CN118139887A - 抗cd25抗体 - Google Patents
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Abstract
本发明中公开的是使用多肽的材料和方法,所述多肽含有结合人CD25的(多个)人源化抗体或其(多个)部分的片段和变体。本发明可以单独或与其他抗肿瘤剂组合用于治疗受试者以减少或消除调节性T细胞、增加效应T细胞并治疗癌症。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年8月25日提交的申请号为63/237,100的美国临时申请、2022年2月21日提交的申请号为63/312,213的美国临时申请和2022年5月6日提交的申请号为63/339,182的美国临时申请的优先权,这些美国临时申请的全部内容通过引用并入本文。
发明的技术领域
本文件涉及用于治疗癌症的材料和方法,具体地涉及抗CD25抗体减少或消除调节性T细胞、增加效应T细胞和治疗癌症的用途。
通过引用并入以光盘提交的材料
本申请包括序列表,其已经经由EFS-Web以ASCII格式提交,并且特此通过引用以其整体并入。所述ASCII副本创建于2022年8月22日,被命名为txt_IBIO2014WO.xml并且大小为16,384字节。
发明背景
在不限制本发明的范围的情况下,结合CD25(IL-2受体的α链)描述其背景。
人类的CD25(其为白介素-2受体的α链)是由IL2RA基因编码的蛋白质。白介素2(IL2)受体α(IL2RA)链、(IL2RB)链和γ链(IL2RG)一起形成高亲和力IL-2受体。同二聚体α链(IL2RA)产生低亲和力受体。同二聚体β(IL2RB)链产生中等亲和力受体。
CD25由调节性T细胞表达。调节性T细胞组成性表达CD25,并起到抑制效应T细胞的扩增,以及维持健康状态并抑制效应T细胞针对自身抗原的反应或对外来抗原的过度反应的作用。在增殖性疾病的情况下,癌细胞通过增加调节性T细胞的量从而限制针对它们的效应T细胞的产生而使健康的免疫反应失效。
需要的是改变表达CD25的调节性T细胞的增殖的新试剂,例如来抑制免疫系统用于癌症治疗或来上调免疫系统用于自身免疫疾病。
发明概述
如本文体现和广泛描述的,本公开内容的一方面涉及结合人CD25的人源化抗体或结合片段,其中抗体或其结合片段包含:SEQ ID NO:1或9的可变重链氨基酸序列,或包含与其至少70%序列同一性的序列;和SEQ ID NO:4或11的可变轻链氨基酸序列,或包含与其至少70%序列同一性的序列。一方面,抗体或结合片段包含SEQ ID NO:1或9的可变重链氨基酸序列,或包含与SEQ ID NO:1或9至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的序列。另一方面,抗体或结合片段包含SEQ ID NO:4或11的可变轻链氨基酸序列,或包含与SEQ ID NO:4或11至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的序列。另一方面,编码SEQ ID NO:1或9的核酸分别具有与SEQ ID NO:2、3或10所示的核酸序列至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性。另一方面,编码SEQ ID NO:4或11的核酸分别具有与SEQ ID NO:5、6或12所示的核酸序列至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性。另一方面,编码SEQ ID NO:4或9的核酸是为在植物中表达而优化的序列。另一方面,抗体还包含一个或多个框架区的突变。另一方面,抗体结合人CD25和食蟹猴CD25,但不结合小鼠或大鼠CD25。另一方面,与人CD25和食蟹猴CD25的结合的EC50比率为约0.75至约1.25。另一方面,抗体是非岩藻糖基化的。另一方面,抗体在CHO细胞或植物细胞的活细胞中(in cellulo)是非岩藻糖基化的。另一方面,在与抗体或结合片段接触时,抗体或结合片段提高效应T细胞功能。
在另一实施方案中,本发明是包含上述人源化CD25抗体或其片段中的任一种的药物组合物。
在另一实施方案中,本发明是编码上述人源化CD25抗体中的任一种的分离的核酸序列。
在另一实施方案中,本发明是包含上述分离的核酸的表达载体。
在另一实施方案中,本发明是包含上述核酸序列的载体。
在另一实施方案中,本发明是治疗有其需要的受试者的方法,其包括给予受试者治疗有效量的上述人源化CD25抗体中的任一种或药物组合物。
在另一实施方案中,本发明是消耗受试者中调节性T细胞的数量的方法,其包括给予受试者治疗有效量的上述人源化CD25抗体中的任一种或药物组合物。一方面,受试者患有癌症。另一方面,受试者患有自身免疫相关疾病或障碍。另一方面,提供给受试者共同治疗。
在另一实施方案中,本发明是消耗包含外周血单核细胞的样品中调节性T细胞的数量的方法,其包括使样品与上述人源化CD25抗体中的任一种接触。
在另一实施方案中,本发明是包含上述抗体中的任一种或药物组合物的药盒。
在另一实施方案中,本发明是包含上述表达载体的根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)细胞。
在另一实施方案中,本发明是制备具有抗癌活性的多肽的方法,该方法包括:(a)将包含编码具有抗癌活性的SEQ ID NO:1和2的多肽的多核苷酸的植物病毒载体导入植物;以及(b)以足以使多肽在至少一些植物细胞中表达的条件和时间维持植物。另一方面,导入包括真空渗入。另一方面,植物包含具有抗癌活性的多肽。另一方面,具有抗癌活性的多肽来自植物。另一方面,多肽具有抗癌活性。
附图说明
为了更完整地理解本发明的特征和优点,现在参考本发明的详细描述以及附图,其中:
图1是显示回收的在植物表达系统中表达的抗体的考马斯蓝染色凝胶,在野生型植物中制备的抗CD25抗体也称为SD-889825-PW-A(IBIO-101,野生型植物),在c-105植株中制备的抗CD25抗体是SD-889825-PC-A(IBIO-101,c-105植物非岩藻糖基化的)。
图2是植物制备的hD11重链和轻链(C105植物)的质量的代表性质谱分析。
图3显示从植物制备的hD11(C105植物)释放的聚糖的质谱分析,hD11不采用岩藻糖制备以促进体内高ADCC活性。
图4是显示HPLC的图,其显示出在植物中产生的抗体的纯度。
图5是显示轻链的质谱表征去卷积MW的图。
图6是显示去糖基化重链的质谱表征去卷积MW的图。
图7是显示糖基化重链的质谱表征去卷积MW的图。
图8是显示完整的去糖基化样品的质谱表征去卷积MW的图。
图9是显示完整的糖基化样品的质谱表征去卷积MW的图。
图10是显示人CD25的CD25结合ELISA图的图。
图11是显示食蟹猴CD25的CD25结合ELISA图的图。
图12是显示小鼠CD25的CD25结合ELISA图的图。
图13显示IBIO-101表现出与SUDHL-1人淋巴瘤细胞系上内源性表达的CD25的强结合。
图14显示CHO和植物非岩藻糖基化的IBIO-101类似地增强了针对SUDHL-1人淋巴瘤细胞系的ADCC效力。
图15是显示IBIO-101分子不抑制IL2/STAT5信号传导途径的图。
图16显示本发明抗体的Western印迹和考马斯蓝染色凝胶,在野生型植物中制备的抗CD25抗体也称为SD-889825-PW-A(IBIO-101,野生型植物),在c-105植株中制备的抗CD25抗体是SD-889825-PC-A(IBIO-101,c-105植物非岩藻糖基化的)。
图17A至17E显示使用Carterra LSA表征的结合CD25的单克隆抗体(IBIO-101)的结合,图17A是在CHO细胞中制备的野生型Ab IBIO-101,图17B是在植物细胞中制备的野生型Ab IBIO-101,图17C是在CHO细胞中制备的非岩藻糖基化的IBIO-101,图17D是在植物细胞中制备的非岩藻糖基化的IBIO-101,图17E是达克珠单抗。
图18显示IBIO-101表现出与诱导型人Treg(iTreg)上内源性表达的CD25的强结合。
图19显示CHO和植物非岩藻糖基化的IBIO-101类似地增强了针对诱导型人Treg(iTreg)的ADCC效力。
图20显示非岩藻糖基化的IBIO-101表现出强的SUDHL-1人淋巴瘤细胞杀伤。
图21显示IBIO-101分子显示出与表达CD25的SUDHL-1和诱导型人Treg(iTreg)细胞的高结合,但与其他主要免疫细胞的低结合。
图22显示IBIO-101分子未显示出与泛B细胞(Pan B cell)的特异性结合。FACS分析显示在CHO和植物中制备的WT岩藻糖基化和非岩藻糖基化的IBIO-101分子以及达克珠单抗与泛B细胞类似地结合。
图23显示iTreg消耗测定门控策略。
图24显示代表性FACS图的iTreg消耗,其显示出在iTreg、活化的CD4+和活化的CD8+细胞中用hIgG1同种型、达克珠单抗、IBIO-101-植物-afuc和IBIO-101-CHO-afuc处理的细胞毒性百分比。
图25A至25D显示在iBio-101处理后诱导型人Treg(iTreg)的选择性消耗。
图26是显示hCD25TG小鼠中iBio-101药代动力学曲线的图。
图27显示iBio-101体内功效研究设计。
图28是显示所有组的iBio-101体内功效研究结果-体重(BW)的图。
图29是显示iBio-101体内功效研究结果-肿瘤体积的结果的图。
图30A显示功效研究中Treg的门控策略-第3天血液样品FACS分析。
图30B显示功效研究中CD4+和CD8+效应细胞的门控策略-第3天血液样品FACS分析。
图31显示来自功效研究的给药后第3天的血液样品的代表性FACS图的FACS分析,其显示出用hIgG1同种型、IBIO-101-CHO-afuc和IBIO-101-植物-afuc处理后血液中的Treg百分比。
图32A至32E显示IBIO-101分子在功效研究的处理后3天减少血液中的Treg细胞。
详述
虽然下面详细讨论了本发明的各种实施方案的形成和使用,但是应当理解,本发明提供了许多可以在多处特定上下文中体现的可应用的发明构思。本文讨论的具体实施方案仅仅是形成和使用本发明的特定方式的说明,并不界定本发明的范围。
为了便于理解本发明,下面定义了多个术语。本文定义的术语具有如本发明相关领域的普通技术人员通常理解的含义。术语诸如“一(a)”、“一个(an)”和“所述(the)”并不旨在仅指单数实体,而是包括其具体实例可用于说明的一般类别。本文中的术语用于描述本发明的具体实施方案,但它们的使用不界定本发明,除非在权利要求中概述。
术语:为了便于审阅本公开内容的各种实施方案,提供了以下对特定术语的解释。
除非另有注明,否则根据常规用法使用技术术语。分子生物学中常见术语的定义可见于Benjamin Lewin,Genes V,Oxford University Press出版,1994(ISBN 0-19-854287-9);Kendrew等人(编著),The Encyclopedia of Molecular Biology,BlackwellScience Ltd.出版,1994(ISBN 0-632-02182-9);和Robert A.Meyers(编著),Molecular Biology and Biotechnology:A Comprehensive Desk Reference,VCH Publishers,Inc.出版,1995(ISBN 1-56081-569-8),相关部分通过引用并入本文。
动物:活的多细胞脊椎动物生物体,种类包括例如哺乳动物和鸟类。术语哺乳动物包括人和非人哺乳动物。类似地,术语“受试者”包括人和兽医受试者。
cDNA(互补DNA):一段缺少内部非编码片段(内含子)和决定转录的调控序列的DNA。cDNA由提取自细胞的信使RNA通过逆转录在实验室中合成。
保守性变体:“保守性”氨基酸取代是基本上不影响或降低(多个)抗体或其(多个)部分的活性的那些取代,诸如多肽单独或与另一种抗肿瘤治疗组合预防、减少或消除癌症和/或调节性T细胞的能力。保守性取代的具体非限制性实例包括以下:
原始残基 | (多种)保守性取代 |
Ala | Ser |
Arg | Lys |
Asn | Gln,His |
Asp | Glu |
Cys | Ser |
Gln | Asn |
Glu | Asp |
His | Asn;Gln |
Ile | Leu,Val |
Leu | Ile;Val |
Lys | Arg;Gln;Glu |
Met | Leu;Ile |
Phe | Met;Leu;Tyr |
Ser | Thr |
Thr | Ser |
Trp | Tyr |
Tyr | Trp;Phe |
Val | Ile;Leu |
术语保守性变异还包括使用取代的氨基酸代替未取代的亲本氨基酸,前提是针对取代的多肽产生的抗体也与未取代的多肽发生免疫反应。非保守性取代是降低活性,诸如蛋白质抑制纤维化的能力的取代。
如本文所用,过渡短语“由......组成”是指多肽,基本上由指定氨基酸序列组成的多肽不包含任何另外的氨基酸残基。由指定氨基酸序列组成的多肽不包含任何另外的氨基酸残基,其也不包含另外的生物组分,诸如核酸脂质、糖,其也不包含标记物。
过渡短语“基本上由......组成”是指可包含另外的非肽组分的多肽,非肽组分诸如标记物(例如,荧光、放射性或固体颗粒标记物)、糖或脂质,其不实质上影响多肽的基本和新颖的特征。由指定氨基酸序列组成或基本上由指定氨基酸序列组成的多肽可以被糖基化或具有酰胺修饰。就多核苷酸而言,基本上由指定核酸序列组成的多核苷酸不包含任何另外的核酸残基。然而,多核苷酸可包含另外的非核酸组分,诸如标记物(例如,荧光、放射性或固体颗粒标记物)或多肽,其不实质上影响多核苷酸的(多种)基本和新颖的特征。由指定核酸序列组成的多核苷酸不包含任何另外的核酸残基,其也不包含另外的生物组分或标记物。
简并变体:一种编码多肽的多核苷酸,该多核苷酸包含由于遗传密码而简并的序列。有20种天然氨基酸,其中大多数由多于一种的密码子指定。因此,只要由核苷酸序列编码的抗体多肽的氨基酸序列不变,所有简并核苷酸序列均包括在本公开内容中。
表达控制序列:与异源核酸序列可操作地连接的调节其表达的核酸序列。当表达控制序列控制和调节核酸序列的转录和视情况而定地控制和调节核酸序列的翻译时,表达控制序列可操作地连接至核酸序列。因此,表达控制序列可包括适当的启动子、增强子、转录终止子、蛋白质编码基因前的起始密码子(即,ATG)、内含子的剪接信号、保持该基因的正确阅读框以允许mRNA正确翻译,以及终止密码子。术语“控制序列”旨在至少包括其存在可以影响表达的组分,并且还可包括其存在是有利的另外的组分,例如,前导序列和融合伴侣序列。表达控制序列可包括启动子。
启动子是足以指导转录的最小序列。足以使启动子依赖性基因表达针对细胞类型特异性、组织特异性可控,或可由外部信号或试剂诱导的那些启动子元件也包括在内;这样的元件可以位于基因的5’区或3’区中。组成型和诱导型启动子都包括在内(参见例如,Bitter等人,Meth Enzymol 153:516-544,1987)。例如,当在细菌系统中克隆时,可以使用诱导型启动子,诸如噬菌体λ的pL、plac、ptrp、ptac(ptrp-lac杂合启动子)等。在一些实施方案中,当在哺乳动物细胞系统中克隆时,可以使用源自哺乳动物细胞基因组的启动子(诸如金属硫蛋白启动子)或源自哺乳动物病毒的启动子(诸如逆转录病毒长末端重复序列;腺病毒晚期启动子;痘苗病毒7.5K启动子)。通过重组DNA或合成技术产生的启动子也可用于提供核酸序列的转录。
宿主细胞:可以在其中增殖载体并表达其DNA的细胞。细胞可以是原核细胞或真核细胞。细胞可以是哺乳动物细胞,诸如人细胞。该术语还包括主题宿主细胞的任何子代。应理解,所有子代可能不与亲本细胞完全一样,因为可能有在复制期间发生的突变。然而,当使用术语“宿主细胞”时,包括这样的子代。
抑制或治疗疾病:抑制诸如癌症的疾病是指抑制疾病的全面发展。在几个实例中,抑制疾病是指减少或消除癌症。“治疗”是指改善疾病的体征或症状,或与疾病相关的病理状态,诸如癌症的治疗性干预。
分离的:“分离的”生物组分(诸如核酸或蛋白质或细胞器)已经基本上与其中天然存在该组分的生物体细胞中的其他生物组分分离或从中纯化出来,所述其他生物组分例如其他染色体和染色体外DNA和RNA、蛋白质和细胞器。已经“分离的”核酸和蛋白质包括通过标准纯化方法纯化的核酸和蛋白质。该术语还包括通过在宿主细胞中重组表达制备的核酸和蛋白质以及化学合成的核酸。
标记物:一种可检测的化合物或组合物,其直接或间接与另一分子缀合以促进该分子的检测。标记物的具体非限制性实例包括荧光标签、酶连接和放射性同位素。
接头序列:接头序列是共价连接两个多肽结构域的氨基酸序列。接头序列可包括在本文公开的抗体或其部分之间,以向连接的多肽结构域提供旋转自由度,从而促进正确的结构域折叠和向MHC的呈递。例如,在含有抗体多肽的重组多肽中,可以在它们之间提供接头序列,诸如含有抗体或其部分-接头-抗体或其部分的多肽。长度一般在2至25个氨基酸之间的接头序列是本领域熟知的,包括但不限于Chaudhary等人,Nature 339:394-397,1989描述的甘氨酸(4)-丝氨酸间隔区(×3)。
哺乳动物:该术语包括人和非人哺乳动物。类似地,术语“受试者”包括人和兽医受试者。
寡核苷酸:长度为最多约100个核苷酸碱基的线性多核苷酸序列。
开放阅读框(ORF):编码氨基酸的无任何内部终止密码子的一系列核苷酸三联体(密码子)。这些序列通常可翻译成多肽。
可操作地连接的:当第一核酸序列与第二核酸序列处于功能性关系中时,第一核酸序列与第二核酸序列可操作地连接。例如,如果启动子影响编码序列,诸如编码(多个)抗体或其(多个)部分的序列的转录或表达,则启动子可操作地连接到编码序列。一般,可操作地连接的DNA序列是连续的,并且当必需连接两个蛋白编码区时,其在同一阅读框中。
肽修饰:抗体或其部分包括本文所述多肽的合成实施方案。另外,这些蛋白质的类似物(非肽有机分子)、衍生物(从公开的多肽序列开始获得的化学官能化的多肽分子)和变体(同源物)可用于本文所述的方法中。本公开内容的每种多肽由氨基酸序列组成,所述氨基酸可以是天然存在的或以其他方式存在的L-和/或D-氨基酸。
药学上可接受的载体:使用的药学上可接受的载体是常规的。E.W.Martin的Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,第15版(1975)描述了适用于本文公开的融合蛋白的药物递送的组合物和制剂,相关部分通过引用并入本文。
一般,载体的性质将取决于所采用的具体给药方式。例如,肠胃外制剂通常包括可注射流体,该可注射流体包括药学上和生理学上可接受的流体,诸如水、生理盐水、平衡盐溶液、葡萄糖水溶液、甘油等作为溶媒。对于固体组合物(诸如粉末、丸剂、片剂或胶囊形式),常规无毒固体载体可包括例如医药级甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除了生物学上的中性载体之外,待给予的药物组合物可含有少量无毒的辅助物质,诸如润湿剂或乳化剂、防腐剂和pH缓冲剂等,例如乙酸钠或脱水山梨糖醇单月桂酸酯。
