CN118056843A - 新的抗her2抗体及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了新型HER2结合分子。本发明还提供了编码所述HER2结合分子的核酸分子,用于表达HER2结合分子的表达载体和宿主细胞。本发明进一步提供了产生所述HER2结合分子的方法及其用途。
Description
序列表
本申请包含序列表,并且其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本申请一般而言涉及抗体。更具体地,本申请涉及特异性识别HER2的抗体、其制备方法及其用途。
背景技术
HER2基因是一种原癌基因,编码p185跨膜蛋白,具有酪氨酸激酶活性,属于人类表皮生长因子受体(HER)家族,该家族成员包括HER1、HER2、HER3和HER4。HER家族调节正常乳腺的生长和发育,但HER2的过度表达与乳腺癌有关。HER2的过表达导致HER2同源及异源二聚体形成增多,从而通过激活PI3K及MAPK通路引起细胞增殖、抗凋亡、侵袭及血管生成等效应。大约15%-30%的乳腺癌和10%-30%的胃/食管癌会发生HER2基因扩增或过度表达。HER2过表达也可见于其他肿瘤如卵巢癌、肺癌、结肠癌等。
针对HER2靶点的单抗药物包括曲妥珠单抗和帕妥珠单抗。曲妥珠单抗是首个针对HER2靶点的人源化单克隆抗体药物,与HER2受体胞外结构域IV结合,由此在高HER2过表达的细胞内阻断配体非依赖性HER2同二聚化,并在较小的程度上还阻断HER2与其它家族成员的异二聚化。帕妥珠单抗是第2个针对HER2靶点的重组人源化单克隆抗体,该药主要与HER2受体胞外结构域Ⅱ区结合,抑制二聚体的形成,抑制受体介导的信号转导通路。帕妥珠单抗和曲妥珠单抗虽然都针对HER2靶点,但结合的表位以及作用机制都不相同。后续的临床试验结果表明曲妥珠单抗和帕妥珠单抗联合用药后,一方面提高了HER2阳性早期乳腺癌和转移性乳腺癌患者的治疗效果,另一方面,针对曲妥珠单抗耐药的HER2转移性乳腺癌,也提高了患者总生存期,证明了曲妥珠单抗和帕妥珠单抗联合用药后,会确切提高靶向HER2治疗的疗效。目前在研的HER2双表位双特异性抗体有苏州康宁杰瑞生物科技有限公司的KN026、Zymeworks公司的ZW25,均处于临床研究阶段。
本领域仍希望开发新的改良的抗HER2抗体,特别是抗HER2双表位的双特异性抗体。
发明内容
广义而言,本公开提供抗体的新型分子、制备方法、组合物和制品。本公开提供的益处广泛地适用于抗体治疗和诊断领域。更具体而言,本公开提供了靶向HER2的单特异性和双特异性抗体,以及制备所述抗体的方法,用于表达所述抗体的表达载体和宿主细胞等。本公开的抗体提供了治疗或预防与HER2相关的病症的方法及其应用,并且可以与多种其他药物联合使用。
在一个方面,本公开提供一种HER2结合分子,其包含两种HER2结合结构域的至少一种,其中第一HER2结合结构域包含第一重链可变区(VH)和第一轻链可变区(VL),第二HER2结合结构域包含第二重链可变区(VH)和第二轻链可变区(VL)。在一些实施方案中,所述HER2结合分子包含第一HER2结合结构域和第二HER2结合结构域(即,是双特异性抗体),所述两种结合结构域结合HER2(例如人HER2)的不同表位,优选两种非重叠的表位。在一些实施方案中,所述HER2结合分子包含第一HER2结合结构域或第二HER2结合结构域(即,是单特异性抗体)。在一些具体的实施方案中,第一轻链可变区与第二轻链可变区具有相同的轻链CDR,进一步地,第一轻链可变区与第二轻链可变区可以完全相同。
在一些实施方案中,如本文公开的第一HER2结合结构域包含:
包含SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1存在不超过2个氨基酸的添加、缺失或取代的差异的氨基酸序列的重链CDR1(HCDR1),
包含SEQ ID NO:2或与SEQ ID NO:2存在不超过2个氨基酸的添加、缺失或取代的差异的氨基酸序列的HCDR2,
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包含SEQ ID NO:9或与SEQ ID NO:9存在不超过2个氨基酸的添加、缺失或取代的差异的氨基酸序列的LCDR3。
在一些实施方案中,如本文公开的第二HER2结合结构域包含:
包含SEQ ID NO:4或与SEQ ID NO:4存在不超过2个氨基酸的添加、缺失或取代的差异的氨基酸序列的HCDR1,
包含SEQ ID NO:5或与SEQ ID NO:5存在不超过2个氨基酸的添加、缺失或取代的差异的氨基酸序列的HCDR2,
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包含SEQ ID NO:7或与SEQ ID NO:7存在不超过2个氨基酸的添加、缺失或取代的差异的氨基酸序列的LCDR1,
包含SEQ ID NO:8或与SEQ ID NO:8存在不超过2个氨基酸的添加、缺失或取代的差异的氨基酸序列的LCDR2,和
包含SEQ ID NO:9或与SEQ ID NO:9存在不超过2个氨基酸的添加、缺失或取代的差异的氨基酸序列的LCDR3。
任选地,所述第一HER2结合结构域与第二HER2结合结构域具有相同的轻链CDR或甚至相同的轻链可变区。
在一些具体的实施方案中,如本文公开的第一HER2结合结构域包含:
包含SEQ ID NO:1的HCDR1,包含SEQ ID NO:2的HCDR2,包含SEQ ID NO:3的HCDR3,和
包含SEQ ID NO:7或与SEQ ID NO:7存在不超过2个氨基酸的添加、缺失或取代的差异的氨基酸序列的LCDR1,包含SEQ ID NO:8或与SEQ ID NO:8存在不超过2个氨基酸的添加、缺失或取代的差异的氨基酸序列的LCDR2,和包含SEQ ID NO:9或与SEQ ID NO:9存在不超过2个氨基酸的添加、缺失或取代的差异的氨基酸序列的LCDR3。
在一些具体的实施方案中,如本文公开的第二HER2结合结构域包含:
包含SEQ ID NO:4的HCDR1,包含SEQ ID NO:5或34的HCDR2,包含SEQ ID NO:6的HCDR3,和
包含SEQ ID NO:7或与SEQ ID NO:7存在不超过2个氨基酸的添加、缺失或取代的差异的氨基酸序列的LCDR1,包含SEQ ID NO:8或与SEQ ID NO:8存在不超过2个氨基酸的添加、缺失或取代的差异的氨基酸序列的LCDR2,和包含SEQ ID NO:9或与SEQ ID NO:9存在不超过2个氨基酸的添加、缺失或取代的差异的氨基酸序列的LCDR3。
在一些实施方案中,所述第一HER2结合结构域包含:包含SEQ ID NO:1的HCDR1,包含SEQ ID NO:2的HCDR2,包含SEQ ID NO:3的HCDR3,以及选自以下任一组的LCDR:
(a)包含如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的LCDR1,包含如式X1X2X3YLYS所示的氨基酸序列的LCDR2,其中X1为T、S或Y,X2为A或S,X3为S或L,和包含如式QQYYX4X5PX6T所示的氨基酸序列的LCDR3,其中X4为F、T或E,X5为Y、N或S,X6为Y或A;
(b)包含如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的LCDR1,包含如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的LCDR2,和包含如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的LCDR3;和
(c)包含如SEQ ID NO:15或17所示的氨基酸序列的LCDR1,包含如SEQ ID NO:16或18所示的氨基酸序列的LCDR2,和包含如SEQ ID NO:12或19所示的氨基酸序列的LCDR3。
在一些实施方案中,所述第二HER2结合结构域包含:包含SEQ ID NO:4的HCDR1,包含SEQ ID NO:5或34的HCDR2,包含SEQ ID NO:6的HCDR3,以及选自以下任一组的LCDR:
(a)包含如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的LCDR1,包含如式X1X2X3YLYS所示的氨基酸序列的LCDR2,其中X1为T、S或Y,X2为A或S,X3为S或L,和包含如式QQYYX4X5PX6T所示的氨基酸序列的LCDR3,其中X4为F、T或E,X5为Y、N或S,X6为Y或A;
(b)包含如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的LCDR1,包含如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的LCDR2,和包含如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的LCDR3;和
(c)包含如SEQ ID NO:15或17所示的氨基酸序列的LCDR1,包含如SEQ ID NO:16或18所示的氨基酸序列的LCDR2,和包含如SEQ ID NO:12或19所示的氨基酸序列的LCDR3。
在一些具体的实施方案中,如本文公开的第一HER2结合结构域包含:包含SEQ IDNO:1的HCDR1,包含SEQ ID NO:2的HCDR2,包含SEQ ID NO:3的HCDR3,包含SEQ ID NO:7、10、15或17的LCDR1,包含SEQ ID NO:8、11、13、16、18、20或21的LCDR2,和包含SEQ ID NO:9、12、14、19、22、23或24的LCDR3。
在一些具体的实施方案中,如本文公开的第二HER2结合结构域包含:包含SEQ IDNO:4的HCDR1,包含SEQ ID NO:5或34的HCDR2,包含SEQ ID NO:6的HCDR3,包含SEQ ID NO:7、10、15或17的LCDR1,包含SEQ ID NO:8、11、13、16、18、20或21的LCDR2,和包含SEQ ID NO:9、12、14、19、22、23或24的LCDR3。
在一些具体的实施方案中,所述双特异性抗体及其抗原结合部分包含第一和第二HER2结合结构域,所述第一HER2结合结构域分别包含如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQID NO:3所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3,所述第二HER2结合结构域分别包含如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3,且所述第一和第二HER2结合结构域具有相同的LCDR1、LCDR2和LCDR3,其中LCDR1、LCDR2和LCDR3选自下组:
(a)如SEQ ID NO:7所示的LCDR1,如SEQ ID NO:8所示的LCDR2和如SEQ ID NO:9所示的LCDR3;
(b)如SEQ ID NO:10所示的LCDR1,如SEQ ID NO:11所示的LCDR2和如SEQ ID NO:12所示的LCDR3;
(c)如SEQ ID NO:7所示的LCDR1,如SEQ ID NO:13所示的LCDR2和如SEQ ID NO:14所示的LCDR3;
(d)如SEQ ID NO:15所示的LCDR1,如SEQ ID NO:16所示的LCDR2和如SEQ ID NO:12所示的LCDR3;
(e)如SEQ ID NO:17所示的LCDR1,如SEQ ID NO:18所示的LCDR2和如SEQ ID NO:19所示的LCDR3;
(f)如SEQ ID NO:7所示的LCDR1,如SEQ ID NO:20所示的LCDR2和如SEQ ID NO:22所示的LCDR3;
(g)如SEQ ID NO:7所示的LCDR1,如SEQ ID NO:21所示的LCDR2和如SEQ ID NO:23所示的LCDR3;和
(h)如SEQ ID NO:7所示的LCDR1,如SEQ ID NO:18所示的LCDR2和如SEQ ID NO:24所示的LCDR3。
在一些具体的实施方案中,所述双特异性抗体及其抗原结合部分包含第一和第二HER2结合结构域,所述第一HER2结合结构域分别包含如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQID NO:3所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3,所述第二HER2结合结构域分别包含如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:6所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3,且所述第一和第二HER2结合结构域具有相同的LCDR1、LCDR2和LCDR3,其中LCDR1、LCDR2和LCDR3选自下组:
(a)如SEQ ID NO:7所示的LCDR1,如SEQ ID NO:8所示的LCDR2和如SEQ ID NO:9所示的LCDR3;
(b)如SEQ ID NO:10所示的LCDR1,如SEQ ID NO:11所示的LCDR2和如SEQ ID NO:12所示的LCDR3;
(c)如SEQ ID NO:7所示的LCDR1,如SEQ ID NO:13所示的LCDR2和如SEQ ID NO:14所示的LCDR3;
(d)如SEQ ID NO:15所示的LCDR1,如SEQ ID NO:16所示的LCDR2和如SEQ ID NO:12所示的LCDR3;
(e)如SEQ ID NO:17所示的LCDR1,如SEQ ID NO:18所示的LCDR2和如SEQ ID NO:19所示的LCDR3;
(f)如SEQ ID NO:7所示的LCDR1,如SEQ ID NO:20所示的LCDR2和如SEQ ID NO:22所示的LCDR3;
(g)如SEQ ID NO:7所示的LCDR1,如SEQ ID NO:21所示的LCDR2和如SEQ ID NO:23所示的LCDR3;和
(h)如SEQ ID NO:7所示的LCDR1,如SEQ ID NO:18所示的LCDR2和如SEQ ID NO:24所示的LCDR3。
在一些实施方案中,第一HER2结合结构域包含:
第一VH,具有:(a)如SEQ ID NO:41中所示的氨基酸序列;或(b)与SEQ ID NO:41至少85%、至少90%、或至少95%相同的氨基酸序列;或(c)与SEQ ID NO:41相比具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸的添加、缺失和/或取代的氨基酸序列;和
第一VL,具有:(a)如SEQ ID NO:26-332中任一项所示的氨基酸序列;或(b)与SEQID NO:26-33中任一项至少85%、至少90%、或至少95%相同的氨基酸序列;或(c)与SEQ IDNO:26-33中任一项相比具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸的添加、缺失和/或取代的氨基酸序列。
在一些进一步的/另外的实施方案中,第二HER2结合结构域包含:
第二VH,具有:(a)如SEQ ID NO:42或43中所示的氨基酸序列;或(b)与SEQ ID NO:42或43至少85%、至少90%、或至少95%相同的氨基酸序列;或(c)与SEQ ID NO:42或43相比具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸的添加、缺失和/或取代的氨基酸序列;和
第二VL,具有:(a)如SEQ ID NO:26-33中任一项所示的氨基酸序列;或(b)与SEQID NO:26-33中任一项至少85%、至少90%、或至少95%相同的氨基酸序列;或(c)与SEQ IDNO:26-33中任一项相比具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸的添加、缺失和/或取代的氨基酸序列。
在一些实施方案中,所述第一VH包含SEQ ID NO:41或由SEQ ID NO:41组成,所述第一VL包含SEQ ID NO:26-33中的任一项或由SEQ ID NO:26-33中的任一项组成。
在一些实施方案中,所述第二VH包含SEQ ID NO:42或43或由SEQ ID NO:42或43组成,所述第二VL包含SEQ ID NO:26-33中的任一项或由SEQ ID NO:26-33中的任一项组成。
