CN118084895A - 一种一氧化氮供体型Omidenepag衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents

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CN118084895A CN202410221052.5A CN202410221052A CN118084895A CN 118084895 A CN118084895 A CN 118084895A CN 202410221052 A CN202410221052 A CN 202410221052A CN 118084895 A CN118084895 A CN 118084895A
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黄张建
吴建兵
刘松琦
张奕华
李存睿
汤濠洋
王伟达
赵芮涵
刘以晨
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Abstract

本发明公开了一种结构式为I的一氧化氮供体型Omidenepag衍生物及其制备方法和应用。这些衍生物涉及不同类别的NO供体，在体外房水中可释放一定量的NO，并保留了较强的EP2受体激动活性，二者协同降低新西兰白兔眼内压，且没有眼结膜的刺激性。本发明涉及此类NO供体型Omidenepag衍生物，含有目标化合物的药用组合以及它们的医药用途，特别是在预防和治疗高眼压和青光眼相关疾病中，具有良好的应用前景。

Description

一种一氧化氮供体型Omidenepag衍生物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种化合物，特别涉及一种一氧化氮供体型Omidenepag衍生物及其制备方法和应用。
背景技术
青光眼是一种神经退行性疾病，随着疾病的发展，青光眼患者会出现视网膜神经节细胞(RGCs)凋亡、视网膜神经纤维层变薄、视盘凹陷增大的特征，最终引起视力损伤和不可逆性失明(Clin.Exp.Ophthalmol.,2012,40(4):341-349)。病理性的眼内压(IOP)升高是最主要的致病危险因素，目前对于青光眼的治疗主要是通过降眼压药物或激光、手术降压来控制及延缓病情发展(JAMA,J.Am.Med.Assoc.,2014,311(18):1901-1911)。青光眼的患病人群主要是中老年人，但是研究表明，青光眼已经出现了年轻化趋势(Drugs Aging,2005,22(1):1-21)。因此，逐年增加的患者数量和年轻化趋势，足以引起人们对该疾病的重视。
前列腺素E2受体亚型EP2是G蛋白偶联受体，已经证实其在眼组织中广泛表达。其可以通过常规流出途径，即经小梁网(TM)和施勒姆氏管(SC)汇入巩膜表面的睫状前静脉出眼和葡萄膜巩膜途径，即经睫状肌束间隙进入睫状体和脉络膜上腔，通过巩膜胶原或神经血管间隙出眼，进而降低IOP，而不会产生严重的副作用。
Omidenepag isopropyl(OMDI)是一种具有非前列腺素结构的选择性前列腺素E2受体2(EP2)激动剂，由Ube Industries和Santen Pharmaceutical开发，作为治疗青光眼和高眼压症的眼用溶液OMDI是一种异丙酯衍生物，在角膜渗透过程中水解为其活性代谢物Omidenepag(OMD)，通过葡萄膜巩膜流出和小梁流出途径增加房水流出，从而降低IOP。2018年9月，0.002％的OMDI滴眼液在日本获批用于治疗青光眼和高眼压症，2022年9月26日，据Santen公司和UBE公司联合宣布，美国食品药品监督管理局(FDA)批准了Omlonti0.002％滴眼液，用于降低原发性开角型青光眼或高眼压症患者IOP。
游离碱的分子式：C26H28N6O4S，分子量：520.61。研究证明，在使用人重组前列腺素受体的体外研究中，OMD被证明能够选择性地结合EP2受体(Ki＝3.6nM)，并表现出对该受体的高激动活性(EC50＝1.1nM)(J Med Chem.2018，61(15):6869-6891)。OMDI在角膜穿透过程中转化为OMD的活性形式，并且OMD增加作为第二信使的cAMP的细胞内水平(AORN J.2019,109(2):256-261)。
OMDI降低患者IOP的的能力若能进一步提高，能更好的用于预防和治疗高眼压和青光眼相关疾病。
发明内容
发明目的：本发明的第一目的是提供一种提高OMDI降低患者IOP能力，从而提高降低眼内压活性和神经保护作用的一氧化氮供体型Omidenepag衍生物；本发明的第二目的为提供所述一氧化氮供体型Omidenepag衍生物的制备方法；本发明的第三目的为所述一氧化氮供体型Omidenepag衍生物的应用。
本发明所述的一氧化氮供体型Omidenepag衍生物，其结构式为：
其中，R1选自或-H；R2选自亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、亚戊基，或，异山梨醇基/>R3选自/> 或-ONO2。
优选的，所述R1为H。
优选的，所述R1为H，R2选自亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基或、亚戊基，R3选
优选的，所述化合物Ⅰ为：
LO7：4-(2-(((6-((N-(4-(1H-吡唑-1-基)苄基)吡啶-3-磺酰胺基)甲基)吡啶-2-基)甘氨基)氧基)乙氧基)-3-(苯基磺酰基)-1,2,5-恶二唑2-氧化物，结构式如下：
LO8：4-(3-(((6-((N-(4-(1H-吡唑-1-基)苄基)吡啶-3-磺酰胺基)甲基)吡啶-2-基)甘氨基)氧基)丙氧基)-3-(苯基磺酰基)-1,2,5-恶二唑2-氧化物，结构式如下：
LO9：4-(4-(((6-(N-(4-(1H-吡唑-1-基)苄基)吡啶-3-磺酰胺基)甲基)吡啶-2-基)甘氨基)氧基)丁氧基)-3-(苯基磺酰基)-1,2,5-恶二唑2-氧化物，结构式如下：
LO10：4-(3-(((6-(N-(4-(1H-吡唑-1-基)苄基)吡啶-3-磺酰胺基)甲基)吡啶-2-基)甘氨基)氧基)丙氧基)-3-甲基-1,2,5-恶二唑2-氧化物，结构式如下：
LO11：4-(4-(((6-(N-(4-(1H-吡唑-1-基)苄基)吡啶-3-磺酰胺基)甲基)吡啶-2-基)甘氨基)氧基)丁氧基)-3-甲基-1,2,5-恶二唑2-氧化物，结构式如下：
LO12：4-((5-(((6-(N-(4-(1H-吡唑-1-基)苄基)吡啶-3-磺酰胺基)甲基)吡啶-2-基)甘氨基)氧基)戊基)氧)-3-甲基-1,2,5-恶二唑2-氧化物，结构式如下：
LO13：4-(3-(((6-(N-(4-(1H-吡唑-1-基)苄基)吡啶-3-磺酰胺基)甲基)吡啶-2-基)甘氨基)氧基)丙氧基)-3-苯基-1,2,5-恶二唑2-氧化物，结构式如下：
LO14：2-(硝基)乙酯(6-((N4-(1H-吡唑-1-基)苯基)吡啶-3-磺胺基)甲基)吡啶-2-基)甘氨酸，结构式如下：
LO15：3-(硝基)丙酯(6-((N4-(1H-吡唑-1-基)苯基)吡啶-3-磺胺基)甲基)吡啶-2-基)甘氨酸，结构式如下：
LO16：(3-呋喃-3-基-3-芳基-6R-吡啶-3-磺酰胺-6As)-6-(硝氧基)六氢呋喃[3je2-]呋喃-3-基(6-((N4-(1H-吡唑-1-基)苯基)吡啶-3-磺酰胺基)吡啶-2-基)吡啶-2-基)甘氨酸，结构式如下：
