体溢出或下溢，以及ALI膜周围的任何气体气泡。流通道中气泡的来源是复杂的，目前没有标准方案来防止它们的形成(Pereiro等人，Lab Chip,2019,19,2296-2314)。一般来说，培养基(medium，也可以译为“介质”)流动的方向可能至关重要：

·如果使用泵来抽吸培养基(放置在下游，即沿着微流体通道循环方向超出细胞物培养灌注)，则膜下方的培养基中的压力降低，这可能有助于随着过量空气从多孔膜上方的气液界面进入培养基而形成气泡。最终，细胞培养物可能由于过量空气而干燥致死。

·如果使用泵来推动培养基(沿微流体通道循环方向放置在细胞培养物灌注之前的上游)，则膜下部的压力增加，这可能导致过量液体穿过多孔膜并进入BNN所在的腔室。最终，细胞培养物可能被推离其与MEA生物芯片电极的接触，从而随着时间的推移破坏细胞培养物电生理测量的稳定性。

图2示出了可以由自动视觉模块观察到的这种气泡的两个例子：

·3D气泡220，其在流体通道中形成并随着液体流从上游流体通道260流向下游流体通道270，可能对ALI系统造成干扰；

·2D气泡210，其看起来是在空气-液体界面设置(setup)的上部多孔聚酰亚胺膜和下部疏水多孔膜之间形成的“更平坦”的气泡，因此阻止了营养液向放置在空气-液体界面膜上方的培养物中的神经元细胞灌注。

发明人尝试了多种最先进的去泡器溶液实验，例如在营养培养基源和MEA生物芯片装置之间的微流体系统上游集成去泡器装置(Elveflow peek气泡去除器)。虽然这种布置在营养物流到达MEA生物芯片自身的空气-液体界面膜之前过滤掉营养物流中的一些气泡，但是他们观察到并不是所有的气泡都被去除，尤其是2D气泡，其专用于该空气-液体界面以促进24/7MEA生物芯片信号监测。事实上，细胞培养物领域中的大部分微流体去泡器解决方案本身使用空气-液体界面通过气体渗透膜对液体和空气的不同支撑件来去除气泡(Williams等人发表的“A low.cost,rapidly integrated debubbler(RID)module formicrofluidic cell culture applications”，Micromachines 2019，10，360)。因此，它们非常适合传统的细胞培养物，其中细胞被浸入充满营养液的腔室或微孔中。然而，它们不能有效地解决需要放置在MEA生物芯片电极的顶部上的神经元培养的特定需求，特别是24/7自动化神经元培养系统，该系统采用空气-液体界面来促进3D神经球或类大脑器官在生物芯片上的长期存活。

现有技术中用于微孔阵列的其他解决方案依赖于用各种成分涂覆微流体通道壁和腔，例如使用低成本单糖——如同在Wang等人在Lab Chip，2012，12，3036-3039所描述的或WO2017180544中所描述的。这种解决方案不能很好地适应自动化细胞培养物监控系统的24/7湿操作的需要。

图3说明了在MEA生物芯片装置的多孔膜中可见的2D气泡的破坏性影响，该装置能够在相同的微流体通道营养物进料下平行监测4种不同的细胞培养物。定制的视觉模块在48小时内以不同的时间间隔捕获MEA生物芯片细胞培养物的图像，并自动识别出现在布置的右侧的2D气泡(可通过自动白线气泡轮廓检测和标记识别)。从左边最早的快照到右边最新的快照，2D气泡的增加在图像中清晰可见：它最终到达了所有MEA培养物。与此同时，图3中细胞培养物监测图像下方显示了MEA4培养物(即设置右侧最早受影响的细胞)的尖峰信号监测。尖峰信号逐渐中断并减慢，直到神经元细胞死亡，信号中仅保留可见的低水平背景残余电噪声。在这个实验中，由于在气液界面产生了破坏性的2D气泡，所有4个培养的神经球最终都在不到48小时的时间里因缺乏营养而死亡。在其他不幸的实验中，由于在双多孔膜中形成失控的2D气泡，发明人观察到信号在不到15分钟内中断，细胞在不到1小时内死亡。

与本申请相反，用于毒性研究和药理学用途的功能效应测试的现有技术应用不需要24/7信号监控。例如，如Wertenbroek等人所述，在暴露于待测试物质的5分钟结束时，再灌注培养基4分钟以洗出物质的剩余成分(可能包括气泡)，并且仅在洗出完成后才进行电测试。在这种设置下，通常的做法是用位于营养液分配系统上微流体出口下游的蠕动泵或注射驱动器自动抽取营养液。会将液体从灌注MEA生物芯片区域带走，而不是将其淹没在生物芯片区域上。如果在测试的早期阶段在ALI膜周围产生气泡，则自动视觉模块仍有可能检测到该气泡并停止测试程序，直到该气泡被修复，或者通过调用手动操作，或者通过用整个微流体系统控制器适应冲洗操作(例如，通过在足够短的持续时间内稍微增加灌注流速直到气泡被冲洗掉，从而不会产生神经元细胞培养物的不可逆溢出)。

然而，这种检测和修复过程在24/7信号监控应用中是不可能的，因为任何气泡一旦形成就可能影响信号处理操作。发明人测试了微流体循环系统的多种布置，使用蠕动泵或注射驱动自动系统，以及在微流体通道中操作营养培养基循环的多种方法，但没有找到有效、持久的24/7解决方案。蠕动泵的例子包括由Longer制造的精确蠕动泵BT100-2J，其可被编程以输送0.2μl/min至380ml/min之间的流速；也包括由Longer制造的具备鲁棒性的工业蠕动泵G100-1J，其可被编程以输送高达500ml/min的任何流速；或者由DarwinMicrofluidics制造的各种蠕动泵型号，其可被编程以输送1.5-2μl/min至367-380ml/min之间的任何流速。注射泵的例子包括由NewEra Instruments制造的SyringeOne系列，其可以根据型号或者由Darwin Microfluidics制造的各种注射泵型号被编程以输送从0.008nl/hr到2545μl/min的流速，其中一些可以被编程以输送宽范围的流速，可能低至约0.5pl/min。

发明人观察到，一旦2D和3D气泡在系统中形成，使用蠕动泵以抽吸模式(吸气)灌注MEA生物芯片增加了2D和3D气泡的尺寸。通过略微增加灌注流速将气泡推离空气-液体界面，直到气泡从装置中被冲走，这在去除气泡方面可能是有效的，但是这需要向生物芯片过快地供应营养液。这增加了液体溢出空气-液体界面的风险。换句话说，为了解决由于ALI中的气泡而导致的空气过多的问题，由于溢流而导致的液体过多的新问题又产生了。ALI上多余的液体会导致它们信号的另一个功能性中断，甚至它们的死亡。

特别地，发明人观察到任何液体溢出都倾向于使神经球失去控制，从而导致其连续MEA信号监测的另一个中断源。图4分别在左边和右边显示了使用两种不同MEA生物芯片培养物的溢出结果的例子：a)和b)正常操作，无溢出；c)和d)溢出的开始可以被视觉检测到；e)和f)中，溢出对细胞培养物的有害影响是可见的，因为一些神经球从MEA生物芯片电极上脱离接触。

因此，需要新的解决方案，使用具有气液界面的MEA生物芯片用于更具鲁棒性的长期自动化神经元细胞培养物，以最大限度地减少界面处气泡的形成。

发明内容

本公开的一个目的是提供改进的3D细胞培养物监控装置、系统和方法，以防止由于微流体系统中可能形成的气泡和液体溢出而导致信号处理中断以及3D培养细胞的退化甚至死亡。

本发明描述了一种用于在空气-液体界面上维持至少一种细胞培养物存活的微流体系统，包括：微流体通道，其布置成通过空气-液体界面的一个或多个多孔膜向所述细胞培养物提供液体灌注；泵送装置，其被布置成使液体循环通过微流体通道，其特征在于，泵送装置适于推动液体连续通过微流体通道的入口，然后通过微流体通道在空气-液体界面 (即，腔室)下方的区域，然后通过微流体通道的出口。