在一些具体的实施方案中,第一VL与第二VL相同。例如,所述双特异性抗体中包含的第一HER2结合结构域包含具有如SEQ ID NO:41中所示的氨基酸序列的第一VH和具有如SEQ ID NO:28中所示的氨基酸序列的第一VL,第二HER2结合结构域包含具有如SEQ ID NO:42或43中所示的氨基酸序列的第二VH和具有如SEQ ID NO:28中所示的氨基酸序列的第二VL。备选地,所述双特异性抗体中包含的第一HER2结合结构域包含具有如SEQ ID NO:41中所示的氨基酸序列的第一VH和具有如SEQ ID NO:30中所示的氨基酸序列的第一VL,第二HER2结合结构域包含具有如SEQ ID NO:42或43中所示的氨基酸序列的第二VH和具有如SEQID NO:30中所示的氨基酸序列的第二VL。
在本文公开的双特异性抗体的一些实施方案中,所述第一和第二HER2结合结构域的重链可变区可操作地连接于免疫球蛋白重链恒定区(例如CH1、铰链区、包含CH2和CH3的Fc区)的N末端,且第一和第二HER2结合结构域的轻链可变区可操作地连接于免疫球蛋白轻链恒定区(例如CL)的N末端。
在一些实施方案中,免疫球蛋白恒定区是人IgG恒定区,例如人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4恒定区。具体地,所述免疫球蛋白恒定区可以是野生型IgG1或IgG4恒定区或其变体。在一些实施方案中,所述双特异性抗体包含人IgG1恒定区且任选地,在Fc区还包含突变以促进异二聚化。例如,在Fc区包含KIH(Knob into hole)突变。
在一些具体的实施方案中,如本文公开的双特异性抗体具有两条相同的轻链。例如,所述抗体包含两条重链和两条轻链,其中第一重链包含第一重链可变区可操作地连接于第一重链恒定区,第二重链包含第二重链可变区可操作地连接于第二重链恒定区,两条轻链相同且包含轻链可变区可操作地连接于轻链恒定区(例如如SEQ ID NO:38或SEQ IDNO:39所示)。第一重链恒定区与第二重链恒定区可以相同或不同。例如,第一和第二重链恒定区可以在Fc中包含突变以形成把手-孔洞(KIH)结构,具体地,第一重链恒定区可以包含SEQ ID NO:36的序列而第二重链恒定区可以包含SEQ ID NO:37的序列,或反之亦可。
在一些实施方案中,所述双特异性抗体是嵌合抗体、人源化抗体或全人抗体。
在一些实施方案中,所述双特异性抗体或其抗原结合部分结合人HER2的胞外结构域(ECD)。
在一方面,本文提供分离的核酸分子,其包含编码如前述任一项所定义的HER2结合分子的第一和/或第二HER2结合结构域以及任选地免疫球蛋白恒定区部分的核酸序列。
在一方面,本文提供一种表达载体,其包含本文公开的分离的核酸分子。
在一方面,本文提供一种宿主细胞,其包含本文公开的表达载体。所述宿主细胞可以是细菌细胞(例如大肠杆菌(E.coli))、真菌细胞(例如酵母)、植物细胞或动物细胞(例如哺乳动物细胞)。
在一方面,本文提供一种药物组合物,其包含至少一种如本文公开的HER2结合分子和药学上可接受的载体。
在一方面,本文提供制备如本文公开的HER2结合分子的方法,包括以下步骤:
-在包含编码HER2结合分子的载体的宿主细胞中表达所述HER2结合分子;和
-从宿主细胞分离HER2结合分子。
在一方面,本文提供治疗受试者中与HER2相关的病症的方法,所述方法包括:向所述受试者施用治疗有效量的如本文公开的HER2结合分子。所述与HER2相关的病症包括涉及表达HER2的细胞的疾病或与表达HER2的细胞相关的疾病,例如是HER2阳性癌症。
在一些实施方案中,所述癌症包括乳腺癌、卵巢癌、胃癌、肺癌、头颈癌、肝癌、宫颈癌、结肠癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、前列腺癌或食道癌。在一些实施方案中,所述癌症是胃癌。在一些实施方案中,所述癌症是乳腺导管癌。
在一方面,本文提供如本文公开的HER2结合分子在制备用于治疗或预防与HER2相关的病症的药物中的用途。
在一方面,本文提供用于治疗或诊断与HER2相关的病症的试剂盒,其包含容器,所述容器包含如本文公开的HER2结合分子。
以上内容是概括性的描述,必要时可包含细节的简化、概括和省略。因此,本领域技术人员将认识到,该概括性的描述仅是举例说明性的,并不意图以任何方式进行限制。
附图说明
图1A-1B显示候选Fab与hHER2-His的结合活性。其中,图1A为筛选获得8条轻链与帕妥珠单抗重链形成的Fab与hHER2-His的结合活性;图1B为筛选获得8条轻链与曲妥珠单抗重链形成的Fab与hHER2-His的结合活性。
图2A-2B显示候选Fab与帕妥珠单抗或曲妥珠单抗竞争hHER2-His的活性。其中,图2A为筛选获得8条轻链与帕妥珠单抗重链形成的Fab与帕妥珠单抗竞争hHER2-His的竞争活性;图2B为筛选获得8条轻链与曲妥珠单抗重链形成的Fab与曲妥珠单抗竞争hHER2-His的活性。
图3A-3B显示从富集较好的噬菌体池挑选的单克隆噬菌体对hHER2-Fc的ELISA亲和活性。
图4显示制备的候选抗体SDS-PAGE电泳鉴定结果。其中,图中的1、2、3、4、5分别为样品B1、B2、PemabHC-A3LC、TrmabHC-A3LC和Pemab19HC-A3LC。
图5显示基于ELISA方法测定候选抗体的亲和活性。
图6A-6D显示基于FACS方法测定候选抗体与肿瘤细胞表面HER2抗原结合的活性。其中图6A、图6B、图6C分别为在SK-BR-3细胞、BT-474细胞和SK-OV-3细胞上的与阳性对照Trmab和Pemab相比的FACS检测结果;图6D为在SK-BR-3细胞上的与阳性对照KN026和ZW25对比的FACS检测结果。
图7A-7D显示候选抗体抑制肿瘤细胞增殖检测结果。
图8A-8D显示候选抗体在SK-BR-3细胞上的抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)。
图9A-9C显示候选抗体在裸鼠模型中对NCI-N87肿瘤细胞的抑瘤效果。
图10A-10B显示候选抗体在NCG鼠模型中对BT-474肿瘤细胞的抑瘤效果。
发明详述
虽然本发明可以以许多不同的形式来实施,但在此公开的是验证本发明原理的其具体的举例说明性实施方案。应该强调的是,本发明不限于所举例说明的具体实施方案。此外,本文使用的任何章节标题仅用于组织目的,并不被解释为限制所描述的主题。
除非在此另外定义,否则与本发明结合使用的科学和技术术语将具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外,除非上下文另有要求,单数形式的术语应包括复数形式,复数形式的术语应包括单数形式。更具体地,如在本说明书和所附权利要求中所使用的,除非上下文另外明确指出,否则单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指示物。因此,例如,提及“一种蛋白质”包括多种蛋白质;提及“一个细胞”包括细胞的混合物等。在本申请中,除非另有说明,否则使用“或”意指“和/或”。此外,术语“包含”以及其他形式(诸如“包括”和“含有”)的使用不是限制性的。此外,说明书和所附权利要求中提供的范围包括端点和端点之间的所有值。
通常,与本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学和蛋白质以及核酸化学和杂交有关的术语以及其技术是本领域众所周知和常用的术语。除非另有说明,否则本发明的方法和技术通常根据本领域公知的常规方法进行,并如在本说明书全文中引用和讨论的各种通用和更具体的参考文献中所述进行。参见例如Abbas等人,Cellular and Molecular Immunology,6th ed.,W.B.Saunders Company(2010);SambrookJ.&Russell D.Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd ed.,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2000);Ausubel等人,Short Protocols inMolecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols in MolecularBiology,Wiley,John&Sons,Inc.(2002);Harlow and Lane Using Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1998);和Coligan等人,Short Protocols in Protein Science,Wiley,John&Sons,Inc.(2003)。与本文描述的分析化学、合成有机化学和药物化学有关的术语以及实验室程序和技术是本领域中众所周知和常用的术语。
定义
为了更好地理解本发明,相关术语的定义和解释提供如下。
如本文所用,术语“HER2结合分子”意指特异性结合HER2的分子。
如本文所用,术语“抗HER2抗体”与“HER2结合分子”可互换地使用,意指能够与HER2(例如人HER2或人HER2胞外结构域)特异性结合的抗体。人HER2胞外结构域的氨基酸序列的一个示例如SEQ ID NO:40所示。
如本文所用,术语“抗体”通常是指表现出所需生物学或结合活性的任何形式的抗体。它包括但不限于人源化抗体、完全人抗体、嵌合抗体和全人抗体。抗体可以包含重链和轻链。重链可分为μ、δ、γ、α和ε,它们分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。每条重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区包含3个结构域(CH1、CH2和CH3)。每条轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。VH和VL区可以进一步分为相对保守的区域(称为框架区(FR))和由FR间隔开的高变区(称为互补决定区(CDR))。每个VH和VL由以下顺序的3个CDR和4个FR组成:从N端到C端的FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。每条重链或轻链的可变区(VH和VL)分别配对以形成抗原结合位点。可以使用本领域中已知的方法来鉴定框架区和CDR区序列,例如AbM定义、Kabat定义、Chothia定义、EU定义和contact定义,这些都是本领域中公知的。参见例如Kabat,E.A.等人(1991)Sequences ofProteins of Immunological Interest,第5版,U.S.Department of Health and HumanServices,NIH Publication No.91-3242,Chothia等人,(1989)Nature 342:877;Edelman等人,Proc Natl Acad Sci U S A.1969 May;63(1):78-85;和Almagro,J.Mol.Recognit.17:132-143(2004)。亦可参见hgmp.mrc.ac.uk和bioinf.org.uk/abs。根据不同定义的编号之间的对应性或比对可见于例如http://www.imgt.org/(亦参见Giudicelli V等人IMGT,the international ImMunoGeneTics database.Nucleic AcidsRes.(1997)25:206–11)。抗体可以具有不同的抗体同种型,例如IgG(包括例如IgG1,IgG2,IgG3或IgG4亚型),IgA1,IgA2,IgD,IgE或IgM抗体。
如本文所用,术语“HER2结合结构域”是指与HER2特异性结合的可变区或可变结构域,通常由重链可变区和轻链可变区组成。在仅重链抗体或VHH的情况下,也可以仅由重链可变区组成。
抗体的“Fab”是指抗体的以下部分,其由单个轻链(可变区和恒定区均有)与单个重链的可变区和第一恒定区通过二硫键联合组成。在某些实施方案中,轻链和重链的两个恒定区可以是多种免疫球蛋白的恒定区。
关于抗体的“Fc”是指由第一重链的第二和第三恒定区经由二硫键合结合至第二重链的第二和第三恒定区组成的抗体的部分,任选地Fc区还包含全部或部分的铰链区。抗体的Fc部分负责多种效应器功能,例如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC),但在抗原结合中通常不起作用。本文中的Fc区既包括野生型Fc区还包括其变体,具有用于多种目的的不同突变。如本文使用的,Fc可以是野生型Fc区例如野生型人IgG1 Fc区或其变体。
如本文所用的术语“人源化抗体”是指其中来源于另一种哺乳动物物种如小鼠的种系的CDR序列已被移植到人框架序列上的抗体。可以在人框架序列内进行额外的框架区修饰。
如本文所用的术语“嵌合抗体”广义上是指含有来自一种抗体的一个或多个区和来自一种或多种其他抗体的一个或多个区的工程化抗体。具体而言,嵌合抗体包含衍生自非人动物抗体的可变区和另一抗体的恒定区,例如包含小鼠来源的可变区和人来源的恒定区。嵌合抗体还可指对至少两种不同抗原具有特异性的多特异性抗体。
如本文所用,“双特异性”表示存在至少两种抗原结合结构域(即可以是双特异性或多特异性的),每种都能够特异性结合不同的表位。例如,可以具有衍生自两种不同单克隆抗体(例如曲妥珠单抗和帕妥珠单抗)的片段并且能够结合HER2上的两种不同表位。
如本文所用,术语“双特异性抗体”指包含至少第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域的蛋白质、多肽或分子复合物。双特异性抗体内的每个抗原结合结构域包含至少一个CDR,其单独地或与一个或多个另外的CDR和/或FR组合地特异性结合特定抗原。在本公开的上下文中,第一抗原结合结构域特异性结合HER2的第一表位,并且第二抗原结合结构域特异性结合HER2的第二表位。
术语“可操作地连接”是指两个或更多个感兴趣的生物序列的并置(带有或不带有间隔区或接头或插入序列)以使得它们处于允许以意图方式起作用的关系。术语“间隔区”是指具有1、2、3、4或5个氨基酸残基或者长度是5至15、20、30、50或更多个氨基酸残基的人工氨基酸序列(例如(G4S)系列),通过肽键连接并用于连接一个或多个结合结构域。当就多肽使用时,是指以允许连接的产物具有意图的生物学功能的方式连接多肽序列。例如,抗体可变区可以可操作地连接于恒定区,以便提供具有抗原结合活性的稳定产物。又例如,抗原结合结构域可以与另一个抗原结合结构域通过其间的插入序列可操作地连接,并且该类插入序列可以是间隔区或可以包含更长的序列,例如抗体的恒定区。该术语也可以关于多核苷酸使用。举例来说,当编码多肽的多核苷酸可操作地连接于调节序列(例如启动子、增强子、沉默子序列等)时,其意指该多核苷酸序列以允许从多核苷酸调节表达多肽的方式连接。
如本文所用的术语“特异性结合”或“特异性结合至”是指两个分子之间例如抗体和抗原之间的非随机结合反应。
如本文所用的术语“EC50”,也被称为“半数有效浓度”,是指在特定的暴露时间后诱导在基线和最大值之间的50%的应答的药物、抗体或毒剂的浓度。在本申请的上下文中,EC50的单位可以为μg/mL或nM。
如本文所用的术语“高亲和力”的抗体是指针对靶抗原具有0.1μg/mL或更低,更优选0.05μg/mL或更低,甚至更优选0.04μg/mL或更低,甚至更优选0.03μg/mL或更低,和甚至更优选0.02μg/mL或更低的EC50值的抗原结合分子。确定EC50值的方法可以是通过ELISA或FACS。
如本文所用,术语“表位”是指免疫球蛋白或抗体特异性结合的抗原部分。“表位”也被称为“抗原决定簇”。表位或抗原决定簇通常由分子例如氨基酸、碳水化合物或糖侧链的化学活性表面基团组成,并且通常具有特定的三维结构和特定的电荷特征。例如,表位通常包含独特立体构象中的至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个连续或不连续的氨基酸,其可以是“线性表位”或“构象表位”。参见例如Epitope Mapping Protocols inMethods in Molecular Biology,Vol.66,G.E.Morris,Ed.(1996)。在线性表位中,蛋白质和相互作用分子(例如抗体)之间的所有相互作用位点沿蛋白质的一级氨基酸序列线性存在。在构象表位中,相互作用位点跨越蛋白质中彼此分离的氨基酸残基。取决于通过本领域技术人员已知的常规技术检测的结合相同表位的竞争性,可以筛选抗体。例如,可以进行竞争或交叉竞争研究以获得彼此竞争或交叉竞争结合抗原(例如HER2)的抗体。在国际专利申请WO 03/048731中描述了用于获得结合相同表位的抗体的高通量方法,其基于它们的交叉竞争。