LO17：(E)-10-(6-((N-(4-(1H-吡唑-1-基)苄基)吡啶-3-磺酰胺基)甲基)吡啶-2-基)-13-(9H-芴-9-基)-2-甲基-8,11-二氧代-5,7,12-三氧杂-2,3,4,10-四氮杂十三碳-3-烯-3-氧化物，结构式如下：
LO18：(E)-4-(6-((N-(4-(1H-吡唑-1-基)苄基)吡啶-3-磺酰胺基)甲基)吡啶-2-基)-12-乙基-1-(9H-芴-9-基)-3,6-二氧代-2,7,9-三氧杂-4,10,11,12-四氮杂十四碳-10-烯11-氧化物，结构式如下：
LO19：(E)-2-(((N-(6-(N-(4-(1H-吡唑-1-基)苄基)吡啶-3-磺酰胺基)甲基)吡啶-2-基)-N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)甘氨基)氧基)甲酰基)-1-吗啉二氮烯-1-氧化物，结构式如下：
LO20：(E)-2-(((N-(6-(N-(4-(1H-吡唑-1-基)苄基)吡啶-3-磺酰胺基)甲基)吡啶-2-基)-N-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)甘氨基)氧基)甲酰基)-1-(4-羟基哌啶-1-基)二氮烯-1-氧化物，结构式如下：
进一步优选的，所述化合物Ⅰ的结构式为：
所述一氧化氮供体型Omidenepag衍生物的制备方法，包括以下步骤：
(1)化合物ⅢOmidenepag和氯甲酸-9-芴基甲酯进行酰胺缩合反应得到中间体IV；
(2)中间体Ⅳ与化合物R3-R2-OH进行酯缩合或与化合物R3-R2-Cl进行亲核取代得到化合物II；
(3)化合物Ⅱ脱除9-芴基甲氧基羰基保护基得到目标化合物Ⅰ；
合成路线如下：
其中，R1选自或-H；R2选自亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、亚戊基，或，异山梨醇基/>R3选自/> 或-ONO2；当R1为/>时，不进行步骤(3)。
优选的，步骤(1)中，所述反应温度为-20～25℃，反应溶剂为无水二氯甲烷，氯仿，乙酸乙酯，重蒸丙酮，无水四氢呋喃，无水N,N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜或二氧六环中的一种或多种。所述步骤(1)反应在碱性条件下进行，碱选自碳酸钾，碳酸钠，碳酸氢钠，氢氧化钠，氢氧化钾，吡啶，4-甲氨基吡啶，三乙胺，N,N-二异丙基甲胺，N-甲基吗啉，哌啶
优选的，步骤(2)中，反应温度为-20～25℃，溶剂选自无水乙腈，无水二氯甲烷，氯仿，乙酸乙酯，重蒸丙酮，无水四氢呋喃，无水N,N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜或二氧六环中的一种或多种。
优选的，步骤(3)中，所述反应温度为-20～25℃，溶剂选自无水哌啶，无水乙腈，无水二氯甲烷，氯仿，乙酸乙酯，重蒸丙酮，无水四氢呋喃，无水N,N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜或二氧六环中的一种或多种。
化合物Ⅲ的合成步骤如下：
所述一氧化氮供体型Omidenepag衍生物在制备预防和/或治疗与眼压升高有关疾病的药物中的应用。
所述与眼压升高有关的疾病为高眼压症、青光眼和糖尿病并发性眼症。
发明机理：本发明的一氧化氮供体型Omidenepag衍生物，能够产生活性物质Omidenepag(OMD)，此外还能释放NO。OMD能够选择性地结合EP2受体。NO具有治疗青光眼的活性，一方面它可以舒张TM进而促进房水从传统途径流出，还可以抑制Na+,K+-ATP酶，减少房水生成，最终降低IOP；另一方面，对于眼部血管和血液系统而言，NO可以调节眼部血管张力，进而维持眼部血流。将OMD和NO供体结合，产生双重降低IOP和保护视网膜神经节细胞的作用，进一步提高了OMD在预防和治疗高眼压和青光眼相关疾病中的效果。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：本发明设计、合成了NO供体型Omidenepag衍生物，证明可以激动EP2受体并释放适量NO，产生双重降低IOP和保护视网膜神经节细胞的作用，且对新西兰白兔眼结膜无刺激性；含有目标化合物的药用组合以及它们的医药用途，特别是在预防和治疗高眼压和青光眼相关疾病中，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为化合物在体外家兔房水内的NO释放图；
图2为化合物代谢出Omidenepag的HPLC检测图；
图3为化合物在室温下的稳定性检测图；
图4为化合物对EP 2受体的激动活性图；
图5为化合物在正常眼压家兔的降眼压活性图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明。
实施例1
本发明所述的neokotalanol衍生物LO7的合成包括以下步骤：
(1)中间体Ⅲ的合成
中间体LO1-2的合成步骤是：将化合物LO1-1(2g，9.62mmol，1.0equiv)溶于无水DMF中，置于-20℃下预冷15分钟后加入氢化钠(461mg，9.62mmol，1.2equiv)，继续搅拌15分钟，加溴乙酸叔丁酯(2.25g，9.62mmol，1.2equiv)后移至室温，氮气保护，搅拌2小时。TLC监测反应(PE:EA＝10：1)，原料反应完全后，加水和乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析纯化(PE:EA＝10：1)，得到LO1-2约1.41g，无色油状物。
中间体LO1-3的合成步骤是：将化合物LO1-2(1.41g，4.37mmol，1.0equiv)溶于无水乙腈中，加入N-溴代丁二酰亚胺(818mg，4.59mmol，1.05equiv)，氮气保护，于40℃下搅拌3小时。TLC监测反应(PE:EA＝20：1)，原料反应完全后，加水和乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析纯化(PE:EA＝50：1)，得到LO1-3约1.21g，白色固体粉末。
中间体LO1的合成步骤是：将化合物LO1-3(1.21g，3.03mmol，1.0equiv)溶于无水1,2-二氯乙烷中，加入N-溴代丁二酰亚胺(565mg，3.18mmol，1.05equiv)和偶氮二异丁腈(50mg，0.3mmol，0.1equiv)，氮气保护，于90℃下反应2小时。TLC监测反应(PE:EA＝20：1)，原料反应完全后，加水和乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析纯化(PE:EA＝50：1)，拿到LO1约1.03g，白色固体粉末。
中间体LO2-2的合成步骤是：将化合物LO2-1(5g，29.58mmol，1.0equiv)溶于无水四氢呋喃中，滴液漏斗中加入四氢铝锂(1M solution in THF)(35.5mmol，1.2equiv)，置换氮气，于0℃预冷15分钟后逐滴加入四氢铝锂，移至室温搅拌3小时，TLC监测反应(PE:EA＝1：2)，原料反应完全后，于0℃下加入15％氢氧化钠水溶液，加水和二氯甲烷萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，此时为白色固体粉末。用二氯甲烷/正己烷打浆，除去杂质，得到LO2-2约2.36g，白色固体粉末。
