CN118139884A - 人源化抗clec-1a抗体和其抗原结合片段及其模拟物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及免疫疗法领域。本发明提供了新的特异性人源化抗CLEC‑1A抗体、其抗原结合片段及其模拟物，特别是抗体。本发明的化合物能够特异性地与CLEC‑1A受体结合，并且拮抗CLEC‑1A与其内源性配体的结合。使用本发明的化合物可用于治疗有害病况。
Description
技术领域
本发明涉及免疫疗法领域。本发明提供了新的特异性人源化抗CLEC-1A抗体。本发明的抗体能够与CLEC-1A特异性结合，并且是人CLEC-1A的拮抗剂，特别地，本发明的抗体拮抗CLEC-1A与其至少一种配体的结合，特别是其内源性配体。本发明的化合物的用途可以是用于治疗有害病况，包括但不限于癌症。
背景技术
利用患者免疫系统的免疫疗法预示着个性化医疗的新时代，为具有严重疾病的患者提供了治愈反应的希望。细胞介导的免疫可消除或预防疾病，包括但不限于癌症、自身免疫性疾病和过敏性疾病。疗法的最新发展包括细胞工程、疾病靶向和患者免疫系统的调节，以提供对疾病的更集中和有效的反应。在这些策略中，使用免疫检查点抑制剂或活化剂的免疫疗法已成为对抗这些疾病的必要武器，最特别是用于治疗癌症。这些分子通常由免疫系统细胞(例如T细胞或树突状细胞)表达，但也由一些癌细胞表达，它们增强对患者的免疫反应，并保持或启动针对致病细胞的免疫细胞反应。免疫检查点是指固有连接到免疫系统的大量抑制路径，其对于维持自我耐受和最大限度地减少侧支组织损伤至关重要。
C型凝集素受体(C-type lectin receptor；CLR)是跨膜可溶性受体的一大家族。这些受体含有一个以上的碳水化合物识别结构域，它们能够识别病原体或自身蛋白质上的多种聚糖。对于这些受体，聚糖识别依赖于Ca2+。尽管如此，许多相关的CLR仍然能够识别碳水化合物，但独立于Ca2+；这些受体被称为C型凝集素样受体(C-type lectin-likereceptor；CTLR)。这些受体因其在联结先天免疫和适应性免疫中的作用而特别地令人感兴趣。CTLR主要由髓系细胞表达，例如单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞(DC)和中性粒细胞。CTLR不仅作为抗原摄取受体用于内化和呈递给T细胞，而且还触发导致NF-κB、I型干扰素(IFN)和/或炎症小体活化的多种信号路径。凭借其呈递抗原和确保细胞活化和抑制之间平衡的能力，CTLR已成为治疗多种疾病(包括癌症、自身免疫性疾病或过敏反应)的具有挑战性的药理学靶点。CTLR调节似乎代表了一种很有前途的疾病管理策略，尽管仍然需要尝试识别内源性配体并解释它们在免疫中的作用。
在这些CTLR中，一个名为CLEC-1的特定成员，也指首字母缩略词CLEC1、CLEC1A、CLEC-1A、CLEC1受体、CLEC1A受体和CLEC-1A受体，特别地令人感兴趣。尽管C型凝集素样受体-1(CLEC-1)在几年前就被发现，但仍未表征下游的信号传导和配体。在人类和啮齿动物中，CLEC1由髓样细胞(例如，单核细胞、树突状细胞和巨噬细胞)表达，但也由内皮细胞表达。CLEC-1表达由促炎刺激降低，由TGFβ增强。有趣的是，发现CLEC-1主要在细胞内表达，特别是在人内皮细胞和中性粒细胞中，这表明细胞表面的表达需要特定条件。
本申请发明人首次显示，CLEC-1A在细胞表面由常规树突状细胞(conventionalDendritic Cell；cDC)以及人血液中单核细胞和DC的小亚群表达，并由免疫抑制性细胞因子TGFβ增强(参见国际申请号WO2018073440)。发明人显示，人CLEC-1A由M2型促肿瘤性巨噬细胞、来自胸腔积液间皮瘤和来自卵巢肿瘤腹水的髓样细胞表达。发明人在啮齿动物和人类中都证明，CLEC-1在髓样细胞中充当抑制性受体，并阻止IL12p40表达和下游的Th1和Th17体内反应。
发明人还显示，使用抗hCLEC-1A抗体作为CLEC-1A拮抗剂可增加人T细胞增殖和人IFN-γ。发明人还证明，缺乏CLEC-1的小鼠对肿瘤生长有更好的抵抗力，并且在肝癌小鼠模型中表现出增加的存活率。因此，CLEC-1A作为细胞表面受体可能是一种有用的治疗工具，可在临床环境中增强抗肿瘤免疫力。
在这种情况下，发明人首次提供了人源化抗CLEC-1A抗体，其识别并与人CLEC-1A的细胞外结构域特异性结合，其是人CLEC-1A的拮抗剂，特别地，其适用于拮抗CLEC-1A与其至少一种配体(特别是内源性配体)的结合，并且在体外使用时与调节(特别是增加)髓样细胞(特别是树突状细胞和/或巨噬细胞)对肿瘤细胞和/或继发性坏死细胞的吞噬作用相关。在本发明的特定实施方式中，提供了人源化抗CLEC-1A抗体，其识别并与人CLEC-1A的细胞外结构域特异性结合，其是人CLEC-1A的拮抗剂，特别地，其适用于拮抗CLEC-1A与其至少一种配体(特别是内源性配体)的结合，并且在体外使用时与调节(特别是增加)巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用相关。
如本发明的实施例所示，首次提供了人源化抗CLEC-1A抗体和其抗原结合片段及其模拟物(特别是抗CLEC-1A抗体)，它们在体内和/或体外使用时具有与调节(特别是增加)髓样细胞(特别是树突状细胞和/或巨噬细胞)对肿瘤细胞和/或继发性坏死细胞的吞噬作用相关的能力。与现有技术中公开的抗CLEC-1A抗体(WO 2018/073440A1和Robles等的文献(Blood advances 2017)，其用于发明的一些工作实施例中，与CLEC-1A结合并且是人CLEC-1A的拮抗剂)相比，本说明书中显示根据本发明的任何实施方式的人源化抗体在体外使用时与调节(特别是增加)免疫系统细胞对肿瘤细胞的吞噬作用相关。与CLEC-1A相互作用的肿瘤细胞和/或继发性坏死细胞逃脱表达CLEC-1A的髓样细胞的吞噬作用。本发明的抗体与CLEC-1A相互作用的方式防止CLEC-1A与肿瘤细胞和/或继发性坏死细胞(其通常与表达CLEC-1A的细胞相互作用)之间的功能上的相互作用，这种相互作用防止肿瘤细胞逃避吞噬作用。如本发明所示，现有技术(WO 2018/073440A1和Robles等(Blood advances 2017)的文献)中公开的抗CLEC-1A抗体拮抗剂在本发明的一些实施例中使用，与髓样细胞(特别是树突状细胞和/或巨噬细胞)对肿瘤细胞吞噬作用的调节无关。只有当实施例中存在本发明的抗体时，才显示了肿瘤细胞吞噬作用的调节。当存在本发明的抗体、其抗原结合片段或其模拟物时，不阻止表达CLEC-1A的髓样细胞、特别是表达CLEC-1A的树突状细胞和/或巨噬细胞、特别是巨噬细胞发挥其对肿瘤细胞和/或继发性坏死细胞的吞噬能力。当施用本发明的化合物时，达到了几种非常有利的生物效应，特别是与髓样细胞(包括树突状细胞和/或巨噬细胞)的吞噬能力相关。本发明的抗体是CLEC-1A的适合的拮抗剂，与树突状细胞和/或巨噬细胞(例如活化的巨噬细胞)的吞噬能力的调节(特别是增加)相关。本发明的抗CLEC1A抗体及其抗原结合片段(特别是抗CLEC-1A抗体)的施用，通过拮抗CLEC-1A与肿瘤细胞和/或继发性坏死细胞表达的靶标(至少一种配体)的结合，与树突状细胞和/或巨噬细胞对肿瘤细胞和/或癌细胞和/或继发性坏死细胞的吞噬作用增强相关。当表达CLEC-1A的巨噬细胞或树突状细胞与表达CLEC-1A的一种配体的细胞相互作用时，这些巨噬细胞或树突状细胞的吞噬能力受到抑制或降低。表达CLEC-1A配体的肿瘤细胞和继发性坏死细胞逃脱巨噬细胞和树突状细胞的吞噬作用。如本发明的实施例所示，当施用本文公开的抗CLEC1A抗体时，通过拮抗CLEC-1A与肿瘤细胞的相互作用，去除了对巨噬细胞和树突状细胞(特别是巨噬细胞)的吞噬能力的抑制，从而导致巨噬细胞和树突状细胞(特别是巨噬细胞)对肿瘤细胞的吞噬。
除了它们通过髓样细胞对肿瘤细胞和/或继发性坏死细胞的吞噬作用外，本发明的人源化抗体还可调节(特别是增强或增加)T细胞的增殖和/或T细胞的活化。
本文所述的抗体可在重组生产系统中高效生产，允许提供展现上述功能性特征的嵌合或(完全)人源化抗体，其数量足以用于进一步开发。
此外，与其小鼠同源物及其嵌合等效物相比，本发明的人源化抗体和其抗原结合片段及其模拟物(特别是抗体)对人CLEC-1A具有特异性亲和性，因为本发明的抗体在体外不与小鼠CLEC-1A蛋白发生交叉反应。此外，如本发明的实施所示，本发明的抗CLEC-1A化合物(特别是抗CLEC-1A抗体)在体外与在人细胞的细胞膜上表达的CLEC-1A的细胞外结构域特异性结合。
在本发明的实施方式中，本发明的抗体和其抗原结合片段及其模拟物破坏了髓样细胞(特别是树突状细胞和/或巨噬细胞)表达的CLEC-1A与继发性坏死细胞和/或肿瘤细胞(例如存在于患有癌症或发展癌症的宿主中的肿瘤细胞)和/或继发性坏死细胞和/或肿瘤细胞的细胞内容物之间的相互作用。本申请发明人确定，CLEC-1A的配体可被受损细胞或肿瘤细胞表达或过表达，但不一定在这些细胞的膜上表达，因此可参与抗肿瘤免疫并改善免疫细胞诱导的肿瘤细胞的死亡。
因此，提供了人源化抗体、其抗原结合片段及其模拟物，发明人为此提供了证据，证明它们：
-与人CLEC-1A、特别是人细胞的细胞膜上表达的CLEC-1A特异性结合；
-是人CLEC-1A的拮抗剂，特别适用于拮抗CLEC-1A与其至少一种配体(特别是其内源性配体之一)的结合，并且具有比嵌合抗体更好的对人CLEC-1A与其配体之一结合的拮抗能力；
-可以可观的产量回收，允许提供具有上述功能性特征的抗体，其数量足以用于进一步开发；以及
-当在体内和/或体外使用时，与髓样细胞(特别是树突状细胞和/或巨噬细胞)对肿瘤细胞和/或继发性坏死细胞的吞噬作用的调节(特别是增加)相关。
这种抗体和其抗原结合片段及其模拟物特别适用于它们在预防和/或治疗多种疾病或有害病况中的用途(特别是当树突状细胞和/或巨噬细胞的吞噬作用需要改善时)，更特别是用于调节对肿瘤细胞和/或继发性坏死细胞的吞噬作用，优选髓样细胞的吞噬活性，特别是用于提高树突状细胞和/或巨噬细胞的吞噬能力，通过增加髓样细胞(特别是树突状细胞和/或巨噬细胞)对肿瘤细胞的吞噬作用来改善疾病的结果。
这些化合物也可以特别适合用于它们在预防和/或治疗多种疾病中的用途，特别是用于调节T细胞反应，特别是通过增强T细胞的活化和/或增殖。
在本发明的具体实施方式中，人源化抗CLEC-1A抗体和其抗原结合片段及其模拟物适合用于减少髓源性抑制细胞的总数，从而导致免疫抑制性细胞(例如但不限于免疫抑制性髓样细胞的减少)。
发明内容
因此，在本发明的第一方面，公开了一种抗体、其抗原结合片段或其模拟物，所述抗体、其抗原结合片段或其模拟物与人C型凝集素样受体-1成员A受体(CLEC-1A受体)的细胞外结构域特异性结合，所述抗体、其抗原结合片段或其模拟物包含：
·抗体重链可变结构域，所述抗体重链可变结构域包含VHCDR1(SEQ ID NO：10)、VHCDR2(SEQ ID NO：11)、VHCDR3(SEQ ID NO：12)；以及抗体轻链可变结构域，所述抗体轻链可变结构域包含VLCDR1(SEQ ID NO：13)、VLCDR2
(SEQ ID NO：14)、VLCDR3(SEQ ID NO：15)；或者
·抗体重链可变结构域，所述抗体重链可变结构域包含VHCDR1(SEQ ID NO：16)、VHCDR2(SEQ ID NO：17)、VHCDR3(SEQ ID NO：18)；以及抗体轻链可变结构域，所述抗体轻链可变结构域包含VLCDR1(SEQ ID NO：19)、VLCDR2
(SEQ ID NO：20)、VLCDR3(SEQ ID NO：21)；或者
·抗体重链可变结构域，所述抗体重链可变结构域包含VHCDR1(SEQ ID NO：22)、VHCDR2(SEQ ID NO：23)、VHCDR3(SEQ ID NO：24)；以及抗体轻链可变结构域，所述抗体轻链可变结构域包含VLCDR1(SEQ ID NO：25)、VLCDR2
(SEQ ID NO：26)、VLCDR3(SEQ ID NO：27)。
根据本实施方式的抗体、其抗原结合片段或其模拟物适合用于拮抗人CLEC-1A，同时其对此受体的结合特性是特异性的。此外，在不同的细胞系(包括但不限于哺乳动物细胞系)中进行生产，其产量适合用于达到候选药物开发的目的。此外，根据本实施方式的抗体、其抗原结合片段能够增强髓样细胞(特别是树突状细胞和/或巨噬细胞)对肿瘤细胞和/或继发性坏死细胞的吞噬作用。
发明人合成了几种抗CLEC-1A人源化抗体，所述抗CLEC-1A人源化抗体各自包含重链可变结构域和轻链可变结构域的组合。因此，在本发明的第二方面，提供了一种抗体或其抗原结合片段，其中
·抗体重链可变结构域，所述抗体重链可变结构域包含或由SEQ ID NO：3中所示的氨基酸序列组成；以及抗体轻链可变结构域，所述抗体轻链可变结构域包含或由SEQ IDNO：4中所示的氨基酸序列组成；或者
·抗体重链可变结构域，所述抗体重链可变结构域包含或由SEQ ID NO：5中所示的氨基酸序列组成；以及抗体轻链可变结构域，所述抗体轻链可变结构域包含或由SEQ IDNO：7中所示的氨基酸序列组成；或者
·抗体重链可变结构域，所述抗体重链可变结构域包含或由SEQ ID NO：6中所示的氨基酸序列组成；以及抗体轻链可变结构域，所述抗体轻链可变结构域包含或由SEQ IDNO：7中所示的氨基酸序列组成；或者
·抗体重链可变结构域，所述抗体重链可变结构域包含或由SEQ ID NO：8中所示的氨基酸序列组成；以及抗体轻链可变结构域，所述抗体轻链可变结构域包含或由SEQ IDNO：9中所示的氨基酸序列组成。
在另一方面，本发明涉及一种人源化抗体、其抗原结合片段或其模拟物，所述人源化抗体、其抗原结合片段或其模拟物与人C型凝集素样受体-1成员A受体(CLEC-1A受体)的细胞外结构域特异性结合，并且在体内和/或体外使用时，与阴性对照相比与调节(特别是增加)髓样细胞(特别是树突状细胞和/或巨噬细胞)对肿瘤细胞和/或继发性坏死细胞的吞噬作用的相关，特别是与阴性对照相比调节(特别是增加)至少10％、更特别是至少20％。
在另一方面，本发明涉及本文公开的人源化抗CLEC-1A抗体、其抗原结合片段或其模拟物，用于治疗疾病或有害病况的用途，特别是，树突状细胞和/或巨噬细胞所发挥的吞噬作用需要改善，和/或树突状细胞和/或巨噬细胞的吞噬能力的提高治疗疾病或有害病况。
在另一方面，本发明涉及如上所述的人源化抗CLEC-1A抗体和其抗原结合片段及其模拟物，用于它们在预防和/或治疗疾病或病症中的用途，其中，髓样细胞(特别是树突状细胞和/或巨噬细胞)的吞噬能力的调节可改善疾病或病症的结果，特别是通过调节对肿瘤细胞和/或继发性坏死细胞的吞噬作用，其中，所述抗CLEC-1A抗体、其抗原结合片段或其模拟物是人CLEC-1A和CLEC-1A配体表达细胞(特别是表达CLEC-1A配体的肿瘤细胞或癌细胞和/或继发性坏死细胞)之间相互作用的拮抗剂。可使用吞噬作用测定法来识别这些抗体或其抗原结合片段，例如，本发明实施例中记载的吞噬作用测定法，包括通过流式细胞术或显微镜。在本发明的更具体的实施方式中，所述人源化抗体、其抗原结合片段或其模拟物与阴性对照相比能够增强髓样细胞(特别是树突状细胞和/或巨噬细胞)对癌细胞和/或继发性坏死细胞的吞噬作用，特别是与阴性对照相比增强至少10％、更特别是至少20％。在特定实施方式中，吞噬作用可根据以下实验进行评估：
用M-CSF(100ng/mL)从单核细胞产生巨噬细胞(MΦ)，持续5天；
然后将巨噬细胞(MΦ)与抗CLEC1化合物预孵育2小时，然后分别在10ng/mL下与非霍奇金淋巴瘤(Raji；CD20+)和抗CD20 mAb(利妥昔单抗；Rituximab)一起培养提供“吃掉我(Eat-me)”信号，持续4小时。
通过显微镜进行吞噬分析，吞噬的百分比由总巨噬细胞中pHrodo(pHrodo-SE，Thermofisher)阳性Raji细胞的百分比计算。
在另一方面，本发明涉及如上所述的人源化抗CLEC-1A抗体或其抗原结合片段或其模拟物，用于其在预防和/或治疗其中T细胞具有有害作用的疾病或病症中的用途，其中，所述抗CLEC-1A抗体、其抗原结合片段或其模拟物是人CLEC-1A与继发性坏死细胞和/或肿瘤细胞和/或存在于患有癌症或发展癌症的宿主中的肿瘤细胞和/或渗透性继发性坏死细胞的细胞内容物和/或渗透性肿瘤细胞的细胞内容物之间相互作用的拮抗剂。
