CN118059319A - 双面结构不对称的鱼鳔膜的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种双面结构不对称的鱼鳔膜的制备方法及应用，属于生物医学材料技术领域，包括以下步骤：将鱼鳔置于十二烷基苯磺酸钠溶液中浸泡，清洗，再将鱼鳔置于聚乙二醇辛基苯基醚溶液中浸泡，清洗，干燥，得到双面结构不对称的脱细胞鱼鳔膜。所述的双面结构不对称的鱼鳔膜力学性能优异，生物相容性好，具有极佳的屏障作用，能够有效阻止成纤维细胞的侵入，同时具有优异的降解性能和抗菌性能，其能够广泛的应用于GBR/GTR膜、组织修复膜、生物补片中，具有广泛的应用前景和市场价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学材料技术领域，具体涉及一种双面结构不对称的鱼鳔膜的制备方法及应用。
背景技术
由感染、肿瘤及各种先天性因素导致的骨缺损是临床的常见病，使骨重建成为临床医学领域的重大挑战。临床常采用牵张成骨术、骨劈开术和自体骨块移植术等修复缺损区的骨量。而随着组织工程技术的发展，引导骨再生(Guided Bone Regeneration,GBR)术逐渐成为临床上最常用的骨增量方法。GBR是利用外科手术在牙龈软组织与骨缺损之间放置引导骨再生膜，选择性地将生长速度较快的成纤维细胞和上皮细胞屏障在缺损区外，为缺损区成骨细胞增殖分化创造相对封闭的微环境，有利于新骨再生。引导性组织再生(guided tissue regeneration，GTR)是在牙周手术中利用膜材料作为屏障，阻挡牙龈上皮及结缔组织与牙根面接触，引导具有形成新附着能力的牙周膜细胞优先占领牙根面，从而在原已暴露于牙周袋内的根面上形成新的牙骨质并有牙周膜纤维埋入，形成新附着性愈合。在这过程中，起生物屏障作用的GBR/GTR膜应当具备理想的生物相容性和软组织屏障功能、生物可降解性及适当的机械性能。
目前GBR/GTR膜主要分为不可吸收膜与可吸收膜两类。不可吸收膜以膨体聚四氟乙烯膜和钛网膜为代表，其无法自行降解，需要通过二次手术取出，在对患者造成额外创伤的同时存在破坏潜在新生骨组织的风险。可吸收膜分为人工合成高分子膜和天然高分子膜两大类。人工高分子以脂肪族聚酯为代表，包括聚乳酸、聚乙醇酸、聚己内酯和聚乳酸-羟基乙酸共聚物等，但其不具备活性位点且降解产物呈酸性，可能引起炎症反应。天然高分子以胶原为代表。胶原是结缔组织的有机成分，也是体内细胞-基质通讯的重要组成部分。胶原膜保留了细胞外基质和胶原结构，具有优越的生物相容性和低免疫原性，对成纤维细胞和成骨细胞的粘附增殖也有一定促进作用。
市面上胶原膜的主要来源是牛或猪的真皮基质膜或心包膜。一方面，牛和猪作为哺乳动物，由其获取的胶原膜具有较高的免疫原性，容易产生排斥和炎症反应，有感染风险；另一方面，大型哺乳动物的养殖条件要求较高，需要投入大量资金，成本高。鱼鳔的主要成分为胶原基质，胶原含量高，是获取胶原的理想选择。同时，鱼类养殖规模小、密度大、产量高，成本相较猪/牛更加低廉。根据统计，2019年全国淡水养殖产量高达30137441吨，其中鱼类达25480260吨；海水养殖产量高达20653687吨，其中鱼类达1605802吨。因此，鱼类尤其是淡水鱼的来源丰富，具有较大的利用潜力。而目前淡水鱼的鱼鳔在市场上的利用率低，常常被丢弃，尚未得到足够的开发。因此，利用淡水鱼的鱼鳔制备胶原膜并应用于生物医学领域，可实现“变废为宝”。
胶原膜还可广泛应用于其他生物医用领域。例如，软组织替代材料可用于口腔软组织修复，其生物相容性理想、生物可降解并具有一定的机械性能。临床上主要利用移植结缔组织或异种胶原基质来实现口腔软组织的扩增或修复。其中，使用来自猪或牛的异种胶原修复膜逐渐成为自体结缔组织移植的有效替代选择。其次，人工硬脑膜是一种用于修补由颅脑疾病引起的硬脑膜或脊膜缺损的脑膜替代物，可防止脑脊液漏、预防周围组织粘连、为神经组织生长创造相对封闭的微环境。临床上应用较广的人工硬脑膜包括天然的生物胶原膜，如牛或羊的心包膜。目前已有多项研究将脱细胞胶原膜(异体真皮基质)应用于硬脑膜损伤的治疗。除此之外，生物疝修补补片主要用于修补腹膜外修补腹股沟疝、股疝等软组织缺损，改善、修复、增强腹壁组织。临床上应用成熟的生物疝修补补片是e-PTFE(膨化聚四氟乙烯)补片和PP(聚丙烯)补片，但它们的生物相容性和柔韧性较差，容易与内脏腹膜发生摩擦并出现腹膜黏连。因此，得益于优异的生物相容性，脱细胞真皮基质开始作为新兴的腹壁缺损修复材料被应用于临床实践，取得了理想的治疗效果。