中间体LO2的合成步骤是：将化合物LO2-2(2.36g，13.64mmol，1.0equiv)溶于无水二氯甲烷中，加入三乙胺(2.76g，27.28mmol，2.0equiv)，于0℃下加入3-吡啶磺酰氯(2.41g，13.64mmol，1.0equiv)搅拌30分钟后移至室温反应过夜，氮气保护。TLC监测反应(PE:EA＝1：2)，原料反应完全后，旋干溶剂，柱层析纯化(PE:EA＝1：2)，得到LO2约1.98g，白色固体粉末。
中间体LO3的合成步骤是：将化合物LO2(1.98g，6.31mmol，1.0equiv)溶于无水DMF中，加入LO1(3.01g，6.31mmol，1.0equiv)和无水碳酸钾(870.2mg，6.31mmol，1.0equiv)，室温搅拌3.5小时。TLC监测反应(PE:EA＝3：1)，原料反应完全后，在反应液中加入大量水，用乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析纯化(PE:EA＝5：1)，得到LO3约2.86g，淡黄色固体粉末。
中间体LO4的合成步骤是：将化合物LO3(2.86g，4.02mmol，1.0equiv)溶于乙醇中，加入钯碳(286mg，0.42mmol，0.1equiv)和三乙胺(812mg，8.04mmol，2.0equiv)，置换氮气后再置换氢气，室温反应4小时。TLC监测反应(PE:EA＝1：1)，原料反应完全后，硅藻土过滤，浓缩，柱层析纯化(PE:EA＝1：1)，得到LO4约2g，淡黄色泡沫状固体。
中间体III的合成步骤是：将化合物LO4(1.98g，0.39mmol，1.0equiv)溶于无水二氯甲烷中，加入氯化氢/1，4-二氧六环溶液(4M)，于室温反应14小时，TLC监测反应(PE:EA＝1：1)，原料反应完全后，旋干溶剂，加入大量二氯甲烷，此时有白色固体粉末析出，超声，过滤不溶物，滤饼用二氯甲烷洗涤多次，60℃下红外烘干，得到LO5约1.48g。
(2)中间体IV的合成
将化合物III(200mg，0.39mmol，1.0equiv)溶于10mL无水二氯甲烷中，将反应瓶置于0℃，缓慢滴加N-甲基吗啉(129μL，1.95mmol，3.0equiv)，并在此温度下剧烈搅拌10分钟，待化合物完全溶解后，分批少量加入氯甲酸-9-芴基甲酯(102mg，0.39mmol，3.0equiv)，此时溶液由淡黄色变成深绿色，氮气保护，移至室温搅拌2小时。TLC监测反应(DCM/MeOH＝25：1)，原料反应完全后，旋蒸除去二氯甲烷，柱层析纯化(DCM/MeOH＝25：1)，浓缩得到中间体IV。
(3)中间体II的合成
将中间体IV(100mg，0.143mmol，1.0equiv)溶于20mL无水二氯甲烷中，将反应瓶置于0℃，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(33mg，0.172mmol，1.2equiv)和1-羟基苯并三唑(24mg，0.172mmol，1.2equiv)，在此温度下搅拌1小时后，加入2-[[5-氧基-4-(苯基磺酰基)-1,2,5-恶二唑-3-基]氧基]乙醇(50mg，0.172mmol，1.2equiv)，氮气保护，室温搅拌过夜。TLC监测反应(DCM/MeOH＝25：1)，原料反应完全后，旋蒸除去二氯甲烷，柱层析纯化(DCM/MeOH＝25：1)，浓缩得到中间体II。
(4)LO7的合成
将中间体II(50mg，0.052mmol，1.0equiv)溶于1mL二氯甲烷中，加入0.5mL哌啶，氮气保护，置于室温反应2小时。TLC监测反应(DCM/MeOH＝25：1)，原料反应完全后，旋蒸除去二氯甲烷，柱层析纯化(DCM/MeOH＝25：1)，浓缩得到淡黄色固体35mg(87％)。
LO7的1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.01(s,1H),8.74(d,J＝8.6Hz,1H),8.08(m,2H),7.97(d,J＝12.6Hz,,1H),7.93(d,J＝4.6Hz,1H),7.76(m,2H),7.62(m,4H),7.38(m,4H),6.49(m,2H),6.33(d,J＝11.8Hz,1H),4.67(m,6H),4.36(s,2H),4.02(d,J＝7.6Hz,2H).13CNMR(75MHz,CDCl3)δ170.99,158.60,152.73,148.08,141.22,139.82,137.81,135.77,134.71,133.71,129.92,129.73,128.63,126.79,123.41,119.23,112.90,107.79,107.68,68.75,61.61,51.23,51.11,43.34.MS(ESI)m/z:747[M+H]+.HRMS(ESI)m/z calcd forC33H30N8O9S2,747.16554；found,747.16335[M+H]+.
实施例2
本发明所述的neokotalanol衍生物LO8的合成包括以下步骤：
(1)中间体IV的合成同实施例1
(2)中间体II的合成
将中间体IV(100mg，0.143mmol，1.0equiv)溶于20mL无水二氯甲烷中，将反应瓶置于0℃，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(33mg，0.172mmol，1.2equiv)和1-羟基苯并三唑(24mg，0.172mmol，1.2equiv)，在此温度下搅拌1小时后，加入3-[[5-氧化-4-(苯磺酰基)-1,2,5-恶二唑-3-基]氧基]-1-丙醇(52mg，0.172mmol，1.2equiv)，氮气保护，室温搅拌过夜。TLC监测反应(DCM/MeOH＝25：1)，原料反应完全后，旋蒸除去二氯甲烷，柱层析纯化(DCM/MeOH＝25：1)，浓缩得到中间体II。
(3)LO8的合成
将中间体II(50mg，0.052mmol，1.0equiv)溶于1mL二氯甲烷中，加入0.5mL哌啶，氮气保护，置于室温反应2小时。TLC监测反应(DCM/MeOH＝25：1)，原料反应完全后，旋蒸除去二氯甲烷，柱层析纯化(DCM/MeOH＝25：1)，浓缩得到淡黄色固体32mg(85％)。
LO8的1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.01(d,J＝1.5Hz,1H),8.73(dd,J＝4.2,1.2Hz,1H),8.07(m,2H),7.96(m,2H),7.74(m,2H),7.64(m,4H),7.38(m,5H),6.48(m,2H),6.33(d,J＝6.4Hz,1H),4.64(s,2H),4.50(t,2H),4.39(t,2H),4.34(m,2H),3.97(d,J＝6.1Hz,2H),2.25(m,2H).13C NMR(75MHz,CDCl3)δ171.12,158.80,157.14,153.31,152.66,148.09,141.22,139.82,137.84,137.82,137.37,135.73,134.70,133.73,129.91,129.73,128.57,126.78,123.33,119.22,107.79,107.55,68.01,61.26,51.19,51.05,43.42,27.92.MS(ESI)m/z:761[M+H]+.HRMS(ESI)m/z calcd for C34H32N8O9S2,761.18119；found,761.17992[M+H]+.