本发明描述了一种用于在空气-液体界面上维持至少一种细胞培养物存活的微流体系统，该微流体系统包括：微流体通道，其布置成通过空气-液体界面的一个或多个多孔膜向所述细胞培养物提供液体灌注；至少一个泵送装置，设置成通过微流体通道循环液体，其特征在于，至少一个泵送装置适于推动液体连续通过微流体通道的入口，然后通过微流体通道在空气-液体界面下方的区域，然后通过微流体通道的出口，其中至少一个泵送装置被编程为以约1μl/hr至约100μl/hr的平均流速推动液体，例如约100μl/hr至约100μl/hr。

在另一个实施例中，至少一个泵送装置被编程为以间歇模式推动液体。在另一个可能的实施例中，至少一个泵送装置被编程为以间歇模式下约10μl/mn或间歇模式下约1μl/mn的平均流速推动液体。间歇模式的示例包括但不限于在间歇模式下每10mn至60mn持续约30s至约5mn的约10μl/mn或约1μl/mn的平均流速，例如在间歇模式下每10mn持续约1mn、每15mn持续约30s、每20mn持续约2mn、每60mn持续约5mn等的约10μl/mn或约1μl/mn的平均流速。优选地，在间歇模式下，每10mn持续约1mn的平均流速约为10μl/mn。

在另一个可能的实施例中，至少一个泵送装置被编程为以本文所描述的流速推动液体，并从推动模式切换到临时抽吸模式。

在另一个可能的实施例中，提供了一种用于维持至少一种细胞培养物在空气-液体界面上存活的微流体系统，包括：微流体通道，设置成通过空气-液体界面的一个或多个多孔膜向所述细胞培养物提供液体灌注；至少一个泵送装置，设置成通过微流体通道循环液体；其特征在于，至少一个泵送装置适于推动液体通过微流体通道的入口，然后通过微流体通道在空气-液体界面下方的区域，然后通过微流体通道的出口，并且还包括第二泵送装置，其适于抽吸液体通过微流体通道的入口，然后通过微流体通道在空气-液体界面下方的区域，然后通过微流体通道的出口。

本发明描述了一种用于在空气-液体界面上维持至少一种细胞培养物存活的微流体系统，该微流体系统包括：微流体通道，设置成通过空气-液体界面的一个或多个多孔膜向所述细胞培养物提供液体灌注；至少一个泵送装置，设置成通过微流体通道循环液体，其特征在于，至少一个泵送装置适于推动液体连续通过微流体通道的入口，然后通过微流体通道在空气-液体界面下方的区域，然后通过微流体通道的出口，其中至少一个泵送装置被编程为以大约1μl/hr至大约100μl/hr之间的平均流速推动液体，优选地以大约10μl/hr至大约100μl/hr之间的平均流速推动液体，或者以间歇模式推动液体，例如以大约10μl/mn或大约1μl/mn的平均流速以间歇模式推动液体，优选在间歇模式下以大约10μl/mn的平均流速抽吸液体，并且还包括第二泵送装置，该第二泵送装置适于抽吸液体通过微流体通道的入口，然后通过微流体通道在空气-液体界面下方的区域，然后通过微流体通道的出口，其中第二泵送装置被编程为以大约1μl/hr至大约100μl/hr的平均流速抽吸液体，优选地在大约10μl/hr和大约100μl/hr之间，或者以间歇模式抽吸液体，例如以大约10μl/mn的平均流速或以间歇模式大约1μl/mn的平均流速，优选地以间歇模式大约10μl/mn的平均流速。间歇模式的例子包括但不限于在间歇模式下持续约30s至约5mn每10mn至60mn的约10μl/mn的平均流速或约1μl/mn的平均流速，例如在间歇模式下持续约1mn每10mn、持续约30s每15mn、持续约2mn每20mn、持续约5mn每60mn的平均流速等。优选地，在间歇模式下，每10mn持续约1mn的平均流速约为10μl/mn。

在另一个可能的实施例中，第二泵送装置被编程为在间歇模式下以大约10μl/mn或大约1μl/mn的平均流速抽取液体，优选地在间歇模式下以大约10μl/mn的平均流速抽取液体。间歇模式的例子类似于第一泵送装置。

在可能的实施例中，根据本发明的微流体系统包括微流体通道的出口，该出口位于与微流体系统中的空气-液体界面的多孔膜相同的高度或低于该多孔膜。

本发明描述了一种用于在空气-液体界面上维持至少一种细胞培养物存活的微流体系统，该微流体系统包括：微流体通道，设置成通过空气-液体界面的一个或多个多孔膜向所述细胞培养物提供液体灌注；至少一个泵送装置，设置成通过微流体通道循环液体，其特征在于，至少一个泵送装置适于推动液体通过微流体通道的入口，然后通过微流体通道的位于空气-液体界面下方的区域，然后通过微流体通道的出口，并且微流体通道的出口位于与微流体系统中的空气-液体界面的多孔膜相同的高度或比其低。

在另一个可能的实施例中，微流体系统包括废物收集器，用于收集从微流体通道的出口推出的液体，并且废物收集器和将出口连接到废物收集器的任何微流体元件被放置在与微流体系统中的空气-液体界面的多孔膜相同的高度或比多孔膜低。在另一个可能的实施例中，微流体通道和空气-液体界面是倾斜的，使得微流体通道出口位于与空气-液体界面的多孔膜相同或更低的高度。在另一个可能的实施例中，微流体通道和空气-液体界面布置在微流体系统中的刚性平面支撑件上，并且该刚性平面支撑件倾斜，使得微流体通道出口位于与空气-液体界面的多孔膜相同的高度或低于该多孔膜。在又一个可能的实施例中，微流体通道的入口低于微流体系统中微流体通道的出口。在另一实施例中，微流体通道是倾斜的，使得微流体通道的入口低于微流体系统中微流体通道的出口。在另一实施例中，微流体通道布置在微流体系统中的刚性平面支撑件上，并且该刚性平面支撑件倾斜，使得微流体通道的入口低于微流体系统中的微流体通道的出口。

泵送装置可以是可编程蠕动泵、注射驱动器或微型齿轮泵。在一个可能的实施例中，泵送装置被编程为以大约10μl/hr和大约100μl/hr之间的平均流速推动液体。在另一个可能的实施例中，可编程泵送装置被编程为以大约10μl/mn的流速以间歇模式推动液体大约每10mn持续1mn。

在可能的实施例中，微流体系统还包括适于利用计算机视觉图像处理系统检测图像特征的中央处理系统和适于根据检测到的图像特征对泵送装置的流动方向、流速和流动持续时间进行编程的中央处理系统。在另一个可能的实施例中，微流体系统可以用经训练的机器学习模型检测气泡或液体溢出，并且中央处理系统可以根据检测到的气泡或液体溢流用预定配置对泵送装置的流动方向、流速和流动持续时间进行编程。在一个可能的实施例中，它可以根据经训练的机器学习模型响应于检测到的气泡或液体溢出而学习到的配置来对泵送装置的流动方向、流速和流动持续时间进行编程。

在另一个可能的实施例中，微流体系统还可以包括电生理学信号处理系统，其适于用电生理学信号处理系统检测细胞培养物电生理学信号的信号特征；并且中央处理系统可以适于根据检测到的信号特征对泵送装置的流动方向、流速和流动持续时间进行编程。

附图说明

图1)示出了示例性现有技术的空气-液体界面(air-liquid interface，ALI)细胞培养物装置，其具有MEA生物芯片以实现细胞培养物电活性(HEPIA SpikeOnChip)的长期电生理学测量；a)示例性ALI MEA生物芯片装置的透视图；b)MEA生物芯片区域的透视俯视图；c)ALI细胞培养物的主要功能层从下到上的摘要剖视图。