“治疗有效量”是在所治疗的受试者中实现期望效果的组合物的量。例如,这可以是诱导免疫反应、抑制癌症、减少瘢痕体积或可测量地改变纤维化病症的外部症状所必需的量。当给予受试者时,一般将使用将实现靶组织浓度(例如,在皮肤细胞或肺组织中)的剂量,该浓度已显示实现了体外效果。
多核苷酸:术语多核苷酸或核酸序列是指长度为至少10个碱基的聚合形式的核苷酸。重组多核苷酸包括与其所源自的生物体天然存在的基因组中与其直接邻接的两个编码序列(一个在5’端并且一个在3’端)不直接邻接的多核苷酸。因此,该术语包括例如结合至载体中的重组DNA;结合至自主复制质粒或病毒中的重组DNA;或结合至原核生物或真核生物基因组DNA中的重组DNA,或作为独立于其他序列的单独分子(例如,cDNA)存在的重组DNA。核苷酸可以是核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或任一核苷酸的修饰形式。该术语包括单链和双链形式的DNA。
肽或多肽:任何氨基酸链,无论长度或翻译后修饰(例如,糖基化或磷酸化)如何。在一些实施方案中,多肽是(多个)抗体或其(多个)部分。多肽的长度可以在5至60个氨基酸之间。在一些实施方案中,多肽的长度为约10至约55个氨基酸。在又一实施方案中,多肽的长度为约20至约50个氨基酸。在又一实施方案中,多肽的长度为约50个氨基酸。就多肽而言,词语“约”表示整数量。因此,在一个实例中,长度为“约”50个氨基酸的多肽的长度为49至51个氨基酸。在一些实施方案中,多肽可以是多聚体形式。
翻译后修饰:新形成的蛋白质的修饰;可涉及氨基酸的缺失、某些氨基酸到某些氨基酸的化学修饰(例如,酰胺化、乙酰化、磷酸化、糖基化、焦谷氨酸酯的形成、甲硫氨酸上的磺胺基团的氧化/还原,或类似小分子的添加)。
探针和引物:探针包括连接到可检测标记物或报告分子的分离的核酸。引物是长度为约15个核苷酸或更长的短核酸,优选DNA寡核苷酸。引物可以通过核酸杂交与互补的靶DNA链退火,以在引物和靶DNA链之间形成杂交体,然后通过DNA聚合酶沿着靶DNA链延伸。引物对可用于扩增核酸序列,例如通过聚合酶链式反应(PCR)或本领域已知的其他核酸扩增方法。本领域技术人员将理解,特定探针或引物的特异性随其长度而增加。因此,例如,与仅15个核苷酸的相应引物相比,含有20个连续核苷酸的引物将以更高的特异性与靶退火。因此,为了获得更高的特异性,可以选择含有约20、25、30、35、40、50或更多个连续核苷酸的探针和引物。
纯化的:本文公开的抗体或其部分可以通过本领域已知的任何方法来纯化(和/或合成)(参见,例如,Guide to Protein Purification,Deutscher编著,Meth.Enzymol.185,Academic Press,San Diego,1990;和Scopes,Protein Purification:Principles and Practice,Springer Verlag,New York,1982),相关部分通过引用并入本文。基本纯化表示从其他蛋白质或细胞组分中纯化。基本上纯化的蛋白质的纯度是至少约60%、70%、80%、90%、95%、98%或99%。因此,在一个具体非限制性实例中,基本上纯化的蛋白质90%不含其他蛋白质或细胞组分。
天然抗体和免疫球蛋白通常是约150000道尔顿的异四聚体糖蛋白,由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接。而二硫键的数量随不同免疫球蛋白同种型的重链变化。每条重链和轻链还具有规则间隔的链内二硫键。每条重链在一端具有可变结构域(VH),随后是多个恒定结构域。每条轻链在一端具有可变结构域(VL),在其另一端具有恒定结构域。轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域对齐,轻链可变结构域与重链的可变结构域对齐。特定氨基酸残基被认为在轻链和重链可变结构域之间形成界面(Clothia等人,J.Mol.Biol.186,651-66,1985;Novotny和Haber,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 824592-4596(1985)),相关部分通过引用并入本文。
因此,术语纯化的不要求绝对的纯度;相反,它旨在作为相对术语。例如,纯化的核酸是其中核酸比细胞内其天然环境中的核酸更富集的核酸。在另外的实施方案中,纯化核酸或细胞制剂,使得核酸或细胞分别占制剂的总核酸或细胞含量的至少约60%(诸如但不限于70%、80%、90%、95%、98%或99%)。
重组的:重组核酸是具有非天然存在的序列或具有由两个另外分离的序列片段的人工组合制备的序列的核酸。这种人工组合通常通过化学合成或更常见地通过人工操作核酸的分离片段,例如,通过基因工程技术来实现。
选择性杂交:在排除不相关核苷酸序列的中度或高度严格条件下的杂交。
在核酸杂交反应中,用于实现特定严格水平的条件将根据被杂交的核酸的性质而变化。例如,在选择杂交条件时,可以考虑核酸杂交区的长度、互补性程度、核苷酸序列组成(例如,GC与AT含量对比)和核酸类型(例如,RNA相对DNA)。另外的考虑是核酸之一是否固定在例如过滤器上。
逐步更高的严格条件的具体实例如下:在约室温下,2×SSC/0.1%SDS(杂交条件);在约室温下,0.2×SSC/0.1%SDS(低严格条件);在约42℃下,0.2×SSC/0.1%SDS(中度严格条件);以及在约68℃下,0.1×SSC(高严格条件)。本领域技术人员可以容易地确定这些条件的变化(例如,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,第1-3卷,Sambrook等人编著,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989),相关部分通过引用并入本文。可以仅使用这些条件中的一个,例如,高严格条件进行洗涤,或者可以以上面列出的顺序使用条件中的每一个,例如,每个10-15分钟,重复列出步骤中的任一个或所有。然而,如上所述,最佳条件将根据所涉及的特定杂交反应而变化,并且可以凭经验确定。
序列同一性:氨基酸序列之间的相似性以序列之间的相似性表示,也称为序列同一性。序列同一性经常以同一性(或相似性或同源性)百分比测量;百分比越高,两个序列越相似。当使用标准方法比对时,(多个)抗体或其(多个)部分的同源物或变体将具有相对高程度的序列同一性。
用于比较的序列比对方法是本领域熟知的。各种程序和比对算法描述于:Smit和Waterman,Adv.Appl.Math.2:482,1981;Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.48:443,1970;Higgins和Sharp,Gene 73:237,1988;Higgins和Sharp,CABIOS 5:151,1989;Corpet等人,Nucleic Acids Research 16:10881,1988;以及Pearson和Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444,1988。Altschul等人,Nature Genet.6:119,1994提供了序列比对方法和同源性计算的详细考虑,相关部分通过引用并入本文。
NCBI基于局部比对算法的搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool,BLAST))(Altschul等人,J.Mol.Biol.215:403,1990)可以从几个来源获得,包括美国国家生物技术信息中心(NCBI,Bethesda,马里兰州)和在互联网上,用于与序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx结合使用,相关部分通过引用并入本文。如何使用该程序确定序列同一性的描述可以在互联网上的NCBI网站获得。
(多个)抗体或其(多个)部分的同源物和变体的特征通常在于具有至少75%,例如至少80%的序列同一性,所述序列同一性使用NCBI Blast 2.0,带空位的blastp设定为默认参数,针对与(多个)抗体或其(多个)部分的氨基酸序列的全长比对计数。为了比较大于约30个氨基酸的氨基酸序列,使用设定为默认参数(空位存在罚分(gap existence cost)为11,并且每个残基空位罚分(per residue gap cost)为1)的默认BLOSUM62矩阵来运用Blast 2序列功能。当比对短肽(少于约30个氨基酸)时,应采用设定为默认参数(开放空位9罚分,延伸空位1罚分)的PAM30矩阵,使用Blast 2序列功能进行比对。当通过该方法评估时,与参考序列具有甚至更大相似性的蛋白质将显示增加的同一性百分比,诸如至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性。当比较少于整个序列的序列同一性时,同源物和变体通常针对10-20个氨基酸的短窗口具有至少80%序列同一性,并且根据它们与参考序列的相似性,可以具有至少85%或至少90%或95%的序列同一性。针对这样的短窗口确定序列同一性的方法可以在互联网上的NCBI网站获得。本领域技术人员将理解,提供这些序列同一性范围仅用于指导;可以获得落在所提供的范围之外的非常显著的同源物是完全可能的。
治疗有效量:足以在所治疗的受试者中实现期望的效果的化合物,诸如(多个)抗体或其(多个)部分的量。例如,这可以是治疗或改善受试者的癌症,诸如皮肤癌或肺癌所必需的量。在一些实施方案中,它是在一段时间内以可测量的量治疗受试者所必需的量,或可测量地抑制受试者的疾病进展所必需的量。在其他实施方案中,治疗有效量是预防性抑制疾病所必需的量。
在治疗过程期间,可以以单一剂量或以若干剂量,例如每日给予有效量的(多个)抗体或其(多个)部分。然而,有效量将取决于所施用的化合物、所治疗的受试者、痛苦的严重程度和类型,以及给予化合物的方式。
本发明可以与一种或多种抗肿瘤剂一起提供。与其他抗肿瘤剂一起的共同治疗的实例包括例如阿柔比星、阿地白介素、阿仑单抗、阿利维A酸、六甲蜜胺、氨磷汀、氨基丙酮酸、氨柔比星、安吖啶、阿那格雷、阿那曲唑、ANGER、安西司亭、阿格拉宾(ARGLABIN)、三氧化二砷、BAM 002(Novelos)、贝沙罗汀、比卡鲁胺、溴尿苷、卡培他滨、西莫白介素、西曲瑞克、克拉屈滨、克霉唑、阿糖胞苷烷磷酯、DA 3030(Dong-A)、达克珠单抗、地尼白介素、地洛瑞林、右雷佐生、地拉卓、多西他赛、二十二醇、度骨化醇、去氧氟尿苷、多柔比星、溴隐亭、卡莫司汀、阿糖胞苷、氟尿嘧啶、HIT双氯芬酸、α干扰素、柔红霉素、多柔比星、维甲酸、依地福新、依决洛单抗、依氟鸟氨酸、乙嘧替氟、表柔比星、倍他依泊汀、磷酸依托泊苷、依西美坦、依昔舒林、法倔唑、非格司亭、非那雄胺、磷酸氟达拉滨、福美司坦、福莫司汀、硝酸镓、吉西他滨、吉妥珠单抗奥唑米星(gemtuzumab zogamicin)、吉美嘧啶/奥替拉西/喃氟啶组合、glycopine、戈舍瑞林、依铂、人绒毛膜促性腺激素、人胎儿甲胎蛋白、伊班膦酸、伊达比星、咪喹莫特、α干扰素或α干扰素家族成员、β干扰素或β干扰素家族成员、γ干扰素或γ干扰素家族成员、白介素-1β、碘苄胍、伊立替康、伊索拉定、兰瑞肽、LC 9018(Yakult)、来氟米特、来格司亭、硫酸香菇多糖、来曲唑、白细胞α干扰素、亮丙瑞林、左旋咪唑+氟尿嘧啶、利阿唑、洛铂、氯尼达明、洛伐他汀、马索罗酚、美拉胂醇、甲氧氯普胺、米非司酮、米替福新、米立司亭、错配的双链RNA、米托胍腙、二溴卫矛醇、米托蒽醌、莫拉司亭、那法瑞林、纳络酮+喷他佐辛、那托司亭、奈达铂、尼鲁米特、诺司卡品、新红细胞生成刺激蛋白、NSC 631570奥曲肽、奥普瑞白介素、奥沙特隆、奥沙利铂、紫杉醇、帕米膦酸、培门冬酶、聚乙二醇干扰素α-2b、木聚硫钠、喷司他丁、溶链菌制剂(picibanil)、吡柔比星、兔抗胸腺细胞多克隆抗体、聚乙二醇干扰素α-2a、卟吩姆钠、雷洛昔芬、雷替曲塞、rasburiembodiment、依替膦酸铼186Re、RII视黄酸酰胺、利妥昔单抗、罗莫肽、来昔决南153钐、沙格司亭、西佐喃、索布佐生、索纳明、氯化89锶、苏拉明、他索纳明、他扎罗汀、喃氟啶、替莫泊芬、替莫唑胺、替尼泊苷、四氯十氧化物(tetrachlorodecaoxide)、沙利度胺、胸腺法新、促甲状腺素α、拓扑替康、托瑞米芬、托西莫单抗-131碘、曲妥珠单抗、曲奥舒凡、维甲酸、曲洛司坦、曲美沙特、曲普瑞林、肿瘤坏死因子α、天然的(natural)、乌苯美司、膀胱癌疫苗、Maruyama疫苗、黑素瘤裂解物疫苗、戊柔比星、维替泊芬、长春瑞滨、VIRULIZIN、净司他丁斯酯或唑来膦酸;阿巴瑞克;AE 941(Aeterna)、氨莫司汀、反义寡核苷酸、bcl-2(Genta)、APC 8015(Dendreon)、西妥昔单抗、地西他滨、右旋氨鲁米特(dexaminoglutethimide)、地吖醌、EL 532(Elan)、EM 800(Endorecherche)、恩尿嘧啶、依他硝唑、芬维A胺、非格司亭SD01、氟维司群、加洛他滨、胃泌素17免疫原、HLA-B7基因治疗(Vical)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、二盐酸组胺、替伊莫单抗、伊洛马司他、IM 862(Cytran)、白介素-2、iproxifene、LDI 200(Milkhaus)、来立司亭、林妥珠单抗、CA125MAb(Biomira)、癌MAb(Japan Pharmaceutical Development)、HER-2和Fc Mab、个体基因型105AD7MAb、个体基因型CEA MAb(Trilex)、LYM-1-131碘MAb(Techniclone)、多态性上皮粘蛋白-钇90MAb(Antisoma)、马立马司他、美诺立尔、米妥莫单抗、莫特沙芬钆、MX 6(Galderma)、奈拉滨、诺拉曲特、P 30蛋白、培维索孟、培美曲塞、泊非霉素、普马司他、RL0903(Shire)、鲁比替康、赛特铂、苯乙酸钠、膦门冬酸、SRL 172(SR Pharma)、SU 5416(SUGEN)、TA 077(Tanabe)、四硫钼酸盐、thaliblastine、血小板生成素、锡乙基初紫红素(tin ethyl etiopurpurin)、替拉扎明、癌症疫苗(Biomira)或伐司扑达。
PD-1(程序性细胞死亡-1)受体的非限制性实例在活化T细胞表面上表达。其配体PD-L1和PD-L2在树突细胞或巨噬细胞表面上表达。PD-1和PD-L1/PD-L2属于免疫检查点蛋白家族,作为可以停止或限制T细胞反应发展的共抑制因子起作用。PD-1/PD-L1相互作用确保免疫系统仅在适当时间被活化,用以使慢性自身免疫炎症的可能性最小化。阻断免疫检查点蛋白的实例包括与单克隆抗体一起的抗PD-1、抗PD-L1和抗CTLA-4。
转导的:转导的细胞是已经通过分子生物学技术被导入核酸分子的细胞。如本文所用,术语转导包括可将核酸分子导入这样的细胞的所有技术,包括用病毒载体转染、用质粒载体转化,以及通过电穿孔、脂质转染和基因枪加速导入裸DNA。
载体:核酸分子当被导入宿主细胞中,从而产生转化的宿主细胞。载体可包含允许其在宿主细胞中复制的核酸序列,诸如复制起点。载体还可包含一种或多种选择性标志物基因和本领域已知的其他遗传元件。载体包括质粒载体,包括用于在革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌细胞中表达的质粒。示例性载体包括用于在大肠杆菌(E.coli)和沙门氏菌(Salmonella)中表达的那些。载体还包括病毒载体,诸如但不限于逆转录病毒、正痘病毒、禽痘病毒、鸡痘病毒、羊痘病毒、猪痘病毒、腺病毒、疱疹病毒、甲病毒、杆状病毒、辛德比斯病毒、牛痘病毒和脊髓灰质炎病毒载体。载体还包括用于在酵母细胞和昆虫细胞中表达的载体。
在这些或其他位置处可以被取代、插入或缺失的其他氨基酸可以通过与生物测定结合的诱变研究来鉴定。上述比对仅作为指导提供。
在示例性实施方案中,抗体被工程化为双特异性、三特异性或多特异性的,并且抗体包含两个或更多个不同的抗原结合区。在一个实例中,抗体是具有针对CD25的特异性的双特异性或三特异性抗体。制备双特异性或三特异性抗体的方法是本领域已知的。参见,例如,Marvin和Zhu,Acta Pharmacologica Sinica 26:649-658(2005),以及专利号为6,551,592的美国专利,相关部分通过引用并入本文。在另一实例中,结合构建体是具有针对CD25的第一表位和CD25的第二表位的特异性的双特异性抗原结合构建体。抗体可以是四源杂交瘤、异二聚体双特异性抗体、双特异性抗体融合蛋白、双特异性抗体片段、双特异性T细胞衔接器(BiTE)或多特异性抗体。抗体可以被工程化为二价、三价或多价的。参见,例如,Cuesta等人,“Multivalent antibodies:when design surpasses evolution”Trends inBiotechnology 28,355-362(2010);Holliger等人,“Engineered antibody fragmentsand the rise of singledomains”Nat.Biotechnol.23,1126-1136(2005);Chan等人,“Therapeutic antibodies for autoimmunity and inflammation”Nat Rev Immunol 10,301-316(2010);Byrne等人,“A tale of two specificities:bispecific antibodiesfor therapeutic and diagnostic applications”Trends Biotechnol.31,621-632(2013),相关部分通过引用并入本文。如果抗体是单体形式,则抗体还可以与一种或多种其他抗体(即,识别与第一抗体相同或不同的表位的抗体)缀合。因此,抗体可以是二聚体、聚合物、寡聚体或多聚体形式。
抗体的抗原结合片段包含抗体的“抗原结合结构域”或“抗原结合部分”。抗原结合片段具有至少一个抗原结合位点,包括但不限于:Fab、F(ab’)2、单特异性或双特异性Fab2、三特异性Fab、单价IgG、scFv、dsFv、scFv-Fc、双特异性双抗体、三特异性三抗体、微抗体或IgNAR的片段(例如,V-NAR)、双scFv,或由Fab表达文库表达的片段。
抗体或其结合片段可以是单体或聚合的、双特异性或三特异性的、二价或三价的。在示例性方面,本文提供的融合蛋白是单特异性、双特异性或三特异性的、二价或三价的,并且可以是全人源的。
含有抗体分子的抗原结合结构域的抗体片段可以通过本领域已知的技术来生成。例如,这样的片段包括但不限于可以通过抗体分子的胃蛋白酶消化产生的F(ab’)2片段;可以通过还原F(ab’)2片段的二硫键生成的Fab’片段;以及可以通过用木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体分子生成的两个Fab’片段。