实施例3
本发明所述的neokotalanol衍生物LO9的合成包括以下步骤：
(1)中间体IV的合成同实施例1
(2)中间体II的合成
将中间体IV(100mg，0.143mmol，1.0equiv)溶于20mL无水二氯甲烷中，将反应瓶置于0℃，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(33mg，0.172mmol，1.2equiv)和1-羟基苯并三唑(24mg，0.172mmol，1.2equiv)，在此温度下搅拌1小时后，加入4-[[5-氧化-4-(苯磺酰基)-1,2,5-恶二唑-3-基]氧基]-1-丁醇(54mg，0.172mmol，1.2equiv)，氮气保护，室温搅拌过夜。TLC监测反应(DCM/MeOH＝25：1)，原料反应完全后，旋蒸除去二氯甲烷，柱层析纯化(DCM/MeOH＝25：1)，浓缩得到中间体II。
(3)LO9的合成
将中间体II(50mg，0.052mmol，1.0equiv)溶于1mL二氯甲烷中，加入0.5mL哌啶，氮气保护，置于室温反应2小时。TLC监测反应(DCM/MeOH＝25：1)，原料反应完全后，旋蒸除去二氯甲烷，柱层析纯化(DCM/MeOH＝25：1)，浓缩得到淡黄色固体33mg(81％)。
LO9的1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.01(d,J＝1.6Hz,1H),8.74(d,J＝4.2Hz,1H),8.08(m,2H),7.98(m,2H),7.78,(m,2H),7.67(m,4H),7.41(m,5H),6.49(m,2H),6.33(d,J＝6.6Hz,1H),4.65(s,2H),4.46(t,2H),4.34(s,2H),4.29(t,2H),3.95(d,J＝6.2Hz,2H),1.86-1.99(m,4H).13C NMR(75MHz,CDCl3)δ170.90,158.91,152.74,148.07,141.23,139.84,137.90,135.70,134.73,133.65,129.98,129.71 128.56,126.79,123.41,119.23,112.81,110.50,107.80,107.57,70.86,64.50,53.47,51.25,43.47,34.99,25.13,25.01.MS(ESI)m/z:775[M+H]+.HRMS(ESI)m/z calcd for C35H34N8O9S2,775.19684；found,775.19595[M+H]+.
实施例4
本发明所述的neokotalanol衍生物LO10的合成包括以下步骤：
(1)中间体IV的合成同实施例1
(2)中间体II的合成
将中间体IV(100mg，0.143mmol，1.0equiv)溶于20mL无水二氯甲烷中，将反应瓶置于0℃，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(33mg，0.172mmol，1.2equiv)和1-羟基苯并三唑(24mg，0.172mmol，1.2equiv)，在此温度下搅拌1小时后，加入4-(3-羟丙氧基)-3-甲基-1,2,5-恶二唑2-氧化物(30mg，0.172mmol，1.2equiv)，氮气保护，室温搅拌过夜。TLC监测反应(DCM/MeOH＝25：1)，原料反应完全后，旋蒸除去二氯甲烷，柱层析纯化(DCM/MeOH＝25：1)，浓缩得到中间体II。
(3)LO10的合成
将中间体II(50mg，0.052mmol，1.0equiv)溶于1mL二氯甲烷中，加入0.5mL哌啶，氮气保护，置于室温反应2小时。TLC监测反应(DCM/MeOH＝25：1)，原料反应完全后，旋蒸除去二氯甲烷，柱层析纯化(DCM/MeOH＝25：1)，浓缩得到淡黄色固体25mg(61％)。
LO10的1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.98(dd,J＝4.2,1.4Hz,1H),8.71(m,1H),7.94(m,2H),7.74(m,1H),7.66(m,2H),7.37(m,6H),6.47(m,2H),6.31(dd,J＝6.4,1.6Hz,1H),4.63(d,J＝9.6Hz,2H),4.54(t,2H),4.42(t,2H),4.33(m,2H),3.78(s,3H),2.20(m,2H).13C NMR(75MHz,CDCl3)δ171.10,153.29,152.63,148.08,141.23,139.84,137.86,137.41,134.72,133.71,129.92,129.89,126.78,123.34,119.27,119.23 112.88,107.81,107.55,66.48,61.12,52.27,51.06,43.41,30.14,27.99,6.78.MS(ESI)m/z:635[M+H]+.HRMS(ESI)m/zcalcd for C29H30N8O7S,635.20364；found,635.20167[M+H]+.
实施例5
本发明所述的neokotalanol衍生物LO11的合成包括以下步骤：
(1)中间体IV的合成同实施例1
(2)中间体II的合成
将中间体IV(100mg，0.143mmol，1.0equiv)溶于20mL无水二氯甲烷中，将反应瓶置于0℃，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(33mg，0.172mmol，1.2equiv)和1-羟基苯并三唑(24mg，0.172mmol，1.2equiv)，在此温度下搅拌1小时后，加入4-(4-羟基丁氧基)-3-甲基-1,2,5-恶二唑2-氧化物(33mg，0.172mmol，1.2equiv)，氮气保护，室温搅拌过夜。TLC监测反应(DCM/MeOH＝25：1)，原料反应完全后，旋蒸除去二氯甲烷，柱层析纯化(DCM/MeOH＝25：1)，浓缩得到中间体II。
(3)LO11的合成
将中间体II(50mg，0.052mmol，1.0equiv)溶于1mL二氯甲烷中，加入0.5mL哌啶，氮气保护，置于室温反应2小时。TLC监测反应(DCM/MeOH＝25：1)，原料反应完全后，旋蒸除去二氯甲烷，柱层析纯化(DCM/MeOH＝25：1)，浓缩得到白色固体27mg(73％)。
LO11的1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.01(m,1H),8.74(d,J＝4.5Hz,1H),7.98(m,2H),7.74(m,1H),7.64(m,2H),7.38(m,4H),6.49(m,2H),6.33(m,1H),4.64(m,2H),4.39(m,2H),4.24(m,2H),3.94(m,2H),3.77(s,2H),2.10(s,3H)1.87(m,2H),1.65(m,2H).13C NMR(75MHz,CDCl3)δ171.11,163.37,157.13,153.26,152.65,148.08,141.23,141.21,139.84,137.84,137.37,134.69,133.82,133.73,130.02,129.92,126.77,123.33,123.29,119.25,112.81,107.81,69.57,64.52,53.48,52.25,43.42,28.74,25.25,6.79.MS(ESI)m/z:649[M+H]+.HRMS(ESI)m/z calcd for C30H32N8O7S,649.21929；found,649.21661[M+H]+.