如本文所用,术语“分离的”是指通过人工方式从天然状态获得的物质或组分的状态。如果某种“分离的”物质或组分天然存在,则可能是因为其所处的天然环境发生了变化,或者从天然环境下分离出该物质或组分,或者两者兼而有之。例如,某种未分离的多核苷酸或多肽天然存在于某个活体动物体内,从该天然状态分离的相同的高纯度多核苷酸或多肽被称为分离的多核苷酸或多肽。术语“分离的”既不排除混合的人造或合成物质,也不排除不影响分离的物质的活性的其他不纯物质。
如本文所用,术语“分离的抗体”旨在指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体。此外,分离的抗体可以基本上不含其他细胞材料和/或化学物质。
如本文所用,术语“载体”是指可以在其中插入多核苷酸的核酸媒介物。当载体允许插入其中的多核苷酸编码的蛋白质的表达时,该载体称为表达载体。该载体可以通过转化、转导或转染入宿主细胞而使携带的遗传物质元件在宿主细胞中表达。载体是本领域技术人员所熟知的,包括但不限于质粒,噬菌体,粘粒,人工染色体如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1衍生人工染色体(PAC),噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体和动物病毒。可用作载体的动物病毒包括但不限于逆转录病毒(包括慢病毒),腺病毒,腺伴随病毒,疱疹病毒(如单纯疱疹病毒),痘病毒,杆状病毒,乳头瘤病毒,乳多空病毒(如SV40)。载体可以包含用于控制表达的多个元件,包括但不限于启动子序列,转录起始序列,增强子序列,选择元件和报道基因。另外,载体可以包含复制起点。
如本文所用,术语“宿主细胞”是指可以导入载体的任何种类的细胞系统,包括但不限于原核细胞如大肠杆菌(E.coli)或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),真菌细胞如酵母细胞或曲霉属(Aspergillus),昆虫细胞如S2果蝇细胞或Sf9,以及动物细胞如成纤维细胞,CHO细胞,COS细胞,NSO细胞,HeLa细胞,BHK细胞,HEK293细胞或人细胞。
利用宿主细胞生产本发明的抗体的方法是本领域常规的,包括在原核或真核细胞中表达抗体,然后分离抗体,并通常纯化至可药用的纯度。如在一些实施方案中,通过本领域已知的标准技术将编码抗体的核酸插入到表达载体并将表达载体导入合适的原核或真核宿主细胞,在足以产生本发明的抗体或其功能性片段的条件和时间下培养宿主细胞,如CHO细胞、NSO细胞、SP2/0细胞、HEK293细胞、COS细胞、PER.C6(R)细胞、酵母或大肠杆菌细胞,并从细胞(裂解后的上清液或细胞)中回收抗体及对抗体进行纯化。用于生产抗体的常规方法是本领域现有技术已知的,描述在例如Makrides,S.C.,Protein Expr.Purif.17(1999)183-202;Geisse,S.等人,Protein Expr.Purif.8(1996)271-282;Kaufman,R.J.,Mol.Biotechnol.16(2000)151-160;Werner,R.G.,Drug Res.48(1998)870-880的综述文章中。
如本文所用,术语“同一性”是指通过比对和比较序列确定的两个或更多个多肽分子或两个或更多个核酸分子的序列之间的关系。“百分比同一性”是指比较分子中氨基酸或核苷酸之间相同残基的百分比,并基于被比较的最小分子的大小计算。对于这些计算,比对中的间隙(如果有的话)优选通过特定的数学模型或计算机程序(即“算法”)来寻址。可以用于计算比对的核酸或多肽的同一性的方法包括在Computational Molecular Biology,(Lesk,A.M.编),1988,New York:Oxford University Press;Biocomputing Informaticsand Genome Projects,(Smith,D.W.编),1993,New York:Academic Press;ComputerAnalysis of Sequence Data,Part I,(Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编),1994,NewJersey:Humana Press;von Heinje,G.,1987,Sequence Analysis in MolecularBiology,New York:Academic Press;Sequence Analysis Primer,(Gribskov,M.andDevereux,J.编),1991,New York:M.Stockton Press;和Carillo等人,1988,SIAMJ.Applied Math.48:1073中描述的那些。
如本文所用,术语“免疫原性”是指刺激生物体中特异性抗体或致敏淋巴细胞形成的能力。它不仅指抗原刺激特定免疫细胞活化、增殖和分化以最终产生免疫效应物质如抗体和致敏淋巴细胞的性质,还指抗体或致敏T淋巴细胞的特异性免疫应答可以在用抗原刺激生物体后在生物体的免疫系统中形成。免疫原性是抗原最重要的特性。抗原是否能够成功诱导宿主中免疫应答的产生取决于三个因素:抗原的性质、宿主的反应性和免疫手段。
如本文所用,术语“转染”是指将核酸引入真核细胞特别是哺乳动物细胞的过程。用于转染的方案和技术包括但不限于脂质转染,化学和物理方法转染如电穿孔。许多转染技术在本领域是公知的,参见例如Graham等人,1973,Virology 52:456;Sambrook等人,2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual;Davis等人,1986,Basic Methods inMolecular Biology,Elsevier;Chu等人,1981,Gene 13:197。
如本文所用,术语“荧光激活细胞分选”或“FACS”是指专门类型的流式细胞术。它提供了根据每个细胞的特定光散射和荧光特征,将生物细胞的异质混合物以每次一个细胞分拣到两个或更多个容器中的方法(FlowMetric.“Sorting Out Fluorescence ActivatedCell Sorting”.2017-11-09)。用于进行FACS的仪器是本领域技术人员已知的并且对于公众是可商购获得的。这种仪器的实例包括Becton Dickinson(Foster City,CA)的FACSStar Plus、FACScan和FACSort仪器、来自Coulter Epics Division(Hialeah,FL)的EpicsC和来自Cytomation(Colorado Springs,Colorado)的MoFlo。
术语“受试者”包括任何人或非人动物,优选人。
如本文所用,术语“与HER2相关的病症”是指由HER2的增加或减少的表达或活性引起、加重或以其它方式与其相关的任何病症。
如本文所用,术语“癌症”是指引发医学病症的任何肿瘤或恶性细胞生长、增殖或转移介导的实体瘤或非实体瘤如白血病。
本文在治疗病情的情况中使用的术语“治疗”一般涉及人或动物的治疗和疗法,其中实现了一些期望的治疗效果,例如,抑制病情进展,包括进展速度下降,进展速度停滞,病情消退,病情改善和病情治愈。还包括了作为预防措施(即预防)的治疗。对于癌症,“治疗”可能是指抑制或减缓肿瘤或恶性细胞生长、增殖或转移或其某种组合。对于肿瘤,“治疗”包括去除全部或部分肿瘤、抑制或减缓肿瘤生长和转移、预防或延迟肿瘤的发展或其某种组合。
如本文所用,术语“治疗有效量”涉及活性化合物或包含活性化合物的材料、组合物或剂型的量,其在按照所需的治疗方案施用时有效用于产生与合理的益处/风险比相称的某些所需的治疗效果。具体而言,“治疗有效量”意指抗体或其抗原结合部分有效治疗与HER2相关的病症的量或浓度。
如本文所用,术语“药学上可接受”是指载体、稀释剂、赋形剂和/或其盐在化学和/或物理上与制剂中的其他成分相容,并且与接受者在生理学上相容。
如本文所用,术语“药学上可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性剂相容的载体和/或赋形剂,其在本领域中是公知的(参见例如,Remington's Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR,19thed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995),并且包括但不限于pH调节剂,表面活性剂,佐剂和离子强度增强剂。例如,pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液;表面活性剂包括但不限于阳离子、阴离子或非离子表面活性剂,例如Tween-80;离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。
如本文所用,术语“佐剂”是指非特异性免疫增强剂,其在与抗原一起递送至生物体或被提前递送至生物体时可以增强生物体中的对抗原的免疫应答或改变免疫应答的类型。现有技术中存在多种佐剂,包括但不限于铝佐剂(例如氢氧化铝),弗氏佐剂(例如弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂),短小棒状杆菌,脂多糖,细胞因子等。弗氏佐剂是目前动物实验中最常用的佐剂。氢氧化铝佐剂更常用于临床试验。
HER2结合分子
在一些方面,本公开提供了一种HER2结合分子。HER2结合分子可以包括任何特异性结合HER2的分子。在一些情况下,“HER2结合分子”可以包括“HER2拮抗剂”。HER2结合分子或HER2拮抗剂可以是多肽或蛋白质,例如抗体,更具体地说是特异性结合HER2(如人HER2)的抗体。
如本文所述的抗体包括但不限于多特异性抗体、双特异性抗体、单特异性抗体、嵌合抗体、人源化抗体或全人抗体等。在一些具体的实施方案中,HER2结合分子是双特异性抗体,包含结合不同表位的第一和第二HER2结合结构域。所述第一和第二HER2结合结构域可以包含或者是分别在Fab两臂上的VH和VL、VHH、scFv等。在一些实施方案中,双特异性的HER2结合分子包含第一和第二HER2结合性Fab。在一些其他实施方案中,HER2结合分子是单特异性抗体,包含第一和第二HER2结合结构域中的一种。
在某些实施方案中,本文提供的双特异性抗体分子基于“完整”抗体的形式,例如完整IgG或IgG样分子。本申请也涵盖其他形式的双特异性抗体分子,例如具有附加抗原结合部分的IgG附加抗体,包含:IgG(H)-scFv;scFv-(H)IgG;IgG(L)-scFv;scFv-(L)IgG;IgG(L,H)-Fv;IgG(H)-V;V(H)-IgG;IgG(L)-V;V(L)-IgG。对于双特异性抗体形式的详细描述,请参见Spiess C.,Zhai Q.和Carter P.J.(2015)Molecular Immunology 67:95-106,其通过引用整体并入本文。
本公开的双特异性抗体或单特异性抗体能够以高亲和力结合人HER2。如本文公开的HER2可以衍生自人、小鼠、大鼠、食蟹猴等。HER2抗原可以表达为可溶性蛋白或在细胞表面表达。优选地,HER2蛋白是人HER2蛋白。
本公开的抗体对HER2的结合可使用本领域中确立的一种或多种技术来评估,例如通过使用重组HER2蛋白进行ELISA测定法,或者通过监测抗体对表达HER2蛋白的细胞的结合来测定。例如,可以通过流式细胞术测试抗体,其中使抗体与表达人HER2的细胞系(例如经过转染以在其细胞表面上表达HER2的CHO细胞)反应。另外或者备选地,可以在BIAcore结合测定法中测试抗体的结合,包括结合动力学(例如KD值)。在一些实施方案中,本公开的抗体能以0.1μg/ml或更低、0.09μg/ml或更低、0.08μg/mL或更低、0.07μg/mL或更低、0.06μg/mL或更低、0.05μg/mL或更低、0.04μg/mL或更低、0.03μg/mL或更低、0.025μg/mL或更低、0.02μg/mL或更低、或0.01μg/mL或更低的EC50结合人HER2蛋白,如通过ELISA测量的。
本文公开的人源化抗体可由本领域技术人员根据本领域已知的方法或任何未来的方法制备。例如,可以使用本领域已知的抗体(如曲妥珠单抗和帕妥珠单抗)作为亲本抗体或者通过免疫动物并从中鉴定与靶抗原结合并中和靶抗原的抗体,或者通过使用本领域已知的分子生物学技术制备文库,然后通过使用噬菌体展示进行筛选。
筛选技术如噬菌体展示和核糖体展示有助于鉴定结合抗原的克隆。其中噬菌体展示是在噬菌体上合成抗体文库(例如Fab文库),用感兴趣的抗原结合部分筛选文库,并分离结合抗原的噬菌体,从其中可以获得免疫反应性片段。用于制备和筛选这种文库的方法是本领域众所周知的,并且用于产生噬菌体展示文库的试剂盒可商购获得(例如,Pharmacia重组噬菌体抗体系统,目录号27-9400-01;以及Stratagene SurfZAPTM噬菌体展示试剂盒,目录号240612)。还有其他方法和试剂可用于产生和筛选抗体展示文库(参见例如Barbas等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:7978-7982(1991))。当最有效的克隆被鉴定出来后,可通过例如亲和力成熟或人源化优化其DNA序列,以防止人体对抗抗体的免疫反应。
在如本文公开的HER2结合分子的一些实施方案中,第一和第二HER2结合结构域与抗体的Fc区(例如IgG(例如IgG1或IgG4)的Fc区)融合。通过融合至Fc区,可以更有效地募集效应功能,例如ADCC和CDC。而且,与Fc区的融合可以帮助HER2结合分子形成二聚体,并且还可以帮助延长HER2结合分子的体内半衰期。
如本文所用,术语“抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用”或“ADCC”是指与某些细胞毒性效应细胞(例如天然杀伤(NK)细胞,嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的Fc受体(FcR)结合的分泌的抗体使这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合携带抗原的靶细胞并随后用细胞毒素杀死靶细胞的细胞毒性形式。抗体“武装”细胞毒性细胞对于这种杀伤是绝对需要的。介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达FcγRIII,而单核细胞表达FcγRI,FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达总结在Ravetch and Kinet,Annu.Rev.Immunol 9:457-92(1991)的464页中。为了评估感兴趣分子的ADCC活性,可以进行体外ADCC测定,例如美国专利US5500362或US5821337中所述的测定方法。可用于此类测定的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。可选或另外地,感兴趣分子的ADCC活性可以在体内评估,例如在如Clynes等人PNAS(USA)95:652-656(1998)公开的动物模型中评估。
HER2结合分子的CDR
在一些实施方案中,本公开的HER2结合分子包含两种HER2结合结构域,所述第一HER2结合结构域包含第一重链可变区(VH)和第一轻链可变区(VL),第二HER2结合结构域包含第二重链可变区(VH)和第二轻链可变区(VL),所述第一HER2结合结构域和第二HER2结合结构域具有相同的LCDR。
除了CDR以外,HER2结合结构域还包含框架区或具有一个或多个突变的框架区。例如,与人框架区序列相比,框架区可以包含一个或多个取代。取代可以是“回复突变”,例如其中一个或多个氨基酸被来自鼠抗体序列的等同残基取代。在一些实施方案中,第一HER2结合结构域和第二HER2结合结构域具有完全相同的VL。
在一些实施方案中,所述HER2结合分子在第一HER2结合结构域中包含:
包含SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1存在不超过2个氨基酸的添加、缺失或取代的差异的氨基酸序列的HCDR1,
包含SEQ ID NO:2或与SEQ ID NO:2存在不超过2个氨基酸的添加、缺失或取代的差异的氨基酸序列的HCDR2,
包含SEQ ID NO:3或与SEQ ID NO:3存在不超过2个氨基酸的添加、缺失或取代的差异的氨基酸序列的HCDR3;和
所述HER2结合分子在第二HER2结合结构域中包含:
包含SEQ ID NO:4或与SEQ ID NO:4存在不超过2个氨基酸的添加、缺失或取代的差异的氨基酸序列的HCDR1,