图2)显示了在操作中的MEA生物芯片和ALI的俯视图中破坏2D和3D气泡的例子。

图3)显示了在从气泡出现到神经元细胞培养物死亡的48小时期间，发展中的2D气泡对操作中的MEA生物芯片布置的俯视图图像以及对来自MEA生物芯片上的神经元细胞培养物之一的监测到的尖峰信号的破坏性影响的示例。

图4)显示了a)b)两个正常操作的MEA生物芯片系统和c)d)e)f)被液体溢出事件破坏的相同MEA生物芯片系统的在不同时间戳的照片。

图5)显示了a)优化ALI细胞培养装置MEA生物芯片区域和流体元件的放置的可能的支撑装置的3D视图，使得流体通道出口位于比MEA生物芯片区域更低的高度。

图6)显示了可能的支撑装置的3D视图，以进一步优化ALI细胞培养装置MEA生物芯片区域和流体元件沿着两个斜面的组合的放置：第一斜面，使得流体通道出口位于比MEA生物芯片区域更低的高度，以及沿着第二斜面，使得ALI细胞培养物下方的微流体通道部分倾斜，输入导管位于比输出导管更低的高度，从而有助于从微流体通道的这一部分向微流体通道出口消除气泡。

图7)示出了24/7自动化细胞培养监控系统的主要元件。

图8)示出了采用所提出系统的四种不同布置的24/7神经元细胞培养实验。

图9)显示了同一MEA生物芯片在两个不同时间的两张照片，其中已经去除了潜在的干扰性的2D气泡。

图10)显示了具有两个泵送装置的示例性微流体系统。

具体实施方式

生物芯片装置被理解为包括与腔室、孔(well)或更一般地任何合适的生物相容性几何形状连接的电子设备的装置布置，以容纳与电子部件如电线、传感器或电极紧密接触的细胞培养物。MEA生物芯片被理解为包括微电极阵列(MEA)的装置布置，该微电极阵列与腔室、孔或更一般地任何合适的生物相容性几何形状连接，以容纳与MEA电极紧密接触的细胞培养物。

应当理解的是，可以使用现有技术的系统和方法在生物芯片的空气-液体界面(ALI)上生长3D细胞培养物，特别是人类神经组织的3D培养物，例如神经球、类脑器官、类皮质器官，也称为“迷你脑”^TM，或任何其他能够进行电生理活动的有机组织，例如心脏组织、肌肉组织和其他人类或动物来源的组织。在一个实施方案中，使用的是神经元细胞培养物，包括2D或3D培养物。在一个实施方案中，从啮齿类动物(大鼠、小鼠)或人类神经祖细胞、永生化神经祖细胞、神经祖细胞、诱导多能干细胞(Induced Pluripotent Stem cell，iPS细胞)、神经玫瑰花结或多能干细胞发展神经元细胞培养物。在另一个实施例中，细胞培养物是啮齿类动物和人神经细胞的混合物。作为商品出售的人祖细胞的一些例子包括(1)Lonza出售的Poietics^TM神经祖细胞系统(NHNP)，(2)Sigma-Aldrich出售的VM，或(3)Sigma-Aldrich出售的/>CX。

在MEA生物芯片装置的一个可能的实施例中，细胞培养物可以在集成了电极的膜上进行监测，本文称为电极膜。电极膜可以由聚酰亚胺膜或任何其他合适的材料制成，例如生物相容的高性能塑料或聚合物。电极膜被布置成集成有电极，例如MEA电极或任何其他合适的电极，以从细胞培养物中捕获样本电生理信号。优选地，电极膜是多孔的，以便促进空气-液体界面。所述电极膜包含例如用于微滤(microfiltration)的0.1至10μm的孔和用于超滤(ultrafiltration)的0.001至0.1μm的孔。所述电极膜是5％-15％多孔的，特别是10％多孔的。在一个具体实施例中，电极膜是聚酰亚胺膜，其具有5％-15％的多孔，特别是10％的多孔，这是由于穿过膜蚀刻的孔的网格有利于空气-液体界面，但是其他实施例也是可能的。

应当理解，3D细胞培养物，特别是人类神经组织的3D培养物，生长在支撑在第二膜层上的电极膜上，第二膜层在本文中称为支撑层。这种支持层与培养基直接接触。支撑膜可以由PET膜或任何其他合适的材料制成，例如PTFE和类似材料，优选透明材料。

应当理解，通过提供必要的气体和液体营养物/细胞废物(也称为培养基)，在MEA生物芯片上随时间维持3D细胞培养物(特别是人类神经组织的3D培养物)的体内平衡。应当理解，可以向细胞培养物的顶室(apical)和底室(basal)提供培养基，或者细胞的底室表面与液体培养基接触，而顶室表面暴露于空气中。

应当理解，生物芯片可以是微流体系统的一部分。特别地，空气-液体界面的液体部分可以由流体或微流体通道提供，该流体或微流体通道被布置成在与生物芯片装置相同的右侧塑料支持件上的平面布置中在空气-液体界面下方通过(图1)。微流体通道130通过以预定流速流动的液体的微流体循环，将液体从上游液体分配器(未示出)通过入口131输送到MEA生物芯片。然后，液体通过空气-液体界面多孔膜120、150的灌注到达细胞培养物100。微流体通道130通过以预定流速流动的液体的微流体循环，进一步通过出口132将液体从MEA生物芯片向下游废物收集器(未示出)输送。微流体通道、导管、软管、管道和/或鲁尔锁系统(例如134)用于互连微流体液体分配系统元件。微流体泵和可选的阀(未示出)用于控制液体通过微流体系统的流速和循环方向。优选地，微流体泵被编程为使得液体通常从液体分配器向废物收集器循环，因此从微流体通道130的入口131向出口132循环，但是它们也可以被编程为暂时反转流动方向。可选地，流量计可以用于测量微流体系统中的实际流速。

空气/气体气泡被理解为液体中的气体小球。如本文所用，2D气泡是在培养物支持系统的两层膜之间形成的相对扁平的泡，通常高度小于1mm。如本文所用，3D气泡在培养物设置的微流体通道中形成，并且通常具有小于1mm直径。

在人神经组织的3D培养物中，2D气泡因此形成在双多孔膜中，例如在电极膜和支撑层膜之间。

“长期”操作或分析是指至少几个月(即至少2、3、6或9个月)或至少几年(即至少2、3、6或9年)或更长的时间。

“自动的”、“全自动的”操作是指自动维护和操作细胞培养物的模型/系统，因此不需要人工操作员监控。这允许连续的信号监控和细胞培养物的维护(24小时/7天操作)。自动化系统的示例包括中央处理计算系统(可选地与用于编程24/7操作的用户界面连接)、如本文所描述的MEA生物芯片、至少一个泵送装置(优选可编程自动泵送装置)、用于监测MEA生物芯片上的细胞培养物的计算机视觉系统和电生理信号记录和刺激系统。

优化的“慢推”泵送

为了试图去除气泡，发明人尝试通过将泵置于微流体通道入口的上游并将其流速从抽吸模式(从微流体出口向废物收集器泵送液体，导致液体从营养分配器被吸到MEA生物芯片)转换到推动模式(将液体从液体分配器泵送到微流体入口以供应MEA生物芯片)来恢复微流体泵送的主要操作模式。

在所提出的系统的一个实施例中，泵装置或泵送装置选自蠕动泵、注射泵、注射驱动器、微型齿轮泵等，优选地，所述泵装置可以是可编程或计算机控制的泵装置。在一个实施例中，可以控制泵送装置，例如蠕动泵，以从推动模式切换到临时抽吸模式。临时模式是指由操作者或如本文所描述的自动化系统确定的时间，并且可以在大约5s到大约15mn之间的范围内，例如10s、30s、60s、3mn、5mn或15mn。在一个实施例中，可以控制泵送装置，例如蠕动泵，以从抽吸模式切换到临时推动模式。在另一个可能的实施例中，至少两个泵送装置被编程为以本文所描述的流速推动和/或抽吸液体，并从推动或抽吸模式切换到临时推动或抽吸模式。