在另一方面，本发明涉及一种增加髓样细胞(特别是树突状细胞和/或巨噬细胞)的吞噬能力的方法，所述方法包括对有需要的患者施用有效量的本发明的人源化抗CLEC-1A抗体、其抗原结合片段或其模拟物，特别是根据本文公开的任何实施方式的抗CLEC1A抗体；特别地，所述抗CLEC-1A抗体、其抗原结合片段或其模拟物与常规治疗或本文定义的至少一种的第二治疗剂同时、单独或依次施用。
在另一方面，本发明涉及如上所述的人源化抗CLEC-1A抗体、其抗原结合片段或其模拟物，用于其在治疗癌症中的用途，特别是用于治疗液体或实体癌，更特别是用于治疗淋巴瘤、结直肠癌、间皮瘤或肝癌。
在本发明的另一方面，本发明涉及治疗化合物组合，所述化合物组合包含作为第一治疗化合物的CLEC-1A拮抗剂抗体、其抗原结合片段或其模拟物(特别是抗CLEC-1A抗体)，以及至少一种第二治疗化合物，所述第二治疗化合物选自免疫治疗剂(特别是肿瘤靶向抗体，特别是适合用于活化和/或增强巨噬细胞、特别是M1巨噬细胞的吞噬能力的抗肿瘤靶向抗体)或化疗剂或放疗剂。本申请发明人已经显示，这些组合特别适合用于治疗癌症。如本发明的实施例所示，这些组合在癌症的治疗中发挥协同作用，导致肿瘤生长、肿瘤体积的急剧减少和/或提高生存率。
附图说明
图1显示了肿瘤细胞(非霍奇金淋巴瘤细胞(Raji细胞)(A)；结肠癌细胞(DLD-1)(B)；乳腺癌细胞(SK-BR3)(C)；非霍奇金淋巴瘤细胞(Raji细胞)(D)；以及肺癌细胞(NSCLC)(E))的吞噬作用测定法。A、B和C中存在本发明的人源化抗体(11H11、14H9和6C5)，与现有技术的抗CLEC-1A抗体(αCLEC-1对照mAb-D和E)相比较，其对应于WO2018073440A1和Robles等(Blood advances，2017)中公开的抗CLEC-1A抗体。同型对照是人源化无关抗体。根据使用的mAb的同型，通过对Clec-1阻断的TGFb-DC(在PBS或对照抗体下吞噬肿瘤细胞)的频率进行归一化来测定吞噬作用的比例。
图2显示了肿瘤细胞(非霍奇金淋巴瘤细胞(Raji细胞)(A)；结肠癌细胞(DLD-1)(B)；乳腺癌细胞(SK-BR3)(C)；非霍奇金淋巴瘤细胞(Raji细胞)(D)的吞噬作用测定法：在存在本发明的人源化抗体(11H11、14H9和6C5)以及1ng/mL的利妥昔单抗(A)、西妥昔单抗(B)和曲妥单抗(C)，与在D中现有技术的抗CLEC-1A抗体(αCLEC-1对照mA，对应于WO2018073440A1和Robles等(Blood advances，2017)中公开的抗CLEC-1A抗体)与1ng/mL的利妥昔单抗组合使用相比较。同型对照是一种人源化无关抗体。根据使用的mAb的同型，通过对Clec-1阻断的TGFb-DC(在PBS或对照抗体下吞噬肿瘤细胞)的频率进行归一化来测定吞噬作用的比例。
图3显示了本发明的抗CLEC1抗体对肝癌小鼠模型(HCC模型)的影响。抗CLEC1抗体(人源化6C5或人源化14H9，3mg/kg)的抗肿瘤作用在小鼠肝癌的正交模型中每周两次i.p.给药，持续3周(第0天通过门静脉注射2.5×106的Hepa 1.6细胞)。对照组(3mg/kg)使用同型对照抗体。
图4显示了本发明的抗CLEC1抗体对结直肠癌小鼠模型(CRC模型)的影响。抗CLEC1抗体(人源化6C5，3mg/kg)的抗肿瘤作用每周两次i.p.给药，持续3周，并与化疗(在小鼠结直肠癌的同源模型中(0.5×106个MC38细胞在第0天皮下注射)，当肿瘤达到50-100mm3时，环磷酰胺100mg/kg一次)组合。对照组采用同型对照抗体(3mg/kg)。
图5显示了人源化抗CLEC1抗体对Fc-CLEC1渗透性Raji相互作用的拮抗剂活性研究(通过FACS)：对不同的抗CLEC1抗体进行了剂量反应测试：6C5、14H9和1H11(本发明的人源化抗CLEC-1A抗体)以及作为阴性对照的同型对照。曲线表示在与抗CLEC1抗体竞争后，10nM的Fc-CLEC1-A488在Raji细胞上的结合百分比。通过细胞计数法评估具有固定浓度(10nM)的A488标记的FcCLEC的渗透性Raji和人源化14H9(▲)、人源化11H11(◆)、人源化6C5(□)和同型对照(+)。在CytoFlex细胞计数器上进行显示，值对应于染色细胞的百分比(％)。
图6显示了抗CLEC1抗体(包括本发明的人源化抗CLEC-1A抗体14H9、11H11和6C5)对Fc-CLEC1渗透性NALM6细胞系的拮抗剂活性研究。曲线表示在与抗hCLEC1抗体竞争后，10nM的Fc-CLEC1-A488在PBMC上的结合百分比。通过细胞计数法评估具有固定浓度(100nM)的A488标记的FcCLEC的渗透性NALM6和人源化14H9(▲)、人源化11H11(◆)、人源化6C5(□)和同型对照(+)。在CytoFlex细胞计数器上进行显示，值对应于染色细胞的百分比(％)。
图7显示了抗CLEC1抗体(包括本发明的人源化抗CLEC-1A抗体14H9、11H11和6C5)对原生Fc-CLEC1非渗透性NALM6细胞系的拮抗剂活性研究。曲线表示在与抗hCLEC1抗体竞争后，100nM的Fc-CLEC1-A488在NALM6上的结合百分比。通过细胞计数法评估具有固定浓度(100nM)的A488标记的FcCLEC的非渗透性NALM6和人源化14H9(▲)、人源化11H11(◆)、人源化6C5(□)和同型对照(+)。在CytoFlex细胞计数器上进行显示，值对应于染色细胞的百分比(％)。
图8显示了人源化和嵌合抗CLEC1抗体(Hepa1.6细胞系上的6C5抗体(A)、1H11抗体(B)和14H9抗体(C))的拮抗剂活性研究。表(D)显示了每种人源化和嵌合抗体的EC50。曲线(A至C)表示根据抗CLEC-1嵌合(空圆圈)或人源化(实心圆圈)mAb的浓度归一化为同型对照抗体条件的Fc-CLEC-1阳性存活细胞的百分比。EC50是指每种人源化和嵌合抗CLEC1A抗体达到这个测定法中的最大信号的50％所需的浓度。
图9显示了在MC38细胞系上人源化和嵌合抗CLEC1抗体(6C5抗体(A)和1H11抗体(B))的拮抗剂活性研究。表(C)显示了每种人源化抗体和嵌合抗体的EC50。曲线(A至C)表示根据抗CLEC-1嵌合(空圆圈)或人源化(实心圆圈)mAb的浓度归一化为同型对照抗体条件的Fc-CLEC-1阳性存活细胞的百分比。EC50是指每种人源化和嵌合抗CLEC1A抗体达到这个测定法中最大信号的50％所需的浓度。
图10显示了本发明的人源化抗CLEC-1A抗体6C5、14H9和11H11在HEK细胞(A)和CHO细胞(B)中的生产率。表(C)显示了在最后的细胞系中，与对照抗CLEC-1A抗体生产相比，回收的抗体的产量。
图11显示了通过Blitz测量的本发明的人源化抗体对人CLEC-A-his重组蛋白的结合亲和力(KD)、亲和常数(ka)和解离常数(kd)。
图12显示了本发明的不同的人源化抗CLEC1抗体在固定化的CLEC-1A-his重组蛋白(A)和Fc-CLEC-1A(B)上的剂量反应上的结合研究。
图13显示了通过流式细胞术(FACS)通过ELISA在人U266细胞系上进行的本发明的人源化CLEC1抗体的结合研究。
图14显示了本发明的不同的人源化CLEC1抗体及其突变版本的结合研究。
具体实施方式
表述“继发性坏死细胞”或“继发性坏死下的细胞”相应地定义了已经进展到以过度浓缩的核染质(固缩)和核破裂(核崩解)为特征的细胞变化阶段的细胞(包括本文公开的细胞系)，并且可能具有细胞质膜破裂、活化半胱天冬酶-3的释放、进一步可能的细胞质肿胀和溶酶体膜渗透的附加特征。继发性坏死下的细胞是细胞凋亡过程进行到自溶性坏死结果的细胞，即细胞崩解的自溶过程。表述“继发性坏死细胞”或“继发性坏死下的细胞”可以类似地通过参考凋亡细胞中这一特定阶段的标志物来合适地定义，其中，标记物是已知的，并且使用的标志物还可区分继发性坏死细胞与早期凋亡细胞或原代坏死细胞。这些标志物包括标记缀合的膜联蛋白V和碘化丙啶(PI)：已知早期凋亡细胞为膜联蛋白V阳性和PI阴性(膜联蛋白+/PI-)，而晚期凋亡细胞已知为膜联蛋白V阳性和PI阳性，即膜联蛋白/PI双阳性(膜联蛋白+/PI+)。这些标记物在本领域有时用于指代晚期凋亡细胞。如本文所用，渗透性细胞是提供细胞内或细胞器内抗原的细胞。渗透性允许抗体通过细胞膜进入，从而允许将本发明的抗CLEC1A抗体、其抗原结合片段和模拟物的这些细胞的细胞内容物与在细胞的细胞内区室内而不是细胞膜上表达的CLEC-1A结合。
关于“内源性配体”，应将其理解为与CLEC-1A受体起源于相同物种或相同生物体内的配体；例如，内源性人CLEC-1A配体是人CLEC-1A受体的人配体；内源性小鼠CLEC-1A配体是小鼠CLEC-1A受体的小鼠配体。
如本文所用，术语“抗体”是指多克隆抗体、单克隆抗体或重组抗体。
如本文所用，“单克隆抗体”意在指抗体分子的制剂，与含有不同氨基酸序列的抗体混合物的“多克隆”抗体制剂相比，具有共同的重链和共同的轻链氨基酸序列的抗体。单克隆抗体可通过几种已知技术产生，例如噬菌体、细菌、酵母或核糖体展示，也可通过杂交瘤衍生抗体等经典的方法产生。因此，术语“单克隆”用于指代衍生自一个核酸克隆的所有抗体。
本发明的抗体包括重组抗体。如本文所用，术语“重组抗体”是指通过重组的方式生产、表达、产生或分离的抗体，例如，使用转染至宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体；从重组组合抗体库中分离的抗体；从因人免疫球蛋白基因而转基因的动物(例如小鼠)中分离出的抗体；或以特定免疫球蛋白基因序列(例如人免疫球蛋白基因序列)与其他DNA序列组合的任何其他方式产生、表达、生成或分离的抗体。例如，重组抗体包括嵌合抗体和人源化抗体。
如本文所用，“嵌合抗体”是指衍生自哺乳动物物种(例如小鼠)的种系的可变结构域的序列已被移植到衍生自另一种哺乳动物物种(例如人类)的种系的恒定结构域的序列上的抗体。
如本文所用，“人源化抗体”是指衍生自另一种哺乳动物物种(例如小鼠)的种系的CDR序列已被移植到人框架序列上的抗体。
本发明的抗体是人源化抗体。在实施方式中，本发明的抗体是重组抗体。在实施方式中，本发明的抗体是重组人源化抗体。本发明的抗体可以是去免疫的。关于“去免疫”，应将其理解为抗体具有与本发明的抗体相似的结构，但通过去除抗体结构中已知的T细胞识别的表位来对抗体结构进行修饰，以降低不需要的T细胞反应的可能性。
如本文所用，“抗体的抗原结合片段”是指抗体的一部分，即对应于本发明抗体的结构的一部分的分子，其可能以其原生形式表现出对CLEC-1A的抗原结合能力；与相应的四链抗体的抗原结合特异性相比，这种片段特别地表现出对CLEC-1A相同或基本相同的抗原结合特异性。有利的是，所述抗原结合片段具有与相应的4链抗体相似的结合亲和性。然而，相对于相应的4链抗体具有降低的抗原结合亲和性的抗原结合片段也包含在本发明中。抗原结合能力可通过测量抗体和靶片段之间的亲和性来测定。这些抗原结合片段也可被称为抗体的“功能性片段”。
如本文所用，抗体的“模拟物”是指抗原结合抗体模拟物。抗原结合抗体模拟物是与抗原特异性结合、但在结构上与抗体无关的有机化合物。它们通常是摩尔质量约为3至20kDa的人工肽或小蛋白质。核酸和小分子有时也被认为是抗体模拟物，但不是人工抗体、抗体片段和由这些组成的融合蛋白。与抗体相比的共同优点是更好的溶解度、组织渗透性、对热和酶的稳定性以及相对较低的生产成本。抗体模拟物正在被开发为治疗和诊断试剂。抗原结合抗体模拟物也可以选自亲和体(affibody)、亲和蛋白(affilin)、亲和物(affimer)、亲和质(affitin)、DARPin以及单体(Monobody)。
如本文所用，术语“CLEC-1”具有其在本领域中的一般含义，是指C型凝集素样受体-1，特别是来自哺乳动物物种，更特别地是人CLEC-1。CLEC-1属于C型凝集素样受体(CTLR)的DECTIN-1簇，其包括CLEC-2、DECTIN-1、CLEC-9A、MICL、MAH和LOX-1。
如本文所用，术语“CLEC-1A”涉及来自哺乳动物物种的CLEC-1A，优选人CLEC-1A。人CLEC-1A的参考序列对应于与登录号Q8NC01 Uniprot相关的序列。优选地，术语“人CLEC-1”、“人CLEC-1A”或“人CLEC-1受体”或“人CLEC-1A受体”指参考Q8NC01Uniprot登录号并由CLEC1A基因(参考NCBI登录号51267)编码的蛋白质。在本说明书中，术语CLEC-1A、CLEC1A、CLEC1、CLEC-1、Clec1、Clec-1、Clec1A和Clec-1A可互换使用，并且都指代对应于人CLEC-1A受体的哺乳动物的CLEC1受体，对应于与登录号Q8NC01 Uniprot相关的序列、其直系同源蛋白或其同源蛋白。特别地，CLEC-1A是具有SEQ ID NO：1氨基酸序列的蛋白质。特别地，CLEC-1A的细胞外结构域是具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的蛋白质。
如本文所用，术语“CLEC-1拮抗剂”具有其在本领域中的一般含义，是指阻断、抑制或降低CLEC-1生物活性的任何天然或合成化合物。特别地，CLEC-1拮抗剂抑制CLEC-1与其至少一种配体之间的相互作用。特别地，CLEC-1拮抗剂增强T细胞反应，特别是增加T细胞增殖和/或细胞因子(例如IFNγ)合成。其还可指任何阻断、抑制或降低CLEC-1生物活性的任何天然或合成的化合物。特别地，CLEC-1拮抗剂抑制受体CLEC-1与其至少一种配体(特别是其所有配体)之间的相互作用。更特别地，CLEC-1拮抗剂可与受体CLEC-1或其任何一种配体结合。
如本文所用，“CLEC-1拮抗剂”或“CLEC-1的拮抗剂”可对应于与CLEC-1A结合的化合物，所述化合物选自抗体、抗体的抗原结合片段、抗体的抗原结合模拟物、包含抗体的抗原结合片段或完全抗体或模拟物的大分子。
抗体、其抗原结合片段或其模拟物的拮抗剂能力可根据本发明实施例(特别是实施例5)中公开的适合的实验来评估。特别地，在如下情况下，抗体或其抗原结合片段或其模拟物可被认为是CLEC-1A、特别是人CLEC-1A的拮抗剂：(i)与不存在拮抗剂候选抗体的相同结合实验相比，它减少CLEC-1A的细胞外结构域的结合，特别是减少融合蛋白(所述融合蛋白包含与人免疫球蛋白、特别是人IgG的Fc片段融合的人CLEC-1A受体的细胞外结构域)与继发性坏死细胞和/或肿瘤细胞和/或继发性坏死细胞的细胞内容物(特别是渗透性RAJI细胞和/或凋亡的PBMC)的结合；以及(ii)与不存在拮抗剂化合物的相同实验相比，它增加髓样细胞对肿瘤细胞的吞噬作用。与阴性实验相比，当结合减少至少1-log、特别是至少2-log、最优选至少3-log时，认为结合降低。当吞噬作用提高至少10％、优选至少20％、最优选至少30％时，认为肿瘤细胞吞噬作用增加。
本发明的抗体和抗原结合片段可根据结构特征进行定义。抗体的抗原结合片段是包含其高变结构域的片段，其称为CDR(互补决定区域)，或其部分，其包含抗原的识别位点，即CLEC-1A的细胞外结构域。
四链免疫球蛋白的每个轻链和重链可变结构域(分别为VL和VH)具有三个CDR，它们分别称为VLCDR1(或LCDR1)、VLCDR2(或LCDR2)、VLCDR3(或LCDR3)和VHCDR1(或HCDR1)、VHCDR2(或HCDR2)、VHCDR3(或HCDR3)。
本领域技术人员能够通过参考这方面的标准定义(包括参考编号系统、参考KABAT编号系统或IMGT“collier de perle”算法的应用)来确定抗体各个区域/结构域的位置。在这方面，对于本发明的序列的定义，需要注意的是，区域/结构域的划分可能因参考系统而异。因此，本发明中定义的区域/结构域涵盖显示相关序列在抗体可变结构域的全长序列内的长度或定位变化约+/-10％的序列。
在本发明的具体实施方式中，抗体的CDR结构域根据Kabat命名法指定。在本发明的另一个具体实施方式中，抗体的CDR结构域根据IMGT命名法指定。换言之，本发明的抗体或其抗原结合片段的任何或全部CDR结构域可通过Kabat命名法来定义；本发明的抗体或其抗原结合片段的任何或全部CDR结构域可通过IMGT命名法来定义。更特别地，本发明的抗体或其抗原结合片段的所有CDR结构域均通过Kabat命名法定义。
基于四链免疫球蛋白的结构，由此可通过与现有数据库和现有技术中抗体的序列进行比较来定义抗原结合片段，特别是通过比较这些序列中功能性结构域域的位置，注意框架和恒定结构域的位置对多种类别的抗体(尤其是IgG，特别是哺乳动物IgG)是定义明确的。这种比较还涉及与抗体的3维结构相关的数据。