尽管生物相容性优越，目前生物医学领域的胶原膜面临两大挑战。首先，胶原膜在体内的降解速率过快，难以满足组织再生需求。其次，胶原膜缺乏抗菌性能，当细菌入侵术区时无法保障组织再生区域理想的微环境。以GBR膜为例，大量临床数据表明骨再生所需时间至少为3个月，理想情况下，GBR膜的降解速度应与骨形成的速度相匹配。然而目前商用胶原膜在体内两周后即出现明显降解，无法维持作用，不能满足骨再生需求。同时，随着降解进程，胶原膜的机械性能大幅度降低，容易在骨再生过程中塌陷，导致垂直骨增量不足，修复效果不理想。与此同时，在难以彻底消毒的复杂口腔环境中进行侵入性的GBR手术，不可避免地会将细菌带入术区，同时在牙龈切口完全愈合前，特别是高张力切口在术后软组织有裂开的风险，导致组织裂隙GBR膜暴露，口腔内的细菌会源源不断地粘附并定植于GBR膜上，引起伤口感染并最终导致引导骨再生术失败。
盖氏公司的GBR胶原膜(Bio-Gide)因其独特的双层结构，已成为当前临床上使用最广泛的GBR膜之一，其软组织面紧密光滑，用于阻止非成骨细胞的迁入干扰；骨组织面粗糙多孔，以利于骨缺损区成骨细胞的粘附增殖。盖氏公司的软组织修复胶原膜(Mucograft)具有两层结构：一层为致密结构，由胶原蛋白紧密结合组成，可以在开放愈合环境下保护伤口，并可以使组织附着，为伤口愈合创造条件。第二层结构是由厚且多孔的胶原厚海绵支架组成，贴敷于组织表面。
正海生物的硬脑膜/嵴补片为天然脱细胞基质材料，具有疏密不对称结构，具备良好的柔韧性，可免缝合贴附使用。卓阮医疗生产的生物疝修补补片(产品规格：Z-ECP-HM)是由猪膀胱基底膜和猪小肠粘膜下层经过脱细胞和复合处理获得的三明治结构补片，孔分布有序，由基底膜作为上下表面，猪小肠粘膜下层作为中间层，隔离细胞和结缔组织，术后8-16周降解。
市面上的胶原膜缺乏刚性和稳定性，其降解速率难以满足组织再生需要，也不具备应对术后细菌感染的抗菌性能。现已有许多物理或化学交联方法用于提高胶原膜的机械性能和缓解降解问题，包括基于物理(紫外线辐射)、化学(戊二醛、己基二异氰酸酯、二苯磷酰肼)和酶(核糖)相互作用。研究显示最广泛应用于胶原基材料的戊二醛交联剂降低了材料的生物相容性，并且存在导致组织钙化的风险，导致组织整合性下降，不适宜临床应用。现有预防术后感染的方法主要是通过理化途径在GBR膜表面引入抗菌成分，包括无机和有机抗菌剂。其中，无机抗菌剂主要包括银、碘、铜、锌等，通过物理吸附或离子交换等不同方法结合到材料表面。但无机金属离子在杀灭细菌的同时对细胞的增殖和分化存在不同程度的影响。有机抗菌剂主要包括抗生素类、抗菌肽类、低分子类抗菌剂，通过物理吸附、共价键结合、氢键作用等方式负载于材料表面而发挥抗菌活性。但抗生素常存在早期暴释，且长期应用会引起耐药性及口腔内菌群失调，进而使口腔内环境的稳态失衡。低分子类抗菌剂负载方法简便，但稳定性欠佳、易析出，抗菌活性不足。
CN108578781A公开了一种鱼鳔源生物瓣膜材料及其制备方法与应用，其分别将鱼鳔膜用SDS、Triton X-100、DNase和RNase进行脱细胞，然后将其用戊二醛进行交联，制备得到了双面结构均光滑的鱼鳔源生物瓣膜材料，由于其双面结构均光滑，不具备疏松面，导致其不利于骨缺损区成骨细胞的粘附增殖，同时戊二醛的交联，导致其生物相容性下降，且其脱细胞过程中用了DNase和RNase，导致鱼鳔膜胶原纤维的致密排列和胶原蛋白的结构被破坏，使其不具备理想的选择性屏障效果。