单链可变区片段(sFv)抗体片段是截短的Fab片段,其包含经由合成肽与抗体轻链的可变(V)结构域连接的抗体重链的V结构域,并且可以使用常规重组DNA技术生成。二硫键稳定的可变区片段(dsFv)可以通过重组DNA技术制备(参见,例如,Reiter等人,ProteinEngineering,7,697-704(1994)),相关部分通过引用并入本文。
重组抗体片段,诸如scFv,也可以被工程化以组装成对不同靶抗原具有高结合亲和力和特异性的稳定多聚寡聚体。这样的双抗体(二聚体)、三抗体(三聚体)或四抗体(四聚体)是本领域熟知的,参见例如,Kortt等人,Biomol Eng.200118:95-108,(2001)和Todorovska等人,J Immunol Methods.248:47-66,(2001),相关部分通过引用并入本文。
在某些实例中,抗原结合片段可包含两个或更多个不同的抗原结合结构域。在一个实例中,结合构建体是具有针对CD25的第一表位和CD25的第二表位的特异性的双特异性抗原结合片段。在一个实例中,结合结构域可以经由螺旋-转角-螺旋基序二聚化、三聚化或变为多价的。
本文还包括含有抗体或其部分的多肽的多聚体,包括如下所述的融合多肽。在一些实施方案中,多聚体可以是二聚体、三聚体、四聚体或五聚体。
本文还包括与异源性肽融合的抗体或其部分,诸如可用于检测、纯化、稳定或增溶(多个)抗体或其(多个)部分的肽。在一些实施方案中,C-末端多肽可以在其N-末端处与免疫球蛋白(Ig)恒定重链或轻链结构域或其部分连接。例如,多肽可以与重链的CH1、CH2和/或CH3结构域连接。如果恒定区来自轻链,则它可以来自κ或λ轻链。如果恒定区来自重链,则它可以来自以下抗体类别中的任一种的抗体:IgG、IgA、IgE、IgD和IgM。IgG可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。恒定结构域可以是Fc片段。恒定结构域可以来自哺乳动物抗体,诸如人抗体。可溶性受体-IgG融合蛋白是常用的免疫试剂,其构建方法是本领域已知的(参见,例如,专利号为5,225,538、5,726,044、5,707,632、750,375、5,925,351、6,406,697的美国专利以及Bergers等人,Science 1999 284:808-12)。在一个实例中,免疫球蛋白是人IgG、特别是IgG1的重链的恒定部分,其中两条重链之间的二聚化发生在铰链区。公认的是,包含Fc区的CH2和CH3结构域作为融合多肽的一部分增加包含Fc区的多肽的体内循环半衰期和包含该多肽的寡聚体或二聚体的体内循环半衰期。
以下序列包括单克隆抗体的各种轻链和重链的核酸和氨基酸序列,它们在这些特定情况下被制成scFv。此外,使用可从IMGT.org上获得的软件,利用Kabat规则确定互补决定区(CDR)。下表包括比较Kabat、Clothia和IMGT规则而可供选择的CDR序列,所有这些均可以与本发明一起用于用本文公开的CDR修饰抗体骨架(例如,人抗体)。
序列实例1:SEQ ID NO:1是ExtSP-hD11重链(HC)。加下划线的是重链恒定区,粗体是伸展蛋白信号肽,/>
SEQ ID NO:2是ExtSP-hD11HC,密码子优化的形式1,加下划线的是重链恒定区,粗体是伸展蛋白信号肽。
/>
SEQ ID NO:3是ExtSP-hD11HC,密码子优化的形式2,加下划线的是重链恒定区,粗体是伸展蛋白信号肽。
/>
SEQ ID NO:4是ExtSP-hD11轻链(LC),斜体是轻链恒定区,粗体是伸展蛋白信号肽,
SEQ ID NO:5是ExtSP-hD11轻链(LC),密码子优化的形式1,斜体是轻链恒定区,粗体是伸展蛋白信号肽。
/>
SEQ ID NO:6是ExtSP-hD11轻链(LC),密码子优化的形式2,斜体是轻链恒定区,粗体是伸展蛋白信号肽。
包含铰链区以及结构域CH2和CH3的人IgG1的Fc部分具有以下核苷酸序列(SEQ IDNO:7):
其编码具有以下氨基酸序列(SEQ ID NO:8)的多肽:
序列实例2:
>重链氨基酸SEQ ID NO:9,
/>
>重链DNA SEQ ID NO:10
ATGGGAAAAATGGCTTCTCTTTTTGCTACTTTCCTTGTTGTGTTGGTTA
GTCTTTCTCTAGCTAGTGAGAGTAGTGCTCAAGTTCAGCTGGTGCAGA
GTGGTGCTGAGGTGAAGAAACCTGGTGCCTCATTGAAAATTTCGTGCA
AAGGGAGCGGGTACACTTTCACCGACTACGCAATGCATTGGGTAAGG
CAAGCACCAGGTCAAGGCTTAGAATGGATTGGAGTCATCAGCACCTA
CTCTGGTGATGCCATATATGCTCAAAAGTTTCAGGGAAGAGCGACAA
TGACTGTTGATACATCAACTTCTACAGCATATCTTGAGTTGTCATCCCT
CCGTAGTGAAGATACTGCTGTTTATTATTGTGCTAGAGGCGTAACATT
TGATTATTGGGGACAAGGAACAACTGTCACGGTTTCTTCCGCTAGCAC
CAAAGGTCCTTCAGTCTTCCCACTTGCGCCAAGTTCCAAAAGCACTTC
TGGCGGCACTGCTGCGCTTGGCTGTCTCGTAAAAGACTATTTTCCAGA
GCCAGTGACAGTCAGTTGGAATAGCGGTGCTCTCACAAGTGGCGTTC
ATACATTTCCTGCTGTTCTGCAATCTTCTGGTTTATACTCTTTATCGAG
CGTAGTAACAGTTCCTTCATCATCACTTGGGACTCAAACTTATATATG
TAATGTCAACCACAAGCCGTCCAACACTAAAGTAGACAAGAAGGTTG
AACCAAAATCTTGTGATAAGACACACACTTGCCCTCCTTGTCCTGCAC
CAGAGCTCTTGGGTGGTCCATCAGTGTTTCTATTCCCGCCAAAGCCAA
AGGATACACTCATGATATCACGCACCCCTGAGGTTACTTGTGTTGTAG
TTGATGTTAGTCATGAAGATCCGGAAGTGAAGTTTAATTGGTATGTTG
ATGGAGTGGAAGTTCACAATGCAAAAACCAAGCCTCGTGAAGAGCAG
TACAATTCAACATATCGTGTTGTTTCAGTTCTAACAGTCCTTCATCAAG
ATTGGTTGAATGGAAAAGAATATAAATGCAAGGTGAGCAACAAAGCA
CTTCCAGCTCCAATTGAGAAAACAATTAGCAAGGCAAAGGGACAACC
AAGAGAACCTCAAGTTTACACGCTTCCTCCCTCCCGAGAAGAAATGA
CAAAGAATCAGGTCAGTCTGACTTGCTTGGTTAAAGGGTTTTACCCCT
CTGATATTGCAGTGGAATGGGAATCTAATGGTCAGCCTGAAAATAAC
TACAAGACCACCCCCCCAGTACTTGATTCAGATGGTTCTTTCTTTTTAT
ATTCTAAATTAACTGTGGATAAATCAAGATGGCAACAAGGGAATGTT
TTCAGTTGCTCCGTGATGCATGAGGCCTTACATAATCATTATACTCAG
AAGTCCCTTAGTCTGTCACCGGGTAAGTGA
>轻链氨基酸SEQ ID NO:11,
>轻链DNA SEQ ID NO:12
ATGGGAAAAATGGCTTCTCTTTTTGCTACTTTCCTTGTTGTGTTGGTTA
GTCTTTCTCTAGCTAGTGAGAGTAGTGCTGACATTCAAATGACTCAAT
CTCCGAGCAGCTTATCTGCCTCAGTAGGTGATAGAGTGACAATAACTT
GCAGGGCATCTCAAGATATTTCAAACTACCTGGAATGGTATCAGCAG
AAACCAGGGAAAGCTCCAAAGCTCCTTGTTTACAATGCAAAGACATT
GGCTGAGGGTGTTCCTTCACGTTTCTCTGGAAGTGGGTCGGGCACCGA
CTTCACGCTAACCATCAGTTCCCTTCAGCCTGAAGATTTTGGAACTTA
TTATTGTCAACATCACTATGATACTCCCTACACATTTGGTCAAGGAAC
AAAGTTGGAGATTAAAAGAACTGTTGCTGCTCCTTCTGTGTTCATTTTT
CCACCATCTGATGAACAACTGAAGAGCGGCACAGCGTCAGTCGTTTG
TTTGTTGAATAATTTTTACCCTAGAGAGGCTAAAGTACAGTGGAAAGT
TGATAATGCTCTGCAGTCTGGAAATTCCCAAGAATCAGTAACAGAGC
AAGATTCAAAGGATTCCACCTACAGTCTTTCGTCTACTTTAACATTGT
CTAAAGCAGACTATGAAAAGCACAAAGTGTATGCTTGTGAAGTTACT
CATCAAGGTCTCAGCTCGCCGGTGACAAAATCGTTCAACAGGGGTGA
ATGTTGA
恒定Ig结构域还可以含有一个或多个减少或消除一种或多种效应功能,例如,与Fc受体结合和补体活化的突变(参见,例如,Morrison,Annu.Rev.Immunol.,10,第239-65页(1992);Duncan和Winter(1988)Nature 332:738-740;以及Xu等人,(1994)JBiol.Chem.269:3469-3474)。例如,提供了对应于人IgG1的Leu235和Pro331的氨基酸分别向Glu和Ser的突变。在专利号为6,656,728的美国专利中进一步描述了这样的构建体。
肽可作为基本上纯的制剂,诸如其中制剂中至少约90%的肽是期望的肽来使用。还可以使用包含至少约50%、60%、70%或80%期望的肽的组合物。肽可以是变性的或非变性的,因此可以是聚集的或非聚集的。
本文包括的其他(多个)抗体或其(多个)部分是包含修饰的氨基酸的那些。示例性肽是衍生肽,其可以是通过糖基化、聚乙二醇化、磷酸化或任何类似过程修饰的肽,保留其所源自的肽的至少一种生物学功能。肽还可包含一个或多个非天然存在的氨基酸。例如,非典型氨基酸或化学氨基酸类似物可以作为取代或添加被引入至肽中。非典型氨基酸包括但不限于常见氨基酸的D-异构体、2,4-二氨基丁酸、α-氨基异丁酸、4-氨基丁酸、Abu、2-氨基丁酸、γ-Abu、-Ahx、6-氨基己酸、Aib、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、高瓜氨酸、磺基丙氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、β-丙氨酸、氟代氨基酸、设计氨基酸诸如β-甲基氨基酸、Cα-甲基氨基酸、Nα-甲基氨基酸和一般的氨基酸类似物。在一些实施方案中,硒代甲硫氨酸取代会是有用的(例如,用于X射线衍射分析)。此外,氨基酸可以是D(右旋)或L(左旋)。在其他具体实施方案中,提供本文列出的肽的分支形式,诸如通过用具有能够与一个或多个氨基酸形成肽键(并因此能够形成“分支”)的游离侧链的氨基酸或氨基酸类似物取代序列内的一个或多个氨基酸。还考虑了环状肽。
还包括在合成期间或之后差异修饰的肽衍生物,诸如通过苄基化、糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、聚乙二醇化、通过已知保护/阻断基团衍生化、蛋白水解、与抗体分子或其他细胞配体连接等。在具体实施方案中,肽在N-末端处乙酰化和/或在C-末端处酰胺化。
还提供抗体或其部分的衍生物,诸如化学修饰的肽和肽模拟物。肽模拟物是基于或衍生自肽和蛋白质的化合物。肽模拟物可以通过使用非天然氨基酸、构象限制、电子等排取代等对已知肽序列进行结构修饰来获得。主题肽模拟物构成肽和非肽合成结构之间的结构空间的连续体,因此,肽模拟物可用于描绘药效团并有助于将肽转变成具有亲本肽活性的非肽化合物。
抗体或其部分的模拟表位(Mimetope)包括在本公开内容中。这样的肽模拟物可具有诸如不可水解(例如,针对蛋白酶或降解相应肽的其他生理条件的稳定性增加)、刺激细胞分化的特异性和/或效力提高的属性。出于说明的目的,可以使用例如苯二氮卓类(例如,参见Freidinger等人的Peptides:Chemistry and Biology,G.R.Marshall编著,ESCOMPublisher:Leiden,Netherlands,1988)、取代的γ内酰胺环(Garvey等人的Peptides: Chemistry and Biology,G.R.Marshall编著,ESCOM Publisher:Leiden,Netherlands,1988,第123页)、C-7模拟物(Huffman等人的Peptides:Chemistry and Biology,G.R.Marshall编著,ESCOM Publisher:Leiden,Netherlands,1988,第105页)、酮-亚甲基假肽(Ewenson等人(1986)J Med Chem29:295;和Ewenson等人的Peptides:Structure and Function (Proceedings of the 9th American Peptide Symposium)Pierce ChemicalCo.Rockland,Ill.,1985)、β-转角二肽核心(Nagai等人,(1985)Tetrahedron Lett 26:647;和Sato等人,(1986)J Chem Soc Perkin Trans 1:1231)、β-氨基醇(Gordon等人,(1985)Biochem BiophysRes Commun 126:419;和Dann等人,(1986)Biochem Biophys ResCommun 134:71)、二氨基酮(Nataraj an等人,(1984)Biochem Biophys Res Commun 124:141)以及亚甲基氨基修饰的(Roark等人的Peptides:Chemistry and Biology,G.R.Marshall编著,ESCOM Publisher:Leiden,Netherlands,1988,第134页)生成肽类似物。此外,一般参见Peptides:Chemistry and Biology,G.R.Marshall编著,ESCOMPublisher:Leiden,Netherlands,1988中的Session III:Analytic and syntheticmethods。
除了可以进行各种侧链取代以生成肽模拟物之外,本公开内容特别考虑使用肽二级结构的构象限制模拟物。已经为肽的酰胺键开发了许多替代物。酰胺键的常用替代物包括以下基团:(i)反式烯烃、(ii)氟代烯烃、(iii)亚甲基氨基、(iv)膦酰胺和(v)磺酰胺。另外,可以使用基于肽骨架的更实质性修饰的肽模拟物。属于这一类的肽模拟物包括(i)反构型-反排列(retro-inverso)类似物,和(ii)N-烷基甘氨酸类似物(所谓的类肽)。此外,可以使用组合化学方法产生肽模拟物。例如,所谓的“肽变形(peptide morphing)”策略的一些实施方案聚焦于随机生成包含多种肽键替代物的肽类似物文库。在一个示例性实施方案中,肽模拟物可以衍生为肽的反构型-反排列类似物。这样的反构型-反排列类似物可以根据本领域已知的方法制备,诸如Sisto等人的专利号为4,522,752的美国专利所描述的。反构型-反排列类似物可以如例如公开号为WO00/01720的PCT公布文本中描述的生成。可以生成混合肽,诸如包含一些正常肽键的混合肽。作为一般性指导,对蛋白水解最敏感的位点通常被改变,较不敏感的酰胺键任选地用于模拟转换。终产物或其中间体可以通过HPLC纯化。
抗体或其部分(包括肽的酰胺化形式)可以通过本领域熟知的自动化固相过程容易地合成。用于固相合成的技术和过程描述于Solid Phase Peptide Synthesis:A Practical Approach,作者E.Atherton和R.C.Sheppard,由IRL,Oxford University Press出版,1989。供选择地,这些肽可以通过片段缩合来制备,如例如Liu等人,TetrahedronLett.37:933-936,1996;Baca等人,J.Am.Chem.Soc.117:1881-1887,1995;Tam等人,Int.J.Peptide Protein Res.45:209-216,1995;Schnolzer和Kent,Science 256:221-225,1992;Liu和Tam,J.Am.Chem.Soc.116:4149-4153,1994;Liu和Tam,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:6584-6588,1994;以及Yamashiro和Li,Int.J.PeptideProtein Res.31:322-334,1988中所述。可用于合成本公开内容的肽的其他方法描述于Nakagawa等人,J.Am.Chem.Soc.107:7087-7092,1985中。本公开内容的肽还可以容易地购自合成肽的商业供应商。这样的供应商包括例如Advanced ChemTech(Louisville,肯塔基州)、Applied Biosystems(Foster City,加利福尼亚州)、Anaspec(San Jose,加利福尼亚州)和Cell Essentials(Boston,马萨诸塞州)。
编码抗体或其部分的多核苷酸和宿主细胞。
还提供了编码本文公开的(多个)抗体或其(多个)部分的多核苷酸。这些多核苷酸包括编码目的肽的DNA、cDNA和RNA序列。编码序列中的沉默突变由遗传密码的简并性(即,冗佘性)导致,由此多于一个的密码子可以编码同一氨基酸残基。因此,例如,亮氨酸可以由CTT、CTC、CTA、CTG、TTA或TTG编码;丝氨酸可以由TCT、TCC、TCA、TCG、AGT或AGC编码;天冬酰胺可以由AAT或AAC编码;天冬氨酸可以由GAT或GAC编码;半胱氨酸可以由TGT或TGC编码;丙氨酸可以由GCT、GCC、GCA或GCG编码;谷氨酰胺可以由CAA或CAG编码;酪氨酸可以由TAT或TAC编码;并且异亮氨酸可以由ATT、ATC或ATA编码。显示标准遗传密码的表可以在各种来源中找到(参见,例如,Stryer,1988,Biochemistry,第3增补修订版,W.H.5Freeman和Co.,NY)。