出于说明本发明的具体实施方式的目的，含有包含所述抗体CDR的可变结构域的抗体的抗原结合片段涵盖Fv、dsFv、scFv、Fab、Fab'、F(ab')2。Fv片段由通过疏水相互作用结合在一起的抗体的VL和VH结构域组成；在dsFv片段中，VH:VL异二聚体通过二硫键稳定；在scFv片段中，VL和VH结构域通过柔性肽接头相互连接，从而形成单链蛋白。Fab片段是通过木瓜蛋白酶消化抗体可获得的单体片段；它们包含通过二硫键结合在一起的完整L链和H链的VH-CH1片段。F(ab')2片段可通过胃蛋白酶消化二硫铰链下方的抗体产生；其包含两个Fab'片段，以及免疫球蛋白分子的铰链区域的一部分。Fab'片段可通过在铰链区域内切割二硫键从F(ab')2片段获得。F(ab')2片段是二价的，即其包含两个抗原结合位点，和原生免疫球蛋白分子一样；另一方面，Fv(构成Fab可变部分的VH:VL二聚体)、dsFv、scFv、Fab和Fab'片段是单价的，即它们包含单个抗原结合位点。本发明的这些基本的抗原结合片段可组合在一起以得到多价抗原结合片段，例如双体、三体或四体。这些多价抗原结合片段也是本发明的一部分。
如本文所用，术语“双特异性”抗体是指通过具有至少一个对第一抗原具有特异性的区域(例如衍生自第一抗体的可变区域)和至少一个对第二抗原具有特异性的第二区域(例如衍生自第二抗体的可变区域)来识别两种不同抗原的抗体。双特异性抗体与两种靶抗原特异性结合，因此是一种多特异性抗体。识别两种以上的不同抗原的多特异性抗体可通过重组DNA方法产生，或者包括但不限于通过任何方便的方法化学产生的抗体。双特异性抗体包括所有抗体或抗体的缀合物，或能够识别两种不同抗原的多聚形式的抗体。双特异性抗体包括经过还原和重组以保留其二价特性的抗体，以及经过化学偶联的抗体，使得它们可对每种抗原具有多个抗原识别位点，例如BiME(双特异性巨噬细胞增强抗体)、BiTE(双特异性T细胞衔接器)、DART(双亲和性重靶向)；DNL(dock-and-lock，对接-锁定)。更特别地，本发明的双特异性抗体可识别并与CLEC-1A结合，并且包含本文公开的CDR的任意组合，或本文公开的重链可变结构域和轻链可变结构域的任意组合，并发挥与本发明的人源化抗CLEC-1A抗体相同的功能和能力，并且识别并与至少一种第二化合物结合，所述第二化合物选自SIRPα、SIRPβ、SIRPγ、CD47、CTLA-4、CD86(B7.2)、CD28、CD40、CD40L、ICOS、ICOS-L、OX40L、GITR、HVEM、BTLA、CD160、LIGHT、TNFRSF25、2B4、CD48、Tim1、Tim3、Tim4、Gal9、LAG-3、CD40、CD40L、CD70、CD27、VISTA、B7H3、B7H4(B7x)、TIGIT、CD112、HHLA2(B7-H7)、TMIGD2(CD28H)、嗜乳脂蛋白样2(BTNL2)、SIGLEC、AXL、B7.1、B7-DC、B7-H1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、CD19、CD20、CD22、CD24、CD137(4-1BB)、CD137L(4-1BBL)、CEA、CXCR3、CXCR4、EGFR、EGFRvIII、ELTD1、EMR1、EMR2、EMR3、EMR4P、ENG、EPCAM、EPHR、PD-L1、TLR1、TLR10、TLR2、TLR3、TLR4、VEGFR、VEGFR2、VIPR1和VIPR2。双特异性抗体可包含两种不同的互补位，一种识别人CLEC-1A(对应于本文公开的CDR的任意组合，或本文公开的重链可变结构域和轻链可变结构域的任意组合)，第二种不同的互补位识别如上列出的另一种化合物。或者，双特异性抗体可以是如本文公开的人源化抗CLEC-1A抗体、其抗原结合片段或其模拟物，其与选自如上列出的化合物的另一种化合物或其片段(例如，当这种化合物具有细胞外结构域时，它的细胞外结构域)连接。
本文公开的针对抗体的所有实施方式经必要修改后可转换至本发明的任何化合物，特别是抗原结合抗体片段、抗体的模拟物，特别是人源化重组抗体。
在本发明的以下描述中，术语“抗CLEC-1A化合物”是指抗体、抗原结合片段或抗体的模拟物，无论是否重组，或包含这种抗体或其抗原结合片段的大分子。当使用术语“抗CLEC-1A抗体”时，此术语涵盖相同的化合物，除非在本发明的特定实施方式中另有说明。
“特异性抗CLEC-1A抗体、其抗原结合片段或其模拟物”是一种化合物，所述化合物表现出对CLEC-1A的特异性结合，并且对另一种化合物不表现出特异性结合，在各情况下，结合都可以通过本领域已知的方法检测，例如但不限于Biacore分析、Blitz分析、ELISA测定法或Scatchard图。尽管如此，特异性“抗CLEC-1A抗体或其抗原结合片段”仍可以与CLEC-1A以外的另一种化合物发生交叉反应，特异性的概念并不排除抗体可以与CLEC-1A以外的其他多肽发生交叉反应，但亲和性较低。因此，特异性抗CLEC-1A抗体、其抗原结合片段或其模拟物也可被定义为对CLEC-1A表现出高结合亲和性但对另一种化合物表现出低结合亲和性的抗体。
抗体及其抗原结合片段
在第一方面，公开了一种人源化抗体、其抗原结合片段或其模拟物，所述人源化抗体、其抗原结合片段或其模拟物与人C型凝集素样受体-1成员A受体(CLEC-1A受体)的细胞外结构域特异性结合，所述人源化抗体、其抗原结合片段或其模拟物包含：
·抗体重链可变结构域，所述抗体重链可变结构域包含VHCDR1(SEQ ID NO：10)、VHCDR2(SEQ ID NO：11)、VHCDR3(SEQ ID NO：12)；以及抗体轻链可变结构域，所述抗体轻链可变结构域包含VLCDR1(SEQ ID NO：13)、VLCDR2(SEQ ID NO：14)、VLCDR3(SEQ ID NO：15)；或者
·抗体重链可变结构域，所述抗体重链可变结构域包含VHCDR1(SEQ ID NO：16)、VHCDR2(SEQ ID NO：17)、VHCDR3(SEQ ID NO：18)；以及抗体轻链可变结构域，所述抗体轻链可变结构域包含VLCDR1(SEQ ID NO：19)、VLCDR2(SEQ ID NO：20)、VLCDR3(SEQ ID NO：21)；或者
·抗体重链可变结构域，所述抗体重链可变结构域包含VHCDR1(SEQ ID NO：22)、VHCDR2(SEQ ID NO：23)、VHCDR3(SEQ ID NO：24)；以及抗体轻链可变结构域，所述抗体轻链可变结构域包含VLCDR1(SEQ ID NO：25)、VLCDR2(SEQ ID NO：26)、VLCDR3(SEQ ID NO：27)。
这些位于示例性抗体的重链可变结构域和轻链可变结构域内的CDR使用Kabat编号提供。这些CDR结构域的组合分别与示例性抗体11H11、14H9和6C5的重链和轻链上存在的CDR结构域对应。
在本发明的另一方面，公开了一种人源化抗体、其抗原结合片段或其模拟物，所述人源化抗体、其抗原结合片段或其模拟物与人C型凝集素样受体-1成员A受体(CLEC-1A受体)的细胞外结构域特异性结合，所述人源化抗体、其抗原结合片段或其模拟物包含：
·抗体重链可变结构域，所述抗体重链可变结构域包含VHCDR1(SEQ ID NO：34)、VHCDR2(SEQ ID NO：35)、VHCDR3(SEQ ID NO：36)；以及抗体轻链可变结构域，所述抗体轻链可变结构域包含VLCDR1(SEQ ID NO：37)、VLCDR2(SEQ ID NO：38)、VLCDR3(SEQ ID NO：39)；或者
·抗体重链可变结构域，所述抗体重链可变结构域包含VHCDR1(SEQ ID NO：40)、VHCDR2(SEQ ID NO：41)、VHCDR3(SEQ ID NO：42)；以及抗体轻链可变结构域，所述抗体轻链可变结构域包含VLCDR1(SEQ ID NO：43)、VLCDR2(SEQ ID NO：44)、VLCDR3(SEQ ID NO：45)；或者
·抗体重链可变结构域，所述抗体重链可变结构域包含VHCDR1(SEQ ID NO：46)、VHCDR2(SEQ ID NO：47)、VHCDR3(SEQ ID NO：48)；以及抗体轻链可变结构域，所述抗体轻链可变结构域包含VLCDR1(SEQ ID NO：49)、VLCDR2(SEQ ID NO：50)、VLCDR3(SEQ ID NO：51)。
这些位于示例性抗体的重链可变结构域和轻链可变结构域内的CDR使用IMGT编号提供。这些CDR结构域的组合分别与示例性抗体11H11、14H9和6C5的重链和轻链上存在的CDR结构域对应。
在本发明的一个特别方面，与人C型凝集素样受体-1成员A受体(CLEC-1A受体)的细胞外结构域特异性结合的人源化抗体、其抗原结合片段或其模拟物包含本文公开的6个CDR结构域的组合，并且与选自11H11、14H9和6C5的抗体的框架区域共享至少80％、特别是至少85％、更特别是至少90％、或至少91％、或至少92％、或至少93％、或至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％，并且具有相同的6个CDR结构域。CDR结构域可根据KABAT编号或IMGT编号进行定义。框架区域对应于位于重链和轻链的可变结构域中的CDR结构域外的氨基酸残基。
这些实施方式的抗体(即抗体及其抗原结合片段，其CDR由Kabat编号或IMGH编号定义)特别适合用于增强树突状细胞对肿瘤细胞的吞噬作用。根据此定义的抗体对人CLEC-1A具有亲和性，适合用于治疗，同时与其他抗CLEC-1A抗体相比、特别是与本发明实施例中使用的对照抗CLEC-1A抗体相比，在相同浓度下对树突状细胞对肿瘤细胞的吞噬能力具有更好的效果(参见图1至4)。此外，与嵌合等效物的拮抗剂能力相比，这些抗体和抗原结合片段对人CLEC-1A具有更优越的拮抗剂能力。
在本发明的一个特定方面，提供了一种人源化抗体、其抗原结合片段或其模拟物，所述人源化抗体、其抗原结合片段或其模拟物与人C型凝集素样受体-1成员A受体(CLEC-1A受体)的细胞外结构域特异性结合，所述人源化抗体、其抗原结合片段或其模拟物包含：
·抗体重链可变结构域，所述抗体重链可变结构域包含VHCDR1(SEQ ID NO：10)、VHCDR2(SEQ ID NO：11)、VHCDR3(SEQ ID NO：12)；以及抗体轻链可变结构域，所述抗体轻链可变结构域包含VLCDR1(SEQ ID NO：19)、VLCDR2(SEQ ID NO：20)、VLCDR3(SEQ ID NO：21)；或者
·抗体重链可变结构域，所述抗体重链可变结构域包含VHCDR1(SEQ ID NO：10)、VHCDR2(SEQ ID NO：11)、VHCDR3(SEQ ID NO：12)；以及抗体轻链可变结构域，所述抗体轻链可变结构域包含VLCDR1(SEQ ID NO：25)、VLCDR2(SEQ ID NO：26)、VLCDR3(SEQ ID NO：27)；或者
·抗体重链可变结构域，所述抗体重链可变结构域包含VHCDR1(SEQ ID NO：16)、VHCDR2(SEQ ID NO：17)、VHCDR3(SEQ ID NO：18)；以及抗体轻链可变结构域，所述抗体轻链可变结构域包含VLCDR1(SEQ ID NO：25)、VLCDR2(SEQ ID NO：26)、VLCDR3(SEQ ID NO：27)；或者
·抗体重链可变结构域，所述抗体重链可变结构域包含VHCDR1(SEQ ID NO：16)、VHCDR2(SEQ ID NO：17)、VHCDR3(SEQ ID NO：18)；以及抗体轻链可变结构域，所述抗体轻链可变结构域包含VLCDR1(SEQ ID NO：13)、VLCDR2(SEQ ID NO：14)、VLCDR3(SEQ ID NO：15)；或者
·抗体重链可变结构域，所述抗体重链可变结构域包含VHCDR1(SEQ ID NO：22)、VHCDR2(SEQ ID NO：23)、VHCDR3(SEQ ID NO：24)；以及抗体轻链可变结构域，所述抗体轻链可变结构域包含VLCDR1(SEQ ID NO：19)、VLCDR2(SEQ ID NO：20)、VLCDR3(SEQ ID NO：21)；或者
·抗体重链可变结构域，所述抗体重链可变结构域包含VHCDR1(SEQ ID NO：22)、VHCDR2(SEQ ID NO：23)、VHCDR3(SEQ ID NO：24)；以及抗体轻链可变结构域，所述抗体轻链可变结构域包含VLCDR1(SEQ ID NO：13)、VLCDR2(SEQ ID NO：14)、VLCDR3(SEQ ID NO：15)。
在本发明的一个特定方面，提供了一种人源化抗体、其抗原结合片段或其模拟物，所述人源化抗体、其抗原结合片段或其模拟物与人C型凝集素样受体-1成员A受体(CLEC-1A受体)的细胞外结构域特异性结合，所述人源化抗体、其抗原结合片段或其模拟物包含：
·抗体重链可变结构域，所述抗体重链可变结构域包含VHCDR1(SEQ ID NO：34)、VHCDR2(SEQ ID NO：35)、VHCDR3(SEQ ID NO：36)；以及抗体轻链可变结构域，所述抗体轻链可变结构域包含VLCDR1(SEQ ID NO：43)、VLCDR2(SEQ ID NO：44)、VLCDR3(SEQ ID NO：45)；或者
·抗体重链可变结构域，所述抗体重链可变结构域包含VHCDR1(SEQ ID NO：34)、VHCDR2(SEQ ID NO：35)、VHCDR3(SEQ ID NO：36)；以及抗体轻链可变结构域，所述抗体轻链可变结构域包含VLCDR1(SEQ ID NO：49)、VLCDR2(SEQ ID NO：50)、VLCDR3(SEQ ID NO：51)；或者
·抗体重链可变结构域，所述抗体重链可变结构域包含VHCDR1(SEQ ID NO：40)、VHCDR2(SEQ ID NO：41)、VHCDR3(SEQ ID NO：42)；以及抗体轻链可变结构域，所述抗体轻链可变结构域包含VLCDR1(SEQ ID NO：49)、VLCDR2(SEQ ID NO：50)、VLCDR3(SEQ ID NO：51)；或者
·抗体重链可变结构域，所述抗体重链可变结构域包含VHCDR1(SEQ ID NO：40)、VHCDR2(SEQ ID NO：41)、VHCDR3(SEQ ID NO：42)；以及抗体轻链可变结构域，所述抗体轻链可变结构域包含VLCDR1(SEQ ID NO：37)、VLCDR2(SEQ ID NO：38)、VLCDR3(SEQ ID NO：39)；或者
·抗体重链可变结构域，所述抗体重链可变结构域包含VHCDR1(SEQ ID NO：46)、VHCDR2(SEQ ID NO：47)、VHCDR3(SEQ ID NO：48)；以及抗体轻链可变结构域，所述抗体轻链可变结构域包含VLCDR1(SEQ ID NO：43)、VLCDR2(SEQ ID NO：44)、VLCDR3(SEQ ID NO：45)；或者
·抗体重链可变结构域，所述抗体重链可变结构域包含VHCDR1(SEQ ID NO：46)、VHCDR2(SEQ ID NO：47)、VHCDR3(SEQ ID NO：48)；以及抗体轻链可变结构域，所述抗体轻链可变结构域包含VLCDR1(SEQ ID NO：37)、VLCDR2(SEQ ID NO：38)、VLCDR3(SEQ ID NO：39)。
在特定实施方式中，本发明的人源化抗体、其抗原结合片段或其模拟物包含：
·抗体重链可变结构域，所述抗体重链可变结构域包含三个VHCDR，其中，所述三个VHCDR的氨基酸序列分别选自：
-VHCDR1(SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：22)；
-VHCDR2(SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：23)；以及
-VHCDR3(SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：24)；以及
·抗体轻链可变结构域，所述抗体轻链可变结构域包含三个VLCDR，其中，所述三个VHCDR的氨基酸序列选自：
-VLCDR1(SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：25)；以及