目前，商用胶原膜仍存在降解较快、机械性能不足、湿润后容易塌陷、无法长期维持屏障作用、缺乏抗菌性能等缺点，导致骨修复效果不理想。同时，现有胶原膜基本都为哺乳动物源性材料，具有较高的免疫原性，容易产生排斥和炎症反应，有感染风险。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供一种双面结构不对称的鱼鳔膜的制备方法及应用，所述的双面结构不对称的鱼鳔膜力学性能优异，生物相容性好，具有极佳的屏障作用，能够有效阻止成纤维细胞的侵入，同时具有优异的降解性能和力学性能，得益于其特定的双面结构不对称性和其优异的性能，使其能够广泛的应用于GBR/GTR膜、组织修复膜、生物补片中，具有广泛的应用前景和市场价值。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种双面结构不对称的鱼鳔膜的制备方法，包括以下步骤：
将鱼鳔置于十二烷基苯磺酸钠溶液中浸泡，清洗，再将鱼鳔置于聚乙二醇辛基苯基醚溶液中浸泡，清洗，干燥，得到双面结构不对称的脱细胞鱼鳔膜。
作为本发明的优选实施方案，所述十二烷基苯磺酸钠溶液的浓度为0.1～10wt％；和/或所述聚乙二醇辛基苯基醚溶液的浓度为0.1～10vt％。
作为本发明的优选实施方案，还包括以下步骤：
将双面结构不对称的脱细胞鱼鳔膜浸入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺溶液中，加入N-羟基琥珀酰亚胺，调节pH至5.2～6，反应，得到双面结构不对称的交联鱼鳔膜。
作为本发明的优选实施方案，所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺溶液中1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺的浓度为2～10g/L。
作为本发明的优选实施方案，所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1：(0.5～2)。
作为本发明的优选实施方案，所述反应在避光条件，温度为2～6℃下进行。
作为本发明的优选实施方案，还包括以下步骤：
将双面结构不对称的交联鱼鳔膜置于次氯酸钠溶液中浸泡，得到双面结构不对称的氯化鱼鳔膜或双面结构不对称的氯化交联鱼鳔膜。
作为本发明的优选实施方案，所述次氯酸钠溶液的浓度为0.1～10wt％。
作为本发明的优选实施方案，所述鱼鳔取自草鱼、鳙鱼、鲫鱼、鲢鱼中的至少一种。
本发明还提供了一种双面结构不对称的鱼鳔膜，采用上述所述的制备方法制备而成。
本发明还提供了一种双面结构不对称的鱼鳔膜在制备GBR膜、GTR膜、组织修复膜、生物补片中的应用。
本发明的有益效果在于：(1)本发明的脱细胞处理方法，相比于现有的酸法、碱法、酶解法等脱细胞方法相比，本发明的脱细胞反应条件温和，能够在保证脱细胞效果的同时最大限度地保留鱼鳔膜胶原纤维的致密排列和胶原蛋白的结构，从而使其具备理想的选择性屏障效果和抗降解能力。(2)本发明将鱼鳔进行脱细胞处理，而后经过交联处理，最后经过次氯酸钠溶液浸泡氯化改性处理，得到具有优异性能的双面结构不对称的鱼鳔膜，所述的双面结构不对称的鱼鳔膜力学性能优异，尤其是湿态环境下的(模拟临床上胶原膜被组织液/血液浸润的应用环境)力学性能优异，生物相容性好，具有极佳的屏障作用，能够有效阻止成纤维细胞的侵入，同时具有优异的降解性能和抗菌性能，得益于其特定的双面结构不对称性和其优异的性能，使其能够广泛的应用于GBR/GTR膜、组织修复膜、生物补片中，具有广泛的应用前景和市场价值。(3)所述鱼鳔膜从脱细胞鱼鳔膜、交联鱼鳔膜到最后的鱼鳔膜均保持双面不对称结构，具有致密面和疏松面，其中致密面光滑致密，疏松面疏松多孔，其中，致密面具有纳米孔结构，疏松面具有为微米孔结构。(4)本发明的双面结构不对称的鱼鳔膜为生物来源，得益于其非哺乳动物的特点，脱细胞鱼鳔膜具有极低的免疫原性和较大的生物医用潜力，不易引起排斥和炎症反应。同时充分利用了丰富的淡水养殖鱼资源带来的大量低附加值副产品，达到“变废为宝”的目的。(5)本发明用次氯酸钠对鱼鳔膜进行改性处理，可去除不稳定的胶原蛋白成分，得到降解性能更优，稳定性更强的鱼鳔膜。随着氯化处理时间增长，还可以赋予鱼鳔膜抗菌性能。
附图说明
图1为实施例1～5的脱细胞鱼鳔膜的电镜图。
图2为交联鱼鳔膜、氯化交联鱼鳔膜、氯化鱼鳔膜的电镜图。
图3为脱细胞鱼鳔膜、交联鱼鳔膜、氯化交联鱼鳔膜、氯化鱼鳔膜的生物相容性实验的OD值。
图4为脱细胞鱼鳔膜、交联鱼鳔膜、氯化交联鱼鳔膜、氯化鱼鳔膜的细胞屏障情况。