在所提出的系统的一个实施例中，泵装置或泵送装置，例如蠕动泵、注射泵、注射驱动器或微型齿轮泵，被放置在微流体通道入口的上游，并以推动模式操作(将液体从液体分配器泵送到微流体入口，以供应MEA生物芯片)。对于细胞培养物领域的技术人员来说显而易见的是，在空气-液体界面上，这不同于将泵装置放置在微流体通道出口下游以抽吸模式操作(将液体从微流体出口泵送到废物收集器，导致液体从营养分配器吸出到MEA生物芯片)的传统设置。

优选地，泵送装置被编程为从液体分配器向入口导管以慢推模式自动操作，从而以低流速用营养培养基灌注细胞培养物。需要以具有足够规则性的时间间隔将培养基通过微流体通道推向细胞培养物，以防止气泡的形成，并根据细胞的生物学需要来饲养细胞。

应当理解，液体流动是指液体流动的连续模式或液体流动的间歇模式，其中液体流动是在给定的时间和给定的时间间隔。本文中，“平均流速”指的是连续流速，“间歇流速”指的是液体流动的间歇模式，其中液体以平均流速和给定的时间间隔流动给定的时间。

在所提出的系统的另一个实施例中，一个泵装置或泵送装置被放置在微流体通道入口的上游并以推动模式操作，其中另一个泵装置或泵送装置被放置在微流体通道出口的下游并以抽吸模式操作。在本文中，泵送装置指的是以推动或抽吸模式操作的泵送装置(推动或抽吸泵送装置)。对于空气-液体界面上的细胞培养领域的技术人员来说显而易见的是，这不同于在系统中仅放置一个泵装置的传统设置。

在另一实施例中，系统中使用至少两个泵送装置。一个泵送装置被编程为从液体分配器向入口导管以推动模式自动操作，以给定的流速用营养培养基灌注细胞培养物，而另一个泵送装置被编程为从液体腔室向出口导管和/或废物收集器以抽吸模式自动操作，以给定的流速用营养培养基灌注细胞培养物。这种系统的例子如图10所示。因此，泵送装置可以称为“推动泵送装置”(push pumping device)，而另一种泵送装置可以称为“抽吸泵送装置”(pull pumping device)。具有至少两个泵送装置的所有上述布置的效果是降低空气-液体界面下的液体压力，以避免溢出。当需要观察分子的效果时，这样的实施例对于药理学实验可能特别有用。与具有一个泵送装置的设置相比，它允许测试的新分子更快地进入细胞培养物下面的腔室。在一个实施例中，抽吸泵送装置和推动泵送装置同时操作。在一个实施例中，抽吸泵送装置可以选自蠕动泵、注射泵、注射驱动器、微型齿轮泵和类似的泵，而推动泵送装置可以选自蠕动泵、注射泵、注射驱动器、微型齿轮泵和类似的泵。两种类型的泵的任何组合都是合适的。

在一个实施例中，抽吸泵送装置和推动泵送装置可以如本文所描述的连续或间歇模式运行。两种类型的流动(连续和/或间歇)的任何组合都是合适的。

在一个可能的实施例中，泵送装置以至少约10μl/hr且至多约100μl/hr的平均流速运行。在一个可能的实施例中，泵送装置可被编程为以至少约1μl/hr且至多约100μl/hr的速率运行，优选地至少约10μl/hr且至多约100μl/hr.

在另一个可能的实施例中，泵送装置可以操作或编程为以间歇模式操作，即，以大约10μl/mn或大约1μl/mn的速率以间歇模式每10mn至大约60mn持续大约30s至大约5mn操作，例如以大约10μl/mn或大约1μl/mn的平均流速以间歇模式每10mn持续大约1mn、每15mn持续大约30s、每20mn持续大约2mn、每60mn持续大约5mn地操作等。优选地，在间歇模式下每10mn持续约1mn的平均流速约为10μl/mn。

在一个实施例中，泵送装置可以操作或编程为以大约25μl/hr的恒定流速操作，或者以大约25μl/hr的流速用注射驱动器以间歇模式操作。

在一个可能的实施例中，泵送装置可以在每10mn持续至少1mn内以大约10μl/mn或大约1μl/mn的速率运行或编程。在可能的实施例中，泵可以被编程为以每10mn持续至少1mn的10μl/mn左右的速率运行。在每10mn持续至少1mn的大约10μl/mn的速率下，这对应于营养液的60μl/hr消耗，这足以维持细胞培养灌注，并且已经通过实验表明避免了许多2D气泡的产生，并且有助于排出可能仍然已经在微流体回路中形成的大的3D气泡。

其他实施例也是可能的，例如对于图1的设置，在大约每20mn、或大约每30mn、或大约每45mn、或大约每60mn的时间段期间，在持续大约1mn至大约5mn的间歇模式下以0.1rpm(对应于10μl/mn)运行蠕动泵；或者运行大约25μl/hr的恒定流速的注射驱动器。

在一个实施例中，蠕动泵可以被编程为从推动模式切换到临时抽吸模式。可以使用抽吸速度/时间参数和推动速度/时间参数的适当组合。例如每1min-1000min以1-100rpm持续1-100秒进行抽吸，随后每1min-1000min以1-100rpm持续1-100秒进行推动，例如以每小时10-15rpm持续4-7秒，随后以1rpm推动5分钟，或者例如每小时10-15rpm持续4-7秒，随后以1rpm抽吸5分钟。在一个实施例中，泵送装置可以在每6小时持续5mn的时间内以对应于35μl/mn的1rpm的速率运行或编程运行。

在另一个可能的实施例中，推动泵送装置(或被编程为)以至少约为1μl/hr且至多约为100μl/hr的平均流速运行或以间歇模式运行，而抽吸泵送装置(或被编程为)以至少约为1μl/hr且至多约为100μl/hr的平均流速运行或以间歇模式运行。优选地，推动泵送装置(或被编程为)以至少约为10μl/hr且至多约为100μl/hr的平均流速运行或以间歇模式运行，而抽吸泵送装置(或被编程为)以至少约为10μl/hr且至多约为100μl/hr的平均流速运行或以间歇模式运行。

在另一个替代实施例中，推动泵送装置以(或被编程为)至少约200μl/mn(约3.4μl/hr)的平均流速运行，并且必须与抽吸泵送装置配对。当需要观察分子的效果时，这样的实施例对于药理学实验特别有用。与使用一个泵送装置的设置相比，测试的新分子将更快地(几分钟)进入细胞培养物下面的腔室。相反，在具有一个使用较慢流速(以避免溢出)的泵送装置的设置中，待测试的分子在到达细胞之前将花费数小时(例如，当使用几米长的管时)，并且其效果将变得难以观察。

在另一个可能的实施例中，提供了一种用于在空气-液体界面上维持至少一种细胞培养物存活的微流体系统，包括：微流体通道，其被设置为通过空气-液体界面的一个或多个多孔膜向所述细胞培养物提供液体灌注；至少一个泵送装置，其被设置为通过微流体通道循环液体，其特征在于，至少一个泵送装置适于推动液体通过微流体通道的入口，然后通过微流体通道的位于空气-液体界面下方的区域，然后通过微流体通道的出口，其中至少一个泵送装置被编程为以大约1μl/mn至至少大约10ml/mn的平均流速推动液体，并且还包括第二泵送装置，该第二泵送装置适于抽吸液体通过微流体通道的入口，然后通过微流体通道的位于空气-液体界面下方的区域，然后通过微流体通道的出口，其中第二泵送装置被编程为以大约1μl/mn至至少大约10ml/mn的平均流速抽吸液体。在一个实施例中，泵送装置可以连续和/或间歇模式运行。选定的连续平均流速的示例包括但不限于约200μl/mn、或约2ml/mn、或10ml/mn或至少10ml/mn的平均流速。间歇模式的示例包括但不限于在间歇模式下大约10μl/mn或大约1μl/mn的平均流速，每10mn到60mn持续大约30s到大约5mn，例如在间歇模式下大约10μl/mn或大约1μl/mn的平均流速，每10mn持续大约1mn，每15mn持续大约30s，每20mn持续大约2mn，每60mn持续大约5mn等等。优选地，在间歇模式下每10mn持续约1mn的平均流速约为10μl/mn。