编码(多个)抗体或其(多个)部分的核酸可以通过体外方法克隆或扩增,所述体外方法诸如聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)、基于转录的扩增系统(TAS)、自主序列复制系统(3SR)和Qβ复制酶扩增系统(QB)。例如,编码蛋白质的多核苷酸可以使用基于该分子DNA序列的引物通过cDNA的聚合酶链式反应来分离。多种克隆和体外扩增方法是本领域技术人员熟知的。PCR方法描述于例如专利号为4,683,195的美国专利;Mullis等人,Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.51:263,1987;和Erlich编著,PCR Technology,(Stockton Press,NY,1989)中。多核苷酸也可以通过在严格杂交条件下用选自期望的多核苷酸序列的探针筛选基因组或cDNA文库来分离。
编码(多个)抗体或其(多个)部分的多核苷酸包括结合至自主复制质粒或病毒的载体中的重组DNA,或结合至原核生物或真核生物的基因组DNA中的重组DNA,或作为独立于其他序列的单独分子(诸如cDNA)存在的重组DNA。核苷酸可以是核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或任一核苷酸的修饰形式。该术语包括单链和双链形式的DNA。
在一些实施方案中,载体用于在酵母,诸如酿酒酵母(S.cerevisiae)或乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)中表达。已知几种启动子可用于酵母表达系统,诸如组成型启动子质膜H+-ATP酶(PMA1)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GPD)、磷酸甘油酸激酶-1(PGK1)、醇脱氢酶-1(ADH1)和多效耐药泵(PDR5)。另外,可使用许多诱导型启动子,诸如GAL1-10(由半乳糖诱导)、PHO5(由低细胞外无机磷酸盐诱导)和串联热激HSE元件(由升高至37℃的温度诱导)。指导响应于可滴定诱导物的可变表达的启动子包括甲硫氨酸响应性MET3和MET25启动子以及铜依赖性CUP1启动子。可以将这些启动子中的任一个克隆至多拷贝(2μ)或单拷贝(CEN)质粒中,以给出对表达水平的另外水平的控制。质粒可包括用于在酵母中选择的营养标志物(诸如URA3、ADE3、HIS1等)和用于在细菌中增殖的抗生素抗性(AMP)。用于在乳酸克鲁维酵母(K.lactis)上表达的质粒是已知的,诸如pKLAC1。因此,在一个实例中,在细菌中扩增后,可以通过类似于细菌转化的方法将质粒导入相应营养缺陷型酵母中。多核苷酸也可以被设计为在昆虫细胞中表达。
(多个)抗体或其(多个)部分可以在各种酵母菌株中表达。例如,7种多效耐药转运蛋白YOR1、SNQ2、PDR5、YCF1、PDR10、PDR11和PDR15,以及它们的激活转录因子PDR1和PDR3一起在酵母宿主细胞中同时缺失,使所得菌株对药物敏感。也可以使用质膜的脂质组成改变的酵母菌株,诸如麦角固醇生物合成缺陷型erg6突变体。对蛋白水解高度敏感的蛋白质可以在缺乏控制其他液泡水解酶活化的主液泡内肽酶Pep4的酵母中表达。如果相应的无效突变体不能存活,则可以在携带基因的温度敏感性(ts)等位基因的菌株中进行异源性表达。
还可以制备编码本文公开的(多个)抗体或其(多个)部分的病毒载体。已经构建了许多病毒载体,包括多瘤病毒SV40(Madzak等人,1992,J.Gen.Virol.,73:15331536)、腺病毒(Berkner,1992,Cur.Top.Microbiol.Immunol.,158:39-6;Berliner等人,1988,BioTechniques,6:616-629;Gorziglia等人,1992,J.Virol.,66:4407-4412;Quantin等人,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:2581-2584;Rosenfeld等人,1992,Cell,68:143-155;Wilkinson等人,1992,Nucl.Acids Res.,20:2233-2239;Stratford-Perricaudet等人,1990,Hum.Gene Ther.,1:241-256)、牛痘病毒(Mackett等人,1992,Biotechnology,24:495-499)、腺相关病毒(Muzyczka,1992,Curr.Top.MicrobioL.Immunol.158:91-123;On等人,1990,Gene,89:279-282)、包括HSV和EBV的疱疹病毒(Margolskee,1992,Curr.Top.Microbiol.Immunol.,158:67-90;Johnson等人,1992,J.Virol.,66:29522965;Fink等人,1992,Hum.Gene Ther.3:11-19;Breakfield等人,1987,Mol.Neurobiol.,1:337-371;Fresse等人,1990,Biochem.Pharmacol.40:2189-2199)、辛德比斯病毒(Herweijer等人,1995,Human Gene Therapy 6:1161-1167;专利号为5,091,309和5,217,879的美国专利)、甲病毒(Schlesinger,1993,Trends Biotechnol.11:18-22;Frolov等人,1996,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:11371-11377),以及禽类来源的逆转录病毒(Brandyopadhyay等人,1984,Mol.Cell Biol.,4:749-754;Petropouplos等人,1992,J.Virol.,66:3391-3397)、鼠来源的逆转录病毒(Miller,1992,Curr.Top.Microbiol.Immunol.,158:1-24;Miller等人,1985,Mol.Cell Biol.,5:431-437;Sorge等人,1984,Mol.Cell Biol.,4:1730-1737;Mann等人,1985,J.Virol.,54:401-407)和人来源的逆转录病毒(Page等人,1990,J.Virol.,64:5370-5276;Buchschalcher等人,1992,J.Virol.,66:2731-2739)。杆状病毒(苜蓿银纹夜蛾多核多角体病毒;AcMNPV)载体也是本领域已知的,可以从商业来源(诸如PharMingen,San Diego,加利福尼亚州;Protein Sciences Corp.,Meriden,康涅狄格州;Stratagene,La Jolla,加利福尼亚州)获得。
因此,在一些实施方案中,编码(多个)抗体或其(多个)部分的多核苷酸包含在病毒载体中。合适的载体包括逆转录病毒载体、正痘病毒载体、禽痘病毒载体、鸡痘病毒载体、羊痘病毒载体、猪痘病毒载体、腺病毒载体、疱疹病毒载体、甲病毒载体、杆状病毒载体、辛德比斯病毒载体、牛痘病毒载体和脊髓灰质炎病毒载体。具体的示例性载体是痘病毒载体,诸如牛痘病毒、鸡痘病毒和高度减毒的牛痘病毒(MVA)、腺病毒、杆状病毒等。
使用的痘病毒包括正痘病毒、猪痘病毒、禽痘病毒和羊痘病毒。正痘(Orthopox)包括牛痘、鼠痘和浣熊痘。使用的正痘的一个实例是牛痘。禽痘(Avipox)包括鸡痘、金丝雀痘和鸽痘。羊痘包括山羊痘和绵羊痘。在一个实例中,猪痘(suipox)是猪痘(swinepox)。用于表达的痘病毒载体的实例如例如专利号为6,165,460的美国专利所述,其通过引用并入本文。可以使用的其他病毒载体包括其他DNA病毒,诸如疱疹病毒和腺病毒,以及RNA病毒,诸如逆转录病毒和脊髓灰质炎病毒。
合适的载体公开于例如专利号为6,998,252的美国专利中,其通过引用并入本文。在一个实例中,重组痘病毒,诸如重组牛痘病毒,通过插入嵌合基因被以合成方法修饰,该嵌合基因含有牛痘调控序列或与其功能等同的DNA序列,其侧翼有DNA序列,所述DNA序列在性质上不与编码(多个)抗体或其(多个)部分的侧翼牛痘调控DNA序列邻接。含有这样的嵌合基因的重组病毒在表达(多个)抗体或其(多个)部分方面是有效的。在一个实例中,疫苗病毒载体包含(A)片段,该片段由(i)编码(多个)抗体或其(多个)部分的第一DNA序列和(ii)痘病毒启动子组成,其中痘病毒启动子与编码(多个)抗体或其(多个)部分的DNA序列相邻并对其发挥转录控制作用;以及所述片段侧翼的(B)来自痘病毒基因组非必需区的DNA。病毒载体可以编码选择性标志物。在一个实例中,痘病毒包括例如胸苷激酶基因(参见专利号为6,998,252的美国专利,其通过引用并入本文)。
编码包括伸展蛋白信号肽和(多个)抗体或其(多个)部分的融合蛋白的痘病毒载体在至少一个与编码(多个)抗体或其(多个)部分的核酸序列可操作地连接的表达控制元件的控制下。表达控制元件被插入痘病毒载体中,以控制和调节核酸序列的表达。在这些载体中使用的表达控制元件的实例包括但不限于lac系统、噬菌体λ的操纵子和启动子区、酵母启动子,以及来源于多瘤病毒、腺病毒、逆转录病毒或SV40的启动子。另外的操作元件包括但不限于前导序列、终止密码子、聚腺苷酸化信号,以及在宿主系统中编码(多个)抗体或其(多个)部分的核酸序列的适当转录和随后翻译所必需的任何其他序列。表达载体可以含有包含核酸序列的表达载体在宿主系统中转移和随后复制所必需的另外的元件。这样的元件的实例包括但不限于复制起点和选择性标志物。本领域技术人员还将理解,这样的载体使用常规方法(Ausubel等人,(1987)在Current Protocols in Molecular Biology,JohnWiley and Sons,New York,N.Y.中)容易构建,并且是市售的。
用于制备含有编码(多个)抗体或其(多个)部分的异源性DNA序列的重组DNA病毒的基本技术是本领域已知的。这样的技术涉及例如供体质粒中DNA序列侧翼的病毒DNA序列和亲本病毒中存在的同源序列之间的同源重组(Mackett等人,1982,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:7415-7419)。特别地,诸如痘病毒载体的重组病毒载体可用于递送基因。载体可以通过例如本领域已知的步骤来构建,诸如类似于专利号为5,093,258的美国专利中描述的用于产生鸡痘病毒的合成重组体的方法的步骤,其通过引用并入本文。其他技术包括使用天然存在或在亲本病毒载体中人工插入的独特限制性内切核酸酶位点来插入异源性DNA。
编码(多个)抗体或其(多个)部分的DNA序列可以通过将DNA转移至合适的宿主细胞中来体外表达。细胞可以是原核细胞或真核细胞。该术语还包括主题宿主细胞的任何子代。应理解,所有子代可能不与亲本细胞完全一样,因为可能有在复制期间发生的突变。稳定转移的方法是本领域已知的,该稳定转移意味着外源DNA在宿主中持续保持。
如上所述,编码(多个)抗体或其(多个)部分的多核苷酸序列可以与表达控制序列可操作地连接。连接与编码序列可操作地连接的表达控制序列,使得在与表达控制序列相容的条件下实现编码序列的表达。表达控制序列包括但不限于适当的启动子、增强子、转录终止子、蛋白质编码基因前的起始密码子(即,ATG)、内含子的剪接信号、保持该基因的正确阅读框以允许mRNA正确翻译,以及终止密码子。
宿主细胞可包括微生物、酵母、昆虫和哺乳动物宿主细胞。
在原核生物中表达具有真核序列或病毒序列的DNA序列的方法是本领域熟知的。合适的宿主细胞的非限制性实例包括细菌、古细菌(archea)、昆虫、真菌(例如酵母)、植物和动物细胞(例如,哺乳动物细胞,诸如人)。使用的示例性细胞包括大肠杆菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、SF9细胞、C129细胞、293细胞、脉孢菌(Neurospora),以及永生化哺乳动物骨髓和淋巴样细胞系。用于培养物中哺乳动物细胞增殖的技术是熟知的(参见,Jakoby和Pastan(编著),1979,Cell Culture.Methods in Enzymology,第58卷,Academic Press,Inc.,Harcourt Brace Jovanovich,N.Y.)。常用的哺乳动物宿主细胞系的实例是VERO和Hela细胞、CHO细胞以及WI38、BHK和COS细胞系,尽管也可以使用诸如设计为提供更高表达的期望的糖基化模式或其他特征的细胞的细胞系。如上所述,用于转化酵母细胞的技术,诸如聚乙二醇转化、原生质体转化和基因枪,也是本领域已知的(参见Gietz和Woods,Meth Enzymol 350:87-96,2002)。
用重组DNA转化宿主细胞可以通过本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主是原核生物,诸如但不限于大肠杆菌时,能够摄取DNA的感受态细胞可以由指数生长期后收获,随后使用本领域熟知的过程通过CaCl2方法处理的细胞制备。供选择地,可以使用MgCl2或RbCl。如果期望,转化还可以在形成宿主细胞的原生质体后进行,或通过电穿孔进行。
当宿主是真核生物时,可以使用诸如磷酸钙共沉淀的DNA转染方法、诸如显微注射、电穿孔、插入包裹在脂质体中的质粒或病毒载体的常规机械过程。真核细胞也可以用编码(多个)抗体或其(多个)部分的多核苷酸序列和编码可选择的表型的第二外源DNA分子,诸如单纯疱疹胸苷激酶基因共转化。另一种方法是使用诸如猿猴病毒40(SV40)或牛乳头瘤病毒的真核病毒载体瞬时感染或转化真核细胞,并表达蛋白质(参见例如,Eukaryotic Viral Vectors,Cold Spring Harbor Laboratory,Gluzman编著,1982)。
(多个)抗体或其(多个)部分和变体也可以在植物中产生。例如,多肽可以使用IBIOLAUNCHTM基因表达平台(iBio,Inc.,Newark,特拉华州)在植物中表达,如例如专利号为7,491,509的美国专利(其通过引用以其整体并入本文)中所述。IBIOLAUNCHTM平台可用于在非转基因植物中产生高水平的靶蛋白。该平台可具有相对于利用动物细胞或微生物的方法的益处和相对于需要转基因植物的系统的益处。
为了使用该系统,将期望的基因克隆至IBIOLAUNCHTM载体中,其被导入植物的叶中(例如,通过自动真空渗入)。使载体扩散至茎和叶的细胞中,在细胞中期望的蛋白质在接下来的4-7天内以极高水平表达。然后收获绿色植物材料,并纯化蛋白质产物。可以在同一设备中对不同蛋白质用新植物作物重复整个IBIOLAUNCHTM基因表达过程,使得该技术成为生产蛋白质药物和疫苗的最灵活且最快的方式。在一个实例中,轻链和重链在不同的载体上进行渗入,但可以在同一载体上表达。
植物表达载体系统可包含一种或多种病毒载体组分。感染各种植物物种的多种病毒是已知的,并且可用于多核苷酸表达。感染植物的病毒家族包括但不限于烟草花叶病毒科、花椰菜花叶病毒科(dsDNA)、双生病毒科(ssDNA)、呼肠孤病毒科和分体病毒科(dsRNA),以及弹状病毒科、布尼亚病毒科、雀麦花叶病毒科和豇豆花叶病毒科(ssRNA)。另外的信息可以在例如“The Classification and Nomenclature of Viruses,Sixth Report of theInternational Committee on Taxonomy of Viruses”(Murphy等人编著),SpringerVerlag:New York,1995中找到,其全部内容通过引用并入本文(还参见,Grierson等人,Plant Molecular Biology,Blackie,London,第126-146页,1984;Gluzman等人,Communications in Molecular Biology:Viral Vectors,Cold Spring HarborLaboratory,NY,第172-189页,1988;以及Mathew,Plant Viruses Online)。
为了成功建立局部(叶内)或全身感染,病毒必须能够复制。许多病毒含有编码参与复制过程的一种或多种蛋白(在本文中称为复制蛋白或复制酶蛋白)的基因。例如,许多RNA植物病毒编码RNA聚合酶。也可能需要另外的蛋白质,诸如解旋酶或(多种)甲基转移酶蛋白。除了编码复制蛋白的功能基因之外,病毒基因组可以含有各种序列组分,这些组分也是复制所需的或促进复制。
任何感染植物的病毒均可用于根据本文所述的方法制备病毒载体或载体系统。ssRNA病毒可以是特别有用的,尤其是具有(+)-链基因组的那些。操纵这样的病毒中存在的遗传物质的技术和试剂包括本领域熟知的那些。通常,例如,制备病毒基因组的DNA拷贝,并将其克隆至微生物载体(例如,细菌载体)中。某些ssDNA病毒,包括双生病毒是特别有用的。应理解,一般来说,载体和病毒基因组可以以RNA或DNA形式存在。另外,当提及存在于DNA载体内的诸如RNA病毒的基因组或其部分的特征时,应理解,该特征作为RNA形式的DNA拷贝存在。
可以使用许多不同类型的病毒。合适的病毒包括例如雀麦花叶病毒科的成员(例如,雀麦花叶病毒属、苜蓿花叶病毒属、等轴不稳环斑病毒属)和烟草花叶病毒科的成员。有用的病毒种类包括例如苜蓿花叶病毒(AlMV)、苹果褪绿叶斑病毒、苹果凹茎病毒、大麦条纹花叶病毒、大麦黄矮病毒、菜豆黄矮病毒、甜菜黄化病毒、蚕豆斑点病毒、蚕豆萎蔫病毒、雀麦花叶病毒(BMV)、香石竹潜隐病毒、香石竹斑点病毒、香石竹环斑病毒、胡萝卜斑点病毒、木薯潜隐病毒(CLV)、豇豆褪绿斑点病毒、豇豆花叶病毒(CPMV)、黄瓜绿斑点花叶病毒、黄瓜花叶病毒、莴苣传染性黄化病毒、玉米褪绿斑点病毒、玉米雷亚多非纳病毒、玉米条纹病毒(MSV)、欧防风黄点病毒、豌豆耳突花叶病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、悬钩子丛矮病毒、水稻坏死病毒(RNV)、水稻条纹病毒、水稻东格鲁球状病毒、黑麦草花叶病毒、土传小麦花叶病毒、南方菜豆花叶病毒、烟草蚀纹病毒(TEV)、烟草花叶病毒(TMV)、烟草坏死病毒、烟草脆裂病毒、烟草环斑病毒、番茄丛矮病毒、番茄金花叶病毒(TGMV)和芜菁黄花叶病毒(TYMV)。
根据已知技术将这些植物病毒的元件基因工程化(参见,例如,Sambrook等人,Molecular Cloning,第2版,Cold Spring Harbor Press,NY,1989;Clover等人,Molecular_Cloning,IRL Press,Oxford,1985;Dason等人,Virology,172:285-292,1989;Takamatsu等人,EMBO J.6:307-311,1987;French等人,Science 231:1294-1297,1986;Takamatsu等人,FEBSLett.269:73-76,1990;Yusibov和Loesch-Fries,Virology,208(1):405-7,1995;以及Spitsin等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,96(5):2549-53,1999)以生成病毒载体,用于在植物中生产目的多肽,包括本文提供的(多个)抗体或其(多个)部分。采用至少两种载体,其中的一种或两种不能全身感染,但它们一起提供支持至少一种载体的全身感染和使目的多核苷酸在整个植物中表达所需的所有功能。因此,病毒组分可以反式互补,以提供全身感染能力。