-VLCDR2(SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：26)；以及
-VLCDR3(SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：27)。
这些位于示例性抗体的重链和轻链的可变结构域内的CDR使用Kabat编号提供。在特定实施方式中，本发明的人源化抗体、其抗原结合片段或其模拟物包含：
·抗体重链可变结构域，所述抗体重链可变结构域包含三个VHCDR，其中，所述三个VHCDR的氨基酸序列分别选自：
-VHCDR1(SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：46)；
-VHCDR2(SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：47)；以及
-VHCDR3(SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：48)；以及
·抗体轻链可变结构域，所述抗体轻链可变结构域包含三个VLCDR，其中，所述三个VHCDR的氨基酸序列选自：
-VLCDR1(SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：49)；以及
-VLCDR2(SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：50)；以及
-VLCDR3(SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：51)。
这些位于示例性抗体的重链和轻链的可变结构域内的CDR使用Kabat编号提供。
在特定实施方式中，本发明的人源化抗体、其抗原结合片段或其模拟物包含：
·抗体重链可变结构域，所述抗体重链可变结构域包含或由SEQ ID NO：3中所示的氨基酸序列组成；以及抗体轻链可变结构域，所述抗体轻链可变结构域包含或由SEQ IDNO：4中所示的氨基酸序列组成；或者
·抗体重链可变结构域，所述抗体重链可变结构域包含或由SEQ ID NO：5中所示的氨基酸序列组成；以及抗体轻链可变结构域，所述抗体轻链可变结构域包含或由SEQ IDNO：7中所示的氨基酸序列组成；或者
·抗体重链可变结构域，所述抗体重链可变结构域包含或由SEQ ID NO：6中所示的氨基酸序列组成；以及抗体轻链可变结构域，所述抗体轻链可变结构域包含或由SEQ IDNO：7中所示的氨基酸序列组成；或者
·抗体重链可变结构域，所述抗体重链可变结构域包含或由SEQ ID NO：8中所示的氨基酸序列组成；以及抗体轻链可变结构域，所述抗体轻链可变结构域包含或由SEQ IDNO：9中所示的氨基酸序列组成。
这些重链可变结构域与轻链可变结构域的组合分别对应于示例性抗体11H11、14H9的重链可变结构域和轻链可变结构域，14H9的人源化重链的突变版本(突变位于链的框架内)和14H9的轻链可变结构域，以及6C5。根据此定义的抗体可特别适合用于调节、特别是增强髓样细胞(特别是树突状细胞或巨噬细胞)对肿瘤细胞和/或继发性坏死细胞的吞噬作用，特别是在体外和/或体内。此外，根据此定义的抗体特别适合用于拮抗人CLEC-1A与其至少一个配体的结合，特别是与嵌合抗体相比。
在特定实施方式中，本发明的人源化抗体、其抗原结合片段或其模拟物包含：
·抗体重链可变结构域，所述抗体重链可变结构域包含或由SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8中所示的氨基酸序列组成；以及
·抗体轻链可变结构域，所述抗体轻链可变结构域包含或由SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：7和SEQ ID NO：9中所示的氨基酸序列组成。
多种抗体分子和片段可衍生自任何通常已知的免疫球蛋白类别(同型)，包括但不限于IgA、分泌型IgA、IgE、IgG和IgM。IgG亚类也为本领域的技术人员熟知，包括但不限于人IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。在本发明的具体实施方式中，抗体的可变区域可与抗体的恒定区域相关联，例如IGg1、IgG2、IgG3或IgG4恒定区域。这些恒定区域可通过本领域已知的方法进一步突变或修饰，以改变它们与Fc受体的结合能力。
在特定实施方式中，本发明的抗体、其抗原结合片段或其模拟物是人源化单克隆抗体，其中，抗体轻链恒定结构域衍生自人κ轻链恒定结构域，特别是所述轻链恒定结构域包含或由SEQ ID NO：33的序列组成。
在特定实施方式中，本发明的抗体、其抗原结合片段或其模拟物是一种人源化单克隆抗体，其中，抗体的重链恒定结构域衍生自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4重链恒定结构域，特别是，所述抗体重链恒定结构域包含或由SEQ ID NO：28(人Fc IgG1)、SEQ ID NO：29(人Fc IgG2)、SEQ ID NO：30(人Fc IgG4)、SEQ ID NO：97(Fc IgG1 N297A)、SEQ ID NO：100(FcG1 LALA)和SEQ ID NO：101(Fc IgG1 LALAPG)的氨基酸序列组成。嵌合抗体(例如在本发明实施例中作为对照的抗体)可包含SEQ ID NO：31(小鼠FcG1)或SEQ ID NO：32的重链恒定结构域。
在另一个实施方式中，抗体、其抗原结合片段或其模拟物与人CLEC-1A结合，其中亲和力约为至少1×10-6M、1×10-7M、1×10-8M、1×10-9M、1×10-10M、1×10-10M、1×10-12M或更高，和/或其与靶标的结合亲和力是对非人CLEC-1A的另一种化合物的亲和力的至少两倍。在特定实施方式中，本发明的抗体或抗原结合片段以至少1E-07M、特别是至少1E-08M的亲和常数(KD)与人CLEC-1A结合。在特定实施方式中，与对照抗CLEC-1A抗体在相同结合条件下与CLEC-1a的结合相比，所述抗体、其抗原结合片段或其模拟物与人CLEC-1A结合的亲和力超过1-log，特别是超过2-log，最优选超过3-log。结合实验可根据本发明实施例中公开的结合实验中的任何一项进行。
在特定实施方式中，当化合物达到根据本发明的最大信号的50％的有效剂量(ED50)对人CLEC-1A的ED50值低于1500ng/mL时，抗CLEC-1A抗体、其抗原结合片段或其模拟物是CLEC-1A特异性的。ED50可根据本领域已知的方法或通过本发明实施例中公开的方法测定，例如图11所示的细胞计数法。在特定实施方式中，当在结合测定法中达到最大信号的50％(EC50)的化合物的有效剂量低于1200ng/mL、更特别是低于800、进一步更特别是低于400ng/mL时，可以认为如上定义的抗CLEC-1A抗体和人CLEC-1A之间的结合是特异性的。例如，这种能力可以根据本发明实施例中所示的方法进行评估。
在另一个特定实施方式中，根据本发明的特异性抗CLEC-1A抗体、其抗原结合片段或其模拟物对人CLEC-1A的ED50值(也称为EC50值)为1ng/mL至1000ng/mL，更特别是5ng/mL至1500ng/mL，更特别是800ng/mL。EC50可根据本领域已知的方法或通过本发明实施例中公开的方法(例如根据与图11所示和来源自实施例7的数据相关的公开的方法)进行确定。
如本文所用，术语“ED50”是指化合物(例如，抗CLEC-1A抗体或其抗原结合片段)在引发生物或生化功能(例如，CLEC-1A的功能或活性)的有效性为50％的量度。例如，EC50表示需要多少抗CLEC-1A抗体、其抗原结合片段或其模拟物才能将CLEC-1A的活性降低一半。也就是说，其是抗CLEC-1A抗体、其抗原结合片段或其模拟物的半数(50％)最大有效浓度(50％ ED或ED50)。ED50代表体外有效性达到50％所需的药物的浓度。ED50可通过本领域已知的技术来测定，例如，通过构建剂量反应曲线并检查不同浓度的抗CLEC-1A化合物对CLEC-1A与Fc-CLEC结合的影响。例如，方法公开于本发明的实施例。
在本发明中，如果在存在拮抗剂抗体的结合竞争测定法中，化合物诱导的Fc-CLEC-1A蛋白对CLEC-1A的KD值增加大于1log、优选大于2log、更优选大于3log、最优选大于4log，还可认为抗CLEC-1A抗体、其抗原结合片段或其模拟物是CLEC-1A的拮抗剂。这个实验可根据Blitz方法或ELISA进行，例如在本发明实施例中所示的实验条件下进行。
抗体、其抗原结合片段或其模拟物(其为人源化抗体)也可以通过将可变链(VH和/或VL)的恒定区域中存在的氨基酸残基替代为根据标准定义和编号的在人抗体中的相应位置的人氨基酸残基来衍生，其中，替代水平为框架区域中的1％至80％、更优选1％至50％、进一步更优选1％至20％、特别是1％至18％的残基。所述恒定区域包括在四链抗体中定义的框架区(FR)的那些，特别是通过参考Kabat编号来识别。或者IMGT编号，更特别是通过Kabat编号。
可根据已知的方法来人源化抗CLEC-1A抗体。作为示例，可将本文公开的CDR的不同组合移植到人重链可变结构域和/或轻链可变结构域上。本发明的嵌合抗体、人源化抗体和/或去免疫抗体可属于任何类别的免疫球蛋白，例如非修饰抗体。优选地，它们属于IgG类的亚类，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
通过将抗体的可变区域与合适的接头或另一种抗体的恒定区域结合来制备重组抗体(或其抗原结合片段或其模拟物)的方法在本领域是众所周知的。
本发明还涉及抗体、其抗原结合片段或其模拟物(特别是人源化抗体或其抗原结合片段)，其与如下抗体竞争：所述抗体包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6或SEQID NO：8的氨基酸序列作为其可变重链结构域以及SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7或SEQ IDNO：9的氨基酸序列作为其可变轻链结构域；特别地，其是本发明的实施例所示的人源化抗体11H11、14H9或6C5，用于与CLEC-1A受体结合并拮抗CLEC-1A与其靶标的结合；特别是与阴性对照相比，更特别是与包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8的氨基酸序列作为其可变重链结构域以及SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：9的氨基酸序列作为其可变轻链结构域的抗体相比，其增强髓样细胞(特别是树突状细胞和/或巨噬细胞)对肿瘤细胞和/或继发性坏死细胞的吞噬作用。
特别地，本发明的抗体、其抗原结合片段或其模拟物与人C型凝集素样受体-1成员A受体(CLEC-1A受体)的细胞外结构域和/或Fc-CLEC-1A蛋白(所述Fc-CLEC-1A蛋白包含或由SEQ ID NO：52中所示的氨基酸序列组成)特异性结合，并且还与包含或由重链可变结构域(包含或由SEQ ID NO：3组成)和轻链可变结构域(包含或由SEQ ID NO：4组成)组成的抗体、特别是包含或由重链结构域(包含或由SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：100或SEQ ID NO：101组成)和轻链结构域(包含或由SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：33组成)组成的抗体竞争，用于与人CLEC-1A受体结合，并且是人CLEC-1A的拮抗剂，特别是拮抗人CLEC-1A的结合，特别是拮抗人CLEC-1A的细胞外结构域或Fc-CLEC-1A蛋白(包含或由SEQ ID NO：52中所示的氨基酸序列组成)与其至少一种配体(特别是其靶标)的结合，特别是所述配体由继发性坏死细胞和/或肿瘤细胞表达；特别是与阴性对照相比，更特别是与包含或由重链可变结构域(包含或由SEQ ID NO：3组成)和轻链可变结构域(包含或由SEQ ID NO：4组成)组成的抗体相比，特别是与包含或由重链结构域(包含或由SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：100或SEQ ID NO：101组成)和轻链结构域(包含或由SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：33组成)组成的抗体相比，本发明的抗体、其抗原结合片段或其模拟物增强髓样细胞(特别是树突状细胞和/或巨噬细胞)对肿瘤细胞和/或继发性坏死细胞的吞噬作用。
特别地，本发明的抗体、其抗原结合片段或其模拟物与人C型凝集素样受体-1成员A受体(CLEC-1A受体)的细胞外结构域和/或Fc-CLEC-1A蛋白(所述Fc-CLEC-1A蛋白包含或由SEQ ID NO：52中所示的氨基酸序列组成)特异性结合，并且还与包含或由重链可变结构域(包含或由SEQ ID NO：5组成)和轻链可变结构域(包含或由SEQ ID NO：7组成)组成的抗体、特别是包含或由重链结构域(包含或由SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：100或SEQ ID NO：101组成)和轻链结构域(包含或由SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：33组成)组成的抗体竞争，用于与人CLEC-1A受体结合，并且是人CLEC-1A的拮抗剂，特别是拮抗人CLEC-1A的结合，特别是拮抗人CLEC-1A的细胞外结构域或Fc-CLEC-1A蛋白(包含或由SEQ ID NO：52中所示的氨基酸序列组成)与其至少一种配体(特别是其靶标)的结合，特别是所述配体由继发性坏死细胞和/或肿瘤细胞表达；特别是与阴性对照相比，更特别是与包含或由重链可变结构域(包含或由SEQ ID NO：5组成)和轻链可变结构域(包含或由SEQ ID NO：7组成)组成的抗体相比，特别是包含或由重链结构域(包含或由SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：97、SEQID NO：100或SEQ ID NO：101组成)和轻链结构域(包含或由SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：33组成)组成的抗体相比，本发明的抗体、其抗原结合片段或其模拟物增强髓样细胞(特别是树突状细胞和/或巨噬细胞)对肿瘤细胞和/或继发性坏死细胞的吞噬作用。
特别地，本发明的抗体、其抗原结合片段或其模拟物与人C型凝集素样受体-1成员A受体(CLEC-1A受体)的细胞外结构域和/或Fc-CLEC-1A蛋白(所述Fc-CLEC-1A蛋白包含或由SEQ ID NO：52中所示的氨基酸序列组成)特异性结合，并且还与包含或由重链可变结构域(包含或由SEQ ID NO：6组成)和轻链可变结构域(包含或由SEQ ID NO：7组成)组成的抗体、特别是包含或由重链结构域(包含或由SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：100或SEQ ID NO：101组成)和轻链结构域(包含或由SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：33组成)组成的抗体竞争，用于与人CLEC-1A受体结合，并且是人CLEC-1A的拮抗剂，特别是拮抗人CLEC-1A的结合，特别是拮抗人CLEC-1A的细胞外结构域或Fc-CLEC-1A蛋白(包含或由SEQ ID NO：52中所示的氨基酸序列组成)与其至少一种配体(特别是其靶标)的结合，特别是所述配体由继发性坏死细胞和/或肿瘤细胞表达；特别是与阴性对照相比，更特别是与包含或由重链可变结构域(包含或由SEQ ID NO：6组成)和轻链可变结构域(包含或由SEQ ID NO：7组成)组成的抗体相比，特别是与包含或由重链结构域(包含或由SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：100或SEQ ID NO：101组成)和轻链结构域(包含或由SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：33组成)组成的抗体相比，本发明的抗体、其抗原结合片段或其模拟物增强髓样细胞(特别是树突状细胞和/或巨噬细胞)对肿瘤细胞和/或继发性坏死细胞的吞噬作用。