图5为脱细胞鱼鳔膜、交联鱼鳔膜、氯化交联鱼鳔膜、氯化鱼鳔膜的存活情况。
图6为脱细胞鱼鳔膜、交联鱼鳔膜、氯化交联鱼鳔膜、氯化鱼鳔膜的降解性能。
具体实施方式
为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
本申请中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
本申请中，涉及到数值区间，如无特别说明，上述数值区间内视为连续，且包括该范围的最小值及最大值，以及这种最小值与最大值之间的每一个值。进一步地，当范围是指整数时，包括该范围的最小值与最大值之间的每一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并该范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之所有范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。
在本申请中，具体的分散、搅拌处理方式没有特别限制。
本申请所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
本申请实施例提供了一种双面结构不对称的鱼鳔膜的制备方法，包括以下步骤：
将鱼鳔置于十二烷基苯磺酸钠溶液中浸泡，清洗，再将鱼鳔置于聚乙二醇辛基苯基醚溶液中浸泡，清洗，干燥，得到双面结构不对称的脱细胞鱼鳔膜(下称脱细胞鱼鳔膜)。
本发明的脱细胞处理方法，相比于现有的酸法、碱法、酶解法等脱细胞方法相比，本发明的脱细胞反应条件温和，能够在保证脱细胞效果的同时最大限度地保留鱼鳔膜胶原纤维的致密排列和胶原蛋白的结构，从而使其具备理想的选择性屏障效果和抗降解能力。
所述的脱细胞鱼鳔膜双面不对称结构，具有致密面和疏松面，其中致密面光滑致密，疏松面疏松多孔，其中，致密面具有纳米孔结构，疏松面具有为微米孔结构。
在其中一个实施方式中，所述十二烷基苯磺酸钠溶液的浓度为0.1～10wt％；和/或所述聚乙二醇辛基苯基醚溶液的浓度为0.1～10vt％。
示例性的，将鱼鳔置于十二烷基苯磺酸钠溶液中浸泡时，浸泡的时间可以为2～10h。
示例性的，将鱼鳔置于聚乙二醇辛基苯基醚溶液中浸泡时，浸泡的时间可以是2～10h。
示例性的，脱细胞处理过程中的清洗采用本领域的常规清洗方法进行清洗，例如清洗可采用PBS缓冲液或水清洗。
在其中一个实施方式中，在脱细胞处理前，鱼鳔通过常规的方法进行储存运输和前处理。
示例性的，储存运输和前处理的方法如下：
从市场中收集的新鲜鱼鳔，立刻储存在含有100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的0.9％生理盐水中，置于冰上运输回实验室；
在显微镜下用手术剪和手术镊小心分离并去除鱼鳔周围的脂肪和附着的黏膜；用无菌磷酸盐缓冲液(PBS，pH＝7.4)搅拌清洗30min。
在其中一个实施方式中，还包括以下步骤：
将双面结构不对称的脱细胞鱼鳔膜浸入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺溶液中，加入N-羟基琥珀酰亚胺，调节pH至5.2～6，反应，得到双面结构不对称的交联鱼鳔膜(下称交联鱼鳔膜)。
所述的交联鱼鳔膜双面不对称结构，具有致密面和疏松面，其中致密面光滑致密，疏松面疏松多孔，其中，致密面具有纳米孔结构，疏松面具有为微米孔结构。
本发明交联鱼鳔膜，力学性能优异，尤其是湿态环境下的(模拟临床上胶原膜被组织液/血液浸润的应用环境)力学性能优异，生物相容性好，具有极佳的屏障作用，能够有效阻止成纤维细胞的侵入，同时具有优异的降解性能，得益于其特定的双面结构不对称性和其优异的性能，使其能够广泛的应用于GBR/GTR膜、组织修复膜、生物补片中，具有广泛的应用前景和市场价值。
示例性的，本发明采用2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)调节pH至5.2～6，采用MES调节pH的同时还能够作为缓冲剂，为交联反应提供稳定的条件。
示例性的，在调节pH至5.2～6，反应后，还包括清洗、干燥。