包含SEQ ID NO:5或与SEQ ID NO:5存在不超过2个氨基酸的添加、缺失或取代的差异的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:34)的HCDR2,
包含SEQ ID NO:6或与SEQ ID NO:6存在不超过2个氨基酸的添加、缺失或取代的差异的氨基酸序列的HCDR3;和
所述HER2结合分子在第一和第二HER2结合结构域中分别包含:
包含SEQ ID NO:7或与SEQ ID NO:7存在不超过2个氨基酸的添加、缺失或取代的差异的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:10、15或17)的LCDR1,
包含SEQ ID NO:8或与SEQ ID NO:8存在不超过2个氨基酸的添加、缺失或取代的差异的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:11、13、16、18、20或21)的LCDR2,和
包含SEQ ID NO:9或与SEQ ID NO:9存在不超过2个氨基酸的添加、缺失或取代的差异的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:12、14、19、22、23或24)的LCDR3。
在一些另外的实施方案中,所述HER2结合分子是单特异性抗体,其仅包含上述第一和第二HER2结合结构域中的一种。在一些具体的实施方案中,所述HER2结合分子包含选自下组的6个CDR:
包含SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1存在不超过2个氨基酸的添加、缺失或取代的差异的氨基酸序列的HCDR1,包含SEQ ID NO:2或与SEQ ID NO:2存在不超过2个氨基酸的添加、缺失或取代的差异的氨基酸序列的HCDR2,包含SEQ ID NO:3或与SEQ ID NO:3存在不超过2个氨基酸的添加、缺失或取代的差异的氨基酸序列的HCDR3;
包含SEQ ID NO:7或与SEQ ID NO:7存在不超过2个氨基酸的添加、缺失或取代的差异的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:10、15或17)的LCDR1,包含SEQ ID NO:8或与SEQ IDNO:8存在不超过2个氨基酸的添加、缺失或取代的差异的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:11、13、16、18、20或21)的LCDR2,和包含SEQ ID NO:9或与SEQ ID NO:9存在不超过2个氨基酸的添加、缺失或取代的差异的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:12、14、19、22、23或24)的LCDR3。
在一些备选的实施方案中,单特异性的HER2结合分子包含选自下组的6个CDR:
包含SEQ ID NO:4或与SEQ ID NO:4存在不超过2个氨基酸的添加、缺失或取代的差异的氨基酸序列的HCDR1,包含SEQ ID NO:5或与SEQ ID NO:5存在不超过2个氨基酸的添加、缺失或取代的差异的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:34)的HCDR2,包含SEQ ID NO:6或与SEQ ID NO:6存在不超过2个氨基酸的添加、缺失或取代的差异的氨基酸序列的HCDR3;
包含SEQ ID NO:7或与SEQ ID NO:7存在不超过2个氨基酸的添加、缺失或取代的差异的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:10、15或17)的LCDR1,包含SEQ ID NO:8或与SEQ IDNO:8存在不超过2个氨基酸的添加、缺失或取代的差异的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:11、13、16、18、20或21)的LCDR2,和包含SEQ ID NO:9或与SEQ ID NO:9存在不超过2个氨基酸的添加、缺失或取代的差异的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:12、14、19、22、23或24)的LCDR3。
本文中使用的表述“不超过2个氨基酸的添加、缺失或取代”包括2个氨基酸的取代,1个氨基酸的取代和1个氨基酸的添加,1个氨基酸的取代和1个氨基酸的缺失,1个氨基酸的缺失和1个氨基酸的添加,2个氨基酸的缺失,2个氨基酸的添加,1个氨基酸的取代,1个氨基酸的缺失,1个氨基酸的添加。优选地,分离的抗体或其抗原结合部分的CDR含有不多于2个氨基酸或不多于1个氨基酸的保守取代。
如本文所用,术语“保守取代”是指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白质/多肽的基本性质的氨基酸取代。例如,保守取代可以通过本领域已知的标准技术(例如定点诱变和PCR介导的诱变)引入。保守氨基酸取代包括其中氨基酸残基被具有相似侧链的另一氨基酸残基取代的取代,例如物理或功能相似的残基(例如具有相似的大小,形状,电荷,化学性质包括形成共价键或氢键的能力等)被相应的氨基酸残基的取代。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸,精氨酸和组氨酸),具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸和谷氨酸),具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸,天冬酰胺,谷氨酰胺,丝氨酸,苏氨酸,酪氨酸,半胱氨酸,色氨酸),具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸,缬氨酸,亮氨酸,异亮氨酸,脯氨酸,苯丙氨酸,甲硫氨酸),具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸,缬氨酸,异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如酪氨酸,苯丙氨酸,色氨酸,组氨酸)。因此,相应的氨基酸残基优选被来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基取代。用于鉴定氨基酸保守取代的方法在本领域中是公知的(参见例如Brummell等人,Biochem.32:1180-1187(1993);Kobayashi等人,ProteinEng.12(10):879-884(1999);和Burks等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:412-417(1997),其通过引用并入本文)。
本文中将氨基酸分配给每个CDR通常根据AbM定义方案来确定。具有相同VH和/或VL CDR的两个抗体是指其CDR在通过同一种方法(例如AbM、Kabat、Chothia或IMGT定义方案,如本领域已知的)来确定时是相同的。
在一些实施方案中,本文公开的HER2结合分子在HER2结合结构域中包含SEQ IDNO:41所示的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3以及SEQ ID NO:26-33所示的任一种氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、LCDR3。在一些实施方案中,本文公开的HER2结合分子在HER2结合结构域中包含SEQ ID NO:42或43所示的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3以及SEQ ID NO:26-33所示的任一种氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、LCDR3。在一些实施方案中,所述HER2结合分子在一个HER2结合结构域中包含SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3以及SEQ ID NO:26-33所示的任一种氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、LCDR3;且在另一个HER2结合结构域中包含SEQ ID NO:42或43所示的氨基酸序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3以及SEQ ID NO:26-33所示的任一种氨基酸序列的LCDR1、LCDR2、LCDR3。所述氨基酸序列的CDR可通过各种定义方案来确定。
抗体序列中的可变区和CDR可以根据本领域已经开发的一般规则(如上所述,例如AbM定义)或通过将序列与已知可变区的数据库比对来鉴定。在Kontermann和Dubel编,Antibody Engineering,Springer,New York,NY,2001和Dinarello等人,CurrentProtocols in Immunology,John Wiley and Sons Inc.,Hoboken,NJ,2000中描述了鉴定这些区域的方法。抗体序列的示例性数据库描述于并可获自www.bioinf.org.uk/abs上的“Abysis”网站(由Department of Biochemistry&Molecular Biology UniversityCollege London,London,England的A.C.Martin维护)和VBASE2网站www.vbase2.org,如Retter等人,Nucl.Acids Res.,33(Database issue):D671-D674(2005)中所述。优选使用Abysis数据库分析序列,其整合了来自Kabat、IMGT和蛋白质数据库(PDB)的序列数据与来自PDB的结构数据,参见Dr.Andrew C.R.Martin所著的书中的Protein Sequence andStructure Analysis of Antibody Variable Domains.In:Antibody Engineering LabManual,ISBN-13:978-3540413547,也可在网站bioinforg.uk/abs上获得。Abysis数据库网站还包括已经开发用于识别可以根据本文的教导使用的CDR的一般规则。
两个氨基酸序列之间的百分比同一性可以使用E.Meyers和W.Miller的算法(Comput.Appl.Biosci.,4:11-17(1988))确定,该算法已被并入ALIGN程序(版本2.0),使用PAM120权重残基表,空位长度罚分为12,空位罚分为4。另外,两个氨基酸序列之间的百分比同一性可以通过Needleman和Wunsch的算法(J.Mol.Biol.48:444-453(1970))确定,其已并入GCG软件包(可从http://www.gcg.com获得)中的GAP程序中,使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵,空隙权重为16、14、12、10、8、6或4,长度权重为1、2、3、4、5或6。
另外地或可选地,本发明的蛋白质序列可以进一步用作“查询序列”来执行针对公共数据库的搜索以例如识别相关序列。这种搜索可以使用Altschul,等人(1990)J.MoI.Biol.215:403-10的XBLAST程序(版本2.0)来执行。可用XBLAST程序进行BLAST蛋白质搜索,得分=50,字长=3,以获得与本发明的抗体分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对,可使用空位BLAST,如Altschul等人,(1997)Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402中所述的。当使用BLAST和空位BLAST程序时,可以使用各个程序(例如,XBLAST和NBLAST)的默认参数,参见www.ncbi.nlm.nih.gov。
在另一些实施方案中,HER2结合分子中包含的HCDR和LCDR的氨基酸序列可以与上文给出的各个序列至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同。
HER2结合分子的VH/VL序列
在一些实施方案中,本公开的HER2结合分子包含第一和第二HER结合结构域,其中所述第一HER结合结构域包含:
第一VH,包含以下或由以下组成:(a)如SEQ ID NO:41中所示的氨基酸序列;或(b)与SEQ ID NO:41至少85%、至少90%、或至少95%相同的氨基酸序列;或(c)与SEQ ID NO:41相比具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸的添加、缺失和/或取代的氨基酸序列;和
第一VL,包含以下或由以下组成:(a)如SEQ ID NO:26-33中任一项所示的氨基酸序列;或(b)与SEQ ID NO:26-33中任一项至少85%、至少90%、或至少95%相同的氨基酸序列;或(c)与SEQ ID NO:26-33中任一项相比具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸的添加、缺失和/或取代的氨基酸序列;
所述第二HER2结合结构域包含:
第二VH,包含以下或由以下组成:(a)如SEQ ID NO:42或43中所示的氨基酸序列;或(b)与SEQ ID NO:42或43至少85%、至少90%、或至少95%相同的氨基酸序列;或(c)与SEQ ID NO:42或43相比具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸的添加、缺失和/或取代的氨基酸序列;和
第二VL,包含以下或由以下组成:(a)如SEQ ID NO:26-33中任一项所示的氨基酸序列;或(b)与SEQ ID NO:26-33中任一项至少85%、至少90%、或至少95%相同的氨基酸序列;或(c)与SEQ ID NO:26-33中任一项相比具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸的添加、缺失和/或取代的氨基酸序列。
在一些具体的实施方案中,第一VL与第二VL相同。例如,所述HER2结合分子中包含的第一HER2结合结构域包含具有如SEQ ID NO:41中所示的氨基酸序列的第一VH和具有如SEQ ID NO:28中所示的氨基酸序列的第一VL,第二HER2结合结构域包含具有如SEQ ID NO:42或43中所示的氨基酸序列的第二VH和具有如SEQ ID NO:28中所示的氨基酸序列的第二VL。备选地,所述HER2结合分子中包含的第一HER2结合结构域包含具有如SEQ ID NO:41中所示的氨基酸序列的第一VH和具有如SEQ ID NO:30中所示的氨基酸序列的第一VL,第二HER2结合结构域包含具有如SEQ ID NO:42或43中所示的氨基酸序列的第二VH和具有如SEQID NO:30中所示的氨基酸序列的第二VL。
在其他实施方案中,所述VH或VL的氨基酸序列可以与上述各个序列至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同。作为说明性实例,抗体可以包含与SEQ ID NO:41、42或43具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的VH,和/或与SEQ ID NO:28具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的VL。
在某些实施方案中,第一HER2结合结构域包含3个HCDR序列和3个LCDR序列,与SEQID NOs:1-3和7-9的序列分别具有至少80%(例如,至少85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%)的序列同一性,并且同时保留与其亲本抗体(例如曲妥珠单抗)相似或甚至更高水平的对HER2的结合亲和力。