特别地，本发明的抗体、其抗原结合片段或其模拟物与人C型凝集素样受体-1成员A受体(CLEC-1A受体)的细胞外结构域和/或Fc-CLEC-1A蛋白(所述Fc-CLEC-1A蛋白包含或由SEQ ID NO：52中所示的氨基酸序列组成)特异性结合，并且还与包含或由重链可变结构域(包含或由SEQ ID NO：8组成)和轻链可变结构域(包含或由SEQ ID NO：9组成)组成的抗体、特别是包含或由重链结构域(包含或由SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：100或SEQ ID NO：101组成)和轻链结构域(包含或由SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：33组成)组成的抗体竞争，用于与人CLEC-1A受体结合，并且是人CLEC-1A的拮抗剂，特别是拮抗人CLEC-1A的结合，特别是拮抗人CLEC-1A的细胞外结构域或Fc-CLEC-1A蛋白(包含或由SEQ ID NO：52中所示的氨基酸序列组成)与其至少一种配体(特别是其靶标)的结合，特别是所述配体由继发性坏死细胞和/或肿瘤细胞表达；特别是与阴性对照相比，更特别是与包含或由重链可变结构域(包含或由SEQ ID NO：8组成)和轻链可变结构域(包含或由SEQ ID NO：9组成)组成的抗体相比，特别是与包含或由重链结构域(包含或由SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：100或SEQ ID NO：101组成)和轻链结构域(包含或由SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：33组成)组成的抗体相比，本发明的抗体、其抗原结合片段或其模拟物增强髓样细胞(特别是树突状细胞和/或巨噬细胞)对肿瘤细胞和/或继发性坏死细胞的吞噬作用。
在本发明的更特定的实施方式中，与阴性对照相比，所述抗体、其抗原结合片段或其模拟物还能够增强髓样细胞(特别是树突状细胞和/或巨噬细胞)对癌细胞和/或继发性坏死细胞的吞噬作用，与阴性对照相比，特别是至少增强10％、更特别是至少增强20％。特别地，与阴性对照相比，所述抗体、其抗原结合片段或其模拟物在体内和/或体外使用时，与调节(特别是增加)髓样细胞(特别是树突状细胞和/或巨噬细胞)对肿瘤细胞和/或继发性坏死细胞的吞噬作用相关，特别是与阴性对照相比，调节(特别是增加)对肿瘤细胞和/或继发性坏死细胞的吞噬作用至少10％、更特别是至少20％。
可使用常规技术(例如免疫测定)，例如通过显示一种抗体阻断另一种抗体与靶抗原结合的能力(例如竞争结合测定法)，对交叉竞争抗体(或化合物)和识别CLEC-1A受体的抗体(或化合物)进行鉴定。可使用如本发明实施例中记载的测定法来测定竞争结合。特别地，可使用实施例7中所示的方法测定竞争结合，其中，通过ELISA研究抗体对His-CLEC1的相互作用和竞争。如果测试的抗CLEC-1A化合物与缺少所述抗体(或化合物)的其中一种的阳性对照相比，将另一种抗体的结合降低至少50％、至少60％、具体至少70％、更具体至少80％，则存在交叉竞争，反之亦然。
本发明还涉及编码本文所述的特异性抗CLEC-1A抗体和其抗原结合片段及其模拟物的至少一部分的基因构建体。
对此，本发明还涉及编码根据本文公开的任何一种定义的抗体、其抗原结合片段或其模拟物的核酸分子或核酸分子组合。换言之，核酸分子编码抗体、其抗原结合片段或其模拟物的至少6个CDR结构域。
本发明还可涉及第一核酸分子和第二核酸分子组合，其中，第一核酸分子至少编码抗体的可变重链结构域，第二核酸分子至少编码抗体的可变轻链结构域。第一核酸分子和第二核酸分子组合编码根据本文公开的任何实施方式的抗体、其抗原结合片段或其模拟物的至少6个CDR结构域。
在本发明的特定实施方式中，提供了编码根据本文公开的任何定义的抗体、其抗原结合片段或其模拟物的核酸分子或核酸分子组合，所述核酸分子或核酸分子组合包含或由以下组成：
(a)编码轻链可变结构域的CDR1的SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：68或SEQ ID NO：69的核苷酸序列；和/或
(b)编码轻链可变结构域的CDR2的SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：70或SEQ ID NO：71的核苷酸序列；和/或
(c)编码轻链可变结构域的CDR3的SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：72或SEQ ID NO：73的核苷酸序列；和/或
(d)编码重链可变结构域的CDR1的SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：89或SEQ ID NO：90的核苷酸序列；和/或
(e)编码重链可变结构域的CDR2的SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：91或SEQ ID NO：92的核苷酸序列；和/或
(f)编码重链可变结构域的CDR3的SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：93或SEQ ID NO：94的核苷酸序列。
在本发明的特定实施方式中，提供了编码根据本文公开的任何定义的抗体、其抗原结合片段或其模拟物的核酸分子或核酸分子组合，所述核酸分子或核酸分子组合包含或由以下组成：
a)编码轻链可变结构域的SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：60或SEQ ID NO：67的核苷酸序列；和/或
b)编码重链可变结构域的SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：88或SEQ IDNO：95的核苷酸序列。
在本发明的特定实施方式中，编码本发明的抗体、其抗原结合片段或其模拟物的核酸分子或核酸分子组合进一步编码轻链的恒定结构域，特别是包含SEQ ID NO：96的核苷酸序列和/或重链的恒定结构域，特别是包含SEQ ID NO：98或SEQ ID NO：99的核苷酸序列。
根据本发明的任何核酸分子都可插入表达载体，例如适合用于在宿主细胞内表达编码序列的质粒。
化合物组合
本发明还涉及化合物组合，所述化合物组合包含人源化抗体或其抗原结合片段作为第一治疗剂和至少一种第二治疗剂。
第一治疗剂是根据本文公开的任何实施方式的人源化抗体、其抗原结合片段或其模拟物。至少一种第二治疗剂选自化疗剂、放疗剂、免疫治疗剂，特别是肿瘤靶向抗体，包括抗hCD20-hIgG1、抗hEGFR-hIgG1、抗hHER2-hIgG1或其抗原结合片段，特别是肿瘤靶向单克隆抗体或其抗原结合片段，更特别是活化和/或增强巨噬细胞的吞噬能力的肿瘤靶向单克隆抗体、其抗原结合片段或其模拟物，进一步更特别是选自阿仑单抗(alemtuzumab)、阿替利珠单抗(atezolizumab)、贝伐单抗(bevacizumab)、抗hEGFR-hIgG1单克隆肿瘤靶向抗体(例如西妥昔单抗(cetuximab)、赫赛汀(herceptin)、帕尼单抗(panitumumab))、抗hCD20-hIgG1单克隆肿瘤靶向抗体(例如利妥昔单抗)、抗hHER2-hIgG1单克隆肿瘤靶向曲妥单抗(trastuzumab)、抗PDL-1抗体和抗CD47抗体的单克隆抗体，或者选自抗PD1抗体、抗CTLA4抗体、激动剂抗CD137抗体、抗CD28抗体、抗CD127抗体、抗bcl2抗体和抗SIRPa抗体的另一种抗体或单克隆抗体；和/或化疗剂和/或细胞治疗剂(例如CAR-T细胞)和/或放疗剂，特别是具有抗增殖、促凋亡、细胞周期阻断和/或分化诱导作用的细胞毒性剂，更特别是选自细胞毒性抗体、烷基化药物、蒽环类药物、抗代谢物、抗微管剂、拓扑异构酶抑制剂、生物碱、博来霉素、抗肿瘤药物和环磷酰胺的细胞毒性剂。
特别地，所述免疫治疗剂选自：抗CD3剂，特别是抗CD3抗体，抗PD1剂(特别是抗PD1抗体)，特别是PD1的拮抗剂，更特别是拮抗剂抗PD1抗体，抗PDL1剂(特别是抗PDL1抗体)，特别是PDL1的拮抗剂，更特别是拮抗剂抗PDL1抗体，抗CTLA4剂(特别是抗CTLA4抗体)，特别是CTLA4的拮抗剂，更特别是拮抗剂抗CTLA4抗体，CD137的激动剂，特别是激动剂抗CD137抗体，抗CLEC-1剂(特别是抗CLEC-1抗体)，抗VEGF剂，特别是抗VEGF抗体，抗CD19剂，特别是抗CD19抗体和抗CD47剂(特别是抗CD47抗体)，特别是CD47的拮抗剂，更特别是抗CD47拮抗剂抗体，抗SIRPa剂(特别是抗SIRPa抗体)，特别是抗SIRPa的拮抗剂，更特别是抗SIRPa拮抗剂抗体，抗CD28剂(特别是抗CD28抗体)，特别是抗CD28的拮抗剂，更特别是抗CD28拮抗剂抗体，抗Bcl-2剂(特别是维奈托克(venetoclax)，其也称为ABT199或GDC-0199)，酪氨酸/激酶路径的抑制剂(例如维奈托克)。
在具体实施方式中，第一治疗剂是根据本文公开的任何实施方式的人源化抗CLEC-1A抗体、其抗原结合片段或其模拟物，至少一种第二治疗剂是西妥昔单抗。
在具体实施方式中，第一治疗剂是根据本文公开的任何实施方式的人源化抗CLEC-1A抗体、其抗原结合片段或其模拟物，至少一种第二治疗剂是利妥昔单抗。
在具体实施方式中，第一治疗剂是根据本文公开的任何实施方式的人源化抗CLEC-1A抗体、其抗原结合片段或其模拟物，至少一种第二治疗剂是曲妥单抗。
肿瘤靶向抗体可被定义为治疗性单克隆抗体，其可识别肿瘤特异性膜蛋白、阻断细胞信号传导并通过Fc驱动的先天免疫反应诱导肿瘤杀伤。
在本发明的具体实施方式中，第一治疗剂是本文公开的由其CDR结构域定义的抗体、其抗原结合片段或其模拟物，第二治疗剂是利妥昔单抗、曲妥单抗、西妥昔单抗，或选自抗PD1抗体、抗PDL-1抗体、抗CD47抗体和抗SIRPa抗体的另一种抗体或单克隆抗体。
在特定实施方式中，抗CLEC-1A抗体、其抗原结合片段或其模拟物是：
-抗体、其抗原结合片段或其模拟物，所述抗体、其抗原结合片段或其模拟物与人C型凝集素样受体-1成员A受体(CLEC-1A受体)的细胞外结构域特异性结合，并且还与包含或由重链可变结构域(包含或由SEQ ID NO：3组成)和轻链可变结构域(包含或由SEQ ID NO：4组成)组成的抗体、特别是包含或由重链结构域(包含或由SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：100或SEQ ID NO：101组成)和轻链结构域(包含或由SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：33组成)组成的抗体竞争，用于与人CLEC-1A受体结合，并且是人CLEC-1的拮抗剂；特别是与阴性对照相比，更特别是与包含或由重链可变结构域(包含或由SEQ ID NO：3组成)和轻链可变结构域(包含或由SEQ ID NO：4组成)组成的抗体相比，特别是与包含或由重链结构域(包含或由SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：28、SEQID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：100或SEQ ID NO：101组成)和轻链结构域(包含或由SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：33组成)组成的抗体相比，所述抗体、其抗原结合片段或其模拟物增强髓样细胞(特别是树突状细胞和/或巨噬细胞)对肿瘤细胞和/或继发性坏死细胞的吞噬作用；或者
-抗体、其抗原结合片段或其模拟物，所述抗体、其抗原结合片段或其模拟物与人C型凝集素样受体-1成员A受体(CLEC-1A受体)的细胞外结构域特异性结合，并且还与包含或由重链可变结构域(包含或由SEQ ID NO：5组成)和轻链可变结构域(包含或由SEQ ID NO：7组成)组成的抗体、特别是包含或由重链结构域(包含或由SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：100或SEQ ID NO：101组成)和轻链结构域(包含或由SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：33组成)组成的抗体竞争，用于与人CLEC-1A受体结合，并且是人CLEC-1的拮抗剂；特别是与阴性对照相比，更特别是与包含或由重链可变结构域(包含或由SEQ ID NO：5组成)和轻链可变结构域(包含或由SEQ ID NO：7组成)组成的抗体相比，特别是与包含或由重链结构域(包含或由SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：28、SEQID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：100或SEQ ID NO：101组成)和轻链结构域(包含或由SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：33组成)组成的抗体相比，所述抗体、其抗原结合片段或其模拟物增强髓样细胞(特别是树突状细胞和/或巨噬细胞)对肿瘤细胞和/或继发性坏死细胞的吞噬作用；或者
-抗体、其抗原结合片段或其模拟物，所述抗体、其抗原结合片段或其模拟物与人C型凝集素样受体-1成员A受体(CLEC-1A受体)的细胞外结构域特异性结合，并且还与包含或由重链可变结构域(包含或由SEQ ID NO：6组成)和轻链可变结构域(包含或由SEQ ID NO：7组成)组成的抗体、特别是包含或由重链结构域(包含或由SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：100或SEQ ID NO：101组成)和轻链结构域(包含或由SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：33组成)组成的抗体竞争，用于与人CLEC-1A受体结合，并且是人CLEC-1的拮抗剂；特别是与阴性对照相比，更特别是与包含或由重链可变结构域(包含或由SEQ ID NO：6组成)和轻链可变结构域(包含或由SEQ ID NO：7组成)组成的抗体相比，特别是与包含或由重链结构域(包含或由SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：28、SEQID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：100或SEQ ID NO：101组成)和轻链结构域(包含或由SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：33组成)组成的抗体相比，所述抗体、其抗原结合片段或其模拟物增强髓样细胞(特别是树突状细胞和/或巨噬细胞)对肿瘤细胞和/或继发性坏死细胞的吞噬作用；或者
-抗体、其抗原结合片段或其模拟物，所述抗体、其抗原结合片段或其模拟物与人C型凝集素样受体-1成员A受体(CLEC-1A受体)的细胞外结构域特异性结合，并且还与包含或由重链可变结构域(包含或由SEQ ID NO：8组成)和轻链可变结构域(包含或由SEQ ID NO：9组成)组成的抗体、特别是包含或由重链结构域(包含或由SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：100或SEQ ID NO：101组成)和轻链结构域(包含或由SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：33组成)组成的抗体竞争，用于与人CLEC-1A受体结合，并且是人CLEC-1的拮抗剂；特别是与阴性对照相比，更特别是与包含或由重链可变结构域(包含或由SEQ ID NO：8组成)和轻链可变结构域(包含或由SEQ ID NO：9组成)组成的抗体相比，特别是与包含或由重链结构域(包含或由SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：28、SEQID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：100或SEQ ID NO：101组成)和轻链结构域(包含或由SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：33组成)组成的抗体相比，所述抗体、其抗原结合片段或其模拟物增强髓样细胞(特别是树突状细胞和/或巨噬细胞)对肿瘤细胞和/或继发性坏死细胞的吞噬作用；并且