特别地,制备生产型载体。该载体包含在调控序列控制下的目的多核苷酸(例如,编码(多个)抗体或其(多个)部分的多核苷酸),该调节序列指导在相关植物宿主中的表达。在一些实施方案中,多核苷酸处于病毒启动子,例如CP启动子的控制下。例如,可能期望用目的多核苷酸取代天然病毒CP基因。生产型载体缺乏全身移动所需的一种或多种组分。例如,生产型载体可能不含有足以表达功能性CP(例如,CP基因)的序列,但可能包含编码细胞间移动蛋白的基因。生产型载体可以含有可能需要为顺式的一个或多个序列元件(例如,组装起点),以在顺式存在时促进病毒传播。例如,生产型载体可以含有CP活性所需或促进CP活性的组装起点,其来自与生产型病毒相同类型的病毒或来自另一种病毒。这样的序列元件可包括CP的识别位点。在其他实施方案中,生产型载体可能缺乏足以表达功能性MP和/或复制酶蛋白的序列。在这些实施方案中,生产型载体可能缺乏或可能不缺乏足以表达功能性CP的序列。
还制备了运输型载体(carrier vector)。该载体补充生产型载体,使得它提供在生产型载体中缺失的全身感染所需的组分。例如,某些运输型载体包含功能性外壳蛋白编码组分。这些运输型载体适合补充缺乏功能性外壳蛋白编码组分的生产型载体。运输型载体可缺乏植物的成功全身感染所需的至少一种病毒组分(例如,编码复制酶或移动蛋白的基因),前提是这样的组分在生产型载体中也不缺乏。运输型载体可包含目的多核苷酸(其可以与生产型载体中的目的多核苷酸相同或不同)。在这样的情况下,可能期望使用全身感染缺陷型运输型载体,例如,因为它缺乏一个或多个必需的顺式作用序列,用以使重组运输型载体向非靶植物的扩散最小化。
运输型载体可以(但不必要)包含细胞间移动组分(例如,编码细胞间移动蛋白的基因或细胞间移动所需的非编码组分)和/或可以缺乏一种或多种复制酶蛋白编码组分。在运输型载体不包含细胞间移动组分(例如,功能性MP编码部分)的实施方案中,这样的组分应包含在生产型载体中。
完整的载体组包括成功的全身病毒感染和目的多核苷酸表达所必需的所有组分。术语“组分”旨在包括蛋白质编码序列和非编码序列,诸如顺式作用序列(例如,启动子、组装起点、对应于mRNA中非翻译区的部分)。不同的载体或载体元件可以来源于不同的植物病毒。事实上,可能期望由不同病毒的元件制备载体,用以利用不同的病毒特征(例如,宿主范围、启动子活性水平、病毒粒子尺寸等)。
在一些实施方案中,提供了包含目的多核苷酸、复制酶基因和移动蛋白基因,但缺乏功能性外壳蛋白编码组分的生产型载体,并且提供了表达外壳蛋白基因的运输型载体。例如,生产型载体可包括基于TMV的载体,其中TMV CP编码序列已经在TMV CP启动子的控制下被目的多核苷酸取代。该生产型载体不能全身移动。野生型AlMV载体可以用作运输型载体。AlMV载体含有功能性外壳蛋白编码组分。用生产型载体和运输型载体共同感染使由AlMV载体CP编码序列产生的CP与基于TMV的载体互补,导致基于TMV的载体的全身移动和多核苷酸在最初未感染的叶中的表达。供选择地,可以使用基于AlMV的载体,其中已经除去了表达AlMV CP所需的组分之外的一种或多种病毒组分(例如,缺乏功能性MP或复制蛋白编码组分的基于AlMV的载体),前提是存在功能性CP编码序列和可操作地连接的启动子。CP可以来自AlMV或来自另一种病毒。
在一些实施方案中,CP实现运输型载体的全身移动,而在其他实施方案中,选择不实现运输型载体的全身移动但实现生产型载体的全身移动的CP。在运输型载体缺乏表达AlMV CP所需的组分之外的一种或多种病毒组分的那些实施方案中,生产型载体可以补充运输型载体。例如,生产型载体可以提供诸如功能性MP或复制酶蛋白编码序列的组分,其分别实现运输型载体(在一些情况下还有生产型载体)细胞间移动或复制。应理解,当生产型载体或运输型载体缺乏复制蛋白编码组分(例如,功能性RNA聚合酶编码组分)而另一载体(分别为运输型载体或生产型载体)提供缺失的组分时,通常期望将来自提供功能性复制组分的载体的启动子(例如,基因组启动子)插入缺乏功能性复制蛋白编码组分的载体中,用以实现复制功能的有效反式互补。
有用的病毒载体系统的另一实例包括生产型载体,其中目的多核苷酸被插入AlMV载体中,取代天然AlMV CP编码组分。目的多核苷酸处于AlMV CP启动子的控制下。该生产型载体由于其缺乏CP而不能全身感染,但能够在被感染的叶中复制和细胞间移动。该系统还包括基于花椰菜花叶病毒(CMV)的运输型载体,其中含或不含AlMV CP 3’UTR的AlMV CP编码部分被插入CMV载体中,取代在天然存在的CMV基因组中发现的CMV CP编码组分。AlMV CP编码组分处于CMV CP启动子的控制下。该载体表达AlMV CP。用生产型载体和运输型载体共同感染实现从运输型载体表达的CP与生产型载体缺乏功能性CP编码组分反式互补,从而实现生产型载体的全身移动。AlMV CP还实现运输型载体的全身移动。
在一些实施方案中,可能期望将来自运输型载体的编码或非编码序列的一部分插入生产型载体中,反之亦然。例如,某些序列可增强复制或者促进细胞间或长距离移动。特别地,某些序列可以用作病毒转录物和CP之间复合物形成的识别位点(例如,组装起点)。在这样的情况下,如果使用来自第二病毒载体的反式提供的CP来实现第一病毒载体的全身移动,则可能期望将来自第二病毒载体的促进CP活性的这样的序列插入第一病毒载体中。这样的序列可包括例如病毒转录物3’UTR的部分或全部。在一些情况下,将AlMV RNA33’UTR的部分或全部插入不同的病毒载体中,例如,基于TMV的载体。在基于TMV的载体中包含该组分促进AlMV CP对缺乏功能性TMV CP编码部分的基于TMV的载体进行反式互补的能力。应理解,这种一般原理可应用于包含反式互补载体的任何病毒载体系统,例如,反式互补的生产型载体和运输型载体系统。
如本领域普通技术人员将理解的,只要载体组包括不能全身病毒感染(例如,缺乏一种或多种功能性复制蛋白、移动蛋白或外壳蛋白编码组分)的生产型载体和提供生产型载体中缺乏的(多个)功能的运输型载体,则该载体组适于根据本文所述的方法使用。在一些实施方案中,没有单独的载体能够全身病毒感染,但作为一个组,载体中的一个或两个能实现这样的感染和目的多核苷酸的表达。这样的系统可以提供许多优点。例如,应理解,如果生产型载体在运输型载体不存在的情况下感染植物,则不会导致全身感染。这降低目的多核苷酸在非目标(非靶)植物、甚至是与靶植物相同的物种中表达的风险。特别地,如果运输型载体不能复制或细胞间移动(因为它缺乏复制或细胞间移动所需的组分)或如果它不能全身感染(例如,因为它缺乏顺式作用序列,诸如长距离移动所需的组装起点),则生产型载体和运输型载体将共同感染非目标植物宿主的可能性大大降低。
一般,为了保持病毒功能并且仅仅为了易于遗传操作,通过改变现有植物病毒基因组(例如,通过除去特定基因和/或通过破坏或取代特定序列以灭活或取代它们)来制备载体。在这样的情况下,载体将显示与天然病毒基因组非常高的序列同一性。当然,也可以制备完全新的载体,例如,通过分开分离各个期望的遗传元件并将它们连接在一起,任选地包含另外的元件。此外,应注意,当特定载体据说缺乏给定基因、蛋白质或活性(例如,生产型载体缺乏外壳蛋白基因)时,如果在感染条件下不从载体表达这样的蛋白质或活性,即使载体仍可能携带相关编码序列,这也是足够的。然而,一般而言,通常期望从载体中除去相关编码序列。
类似地,当载体据说肯定地表达特定蛋白质或活性时,相关基因不必需与天然发现的相应基因完全相同。例如,已发现,外壳蛋白有时可以容许小的缺失(参见,例如,WO00/46350,其通过引用以其整体并入本文)。只要蛋白质是有功能的,其就可以根据本文所述的方法使用。然而,与天然蛋白质非常高的序列同一性一般被认为是最有用的。例如,一般应避免大的缺失(例如,大于约25个氨基酸)。通常,病毒蛋白将显示与相应的天然病毒蛋白至少50%(例如,60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%)的序列同一性。更特别地,病毒蛋白通常应与相关天然病毒蛋白的关键功能性部分(通常是至少几个氨基酸,通常是至少10、20、30、40、50或更多个氨基酸)具有100%同一性。
应注意,在许多蛋白质的情况下,可以进行许多氨基酸改变而不显著影响蛋白质的功能活性和/或各种其他性质,诸如稳定性等。特别地,许多蛋白质容许保守性氨基酸改变一用具有类似性质的不同氨基酸取代氨基酸,而不显著降低活性。保守性氨基酸取代是本领域熟知的,并代表一种获得具有与给定多肽的性质相似或基本上相似的性质同时改变氨基酸序列的多肽的方法。一般,氨基酸已根据(1)电荷(正电荷、负电荷或不带电荷);(2)体积和极性;(3)Grantham物理-化学距离;以及这些的组合进行了分类和分组。参见,例如,Zhang,J.Mol.Evol.,50:56-68,2000;Grantham,Science,85:862-864,1974;Dagan等人,Mol.Biol.Evol.,19(7),1022-1025,2002;Biochemistry,第4版,Stryer等人,W.Freemanand Co.,1995;以及专利号为6,015,692的美国专利。例如,可以基于体积和极性将氨基酸分成以下类别:特殊氨基酸(C);中性且小的氨基酸(A、G、P、S、T);极性且相对小的氨基酸(N、D、Q、E);极性且相对大的氨基酸(R、H、K);非极性且相对小的氨基酸(I、L、M、V),以及非极性且相对大的氨基酸(F、W、Y)。保守性氨基酸取代可被定义为用同一组中的氨基酸取代一个氨基酸的取代。因此,通过在给定的病毒蛋白中进行一个或多个保守性氨基酸取代,可以衍生出各种功能上等同的蛋白质。
可以根据本文所述的方法利用任何对病毒感染敏感的植物。一般,通常将期望利用在限定条件下,例如在温室和/或在水性系统中易于生长的植物。还可能期望选择通常不被人类或家养动物消耗和/或通常不是人类食物链的一部分的植物,以便它们可以在外面生长,而不用担心表达的多核苷酸可能被不期望地摄取。然而,在其他实施方案中,期望采用可食用植物。
通常,某些期望的植物特征将由待表达的特定多核苷酸决定。仅举几个例子,当多核苷酸编码将以高产率生产的蛋白质时(如通常将是这种情况,例如,当将表达治疗性蛋白质时),将通常期望选择具有相对较高生物量的植物(例如,烟草,其具有其对病毒感染高度敏感的另外优点、生长期短,并且不处于人类食物链中)。当多核苷酸编码全部活性需要特定翻译后修饰(或被特定翻译后修饰抑制)的蛋白质时,某些植物物种完成相关修饰(例如,特定糖基化)的能力(或无能力)可以指导选择。
在一些实施方案中,利用作物植物或作物相关植物。在一些实施方案中,利用可食用植物。
适合根据本文所述的方法使用的植物包括但不限于被子植物、苔藓植物(例如,苔类、藓类等),蕨类植物(例如,蕨类、木贼类、石松类)、裸子植物(例如,松柏类、苏铁类(cycase)、银杏、买麻藤目)和藻类植物(例如,绿藻类、褐藻类、红藻类、蓝藻类、黄藻类和裸藻类)。在一些实施方案中,以下科的成员可以是特别有用的:豆科(Leguminosae/Fabaceae)(例如,豌豆、苜蓿、大豆);禾本科(Gramineae/Poaceae)(例如,玉米、小麦、水稻);茄科,特别是番茄属(例如,番茄)、茄属(例如,马铃薯、茄子)、辣椒属(Capsium)(例如,胡椒)或烟草属(例如,烟草);伞形科,特别是胡萝卜属(例如,胡萝卜)、芹菜属(例如,芹菜)或芸香科(例如,橙子);菊科,特别是莴苣属(例如,莴苣);以及十字花科(Brassicaceae/Cruciferae),特别是芸苔属或白芥属。例如,有用的十字花科家族成员包括芸苔(Brassicacampestris)、埃塞俄比亚芥(B.carinata)、芥菜(B.juncea)、欧洲油菜(B.napus)、黑芥(B.nigra)、甘蓝(B.oleraceae)、撒哈拉芥菜(B.tournifortii)、白芥(Sinapis alba)和萝卜(Raphanus sativus)。示例性烟草属植物包括Schneider等人(Plant Physiology andBiochemistry 92(2015),39-47)教导的那些,相关部分通过引用并入本文,诸如含修饰的N-糖基化的GalT-dXT/FT本特哈曼烟草(Nicotiana benthamiana)植物,或含修饰的N-糖基化的C105dXT/FT本特哈曼烟草植物。
表达系统可用于感染任何发育阶段的植物和/或在该植物中表达多核苷酸,所述发育阶段包括例如成熟植物、幼苗、芽和种子。该系统可用于感染植物的任何部分(例如,根、叶、茎等)。在一些实施方案中,该系统用于感染芽。一般,当植物是这样的幼苗时认为该植物是芽,即所述幼苗不需要超过达到正常发芽温度所需的光或热形式的外部养分或能量。通常,认为小于2周龄并且通常小于10日龄的幼苗是芽。
一般,可以根据已知技术将病毒载体递送至植物。例如,可以直接将载体本身施用于植物(例如,经由研磨接种(abrasive inoculation)、机械化喷雾接种、真空渗入、粒子轰击或电穿孔)。供选择地,可以(例如,由已感染的植物)制备病毒粒子,并且可以根据已知技术将其施用于其他植物。
如上所述,在一些实施方案中,(例如,通过渗透或机械接种[喷雾])将病毒载体施用于芽。
当通过将病毒基因组直接施用于植物来完成感染时,可以使用任何可用的技术来制备基因组。例如,根据本文所述的方法有效采用的许多病毒具有ssRNA基因组。ssRNA可以通过在体内或体外转录基因组的DNA拷贝或通过复制RNA拷贝来制备。鉴于易使用的体外转录系统(例如,SP6、T7、网织红细胞裂解物等)的易获得性,以及保持RNA载体的DNA拷贝的便利性,预期ssRNA载体通常将通过体外转录来制备,特别是用T7或SP6聚合酶。
在一些实施方案中,期望从表达多核苷酸表达产物的植物组织中分离该多核苷酸表达产物。还可能期望配制这样的分离产物用于其预期用途(例如,作为药物或诊断剂、作为试剂等)。在其他实施方案中,将期望将产物与表达它们的一些或全部植物组织一起配制。
为了从表达表达产物的一些或全部植物组织中分离该表达产物,可以采用任何可用的纯化技术。本领域普通技术人员熟悉多种分馏和分离过程(参见,例如,Scopes等人,Protein Purification:Principles and Practice,第3版,Janson等人,“ProteinPurification:Principles,High Resolution Methods,and Applications,”Wiley-VCH,1998;Springer-Verlag,NY,1993;以及Roe,Protein Purification Techniques,OxfordUniversity Press,2001,其中的每一个通过引用以其整体并入本文)。通常,将期望使产物的纯度超过约50%,优选超过约60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。
为了将产物与植物材料一起配制,通常将期望已经利用对相关接受者(例如,人或其他动物)无毒的植物。可以根据本领域已知的技术简单地收获和加工相关植物组织(例如,叶),充分考虑保持表达产物的活性。在一些实施方案中,多核苷酸可以在可食用植物中(特别是在植物的可食用部分中)表达,以便材料可以随后被食用。例如,当多核苷酸编码营养相关蛋白或在口服递送后具有活性的治疗性蛋白质时(当正确配制时),可能有用的是在可食用植物部分中产生蛋白质,并将表达的多核苷酸与用其表达该多核苷酸的一些或全部植物材料一起配制用于口服递送。
当多核苷酸编码或产生治疗剂时,其可以根据已知技术配制。例如,有效量的药学活性产物可以与一种或多种有机或无机、液体或固体、药学上合适的载体材料一起配制。药学活性产物可以以诸如片剂、胶囊、锭剂、分散剂、悬浮剂、溶液、胶囊、乳膏、软膏、气溶胶、粉末包、液体溶液、溶剂、稀释剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂和固体粘合剂的剂型使用,只要这样的剂型不破坏蛋白质的生物活性。
可用作药学上可接受的载体的材料包括但不限于糖,诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖;淀粉,诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉;纤维素及其衍生物,诸如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素;粉末状黄蓍胶;麦芽;明胶;滑石;赋形剂,诸如可可脂和栓剂蜡;油,诸如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油;二醇,诸如丙二醇;酯,诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯;琼脂;缓冲剂,诸如氢氧化镁和氢氧化铝;海藻酸;无热原水;等渗盐水;林格氏溶液;乙醇和磷酸盐缓冲溶液,以及诸如月桂基硫酸钠和硬脂酸镁的其他无毒相容的润滑剂,以及根据配制人员的判断,着色剂、释放剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂也可以存在于组合物中(还参见Remington’s Pharmaceutical Sciences,第15版,E.W.Martin,Mack Publishing Co.,Easton PA,1975)。例如,多核苷酸表达产物可以通过常规的混合制粒制糖衣丸、溶解、冻干或类似过程作为药物组合物提供。
在一些实施方案中,通过减缓皮下或肌内注射的药学活性产物(例如,蛋白质)的吸收来延长药物制剂的效果可能是有用的。这可以通过使用水溶性差的结晶或无定形材料的液体悬浮液来完成。产物的吸收速率则取决于其溶解速率,而溶解速率又可以取决于大小和形式。供选择地,胃肠外给予的产物的延迟吸收通过将产物溶解或悬浮于油载体中来完成。可注射贮库形式通过在诸如聚丙交酯-聚乙交酯的可生物降解聚合物中形成蛋白质的微胶囊基质来制备。根据产物与聚合物的比率和所采用的特定聚合物的性质,可以控制释放速率。其他可生物降解聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。贮库可注射制剂可以通过将产物包埋在与身体组织相容的脂质体或微乳液中来制备。
药学活性产物的肠内给药制剂可以以固体、半固体、悬浮液或乳液的形式引入,并且可以与任何药学上可接受的载体,诸如水、悬浮剂和乳化剂混合。也可以通过泵或缓释形式给予表达产物,尤其是当作为预防措施给药时,用以预防受试者疾病的发展或者改善或延迟已确定的疾病。