示例性的，在将交联鱼鳔膜置于次氯酸钠溶液中浸泡后，还包括清洗，干燥。
示例性的，本领域技术人员可以根据实际需要选择清洗的方法，只要达到清洗的目的即可，例如清洗可采用PBS缓冲液或水清洗。
示例性的，本领域技术人员可以根据实际需要选择干燥的方法，只要达到干燥的目的即可，例如干燥可采用真空干燥、烘箱干燥、自然烘干。
在其中一个实施方式中，所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺溶液中1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺的浓度为2～10g/L。
在其中一个实施方式中，所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1：(0.5～2)。
在其中一个实施方式中，所述反应在避光条件，温度为2～6℃下进行。
在其中一个实施方式中，还包括以下步骤：
将双面结构不对称的交联鱼鳔膜置于次氯酸钠溶液中浸泡，得到双面结构不对称的氯化鱼鳔膜(下称氯化鱼鳔膜)或双面结构不对称的氯化交联鱼鳔膜(下称氯化交联鱼鳔膜)。
其中，若直接对双面结构不对称的脱细胞鱼鳔膜进行氯化处理，得到双面结构不对称的氯化鱼鳔膜。
若对双面结构不对称的交联鱼鳔膜进行氯化处理，得到双面结构不对称的氯化交联鱼鳔膜。
本发明采用次氯酸钠溶液浸泡氯化改性，与现有的抗菌改性手段相比，本发明的改性反应条件简单、时间短，引入的N-卤胺化合物拥有更好的化学稳定性、持久的抗菌活性、易加工性和不易挥发性。
本发明创造性的将鱼鳔进行脱细胞处理，而后经过交联处理，最后经过次氯酸钠溶液浸泡氯化改性处理，得到具有优异性能的氯化交联鱼鳔膜。
所述鱼鳔膜从脱细胞鱼鳔膜、交联鱼鳔膜到最后的交联氯化鱼鳔膜均保持双面不对称结构，具有致密面和疏松面，其中致密面光滑致密，疏松面疏松多孔，其中，致密面具有纳米孔结构，疏松面具有为微米孔结构。
本发明氯化交联鱼鳔膜，力学性能优异，尤其是湿态环境下的(模拟临床上胶原膜被组织液/血液浸润的应用环境)力学性能优异，生物相容性好，具有极佳的屏障作用，能够有效阻止成纤维细胞的侵入，同时具有优异的降解性能和抗菌性能，得益于其特定的双面结构不对称性和其优异的性能，使其能够广泛的应用于GBR/GTR膜、组织修复膜、生物补片中，具有广泛的应用前景和市场价值。
本发明的脱细胞鱼鳔膜、交联鱼鳔膜、氯化鱼鳔膜以及交联氯化鱼鳔膜为生物来源，得益于其非哺乳动物的特点，脱细胞鱼鳔膜具有极低的免疫原性和较大的生物医用潜力，不易引起排斥和炎症反应。同时充分利用了丰富的淡水养殖鱼资源带来的大量低附加值副产品，达到“变废为宝”的目的。
在其中一个实施方式中，所述次氯酸钠溶液的浓度为0.1～10wt％。
示例性的，将交联鱼鳔膜置于次氯酸钠溶液中浸泡时，浸泡的时间为20～60min。
在其中一个实施方式中，所述鱼鳔取自草鱼、鳙鱼、鲫鱼、鲢鱼中的至少一种。本发明的发明人在大量的鱼鳔研究中发现，草鱼、鳙鱼、鲫鱼、鲢鱼适合制备双面结构不对称的鱼鳔膜，而采用例如鲮鱼时，其双面结构无明显差异，特别是采用草鱼、鳙鱼、鲫鱼时，效果更佳。
本发明还提供了一种双面结构不对称的鱼鳔膜，采用上述所述的制备方法制备而成。
本发明还提供了一种双面结构不对称的鱼鳔膜在制备GBR膜、GTR膜、组织修复膜、生物补片中的应用。
下面以具体实施例进一步阐述本发明：
实施例1
一种脱细胞鱼鳔膜的制备方法，包括以下步骤：
(1)将鳙鱼鱼鳔在显微镜下用手术剪和手术镊小心分离、去除鱼鳔周围的脂肪和附着的黏膜，处理完毕后储存于含有100U/mL青霉素和100μg/mL的0.9％生理盐水中，并置于冰柜中备用。
(2)将步骤(1)中经处理得到的鳙鱼鱼鳔在无菌磷酸盐缓冲液(PBS，pH＝7.4)搅拌清洗30min后，在室温下用1％(w/v)的十二烷基磺酸钠(SDS)水溶液搅拌处理6h，随后用PBS清洗，去除残留SDS，得到初步脱细胞鱼鳔。
(3)将步骤(2)中得到的初步脱细胞鱼鳔在室温下用1％(v/v)的Triton-X100水溶液在避光条件下搅拌处理6h，随后用PBS清洗7d，获得双面结构不对称的脱细胞鱼鳔膜-1。
实施例2
一种脱细胞鱼鳔膜的制备方法，包括以下步骤：