实施例6
本发明所述的neokotalanol衍生物LO12的合成包括以下步骤：
/>
(1)中间体IV的合成同实施例1
(2)中间体II的合成
将中间体IV(100mg，0.143mmol，1.0equiv)溶于20mL无水二氯甲烷中，将反应瓶置于0℃，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(33mg，0.172mmol，1.2equiv)和1-羟基苯并三唑(24mg，0.172mmol，1.2equiv)，在此温度下搅拌1小时后，加入4-(4-羟基丁氧基)-3-甲基-1,2,5-恶二唑2-氧化物(35mg，0.172mmol，1.2equiv)，氮气保护，室温搅拌过夜。TLC监测反应(DCM/MeOH＝25：1)，原料反应完全后，旋蒸除去二氯甲烷，柱层析纯化(DCM/MeOH＝25：1)，浓缩得到中间体II。
(3)LO12的合成
将中间体II(50mg，0.052mmol，1.0equiv)溶于1mL二氯甲烷中，加入0.5mL哌啶，氮气保护，置于室温反应2小时。TLC监测反应(DCM/MeOH＝25：1)，原料反应完全后，旋蒸除去二氯甲烷，柱层析纯化(DCM/MeOH＝25：1)，浓缩得到灰色固体21mg(68％)。
LO12的1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.01(d,J＝1.3Hz,1H),8.74(d,J＝4.2Hz,1H),7.98(m,2H),7.73(d,J＝1.2Hz,,1H),7.64(d,J＝7.8Hz,2H),7.38(m,4H),6.49(m,2H),6.33(d,J＝6.9Hz,1H),4.65(s,2H),4.39(m,4H),4.20(t,2H),3.92(d,J＝4.6Hz,2H),3.77(s,2H),2.10(s,3H),1.45-1.89(m,6H).13C NMR(75MHz,CDCl3)δ163.44,152.70,148.09,141.24,139.86,134.71,129.98,126.77,123.36,119.23,112.81,107.81,107.52,69.92,64.97,62.56,53.47,43.46,29.71,28.45,6.82.MS(ESI)m/z:663[M+H]+.HRMS(ESI)m/zcalcd for C31H34N8O7S,663.23494；found,663.23184[M+H]+.
实施例7
本发明所述的neokotalanol衍生物LO13的合成包括以下步骤：
(1)中间体IV的合成同实施例1
(2)中间体II的合成
将中间体IV(100mg，0.143mmol，1.0equiv)溶于20mL无水二氯甲烷中，将反应瓶置于0℃，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(33mg，0.172mmol，1.2equiv)和1-羟基苯并三唑(24mg，0.172mmol，1.2equiv)，在此温度下搅拌1小时后，加入4-(3-羟丙氧基)-3-苯基-1,2,5-恶二唑2-氧化物(41mg，0.172mmol，1.2equiv)，氮气保护，室温搅拌过夜。TLC监测反应(DCM/MeOH＝25：1)，原料反应完全后，旋蒸除去二氯甲烷，柱层析纯化(DCM/MeOH＝25：1)，浓缩得到中间体II。
(3)LO13的合成
将中间体II(50mg，0.052mmol，1.0equiv)溶于1mL二氯甲烷中，加入0.5mL哌啶，氮气保护，置于室温反应2小时。TLC监测反应(DCM/MeOH＝25：1)，原料反应完全后，旋蒸除去二氯甲烷，柱层析纯化(DCM/MeOH＝25：1)，浓缩得到淡黄色固体28mg(77％)。
LO13的1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.99(d,J＝2.2Hz,1H),8.72(m,1H),8.08(m,2H),7.93(m,2H),7.74(d,J＝4.6Hz,1H),7.63(m,2H),7.48(m,3H),7.34(m,5H),6.48(m,2H),6.33(d,J＝11.8Hz,1H),4.61(s,2H),4.55(t,2H),4.38(t,2H),3.93(d,J＝8.3Hz,2H),2.28(m,2H).13C NMR(75MHz,CDCl3)δ170.78,162.10,152.70,148.07,141.22,139.82,134.70,133.62,130.57,129.91,128.93,126.77,126.09,123.37,122.30,119.21,112.88,107.79,107.53,67.24,61.35,53.53,51.19,28.05.MS(ESI)m/z:697[M+H]+.HRMS(ESI)m/zcalcd for C34H32N8O7S,697.21929；found,697.21712[M+H]+.
实施例8
本发明所述的neokotalanol衍生物LO14的合成包括以下步骤：
(1)中间体IV的合成同实施例1
(2)中间体II的合成
将中间体IV(100mg，0.143mmol，1.0equiv)溶于20mL无水二氯甲烷中，将反应瓶置于0℃，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(33mg，0.172mmol，1.2equiv)和1-羟基苯并三唑(24mg，0.172mmol，1.2equiv)，在此温度下搅拌1小时后，加入硝酸2-羟乙基酯(19mg，0.172mmol，1.2equiv)，氮气保护，室温搅拌过夜。TLC监测反应(DCM/MeOH＝25：1)，原料反应完全后，旋蒸除去二氯甲烷，柱层析纯化(DCM/MeOH＝25：1)，浓缩得到中间体II。
(3)LO14的合成
将中间体II(50mg，0.052mmol，1.0equiv)溶于1mL二氯甲烷中，加入0.5mL哌啶，氮气保护，置于室温反应2小时。TLC监测反应(DCM/MeOH＝25：1)，原料反应完全后，旋蒸除去二氯甲烷，柱层析纯化(DCM/MeOH＝25：1)，浓缩得到淡黄色固体28mg(77％)。
LO14的1H NMR(300MHz,CDCl3)δ9.00(s,1H),8.73(d,J＝4.6Hz,1H),7.93(m,2H),7.74(d,J＝1.5Hz,1H),7.62(d,H＝8.9Hz,2H),7.33(m,4H),6.46(m,2H),6.32(d,J＝6.4Hz,1H),4.63(m,2H),4.48(t,J＝2.8Hz,2H),4.33(s,2H),4.27(t,2H),3.94(m,2H),2.04(m,2H).13C NMR(75MHz,CDCl3)δ170.97,157.06,153.26,152.66,148.08,141.23,139.83,137.89,137.34,134.69,133.72,129.90,126.79,123.34,119.23,112.86,107.80,107.59,70.34,61.23,51.11,53.49,43.38,26.32.MS(ESI)m/z:568[M+H]+.HRMS(ESI)m/zcalcd for C26H27N7O7S,568.16144；found,568.15933[M+H]+.
实施例9
本发明所述的neokotalanol衍生物LO15的合成包括以下步骤：
/>
(1)中间体IV的合成同实施例1
(2)中间体II的合成
将中间体IV(100mg，0.143mmol，1.0equiv)溶于20mL无水二氯甲烷中，将反应瓶置于0℃，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(33mg，0.172mmol，1.2equiv)和1-羟基苯并三唑(24mg，0.172mmol，1.2equiv)，在此温度下搅拌1小时后，加入硝酸3-羟丙酯(21mg，0.172mmol，1.2equiv)，氮气保护，室温搅拌过夜。TLC监测反应(DCM/MeOH＝25：1)，原料反应完全后，旋蒸除去二氯甲烷，柱层析纯化(DCM/MeOH＝25：1)，浓缩得到中间体II。
(3)LO15的合成
将中间体II(50mg，0.052mmol，1.0equiv)溶于1mL二氯甲烷中，加入0.5mL哌啶，氮气保护，置于室温反应2小时。TLC监测反应(DCM/MeOH＝25：1)，原料反应完全后，旋蒸除去二氯甲烷，柱层析纯化(DCM/MeOH＝25：1)，浓缩得到淡黄色固体23mg(77％)。
LO15的1H NMR(300MHz,CDCl3)δ9.00(s,1H),8.73(d,J＝4.6Hz,1H),7.93(m,2H),7.74(d,J＝1.5Hz,1H),7.62(d,H＝8.9Hz,2H),7.33(m,4H),6.46(m,2H),6.32(d,J＝6.4Hz,1H),4.63(m,2H),4.48(t,J＝2.8Hz,2H),4.33(s,2H),4.27(t,2H),3.94(m,2H),2.04(m,2H).13C NMR(75MHz,CDCl3)δ170.97,157.06,153.26,152.66,148.08,141.23,139.83,137.89,137.34,134.69,133.72,129.90,126.79,123.34,119.23,112.86,107.80,107.59,70.34,61.23,51.11,53.49,43.38,26.32.MS(ESI)m/z:582[M+H]+.HRMS(ESI)m/zcalcd for C26H27N7O7S,582.17709；found,582.17450[M+H]+.