药学活性产物,任选地与植物组织一起,可以特别适合作为药物组合物口服给药。收获的植物材料可以以各种方式(例如,空气干燥、冷冻干燥、提取等)中的任一种进行加工,这取决于期望的治疗性产品的性质及其期望的形式。在优选实施方案中,如上所述的这样的组合物单独被口服摄取或与食物或饲料或饮料一起被摄取。用于口服给药的组合物包括感染的植物;感染的植物的提取物,以及以干粉、食品、水性溶剂或非水性溶剂、悬浮液或乳液形式提供的从感染植物中纯化的蛋白质。非水性溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油、鱼油和可注射有机酯。水性载体包括水、水-醇溶液、乳液或悬浮液,包括盐水和缓冲的中间肠胃外载体,该载体包括氯化钠溶液,林格氏葡萄糖溶液,葡萄糖加氯化钠溶液、含有乳糖的林格氏溶液或非挥发性油。干粉的实例包括已经干燥,例如冷冻干燥、空气干燥或喷雾干燥的任何感染的植物生物质。例如,植物可以通过置于约120华氏度的商业空气干燥器中直到生物质含有按重量计小于5%的水分来被空气干燥。干燥的植物可以作为大块固体储存用于进一步加工或通过研磨成期望的筛目大小的粉末被进一步加工。供选择地,对空气干燥敏感的产物可以使用冷冻干燥。可以通过将产物置于真空干燥器中并在真空下冷冻干燥直到生物质含有按重量计小于约5%的水分来冷冻干燥产物。干燥的材料可以被进一步加工。
感染的植物可以作为一种或多种草药制剂给药,或者与一种或多种草药制剂一起给药。有用的草药制剂包括液体和固体草药制剂。草药制剂的一些实例包括酊剂、提取物(例如,水提取物、醇提取物)、煎剂、干燥(例如,空气干燥、喷雾干燥、冷冻或冷冻干燥)制剂、粉末(例如,冻干粉末)和液体。草药制剂可以以任何标准递送载体,诸如胶囊、片剂、栓剂、液体剂型等提供。本领域技术人员将理解可施用的草药制剂的各种配方和递送方式。
本领域技术人员还将理解,获得期望的药学活性产物的特别有用的方法是通过提取。可以提取感染的植物,以从残余生物质中移出期望的产物,从而增加产物的浓度和纯度。植物也可以在缓冲溶液中提取。
例如,可以将新鲜收获的植物以1:1的重量比转移至已经用例如磷酸盐缓冲液缓冲的一定量冰冷的水中。还可以根据需要加入蛋白酶抑制剂。当悬浮于缓冲溶液中时,可以通过剧烈混合或研磨来破坏植物,并通过过滤或离心移出提取的生物质。溶液中携带的转基因产物可以通过另外的步骤进一步纯化或者通过冷冻干燥或沉淀转化为干粉。提取也可以通过压榨进行。活植物还可以通过在压榨机中压榨或通过在它们穿过紧密间隔的辊时被压碎来提取。根据本领域熟知的方法收集和处理从压碎的植物中榨出的流体。通过压榨提取使产物以更浓缩的形式释放。然而,产物的总产率可能低于在溶液中提取产物的情况。
感染的植物、提取物、粉末、干燥制剂和纯化的蛋白质产物等也可以是含或不含一种或多种如上所述赋形剂的包封的形式。片剂、糖衣丸、胶囊、丸剂和颗粒的固体剂型可以用包衣和外壳,诸如肠溶包衣、释放控制包衣和药物制剂领域熟知的其他包衣制备。在这样的固体剂型中,活性产物可以与至少一种惰性稀释剂,诸如蔗糖、乳糖或淀粉混合。如正常实践那样,这样的剂型还可包含除惰性稀释剂之外的另外的物质,例如,压片润滑剂和其他压片助剂,诸如硬脂酸镁和微晶纤维素。在胶囊、片剂和丸剂的情况下,剂型还可包含缓冲剂。它们可以任选地含有遮光剂,并且还可以是仅在或优选在肠道的某一部分中任选地以延迟方式释放(多种)活性成分的组合物。可使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。
在一些实施方案中,表达药学活性产物的感染的植物或感染的植物的生物质作为药用食物口服给予。这样的可食用组合物如果是固体形式则通过生食来消耗,如果是液体形式则通过饮用来消耗。在一些实施方案中,转基因植物材料在没有预先加工步骤的情况下或在最少烹饪准备后被直接摄取。例如,药学活性蛋白质在可直接食用的芽(例如,苜蓿芽、绿豆芽、菠菜芽或莴苣叶芽)中表达。在一些实施方案中,加工植物生物质,并摄取加工步骤后回收的材料。
治疗方法和药物组合物。
本文公开的抗体或其部分或者编码该抗体或其部分的核酸可用于治疗癌症。在几个实例中,抗体或其部分或者编码这些多肽的核酸可用于减少诸如受试者的癌症。因此,在几个实施方案中,该方法包括向受试者给予治疗有效量的本文公开的抗体或其部分中的一种或多种或者编码这些多肽的多核苷酸,用以减少癌症。然而,本文公开的抗体或其部分中的任一种可用于减少癌症。在一些实施方案中,肽可以作为单位剂量给药。在一些实施方案中,多肽作为多聚体给药。
治疗有效量的(多个)抗体或其(多个)部分或者编码肽的多核苷酸可以以药学上可接受的载体给药。药理学上可接受的载体(例如,生理学上或药学上可接受的载体)是本领域熟知的,包括但不限于生理pH(例如,约7.0至约8.0的pH,或约7.4的pH)的缓冲溶液。生理上相容的缓冲溶液的一个具体的非限制性实例是磷酸盐缓冲盐水。其他药理学上可接受的载体包括渗透剂,其特别适合旨在局部施用(例如在手术伤口施用以促进愈合)的药物制剂。
本文公开的药理学组合物促进在体内或离体使用至少一种(多个)抗体或其(多个)部分或者编码(多个)抗体或其(多个)部分的多核苷酸,以减少癌症。这样的组合物可以适合将活性成分递送至任何合适的受试者,并且可以以本身已知的方式制备,例如,通过常规的混合、溶解、制粒、乳化、包封、包埋或冻干过程。可以使用一种或多种药理学上(例如,生理学上或药学上)可接受的载体以及任选的助剂以常规方式配制药理学组合物,所述助剂促进将活性化合物加工成药学上可以使用的制剂。合适的制剂取决于所选的给药途径。因此,对于注射,可以将活性成分配制在水溶液中。对于经粘膜给药,在制剂中使用适于待渗透的屏障的渗透剂。这样的渗透剂一般是本领域已知的。
对于口服给药,治疗有效量的至少一种(多个)抗体或其(多个)部分或者编码肽的核酸可以与适合掺入片剂、丸剂、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液、悬浮液等的载体组合。
蛋白质药物在消化道中通过诸如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和刷状缘肽酶的酶的作用经受蛋白酶介导的降解,使得大蛋白质分子的口服给药通常不会产生预期的治疗作用(Soltero和Ekwruibe,2001Innovations in Pharmaceutical Technology,1:106-110)。
在一些实施方案中,对于肠胃外给药,治疗有效量的(多个)抗体或其(多个)部分或者编码肽的核酸可以通过注射给药,诸如通过推注或连续输注给药。这样的组合物可以在油性或水性载体中采取诸如悬浮液、溶液或乳液的形式,并且可以含有配制剂,诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。其他药理学赋形剂是本领域已知的。
任选地,(多个)抗体或其(多个)部分或者编码肽的多核苷酸可包含在异源性蛋白质、烃或脂质内,或与异源性蛋白质、烃或脂质缀合,用于体外或体内给药。共同给药可以使得在蛋白质、烃或脂质之前、基本上同时或之后给予(多个)抗体或其(多个)部分或者编码肽的多核苷酸。在一些实施方案中,与蛋白质、烃或脂质基本上同时给予(多个)抗体或其(多个)部分或者编码肽的多核苷酸。
其他递送系统可包括定时释放(time-release)、延迟释放或持续释放递送系统。这样的系统可以避免重复给予上述本发明的组合物,增加受试者和医师的便利。许多类型的释放递送系统是可用的,并且是本领域普通技术人员已知的。它们包括基于聚合物的系统,诸如聚(丙交酯-乙交酯)、共聚草酸酯、聚己内酯、聚酯酰胺、聚原酸酯、聚羟基丁酸和聚酸酐。含有药物的前述聚合物的微胶囊描述于例如专利号为5,075,109的美国专利中。递送系统还包括非聚合物系统,诸如脂质,包括诸如胆固醇的甾醇、胆固醇酯以及诸如甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯的脂肪酸或中性脂肪;水凝胶释放系统;硅橡胶系统;基于肽的系统;蜡涂层;使用常规粘合剂和赋形剂的压制的片剂;部分融合植入物;等等。具体实例包括但不限于:(a)侵蚀系统,其中(多个)抗体或其(多个)部分或者编码肽的多核苷酸以一种形式包含在基质内,诸如专利号为4,452,775、4,667,014、4,748,034、5,239,660和6,218,371的美国专利中描述的那些,以及(b)扩散系统,其中活性组分以受控速率从聚合物中渗透,诸如专利号为3,832,253和3,854,480的美国专利中描述的。另外,可以使用基于泵的硬件输送系统,其中一些适于植入。
(多个)抗体或其(多个)部分或者编码肽的多核苷酸的治疗有效量将取决于所利用的(多个)抗体或其(多个)部分或者编码肽的多核苷酸、所治疗的受试者、痛苦的严重程度和类型,以及给药方式。例如,编码肽的多核苷酸的治疗有效量可以从约0.01μg/千克(kg)体重至约1g/kg体重变化,诸如约1μg至约5mg/kg体重,或约5μg至约1mg/kg体重。本领域技术人员基于具体化合物的效力以及受试者的年龄、体重、性别和生理状况容易确定精确剂量。
关于给予核酸,给予核酸的一种方法是用质粒DNA直接治疗,诸如用哺乳动物表达质粒直接治疗。如上所述,编码(多个)抗体或其(多个)部分的核苷酸序列可以处于启动子的控制下,以增加分子的表达。
当利用病毒载体进行体内给药时,期望向接受者提供的组合物中每种重组病毒的剂量范围为约105至约1010噬斑形成单位/mg哺乳动物,尽管可以给予更低或更高的剂量。重组病毒载体的组合物可以在有任何癌症迹象之前被导入哺乳动物中,或介导患有癌症的哺乳动物的疾病的消退。向哺乳动物给予组合物的方法的实例包括但不限于将细胞离体暴露于重组病毒,或将组合物注射至受影响的组织中,或静脉内、皮下、皮内或肌内给予病毒。供选择地,重组病毒载体或重组病毒载体的组合可以通过以药学上可接受的载体直接注射至癌性病变中而局部给药。一般,携带待给予的一种或多种抗体或其部分的核酸序列的重组病毒载体的量基于病毒颗粒的滴度。待给予的免疫原的示例性范围为105至1010个病毒颗粒/哺乳动物(诸如人)。
在一个具体非限制性实例中,用于静脉内给药的药物组合物将包含约0.1μg至10mg的(多个)抗体或其(多个)部分/患者/天。可以使用从0.1到至多约100mg/天/患者的剂量,特别是如果向隔绝的部位给予药剂而不进入循环系统或淋巴系统,诸如进入体腔或进入器官内腔。制备可给药组合物的实际方法是本领域技术人员已知或显而易见的,并且更详细地描述于诸如Remington’s Pharmaceutical Sciences,第19版,Mack PublishingCompany,Easton,Pa.,1995的出版物中。
根据受试者所需和耐受的剂量和频率,给予药物组合物的单次给药或多次给药。在一些实施方案中,该剂量作为大剂量一次给予,但在另一个实施方案中,可定期施用直到实现治疗性结果。一般,该剂量足以治疗或改善疾病的症状或体征而不对受试者产生不可接受的毒性。可以利用全身或局部给药。
在另一种方法中,给予另外的药剂。在一个实例中,该给药是依次进行的。在其他实例中,和(多个)抗体或其(多个)部分同时给予另外的药剂。
在以下实施例中进一步描述本发明,这些实施例不限制权利要求中所述的本发明的范围。
实施例1
材料和方法。图1是显示回收的在植物表达系统中表达的抗体的考马斯蓝染色的凝胶。将表达载体共渗入野生型植物中。收获并提取植物组织,捕获hD11抗体,通过蛋白A色谱洗脱,并通过PAGE分离。HR:加热并还原的。NHNR:不加热、不还原的。在野生型植物中制备的抗CD25抗体也称为SD-889825-PW-A(IBIO-101,野生型植物),在c-105植株中制备的抗CD25抗体是SD-889825-PC-A(IBIO-101,c-105植物非岩藻糖基化的)。如本文所用,以下命名可互换使用:(SD-889825-CW-A是IBIO-101,野生型CHO细胞);(SD-889825-CG-A是IBIO-101,CHO细胞非岩藻糖基化的);(SD-889825-PW-A是IBIO-101,野生型植物);以及(SD-889825-PC-A是IBIO-101,c-105植物非岩藻糖基化的)。
将表达载体共渗入岩藻糖基化和木糖基化缺陷型C 105DXT/DFT植物中。收获并提取植物组织,捕获hD11抗体,通过蛋白A色谱洗脱,并通过PAGE分离。HR:加热并还原的。NHNR:不加热、不还原的。
图2是植物制备的hD11重链和轻链(C105植物)的质量的代表性质谱分析。
图3显示从植物制备的hD11(C105植物)释放的聚糖的质谱分析,hD11不采用岩藻糖制备以促进体内高ADCC活性。
实施例2:用于在癌症中有效消耗Treg的新型IL-2信号传导允许性抗CD25抗体的基于植物的表达和糖工程化。
靶向CD25用于T调节性细胞(Treg)消耗而不阻断肿瘤微环境中T效应细胞上的IL-2-STAT5信号传导的单克隆抗体已被证明作为单一疗法在临床前模型中提供针对实体瘤的有利反应。另外,CD25抗体与免疫检查点阻断的联合疗法已显示出协同作用。能够预测结构表位的表位具体表现的新型AI/ML平台被用于指导针对特异性表位的抗体选择。先导分子RTX-003(IBIO-101)是一种抗CD25抗体,其选自一组常规的且表位选择性的克隆,并使用植物本特哈曼烟草(Nicotiana benthamiana)在基于植物的表达系统中表达。使用缺乏β1,2-木糖基转移酶和α1,3-岩藻糖基转移酶活性的糖工程化的(GE)ΔXT/FT本特哈曼烟草宿主,我们能够产生效应功能显著增加的非岩藻糖基化的IBIO-101。IBIO-101与CD25+癌细胞特异性结合,经由pSTAT5保持IL-2信号传导,并引发强效的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)活性。采用iBio的和GLYCANEERINGTM平台产生的IBIO-101的临床前评价显示出与CHO制备的IBIO-101相当的功效和效力。基于GE植物的表达系统的快速可扩展性以及预期的产生GMP材料的时间节约支持IBIO-101进入临床开发。
图4是显示HPLC的图,其显示出在植物中产生的抗体的纯度。图5是显示轻链的质谱表征去卷积MW的图。图6是显示去糖基化重链的质谱表征去卷积MW的图。图7是显示糖基化重链的质谱表征去卷积MW的图。图8是显示完整的去糖基化样品的质谱表征去卷积MW的图。图9是显示完整的糖基化样品的质谱表征去卷积MW的图。
发现IBIO-101分子结合人和食蟹猴CD25,但不结合小鼠CD25。ELISA测定显示在CHO和植物中制备的WT岩藻糖基化和非岩藻糖基化的IBIO-101分子以及达克珠单抗以浓度依赖性方式与固定化的人或食蟹猴CD25结合。未检测到与固定化的小鼠CD25的结合。绘制的值是在450nm波长下测量的吸光度。EC50值是n≥3次实验的平均值。
CD25结合ELISA:首先,将ELISA板(Biolegend,423501)用在pH 9.5的50mM碳酸盐缓冲液(Teknova,S9225)中的1μg/mL的人CD25(Sino Biologicals,10165-H08H)或食蟹猴CD25(Sino Biologicals,90265-C08H)包被,在4℃下过夜。第二天,用洗涤缓冲液[1X PBS,含0.1%吐温-20(Teknova,P0207)]洗涤板3次,随后加入阻断缓冲液[1X PBS,1%BSA(Teknova,B0101)],在室温下持续1小时。阻断后,用洗涤缓冲液洗涤板3次,随后加入在洗涤缓冲液中浓度增加(0.0006-10μg/mL)的抗CD25抗体或对照抗体,在室温下持续1小时。孵育后,用洗涤缓冲液洗涤板3次,随后加入用洗涤缓冲液1:2500稀释的山羊抗人IgG-HRP第二抗体(Biorad,STAR126P),在室温下持续1小时。用第二抗体孵育后,用洗涤缓冲液洗涤板6次,随后加入TMB底物(VWR,95059-154),在室温下持续5分钟。在TMB底物孵育后,向板中加入与TMB底物等体积的ELISA终止溶液(Thermo Fisher,SS04),并在450nm下读取吸光度。使用GraphPad Prism9.3.0软件绘制数据,并通过该软件计算EC50值。
SUDHL-1和iTreg细胞结合测定:在补充有10%FBS(ATCC,30-2020)和1X青霉素-链霉素(Corning,30-002-CI)的RPMI 1640(ATCC,30-2001)中培养SUDHL-1细胞(ATCC,CRL-2955)。在补充有25μl/ml的Immunocult人CD3/CD28/CD2T细胞活化剂(Stemcell,10970)和3000IU/ml的IL2(Miltenyi Biotec,130-097-74)的Immunocult XF T细胞扩增培养基(Stemcell,10981)中培养人诱导型Treg(iTreg)细胞。
对于细胞结合测定,使用补充有2%FBS的DPBS(VWR,45000-436)作为测定缓冲液。对SUDHL-1细胞或iTreg细胞进行计数,然后将它们重悬于测定缓冲液中,以1×105个细胞/孔接种于96孔板(VWR,89089-826)上。将板离心,吸取上清液,然后保持在冰上用于剩余测定步骤。吸取上清液后,在冰上向细胞中加入在测定缓冲液中浓度增加(0.64-10,000ng/mL)的抗CD25抗体或对照抗体,持续20分钟。孵育后,将板离心并吸取上清液,然后用测定缓冲液洗涤细胞一次,随后离心并吸取上清液。洗涤后,在冰上加入用测定缓冲液1:200稀释的大鼠抗人IgG Alexa Fluor 647第二抗体(Biolegend,410714),持续20分钟。孵育后,将板离心并吸取上清液,然后用测定缓冲液洗涤细胞一次,随后离心并吸取上清液。洗涤后,向细胞中加入用测定缓冲液1:5000稀释的DAPI(Biolegend,422801)。在MiltenyiMACSQuant 16流式细胞仪上分析细胞结合。用FlowJo流式细胞术分析软件分析流式细胞术数据。为了制作图和计算EC50值,使用GraphPad Prism 9.3.0。
SUDHL-1和iTregADCC报告子测定:在补充有10%FBS(ATCC,30-2020)和1X青霉素-链霉素(Corning,30-002-CI)的RPMI 1640(ATCC,30-2001)中培养SUDHL-1细胞(ATCC,CRL-2955)。在补充有25μl/ml的Immunocult人CD3/CD28/CD2T细胞活化剂(STEMCELL,10970)和3000IU/ml的IL2(Miltenyi,130-097-74)的Immunocult XF T细胞扩增培养基(Stemcell,10981)中培养人诱导型Treg(iTreg)细胞。在补充有10%FBS(Sigma,F4135500)和100μg/mlNormocin的IMDM(ATCC,30-2005)中培养Jurkat NFAT/CD16细胞(Invivogen,jktl-nfat-cd16)。为了维持选择,在Jurkat NFAT/CD16细胞的每隔一次传代时,向生长培养基中加入10μg/ml的杀稻瘟菌素和100μg/ml的博莱霉素。
对于ADCC报告子测定,对SUDHL-1细胞或iTreg细胞进行计数,以评估细胞数量和活力。将细胞离心并以1×106个细胞/ml重悬于Xvivo 15培养基(Lonza,BE02-053Q)中。以5×104个细胞/孔接种于96孔板(VWR,89131-676)上。接种后,向细胞中加入在Xvivo 15培养基中浓度增加(0.32-5000ng/mL)的抗CD25抗体或对照抗体,在37℃和5%CO2下持续20分钟。用抗体孵育后,向每个孔中加入1×105个Jurkat NFAT/CD16细胞,然后在37℃和5%CO2下孵育16-17小时。孵育后,将测定板在室温下平衡15分钟,然后读板。为了观察报告细胞活化,向平底白色96孔板(VWR,89130-330)的相应孔中加入20μL的来自测定板每个孔的培养基以及50μL/孔的QUANTI-Luc Gold(Invivogen,rep-qlcg1)溶液。使用Promega GloMax酶标仪组,以0.5秒/孔的积分时间读取板的发光读数。通过从所有其他孔中减去空白孔的平均基线发光值来将数据标准化,并使用Graphpad Prism 9.3.0进行分析,包括计算EC50值。