在某些实施方案中,第一HER2结合结构域包含VH和VL序列,其中VH序列与SEQ IDNO:41具有至少80%(例如,至少85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%)的序列同一性,VL序列与SEQ ID NO:28或30具有至少80%(例如,至少85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%)的序列同一性,并且同时保留与其亲本抗体(例如曲妥珠单抗)相似或甚至更高水平的对HER2的结合亲和力。在一些实施方案中,在如SEQ ID NO:41、28和/或30所示的可变区序列中取代、插入或缺失总共1至10个氨基酸。在一些实施方案中,取代、插入或缺失发生在CDR以外的区域中(例如,在FR中)。
在某些实施方案中,第二HER2结合结构域包含3个HCDR序列和3个LCDR序列,与SEQID NOs:4-6和7-9的序列分别具有至少80%(例如,至少85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%)的序列同一性,并同时保留与其亲本抗体(例如帕妥珠单抗)相似或甚至更高水平的对HER2的结合亲和力。
在某些实施方案中,第二HER2结合结构域包含VH和VL序列,其中VH序列与SEQ IDNO:42或43具有至少80%(例如,至少85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%)的序列同一性,VL序列与SEQ ID NO:28或30具有至少80%(例如,至少85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%)的序列同一性,并且同时保留与其亲本抗体相似或甚至更高水平的对PD-1的结合亲和力。在一些实施方案中,在如SEQ ID NO:42、43、28和/或30所示的可变区序列中取代、插入或缺失总共1至10个氨基酸。在一些实施方案中,取代、插入或缺失发生在CDR以外的区域中(例如,在FR中)。
本公开的HER2结合分子可以包含重链或轻链可变区中的氨基酸的保守取代或修饰。本领域理解的是,可以进行某些不消除抗原结合性质的保守序列修饰。参见例如Brummell等人(1993)Biochem 32:1180-8;de Wildt等人(1997)Prot.Eng.10:835-41;Komissarov等人(1997)J.Biol.Chem.272:26864-26870;Hall等人(1992)J.Immunol.149:1605-12;Kelley and O’Connell(1993)Biochem.32:6862-35;Adib-Conquy等人(1998)Int.Immunol.10:341-6和Beers等人(2000)Clin.Can.Res.6:2835-43。
在一些实施方案中,所述第一VH包含SEQ ID NO:41或由SEQ ID NO:41组成,所述第一VL包含SEQ ID NO:26-33中的任一项或由SEQ ID NO:26-33中的任一项组成;和第二VH包含SEQ ID NO:42或43或由SEQ ID NO:42或43组成,所述第二VL包含SEQ ID NO:26-33中的任一项或由SEQ ID NO:26-33中的任一项组成。
双特异性抗体的生成
本文中提供的双特异性HER2结合分子及其抗原结合部分可使用本领域中已知的任何适宜的方法来制备。一种常规的办法是将两对免疫球蛋白重链-轻链在宿主细胞中共表达从而以重组方式产生双特异性抗体(参见,例如Milstein和Cuello,Nature,305:537(1983)),然后通过亲和层析纯化。还可以将编码针对两种特异性的抗体重链可变域的序列分别与免疫球蛋白恒定域序列融合,然后插入表达载体,将该表达载体与轻链序列的表达载体共转染至适宜的宿主细胞,从而重组表达双特异性抗体(参见,例如WO 94/04690;Suresh等人,Methods in Enzymology,121:210(1986))。
Fc区
本公开的HER2结合分子的Fc区优选是人IgG Fc区,所述Fc区可以具有任何同种型,包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在某些实施方案中,Fc区为IgG1同种型。与野生型Fc区相比,Fc区可以包含一个或多个氨基酸改变(例如,插入,缺失或取代),而不改变所需的功能性。
在某些实施方案中,双特异性的HER2结合分子在Fc区的界面中包含一个或多个氨基酸取代,以协助和/或促进异二聚化。这些修饰包括将“把手”引入第一Fc多肽中和将“孔洞”引入第二Fc多肽中,其中“把手”可以位于“孔洞”中以促进第一和第二Fc多肽的相互作用而形成异二聚体或复合物。生成具有这些修饰的抗体的方法在本领域中是已知的,例如,如在美国专利号5,731,168中所述。这种修饰在本文中又称为“KIH突变”或“把手-孔洞结构”,其指的是组成双特异性抗体的两对轻重链对中,一对的重链的CH3区存在突变(例如T366W)形成一个突起的“把手”的结构,另一对的重链的CH3区存在突变(例如T366S、L368A、Y407V)形成一个凹陷的“孔洞”的结构,该结构设计有利于两种异源抗体重链的正确装配。
此外,本公开还包括,例如在Fc区中包含一个或多个修饰,其导致在Fc与FcRn之间具有修饰的结合相互作用(例如增强或减弱)的修饰的Fc区。此类Fc修饰的非限制性实例包括例如在人IgG4 Fc区的氨基酸序列的位置228上丝氨酸(“S”)突变为脯氨酸(“P”)。当指免疫球蛋白重链恒定区中的残基时,通常使用“EU编号系统”或“EU索引”(例如,Kabat等人报道的EU索引,见上文)。“Kabat中的EU编号”或“Kabat中的EU索引”是指人IgG1 EU抗体的残基编号。除非本文另有说明,否则在抗体恒定结构域中提及残基编号是指通过EU编号系统的残基编号。
工程化抗体分子以改善与FcRn的结合亲和力的方法在本领域中是众所周知的,参见,例如,Vaughn,D.等人,Structure,6(1):63-73,1998;Kontermann,R.等人,AntibodyEngineering,Volume 1,Chapter 27:Engineering of the Fc region for improved PK,published by Springer,2010;Yeung,Y.等人,Cancer Research,70:3269-3277(2010);和Hinton,P.等人,J.Immunology,176:346-356(2006)。
在某些实施方案中,抗原结合结构域和双特异性抗体分子包含一个或多个改变抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的氨基酸取代。可以取代在Fc区(例如在CH2结构域)的某些氨基酸残基以提供改变的(例如增强的、降低的或耗尽的)ADCC活性。备选地或另外地,可以改变抗体上的碳水化合物结构以改变(例如增强、降低或消耗)ADCC活性。通过抗体工程化来改变ADCC活性的方法已经在本领域中进行了描述,参见例如Shields RL.等人,J BiolChem.2001.276(9):6591-604;Idusogie EE.等人,JImmunol.2000.164(8):4178-84;Steurer W.等人,J Immunol.1995,155(3):1165-74;Idusogie EE.等人,J Immunol.2001,166(4):2571-5;Lazar GA.等人,PNAS,2006,103(11):4005-4010;Ryan MC.等人,Mol.Cancer Ther.,2007,6:3009-3018;Richards JO,.等人,Mol Cancer Ther.2008,7(8):2517-27;Shields R.L.等人,J.Biol.Chem,2002,277:26733-26740;Shinkawa T.等人,J.Biol.Chem,2003,278:3466-3473。
编码本公开的抗体的核酸分子
在一些方面,本发明涉及分离的核酸分子,其包含编码本公开的HER2结合分子或其可变区片段的核酸序列。
本发明的核酸可以使用标准分子生物学技术获得。对于从免疫球蛋白基因文库获得的抗体(例如,使用噬菌体展示技术),编码这种抗体的核酸可以从基因文库中回收。
可以使用本领域已知的重组技术将编码本公开的HER2结合分子的核酸分子插入载体以进一步克隆(扩增DNA)或用于表达。许多载体是可用的。载体或载体组分通常包括但不限于以下一种或多种:信号序列,复制起点,一个或多个标记基因,增强子元件,启动子(例如SV40,CMV,EF-1α),和转录终止序列。选择标记基因有助于选择导入了载体的宿主细胞(参见例如美国专利号4,399,216;4,634,665和5,179,017)。例如,通常选择标记基因赋予载体已经导入其中的宿主细胞对药物(例如G418,潮霉素或甲氨蝶呤)的抗性。在一个实施方案中,选择标记基因可以包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于具有甲氨蝶呤选择/扩增的dhfr-宿主细胞)和neo基因(用于G418选择)。在另一个实施方案中,抗体可以通过本领域已知的同源重组产生。编码单克隆抗体的DNA易于使用常规方法分离和测序(例如,通过使用能够与编码抗体重链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。
在一些实施方案中,载体系统包括哺乳动物、细菌、酵母系统等,并包括质粒,例如,但不限于,pALTER、pBAD、pcDNA、pCal、pL、pET、pGEMEX、pGEX、pCI、pCMV、pEGFP、pEGFT、pSV2、pFUSE、pVITRO、pVIVO、pMAL、pMONO、pSELECT、pUNO、pDUO、Psg5L、pBABE、pWPXL、pBI、p15TV-L、pPro18、pTD、pRS420、pLexA、pACT2.2等等,以及其他实验室和商业可用的载体。合适的载体可以包括质粒或病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒,腺病毒和腺伴随病毒)。在本发明的一个实施方案中,载体可以是pET,例如含有六组氨酸标签和c-Myc-标签基因的pETbac。
包含编码本公开的HER2结合分子的核酸序列的载体可以被引入宿主细胞用于克隆或基因表达。用于在本文的载体中克隆或表达DNA的合适宿主细胞是原核生物、酵母或高等真核生物细胞。用于该目的的合适原核生物包括真细菌,例如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体,例如肠杆菌科如埃希氏菌属,例如大肠杆菌,肠杆菌属,欧文氏菌属,克雷伯氏菌属,变形杆菌属,沙门氏菌属,例如鼠伤寒沙门氏菌,沙雷氏菌属,例如粘质沙雷氏菌和志贺氏菌,以及芽孢杆菌属如枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌,假单胞菌属如铜绿假单胞菌和链霉菌。
除了原核生物以外,真核微生物如丝状真菌或酵母是合适的用于表达本公开的HER2结合分子的宿主细胞。酿酒酵母或普通面包酵母是低等真核宿主微生物中最常用的。然而,许多其它属、种和菌株通常是可获得的并且可用于本发明,例如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe);克鲁维酵母属(Kluyveromyces)宿主,例如乳克鲁维酵母(K.lactis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC 12,424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)、威克曼氏克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC 24,178)、K.waltii(ATCC 56,500)、果蝇克鲁维酵母(K drosophilarum)(ATCC 36,906)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)和马克斯克鲁维氏酵母(K.marxianus);西洋蓍霉(yarrowia)(EP402,226);巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)(EP 183,070);念珠菌属(Candida);Trichoderma reesia(EP 244,234);粗糙链孢霉(Neurospora crassa);许旺氏酵母属(schwanniomyces)如西方许旺氏酵母(schwanniomyces occidentalis);和丝状真菌,例如链孢霉属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、Tolypocladium以及曲霉属宿主如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。
用于表达本公开的HER2结合分子的其他合适的宿主细胞来源于多细胞生物体。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。目前已经从下述宿主中鉴定了大量的杆状病毒株和变体以及相应的容许型昆虫宿主细胞:草地夜蛾(Spodoptera Frugiperda,毛虫)、埃及伊蚊(Aedes aegypti,蚊子)、白纹伊蚊(Aedes albopictus,蚊子)、Drosophilamelanogaster(果蝇)和家蚕蛾(Bombyx mori)。用于转染的各种病毒株是公众可获得的,例如苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)NPV的L-1变体和家蚕NPV的Bm-5株,并且根据本公开,这些病毒可以用于HER2结合分子在合适的宿主细胞中表达的转染过程,特别是用于转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。棉花、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛花、番茄和烟草的植物细胞培养物也可用作宿主。
以上述用于本公开的HER2结合分子产生的载体转化宿主细胞,并在用于诱导启动子、选择转化体或扩增编码所需序列的基因的根据需要修改的常规营养培养基中培养。
用于产生本公开的HER2结合分子的宿主细胞可以在各种培养基中培养。诸如Ham's F10(Sigma),Minimal Essential Medium(MEM),(Sigma),RPMI-1640(Sigma)和Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM,Sigma)的商业上可获得的培养基适于培养宿主细胞。此外,Ham等人.,Meth.Enz.58:44(1979),Barnes等人.,Anal.Biochem.102:255(1980),U.S.Pat.No.4,767,704;4,657,866;4,927,762;4,560,655;或5,122,469;WO 90/03430;WO 87/00195;或U.S.Pat.Re.30,985中描述的任何培养基可用作宿主细胞的培养基。必要时可以用激素和/或其他生长因子(如胰岛素,转铁蛋白或表皮生长因子),盐(如氯化钠,钙,镁和磷酸盐),缓冲液(如HEPES),核苷酸(如腺苷和胸腺嘧啶),抗生素(如GENTAMYCIN药物),微量元素(定义为无机化合物,通常以微摩尔范围内的终浓度存在)和葡萄糖或等同能量来源添加至任何这些培养基。任何其他必需的补充剂也可以以本领域技术人员已知的适当浓度包含在内。诸如温度、pH等培养条件是与之前选择用于表达的宿主细胞一起使用的那些,并且对普通技术人员而言将是明显的。
当使用重组技术时,抗体可以在细胞内,在周质空间中产生,或者直接分泌到培养基中。如果抗体在细胞内产生,作为第一步,例如通过离心或超滤除去微粒碎片(宿主细胞或裂解片段)。Carter等人,Bio/Technology 10:163-167(1992)描述了分离分泌到大肠杆菌周质空间的抗体的方法。简而言之,在约30分钟内,在乙酸钠(pH 3.5),EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)的存在下融化细胞。细胞碎片可以通过离心去除。在抗体分泌到培养基中的情况下,通常首先使用市售的蛋白质浓缩过滤器,例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元浓缩来自这种表达系统的上清液。蛋白酶抑制剂例如PMSF可包括在任何前述步骤中以抑制蛋白水解,并可包含抗生素以防止外来污染物的生长。