当需要观察分子的效果并进一步将其与电刺激(即电化学刺激)结合时，适当选择平均流量对于药理学实验特别有用。较高的平均流速可能更适合电化学刺激实验。

在另一实施例中，推动泵送装置(或被编程为)以至少约200μl/mn的平均流速运行，而抽吸泵送装置(或被编程为)以约200μl/mn的平均流速运行。

在另一个可能的实施例中，推动泵送装置(或被编程为)以大约1ml/s或至少大约1ml/s的速率以间歇模式操作，而抽吸泵送装置(或被编程为)以大约1ml/s或至少大约1ml/s的速率以间歇模式操作。具体而言，当需要快速更换腔室中的培养基时，这种实施例可能特别有用。具体而言，当需要快速更换体积约为0.5-3ml³(例如1ml³)的腔室中的培养基时，这种实施例可能特别有用。

间歇模式的示例包括但不限于大约1ml/s的平均流速，或者在间歇模式下每10mn到60mn持续大约30s到大约5mn，例如在间歇模式下大约1ml/s的平均流速，每10mn持续大约1mn，每15mn持续大约30s，每20mn持续大约2mn，每60mn持续大约5mn，等等。优选地，在每10mn持续约30s的间歇模式中，平均流速约为1ml/s。

推动和抽吸泵送装置可以在上述限定的范围内(或被编程为)以相同或不同的平均流速运行。

在另一个可能的实施例中，提供了一种用于在空气-液体界面上维持至少一种细胞培养物存活的微流体系统，包括：微流体通道，其被设置为通过空气-液体界面的一个或多个多孔膜向所述细胞培养物提供液体灌注；至少一个泵送装置，其被设置为通过微流体通道循环液体，其特征在于，至少一个泵送装置适于推动液体通过微流体通道的入口，然后通过微流体通道的位于空气-液体界面下方的区域，然后通过微流体通道的出口，其中至少一个泵送装置被编程为以大约1μl/mn至至少大约10ml/mn的平均流速推动液体，并且还包括第二泵送装置，该第二泵送装置适于抽吸液体通过微流体通道的入口，然后通过微流体通道的位于空气-液体界面下方的区域，然后通过微流体通道的出口，其中第二泵送装置被编程为以从大约1μl/mn到至少大约10ml/m的平均流速抽吸液体。选定平均流速的示例包括但不限于约200μl/mn、或约2μl/mn、或10μl/mn或至少10μl/mn的平均流速。当需要观察分子的效果并进一步将其与电刺激(即电化学刺激)相结合时，选择合适的平均流量对于药理学实验特别有用。较高的平均流速可能更适合电化学刺激实验。

在另一个实施例中，推动泵送装置(或被编程为)以至少大约200μl/mn的平均流速运行，而抽吸泵送装置(或被编程为)以大约200μl/mn的平均流速运行。

推动和抽吸泵送装置可以(或被编程为)在上述限定的范围内以相同或不同的平均流速运行。

可以使用从1μl/min到10ml/min的任何速率来同时抽吸和推动，并且可以是间歇的或恒定的流速。

在一个实施例中，本文描述的系统和方法适用于微流体系统，其中微流体通道在空气-液体界面(即，腔室)下的区域在体积上为约0.5-3ml³，例如1ml³。

优化的几何形状

有了上面的“慢推”模式泵送方案，在短期操作就总体解决了气泡问题。然而，取决于端对端微流体通道的实际几何形状，所提出的速率流动仍可能导致营养液通过灌注膜逐渐溢出，因为太多的液体最终被推向细胞腔室。发明人观察到，如图1所示的微流体装置的特定几何形状，其中微流体通道入口和出口导管垂直地放置在承载MEA生物芯片的装置的水平面上方——在该水平面上方约1cm的高度处，可以通过利用重力来补偿营养液分配的过度压力而改进以降低溢出的风险，该过度压力可能由上游泵的推动操作模式引起。

在一个可能的实施例中，MEA生物芯片装置可以布置成在非水平面(例如，倾斜的面)中操作，使得微流体通道的出口位于与空气-液体界面膜相同的高度或低于空气-液体界面膜。通过这种布置，由于慢推操作而过量的任何液体营养物不再溢出培养细胞灌注，而是更自然地在空气-液体界面的下方流向微流体通道出口。换句话说，重力有助于人为地将液体营养物从MEA生物芯片“拉”走，因此泵可以用较小的力将液体营养物推向MEA生物芯片，从而在液体营养物的流中产生较小的扰动。

在另一个可能的实施例中，容纳排出的营养物的所有元件，例如出口鲁尔锁、将出口连接到用于洗出的液体营养物的废物容器的任何软管、以及废物容器本身可以被几何设计和/或空间布置成放置在24/7端到端系统中的MEA生物芯片空气-液体界面膜的相同高度或更低的高度。例如，可以采用较短的出口、锁或软管，以保持与空气-液体界面膜的高度相比尽可能小；废物容器，例如Falcon 50容器，本身可以倾斜以缩短其高度，如图8所示。结果是，当液体通过微流体通道从入口更平稳地流到出口导管时，在ALI膜水平形成更少的气泡，特别是形成更少的2D气泡，而在膜界面高度没有对营养液的额外重力压力。

MEA生物芯片装置可以用不同的固定装置定位在非水平面上。在一个可能的实施例中，它可以简单地放置在倾斜表面支撑件上。可以使用增材制造技术(例如3D打印)以低成本制造倾斜表面支撑件。图5a)示出了从倾斜表面支撑件模型500中提取的示例性3D视图，该模型可以用适于3D打印的STL文件格式表示。在该实施例中，倾斜表面500沿着微流体通道130输出导管的轴线向下倾斜设置，该输出导管将MEA生物芯片空气-液体界面区域连接到出口132。由于自动重力放置，这种几何形状确保培养的神经球仍然以足够的接触躺在MEA生物芯片上，同时微流体通道出口132放置在与ALI膜相同的高度或低于ALI膜，以防止在培养的细胞附近形成气泡。如图5b)中示意性示出的，输出软管510也可以设置有曲率，以最小化其在鲁尔锁上方的额外高度。更一般地，将MEA生物芯片微流体通道出口连接到培养基废物收集器(未示出)的任何下游元件可以几何地布置成放置在MEA生物芯片ALI区域下方。

倾斜支撑件的其他布置也是可能的。如图2所示，3D气泡220倾向于在微流体通道导管的边缘附近形成，该微流体通道导管直接位于空气-液体界面膜下方，特别是当微流体通道的这部分比输入和输出导管窄时。为了补偿MEA生物芯片装置的这种几何构型，在ALI界面下方沿微流体通道导管的中心部分的流动的轴线几何地设计第二斜面可能是有利的。参考图2的示例，上游导管260可以优选地放置成低于下游导管270，使得3D气泡被自然地推向出口方向。因此，在另一个可能的实施方案中，支撑MEA生物芯片细胞培养物的表面可以结合沿着从MEA生物芯片细胞培养物到微流体出口的微流体通道的下游部分的第一轴线的第一斜面和沿着位于用于灌注的MEA生物芯片细胞培养物的空气-液体界面下方的微流体导管部分的轴线的第二斜面而倾斜。可以结合第一倾斜角和第二倾斜角来选择这种几何布置，使得培养的神经球由于自动重力放置而仍然以足够的接触躺在MEA生物芯片上，同时便于防止和消除沿微流体通道的任何2D或3D气泡，特别是在MEA生物芯片的关键ALI区域附近和下方。更一般地，支撑MEA生物芯片细胞培养物的表面可以倾斜，使得微流体通道130的入口131低于出口132。图6相应地示出了从双斜面支撑模型500中提取的示例性3D视图，该双斜面支撑模型500可以用适于3D打印的STL文件格式来表示。