磷酸化STAT5(pSTAT5)测定:在补充有10%FBS(VWR,45001-108)、1X青霉素-链霉素(VWR,45000-652)、100mg/mL normocin(Invivogen,Ant-nr-1)、1μg/mL嘌呤霉素(Invivogen,Ant-pr-1)的DMEM(VWR,45001-304)中培养HEK-Blue IL-2细胞(Invivogen,Hkb-il2)。在本测定中使用1X HEK-Blue CLR selection(Invivogen,HB-csm)。对于pSTAT5测定,使用补充有10%FBS、1X青霉素-链霉素和100mg/mL normocin的DMEM作为测试培养基。对HEK-Blue IL-2细胞进行计数,然后以1×106个细胞/mL重悬于PBS中。在冰上,用LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain(Thermo Fisher,L34957)将细胞染色30分钟。染色后,将细胞离心,然后用PBS洗涤。洗涤后,将细胞离心并用测试培养基重悬,然后以1×105个细胞/孔接种于96孔板(VWR,89089-826)中。接种后,将板离心,除去上清液,并将细胞重悬于含有浓度递增(0.1-100μg/mL)的抗CD25抗体或对照抗体的测试培养基中,在37℃和5%CO2下孵育15分钟。用抗体孵育后,向细胞中加入含有IL-2的测试培养基(VWR,10779-568),最终IL-2浓度为100ng/mL,并在37℃和5%CO2下再孵育10分钟。用IL-2孵育后,将板离心,除去上清液,并将细胞重悬于固定缓冲液(BD Biosciences,554655)中,在室温下孵育15分钟。固定后,将板离心,除去上清液,并用冰冷的FACS缓冲液(含2%FBS和2mM EDTA的PBS)洗涤细胞。洗涤后,将板离心,除去上清液,并将细胞重悬于冰冷的透化缓冲液(BDBiosciences,558050)中,在冰上孵育15分钟。之后,将板离心,除去上清液,并用冰冷的FACS缓冲液再洗涤细胞一次,然后向细胞中加入小鼠抗Stat5(pY694)Alexa Fluor 488(BDBiosciences,562075),在冰上孵育30分钟。孵育后,将板离心,除去上清液,用冰冷的FACS缓冲液洗涤细胞。在Miltenyi MACSQuant 16流式细胞仪上分析pSTAT5水平。用FlowJo流式细胞术分析软件分析流式细胞术数据,并在GraphPad Prism 9.3.0中绘制。GraphPadPrism 9.3.0也用于计算EC50值。
体外iTregADCC测定:iTreg分离和扩增:使用EasySep Treg阴性分离试剂盒(Stemcell,19232)从人外周血单核细胞中分离Treg细胞。将新鲜分离的Treg以106个细胞/mL接种于补充有25μl/ml的Immunocult人CD3/CD28/CD2T细胞活化剂(Stemcell,10970)和3000IU/mL的IL-2(Miltenyi Biotec,130-097-743)的人诱导型Treg(iTreg)细胞生长培养基(Immunocult XF T细胞扩增培养基(Stemcell,10981))中,用于Treg诱导。监测细胞的活力,并通过加入新鲜的iTreg生长培养基,每2-3天将活细胞密度调节至约1×106至2×106个细胞/mL。通过用CD3-BV605(BioLegend,317322)、CD4-PerCP/cy5.5(BioLegend,300530)、CD25-APC-cy7(BioLegend,302614)和FoxP3-FITC(BioLegend,320106)进行染色,评价分离的iTreg的纯度。
ADCC评价:对iTreg细胞进行计数,并评估细胞活力。将细胞离心并重悬于测定培养基(RPMI 1640,10%FBS,1%的青霉素/链霉素,5ng/ml的IL2)中。将5000个iTreg细胞接种在96孔板的每个孔中。接种细胞后,向细胞中加入浓度递增(0.64-10000ng/mL)的hIgG1同种型对照抗体或抗CD25抗体,在37℃和5%CO2下持续10分钟。之后,向96孔板的每个孔中加入105个外周血单核细胞(PBMC)(Stemcell,70025.1)。在37℃下,将细胞和抗体在5%CO2培养箱中孵育3天。用LIVE/DEADTM可固定的Aqua Dead Cell Stain Kit(Thermo Fisher,L34957)将样品染色,随后在冰上用TruStain FCX阻断抗体(BioLegend,422302)染色15分钟。之后,在冰上用抗人CD3-BV605(BioLegend,317322)、CD4-PerCP/Cy5.5(BioLegend,300530)、CD8a-APC(BioLegend,300912)、CD69-PE(BioLegend,31090)、CD25-APC-Cy7(BioLegend,302614)将细胞染色30分钟。然后将样品固定、透化,并在冰上进行FoxP3-FITC(BioLegend,320106)染色30分钟。
iTreg细胞被门控(CD3+、CD4+、CD25+、Foxp3+)。通过总iTreg中死亡的iTreg%(CD3+、CD4+、CD25+、Foxp3+、aqua Live/dead+)计算iTreg细胞裂解%。活化的CD4+细胞被门控(CD3+、CD4+、Foxp3-、CD69+)。通过总活化CD4+细胞中死亡的活化CD4+%(CD3+、CD4+、Foxp3-、CD69+、aqua Live/dead+)计算活化CD4+细胞裂解%。活化的CD8+细胞被门控(CD3+、CD8+、CD69+),通过总活化CD8+细胞中死亡的活化CD8+%(CD3+、CD8+、CD69+、aqua Live/dead+)计算活化CD8+细胞裂解%。
体内iTregADCC测定:IL2RA 人/人人源化小鼠用于这些实验。插入编码人IL2RA细胞外结构域的序列,以取代编码鼠IL2RA细胞外结构域的序列。纯合小鼠用于实验。在Biocytogen Pharmaceuticals(北京,中国)进行实验。
在用hIgG1同种型对照抗体或抗CD25抗体处理(每组4只小鼠)后3天,用抗凝剂(EDTA-K2)从小鼠眶窦中收集约120μL的血液。对于流式细胞术分析,将100μL的血液样品与1mL的红细胞裂解缓冲液在室温下混合5分钟,随后在4℃下以500g离心5分钟。使用自动化细胞计数器进行总细胞数量的计数和记录。将血细胞重悬于PBS中至流式细胞术所需的体积。将样品分成两组,以检测Treg和Teff细胞。
对于Treg检测,用抗CD16/CD32(Biolegend,101302)将样品在室温下染色15分钟,随后在冰上用含有小鼠CD45+-APC/cy7抗体(Biolegend,103116)、小鼠CD3+-Alexa Fluor700抗体(Biolegend,100216)、小鼠CD4+-FITC(Biolegend,100406)抗体、小鼠CD8+-BV605(Biolegend,100748)抗体、人CD25+-APC(Biolegend,302610)抗体的抗体混合物染色30分钟。之后,将样品固定、透化,并用小鼠Foxp3-PE/Cy7(eBioscience,25-5773-82)抗体进行染色。
对于CD4+和CD8+T效应细胞检测,用含有小鼠CD45+-APC/Cy7抗体(Biolegend,103116)、小鼠CD3+-Alexa Fluor 700抗体(Biolegend,100216)、小鼠CD4+-FITC(Biolegend,100406)抗体、小鼠CD8+-BV605(Biolegend,100748)抗体、小鼠CD44-PE抗体(Biolegend,103008)、小鼠CD62L-PerCP/Cy5.5抗体(Biolegend,104432)的抗体混合物将样品染色。通过流式细胞术分析计数。
主要免疫细胞结合测定:如上所述的从人PBMC中分离iTreg。在补充有10%FBS(Sigma,F4135)和1X青霉素-链霉素(Corbing,30-002-CI)的RPMI 1640(ATCC,30-2001)中培养SUDHL-1细胞(ATCC,CRL-2955)、人单核细胞(Stemcell,70034)、人泛B细胞(Stemcell,70023)、人泛T细胞(Stemcell,700024.1)、人效应记忆CD8+T细胞(Stemcell,200-0383)和人NK细胞(Stemcell,70036)。
制备由DPBS(VWR,45000-436)、2%FBS和0.1%EDTA(Quality Biological,351-027-721)组成的测定缓冲液,并将其保持在冰上备用。对细胞进行计数,并以1×105个细胞/孔接种于96孔板(VWR,89089-826)的测定缓冲液中。将板以300g离心5分钟,并除去上清液。以在测定缓冲液中10μg/mL的浓度向各孔中加入人IgG1同种型(Biolegend,403502)、达克珠单抗(Absolute antibody,Ab00187-10.0)、IBIO-101-CHO-WT(SD-889825-CW)、IBIO-101-CHO-afuc(SD-889825-CG)、IBIO-101-植物-WT(SD-889825-PW)、IBIO-101-植物-afuc(SD-889825-PC)。在冰上将细胞孵育20分钟。孵育后,通过将板以300g离心5min并除去上清液来洗涤细胞,然后用测定缓冲液洗涤细胞一次,并在离心后除去上清液。向细胞中加入用测定缓冲液(1:200)稀释的大鼠抗人IgG Alexa Fluor 647第二抗体(Biolegend,410714),随后在冰上、在黑暗中孵育20分钟。用第二抗体孵育后,用测定缓冲液洗涤细胞一次。然后,向细胞中加入用测定缓冲液1:5000稀释的DAPI(Biolegend,422801)。在MiltenyiMACSQuant 16流式细胞仪上分析细胞。用FlowJo(Becton,Dickinson&Company)分析软件分析流式细胞术数据。首先鉴定细胞群并通过它们的前向和侧向散射进行门控。通过使用侧向散射面积和侧向散射高度来门控单线态。使用DAPI(BV-421)的负染色鉴定活单线态细胞。然后从活细胞群中确定CD25-APC细胞。
SEC-HPLC:用于sec分析的样品制备:使用用流动相,200mm磷酸盐、pH 6.2、250mm氯化钾预处理的0.2μm旋转过滤器过滤所有样品,然后转移至300μl自动采样瓶进行分析。
SEC数据采集:将IBIO-101样品上样至TSKG3SWxl(5μm,7.8mm×30cm)和TSKGuardSwxl(7μm,6.0mm×4cm)上。用200mM磷酸盐、pH6.2、250mM氯化钾作为流动相以0.5mL/min进行色谱分析,在20-25℃下分析时间为30min。使用BEH200SEC标准(Waters)评估系统性能并提供保留时间参考。
数据处理:在自动设定中进行峰积分。在7.5-22min范围内对峰进行积分。从7.5min开始计算基线,并且肩部下降。推定主峰为完整的完全组装IBIO-101。
LC-MS-释放的聚糖分析:用于LC-MS分析的样品制备:去糖基化的完整样品用于本分析。
LC-MS数据采集:完整样品的LC-MS分析采用标准MS方法进行。使用Turbo VTM离子源,在5.3kV的电喷雾电势下进行分析物电离。气帘气设定在30psi。气体1和2压力均设定为80psi。气体2温度设定为675℃。MS扫描的质量范围为900Da-2000Da。累积时间为0.4s。TOFbin大小为80。方法持续时间为22min。使用以下参数进行HPLC:(i)BioZen Glycan(150X2.1,2.6um),(ii)A相是0.10%在H2O中的FA/,(iii)B相是0.10%在ACN中的FA;柱温箱设定为65℃,(iv)流速设定为0.43mL/min;梯度时间=25min。
LC-MS数据处理:将*.wiff格式的原始数据直接上传至PeakView软件,无另外的处理。基于聚糖分子量生成所提取的离子色谱图。
表1是CD25结合ELISA汇总表。表2A是SUDHL-1细胞结合测定汇总表。表2B是iTreg细胞结合测定汇总表。
表1.CD25结合ELISA:汇总表。
表2A.SUDHL-1细胞结合测定:汇总表。
表2B.iTreg细胞结合测定:汇总表。
表3A.SUDHL-1/NFAT CD16ADCC报告子测定:汇总表。
表3B.iTreg/NFAT CD16ADCC报告子测定:汇总表
表4.IL-2报告子HEK293pSTAT5测定:汇总表。
图17A至17E显示使用Carterra LSA表征的结合CD25的单克隆抗体(IBIO-101)的结合,图17A是在CHO细胞中制备的野生型Ab IBIO-101,图17B是在植物细胞中制备的野生型Ab IBIO-101,图17C是在CHO细胞中制备的非岩藻糖基化的IBIO-101,图17D是在植物细胞中制备的非岩藻糖基化的IBIO-101,图17E是达克珠单抗。
表5.IBIO-101结合动力学曲线在CHO和植物表达系统中类似。
抗体 | Kon(M-1s-1) | Koff(s-1) | KD(nM) | KD SD(nM) |
IBIO-101-CHO WT | 4.71E+05 | 1.92E-03 | 4.10 | 0.37 |
IBIO-101-CHO afuc | 4.99E+05 | 1.191E-03 | 3.9 | 1.03 |
IBIO-101一植物WT | 4.85E+05 | 1.196E-03 | 4.20 | 0.69 |
IBIO-101-植物afuc | 4.92E+05 | 2.07E-03 | 4.27 | 1.27 |
达克珠单抗 | 4.15E+05 | 7.40E-05 | 0.18 | 0.07 |
图13和图18显示IBIO-101表现出与SUDHL-1人淋巴瘤细胞系(图13)和诱导型人Treg(iTreg)(图18)上内源性表达的CD25的强结合。FACS分析显示在CHO和植物中制备的WT和非岩藻糖基化的IBIO-101分子以及达克珠单抗与SUDHL-1和iTreg上的CD25结合。绘制的值是中值荧光强度。EC50值是n≥3次实验的平均值。
图14和图19显示CHO和植物非岩藻糖基化IBIO-101类似地增强了针对SUDHL-1人淋巴瘤细胞系(图14)和诱导型人Treg(iTreg)(图19)的ADCC效力。NFAT CD16Jurkat ADCC报告细胞系用于显示在CHO和植物中制备的WT和非岩藻糖基化的IBIO-101以及达克珠单抗针对表达CD25的SUDHL-1和iTreg靶细胞的ADCC效力。EC50值是n≥3次实验的平均值。
图15是显示IBIO-101分子不抑制IL2/STAT5信号传导途径的图。FACS分析显示在HEK blue人IL2R过表达细胞系中,通过IL2或在达克珠单抗、IBIO-101-CHO-WT、IBIO-101-CHO-afuc、IBIO-101-植物-WT或IBIO-101-植物-afuc存在下的STAT5的剂量依赖性活化。STAT5活化通过对磷酸化的STAT5蛋白进行染色来测量。在CHO或植物中产生的岩藻糖基化和非岩藻糖基化的IBIO-101分子未显示对IL2/STAT5信号传导的抑制作用,而达克珠单抗显著抑制IL2对STAT5的活化。EC50值是n≥3次实验的平均值。
图20显示非岩藻糖基化的IBIO-101表现出强SUDHL-1人淋巴瘤细胞杀伤。FACS分析显示由CHO或植物制备的非岩藻糖基化的IBIO-101针对表达CD25的SUDHL-1靶细胞和作为效应细胞的人PBMC引发的细胞死亡。细胞毒性通过CFSE染色的靶细胞的live/deadBV510染料染色来测量。EC50值是n=3次实验的平均值。
图21显示IBIO-101分子显示出与表达CD25的SUDHL-1和诱导型人Treg(iTreg)细胞的高结合,但与其他主要免疫细胞的低结合。FACS分析显示在CHO和植物中制备的WT岩藻糖基化和非岩藻糖基化的IBIO-101分子以及达克珠单抗与人淋巴瘤SUDHL-1细胞和iTreg细胞的高水平结合。泛T细胞、NK细胞、单核细胞和CD8+效应T细胞表现出与IBIO-101分子的低水平结合。采用前向散射(FSC)相对所指示细胞类型中的CD25显示代表性FACS图,在每个图上示出与人IgG1同种型、IBIO-101分子或达克珠单抗的结合百分比;n=2。
图22显示IBIO-101分子未显示出与泛B细胞的特异性结合。FACS分析显示出在CHO和植物中制备的WT岩藻糖基化和非岩藻糖基化的IBIO-101分子以及达克珠单抗与泛B细胞类似地结合。结合信号的水平与仅用第二抗体的染色相当。采用前向散射(FSC)相对泛B细胞中的CD25显示代表性FACS图,在每个图上示出与人IgGl同种型、IBIO-101分子或达克珠单抗的结合百分比;n=2。
表6.iTreg消耗测定:汇总表。
图23显示iTreg消耗测定门控策略。
图24显示代表性FACS图的iTreg消耗,其显示出在iTreg、活化的CD4+和活化的CD8+细胞中用hIgG1同种型、达克珠单抗、IBIO-101-植物-afuc和IBIO-101-CHO-afuc处理的细胞毒性百分比。
图25A至25D显示在iBio-101处理后诱导型人Treg(iTreg)的选择性消耗。FACS分析显示在培养物中处理后3天,人IgG1同种型和达克珠单抗不显著消耗iTreg、活化的CD4+和CD8+细胞(分别为图25A和图25B)。然而,在CHO和植物中制备的非岩藻糖基化的iBio-101分子强烈诱导iTreg裂解,其中在同一处理期内的活化的CD4+和CD8+细胞中观察到最小细胞毒性水平(分别为图25C和图25D)。
Tg-hCD25小鼠:插入编码人IL2RA细胞外结构域的序列,以取代编码鼠IL2RA细胞外结构域的序列。本研究中的小鼠基因型是纯合子(IL2RA人/人)。Tg-hCD25小鼠腹膜内(IP)给予2.5mpk的IBIO-101-植物-afuc。在给药后5min、15min、30min、1小时、2小时、4小时和8小时收集血液样品,从第1天至第7天每天一次,从第7天至第17天每隔一天一次,从第17天至第28天每周两次。IBIO-101-植物-afuc在Tg-hCD25小鼠中表现出约47小时的半衰期,Tmax为2小时,Cmax为10.1μg/ml。每周两次2.5mpk腹膜内给药将提供人PBMC ADCC活性的EC90覆盖。因此,实施每周两次IP注射进行Tg-hCD25小鼠中的功效研究。
图26是显示iBio-101在hCD25TG小鼠中的药代动力学曲线的图。
图27显示iBio-101体内功效研究设计。评估IBIO-101-植物和IBIO-101-CHO针对当前S.O.C.的功效。探究IBIO-101作为单一药剂或与抗PD-1抗体组合。确定IBIO-101在经处理的小鼠的免疫细胞中的作用机制。