第二治疗剂选自本文如上或如下记载的列表。
术语“化疗剂”包括有效抑制肿瘤生长的化合物。化疗剂可以是常规的细胞毒性剂，即在暴露后通过干扰DNA复制、有丝分裂等诱导不可逆的致死伤害的化合物。这些药剂可具有抗增殖、促凋亡、细胞周期阻断和分化诱导作用。这些药剂优先选自烷基化药物(顺铂(cisplatin)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、甲苄肼(procarbazine)、卡莫司汀(carmustine))、蒽环类药物和其他细胞毒性抗生素、抗代谢物(即甲氨蝶呤(methotrexate)、阿糖胞苷(cytarabine)、吉西他滨(gemcitabine))、抗微管剂(即长春花碱(vinblastine)、紫杉醇(paclitaxel)、多西他赛(docetaxel))、拓扑异构酶抑制剂(即依托泊苷(etoposide)、多柔比星(doxorubicin))、生物碱(即长春新碱(vincristine)、长春花碱、长春瑞滨(vinorelbine)、喜树碱(camptothecin))或博来霉素(抑制胸苷掺入DNA链)。
发明人显示，将CLEC-1A的拮抗剂(特别是CLEC-1A的人源化拮抗剂抗体)与另一种治疗剂(特别是利妥昔单抗)组合使用，可增强巨噬细胞(特别是M1巨噬细胞)的吞噬能力，因此，抗CLEC-1A拮抗剂化合物适合用于增强同时、单独或依次施用的第二治疗剂的治疗效果。
在特定实施方式中，治疗剂可在治疗疾病中同时、单独或依次施用。
本发明还涉及一种药物组合物，所述药物组合物包含作为第一治疗剂的根据本文公开的任何实施方式的抗CLEC-1A人源化抗体、其抗原结合片段、其模拟物、核酸分子或核酸分子组合，其单独或与本文公开的第二治疗剂组合，以及药学上合适的载剂，它们在能够施用于有需要的患者的制剂在药学上是可接受的。特别是，它们可以是等张、无菌、盐水溶液(磷酸一钠或磷酸二钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙或氯化镁等或这类盐的混合物)，或干燥的(特别是冷冻干燥的)组合物，它们根据情况加入灭菌水或生理盐水，允许构成可注射溶液。
本发明还涉及一种药物组合物，所述药物组合物包含本文定义的第一治疗剂，特别是根据本文公开的任何实施方式的人源化抗CLEC-1A拮抗剂抗体、其抗原结合片段或其模拟物，单独或与第二治疗剂组合，和/或与本文定义的药学上合适的载剂组合，用于与另一种治疗的组合疗法，包括使用包含化疗剂、放疗剂、免疫治疗剂(例如肿瘤靶向单克隆抗体)、细胞治疗剂(如CAR-T细胞)、免疫抑制剂、促凋亡剂、抗生素、靶向癌症治疗剂和/或益生菌的药物，特别是用于同时、单独或依次施用于有需要的患者。放疗可包括放射线或相关地对患者施用放射性药物。放射源可以是接受治疗的患者的外部或内部(例如，放射治疗可以是以外照射放射疗法(EBRT)或近距放射疗法(BT)的形式)。靶向癌症治疗剂是通过干扰参与癌症生长、进展和扩散的特定的分子(“分子靶点”)来阻止癌症生长和扩散的药物或其他物质。靶向癌症治疗剂有时被称为“分子靶向药物”、“分子靶向治疗”、“精准药物”或类似的名称。在一些实施方式中，靶向治疗包括向受试者施用酪氨酸激酶抑制剂。术语“酪氨酸激酶抑制剂”是指作为受体和/或非受体酪氨酸激酶的选择性或非选择性抑制剂的多种治疗剂或药物中的任何一种。酪氨酸激酶抑制剂和相关化合物是在本领域中众所周知的，并且在美国专利公开2007/0254295中记载，其通过引用以全文并入本文。
本发明还涉及一种在有需要的人类受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的本文定义的第一治疗剂，特别是根据本文公开的任何实施方式的人源化抗CLEC-1A拮抗剂抗体、其抗原结合片段或其模拟物；其中，所述第一治疗剂与常规治疗(特别是常规癌症治疗)组合使用。本发明还涉及根据本文公开的任何实施方式的人源化抗CLEC-1A拮抗剂抗体、其抗原结合片段或其模拟物，用于与常规癌症治疗组合的癌症的治疗的用途中。
如本文所用，术语“标准或常规治疗”是指通常对患有癌症的受试者进行的任何癌症治疗(药物、放射治疗等)。
特别地，人源化抗CLEC-1A拮抗剂抗体、其抗原结合片段或其模拟物与化疗剂、放疗剂、免疫治疗剂(例如肿瘤靶向单克隆抗体)、细胞治疗剂(例如CAR-T细胞)、免疫抑制剂、促凋亡剂、抗生素、靶向癌症治疗剂和/或益生菌组合使用。
本发明还涉及本文公开的抗CLEC1A抗体和其抗原结合片段及其模拟物的用途，用于治疗癌症的用途中。术语“癌症”在本领域中具有其一般含义，是指一组涉及异常细胞生长、具有侵入或扩散到身体其他部位的潜力的疾病。术语“癌症”还包括原发性和转移性癌症。可通过本发明的方法和组合物治疗的癌症的示例包括但不限于来自膀胱、血液、骨骼、骨髓、脑、乳房、结肠、食道、胃肠道、牙龈、头部、肾脏、肝脏、肺、鼻咽、颈部、卵巢、前列腺、皮肤、胃、睾丸、舌头或子宫的癌症。此外，癌症可能为以下特定的组织学类型，但不限于这些：肿瘤，恶性；癌；癌，未分化；巨细胞癌和梭形细胞癌；小细胞癌；乳头状癌；鳞状细胞癌；淋巴上皮癌；基底细胞癌；毛发矩阵癌；过渡细胞癌；乳头状过渡细胞癌；腺癌；胃泌素瘤，恶性；胆管癌；肝细胞癌；合并肝细胞癌和合并胆管癌；小梁腺癌；腺样囊性癌；腺瘤性息肉中的腺癌；腺癌，家族性结肠息肉病；实体癌；类癌瘤，恶性；细支气管肺泡腺癌；乳头状腺癌；嫌色细胞癌；嗜酸性细胞癌；嗜氧性腺癌；嗜碱性细胞癌；透明细胞腺癌；颗粒细胞癌；滤泡腺癌；乳头状和滤泡腺癌；非包膜性硬化癌；肾上腺皮质癌；子宫内膜癌；皮肤附属器癌；大汗腺腺癌；皮脂腺癌；耵聍；腺癌；粘液表皮样癌；囊腺癌；乳头状囊腺癌；乳头状浆液性囊腺癌；粘液性囊腺癌；粘液性腺癌；印戒细胞癌；浸润性导管癌；髓样癌；小叶癌；炎性癌；帕吉特病，乳腺；腺泡细胞癌；腺鳞癌；腺癌伴鳞状化生；胸腺瘤，恶性；卵巢间质瘤，恶性；泡膜细胞瘤，恶性；粒层细胞瘤，恶性；男性母细胞瘤，恶性；支持细胞癌；间质细胞瘤，恶性；脂质细胞肿瘤，恶性；副神经节瘤，恶性；乳腺外副神经节瘤，恶性；嗜铬细胞瘤；血管球肉瘤(glomangiosarcoma)；恶性黑色素瘤；无黑色素性黑色素瘤；浅表扩散性黑色素瘤；巨大色素痣中的恶性黑色素瘤；上皮样细胞黑色素瘤；蓝痣，恶性；肉瘤；纤维肉瘤；纤维性组织细胞瘤，恶性；粘液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎性横纹肌肉瘤；肺泡横纹肌肉瘤；间质肉瘤；混合肿瘤，恶性；Mullerian混合瘤；肾胚细胞瘤；肝母细胞瘤；癌肉瘤；间充质瘤，恶性；布伦纳氏瘤，恶性；叶状肿瘤，恶性；滑膜肉瘤；间皮瘤，恶性；无性细胞瘤；胚胎性癌；畸胎瘤，恶性；卵巢甲状腺瘤，恶性；绒毛膜癌；中肾瘤，恶性；血管肉瘤；血管内皮瘤，恶性；卡波西肉瘤；血管外皮细胞瘤，恶性；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；皮质旁成骨肉瘤；软骨肉瘤；成软骨细胞瘤，恶性；间叶性软骨肉瘤；骨巨细胞瘤；尤因氏肉瘤；牙源性肿瘤，恶性；成釉细胞牙肉瘤；成釉细胞瘤，恶性；成釉细胞纤维肉瘤；松果体瘤，恶性；脊索瘤；神经胶质瘤，恶性；室管膜瘤；星形细胞瘤；原生质星形细胞瘤；纤维性星形细胞瘤；星形母细胞瘤；胶质母细胞瘤；少突胶质细胞瘤；成少突神经胶质细胞瘤；原始性神经外胚层肿瘤；小脑肉瘤；神经节神经母细胞瘤；成神经细胞瘤；视网膜母细胞瘤；嗅神经源性肿瘤；脑膜瘤，恶性；神经纤维肉瘤；神经鞘膜瘤，恶性；颗粒细胞瘤，恶性；恶性淋巴瘤；霍奇金病；霍奇金淋巴瘤；副肉芽肿；恶性淋巴瘤，小淋巴细胞；恶性淋巴瘤，大细胞，弥漫性；恶性淋巴瘤，滤泡性；蕈样肉芽肿；其他特定的非霍奇金淋巴瘤；恶性组织细胞增生症；多发性骨髓瘤；肥胖细胞肉瘤；免疫增生性小肠疾病；白血病；淋巴性白血病；浆细胞白血病；红白血病；淋巴肉瘤细胞白血病；髓样白血病；嗜碱性细胞白血病；嗜酸性细胞白血病；单核细胞性白血病；肥大细胞白血病；巨核细胞白血病；髓样肉瘤；以及毛细胞白血病。
在一些实施方式中，受试者患有选自胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑和中枢神经系统癌症、乳腺癌、巨大淋巴结增生、宫颈癌、结直肠癌、子宫内膜癌、食管癌、胆囊癌、胃肠道类癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、卡波西肉瘤、肾癌、喉癌和下咽癌、肝癌、肺癌、间皮瘤、浆细胞瘤、鼻腔和鼻旁窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、口腔和口咽癌、卵巢癌、胰腺癌、阴茎癌、垂体癌、前列腺癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、皮肤癌、胃癌、睾丸癌、胸腺癌、甲状腺癌、阴道癌、外阴癌和子宫癌的癌症。
本发明还涉及本文公开的抗CLEC1A抗体和抗原结合片段及其模拟物的用途，用于在有害病况或疾病的治疗(包括预防性治疗)中的用途，特别是，涉及髓样细胞(特别是树突状细胞和/或巨噬细胞)的吞噬能力。在特定实施方式中，疾病或病况选自癌症，特别是如上列出的癌症，更特别是液体癌、实体癌、淋巴瘤、结直肠癌、间皮瘤或肝癌。
本发明还涉及本文公开的抗CLEC1A抗体和其抗原结合片段及其模拟物的用途，用于在有害疾病或病况的治疗(包括预防性治疗)中的用途，特别是，刺激树突状细胞的吞噬能力可改善或治疗所述病况或疾病。在特定实施方式中，疾病或病况选自癌症，特别是如上列出的癌症，更特别是液体癌、实体癌、淋巴瘤、结直肠癌、间皮瘤或肝癌。
本发明还涉及本文公开的抗CLEC1A抗体和抗原结合片段及其模拟物的用途，用于在易于通过增加髓样细胞(特别是树突状细胞和/或巨噬细胞)的吞噬能力来改善或预防的任何疾病或病况的治疗(包括预防性治疗)中的用途。特别地，疾病或病况选自癌症，特别是如上列出的癌症，更特别是液体癌、实体癌、淋巴瘤、结直肠癌、间皮瘤或肝癌。
本发明还涉及本文公开的抗CLEC1A抗体和抗原结合片段及其模拟物的用途，用于在有害病况或疾病的治疗(包括预防性治疗)中的用途，特别是，涉及T细胞，涉及T细胞的增殖。在特定实施方式中，疾病或病况选自癌症，特别是如上列出的癌症，更特别是液体癌、实体癌、淋巴瘤、结直肠癌、间皮瘤或肝癌。
本发明还涉及一种增加髓样细胞(特别是树突状细胞和/或巨噬细胞)的吞噬能力的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的根据本文公开的任何实施方式的抗CLEC1A抗体、其抗原结合片段或其模拟物；特别地，抗体、其抗原结合片段或其模拟物与本文定义的常规治疗或至少一种第二治疗剂同时、单独或依次施用。
本发明还涉及本发明的抗体、其抗原结合片段或其模拟物，和/或本发明的核酸分子或核酸分子组合，和/或本发明的化合物组合和/或药物组合物，作为药物的用途。
本发明还涉及根据本文公开的任何实施方式的人源化抗CLEC1A抗体、其抗原结合片段或其模拟物，和/或本发明的核酸分子或核酸分子组合，和/或本发明的化合物组合和/或药物组合物，用于制造药物的用途。特别地，本发明涉及这种抗CLEC-1A抗体、其抗原结合片段或其模拟物，和/或本发明的核酸分子或核酸分子组合，和/或本发明的化合物组合和/或药物组合物的用途，用于制造用于治疗和/或预防癌症的药物的用途，特别地，所述癌症是如上列出的癌症，更特别是液体癌和实体癌，进一步更特别是淋巴瘤、结直肠癌、间皮瘤或肝癌。
本发明还涉及一种治疗或预防疾病的方法，通过对有需要的患者施用治疗量的根据本文公开的任何定义的人源化抗CLEC1A抗体、其抗原结合片段或其模拟物，和/或本发明的核酸分子或核酸分子组合，和/或本发明的化合物组合和/或药物组合物。特别地，本发明涉及一种治疗或预防癌症的方法，特别地，所述癌症是如上列出的癌症，更特别是液体癌和实体癌，进一步更特别是淋巴瘤、结直肠癌、间皮瘤或肝癌。
本发明还涉及本文定义的化合物、组合物和化合物组合的用途，特别是用于预防或治疗疾病或病症的用途。因此，提供了根据本发明的公开内容的人源化抗体、其抗原结合片段或其模拟物，或本发明的核酸分子或核酸分子组合，或本发明的化合物组合，用于预防和/或治疗疾病或病症，特别是人类疾病或人类病症，其中，髓样细胞(特别是树突状细胞和/或巨噬细胞)吞噬能力的增加改善或预防疾病或病症。
还提供了人源化抗CLEC1A抗体、其抗原结合片段或其模拟物，或本发明的核酸分子或核酸分子组合，或本发明的化合物组合，用于治疗疾病或病况，其中，在患者中诱导吞噬作用改善或预防疾病或病况。
还提供了人源化抗CLEC1A抗体、其抗原结合片段或其模拟物，或本发明的核酸分子或核酸分子组合，或本发明的化合物组合，用于治疗患有癌症的患者，特别地，所述癌症是液体或实体癌，更特别是淋巴瘤、结直肠癌、间皮瘤或肝癌、炎症性疾病、慢性感染或败血症。
还提供了人源化抗体、其抗原结合片段或其模拟物，或本发明的核酸分子或核酸分子组合，或本发明的化合物组合，用于组合疗法，其中，第一药物包含化疗剂、放疗剂、免疫治疗剂(例如肿瘤靶向单克隆抗体)、细胞治疗剂(例如CAR-T细胞)、免疫抑制剂、促凋亡剂、抗生素、靶向癌症治疗剂和/或益生菌，特别是用于对有需要的患者同时、单独或依次施用。
表1：根据本发明的抗体的重链可变结构域和轻链可变结构域的特定的CDR结构域的序列(根据Kabat系统)
| CDR | 序列 | SEQ ID NO |
| 11H11 VHCDR1 | NFGMN | 10 |
| 11H11 VHCDR2 | WINTNTGEPTYADDFKG | 11 |
| 11H11 VHCDR3 | GAPAWFTY | 12 |
| 11H11 VLCDR1 | RASESIYSYLA | 13 |
| 11H11 VLCDR2 | NAKTLAS | 14 |
| 11H11 VLCDR3 | QHHFGTPLT | 15 |
| 14H9 VHCDR1 | TYGIH | 16 |
| 14H9 VHCDR2 | VIWSDASTIYASSLKS | 17 |
| 14H9 VHCDR3 | HGGYYNYFDY | 18 |
| 14H9 VLCDR1 | HASQNINVWLS | 19 |
| 14H9 VLCDR2 | KASNLHT | 20 |
| 14H9 VLCDR3 | QQGQSYWT | 21 |
| 6C5 VHCDR1 | DYVIS | 22 |
| 6C5 VHCDR2 | EIYPGSGNTYYNQKFQG | 23 |
| 6C5 VHCDR3 | GGSSHFDY | 24 |
| 6C5 VLCDR1 | RASQSVDNHGFSFMN | 25 |
| 6C5 VLCDR2 | AASNRGT | 26 |
| 6C5 VLCDR3 | QQSKEVPWT | 27 |
本发明考虑了vHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、vLCDR2和vLCDR3的任意组合。
表2：本发明的抗体的重链可变结构域的序列
本文列出的可变重链对应于在本发明工作实施例中使用的抗体11H11、14H9和6C5中存在的可变重链。
表3：本发明的抗体的轻链可变结构域的序列
本文列出的可变轻链对应于在本发明工作实施例中使用的抗体11H11、14H9和6C5中存在的可变轻链。
本发明考虑选自表2的一个重链可变结构域与选自表3的一个轻链可变结构域的任意组合。
以下附图和实施例旨在为本领域的普通技术人员提供关于如何制造和使用本发明的完整公开和记载，其并不旨在限制发明人认为是其发明的范围，也不旨在表示以下实验是进行的全部或唯一的实验。虽然已经参照其具体实施方式对本发明进行了描述，但本领域技术人员应理解，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可进行多种变化和替换等效物。此外，可进行诸多修改以适应本发明的目的、精神和范围的特定情况、材料、物质、组合物、过程、过程步骤或步骤。所有的这类修改均意在本文所附权利要求的范围内。