实施例10
本发明所述的neokotalanol衍生物LO16的合成包括以下步骤：
(1)中间体IV的合成同实施例1
(2)中间体II的合成
将中间体IV(100mg，0.143mmol，1.0equiv)溶于20mL无水二氯甲烷中，将反应瓶置于0℃，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(33mg，0.172mmol，1.2equiv)和1-羟基苯并三唑(24mg，0.172mmol，1.2equiv)，在此温度下搅拌1小时后，加入硝酸3-羟丙酯(21mg，0.172mmol，1.2equiv)，氮气保护，室温搅拌过夜。TLC监测反应(DCM/MeOH＝25：1)，原料反应完全后，旋蒸除去二氯甲烷，柱层析纯化(DCM/MeOH＝25：1)，浓缩得到中间体II。
(3)LO16的合成
将中间体II(50mg，0.052mmol，1.0equiv)溶于1mL二氯甲烷中，加入0.5mL哌啶，氮气保护，置于室温反应2小时。TLC监测反应(DCM/MeOH＝25：1)，原料反应完全后，旋蒸除去二氯甲烷，柱层析纯化(DCM/MeOH＝25：1)，浓缩得到淡黄色固体18mg(52％)。
LO16的1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.01(m,1H),8.74(m,1H),7.98(m,2H),7.93(d,J＝4.6Hz,1H),7.74(m,1H),7.67(m,2H),7.33(m,3H),6.49(m,2H),6.33(d,J＝12.2Hz,1H),5.29(m,1H),4.61(s,2H),4.48(d,J＝7.8Hz,1H),4.33(s,2H),3.86-4.04(m,8H).13C NMR(75MHz,CDCl3)δ174.46,152.75,148.15,141.24,139.94,134.71,133.59,129.87,126.80,123.32,119.25,113.01,107.81,86.43,81.62,81.20,78.05,73.38,69.34,53.47,51.10,43.43.MS(ESI)m/z:652[M+H]+.HRMS(ESI)m/z calcd for C29H29N7O9S,652.18257；found,652.18130[M+H]+
实施例11
本发明所述的neokotalanol衍生物LO17的合成包括以下步骤：
(1)中间体IV的合成同实施例1
(2)LO17的合成
将中间体IV(100mg，0.143mmol，1.0equiv)溶于20mL无水乙腈中，加入碳酸钾(99mg，0.715mmol，5.0equiv)，置于室温搅拌1小时。加入(E)-1-(氯甲氧基)-3,3-二甲基三氮-1-烯2-氧化物(27mg，0.172mmol，1.2equiv)，氮气保护，室温反应过夜。TLC监测反应(DCM/MeOH＝25：1)，原料反应完全后，旋蒸除去二氯甲烷，柱层析纯化(DCM/MeOH＝25：1)，浓缩得到淡黄色固体22mg(56％)。
LO17的1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.00(s,1H),8.71(s,1H),7.92(m,2H),7.81(m,2H),7.73(d,J＝2.2Hz,1H),7.59(m,4H),7.44(m,3H),7.35(m,3H),7.27(m,4H),6.88(m,1H),6.49(m,1H),5.76(s,2H),4.66(d,J＝4.2Hz,1H),4.51(d,J＝3.6Hz,2H),4.38(s,2H),4.29(m,2H),2.904.38(s,6H).13C NMR(75MHz,CDCl3)δ168.19,154.20,153.35,152.15,147.86,143.53,141.39,141.23,139.82,138.23,134.61,133.34,129.84,127.89,127.25,126.81,124.75,120.09,119.20,118.68,107.80,87.62,68.12,51.69,51.54,46.96,42.11.MS(ESI)m/z:840[M+Na]+.HRMS(ESI)m/z calcd for C41H39N9O8S,840.25400；found,840.25303[M+Na]+.
实施例12
本发明所述的neokotalanol衍生物LO18的合成包括以下步骤：
(1)中间体IV的合成同实施例1
(2)LO18的合成
将中间体IV(100mg，0.143mmol，1.0equiv)溶于20mL无水乙腈中，加入碳酸钾(99mg，0.715mmol，5.0equiv)，置于室温搅拌1小时。加入(E)-1-(氯甲氧基)-3,3-二乙基三氮-1-烯2-氧化物(32mg，0.172mmol，1.2equiv)，氮气保护，室温反应过夜。TLC监测反应(DCM/MeOH＝25：1)，原料反应完全后，旋蒸除去二氯甲烷，柱层析纯化(DCM/MeOH＝25：1)，浓缩得到白色固体27mg(54％)。
LO18的1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.00(s,1H),8.72(m,1H),8.08(m,2H),7.93(m,2H),7.79(d,J＝6.6Hz,2H),7.72(d,J＝1.8Hz,1H),7.57(t,4H),7.24-7.46(m,7H),6.93(m,1H),6.48(t,1H),5.77(s,2H),4.68(d,J＝7.8Hz,2H),4.47(d,J＝12.8Hz,4H),4.38(s,2H),4.29(t,1H),3.11(q,4H),0.99(t,6H).13C NMR(75MHz,CDCl3)δ168.10,154.15,153.37,152.94,152.12,147.89,143.52,141.38,141.20,139.81,138.21,134.57,133.30,129.84,127.88,127.25,126.80,124.72,123.60,120.08,119.19,118.70,116.65,107.78,87.80,68.10,51.84,51.61,47.67,46.96,31.52.MS(ESI)m/z:868[M+Na]+.HRMS(ESI)m/zcalcd for C43H43N9O8S,868.28530；found,868.28380[M+Na]+.