在另一个实施例中，所有上述优化的几何布置可以应用于本发明的具有至少两个泵送装置的微流体系统，例如具有推动和抽吸泵送送装置。对系统进行必要的修改以将第二泵送装置应用到具有一个泵和本文描述的几何布置的系统中，都将在标准方法内。

所有上述优化的几何布置的效果是降低空气-液体界面下的液体压力，以避免推动的时候也溢出。另一种描述效果的方式是考虑膜下培养基中的液压接近膜上的大气压，以避免溢出(当液压较高时)和气泡(当液压较低时)。

长期运行的自动控制泵送

利用上述微流体系统布置，例如利用与细胞培养物监控系统的优化几何结构相结合的上述“慢推”自动泵送解决方案，气泡和溢出问题总体被解决以用于可持续的24/7操作。然而，在几周或几个月后的中长期操作中，已经观察到缓慢漂移，特别是泵老化，以及不时出现的意外事件，仍然会导致2D或3D气泡的形成和不受控制的发展。

图7示出了24/7MEA生物芯片监测系统的主要系统部件，其包括：

-与用户界面780连接的中央处理计算系统700，用于编程24/7操作并向终端用户报告细胞培养物监控结果，例如报告和警报；中央处理系统和用户界面可以在实验室的本地，或者通过通信网络(未示出)而被远程操作。

-MEA生物芯片750，包括微流体通道130，以供给3D细胞培养物100(未示出)。

-可编程自动泵710，用于通过MEA生物芯片150的微流体通道130循环液体，以灌注在MEA生物芯片150上生长的3D细胞培养物100。泵可以用来自中央处理计算系统700的可变参数编程，例如泵送流速、泵送流动方向、泵送开始时间、泵送持续时间，并且可以向中央处理计算系统700报告泵710的状态。

-计算机视觉系统760，用照相机、透镜和照明系统监控MEA生物芯片750上的细胞培养物100。计算机视觉系统从中央处理计算系统700接收配置参数，例如随时间捕获的图像快照的频率，并将捕获的图像传送回中央处理计算系统700。

-电生理信号记录和刺激系统770，其记录和预处理来自MEA生物芯片的原始MEA信号，并将它们传输到中央处理计算系统700。当MEA生物芯片以双模式(细胞信号记录和细胞刺激)操作时，电生理信号记录和刺激系统770也可以从中央处理计算系统700接收MEA刺激信号参数。

在一个可能的实施例中，所提出的神经元培养自动监控系统可以使用视觉系统760，例如Wertenbroek的定制视觉模块，或者包括照相机、透镜和光源的其他细胞培养物视觉监控系统。视觉系统760可与中央处理计算系统700联合操作，以实时监测来自MEA生物芯片750上的神经元细胞培养物100的图像，从而使用计算机实施的图像处理方法从细胞培养物图像中检测潜在有害事件的发展。

在可能的实施例中，中央处理计算系统700可以从视觉系统760捕获的图像中检测一个或多个特征，例如：

·基于纹理、颜色和/或边缘检测算法提取的气泡特征：

·存在/缺失气泡

o分类为2D或3D气泡

o气泡计数

·对于每个气泡：

o MEA生物芯片区的位置

在图像平面的绝对坐标中

作为到最近的神经球的相对距离

检测ALI某些敏感区域的存在

o大小

o增长率

o运动检测

运动方向

运动速度

o变形

·溢出特征：

o根据灌注的神经元培养物的纹理、颜色和/或边缘检测，从较小的外观到较大的影响的溢出阶段

o演变速率

对于图像处理领域的技术人员来说显而易见的是，各种算法，例如来自OpenCV或Imaris软件工具库的算法，可以用于从一个或多个成像特征中检测气泡和/或溢出特征，例如纹理、颜色、边缘、数学形态学、细胞培养汇合等。

在一个可能的实施例中，所提出的神经元培养物自动监测系统可以使用自动电生理学监测系统770，例如Wertenbroek的定制MEA监测模块，或其他MEA监测系统，与中央处理计算系统700结合，以实时监测来自MEA生物芯片空气-液体界面上的神经元细胞培养物的尖峰活动，并使用计算机实现的电信号处理方法检测来自细胞培养物电生理学活动的潜在有害事件的发展。

在可能的实施例中，中央处理计算系统700可以采用从图像中提取特征的经训练机器学习系统，例如深度学习工具、卷积神经网络工具(CNN)、人工神经网络工具(ANN)或其他。在可能的实施例中，可以使用基于全自动卷积神经网络(CNN)的工具，例如AlexNet、VGG、GoogleNet、UNet、Vnet、ResNet或其他工具，但是其他实施例也是可能的。在一个可能的实施方案中，在具有规则性的时间，例如每15、10、20、30、60或90分钟一次，中央处理计算系统700可以用计算机视觉模块760触发从细胞培养物中捕获快照图像，并分析图像以检测2D气泡、3D气泡或溢出。可以训练三个不同的专用神经网络来分别专门地学习如何识别2D气泡、3D气泡或溢出，或者可以训练单个多功能神经网络来联合标记这三个事件。在另一个可能的实施例中，中央处理计算系统700可以比较不同时间的两个快照，以测量2D气泡、3D气泡和/或溢出事件的演变。

在可能的实施例中，中央处理计算系统700可以从MEA电信号中检测一个或多个特征，例如平均点火频率、信噪比(SNR)、信号功率等。在另一个可能的实施例中，中央处理计算系统700可以检测来自神经元细胞培养物的电生理活动的一个或多个特征的漂移，作为灌注系统不再以最佳方式维持神经元细胞培养物健康的可能信号。

在可能的实施例中，中央处理计算系统700可以采用机器学习系统，该机器学习系统被训练成从电生理学信号中提取特征，例如深度学习工具、卷积神经网络工具(CNN)、人工神经网络工具(ANN)或其他。在一个可能的实施例中，可以使用基于全自动卷积神经网络(CNN)的工具，例如AlexNet、VGG、GoogleNet、UNet、Vnet、ResNet或其他工具，但是其他实施例也是可能的。在一个可能的实施例中，中央处理计算系统700可以定期(例如每1 5、10、20、30、60或90分钟一次)利用电生理学记录模块从MEA生物芯片监测的信号中提取快照，并分析该信号以根据预定的细胞培养稳定性度量来测量值。

在可能的实施例中，中央处理计算系统700可以采用多模态机器学习系统来将细胞培养物图像中可见的事件检测与电生理学信号中可观察到的事件检测相结合。

视觉系统760和/或MEA监测系统770可以根据检测到的特征发出警报进行人工干预。在另一个可能的实施例中，中央处理计算系统700可以通过接收来自计算机视觉系统760、或来自MEA电生理信号监测系统770、或来自流量计装置(未示出)或其组合的测量值和警报，并通过用诸如流动方向(推动、抽吸或推动和抽吸的交替)、流速、间歇模式下每次泵送操作的开始和结束时间等的参数指挥泵系统，以尽可能快地对触发事件做出反应，而无需等待人工干预。

在一个可能的实施例中，所提出的神经元培养物自动监控系统可以使用监控中的腔室的平均颜色的方法来检测溢出。为此，例如每小时根据等式1计算值D：

(等式1)D＝Abs(R-R’)+Abs(G-G’)+Abs(B-B’)，

其中Abs是绝对值，R是显示该腔室(图1b，120)的当前图像的一组红色分量的平均值，R’是一小时前的相同图像；G是显示该腔室(图1b，120)的当前图像的一组绿色分量的平均值，G’是一小时前的相同图像；B是显示该腔室(图1b，120)的当前图像的一组蓝色分量的平均值，B’是一小时前的相同图像。

接下来，如果D大于预定义的阈值，则发出警报。例如，在实践中，计算机可能会向操作员的连接的手表发送信号，因此他会立即得到通知。此外，泵可能会停止运行，直到操作员重新启动它。