IBIO-101-植物和IBIO-101-CHO在B-hIL2RA小鼠皮下MC38结肠癌模型的处理中的功效的体内功效评估:对B-hIL2RA小鼠皮下注射MC38肿瘤细胞。肿瘤接种后约7天,当平均肿瘤大小达到约50-100mm3时,将荷瘤动物随机分入8个研究组。每组由7只小鼠组成。在分组日(第0天)给予初始治疗。基于PK研究曲线,每周给予供试品两次。使用卡尺以两种尺寸每周测量肿瘤大小两次,并且使用以下公式以mm3表示体积:V=0.5a×b2,其中a和b分别是肿瘤的长尺寸和短尺寸。在第3天Cmax区的高范围的中点收集血液,用于免疫分析(Treg与Teff的比率)作用机制。
图28是显示所有组的iBio-101体内功效研究结果-体重(BW)的图。动物按体重随机分组,然后在实验期间每周和实验结束前立即称重两次。在实验期间未观察到明显的临床体征和动物死亡,这表明动物对所有供试品均具有良好的耐受性。所有治疗组中平均体重随时间的变化类似,这表明所有治疗均无安全问题。
图29是显示iBio-101体内功效研究结果-肿瘤体积的结果的图。在最后一天,所有治疗组均显著不同于同种型载体(vehicle)。非岩藻糖基化的植物和CHO iBio-101抗体均表现出剂量依赖性抗肿瘤作用。非岩藻糖基化的植物或CHO iBio-101(1mpk)与抗PD1(2.5mpk)抗体的组合显示比单独的抗PD-1抗体显著更强的肿瘤抑制。数据是平均值±SEM。每组N=7。*p<0.05相对于同种型对照,#:p<0.05相对于抗PD1,双向ANOVA多重比较,随后Tukey检验。
图30A显示功效研究中对Treg的门控策略-第3天血液样品FACS分析。图30B显示功效研究中对CD4+和CD8+效应细胞的门控策略-第3天血液样品FACS分析。
图31显示代表性FACS图的第3天血液样品FACS分析,其显示出用hIgG1同种型、IBIO-101-CHO-afuc和IBIO-101-植物-afuc治疗后血液中的Treg百分比。
图32是显示第3天植物或CHO消耗的Treg与同种型对照消耗的Treg的比较的图。
图32A至32E显示IBIO-101分子在治疗后3天减少血液中的Treg细胞。FACS分析显示与仅抗PD1或人同种型对照相比,在CHO和植物中制备的非岩藻糖基化的IBIO-101分子对血液中的循环Treg(图33A)、CD4+效应细胞(图33B)和CD8+效应细胞(图33C)的剂量依赖性细胞毒性作用。CD4+效应/Treg细胞和CD8+效应/Treg细胞之间的比率分别显示于图33D和图33E中。绘制的值是平均细胞数量±SEM(n=4/组)。第1行-hIgG1同种型对照;第2行-抗PD1,2.5mg/kg;第3行-IBIO-101-植物-afuc,0.1mg/kg;第4行-IBIO-101-植物-afuc,1.0mg/kg;第5行-IBIO-101-CHO-afuc,0.1mg/kg;第6行-IBIO-101-CHO-afuc,1.0mg/kg;第7行-IBIO-101-植物-afuc,1.0mg/kg+抗PD1,2.5mg/kg;第8行-IBIO-101-CHO-afuc,1.0mg/kg+抗PD1,2.5mg/kg。
使用人工智能连同(injunction with)表位选择性抗体发现平台设计了一种新型CD25mAb IBIO-101。糖工程化的转基因本特哈曼烟草植物系(ΔXT/FT)用于产生基于植物的IBIO-101。基于植物的IBIO-101在动力学亲和力以及与人和食蟹猴而非小鼠CD25的选择性结合方面与CHO制备的IBIO-101相当。植物和CHO制备的IBIO-101均对SUDHL1(一种CD25高表达癌细胞系)和人iTreg细胞具有高亲和力,同时避开IL-2阻断信号传导途径。糖工程化的非岩藻糖基化的IBIO-101增强了ADCC活性和经由人PBMC的癌细胞杀伤,同时也消耗人Treg。植物和CHO制备的IBIO-101在通过消耗Treg细胞同时保留Teff细胞来减少hTg CD25小鼠的MC38(结肠癌)肿瘤中均表现出剂量依赖性。在MC38TgCD25小鼠异种移植模型中,IBIO-101在用抗PD1抗体组合疗法减少肿瘤中显示出累加作用。植物和CHO制备的IBIO-101之间效力的等同性证明基于CHO和植物的生物制品均是人癌症治疗的合适和可行的选择。
如本文体现和广泛描述的,本公开内容的一方面涉及结合人CD25的人源化抗体或结合片段,其中抗体或其结合片段包含以下、基本上由以下组成或由以下组成:SEQ ID NO:1或9的可变重链氨基酸序列,或包含与其至少70%序列同一性的序列;和SEQ ID NO:4或11的可变轻链氨基酸序列,或包含与其至少70%序列同一性的序列。一方面,抗体或结合片段包含SEQ ID NO:1或9的可变重链氨基酸序列,或包含与SEQ ID NO:1或9至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的序列。另一方面,抗体或结合片段包含SEQ ID NO:4或11的可变轻链氨基酸序列,或包含与SEQID NO:4或11至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的序列。另一方面,编码SEQ ID NO:1或9的核酸分别具有与SEQ IDNO:2、3或10所示的核酸序列至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性。另一方面,编码SEQ ID NO:4或11的核酸分别具有与SEQ ID NO:5、6或12所示的核酸序列至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性。另一方面,编码SEQ ID NO:4或9的核酸是为在植物中表达而优化的序列。另一方面,抗体还包含一个或多个框架区的突变。另一方面,抗体结合人CD25和食蟹猴CD25,但不结合小鼠或大鼠CD25。另一方面,与人CD25和食蟹猴CD25的结合的EC50比率为约0.75至约1.25。另一方面,抗体是非岩藻糖基化的。另一方面,抗体在CHO细胞或植物细胞的活细胞中是非岩藻糖基化的。另一方面,在与抗体或结合片段接触时,抗体或结合片段提高效应T细胞功能。
在另一实施方案中,本发明是包含上述人源化CD25抗体或其片段中的任一种、基本上由上述人源化CD25抗体或其片段中的任一种组成或由上述人源化CD25抗体或其片段中的任一种组成的药物组合物。
在另一实施方案中,本发明是编码上述人源化CD25抗体中的任一种的分离的核酸序列。
在另一实施方案中,本发明是包含上述分离的核酸的表达载体。
在另一实施方案中,本发明是包含上述核酸序列的载体。
在另一实施方案中,本发明是治疗有其需要的受试者的方法,其包括以下、基本上由以下组成或由以下组成:给予受试者治疗有效量的上述人源化CD25抗体中的任一种或药物组合物。
在另一实施方案中,本发明是消耗受试者中调节性T细胞的数量的方法,其包括以下、基本上由以下组成或由以下组成:给予受试者治疗有效量的上述人源化CD25抗体中的任一种或药物组合物。一方面,受试者患有癌症。另一方面,受试者患有自身免疫相关疾病或障碍。另一方面,提供给受试者共同治疗。
在另一实施方案中,本发明是消耗包含外周血单核细胞、基本上由外周血单核细胞组成或由外周血单核细胞组成的样品中调节性T细胞的数量的方法,其包括使样品与上述人源化CD25抗体中的任一种接触。
在另一实施方案中,本发明是包含上述抗体中的任一种或药物组合物、基本上由上述抗体中的任一种或药物组合物组成或由上述抗体中的任一种或药物组合物组成的药盒。
在另一实施方案中,本发明是包含上述表达载体、基本上由上述表达载体组成或由上述表达载体组成的根癌农杆菌细胞。
在另一实施方案中,本发明是制备具有抗癌活性的抗体的方法,该方法包括以下、基本上由以下组成或由以下组成:(a)将包含编码具有抗癌活性的SEQ ID NO:1和2的多肽,或包含与其至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的序列的多核苷酸的植物病毒载体导入植物;以及(b)以足以使抗体在至少一些植物细胞中表达的条件和时间维持植物。另一方面,导入包括真空渗入。另一方面,植物包含具有抗癌活性的抗体。另一方面,具有抗癌活性的抗体来自植物。另一方面,抗体具有抗癌活性。
应理解,虽然已经结合其详细描述对本发明进行了描述,但前述描述旨在说明而非限制本发明的范围,本发明的范围由所附权利要求的范围限定。其他方面、优点和修改在以下权利要求的范围内。
预期就本发明的任何方法、药盒、试剂或组合物而言,本说明书中讨论的任何实施方案都可以实施,反之亦然。此外,本发明的组合物可用于实现本发明的方法。
应理解,本文所述的特定实施方案通过说明显示,而非作为对本发明的限制。在不脱离本发明的范围的情况下,可以在各种实施方案中采用本发明的主要特征。本领域技术人员将认识到或仅使用常规实验就能够确定本文所述具体过程的许多等同方案。这样的等同方案被认为在本发明的范围内,并且被权利要求覆盖。
本说明书中提及的所有出版物和专利申请表示本发明所属领域的技术人员的技术水平。所有出版物和专利申请通过引用并入本文,其程度如同每个单独的出版物或专利申请被明确且单独地显示为通过引用并入。
当在权利要求和/或说明书中与术语“包含(comprising)”结合使用时,词语“一(a)”或“一(an)”的使用可以表示“一(one)”,但它也符合“一或多”、“至少一”和“一或多于一”的含义。权利要求中使用的术语“或”用于表示“和/或”,除非明确指出仅指备选方案或者备选方案是互相排斥的,尽管本公开内容支持仅指备选方案以及“和/或”的定义。在整个本申请中,术语“约”用于表示值包括设备误差的固有变化、用于确定该值的方法,或在研究受试者中存在的变化。
如本说明书和(多个)权利要求中所用,词语“包含(comprising)”(以及包含(comprising)的任何形式,诸如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”)、“具有(having)”(以及具有(having)的任何形式,诸如“具有(have)”和“具有(has)”)、“包括(including)”(以及包括(including)的任何形式,诸如“包括(includes)”和“包括(include)”)或“含有(containing)”(以及含有(containing)的任何形式,诸如“含有(contains)”和“含有(contain)”)是包括性的或开放式的,并且不排除另外的、未列举的要素或方法步骤。在本文提供的任何组合物和方法的实施方案中,“包含(comprising)”可以用“基本上由......组成”或“由......组成”代替。如本文所用,短语“基本上由......组成”要求指定的(多个)整数或步骤以及不实质上影响所要求保护的发明的特征或功能的那些。如本文所用,术语“组成(consisting)”仅用于表示所列出的整体(例如,特征、要素、特性、性质、方法/过程步骤或限定)或整体组(例如,(多个)特征、(多个)要素、(多个)特性、(多个)性质、方法/过程步骤或(多个)限定)的存在。
如本文所用的术语“或其组合”是指在术语前所列出的项目的所有排列组合。例如,“A、B、C或其组合”旨在包括以下中的至少一种:A、B、C、AB、AC、BC或ABC,并且如果在特定上下文中顺序是重要的,则还包括BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC或CAB。继续该实例,明确包括的是含有一个或多个项目或术语的重复的组合,诸如BB、AAA、AB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABB等。技术人员将理解,通常对任何组合中的项目或术语的数量无限制,除非从上下文中显而易见。
如本文所用,诸如但不限于“约”、“基本的(substantial)”或“基本上(substantially)”的近似词是指当如此修饰时被理解为不一定是绝对的或完美的,但将被认为对于本领域普通技术人员而言足够接近以保证将情况指明为存在的情况。描述可以改变的程度将取决于可以进行多大的改变,并且仍使本领域普通技术人员认识到修改的特征仍具有未修改的特征的所需特性和能力。一般,但受制于前述讨论,本文中由诸如“约”的近似词修饰的数值可以由所述值变化至少±1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、10%、12%或15%。
另外,提供本文的章节标题是为了符合37CFR 1.77下的建议或以其他方式提供组织线索。这些标题不应限制或表征可从本公开内容发布的任何权利要求中阐述的(多个)发明。具体地,例如,尽管标题称为“发明领域”,但这样的权利要求不应被该标题下描述所谓技术领域的语言限制。此外,“发明背景”部分中的技术描述不应被解释为承认技术是本公开内容中任何(多个)发明的在先技术。“概述”也不应被认为是对在所发布的权利要求中阐述的(多个)发明的表征。此外,在本公开内容中任何以单数形式对“发明”的称呼均不应用于主张本公开内容中仅存在单一的新颖点。可以根据本公开内容发布的多个权利要求的限定来阐述多个发明,并且这样的权利要求相应地限定由此保护的(多个)发明及其等同方案。在所有情况下,这样的权利要求的范围应根据本公开内容自身的优点来考虑,但不应被本文阐述的标题限制。
根据本公开内容,本文公开和要求保护的所有组合物和/或方法可以在无过度实验的情况下制备和实施。虽然本发明的组合物和方法已经就优选的实施方案进行了描述,但对于本领域技术人员显而易见的是,在不脱离本发明的构思、精神和范围的情况下,可以对本文所述的组合物和/或方法以及在本文所述的方法的步骤中或在本文所述的方法的步骤顺序中进行改变。对于本领域技术人员显而易见的所有这样的类似取代和修改被认为是在由所附权利要求限定的本发明的精神、范围和构思内。
为了帮助专利局和基于本申请发布的任何专利的任何读者解释本文所附的权利要求,申请人希望注明,除非在特定权利要求中明确地使用词语“用于......的方式”或“用于.........的步骤”,否则他们不打算因为35U.S.C.§112的第6段、U.S.C.§112的第(f)段或等同规定在本申请提交之日存在就让所附权利要求中的任一项对其援引。
对于权利要求中的每一项,每个从属权利要求均可以从属于独立权利要求和从属于每一个权利要求的在先从属权利中的每一项,只要在先权利要求为权利要求项目或要素提供了适当的在先基础。
Claims (30)
1.一种结合人CD25的人源化抗体或结合片段,其中所述抗体或其结合片段包含:
SEQ ID NO:1或9的可变重链氨基酸序列,或包含与其至少70%序列同一性的序列;以及
SEQ ID NO:4或11的可变轻链氨基酸序列,或包含与其至少70%序列同一性的序列。
2.权利要求1所述的人源化CD25抗体,其中所述抗体或结合片段包含SEQ ID NO:1或9的可变重链氨基酸序列,或包含与SEQ ID NO:1或9至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的序列。
3.权利要求1所述的人源化CD25抗体,其中所述抗体或结合片段包含SEQ ID NO:4或11的可变轻链氨基酸序列,或包含与SEQ ID NO:4或11至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的序列。
4.权利要求1所述的人源化CD25抗体,其中编码SEQ ID NO:1或9的核酸分别具有与SEQID NO:2、3或10所示的核酸序列至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性。
5.权利要求1所述的人源化CD25抗体,其中编码SEQ ID NO:4或11的核酸分别具有与SEQ ID NO:5、6或12所示的核酸序列至少75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性。
6.权利要求1所述的人源化CD25抗体,其中所述编码SEQ ID NO:4或9的核酸是为在植物中表达而优化的序列。
7.权利要求1所述的人源化CD25抗体,其中所述抗体或结合片段还包含一个或多个框架区的突变。
8.权利要求1至7中任一项所述的人源化CD25抗体,其中所述抗体或结合片段结合人CD25和食蟹猴CD25,但不结合小鼠或大鼠CD25。
9.权利要求1至8中任一项所述的人源化CD25抗体,其中与人CD25和食蟹猴CD25的结合的EC50比率为约0.75至约1.25。
10.权利要求1至9中任一项所述的人源化CD25抗体,其中所述抗体或结合片段是非岩藻糖基化的。
11.权利要求1至9中任一项所述的人源化CD25抗体,其中所述抗体或结合片段在CHO细胞或植物细胞的活细胞中是非岩藻糖基化的。
12.权利要求1至11中任一项所述的人源化CD25抗体,其中在与所述抗体或结合片段接触时,所述抗体或结合片段提高效应T细胞功能。
13.一种药物组合物,其包含权利要求1至11所述的人源化CD25抗体或结合片段中的任一种。
14.一种分离的核酸序列,其编码权利要求1至11中任一项所述的人源化CD25抗体或结合片段中的任一种。
15.一种表达载体,其包含权利要求14所述的分离的核酸。
16.一种载体,其包含权利要求14所述的核酸序列。
17.一种治疗有其需要的受试者的方法,其包括给予所述受试者治疗有效量的权利要求1至11所述的人源化CD25抗体或结合片段中的任一种或权利要求13所述的药物组合物。
18.一种消耗受试者中调节性T细胞的数量的方法,其包括给予所述受试者治疗有效量的权利要求1至11所述的人源化CD25抗体或结合片段中的任一种或权利要求13所述的药物组合物。
19.权利要求17或18所述的方法,其中所述受试者患有癌症。
20.权利要求17或18所述的方法,其中所述受试者患有自身免疫相关疾病或障碍。
21.权利要求17或18所述的方法,其中提供给所述受试者共同治疗。
22.一种消耗包含外周血单核细胞的样品中调节性T细胞的数量的方法,其包括使所述样品与权利要求1至11所述的人源化CD25抗体或结合片段中的任一种接触。
23.一种药盒,其包含权利要求1至11所述的抗体中的任一种或权利要求13所述的药物组合物。
24.一种根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)细胞,其包含权利要求12所述的表达载体。
25.一种制备具有抗癌活性的多肽的方法,所述方法包括:
(a)将包含编码具有抗癌活性的SEQ ID NO:1或3和5、或9和10的多肽的多核苷酸的植物病毒载体导入植物;以及
(b)以足以使所述多肽在至少一些植物细胞中表达的条件和时间维持所述植物。
26.权利要求25所述的方法,其中所述导入包括真空渗入。
27.权利要求25所述的方法,其还包括收获所述植物,其中所述植物包含所述具有抗癌活性的多肽。
28.权利要求27所述的方法,其还包括从所述植物中提取所述具有抗癌活性的多肽。
29.权利要求28所述的方法,其还包括纯化所述具有抗癌活性的多肽。
30.权利要求25所述的方法,其中所述抗体具有抗体依赖性细胞毒性活性。
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