(1)将鲮鱼鱼鳔在显微镜下用手术剪和手术镊小心分离、去除鱼鳔周围的脂肪和附着的黏膜，处理完毕后储存于含有100U/mL青霉素和100μg/mL的0.9％生理盐水中，并置于冰柜中备用。
(2)将步骤(1)中经处理得到的鲮鱼鱼鳔在无菌磷酸盐缓冲液(PBS，pH＝7.4)搅拌清洗30min后，在室温下用1％(w/v)的十二烷基磺酸钠(SDS)水溶液搅拌处理6h，随后用PBS清洗，去除残留SDS，得到初步脱细胞鱼鳔。
(3)将步骤(2)中得到的初步脱细胞鱼鳔在室温下用1％(v/v)的Triton-X100水溶液在避光条件下搅拌处理6h，随后用PBS清洗7d，获得脱细胞鱼鳔膜-2。
实施例3
一种脱细胞鱼鳔膜的制备方法，包括以下步骤：
(1)将草鱼鱼鳔在显微镜下用手术剪和手术镊小心分离、去除鱼鳔周围的脂肪和附着的黏膜，处理完毕后储存于含有100U/mL青霉素和100μg/mL的0.9％生理盐水中，并置于冰柜中备用。
(2)将步骤(1)中经处理得到的草鱼鱼鳔在无菌磷酸盐缓冲液(PBS，pH＝7.4)搅拌清洗30min后，在室温下用1％(w/v)的十二烷基磺酸钠(SDS)水溶液搅拌处理6h，随后用PBS清洗，去除残留SDS，得到初步脱细胞鱼鳔。
(3)将步骤(2)中得到的初步脱细胞鱼鳔在室温下用1％(v/v)的Triton-X100水溶液在避光条件下搅拌处理6h，随后用PBS清洗7d，获得双面结构不对称的脱细胞鱼鳔膜-3。
实施例4
一种脱细胞鱼鳔膜的制备方法，包括以下步骤：
(1)将鲫鱼鱼鳔在显微镜下用手术剪和手术镊小心分离、去除鱼鳔周围的脂肪和附着的黏膜，处理完毕后储存于含有100U/mL青霉素和100μg/mL的0.9％生理盐水中，并置于冰柜中备用。
(2)将步骤(1)中经处理得到的鲫鱼鱼鳔在无菌磷酸盐缓冲液(PBS，pH＝7.4)搅拌清洗30min后，在室温下用1％(w/v)的十二烷基磺酸钠(SDS)水溶液搅拌处理6h，随后用PBS清洗，去除残留SDS，得到初步脱细胞鱼鳔。
(3)将步骤(2)中得到的初步脱细胞鱼鳔在室温下用1％(v/v)的Triton-X100水溶液在避光条件下搅拌处理6h，随后用PBS清洗7d，获得双面结构不对称的脱细胞鱼鳔膜-4。
实施例5
一种脱细胞鱼鳔膜的制备方法，包括以下步骤：
(1)将鲢鱼鱼鳔在显微镜下用手术剪和手术镊小心分离、去除鱼鳔周围的脂肪和附着的黏膜，处理完毕后储存于含有100U/mL青霉素和100μg/mL的0.9％生理盐水中，并置于冰柜中备用。
(2)将步骤(1)中经处理得到的鲢鱼鱼鳔在无菌磷酸盐缓冲液(PBS，pH＝7.4)搅拌清洗30min后，在室温下用1％(w/v)的十二烷基磺酸钠(SDS)水溶液搅拌处理6h，随后用PBS清洗，去除残留SDS，得到初步脱细胞鱼鳔。
(3)将步骤(2)中得到的初步脱细胞鱼鳔在室温下用1％(v/v)的Triton-X100水溶液在避光条件下搅拌处理6h，随后用PBS清洗7d，获得双面结构不对称的脱细胞鱼鳔膜-5。
实施例6
一种交联鱼鳔膜的制备方法，包括以下步骤：
(1)将鳙鱼鱼鳔在显微镜下用手术剪和手术镊小心分离、去除鱼鳔周围的脂肪和附着的黏膜，处理完毕后储存于含有100U/mL青霉素和100μg/mL的0.9％生理盐水中，并置于冰柜中备用。
(2)将步骤(1)中经处理得到的鳙鱼鱼鳔在无菌磷酸盐缓冲液(PBS，pH＝7.4)搅拌清洗30min后，在室温下用1％(w/v)的十二烷基磺酸钠(SDS)水溶液搅拌处理6h，随后用PBS清洗，去除残留SDS，得到初步脱细胞鱼鳔。
(3)将步骤(2)中得到的初步脱细胞鱼鳔在室温下用1％(v/v)的Triton-X100水溶液在避光条件下搅拌处理6h，随后用PBS清洗7d，获得双面结构不对称的脱细胞鱼鳔膜(下称脱细胞鱼鳔膜)。
(4)将脱细胞鱼鳔膜-1浸入4g/L的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)溶液中，将N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)按nEDC:nNHS为1:1的量加入，以2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)为缓冲剂调pH值为5.5，于4℃下避光反应24小时，去离子水清洗24小时后在真空状态下冷冻干燥至完全脱水，获得双面结构不对称的脱细胞鱼鳔膜的交联鱼鳔膜(下称交联鱼鳔膜)。