实验

图8示出了根据本公开的一些实施例的并行操作的四个神经元细胞培养物监控小型实验室，每个小型实验室具有其自己的微流体系统：

·图8a)和d)：注射泵(SyringeOne，NewEra)，其被编程为以25μl/hr的恒定流量将营养液推动到MEA生物芯片(MEA1，MEA4)上，该MEA生物芯片向上放置并沿第一轴线倾斜，使得其出口、其废物收集器储存库(Falcon50)和连接后者的软管放置在MEA生物芯片装置下方。

·图8b)：蠕动泵(BT100-2J，Longer)，编程为每10分钟持续1mn以0.1rpm(相当于10μl/mn)的速度将营养液推动到MEA生物芯片(MEA2)上，该MEA生物芯片向上放置并沿第一轴线倾斜，使得其出口、其废物收集器储存库(Falcon50)和连接后者的软管放置在MEA生物芯片装置下方。

·图8c)：蠕动泵(BT100-2J，Longer)，编程为每10分钟持续1mn以0.1rpm(相当于10μl/mn)的速度将营养液推动到MEA生物芯片(MEA3)上，该MEA生物芯片向上放置并沿第一轴线倾斜，使得其出口、废物收集器储存库(Falcon50)和连接后者的软管位于MEA生物芯片装置下方。

用计算机视觉系统监控图8的MEA生物芯片的细胞培养物，该系统定期捕捉细胞和下面的空气-液体界面的图像，以便检测任何有害事件，例如2D气泡、3D气泡或液体溢出。图9示出了2D气泡在第一时间戳的出现以及在第二时间戳的去除。

在一个实验中，还测试了使用图7的自动化系统的推动和抽吸策略的组合，使用计算机视觉系统760捕获MEA细胞培养物100的图像，并使用中央处理计算系统700以闭环自动化模式命令泵710。可以用蠕动泵以1rpm的速率推动液体营养物，相当于35μl/min，每6小时持续5分钟(相当于总共175μl/hr，即位于如图2所示的多孔膜120的边缘260、270之间的空气-液体界面下方的微流体通道部分的体积的一半)。如果需要，可以对蠕动泵进行编程，以10-15rpm的速度切换到临时抽吸模式并且在每小时持续4-7秒，然后以每分钟1rpm的速度推动持续5分钟。这些参数可以根据度量(反馈回路)进行调整。例如，中央处理计算系统700接收由计算机视觉系统捕获的图像，并利用经训练的人工神经网络工具(ANN)提取在两个不同时间戳形成的检测到的2D气泡的图像。或者其他。对ANN的输出图像进行后处理，以测量2D气泡的尺寸度量。如果2D气泡大小落在两个预定阈值之间的区间内，则算法命令尝试临时抽吸策略来进一步去除2D气泡。

其他实施例和应用

作为蠕动泵或注射器驱动装置的替代物，可以使用其他类型的泵，如微型齿轮泵，特别是微型环形齿轮泵，这可以简化长期24/7全自动操作的维护操作。这些微型齿轮泵优于注射泵，因为它避免了重新填充注射器的任何操作。与蠕动泵相比，微型齿轮泵的抗老化能力更强，因为随着时间的推移，管的压缩可能会导致破裂。

作为所提出的系统布置的替代实施例，其中泵放置在MEA生物芯片的上游以将液体推向空气-液体界面，泵可以放置在微流体通道的下游部分，以有规律地以抽吸模式操作(抽吸而不是将液体从液体分配器推向废物收集器)。利用这种配置，系统的几何形状可以被布置成将微流体通道入口和任何上游部件(包括但不限于液体分配器)放置在MEA生物芯片ALI上方，以产生重力辅助推动来补充抽吸泵送作用。

虽然本公开主要描述了示例性实施例，其中MEA生物芯片包括直接布置在空气-液体界面多孔膜120和细胞培养物100之间的电极125，但是其他MEA布置也是可能的。例如，自动细胞监测系统可以采用与微流体系统的ALI多孔膜分开布置的条形MEA和/或高密度CMOSMEA。特别是，MEA电极不一定位于细胞培养物下面。

虽然本公开主要描述了示例性实施例，其中空气-液体界面下方的微流体通道和空气-液体界面集成在生物芯片装置的刚性塑料支撑件上(图1)，但是其他布置也是可能的。在可能的替代实施例中，空气-液体界面和微流体通道可由柔性材料制成，以更好地适应细胞培养物类器官的形状。

虽然本公开主要描述了生物芯片装置的微流体通道的入口和出口垂直布置(顶部装载)的示例性实施例(图1)，但是其他布置也是可能的。在一个可能的替代实施例中，入口和/或出口可以平行于微流体通道布置(直列式)。更一般地，入口可以是有助于液体进入微流体通道朝向空气-液体界面的任何元件，而出口可以是有助于液体从微流体通道中释放出来远离空气-液体界面的任何元件。

虽然上面已经描述了各种实施例，但是应该理解它们是通过示例而非限制的方式呈现的。对相关领域的技术人员来说显而易见的是，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以在形式和细节上进行各种改变。事实上，在阅读以上描述后，相关领域的技术人员将清楚如何实现替代实施例。

尽管上面的详细描述包含许多具体细节，但是这些不应被解释为限制实施例的范围，而是仅提供几个实施例中的一些的说明。

虽然上面已经描述了各种实施例，但是应该理解它们是通过示例而非限制的方式呈现的。对相关领域的技术人员来说显而易见的是，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以在形式和细节上进行各种改变。事实上，在阅读以上描述后，相关领域的技术人员将清楚如何实现替代实施例。

此外，应当理解，任何突出功能和优点的附图仅出于示例目的而给出。所公开的方法足够灵活和可配置，使得它们可以以不同于所示的方式被利用。

尽管术语“至少一个”可能经常在说明书、权利要求书和附图中使用，但是术语“一”(“a”“an”)、“该”(“the”)、“所述”(“said”)等也表示说明书、权利要求书和附图中的“至少一个”或“该至少一个”。

在整个说明书中，多个实例可以实现被描述为单个实例的组件、操作或结构。尽管一个或多个方法的各个操作被示出并描述为单独的操作，但是一个或多个单独的操作可以同时执行，并且不要求这些操作以所示的顺序执行。在示例配置中作为单独组件呈现的结构和功能可以实现为组合的结构或组件。类似地，作为单个组件呈现的结构和功能可以作为单独的组件来实现。这些和其他变化、修改、添加和改进落入本文主题的范围内。

某些实施例在此被描述为包括逻辑或多个组件、模块、单元或机制。模块或单元可以构成软件模块(例如，机器可读介质上或传输信号中包含的代码)或硬件模块。“硬件模块”是能够执行特定操作的有形单元，并且可以以特定的物理方式配置或布置。在各种示例实施例中，一个或多个计算机系统(例如，独立计算机系统、客户端计算机系统或服务器计算机系统)或计算机系统的一个或多个硬件模块(例如，处理器或一组处理器)可以由软件(例如，应用程序或应用程序部分)配置为硬件模块，该硬件模块用于执行本文所描述的特定操作。

在一些实施例中，硬件模块可以机械地、电子地、生物地或其任何合适的组合来实现。例如，硬件模块可以包括被永久配置为执行某些操作的专用电路或逻辑。例如，硬件模块可以是专用处理器，例如现场可编程门阵列(FPGA)或ASIC。硬件模块还可以包括由软件临时配置来执行某些操作的可编程逻辑或电路。例如，硬件模块可以包括通用处理器或其他可编程处理器中包含的软件。应当理解，在专用和永久配置的电路中或者在临时配置的电路(例如，由软件配置的电路)中机械地实现硬件模块的决定可以由成本和时间考虑来驱动。随着合成生物学的发展，硬件模块的全部或部分可能由生物细胞制成，如神经球和/或基因工程细胞(也称为湿件)。

本文描述的示例方法的各种操作可以至少部分地由临时配置(例如，通过软件)或永久配置来执行相关操作的一个或多个处理器来执行。无论是临时配置还是永久配置，这些处理器都可以构成处理器实现的模块，其用于执行本文所述的一个或多个操作或功能。如本文所使用的“处理器实现的模块”指的是使用一个或多个处理器实现的硬件模块。