可以使用例如羟基磷灰石层析,凝胶电泳,透析,DEAE-纤维素离子交换层析,硫酸铵沉淀,盐析和亲和层析来纯化从细胞制备的抗体,其中亲和层析是优选的纯化技术。在任何初步纯化步骤之后,包含目标抗体和污染物的混合物可以使用pH介于约2.5-4.5之间的洗脱缓冲液进行低pH疏水相互作用色谱,优选在低盐浓度(例如约0-0.25M盐)下进行。
药物组合物
在一些方面,本发明涉及药物组合物,其包含至少一种如本文所公开的HER2结合分子(例如,本公开的HER2结合分子)和药学上可接受的载体。
药物组合物的组分
药物组合物可以任选地含有一种或多种另外的药物活性成分,例如另一种抗体或药物。本发明的药物组合物还可以与例如另一种免疫刺激剂、抗癌剂、抗病毒剂或疫苗组合施用,使得HER2结合分子增强对疫苗的免疫反应。药学上可接受的载体可以包括例如药学上可接受的液体,凝胶或固体载体,水性介质,非水性介质,抗微生物剂,等渗剂,缓冲剂,抗氧化剂,麻醉剂,悬浮/分散剂,螯合剂,稀释剂,佐剂,赋形剂或无毒的辅助物质,本领域已知的各种组分的组合或更多。
合适的组分可以包括例如抗氧化剂,填充剂,粘合剂,崩解剂,缓冲剂,防腐剂,润滑剂,调味剂,增稠剂,着色剂,乳化剂或稳定剂如糖和环糊精。合适的抗氧化剂可包括例如甲硫氨酸,抗坏血酸,EDTA,硫代硫酸钠,铂,过氧化氢酶,柠檬酸,半胱氨酸,巯基甘油,巯基乙酸,巯基山梨糖醇,丁基甲基苯甲醚,丁基化羟基甲苯和/或没食子酸丙酯。如本发明所公开的,在包含还原抗体或其抗原结合片段的一种或多种抗氧化剂如甲硫氨酸的含有本发明公开的组合物的抗体或抗原结合片段的溶剂中,其可被氧化。氧化还原可防止或减少结合亲和力的降低,从而增强抗体稳定性并延长保质期。因此,在一些实施方案中,本发明提供了包含一种或多种抗体或其抗原结合片段和一种或多种抗氧化剂如甲硫氨酸的组合物。本发明进一步提供了多种方法,其中将抗体或其抗原结合片段与一种或多种抗氧化剂如甲硫氨酸混合。从而,抗体或其抗原结合片段可以被防止氧化,以延长其保质期和/或增加活性。
为了进一步说明,药学上可接受的载体可以包括例如水性载体,例如氯化钠注射液,林格氏注射液,等渗右旋糖注射液,无菌水注射液或右旋糖和乳酸林格氏注射液,非水性载体如植物来源的固定油,棉籽油,玉米油,芝麻油或花生油,抑菌剂或抑真菌浓度的抗微生物剂,等渗剂如氯化钠或葡萄糖,缓冲剂如磷酸盐或柠檬酸盐缓冲剂,抗氧化剂如硫酸氢钠,局部麻醉剂如盐酸普鲁卡因,悬浮剂和分散剂如羧甲基纤维素钠,羟丙基甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮,乳化剂如聚山梨酯80(TWEEN-80),螯合剂如EDTA(乙二胺四乙酸)或EGTA(乙二醇四乙酸),乙醇,聚乙二醇,丙二醇,氢氧化钠,盐酸,柠檬酸或乳酸。用作载体的抗微生物剂可以添加到包含酚或甲酚、汞制剂、苯甲醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、硫柳汞、苯扎氯铵和苄索氯铵的多剂量容器中的药物组合物中。合适的赋形剂可以包括例如水,盐水,右旋糖,甘油或乙醇。合适的无毒辅助物质可以包括例如润湿剂或乳化剂,pH缓冲剂,稳定剂,溶解度增强剂或诸如乙酸钠,脱水山梨糖醇单月桂酸酯,三乙醇胺油酸酯或环糊精的试剂。
施用、制剂和剂量
本发明的药物组合物可以通过各种途径体内施用至有需要的受试者,所述途径包括但不限于口服,静脉内,动脉内,皮下,肠胃外,鼻内,肌内,颅内,心内,心室内,气管内,口腔,直肠,腹膜内,皮内,局部,经皮和鞘内,或者通过植入或吸入。本发明的药物组合物可以配制成固体、半固体、液体或气体形式的制剂;包括但不限于片剂,胶囊剂,粉剂,颗粒剂,软膏剂,溶液剂,栓剂,灌肠剂,注射剂,吸入剂和气雾剂。根据预期的应用和治疗方案可以选择合适的制剂和施用途径。
用于肠内施用的合适制剂包括硬或软的明胶胶囊,丸剂,片剂,包括包衣片剂,酏剂,混悬剂,糖浆剂或吸入剂及其控释剂型。
适用于肠胃外施用(例如通过注射)的制剂包括活性成分溶解、悬浮于其中或以其他方式提供的(例如,在脂质体或其他微粒中)的水性或非水性、等渗、无热原、无菌液体(例如溶液,混悬液)。这些液体可以另外含有其它药学上可接受的成分,例如抗氧化剂,缓冲剂,防腐剂,稳定剂,抑菌剂,悬浮剂,增稠剂和使制剂与预期接受者的血液(或其他相关体液)等渗的溶质。赋形剂的实例包括例如水,醇,多元醇,甘油,植物油等。适用于此类制剂的等渗载体的实例包括氯化钠注射液,林格溶液或乳酸林格氏注射液。类似地,特定剂量方案(即剂量,时间和重复)将取决于具体个体和个体的病史以及诸如药代动力学(例如半衰期,清除率等)的经验考虑。
施用频率可以在治疗过程中确定和调整,并且基于减少增殖或致瘤细胞的数量,维持这种肿瘤细胞的减少,减少肿瘤细胞的增殖或延迟转移的发展。在一些实施方案中,施用的剂量可以被调节或减少以控制潜在的副作用和/或毒性。或者,本发明的用于治疗的药物组合物的持续连续释放制剂可能是合适的。
本领域技术人员将会理解,合适的剂量可因患者而异。确定最佳剂量通常涉及治疗益处水平与任何风险或有害副作用的平衡。所选择的剂量水平将取决于多种因素,包括但不限于特定化合物的活性,施用,施用时间,化合物清除速率,治疗持续时间,其他联合使用的药物、化合物和/或材料,病症的严重程度,以及物种,患者的性别、年龄、体重、病情、一般健康状况和以前的病史。化合物的量和施用途径最终由医生、兽医或临床医师决定,但通常选择剂量以达到实现所需效果的作用部位处的局部浓度,而不会导致实质性的有害或不利副作用。
通常,HER2结合分子可以以各种剂量范围施用。在一些实施方案中,本文提供的HER2结合分子可以以约0.01mg/kg至约100mg/kg(例如约0.01mg/kg、约0.5mg/kg、约1mg/kg、约2mg/kg、约5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、约35mg/kg、约40mg/kg、约45mg/kg、约50mg/kg、约55mg/kg、约60mg/kg、约65mg/kg、约70mg/kg、约75mg/kg、约80mg/kg、约85mg/kg、约90mg/kg、约95mg/kg、或约100mg/kg)的治疗有效剂量施用。在这些实施方案的某些中,抗体以约50mg/kg或更低的剂量施用,并且在这些实施方案中的某些中,剂量为10mg/kg或更低,5mg/kg或更低,1mg/kg或更低,0.5mg/kg或更低,或者0.1mg/kg或更低。在某些实施方案中,施用剂量可以在治疗过程中改变。例如,在某些实施方案中,初始施用剂量可以高于后续施用剂量。在某些实施方案中,取决于受试者的反应,施用剂量可以在治疗过程中变化。
无论如何,本发明的抗体或其抗原结合部分优选根据需要施用于有需要的受试者。本领域技术人员可以确定施用频率,例如主治医生基于所治疗病症、所治疗受试者的年龄、所治疗病症的严重程度、所治疗受试者的一般健康状况等的考虑。
在某些优选的实施方案中,涉及本发明的抗体或其抗原结合部分的治疗过程将包含在数周或数月的时间内施用的多剂量的所选药物产品。更具体地说,本发明的抗体或其抗原结合部分可以每天,每两天,每四天,每周,每十天,每两周,每三周,每月,每六周,每两个月,每十周或每三个月施用。就此而言,可以理解的是,可以基于患者响应和临床实践来改变剂量或者调整间隔。
在给予一次或多次施用的个体中也可凭经验确定所公开的用于治疗的药物组合物的剂量和方案。例如,可给予个体增量剂量的如本文所述的药物组合物。在选定的实施方案中,剂量可分别根据经验确定,或根据观察到的副作用或毒性逐渐增加或减少。为了评估所选择的组合物的功效,可以跟踪特定疾病、病症或病情的标志物。对于癌症,这些包括通过触诊或视觉观察直接测量肿瘤大小,通过X射线或其他成像技术间接测量肿瘤大小;通过直接肿瘤活组织检查和肿瘤样本的显微镜检查评估的改善;测量根据本文所述方法鉴定的间接肿瘤标志物(例如用于前列腺癌的PSA)或致瘤性抗原,疼痛或麻痹的减轻;与肿瘤相关的言语、视力、呼吸或其他失能的改善;食欲增加;或通过接受的测试测量的生活质量的提高或生存期的延长。本领域技术人员将明白,剂量将根据个体、肿瘤病情的类型、肿瘤病情的阶段、肿瘤病情是否已开始转移至个体中的其他位置以及过去使用的治疗和并行使用的治疗而变化。
用于肠胃外施用(例如静脉内注射)的相容制剂可包含浓度为约10μg/mL至约100mg/mL的如本文提供的HER2结合分子。在一些实施方案中,HER2结合分子的浓度可包括20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL、500μg/mL、600μg/mL、700μg/mL、800μg/mL、900μg/mL或1mg/mL。在其他优选的实施方案中,HER2结合分子的浓度将包括2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、8mg/mL、10mg/mL、12mg/mL、14mg/mL、16mg/mL、18mg/mL、20mg/mL、25mg/mL、30mg/mL、35mg/mL、40mg/mL、45mg/mL、50mg/mL、60mg/mL、70mg/mL、80mg/mL、90mg/mL或100mg/mL。若以摩尔浓度计算,在一些实施方案中,HER2结合分子的浓度可包括例如133nM、266nM、400nM、533nM、667nM、1.3μM、2μM、2.67μM、3.33μM、4μM、4.67μM、5.33μM、6μM或6.67μM。
本发明的应用
本发明的HER2结合分子具有许多体外和体内用途。
治疗疾病
与HER2相关的病症和障碍可以是与免疫相关的疾病或病症,包括但不限于“涉及表达HER2的细胞的疾病”或“与表达HER2的细胞相关的疾病”或类似表述,意指HER2在患病组织或器官的细胞中表达。在一个实施方案中,与对应健康组织或器官中的状态相比,HER2在患病组织或器官的细胞中的表达提高。提高是指提高至少10%,特别地至少20%、至少50%、至少100%、至少200%、至少500%、至少1000%、至少10000%或甚至更多。在一个实施方案中,表达仅见于患病组织,而相应健康组织中的表达被抑制。根据本发明,与表达HER2的细胞相关的疾病包括癌症疾病。此外,根据本发明,癌症疾病优选为其中癌细胞表达HER2的那些。
术语“癌症疾病”或“癌症”是指或描述个体中通常以不受调节的细胞生长为特征的生理状况。癌症的实例包括但不限于乳腺癌、卵巢癌、胃癌、上皮癌、淋巴瘤、母细胞瘤和白血病。更特别地,这样的癌症的实例包括骨癌、血癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、子宫癌、性器官和生殖器官癌、霍奇金病(Hodgkin′sDisease)、食管癌、小肠癌、内分泌系统癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、膀胱癌、肾癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、神经外胚层癌症、脊柱轴肿瘤、胶质瘤、脑脊膜瘤和垂体腺瘤。根据本发明的术语“癌症”还包括癌症转移。优选地,“癌症疾病”的特征在于表达HER2的细胞,以及癌细胞表达HER2。表达HER2的细胞优选是癌细胞,优选本文中所述的癌症的癌细胞。
根据本公开,术语“肿瘤”或“肿瘤疾病”是指细胞(被称为赘生性细胞、肿瘤发生性细胞或肿瘤细胞)的异常生长,优选形成肿胀或病变。“肿瘤细胞”意指通过迅速的不受控制的细胞增殖而生长并且在引发新生长的刺激停止之后继续生长的异常细胞。肿瘤显示出结构组织和与正常组织的功能协调的部分或完全缺失,并且通常形成独特的组织团块,其可以是良性的、恶化前的或恶性的。根据本发明,“癌症疾病”优选为“肿瘤疾病”。然而,通常术语“癌症”和“肿瘤”在本文中可互换使用。
在一个实施方案中,根据本公开的癌症涉及表达HER2的癌细胞。在一个实施方案中,癌症是HER2阳性的。在一个实施方案中,HER2的表达是位于细胞的表面。在一个实施方案中,至少50%,优选60%、70%、80%或90%的癌细胞是HER2阳性的,和/或至少40%,优选至少50%的癌细胞对HER2的表面表达呈阳性。在一个实施方案中,至少95%或至少98%的癌细胞是HER2阳性的。在一个实施方案中,至少60%、至少70%、至少80%或至少90%的癌细胞对于HER2的表面表达是阳性的。
在一个实施方案中,表达HER2的癌症、涉及表达HER2的癌细胞的癌症或HER2阳性癌症选自:乳腺癌、卵巢癌、胃癌、食管癌、胰腺癌、肺癌(例如非小细胞肺癌(NSCLC))、结肠癌、肝癌、头颈癌和胆囊癌,及其转移。在一个实施方案中,癌症是腺癌,特别是晚期腺癌。特别优选的癌症疾病是乳腺、卵巢、胃、食管、胰管、胆管的癌症。在一个实施方案中,癌症选自乳腺癌、卵巢癌和胃癌。在一个特别优选的实施方案中,癌症是乳腺癌,例如转移性、顽固性或复发性晚期乳腺癌。
此外,本公开的抗体或其抗原结合部分可以与化学疗法或放射疗法组合使用。
与化疗组合使用
抗体或其抗原结合部分可以与抗癌剂、细胞毒性剂或化学治疗剂组合使用。
术语“抗癌剂”或“抗增殖剂”意指可用于治疗细胞增殖性病症例如癌症的任何药剂,并且包括但不限于细胞毒性剂,细胞抑制剂,抗血管生成剂,放射疗法和放射治疗剂,靶向抗癌剂,BRM,治疗性抗体,癌症疫苗,细胞因子,激素疗法,放射疗法和抗转移剂和免疫治疗剂。应该理解的是,在如上所述的选定实施方案中,此类抗癌剂可以包含缀合物并且可以在施用之前与公开的位点特异性抗体结合。更具体而言,在一些实施方案中,将选择的抗癌剂连接至工程化抗体的不配对半胱氨酸以提供如本文所述的工程化偶联物。因此,这样的工程化缀合物被明确地考虑在本发明的范围内。在其他实施方案中,所公开的抗癌剂将与包含如上所述的不同治疗剂的位点特异性缀合物组合施用。
如本文所用,术语“细胞毒性剂”是指对细胞有毒并降低或抑制细胞功能和/或引起细胞破坏的物质。在一些实施方案中,该物质是源自活生物体的天然存在的分子。细胞毒性剂的实例包括但不限于细菌(例如,白喉毒素,假单胞菌内毒素和外毒素,葡萄球菌肠毒素A),真菌(例如α-八叠球菌素,局限曲霉素),植物(相思豆毒蛋白,蓖麻毒素,蒴莲根毒素,槲寄生素,美洲商陆抗病毒蛋白,皂草素,白树毒素,momoridin,天花粉蛋白,大麦毒素,油桐(Aleurites fordii)蛋白,石竹素蛋白,Phytolacca mericana蛋白(PAPI,PAPII和PAP-S),苦瓜抑制剂,麻风树毒蛋白,巴豆毒素,石碱草抑制剂,白树毒素,mitegellin,局限曲霉素,酚霉素,新霉素和单端孢霉烯族化合物)或动物(例如细胞毒性RNA酶,如胞外胰腺RNA酶;DNA酶I,包括其片段和/或变体)的小分子毒素或酶促活性毒素。
为了本发明的目的,“化学治疗剂”包括非特异性降低或抑制癌细胞的生长、增殖和/或存活的化学化合物(例如细胞毒性剂或细胞抑制剂)。这些化学试剂通常针对细胞生长或分裂所需的细胞内过程,因此对于通常快速生长和分裂的癌细胞特别有效。例如,长春新碱使微管解聚,从而抑制细胞进入有丝分裂。通常,化学治疗剂可以包括抑制或被设计用于抑制癌细胞或可能变成性或产生致瘤后代(例如TIC)的细胞的任何化学药剂。这些药剂通常是组合使用的,并且通常是最有效的,例如,在诸如CHOP或FOLFIRI的方案中。