实施例7
(1)将鳙鱼鱼鳔在显微镜下用手术剪和手术镊小心分离、去除鱼鳔周围的脂肪和附着的黏膜，处理完毕后储存于含有100U/mL青霉素和100μg/mL的0.9％生理盐水中，并置于冰柜中备用。
(2)将步骤(1)中经处理得到的鳙鱼鱼鳔在无菌磷酸盐缓冲液(PBS，pH＝7.4)搅拌清洗30min后，在室温下用1％(w/v)的十二烷基磺酸钠(SDS)水溶液搅拌处理6h，随后用PBS清洗，去除残留SDS，得到初步脱细胞鱼鳔。
(3)将步骤(2)中得到的初步脱细胞鱼鳔在室温下用1％(v/v)的Triton-X100水溶液在避光条件下搅拌处理6h，随后用PBS清洗7d，获得双面结构不对称的脱细胞鱼鳔膜。
(4)将脱细胞鱼鳔膜-1浸入4g/L的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)溶液中，将N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)按nEDC:nNHS为1:1的量加入，以2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)为缓冲剂调pH值为5.5，于4℃下避光反应24小时，去离子水清洗24小时后在真空状态下冷冻干燥至完全脱水，获得双面结构不对称的脱细胞鱼鳔膜的交联鱼鳔膜。
(5)将交联鱼鳔膜浸泡于1％次氯酸钠溶液中30分钟，去离子水清洗24小时后在真空状态下冷冻干燥至完全脱水，得到氯化交联鱼鳔膜，即双面结构不对称的氯化交联鱼鳔膜(下称氯化交联鱼鳔膜)。
实施例8
(1)将鳙鱼鱼鳔在显微镜下用手术剪和手术镊小心分离、去除鱼鳔周围的脂肪和附着的黏膜，处理完毕后储存于含有100U/mL青霉素和100μg/mL的0.9％生理盐水中，并置于冰柜中备用。
(2)将步骤(1)中经处理得到的鳙鱼鱼鳔在无菌磷酸盐缓冲液(PBS，pH＝7.4)搅拌清洗30min后，在室温下用1％(w/v)的十二烷基磺酸钠(SDS)水溶液搅拌处理6h，随后用PBS清洗，去除残留SDS，得到初步脱细胞鱼鳔。
(3)将步骤(2)中得到的初步脱细胞鱼鳔在室温下用1％(v/v)的Triton-X100水溶液在避光条件下搅拌处理6h，随后用PBS清洗7d，获得双面结构不对称的脱细胞鱼鳔膜。
(4)将脱细胞鱼鳔膜浸泡于1％次氯酸钠溶液中30分钟，去离子水清洗24小时后在真空状态下冷冻干燥至完全脱水，得到氯化鱼鳔膜，即双面结构不对称的氯化鱼鳔膜(下称氯化鱼鳔膜)。
测试例
1.将实施例1～5制备得到的不同鱼种来源的脱细胞鱼鳔膜进行扫描电镜表征，如图1所示，表明鳙鱼、草鱼、鲫鱼和鲢鱼鱼鳔呈现双面结构不对称，一面致密光滑，一面疏松粗糙，而体积最小且厚度最薄的鲮鱼鱼鳔两侧结构无明显差异。
2.将交联鱼鳔膜、氯化鱼鳔膜以及氯化交联鱼鳔膜进行扫描电镜表征，如图2所示，表明制备得到的交联鱼鳔膜、氯化交联鱼鳔膜保持了双面结构不对称，一面致密光滑，一面疏松粗糙，且氯化交联鱼鳔膜疏松面相比于交联鱼鳔膜疏松面更加疏松多孔，而氯化鱼鳔膜尽管没有经过交联处理，但致密面的致密结构仍保持完整。
3.细胞相容性实验：取L929成纤维细胞接种于四组鱼鳔膜(分别为脱细胞鱼鳔膜、交联鱼鳔膜、氯化鱼鳔膜、氯化交联鱼鳔膜)的致密面，分别在第1、3和7天在避光条件下按照CCK-8试剂盒说明书进行操作，于每孔加入200μLCCK-8工作液，在37℃，5％CO2培养箱中孵育1h后将上清液转移至96孔板中，使用酶标仪检测各孔在450nm处的吸光值(如图3所示，图3中的脱细胞鱼鳔膜代表脱细胞鱼鳔膜-1)，证明其对细胞的增殖能力及细胞骨架均无明显影响。
4.细胞屏障实验：取L929成纤维细胞接种于四组鱼鳔膜(分别为脱细胞鱼鳔膜、交联鱼鳔膜、氯化鱼鳔膜、氯化交联鱼鳔膜)的致密面上，在第3d通过荧光共聚焦显微镜观察致密面和疏松面的细胞生长情况，如图4所示，发现致密面上细胞密度较高，而疏松面上基本没有细胞生长，证明该材料的细胞屏障作用良好，能够有效阻止成纤维细胞的侵入。