材料和方法
人源化抗CLEC抗体的制备和表征
对于人源化抗CLEC，通过EcoRV在含有hIgG4的CH1-铰链-CH2-CH3结构域的pcDNA3.4人G4m表达质粒(OSE免疫疗法质粒)中克隆抗CLEC抗体的重链(VH)可变序列，并在S228P位点突变，以稳定铰链区域。通过BsiWI在含有人CLκ的pcDNA3.4CLIg-hκ表达质粒(OSE免疫疗法质粒)中克隆抗CLaCD抗体的轻链(VL)可变序列。
在HEK FreeStyle细胞或CHO哺乳动物细胞中，我们通过Lipofectamine法或聚乙烯亚胺法共转染含有VH-hFcG4m和VL-CLhk的相同质粒。在孵育6-7天后，回收上清液，用柠檬酸0.1M pH 3洗脱缓冲液在蛋白A色谱(HiTrap，GeHealthcare)上通过亲和性纯化。将纯化的抗体在PBS、100mM精氨酸/L-谷氨酸中透析并浓缩。通过280nm的紫外线对它们进行定量，并在多项测试中进行测试：在ELISA和Blitz(ForteBio)中对CLEC-His的活性测定、对U266细胞进行的活性测定(CLEC存在于细胞表面)、渗透性细胞系的拮抗剂测定法。
人源化抗CLEC1抗体的变体的制备和表征
使用含有取代核苷酸的引物和定向位点诱变试剂盒(NEBiolabs)通过PCR产生人源化抗CLEC1抗体的变体(11H11m、6C5m1、6C5m2和14H9m)，并在质粒纯化前在Top10化学感受态细胞中转化。在CHO哺乳动物细胞中，通过聚乙烯亚胺法共转染含有VH-hFcG4m和VL-CLhk的相同质粒。在孵育6-7天后，通过夹心ELISA测定法和CLEC1结合测定法回收并定量上清液。
通过夹心法进行ELISA定量测定法
对于定量ELISA测定法，将驴抗人IgG Fc特异性抗体(Jackson Immunoresearch#709-005-098)以1.3μg/mL的浓度固定在塑料上，添加含有抗体或纯化抗体的上清液，测量结合。在孵育和洗涤后，添加小鼠抗人κ抗体(OSE免疫疗法；参考号NaM76-5F3)，然后添加过氧化物酶标记的驴抗小鼠IgG(Jackson Immunoresearch；参考号715-036-151)并通过常规方法显示。
包被CLEC1-His的人抗CLEC-1A的ELISA活性测定法
对于活性ELISA测定法，将重组hCLEC-His(R&D Systems；参考号1704-CL)以2μg/mL的浓度固定在塑料上，添加含有抗体或纯化抗体的上清液，测量结合。在孵育和洗涤后，添加过氧化物酶标记的驴抗人IgG(Jackson Immunoresearch；参考号709-035-149)通过常规方法显示。
包被Fc-CLEC1的人抗CLEC-1A的ELISA活性测定法
对于活性ELISA测定法，将重组hFc-CLEC(OSE免疫疗法，南特)以2μg/mL的浓度固定在塑料上，添加含有抗体或纯化抗体的上清液，测量结合。在孵育和洗涤后，加入小鼠的抗人κ抗体(OSE免疫疗法；参考号NaM76-5F3)，然后添加过氧化物酶标记的驴抗小鼠IgG(Jackson Immunoresearch；参考号715-036-151)，通过常规方法显示。
通过细胞荧光测定术对U266细胞进行抗CLEC结合测定法
为了测量抗CLEC在U266细胞CLEC1+上的结合，首先将以1/50稀释(BDPharmingen；美国；参考号564220)的人Fc受体结合抑制剂在室温下添加30分钟，以阻断U266细胞上的人Fc受体以减少背景。然后，将抗体在4℃下孵育30分钟，洗涤后在4℃下用PE标记的抗人IgG Fc染色15分钟(Biolegend；美国；参考号409303)。在Cytoflex(BeckmanCoulter)上分析样品。
通过Blitz对抗CLEC抗体进行对人CLEC-His重组蛋白的亲和性分析
将CLEC-His重组蛋白(R&D Systems；参考号1704-CL)以10μg/mL的浓度固定在NINTA生物传感器上，并以20μg/mL的浓度添加指定的抗体。在120秒的缔合期(ka)和120秒的解离期(kd)后推导出值，以测定亲和常数(KD)。
通过流式细胞术测定拮抗剂活性
对于竞争测定法，将Fc-Clec-1(免疫疗法，法国南特)与Alexa Fluor 488(Alexa/>488微型蛋白质标记试剂盒#A30006，Fisher Scientific，Illkirch，法国)偶联。
渗透性(参考号554714CytoFix/Cytoperm试剂盒，BD Biosciences，法国)和Fc阻断(参考号564220，BD Biosciences)的伯基特淋巴瘤Raji细胞表达Clec-1配体，其在与Alexa488标记的Fc-Clec(10nM)孵育后可被检测到。为了测量竞争，将不同浓度的纯化抗Clec抗体与Alexa488标记的Fc-Clec(固定的10nM)在室温下预孵育15分钟。然后将预孵育的混合物在渗透性和Fc阻断的Raji细胞在冰上孵育30分钟。然后用PFA 2％在冰上在冷PBS中固定细胞上的结合10分钟，在CytoFlex细胞荧光计(Beckman Coulter France，Villepinte)上分析。
在NALM6细胞上也测量了竞争，该细胞也可以在细胞内或细胞外表面表达配体。将不同浓度的纯化的抗Clec抗体与Alexa488标记的Fc-Clec(100nM)在室温下预孵育15分钟。然后将预孵育的混合物在Fc阻断的NALM6细胞上在冰上孵育30分钟，无论是否预渗透。然后在冰上用2％的PFA在冷PBS中固定细胞上的结合10分钟，并在CytoFlex细胞荧光计(Beckman-Colter France，Villepinte)上进行分析。
吞噬作用测定法
使用Miltenyi提供的经典单核细胞分离试剂盒，通过磁性分选从健康的志愿者的细胞分离术中分离单核细胞。然后，用50ng/mL的人重组GM-CSF(CellGenix)和20ng/mL的人重组IL-4(CellGenix)培养单核细胞6-7天，以生成未成熟树突状细胞(iDC)。用50ng/mL的人重组TGFb(PeproTech)将iDC极化为免疫耐受DC，持续2天，导致这些TGFb-DC过表达Clec-1。在极化过程中以10μg/mL添加抗体。用10ng/mL的抗CD20单克隆抗体(利妥昔单抗)以1：1的比例培养TGFβ-DC与非霍奇金淋巴瘤(Raji)，提供“吃掉我”信号；用TGFβ-DC培养裸NSCLC细胞(A549)5小时。通过流式细胞术分析吞噬作用并在每个供体的对照抗体条件下进行归一化。
用M-CSF(100ng/mL)从单核细胞中产生巨噬细胞(MΦ)，持续5天。将MΦ与非霍奇金淋巴瘤(Raji；CD20+)、结肠癌(DLD-1；EGFR2+)或乳腺癌(SK-BR3；Her2+)以1：2的比例进行培养+/-分别10ng/mL的抗CD20单克隆抗体(利妥昔单抗)、抗EGFR单克隆抗体(西妥昔单抗)或抗Her2单克隆抗体(曲妥单抗)，提供“吃掉我”信号，持续2小时。通过流式细胞术进行吞噬作用分析，以CPDe670+细胞占CPDe450+细胞总数的百分比计算吞噬作用的百分比。通过将吞噬Raji细胞的M1百分比乘以吞噬细胞的中位强度荧光来表达，并根据利妥昔单抗浓度表示结果。
对于肉眼观察测定法，如上所述地产生巨噬细胞。将MΦ与抗CLEC1嵌合mAb预孵育2小时，然后与非霍奇金淋巴瘤(Raji；CD20+)+抗CD20单克隆抗体(利妥昔单抗)分别以10ng/mL培养，提供“吃掉我”信号，持续4小时。通过显微镜进行吞噬分析，并通过总巨噬细胞中pHrodo(pHrodo-SE，Thermofisher)阳性Raji的百分比计算吞噬作用的百分比。
用荧光染料染色肿瘤细胞系、Raji(B淋巴瘤)CSCLC细胞、结直肠癌细胞和乳腺癌细胞Huh7(肝癌)，以表征吞噬作用测定中的细胞。简而言之，将肿瘤细胞与细胞增殖染料eFluor 670一起孵育15分钟，并根据制造商的说明(Life Technologies)在进行UV处理前进行洗涤。然后，用150mJ/cm2的UV处理细胞并孵育过夜以触发凋亡诱导程序，从而导致Clec-1配体表达。
收集TGFb-DC和肿瘤细胞系，编号，以2个DC对1个肿瘤细胞的比率孵育5小时，在这个过程中以10μg/mL添加抗体。通过流式细胞术对CPD-eFluor670阳性TGFb-DC进行吞噬作用评估。
在本发明实施例中，除非特别说明，否则抗CLEC-1A对照抗体为不具有拮抗剂性质的内部(in-house)抗体。
本发明的实施例
实施例1：本发明的人源化抗hCLEC1A拮抗性抗体和现有技术中公开的抗hCLEC1A 拮抗性抗体对树突状细胞肿瘤吞噬作用的生物活性–图1
方法
a)用TGFb重组蛋白极化的衍生自单核细胞的树突状细胞(DC)的产生
使用Miltenyi提供的经典单核细胞分离试剂盒，通过磁性分选从健康志愿者的细胞分离术中分离出单核细胞。然后，用50ng/mL的人重组GM-CSF(CellGenix)和20ng/mL的人重组IL-4(CellGenix)培养单核细胞6-7天，产生未成熟树突状细胞(iDC)。用50ng/mL的人重组TGFb(PeproTech)将iDC极化为免疫耐受DC，持续2天，导致这些TGFb-DC过表达CLEC-1。在极化过程中以10μg/mL添加抗体。
b)经UV处理的凋亡肿瘤细胞系的产生
用荧光染料对对应于非霍奇金B淋巴瘤(Raji细胞-图1A和图1D)、结肠癌(DLD-1模型-图1B)、乳腺癌(SK-BR3细胞系-图1C)和肺癌(NSCLC细胞-图1E)的肿瘤细胞系进行染色，表征吞噬作用测定法中的细胞。简而言之，将肿瘤细胞与细胞增殖染料eFluor 670一起孵育15分钟，并根据制造商的说明在进行UV处理前洗涤(Life Technologies)。然后，用150mJ/cm2的UV处理细胞并孵育过夜以触发凋亡诱导程序，从而导致CLEC-1配体表达。
c)吞噬作用测定法
收集TGFb-DC和肿瘤细胞系，编号，以2个DC对1个肿瘤细胞的比率孵育5小时，在这个过程中以10μg/mL添加抗体。通过流式细胞术对CPD-eFluor670阳性TGFb-DC进行吞噬作用评估。用eFluor450细胞增殖染料(Life technologies)染色后，将人源化抗Clec-1mAb与人巨噬细胞(衍生自单核细胞的用IFNγ极化的巨噬细胞)在37℃下孵育1小时。
结果：图1显示了在对照条件下归一化的TGFb-DC对经UV处理的肿瘤细胞的吞噬作用。在三种不同的癌症模型淋巴瘤(图1A)、癌(图1B)和乳腺癌(图1C)中，本发明的拮抗性人源化14H9、6C5和11H11抗体增加了对肿瘤细胞的吞噬作用，而现有技术的对照抗体(公开于WO2018073440A1和Robles等(Blood advances，2017)))没有诱导淋巴瘤(图1D)或肺癌(图1E)中DC对肿瘤细胞的吞噬作用的能力发生任何显著变化。与阴性对照相比，在所有癌症模型中，在对照条件下归一化的TGFb-DC对经UV处理的肿瘤细胞的吞噬作用在本发明的抗体的存在下得到增强。
此实施例证明了本发明的人源化抗体的增强树突状细胞对肿瘤细胞吞噬作用的能力，相比于现有技术的抗体(公开于WO2018073440A1和Robles等(Blood advances，2017))。需要注意的是，人源化抗CLEC-1A抗体6C5和14H9为IgG1抗体，它们具有对应于IgG1N297A的恒定链结构域(SEQ ID NO：97(人源化6C5-m，人源化14H9-m)。人源化11H11抗体是IgG4抗体(S228P)(人源化11H11)。根据所示结果，当人源化抗体为6C5或14H9时，对肿瘤细胞的吞噬作用似乎更高，与提供的IgG4等效物相比，提供的IgG1人源化抗CLEC-1A抗体可能更令人感兴趣。
实施例2：本发明的抗hCLEC-1A拮抗性抗体或现有技术的抗hCLEC1A拮抗性抗体与 肿瘤靶向抗体的组合的生物活性：利妥昔单抗、西妥昔单抗或曲妥单抗–图2
方法
用eFluor450细胞增殖染料(Life technologies)染色后，将人源化抗Clec-1mAb与人巨噬细胞(衍生自单核细胞的用IFNγ极化的巨噬细胞)在37℃下以10μg/mL孵育1小时。
在用eFluor 647细胞增殖染料(Life technologies)染色后，人Raji B淋巴瘤、DLD-1结肠癌、SK-BR3乳腺癌细胞系在37℃下与培养基或抗肿瘤相关抗原(TAA)(Raji上的利妥昔单抗抗CD20、DLD-1上的西妥昔单抗抗EGFR、SK-BR3上的曲妥单抗抗Her2)(1ng/mL)一起孵育1小时。将抗CLEC-1处理的巨噬细胞与+/-抗TAA调理的肿瘤细胞系在37℃下孵育1小时，进行吞噬作用测定法。通过流式细胞术进行吞噬作用分析，通过CPDe670+细胞占总CPDe450+细胞的百分比计算吞噬作用百分比。通过将吞噬Raji细胞的M1的百分比乘以吞噬细胞的中位强度荧光来表达，并根据利妥昔单抗浓度表示结果。
结果：吞噬作用测定法显示，与WO2018073440A1和Robles等(Blood advances，2017)中公开的现有技术的抗体(参见图2D)相比，M1巨噬细胞能够在利妥昔单抗和本发明的抗CLEC-1A抗体的组合的存在下吞噬Raji细胞(图2A)。对于另外两种癌症模型，也显示了相同的结果；当施用西妥昔单抗和本发明的抗CLEC-1A抗体的组合时，巨噬细胞对结肠癌肿瘤细胞的吞噬作用增加(图2B)；当施用曲妥单抗和本发明的抗CLEC-1A抗体的组合时，巨噬细胞对乳腺癌肿瘤细胞的吞噬作用增加(图2C)。本发明的抗CLEC-1A抗体与第二抗肿瘤抗体的结合增强了巨噬细胞M1的吞噬能力。因此，显示使用本发明的抗CLEC-1A拮抗剂抗体增强了肿瘤靶向抗体的治疗效果。
此实施例证明了本发明的抗体与肿瘤靶向抗体组合，增加巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用的能力，相比于现有技术的抗体(公开于WO2018073440A1和Robles等(Bloodadvances，2017))。
实施例3：抗肿瘤效果对小鼠肝癌肿瘤模型总生存期的影响–图3
方法
用空气/异氟烷混合物麻醉小鼠。在剖腹手术后，通过门静脉(2.5×106个细胞/100μL)注射在PBS中的肿瘤性Hepa 1.6细胞。治疗在肿瘤注射4天后开始。抗CLEC1抗体和同型对照以3mg/kg注射，每周2次，持续3周。跟踪总生存期，并报告每种条件下的存活百分比(图3)。
结果：如图3所示，用本发明的人源化抗CLEC1抗体治疗的动物在两种抗CLEC1疗法中都延长了存活率(用对照抗体治疗的小鼠在25天后全部死亡，而用本发明的抗CLEC1抗体6C5或14H9治疗的小鼠的存活时间至少延长了两倍)。这个结果表明，治疗性单一疗法(本发明的人源化抗CLEC1抗体)对HCC肿瘤模型具有意想不到的效率。
实施例4：组合疗法(抗CLEC1抗体和化疗)治疗对小鼠结直肠癌肿瘤模型的肿瘤发 展的抗肿瘤效果–图4
方法
用空气/异氟烷混合物麻醉小鼠。皮下注射在PBS中的肿瘤性MC38细胞(0.5×106个细胞/100μL)。治疗在肿瘤注射4天后开始。本发明的抗CLEC1抗体6C5和同型对照以3mg/kg注射，每周2次，持续3周。当肿瘤达到50-100mm3时，以100mg/kg腹膜内施用在PBS中的化疗一次。通过测量肿瘤的长度和宽度来评估肿瘤发展，从每种条件下的肿瘤测量基线确定肿瘤发展并报告(图4)。
结果：如图4所示，与仅化疗相比，用本发明的人源化抗CLEC1抗体和化疗治疗的动物观察到更好的反应率。在40天后，用抗CLEC1抗体和化疗治疗的小鼠肿瘤体积的合计测量值没有仅用化疗治疗的小鼠增加那么多(600mm3 vs.1500mm3)。此外，用本发明的人源化抗CLEC1抗体6C5和化疗治疗的4只小鼠(共10只)在实验后存活，而所有仅接受化疗治疗的小鼠均死亡。这一结果表明，治疗组合(本发明的人源化抗CLEC1抗体+化疗)对CRC肿瘤模型具有意想不到的效率。
实施例5：使用拮抗剂测定法进行CLEC1配体与人源化抗hCLEC1抗体之间的竞争研 究–图5至9