实施例13
本发明所述的neokotalanol衍生物LO19的合成包括以下步骤：
(1)中间体IV的合成同实施例1
(2)LO19的合成
将中间体IV(100mg，0.143mmol，1.0equiv)溶于20mL无水乙腈中，加入碳酸钾(99mg，0.715mmol，5.0equiv)，置于室温搅拌1小时。加入(Z)-2-(氯甲氧基)-1-吗啉二氮烯-1-氧化物(34mg，0.172mmol，1.2equiv)，氮气保护，室温反应过夜。TLC监测反应(DCM/MeOH＝25：1)，原料反应完全后，旋蒸除去二氯甲烷，柱层析纯化(DCM/MeOH＝25：1)，浓缩得到灰色固体26mg(51％)。
LO19的1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.98(s,1H),8.71(d,J＝1.7Hz,1H),7.93(m,2H),7.79(d,J＝7.6Hz,2H),7.72(d,J＝2.2Hz,1H),7.57(t,4H),7.44(m,3H),7.24-7.36(m,6H),6.93(m,1H),6.48(m,1H),5.75(s,2H),4.68(d,J＝7.9Hz,2H),4.52(d,J＝12.5Hz,4H),4.38(s,2H),4.29(t,1H),3.80(m,2H),3.54(m,4H),3.16(m,2H).13C NMR(75MHz,CDCl3)δ168.13,154.21,153.37,152.13,148.31,143.51,141.40,141.27,139.81,138.26,134.63,133.45,129.86,127.91,127.27,126.94,124.74,120.10,119.39,118.66,107.84,87.66,68.12,65.29,51.65,51.56,47.69,46.97.MS(ESI)m/z:882[M+Na]+.HRMS(ESI)m/zcalcd for C43H41N9O9S,882.26456；found,882.26379[M+Na]+.
实施例14
本发明所述的neokotalanol衍生物LO20的合成包括以下步骤：
(1)中间体IV的合成同实施例1
(2)LO20的合成
将中间体IV(100mg，0.143mmol，1.0equiv)溶于20mL无水乙腈中，加入碳酸钾(99mg，0.715mmol，5.0equiv)，置于室温搅拌1小时。加入(Z)-2-(氯甲氧基)-1-(4-羟基哌啶-1-基)二氮烯-1-氧化物(36mg，0.172mmol，1.2equiv)，氮气保护，室温反应过夜。TLC监测反应(DCM/MeOH＝25：1)，原料反应完全后，旋蒸除去二氯甲烷，柱层析纯化(DCM/MeOH＝25：1)，浓缩得到淡黄色固体33mg(67％)。
LO20的1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.01(s,1H),8.71(s,1H),7.93(m,2H),7.80(d,J＝7.9Hz,2H),7.72(d,J＝2.1Hz,1H),7.57(m,4H),7.44(m,3H),7.24-7.36(m,6H),6.93(m,1H),6.48(m,1H),5.76(s,2H),4.68(d,J＝7.4Hz,2H),4.52(d,J＝12.9Hz,4H),4.38(s,2H),4.29(t,1H),3.68(m,4H),3.27(t,4H).13C NMR(75MHz,CDCl3)δ168.19,154.17,153.34,152.96,152.16,147.90,143.52,141.39,141.25,139.84,138.25,134.57,133.29,129.83,127.92,127.27,126.77,124.75,120.10,119.19,118.66,107.83,87.61,68.16,65.89,51.64,51.48,51.05,46.96,29.72.MS(ESI)m/z:896[M+Na]+.HRMS(ESI)m/z calcdfor C44H43N9O9S,896.28021；found,896.27883[M+Na]+.
性能表征
1、NO供体型Omidenepag衍生物在体外房水内的NO释放情况
实验方法：用新西兰白兔(1-2kg，雌雄各半)的房水，将500μM的NaNO2溶液加到96孔板中(三复孔，每个空加80μL)，然后梯度稀释(用空白溶液稀释，每次稀释两倍)，从而得到浓度分别为500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.8125μM的NaNO2溶液，此外还需要设置空白对照组(每个浓度三个孔，每个孔40μL)。随后再加入40μL Griess试剂，用酶标仪测定540nm下的吸光度，对吸光度和浓度进行线性拟合，即得到标准曲线。将配制好的受试化合物房水溶液(200μM)和不加受试化合物的房水溶液对照组置于摇床中(37℃、120rpm)孵育2h，用移液枪取40μL，加入96孔板中(三复孔)，再加入40μL的Griess试剂，置于酶标仪中于540nm下测定吸光度，并将其代入标准曲线中，计算浓度。每个受试化合物均进行三次独立实验。实验结果如图1所示。
如图1所示，所有化合物均可在体外家兔房水中释放出NO。且不同类型的NO供体释放NO的量有所不同，其中偶氮鎓类释放NO的量最多，呋咱氮氧化物类释放NO的量适中，硝酸酯类释放NO的量最少。此外还研究了8h内化合物以时间依赖性释放NO，并且不同类型NO供体释放NO速率不同。表明化合物在体外家兔房水中可释放出NO，且不同类型NO供体能以不同速率释放不同量的NO。
2、NO供体型Omidenepag衍生物在滴眼给药后代谢出原药情况
实验方法：采用新西兰白兔(1-2kg，雌雄各半)，实验前家兔适应性饲养3天(温度25℃，湿度40％-70％)，并对其眼部进行检查，确保眼部正常。左眼滴眼给药25μL的2mM受试化合物，于给药2h后吸取家兔左眼房水100μL，暂存于液氮中。加入100μL质谱甲醇，离心后取上清，0.22μm有机滤膜过滤，通过内标法采用HPLC检测化合物浓度。实验结果如图2所示。
如图2所示，滴眼给药后发现未检测出受试化合物，表明所有受试化合物均可在滴眼给药后穿透角膜后释放出原药Omidenepag，其中化合物LO7、LO10、LO12、LO16、LO17和LO19能在滴眼给药后释放出较多的原药。
3、NO供体型Omidenepag衍生物在溶媒中的稳定性
实验方法：配制2mM受试化合物纯水母液，另取EP管，加入3600μL溶媒，再加入400μL母液，得到200μM的受试化合物溶液4000μL。置于摇床中(25℃，120rpm)中孵育7d，并于孵育后0min、15min、30min、1h、2h、4h、8h、1d、2d、3d、4d、5d、6d和7d，用移液枪取200μL，加入200μL质谱甲醇，离心后取上清，0.22μM有机滤膜过滤，采用HPLC检测，计算浓度。实验结果如图3所示。
如图3所示，所有化合物在7d后均还有80％以上剩余，且与阳性药OMDI相比，接不同类型的NO供体的化合物仍保留了较高的稳定性，即室温下化合物在溶媒中具有一定的稳定性。
4、NO供体型Omidenepag衍生物在体外具有EP2受体激动作用