5.采用万能试验机检测四组鱼鳔膜在湿态条件下的拉伸强度，具体而言，将样品在浓度为0.9％的生理盐水中浸泡1小时，轻轻擦去材料表面的多余液体，再进行检测，以模拟临床上胶原膜被组织液/血液浸润的应用环境；同时检测四组胶原膜在干态条件下的拉伸强度，测试结果如表1所示。
6.以金黄色葡萄球菌作为模型菌，以400μL,106CFU/mL接种于四组鱼鳔膜，在24h后，通过扫描电镜观察细菌的存活情况(如图5所示，图5中的脱细胞鱼鳔膜代表脱细胞鱼鳔膜-1)，并计算抗菌率，测试结果如表1所示。
7.使用100ug/ml的I型胶原酶检测四组鱼鳔膜的降解性能，将干燥后的四组材料随机分为4组，每组设置3个重复样本，每个样本都被称重且记录样品初始质量为m0，将样本浸泡在1mL 100ug/ml的I型胶原酶中室温摇床孵育，每24h更换一次酶溶液。在每个测量时间点倒去酶溶液并用超纯水洗涤样品三次，冷冻干燥，称重且记录样品剩余质量为m1，失重率的计算公式如下：
失重率(％)＝[(m0-m1)/m0]×100％。测试结果如图6所示。
表1
从表1可看出，本发明的脱细胞鱼鳔膜具有较优的力学性能，但不具有抗菌性能。
仅经过交联处理后，湿态环境下的(模拟临床上胶原膜被组织液/血液浸润的应用环境)力学性能得到显著提高，同时开始具有一定的抗菌性能。
仅经过氯化处理后，抗菌性能得到显著提高，湿态环境下的力学性能出现一定幅度的下降(但在可接受的范围内)。
经过交联、氯化处理后，湿态环境下的力学性能的抗菌性能均得到显著提高。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (11)
1.一种双面结构不对称的鱼鳔膜的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将鱼鳔置于十二烷基苯磺酸钠溶液中浸泡，清洗，再将鱼鳔置于聚乙二醇辛基苯基醚溶液中浸泡，清洗，干燥，得到双面结构不对称的脱细胞鱼鳔膜。
2.根据权利要求1所述的双面结构不对称的鱼鳔膜的制备方法，其特征在于，所述十二烷基苯磺酸钠溶液的浓度为0.1～10wt％；和/或
所述聚乙二醇辛基苯基醚溶液的浓度为0.1～10vt％。
3.根据权利要求1所述的双面结构不对称的鱼鳔膜的制备方法，其特征在于，还包括以下步骤：
将双面结构不对称的脱细胞鱼鳔膜浸入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺溶液中，加入N-羟基琥珀酰亚胺，调节pH至5.2～6，反应，得到双面结构不对称的交联鱼鳔膜。
4.根据权利要求3所述的双面结构不对称的鱼鳔膜的制备方法，其特征在于，所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺溶液中1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺的浓度为2～10g/L。
5.根据权利要求3所述的双面结构不对称的鱼鳔膜的制备方法，其特征在于，所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1：(0.5～2)。
6.根据权利要求3所述的双面结构不对称的鱼鳔膜的制备方法，其特征在于，所述反应在避光条件，温度为2～6℃下进行。
7.根据权利要求1～6任一所述的双面结构不对称的鱼鳔膜的制备方法，其特征在于，还包括以下步骤：
将双面结构不对称的交联鱼鳔膜置于次氯酸钠溶液中浸泡，得到双面结构不对称的氯化鱼鳔膜或双面结构不对称的氯化交联鱼鳔膜。
8.根据权利要求1～6任一所述的双面结构不对称的鱼鳔膜的制备方法，其特征在于，所述次氯酸钠溶液的浓度为0.1～10wt％。
9.根据权利要求1所述的双面结构不对称的鱼鳔膜的制备方法，其特征在于，所述鱼鳔取自草鱼、鳙鱼、鲫鱼、鲢鱼中的至少一种。
10.一种双面结构不对称的鱼鳔膜，其特征在于，采用权利要求1～8任一所述的制备方法制备而成。
11.权利要求10所述的双面结构不对称的鱼鳔膜在制备GBR膜、GTR膜、组织修复膜、生物补片中的应用。
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