可以与本发明的位点特异性构建体组合使用的抗癌剂(作为位点特异性缀合物的组分或未缀合状态)的实例包括但不限于烷化剂、烷基磺酸盐、氮丙啶、乙烯亚胺和甲基三聚氰胺、多聚乙酰(acetogenins)、喜树碱、苔藓抑素、卡利士他汀(callystatin)、CC-1065、克瑞托欣(cryptophycins)、多拉司他汀、多卡米星、艾榴素(eleutherobin)、水鬼蕉碱、沙克迪因(sarcodictyin)、海绵素(spongistatin)、氮芥、抗生素、烯二炔类抗生素、dynemicin、双膦酸盐、埃斯波霉素、色素蛋白烯二炔抗生素发色团、阿克拉霉素类(aclacinomysins)、放线菌素、安曲霉素、偶氮丝氨酸、博莱霉素、放线菌素C、卡拉宾辛(carabicin)、洋红霉素、嗜癌霉素、色霉素类(chromomycinis)、更生霉素、柔红霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培洛霉素、博地霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑菌素、链脲菌素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星;抗-代谢物、埃罗替尼、威罗菲尼、克唑替尼、索拉非尼、依鲁替尼、恩杂鲁胺、叶酸类似物、嘌呤类似物、雄激素、抗-肾上腺素、叶酸补充剂如弗林酸(frolinic acid)、醋葡醛内酯、醛磷酰胺糖苷、氨基乙酰丙酸、恩尿嘧啶、安吖啶、贝斯布希(bestrabucil)、比生群、依达曲沙、迪夫法明(defofamine)、秋水仙胺、地吖醌、艾夫尼辛(elfornithine)、依利醋铵、爱波喜龙、依托格鲁、硝酸镓、羟基脲、香菇多糖、氯尼达明、美坦生类化合物(maytansinoids)、米托胍腙、米托蒽醌、莫丹摩尔(mopidanmol)、尼特林(nitraerine)、喷司他丁、蛋氨氮芥、吡柔比星、洛索蒽醌、鬼臼酸、2-乙基肼、丙卡巴肼、多糖复合物(JHS Natural Products,Eugene,OR)、雷佐生;根霉素;西佐喃;锗螺胺;替奴佐酸;三亚胺醌;2,2',2”-三氯三乙胺;单端孢霉烯类(尤其是T-2毒素、维拉库林A(verracurin A)、杆孢菌素A和蛇形菌素);乌拉坦;长春地辛;达卡巴嗪;甘露莫司汀;二溴甘露醇;二溴卫矛醇;哌泊溴烷;卡西托欣(gacytosine);阿拉伯糖苷(“Ara-C”);环磷酰胺;噻替派;紫杉烷类;苯丁酸氮芥(chloranbucil);/>吉西他滨;6-硫代鸟嘌呤;巯嘌呤;氨甲喋呤;铂类似物;长春碱;铂;依托泊苷(VP-16);异环磷酰胺;米托蒽醌;长春新碱,/>长春瑞滨;诺消灵;替尼泊苷;依达曲沙;柔红霉素;氨基蝶呤;希罗达;伊班膦酸盐;伊立替康(Camptosar,CPT-11);拓扑异构酶抑制剂RFS 2000;二氟甲基鸟氨酸;类视色素;卡培他滨;考布他汀;甲酰四氢叶酸;奥沙利铂;PKC-α、Raf、H-Ras、EGFR和VEGF-A的抑制剂(其减少细胞增殖),以及上述任一项的药学上可接受的盐、酸或衍生物。这一定义中还包括用于调节或抑制对肿瘤的激素作用的抗激素剂,诸如抗雌激素和选择性雌激素受体调节剂,抑制调节肾上腺中的雌激素产生的芳香酶的芳香酶抑制剂,和抗-雄激素;以及曲沙他滨(1,3-二氧杂环戊烷核苷胞嘧啶类似物);反义寡核苷酸、核酶诸如VEGF表达抑制剂和HER2表达抑制剂;疫苗,/>rIL-2;/>拓扑异构酶1抑制剂;/>rmRH;长春瑞滨和埃斯波霉素,以及上述任一项的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
与放射疗法组合使用
本发明还提供了抗体或其抗原结合部分与放射疗法(即,用于在肿瘤细胞内局部诱导DNA损伤的任何机制,例如γ-照射,X-射线,UV-照射,微波,电子发射等)的组合。还考虑了使用放射性同位素至肿瘤细胞的定向递送的联合疗法,并且所公开的抗体可以与靶向的抗癌剂或其他靶向手段结合使用。通常,放射疗法在约1周至约2周的时间段内以脉冲方式施用。放射疗法可以对患有头颈癌的受试者施用约6至7周。任选地,放射疗法可以作为单剂量或作为多个顺序剂量施用。
诊断
本发明提供了用于检测、诊断或监测增殖性病症的体外和体内方法以及筛选来自患者的细胞以鉴定肿瘤细胞包括致瘤细胞的方法。这样的方法包括鉴定用于治疗的患有癌症的个体或监测癌症的进展,包括将患者或从患者获得的样品(体内或体外)与本文所述的抗体接触,并检测样品中与结合的或游离的靶分子的结合的抗体的存在或不存在或结合水平。在一些实施方案中,抗体将包含可检测标记或报道分子。
在一些实施方案中,抗体与样品中特定细胞的结合可表示样品可能含有致瘤细胞,从而表明具有癌症的个体可用本文所述的抗体有效治疗。
可以通过多种测定法分析样品,例如放射免疫测定法,酶免疫测定法(例如ELISA),竞争结合测定法,荧光免疫测定法,免疫印迹测定法,Western印迹分析和流式细胞术测定法。兼容的体内诊断或诊断测定可以包括本领域公知的成像或监测技术,例如本领域技术人员已知的磁共振成像,计算机化断层摄影(例如CAT扫描),正电子断层扫描(例如PET扫描),放射线照相术,超声波等。
药物包装和试剂盒
本发明还提供了包含一个或多个剂量的抗体或其抗原结合部分的一个或多个容器的药物包装和试剂盒。在一些实施方案中,提供单位剂量,其中单位剂量含有预定量的组合物,所述组合物包含例如抗体或其抗原结合部分,具有或不具有一种或多种其他试剂。对于其他实施方案,这种单位剂量以一次性使用的预充式注射用注射器供应。在其他实施方案中,单位剂量中包含的组合物可以包含盐水、蔗糖或类似物;缓冲液,如磷酸盐等;和/或配制在稳定和有效的pH范围内。或者,在一些实施方案中,所述组合物是缀合物组合物,其可以作为冻干粉末提供并在加入合适的液体(例如无菌水或盐溶液)后重建。容器上或与容器相关联的任何标签指示封装的组合物用于治疗选择的肿瘤疾病状况。在一些优选的实施方案中,组合物包含一种或多种抑制蛋白质聚集的物质,包括但不限于蔗糖和精氨酸。
本发明还提供了用于产生位点特异性抗体以及任选地一种或多种抗癌剂的单剂量或多剂量施用单元的试剂盒。该试剂盒包括容器以及在容器上或与容器相关联的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶,小瓶,注射器等。容器可以由多种材料形成,例如玻璃或塑料,并且包含药学有效量的所公开的缀合或非缀合形式的HER2结合分子。在其他优选实施例中,容器包括无菌存取口(例如容器可以是静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针头刺穿的塞子的小瓶)。这样的试剂盒通常在合适的容器中包含工程化偶联物的药学上可接受的制剂,并且任选地在相同或不同的容器中包含一种或多种抗癌剂。试剂盒还可以含有其他药学上可接受的制剂,用于诊断或组合治疗。例如,除了本发明的抗体或其抗原结合部分之外,这样的试剂盒可以含有任何一种或多种抗癌剂,例如化学治疗剂或放射治疗剂;抗血管生成剂;抗转移剂;靶向抗癌剂;细胞毒性剂;和/或其他抗癌剂。
更具体地说,试剂盒可以具有含有所公开的抗体或其抗原结合部分的单个容器,其含有或不含另外的组分,或者它们可以具有用于每种所需试剂的不同容器。试剂盒还可以包含用于容纳无菌药学上可接受的缓冲液或其他稀释剂例如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、林格氏溶液和葡萄糖溶液的第二/第三容器装置。
当试剂盒的组分以一种或多种液体溶液提供时,液体溶液优选为水溶液,特别优选无菌水溶液或盐水溶液。然而,试剂盒的组分可以作为干粉提供。当试剂或组分以干粉形式提供时,可以通过添加合适的溶剂来重构粉末。可以设想溶剂也可以提供于另一个容器中。
如上简要所述,所述试剂盒还可含有向患者施用抗体或其抗原结合部分和任何任选组分的工具,例如一种或多种针,I.V.袋或注射器,或者甚至滴眼器、移液管或其他类似装置,通过其可以将制剂注射或引入动物体内或将其施用于身体的患病区域。本发明的试剂盒通常还包括用于容纳小瓶或类似物的装置以及用于商业销售的其他紧密封闭的部件,例如注射或吹塑塑料容器,其中放置并且保持所需的小瓶和其他装置。
HER2结合分子的效果
本公开的HER2结合分子能够以高亲和力结合人HER2。特别是,双特异性的HER2结合分子能够同时结合HER2上的不同表位,产生协同的HER2拮抗效果。如实施例中验证的,所述HER2结合分子可以通过ADCC杀伤细胞,还可以通过抗体交联HER2从而介导细胞的凋亡,而且可以显著抑制抑制细胞的增殖;而且能提供比已知的单特异性抗体(例如曲妥珠单抗和帕妥珠单抗)和双特异性抗体(例如KN026和ZW25)显著更好的抗肿瘤功效。
结合HER2靶点的特性,此抗体用于癌症的免疫治疗,具有更低的毒副作用和更佳的临床药效,将给患者提供更多的药物选择。
下面列出了本申请中涉及的序列。
表A:CDR的氨基酸序列
表B:重链可变区的氨基酸序列
表C:轻链可变区的氨基酸序列
表D:重链和轻链恒定区的氨基酸序列
表E:人HER2的胞外结构区的氨基酸序列
实施例
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解,下面的实施例仅用于说明本发明,而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的,按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著,黄培堂等译的《分子克隆实验指南》,第三版,科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1:共同轻链发现
通过文库构建、文库筛选和单克隆的挑选(方法可参考CN113121689A的实施例2)从富集较好的多个噬菌体池挑选了大量单克隆进行ELISA初筛。经测序分析和ELISA结合初筛获得21个轻链序列多样性抗体,结合序列的差异和亲和力,选择了8条候选轻链,分别为A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7和A8。另外,根据曲妥珠单抗和帕妥珠单抗轻链在抗原结合中的作用特点,设计获得新的轻链,称为CLC-139(其轻链可变区如SEQ ID NO:25所示)。
实施例2:ELISA亲和与竞争检测
本实施例通过ELISA方法评价了8条候选轻链与曲妥珠单抗和帕妥珠单抗组成Fab后的结合活性及竞争活性,以筛选出较优的共同轻链。使用的抗HER2的曲妥珠单抗(Trastuzumab,简称Trmab)和帕妥珠单抗(Pertuzumab,简称Pemab)序列分别来自专利申请WO1992022653A1和WO2001000245A2。
2.1基于ELISA检测抗体与HER2抗原的结合活性
用hHER2-His(hHER2序列来源于UniProt NO:P04626,AA23-652,SEQ ID NO:40)包被96孔板,4℃过夜;次日,将96孔板用PBST洗3次后用5%脱脂牛奶封闭2h;用PBST洗板3次后,加入梯度稀释的待测Fab(曲妥珠单抗重链分别与8条轻链A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7和A8组合的Fab,分别命名为THA1、THA2、THA3、THA4、THA5、THA6、THA7和THA8)并孵育1h;之后,用PBST清洗3次后加入二抗抗kappa-HRP,并孵育1h;孵育完成后,PBST洗板,加TMB显色;根据显色结果,加入2M HCl终止反应。同样方法测定上述候选轻链和帕妥珠单抗重链组合成的Fab与hHER2-His的结合活性,其中待测样品具体为PHA1、PHA2、PHA3、PHA4、PHA5、PHA6、PHA7和PHA8。P-139、T-139分别为CLC-139轻链与帕妥珠单抗重链和曲妥珠单抗组成的Fab,作为对照。
结果显示在图1A-1B中,结果表明,所有候选轻链与曲妥珠单抗或帕妥珠单抗重链组成Fab后,与hHER2-His都具有结合活性。
2.2基于ELISA检测抗体与对照单抗的竞争活性
用hHER2-His包被96孔板,4℃过夜;次日,将96孔板用PBST洗3次后用5%脱脂牛奶封闭2h;用PBST洗板3次后,将梯度稀释的待测Fab或者无关Fab(阴性对照)与生物素标记的曲妥珠单抗(Trastuzumab-biotin)或帕妥珠单抗(Pertuzumab-biotin)孵育0.5h;之后,将共孵育的混合物加入到ELISA板中孵育1h,用PBST清洗3此后加入二抗抗NeutrAvidin-HRP并孵育1h;孵育完成后,PBST洗板,加TMB显色;根据显色结果,加入2M HCl终止反应。
结果显示在图2A-2B中,结果显示所有候选轻链与帕妥珠单抗重链组合成的Fab与Pemab具有较好的竞争S型曲线,所有候选轻链与曲妥珠单抗重链组合成的Fab与Trmab具有较好的竞争S型曲线。
实施例3:候选Fab的亲和力成熟
本实施例基于PHA3(帕妥珠单抗重链和轻链A3组成的Fab)为母本Fab,进行了抗体亲和力成熟,对帕妥珠单抗重链CDR区域进行改造,以期提高抗体的亲和力。
本实施例对帕妥珠重链的HCDR1、HCDR2和HCDR3构建了单点和双点突变文库,进行了3轮筛选,从富集较好的噬菌体池挑选了大量单克隆进行对hHER2-Fc(Fc标签序列来源于Uniprot No.P0DOX5的218-449AA)的ELISA初筛,经测序分析和ELISA结合初筛获得28个重链序列多样性抗体,结合序列突变热点分布的特点及ELISA结合活性(ELISA结果如图3A-3B所示),选择了19号重链Pemab19(3rd-1-19)作为优选序列,其可变区序列如SEQ ID NO:43所示。
实施例4:抗体的构建、表达和纯化
基于实施例1、2和3的数据及序列,选择了轻链A3作为曲妥珠单抗重链、帕妥珠单抗重链及帕妥珠单抗改造后重链(Pemab19)的组合轻链,进行单抗、共同轻链双特异性抗体的构建、表达和纯化。
4.1质粒构建
将编码A3的VL的DNA片段构建至含CL序列(SEQ ID NO:38)的真核表达载体质粒pcDNA3.4上,获得包含完整的轻链全长(以下称为A3LC)基因的重组质粒。将重链恒定区进行突变,引入KIH突变位点(Knob into hole,参考专利US5731168A),突变后的重链恒定区序列详见SEQ ID NO:36-37,基于前述构建方法分别制备含KIH突变位点的曲妥珠单抗重链、帕妥珠单抗重链以及帕妥珠单抗改造后的重链重组质粒,构建的抗体组成及名称详见表1。
表1构建的抗体组成
抗体名称 | 重链1 | 重链2 | 轻链 | Fc特点 | 抗体类型 |
B1 | Trmab | Pemab | A3LC | 包含KIH突变Fc | 双抗 |
B2 | Trmab | Pemab19 | A3LC | 包含KIH突变Fc | 双抗 |
PemabHC-A3LC | Pemab | 无 | A3LC | 野生型Fc | 单抗 |
TrmabHC-A3LC | Trmab | 无 | A3LC | 野生型Fc | 单抗 |
Pemab19HC-A3LC | Pemab19 | 无 | A3LC | 野生型Fc | 单抗 |
4.2抗体的表达和纯化
将制备的质粒与转染试剂按1:4混合均匀后室温静置5min,然后加入到合适的细胞(CHO细胞),37℃,5%CO2细胞培养箱中培养7-15天,收集细胞上清,通过蛋白A亲和层析柱结合蛋白,再用100mM乙酸钠(pH 3.0)洗脱目的蛋白。将洗脱的蛋白超滤至PBS中,测定产量。然后用SDS-PAGE和SEC-HPLC标准分析技术对其进行质量鉴定后用于后续的药效学研究。
抗体的SDS-PAGE结果显示在图4:抗体和质控品IPI非还原胶的条带的表观相对分子量在150kD左右,还原胶的条带的表观相对分子量在是55kD左右和25kD左右。通过还原和非还原SDS-PAGE分析的抗体的分子量符合预期大小,并且纯度均大于95%。
抗体的SEC-HPLC分析结果表明:按照面积归一法计算样品中高分子聚集物、抗体单体和低分子聚集物百分比,单抗SEC单体纯度均为100%,双抗B1和B2的SEC纯度分别为90.9%和92.8%。
实施例5:基于ELISA方法测定抗体的亲和活性
hHER2-His包被96孔板,4℃过夜;次日,将96孔板用PBST洗3次后用5%脱脂牛奶封闭2h;用PBST洗板3次后,加入梯度稀释的待测抗体并孵育1h;之后,用PBST清洗3次后加入二抗抗人Fc-HRP并孵育1h;孵育完成后,PBST洗板六次,加TMB显色;根据显色结果,加入2MHCl终止反应,通过酶标仪在OD450下读板。
结果显示在图5中,结果表明,双抗B1和B2的ELISA结合亲和活性高于阳性对照单抗,B1和B2的EC50分别为0.0138μg/mL和0.0217μg/mL,Trmab和Pemab的EC50分别为0.0278μg/mL和0.0540μg/mL。
实施例6:基于FACS方法测定抗体与肿瘤细胞表面HER2抗原结合
在本实施例中,基于FACS方法检测候选双特异性抗体和单抗对照与肿瘤细胞SK-OV-3、BT-474和SK-BR-3表面HER2抗原结合活性。其中,阳性对照双特异性抗体KN026序列来自专利US10808043B2、双特异性抗体ZW25序列来自专利申请US20150125449A1。
将指数生长期的人SK-OV-3、BT-474和SK-BR-3肿瘤细胞加入96孔圆底板中,离心去上清。向对应孔中加入梯度稀释的候选抗体稀释液,将细胞混匀并孵育30min。将孵育后的细胞混合液离心去上清,向对应孔中加入FACS缓冲液并重悬细胞;加入FITC标记的anti-human-IgG-Fc流式抗体,将细胞混匀并孵育30min。随后,通过FACS缓冲液洗涤。最后,通过流式细胞仪上机检测。
结果显示在图6A-6D中,结果表明在同等实验条件及抗体浓度条件下,B1和B2与细胞表面HER2结合活性优于阳性对照单抗Trmab和Pemab;单抗PemabHC-A3LC、TrmabHC-A3LC和Pemab19HC-A3LC与细胞表面HER2结合活性与对照单抗Trmab和Pemab相当(图6A-6C);且B1和B2的FACS结合活性略优于阳性对照KN026和ZW25(图6D)。
实施例7:抗体亲和动力学(Gator)分析
本实施例中,将PBS(10mM pH 7.4)+0.02% Tween 20+0.2%BSA配置成Q buffer缓冲液,用配置好的Q buffer缓冲液将待测抗体的存储液稀释到终浓度为30nM的工作液;将hHER2-His存储液用Q buffer配置成倍数稀释(300、150、75、37.5、18.75nM)的工作液,然后利用Gator仪器及其配套软件,选择Advanced Kinetics实验模式进行检测和分析。结果如表4所示,B1和B2与阳性对照Trmab和对照抗体Pemab的亲和力相当。