实验方法：利用表达EP2受体的稳转系细胞，与不同浓度的测试化合物孵育，通过TR-FRET cAMP试剂盒测定化合物对EP2受体的激动情况。EP2稳定表达的HEK细胞系在含有10％胎牛血清及0.1mg/mL Hygromycin B的DMEM培养基中培养，培养温度为37℃，二氧化碳浓度为5％。细胞传代：除去旧培养基并用PBS洗一次，然后加入1mL TrypLETMExpress溶液，37℃孵育2分钟左右。当细胞从皿底脱离，加入约2mL37℃预热的完全培养基。将细胞悬液用吸管轻轻吹打使聚集的细胞分离。将细胞悬液转移至无菌的离心管中，1000rpm离心5分钟。为维持细胞的生理活性，实验细胞融合度控制在80％左右。按照试剂盒说明书配制1×Stimulation Buffer待用。利用DMSO将阳性化合物及待测化合物进行梯度稀释10个浓度，然后用1×Stimulation Buffer将化合物稀释至10×，振荡混匀备用。稳转系细胞培养至80％融合度，胰酶消化处理收集细胞，经计数后激动模式接种9μL/well于384-well板中。取1μL步骤2中稀释好的10×化合物加入到相应实验孔中，其中PC孔加入1μL 10×首浓度阳性化合物，VC孔加入1μL 10×DMSO buffer(1％)，离心后放置于37℃孵育30分钟。将Eu-cAMP用Detection buffer稀释至工作浓度，取5μL/well加入相应实验孔中。将ULightTM-anti-cAMP抗体用Detection buffer稀释至工作浓度，取5μL/well加入相应实验孔中；离心后室温孵育1小时。孵育完成后，利用酶标仪检测波长330nm激发下，665nm和620nm读值。％激动率公式为：
式中：表示阳性对照的平均值；/>表示阴性对照的平均值(DMSO)。实验结果如图4所示。
如图4所示，发现优选化合物在体外均对EP2受体有激动作用，其中化合物LO7、LO10和LO12对EP2受体的激动活性均优于OMDI，EC50分别为1.688nM、0.8223nM和3.69nM(表1)。在三种不同类型的NO供体的化合物中分别筛选出一个体外EP2受体激动作用效果较好的化合物，并结合家兔体外房水NO释放和滴眼给药代谢出原药的情况，最终以LO10、LO16和LO19作为优选化合物进一步在体内评价其生物活性。
表1表示优选化合物对EP2受体的激动作用
Compound ID EC50(nM) Bottom Top
PGE2 0.01412 0.64 100.20
LO7 1.688 17.86 101.70
LO10 0.8223 4.76 100.90
LO12 3.69 5.63 101.80
LO16 11.57 13.29 ＝100.0
LO17 14.65 12.45 ＝100.0
LO19 9.511 8.04 ＝100.0
OMDI 4.86 8.19 100.00
5、NO供体型Omidenepag衍生物在正常眼压家兔中的眼内压降低作用
实验方法：采用新西兰白兔(1-2kg，雌雄各半)，实验前家兔适应性饲养3天(温度25℃，湿度40％-70％)，并对其眼部进行检查，确保眼部正常。动物给药前进行正常眼压测定，用回弹式眼压计测量双眼眼压，每眼测量五次，去掉最大和最小值，取平均值作为0h眼压(对照组)。每只家兔统一选左眼进行给药，右眼不做处理。用生理盐水冲洗角膜表面和结膜囊，保持眼部湿润。首先，我们以OMDI为阳性对照，(设置浓度为0.002％，本文若不做说明，均为生理盐水配置),评估化合物LO10(呋咱氮氧化物类)、LO16(硝酸酯类)和LO19(偶氮鎓二醇盐类)的降眼压活性(与OMDI等摩尔)，给药后在1、2、3、4、5、6、7、8和24h分别测定其眼压，记录数据，实验结果如图5所示。
如图5所示，我们发现给药后，三种NO供体型Omidenepag衍生物均能降低正常家兔的眼内压。在给药后3和24小时，LO10的降眼压活性要更好，并且与LO16、LO19和OMDI相比均有显著性差异，且降眼压维持时间较长，并且在24小时无反弹现象。
本发明的通式I所示的一种一氧化氮供体型Omidenepag衍生物或其药理学上允许的盐。眼部代谢实验表明，所有化合物都能够产生活性物质Omidenepag(OMD)，且在房水中释放出NO，从而与OMD协同产生降眼压作用。体外EP2激动活性表明，三种一氧化氮供体型Omidenepag衍生物均保留了较好的EP2受体激动活性，其中化合物LO10在体外对EP2受体激动的EC50为0.8223nM，优于OMDI(4.86nM)，保留了较强的EP2受体激动作用。在体外溶媒中的稳定性实验中，三种一氧化氮供体型Omidenepag衍生物均保留较高的稳定性，其中化合物LO10在第七天还有87％的剩余，与OMDI(87％)相当，在提升药效的同时保留了原有的稳定性。在正常眼压家兔中的降眼压实验中，三种一氧化氮供体型Omidenepag衍生物均有良好的降眼压活性，且在与OMDI上市浓度等摩尔的剂量下，在给药后3和24小时化合物LO10的降眼压活性优于阳性对照OMDI，且降眼压维持时间较长，眼部刺激性较小，并且在24小时无反弹现象。因此根据本发明，能够提供作为眼科疾病方面(特别是青光眼或高眼压)的预防和治疗方面具有优异性质的新型化合物。

Claims (10)

1.一种一氧化氮供体型Omidenepag衍生物，其特征在于，其结构式为：
其中，R1选自或-H；R2选自亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、亚戊基，或，异山梨醇基/>R3选自/> 或-ONO2。
2.根据权利要求1所述的一氧化氮供体型Omidenepag衍生物，其特征在于，所述R1为H。
3.根据权利要求1所述的一氧化氮供体型Omidenepag衍生物，其特征在于，所述R1为H，R2选自亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基或、亚戊基，R3选
4.根据权利要求1所述的一氧化氮供体型Omidenepag衍生物，其特征在于，所述衍生物的结构式为：
5.一种权利要求1～4所述一氧化氮供体型Omidenepag衍生物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)化合物ⅢOmidenepag和氯甲酸-9-芴基甲酯进行酰胺缩合反应得中间体IV；
(2)中间体Ⅳ与化合物R3-R2-OH进行酯缩合或与化合物R3-R2-Cl进行亲核取代得到化合物II；
(3)化合物Ⅱ脱除9-芴基甲氧基羰基保护基得到目标化合物Ⅰ；
合成路线如下：
其中，R1选自或-H；R2选自亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、亚戊基，或，异山梨醇基/>R3选自/> 或-ONO2；当R1为/>时，不进行步骤(3)。
6.根据权利要求5所述的一氧化氮供体型Omidenepag衍生物的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述反应温度为-20～25℃，反应溶剂为无水二氯甲烷，氯仿，乙酸乙酯，重蒸丙酮，无水四氢呋喃，无水N,N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜或二氧六环中的一种或多种。
7.根据权利要求5所述的一氧化氮供体型Omidenepag衍生物的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，反应温度为-20～25℃，溶剂选自无水乙腈，无水二氯甲烷，氯仿，乙酸乙酯，重蒸丙酮，无水四氢呋喃，无水N,N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜或二氧六环中的一种或多种。
8.根据权利要求5所述的一氧化氮供体型Omidenepag衍生物的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述反应温度为-20～25℃，溶剂选自无水哌啶，无水乙腈，无水二氯甲烷，氯仿，乙酸乙酯，重蒸丙酮，无水四氢呋喃，无水N,N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜或二氧六环中的一种或多种。
9.权利要求1～4任意一项所述一氧化氮供体型Omidenepag衍生物在制备预防和/或治疗与眼压升高有关疾病的药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述与眼压升高有关的疾病为高眼压症、青光眼和糖尿病并发性眼症。
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