方法：为了测量表达CLEC1配体的渗透性Raji(CytoFix/cytoperm试剂盒，BDBiosciences)的竞争，使用与渗透性Raji特异性结合的Fc-CLEC1标记的A488。为了测量竞争，将10nM的Fc-CLEC1标记的A488与不同浓度的人源化抗hCLEC1在室温(RT)下混合15分钟，然后在4℃下添加到这些细胞上30分钟。在孵育和洗涤后，将PFA 2％添加到孔中，在4℃下固定细胞10分钟，在CytoFlex(Beckman)细胞荧光计上分析以检测Fc-CLEC1标记的抑制。为了测量NALM6细胞的竞争，将100nM的Fc-CLEC1标记的A488与不同浓度的人源化抗hCLEC1在RT下混合15分钟，然后在4℃下添加到这些细胞上30分钟。在孵育和洗涤后，将PFA 2％添加到孔中，在4℃下固定细胞10分钟，并在CytoFlex(Beckman)细胞荧光计上分析以检测Fc-CLEC1标记的抑制。
在拮抗剂测定法中还使用小鼠肝癌Hepa 1.6或结直肠癌MC38细胞系。将嵌合或人源化抗Clec-1mAb(6C5、11H11、14H9)在不同浓度(从60μg/mL到0.08μg/mL)下与人Fc-CLEC-1重组蛋白与10μg/mL的A488荧光染料在冰上缀合30分钟。先用活性标志物对小鼠肝癌Hepa1.6或结直肠癌MC38细胞系进行染色，然后用A488荧光染料缀合的重组人Fc-CLEC-1蛋白与拮抗性抗CLEC-1mAb在冰上预孵育30分钟。最后，用1％PFA溶液固定细胞，并在细胞计数器上读取。
图表描述了根据抗CLEC-1嵌合(空圆圈)或人源化(实心圆圈)mAb的浓度的hIgG4对照条件归一化的Fc-CLEC-1阳性存活细胞的百分比。
结果：图5-9显示了与同型对照或内部嵌合抗CLEC1对照(对照+抗Clec1)相比，本发明的人源化抗hCLEC1抗体的拮抗活性。分别10nM和100nM的Fc-CLEC1能够与渗透性Raji、渗透性NALM6细胞和原生NALM6细胞特异性结合。与同型对照相比，3种测试的抗体能够以剂量依赖性方式阻断Fc-CLEC与其配体在渗透性Raji、渗透性NALM6细胞和原生NALM6上的相互作用，其中，同型对照不抑制Fc-CLEC在这些细胞上的结合。在3种抗体中，所有抗体的IC50相似，并且抑制曲线相似(参见图5至7)。
在补充测定法中，评估了拮抗人CLEC-1A的能力，以与本发明的人源化抗体获得的结果比较(与它们的嵌合抗体相比)。如图8和9所示，所有三种人源化抗体11H11、14H9和6C5都拮抗Fc-CLEC1A与小鼠肝癌Hepa 1.6或结直肠癌MC38细胞系的结合(图8A-C和图9A-B)。在最低浓度下，人源化抗体，与它们对应的嵌合抗体相比，是更好的拮抗剂。如图表所示(图8D和图9C)，人源化抗体的EC50是它们对应的嵌合抗体的EC50的最大的一半，并且大多数时间在1/5和1/3之间。
因此，所有测试的本发明的人源化抗体都能够阻止CLEC-1A与通常与CLEC-1A结合的细胞之间的结合，从而说明这些抗体能够拮抗CLEC-1A与其配体之一的结合。因此，这个实施例说明本发明的抗体是人CLEC-1的拮抗剂。此外，本发明的人源化抗体似乎是比它们的嵌合对应物更好的CLEC-1A拮抗剂，特别是在低浓度下。
实施例6：人源化抗CLEC1抗体的产生–图10
在哺乳动物HEK细胞和CHO细胞中，我们分别通过Lipofectamine法或聚乙烯亚胺(PEI)将含有VH-hFcG4m或VH-hFcG1N297A的质粒与含有VL-CLκ的质粒共转染。在孵育5-6天后，在蛋白A色谱(HiTrap，GeHealthcare)上用柠檬酸0.1M pH 3洗脱缓冲液通过亲和性纯化上清液。将纯化的抗体在PBS、100mM精氨酸/L-谷氨酸中透析并浓缩。它们通过UV(A280nm)进行定量，产量与每升收集的培养上清液中纯化的抗体量对应。
如图10A和10B所示，本发明的抗体以不同的生产率良好表达(使用的信号肽：IgKleader)。如表(图10C)所示，人源化抗体在HEK细胞和CHO细胞中具有较高产量。
这个实施例说明本发明的抗体可在重组生产系统中高效生产。
实施例7：通过ELISA进行人源化抗hCLEC抗体的CLEC结合测定法–图11-图14
方法：通过Blitz对人CLEC1-His重组蛋白上的抗CLEC1抗体进行亲和性分析。将CLEC1-His重组蛋白固定在NINTA生物传感器上，以20μg/mL的浓度添加指定抗体。在120秒的缔合期(ka)和120秒的解离期(kd)后推导出值，确定亲和常数(KD)(图11)。
抗hCLEC1抗体的结合活性也通过ELISA(酶联免疫吸附测定)进行评估。对于ELISA测定，将重组hCLEC1-His(R&D Systems；参考号1704-CL)在碳酸盐缓冲液(pH9.2)中以2μg/ml固定在塑料上，添加不同浓度的纯化抗体，测量结合。在孵育和洗涤后，用过氧化物酶标记的驴抗人抗体进行显示，并且使用TMB底物在450nm处通过比色法显示(JacksonImmunoresearch；参考号715-036-151)(图12A)。如上所述，进行第二次ELISA测定法，以2μg/mL固定Fc-CLEC1(OSE免疫疗法)。如上所述，ELISA是在碳酸盐缓冲液中以2μg/mL固定小鼠Fc-CLEC1(OSE免疫疗法)而不是His-CLEC。添加不同浓度的纯化抗体，测量结合。在孵育和洗涤后，用小鼠抗人κ抗体和过氧化物酶标记的驴抗小鼠抗体进行显示，并且使用TMB底物在450nm处通过比色法显示。ED50是指抗体在该测定中达到信号的50％的浓度。(图12B)对照抗体是同型对照。通过细胞荧光法对人源化14H9、人源化11H1、人源化6C5和同型对照的人U266细胞系CLEC1+进行第三项结合研究。在CytoFlex细胞计数器上使用PE标记的小鼠抗人Fc mAb进行显示，值对应于平均荧光强度(MFI)(图13)。
结果：如图11-图13所示，通过ELISA测定的本发明的不同的人源化抗CLEC1抗体对CLEC1-His的结合活性显示所有抗体均具有结合活性。本发明的所有人源化抗CLEC-1A抗体都引起与CLEC-His的特异性结合活性。通过ELISA测量的嵌合抗CLEC1抗体在CLEC1-His上的结合活性显示，所有抗体都具有结合活性，EC50不同(图12A)。本发明的所有人源化抗CLEC-1A抗体都引起与Fc-CLEC-1A(图12B)的特异性结合活性，ED50不同。此外，所有人源化抗体都能够与人U266细胞结合(图13)。
这个实施例表明，本发明的抗体对人CLEC-1A具有特异性亲和性。
为了评估具有与本发明抗体(参考6C5、11H11和14H9)相同的CDR组合的抗CLEC1抗体的结合能力，提供了这些抗体的突变版本，并且评估了它们与Fc-CLEC的结合能力(图14A-D)。对本发明的6C5、11H11和14H9抗体在轻链可变区域或重链可变区域，或者所述轻链和重链的可变区域的框架区域进行突变。为此，提供了14H9的突变版本(在图14A中参考14H9m)，其包含14H9轻链(SEQ ID NO：7)和重链的突变版本(SEQ ID NO：6)(与14H9相比，第三个框架区域中有两处取代：T74S和V89I)。提供了11H11的突变版本(在图14B中参考11H11m)，其包含11H11的重链(SEQ ID NO：3)和11H11的可变轻链的突变版本(SEQ ID NO：102)(与11H11相比，在第二框架区域中有一处取代：A43S)。提供了6C5的两个突变版本(在图14C-D中参考6C5m1和6C5m2)。6C5m1包含6C5的轻链(SEQ ID NO：9)和重链的突变版本(SEQ ID NO：103)(与6C5相比，在第三个框架区域中有一处取代：M81I)。6C5m2包含6C5的重链(SEQ ID NO：8)和轻链的突变版本(SEQ ID NO：104)(与16C5相比，第二框架区域中有两处取代：A43P和R45K)。将这四种突变体与Fc-CLEC1的结合能力与它们各自的亲本抗体进行了比较。如图14所示，突变抗体具有与它们各自的亲本抗体相同的结合能力。因此，框架区域内的突变可能对抗体的能力没有影响，条件是CDR未经修饰。
Claims (16)
1.一种抗体、其抗原结合片段或其模拟物，所述抗体、其抗原结合片段或其模拟物与人C型凝集素样受体-1成员A受体(CLEC-1A受体)的细胞外结构域特异性结合，所述抗体、其抗原结合片段或其模拟物包含：
·抗体重链可变结构域，所述抗体重链可变结构域包含SEQ ID NO：10的VHCDR1、SEQID NO：11的VHCDR2、SEQ ID NO：12的VHCDR3；以及抗体轻链可变结构域，所述抗体轻链可变结构域包含SEQ ID NO：13的VLCDR1、SEQ ID NO：
14的VLCDR2、SEQ ID NO：15的VLCDR3；或者
·抗体重链可变结构域，所述抗体重链可变结构域包含SEQ ID NO：16的VHCDR1、SEQID NO：17的VHCDR2、SEQ ID NO：18的VHCDR3；以及抗体轻链可变结构域，所述抗体轻链可变结构域包含SEQ ID NO：19的VLCDR1、SEQ ID NO：
20的VLCDR2、SEQ ID NO：21的VLCDR3；或者
·抗体重链可变结构域，所述抗体重链可变结构域包含SEQ ID NO：22的VHCDR1、SEQID NO：23的VHCDR2、SEQ ID NO：24的VHCDR3；以及抗体轻链可变结构域，所述抗体轻链可变结构域包含SEQ ID NO：25的VLCDR1、SEQ ID NO：
26的VLCDR2、SEQ ID NO：27的VLCDR3。
2.根据权利要求1所述的抗体、其抗原结合片段或其模拟物，其中，所述抗体、其抗原结合片段或其模拟物包含：
·抗体重链可变结构域，所述抗体重链可变结构域包含或由SEQ ID NO：3中所示的氨基酸序列组成；以及抗体轻链可变结构域，所述抗体轻链可变结构域包含或由SEQ ID NO：4中所示的氨基酸序列组成；或者
·抗体重链可变结构域，所述抗体重链可变结构域包含或由SEQ ID NO：5中所示的氨基酸序列组成；以及抗体轻链可变结构域，所述抗体轻链可变结构域包含或由SEQ ID NO：7中所示的氨基酸序列组成；或者
·抗体重链可变结构域，所述抗体重链可变结构域包含或由SEQ ID NO：8中所示的氨基酸序列组成；以及抗体轻链可变结构域，所述抗体轻链可变结构域包含或由SEQ ID NO：9中所示的氨基酸序列组成。
3.根据权利要求1或2所述的抗体、其抗原结合片段或其模拟物，其中，所述抗体、其抗原结合片段或其模拟物拮抗人CLEC-1A的细胞外结构域、特别是融合蛋白与继发性坏死细胞和/或肿瘤细胞、和/或继发性坏死细胞和/或肿瘤细胞的细胞内容物的结合，所述融合蛋白包含与人免疫球蛋白、特别是人IgG的Fc片段融合的人CLEC-1A受体的细胞外结构域。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或其模拟物，其中，所述抗体是重组抗体，所述重组抗体包含人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恒定区域。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或其模拟物，其中，所述抗体的重链恒定区域包含或由SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：100或SEQ ID NO：101中所示的氨基酸序列组成。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或其模拟物，其中，所述抗体的轻链恒定区域衍生自或来源自κ轻链恒定区域，或者是κ轻链恒定区域，特别是包含或由SEQ ID NO：33中所示的氨基酸序列组成。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或其模拟物，其中，所述抗体、其抗原结合片段或其模拟物以至少1E-07M、更特别是至少1E-08M的亲和常数(KD)与人CLEC-1A结合。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或其模拟物，其中，所述抗体、其抗原结合片段或其模拟物与阴性对照相比，在体内和/或体外使用时与调节、特别是增加髓样细胞、特别是树突状细胞和/或巨噬细胞对肿瘤细胞和/或继发性坏死细胞的吞噬作用相关，特别是与阴性对照相比对肿瘤细胞的吞噬作用增加至少10％。
9.一种核酸分子或核酸分子组合，所述核酸分子或核酸分子组合编码多肽，所述多肽包含或由权利要求1至8中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或其模拟物组成，所述核酸分子或核酸分子组合编码权利要求1至8中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或其模拟物的至少6个CDR结构域。
10.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1至8中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或其模拟物，和/或权利要求9所述的核酸分子或核酸分子组，以及药学上合适的载剂。
11.一种化合物组合，所述化合物组合包含第一治疗剂和至少一种第二治疗剂，其中：
i)所述第一治疗剂是权利要求1至8中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或其模拟物，和/或权利要求9所述的核酸分子或核酸分子组；以及
ii)所述至少一种第二治疗剂选自：免疫治疗剂，特别是肿瘤靶向抗体或其抗原结合片段，特别是肿瘤靶向单克隆抗体或其抗原结合片段，更特别是活化和/或增强巨噬细胞的吞噬能力的肿瘤靶向单克隆抗体、其抗原结合片段或其模拟物，进一步更特别是选自阿仑单抗、阿替利珠单抗、贝伐单抗、西妥昔单抗、赫赛汀、帕尼单抗、利妥昔单抗、曲妥单抗、抗PDL-1抗体和抗CD47抗体的单克隆抗体，和/或选自抗PD1抗体、抗CTLA4抗体、激动剂抗CD137抗体、抗CD28抗体、抗CD127抗体、抗bcl2抗体和抗SIRPa抗体的另一种抗体或单克隆抗体；和/或化疗剂，和/或细胞治疗剂(例如CAR-T细胞)和/或放疗剂，特别是具有抗增殖、促凋亡、细胞周期阻断和/或分化诱导作用的细胞毒性剂，更特别是选自细胞毒性抗体、烷基化药物、蒽环类药物、抗代谢物、抗微管剂、拓扑异构酶抑制剂、生物碱、博来霉素、抗肿瘤药物和环磷酰胺的细胞毒性剂；特别地，所述第一治疗剂和第二治疗剂同时、单独或依次使用。
12.权利要求1至8中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或其模拟物，或权利要求9所述的核酸分子或核酸分子组合，或权利要求10所述的药物组合物，或权利要求11所述的化合物组合，用于作为药物的用途。
13.权利要求1至8中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或其模拟物，或权利要求9所述的核酸分子或核酸分子组合，或权利要求10所述的药物组合物，或权利要求11所述的化合物组合，用于在预防和/或治疗疾病或病症、特别是人类疾病或人类病症中的用途，其中，髓样细胞、特别是树突状细胞和/或巨噬细胞的吞噬能力的增加改善或预防所述疾病或病症。
14.权利要求1至8中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或其模拟物，或权利要求9所述的核酸分子或核酸分子组合，或权利要求10所述的药物组合物，或权利要求11所述的化合物组合，用于在治疗疾病或病况中的用途，其中，在患者中吞噬作用的诱导改善或预防所述疾病或病况。
15.权利要求1至8中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或其模拟物，或权利要求9所述的核酸分子或核酸分子组合，或权利要求10所述的药物组合物，或权利要求11所述的化合物组合，用于治疗患有癌症、炎症性疾病、慢性感染或败血症的患者，所述癌症特别是液体癌或实体癌，更特别是淋巴瘤、结直肠癌、间皮瘤或肝癌。
16.权利要求1至8中任一项所述的抗体、其抗原结合片段或其模拟物，或权利要求9所述的核酸分子或核酸分子组合，或权利要求10所述的药物组合物，或权利要求11所述的化合物组合，用于在组合疗法中的用途，其中，向有需要的患者施用第一药物，所述第一药物包含化疗剂、放疗剂、免疫治疗剂(例如肿瘤靶向单克隆抗体)、细胞治疗剂(例如CAR-T细胞)、免疫抑制剂、促凋亡剂、抗生素、靶向癌症治疗剂和/或益生菌，特别是用于同时、单独或依次施用。
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