表2候选抗体的亲和动力学评估
抗体名称 | KD(M) | ka(1/Ms) | kd(1/s) | R2 | Rmax(nm) |
B1 | 1.47E-09 | 6.62E+04 | 9.71E-05 | 0.995 | 0.499 |
B2 | 1.68E-09 | 4.86E+04 | 8.14E-05 | 0.997 | 0.494 |
Trmab | 1.07E-09 | 1.44E+04 | 1.54E-05 | 0.994 | 0.419 |
Pemab | 2.49E-09 | 6.00E+04 | 1.50E-04 | 0.998 | 0.760 |
实施例8:抗体抑制肿瘤细胞增殖检测
将对数生长期SK-BR-3细胞接种至96孔平底细胞培养板,37℃培养过夜。使用含1%FBS的RPMI 1640培养基梯度稀释待检抗体加至过夜培养的SK-BR-3细胞的96孔细胞培养板中并将其放置于37℃培养箱中培养72h。以30μL/孔向96孔细胞培养板加入MTS检测试剂,放置培养箱孵育3h,酶标仪读取OD492。
与阳性对照单抗Trmab比较的结果显示在图7A-7B中,双抗B1和B2增殖抑制窗口大于Trmab,在等同实验条件下,B1和B2的最大抑制窗口分别达到36.1%和34.7%,而Trmab的最大抑制窗口为26.4%;与阳性对照KN026和ZW25比较的结果显示在图7C-7D中,双抗B1的增殖抑制活性优于ZW25分子,与KN026分子相当。
实施例9:抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)
本实施例利用乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测ADCC效应。其原理是:抗体的可变区结合靶细胞上的目标抗原,当抗体的Fc段与PBMC中的NK效应细胞上的FcRIIIa(又名CD16a)结合后,NK细胞会释放穿孔素、颗粒酶等裂解靶细胞,然后通过LDH乳酸脱氢酶试剂盒可以检测细胞上清中乳酸脱氢酶的释放,以此来测定NK细胞对靶细胞的杀伤程度。
在96孔细胞培养板中加入SK-BR-3细胞,置于37℃培养箱中培养过夜。加入经梯度稀释的待检抗体,混匀后于37℃培养箱孵育30min,再加入复苏好的人PBMC细胞(效应细胞/靶细胞比例为40:1),37℃培养箱孵育16h后,离心得到上清,然后加入LDH检测试剂,反应60min,最后通过酶标仪测定在492nm波长下的OD值并进行检测结果的分析。其中以只加靶细胞作为空白阴性对照,以PBMC加靶细胞作为背景阴性对照。细胞杀伤率按如下公式计算:杀伤率(%)=(候选抗体孔OD值-背景孔OD值)/(全裂解孔OD值-空白孔OD值)×100%
与阳性对照单抗Trmab比较的ADCC结果如图8A-8B所示,双抗B1和B2与Trmab具有相当的细胞杀伤活性。其中,图8A中显示B1和Trmab的ADCC细胞杀伤EC50分别是0.0021μg/mL和0.0045μg/mL;图8B中显示B2和Trmab的ADCC细胞杀伤EC50分别是0.0029μg/mL和0.0031μg/mL。与阳性对照KN026和ZW25比较的ADCC结果如图8C-8D所示,B2的ADCC活性优于KN026且与ZW25相当,ADCC细胞杀伤EC50分别是B2 vs.KN026=0.1580μg/mL vs.0.4460μg/mL,B2vs.ZW25=0.2266μg/mL vs.0.1782μg/mL。
实施例10:抗体对N87肿瘤细胞在裸鼠模型的抑瘤效果
本实施例中,验证了B1双抗及阳性对照Trmab和KN026在动物体内的抑瘤效果,所使用肿瘤细胞为胃癌细胞NCI-N87。购买6-8周龄的雌性裸鼠,实验小鼠饲养在恒温恒湿的独立通风盒内,饲养室温度21-24℃,湿度30-53%,10-20次/h换气,昼夜明暗交替时间12h/12h;持续供给放射灭菌鼠全价颗粒饲料,不限量饮用水提供。每只裸鼠皮下注射NCI-N87细胞,待荷瘤体积达130mm3左右时,进行分组分笼和给药操作,每组6只荷瘤裸鼠。给药方式为腹腔注射给药,剂量如图9A-9C所示,每3-4天给药一次,每周给药2次并测量2次瘤体积,共给药8次/4周,给药结束后1周将小鼠安乐死,取肿瘤并测量瘤重,分析瘤体积、瘤重变化数据。
结果如图9A-9C示,和PBS组比较,所有抗体都具有显著的抑瘤效果,抗Her2双抗在10mpk剂量下抑瘤效优于同剂量对照抗体Trmab+Pemab,另外在20mpk剂量下抑瘤效果优于同剂量对照抗体Trmab及KN026。
实施例11:抗体对BT-474肿瘤细胞在NCG鼠模型的抑瘤效果
本实施例中,验证了B1双抗及阳性对照Trmab和KN026在动物体内的抑瘤效果,所使用肿瘤细胞为乳腺癌细胞BT-474。购买6-8周龄的雌性NCG鼠(饲养条件与实施例10一致),每只NCG鼠原位注射BT-474细胞,待荷瘤体积达80mm3左右时,进行分组分笼和给药操作。每组8只荷瘤NCG鼠。给药方式为腹腔注射给药,剂量如图10A-10B所示,每3-4天给药一次,每周给药2次并测量2次瘤体积,共给药8次/3周,给药结束后1周将小鼠安乐死,取肿瘤并测量瘤重,分析瘤体积、瘤重变化数据。
结果如图10A-10B所示,和PBS组比较,所有抗体都具有显著的抑瘤效果,抗Her2双抗在20mpk剂量下抑瘤效果最佳,优于同剂量对照抗体Trmab。
本领域技术人员将进一步认识到,在不脱离其精神或中心特征的情况下,本发明可以以其他具体形式来实施。由于本发明的前述描述仅公开了其示例性实施方案,应该理解的是,其他变化被认为是在本发明的范围内。因此,本发明不限于在此详细描述的特定实施方案。相反,应当参考所附权利要求来指示本发明的范围和内容。
Claims (25)
1.一种HER2结合分子,其包含两种HER2结合结构域的至少一种,其中第一HER2结合结构域包含第一重链可变区(VH)和第一轻链可变区(VL),第二HER2结合结构域包含第二重链可变区(VH)和第二轻链可变区(VL),
所述第一VH包含:
包含SEQ ID NO:1的HCDR1,包含SEQ ID NO:2的HCDR2,和包含SEQ ID NO:3的HCDR3;
所述第二VH包含:
包含SEQ ID NO:4的HCDR1,包含SEQ ID NO:5或34的HCDR2,和包含SEQ ID NO:6的HCDR3;
所述第一VL和第二VL包含相同的LCDR1、LCDR2和LCDR3,且分别包含:
包含SEQ ID NO:7或与SEQ ID NO:7存在不超过2个氨基酸的添加、缺失或取代的差异的氨基酸序列的LCDR1,包含SEQ ID NO:8或与SEQ ID NO:8存在不超过2个氨基酸的添加、缺失或取代的差异的氨基酸序列的LCDR2,和包含SEQ ID NO:9或与SEQ ID NO:9存在不超过2个氨基酸的添加、缺失或取代的差异的氨基酸序列的LCDR3。
2.权利要求1的HER2结合分子,其同时包含第一和第二HER2结合结构域。
3.权利要求1的HER2结合分子,其仅包含第一HER2结合结构域和第二HER2结合结构域中的一种。
4.前述权利要求中任一项的HER2结合分子,其中所述第一VL和第二VL包含选自以下任一组的LCDR:
(a)包含如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的LCDR1,包含如式X1X2X3YLYS所示的氨基酸序列的LCDR2,其中X1为T、S或Y,X2为A或S,X3为S或L,和包含如式QQYYX4X5PX6T所示的氨基酸序列的LCDR3,其中X4为F、T或E,X5为Y、N或S,X6为Y或A;
(b)包含如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的LCDR1,包含如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列的LCDR2,和包含如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的LCDR3;
(c)包含如SEQ ID NO:15或17所示的氨基酸序列的LCDR1,包含如SEQ ID NO:16或18所示的氨基酸序列的LCDR2,和包含如SEQ ID NO:12或19所示的氨基酸序列的LCDR3。
5.前述权利要求中任一项的HER2结合分子,其中所述第一VL和第二VL包含选自下组的LCDR:
(a)包含SEQ ID NO:7的LCDR1,包含SEQ ID NO:8的LCDR2和包含SEQ ID NO:9的LCDR3;
(b)包含SEQ ID NO:10的LCDR1,包含SEQ ID NO:11的LCDR2和包含SEQ ID NO:12的LCDR3;
(c)包含SEQ ID NO:7的LCDR1,包含SEQ ID NO:13的LCDR2和包含SEQ ID NO:14的LCDR3;
(d)包含SEQ ID NO:15的LCDR1,包含SEQ ID NO:16的LCDR2和包含SEQ ID NO:12的LCDR3;
(e)包含SEQ ID NO:17的LCDR1,包含SEQ ID NO:18的LCDR2和包含SEQ ID NO:19的LCDR3;
(f)包含SEQ ID NO:7的LCDR1,包含SEQ ID NO:20的LCDR2和包含SEQ ID NO:22的LCDR3;
(g)包含SEQ ID NO:7的LCDR1,包含SEQ ID NO:21的LCDR2和包含SEQ ID NO:23的LCDR3;和
(h)包含SEQ ID NO:7的LCDR1,包含SEQ ID NO:18的LCDR2和包含SEQ ID NO:24的LCDR3。
6.权利要求5的HER2结合分子,其中所述第一VL和第二VL包含选自下组的LCDR:
(a)如SEQ ID NO:7所示的LCDR1,如SEQ ID NO:8所示的LCDR2和如SEQ ID NO:9所示的LCDR3;
(b)如SEQ ID NO:10所示的LCDR1,如SEQ ID NO:11所示的LCDR2和如SEQ ID NO:12所示的LCDR3;
(c)如SEQ ID NO:7所示的LCDR1,如SEQ ID NO:13所示的LCDR2和如SEQ ID NO:14所示的LCDR3;
(d)如SEQ ID NO:15所示的LCDR1,如SEQ ID NO:16所示的LCDR2和如SEQ ID NO:12所示的LCDR3;
(e)如SEQ ID NO:17所示的LCDR1,如SEQ ID NO:18所示的LCDR2和如SEQ ID NO:19所示的LCDR3;
(f)如SEQ ID NO:7所示的LCDR1,如SEQ ID NO:20所示的LCDR2和如SEQ ID NO:22所示的LCDR3;
(g)如SEQ ID NO:7所示的LCDR1,如SEQ ID NO:21所示的LCDR2和如SEQ ID NO:23所示的LCDR3;和
(h)如SEQ ID NO:7所示的LCDR1,如SEQ ID NO:18所示的LCDR2和如SEQ ID NO:24所示的LCDR3。
7.前述权利要求中任一项的HER2结合分子,其中所述第一VL与第二VL相同。
8.前述权利要求中任一项的HER2结合分子,其中:
第一VH包含:(a)如SEQ ID NO:41中所示的氨基酸序列;或(b)与SEQ ID NO:41相比在框架区中至少85%、至少90%、或至少95%相同的氨基酸序列;或(c)与SEQ ID NO:41相比在框架区中具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸的添加、缺失和/或取代的氨基酸序列;
第二VH包含:(a)如SEQ ID NO:42或43中所示的氨基酸序列;或(b)与SEQ ID NO:42或43相比在框架区中至少85%、至少90%、或至少95%相同的氨基酸序列;或(c)与SEQ IDNO:42或43相比在框架区中具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸的添加、缺失和/或取代的氨基酸序列;和
第一和第二VL,各自包含:(a)如SEQ ID NO:26-33中任一项所示的氨基酸序列;或(b)与SEQ ID NO:26-33中任一项相比在框架区中至少85%、至少90%、或至少95%相同的氨基酸序列;或(c)与SEQ ID NO:26-33中任一项相比在框架区中具有一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸的添加、缺失和/或取代的氨基酸序列。
9.权利要求8的HER2结合分子,其中所述第一VH由SEQ ID NO:41组成,所述第二VH由SEQ ID NO:42或43组成,所述第一VL和第二VL分别由SEQ ID NO:26-33中的任一项组成。
10.前述权利要求中任一项的HER2结合分子,其中所述HER2结合结构域可操作地连接于免疫球蛋白恒定区的N末端。
11.权利要求10的HER2结合分子,其中所述免疫球蛋白恒定区为人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型,例如包含野生型人IgG1 Fc区或其变体。
12.权利要求11的HER2结合分子,其中所述变体包含突变以促进异二聚化,例如在Fc区包含KIH突变。
13.前述权利要求中任一项的HER2结合分子,其中所述HER2结合分子包含第一HER2结合结构域和第二HER2结合结构域,且所述HER2结合分子包含选自下组的两条不同的重链和两条相同的轻链:
(a)包含如SEQ ID NO:41所示的重链可变区和如SEQ ID NO:36所示的重链恒定区的第一重链,包含如SEQ ID NO:42或43所示的重链可变区和如SEQ ID NO:37所示的重链恒定区的第二重链,包含如SEQ ID NO:26-33中任一项所示的轻链可变区和如SEQ ID NO:38所示的轻链恒定区的轻链;和
(b)包含如SEQ ID NO:41所示的重链可变区和如SEQ ID NO:37所示的重链恒定区的第一重链,包含如SEQ ID NO:42或43所示的重链可变区和如SEQ ID NO:36所示的重链恒定区的第二重链,包含如SEQ ID NO:26-33中任一项所示的轻链可变区和如SEQ ID NO:38所示的轻链恒定区的轻链。
14.权利要求1-12中任一项的HER2结合分子,其中所述HER2结合分子仅包含第一HER2结合性Fab和第二HER2结合结构域中的一种,且所述HER2结合分子包含选自下组的两条相同的重链和两条相同的轻链:
(a)包含如SEQ ID NO:41所示的重链可变区和如SEQ ID NO:35所示的重链恒定区的重链,包含如SEQ ID NO:26-33中任一项所示的轻链可变区和如SEQ ID NO:38所示的轻链恒定区的轻链;或
(b)包含如SEQ ID NO:42或43所示的重链可变区和如SEQ ID NO:35所示的重链恒定区的重链,包含如SEQ ID NO:26-33中任一项所示的轻链可变区和如SEQ ID NO:38所示的轻链恒定区的轻链。
15.前述权利要求中任一项的HER2结合分子,其为嵌合抗体、人源化抗体或全人抗体。
16.一种分离的核酸分子,其包含编码权利要求1-15中任一项的HER2结合分子的第一和/或第二HER2结合结构域的核酸序列。
17.一种表达载体,其包含权利要求16的分离的核酸分子。
18.一种宿主细胞,其包含权利要求17的表达载体。
19.权利要求18的宿主细胞,其为细菌细胞(例如大肠杆菌(E.coli))、真菌细胞(例如酵母)、植物细胞或动物细胞(例如哺乳动物细胞)。
20.一种药物组合物,其包含权利要求1-15中任一项的HER2结合分子和药学上可接受的载体。
21.一种制备权利要求1-15中任一项的HER2结合分子的方法,包括以下步骤:
-在合适的条件下培养权利要求18的宿主细胞;和
-从培养上清液中分离所述HER2结合分子。
22.权利要求1-15中任一项的HER2结合分子在制备用于预防、减轻或治疗受试者中与HER2相关的病症的药物中的用途。
23.权利要求22的用途,其中所述与HER2相关的病症包括涉及表达HER2的细胞的疾病或与表达HER2的细胞相关的疾病,例如是HER2阳性癌症。
24.权利要求23的用途,其中所述癌症选自乳腺癌、卵巢癌、胃癌、肺癌、头颈癌、肝癌、宫颈癌、结肠癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、前列腺癌和食道癌。
25.一种试剂盒,其包含容器,所述容器包含权利要求1-15中任一项的HER2结合分子或权利要求20的药物组合物。
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