类似地，本文描述的方法可以至少部分由处理器实现，处理器是硬件的一个示例。例如，方法的至少一些操作可以由一个或多个处理器或处理器实现的模块来执行。

本文讨论的主题的一些部分可以按照对在机器存储器(例如，计算机存储器)中存储为比特或二进制数字信号的数据的操作的算法或符号表示来呈现。这种算法或符号表示是数据处理领域的普通技术人员用来向本领域的其他技术人员传达其工作实质的技术示例。如本文所使用的，“算法”是导致期望结果的操作或类似处理的自洽序列。在这种情况下，算法和操作涉及物理量的物理操作。

尽管已经参考特定示例实施例描述了本发明主题的概述，但是在不脱离本发明实施例的更广泛精神和范围的情况下，可以对这些实施例进行各种修改和改变。例如，本领域普通技术人员可以混合和匹配或选择其各种实施例或特征。本发明主题的这些实施例在本文中可以单独或集体地称为术语“发明”，这仅仅是为了方便起见，如果实际上公开了一个以上的发明或发明概念，则并不意图将本申请的范围自愿限制为任何单个发明或发明概念。

能够相信的是，对本文所示实施例的描述足够详细，以使本领域技术人员能够实践所公开的教导。可以使用其他实施例并从中衍生出其他实施例，从而可以在不脱离本公开的范围的情况下进行结构和逻辑上的替换和改变。因此，具体实施方式不应被理解为限制性的，并且各种实施例的范围仅由所附权利要求以及这些权利要求授权的等效物的全部范围来定义。

此外，可以为本文作为单个实例描述的资源、操作或结构提供多个实例。此外，各种资源、操作、模块、引擎和数据存储之间的边界在某种程度上是任意的，并且特定操作是在特定说明性配置的上下文中示出的。功能的其他分配是可以预见的，并且可以落在本发明的各种实施例的范围内。一般而言，在示例配置中作为单独资源呈现的结构和功能可以实现为组合的结构或资源。类似地，作为单个资源呈现的结构和功能可以作为单独的资源来实现。这些和其他变化、修改、添加和改进落入由所附权利要求表示的本发明实施例的范围内。因此，说明书和附图应被视为说明性的而非限制性的。

Claims (19)

1.一种用于在空气-液体界面上维持至少一种细胞培养物存活的微流体系统，包括：

-微流体通道，布置成通过所述空气-液体界面的一个或多个多孔膜向所述细胞培养物提供液体灌注，

-至少一个泵送装置，被布置成使液体循环通过微流体通道，

其特征在于：

-所述至少一个泵送装置适于推动液体通过所述微流体通道的入口，然后通过所述微流体通道在所述空气-液体界面下方的区域，然后通过所述微流体通道的出口，其中所述至少一个泵送装置被编程为以大约1μl/hr至大约100μl/hr之间的平均流速推动液体，或者至少一个泵送装置被编程为以间歇流速推动液体。

2.根据权利要求1所述的微流体系统，还包括：

-第二泵送装置，适于抽吸液体通过所述微流体通道的入口，然后通过所述微流体通道在空气-液体界面下方的区域，然后通过微流体通道的出口，其中所述第二泵送装置被编程为以大约1μl/hr至大约100μl/hr之间的平均流速抽吸液体，或者所述第二泵送装置被编程为以间歇流速抽吸液体。

3.根据权利要求1所述的微流体系统，其中所述至少一个泵送装置被编程为从推动模式切换到临时抽吸模式。

4.一种用于在空气-液体界面上维持至少一种细胞培养物存活的微流体系统，包括：

-微流体通道，布置成通过所述空气-液体界面的一个或多个多孔膜向所述细胞培养物提供液体灌注，

-至少一个泵送装置，被布置成使液体循环通过所述微流体通道，

其特征在于：

-所述至少一个泵送装置适于推动液体通过所述微流体通道的入口，然后通过所述微流体通道在空气-液体界面下方的区域，然后通过所述微流体通道的出口，并且还包括：

-第二泵送装置，适于抽吸液体通过所述微流体通道的入口，然后通过所述微流体通道在所述空气-液体界面下方的区域，然后通过微流体通道的出口。

5.根据权利要求1-4所述的微流体系统，其特征还在于，所述微流体通道的出口位于与所述微流体系统中的空气-液体界面的多孔膜相同或更低的高度。

6.一种用于在空气-液体界面上维持至少一种细胞培养物存活的微流体系统，包括：

-微流体通道，布置成通过所述空气-液体界面的一个或多个多孔膜向所述细胞培养物提供液体灌注，

-至少一个泵送装置，被布置成使液体循环通过微流体通道，

其特征在于：

-所述至少一个泵送装置适于推动液体通过所述微流体通道的入口，然后通过所述微流体通道在所述空气-液体界面下方的区域，然后通过微流体通道的出口；

-所述微流体通道的出口位于与所述微流体系统中的空气-液体界面的多孔膜相同或更低的高度。

7.根据权利要求5或6所述的微流体系统，还包括废物收集器，用于收集从所述微流体通道的出口推出的液体，其特征在于，所述废物收集器和将所述出口连接到所述废物收集器的任何微流体元件位于与所述微流体系统中的空气-液体界面的多孔膜相同或更低的高度。

8.根据前述权利要求中任一项所述的微流体系统，其特征在于，所述微流体通道和所述空气-液体界面是倾斜的，使得所述微流体通道出口位于与所述空气-液体界面的多孔膜相同或更低的高度。

9.根据权利要求8所述的微流体系统，其特征在于，所述微流体通道和所述空气-液体界面布置在所述微流体系统中的刚性平面支撑件上，并且所述刚性平面支撑件倾斜，使得所述微流体通道出口位于与所述空气-液体界面的多孔膜相同的高度或更低的高度。

10.根据前述权利要求中任一项所述的微流体系统，其特征在于，所述微流体通道的入口低于所述微流体系统中的微流体通道的出口。

11.根据权利要求10所述的微流体系统，其特征在于，所述微流体通道倾斜，使得所述微流体通道的入口低于微流体系统中的微流体通道的出口。

12.根据权利要求11所述的微流体系统，其特征在于，所述微流体通道设置在微流体系统中的刚性平面支撑件上，并且所述刚性平面支撑件倾斜，使得所述微流体通道的入口低于所述微流体系统中的微流体通道的出口。

13.根据前述权利要求中任一项所述的微流体系统，其中所述泵送装置是可编程蠕动泵、注射驱动器或微型齿轮泵。

14.根据权利要求6所述的微流体系统，其中所述至少一个泵送装置被编程为以大约1μl/hr至大约100μl/hr的平均流速推动液体。

15.根据权利要求6所述的微流体系统，其中所述至少一个泵送装置被编程为以大约1μl/mn或10μl/mn的间歇流速在每大约10mn至60mn持续30s至大约5min之间推动液体。

16.根据前述权利要求中任一项所述的微流体系统，还包括计算机视觉图像处理系统和中央处理计算系统，其适于：

-用所述计算机视觉图像处理系统检测图像特征；

-用所述中央处理计算系统根据检测到的图像特征对所述泵送装置的流动方向、流速和流动持续时间进行编程。

17.根据权利要求16所述的微流体系统，还适于：

-使用经训练的机器学习模型检测气泡或液体溢出，

-根据检测到的气泡或液体溢流，用所述中央处理计算系统以预定配置对所述泵送装置的流动方向、流速和流动持续时间进行编程。

18.根据权利要求17所述的微流体系统，还适于：

-响应于检测到的气泡或液体溢流，根据由经训练的机器系统学习的配置，用所述中央处理计算系统对所述泵送装置的流动方向、流速和流动持续时间进行编程。

19.根据前述权利要求中任一项所述的微流体系统，还包括电生理学信号处理系统，其适于：

-用所述电生理学信号处理系统检测细胞培养物电生理学信号的信号特征；

-根据检测到的信号特征对泵送装置的流动方向、流速和流动持续时间进行编程。