CN118055910A - 工程活性材料 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种包含碳酸钙结合骨料的生物矿化材料的生产方法，该方法包括：在水凝胶基质中培养光合微生物，其中该微生物将胞外碳酸酐酶释放到水凝胶基质中；并且其中该水凝胶基质包含：i)水凝胶，ii)骨料，iii)生长培养基，以及iv)氯化钙(CaCl2)。其中，胞外碳酸酐酶将氯化钙转化为碳酸钙沉淀物，从而将骨料结合，以形成生物矿化材料。本发明还涉及相关材料、组合物和应用。
Description
生物技术、材料科学和人工智能等领域的最新进展正在为新的跨学科研究领域开辟道路，而这些研究领域在以前是不可能出现的。工程活性材料(ELM，英语为EngineeredLiving Material)就是这样一个新兴且正在快速发展的领域。ELM是一类智能化生物增强材料，其构建和特性由活细胞控制。从历史上看，人类文明中的材料一直被视为预先存在的无生命元素，它们可以通过纯粹的物理手段(例如加热或加压)来提取、重塑和重新组合。尽管这些工艺过程已经取得了巨大的成就，可以生产出当今存在的令人难以置信的各种材料，但这些方法最终得到的结果通常具有固定的物理和化学性质。此外，它们通常是单向的能量转移机制，因此考虑到我们今天面临的全球环境挑战，它们是不可持续的。相反，所有生命系统都通过平行机制运行，其中维持其生存所需的生物材料，如蛋白质和组织，是通过生长或自下而上自主组装的方式形成的。生物材料是分级的，因此效率极高。它们会对环境条件做出反应，因此其特性具有固有的灵活性，或者具有自我修复和再生的能力。这些材料适合更大的能量流循环，使其在环境问题上具有可持续性。工程活性材料领域的目标是将迄今为止仅存在于生命系统中的这些复杂特性嵌入到功能设计材料中。
生产ELM的一种方法实际上是自上而下实现的，其中细胞和生物膜悬浮在基质或支架中生长，并产生希望得到的结果。这种方法依赖于组织工程技术，生产的ELM是人工生成的含有生物和非生物元素的活性复合材料。
目前，ELM领域中均存在一些关键的限制因素和挑战。第一个挑战与扩大规模有关，因为大多数自下而上的方法都适用于微观结构。在微电子和机器人等某些领域，规模可能不是问题，但在建筑等其他行业，规模则至关重要。第二个挑战是生产和活性材料生长所需的时间，这也和第一个挑战直接相关。由于生物过程速度缓慢，因此这些ELM可能无法在商业上可行的时间内完成生长。第三个挑战是如何维持细胞/生物体的长期活力。基于化学营养系统的ELM需要维持在合适的环境条件下，并持续提供适当的营养物质。对于依赖转基因生物的系统，生物防护是应用过程中的另一个挑战。尽管基于野生型生物体运作的ELM不会面临这一挑战，但自然生命系统通常需要在由其他细胞和微生物构成的复杂网络/综合体中运作。
公开号为WO2020/180914的国际专利申请描述了一种ELM生产工艺，通过培养蓝藻细胞，并将其添加到水凝胶和骨料的混合物中。将混合物维持在模拟的50％-100％湿度条件下，以保持细胞的完整新陈代谢过程，并形成矿物质沉淀。然而，一经混合，细胞就不再生长，其质量也会减少，在模拟条件下30天之后，活性细胞仅剩9-14％。虽然实现了材料的生产，但它实际上在很长一段时间内不再是活性材料，并且在材料形成后也不会持续固碳。此外，该材料无法在高于40℃的温度下工作，因为明胶基质会熔化。由于需要大型生物反应器和骨料灭菌设施，生产成本也可能很高。
因此需要开发新的工具包和工艺来研究、生产和应用ELM。
根据本发明的第一方面，提供了一种包含碳酸钙结合骨料的生物矿化材料的生产方法，该方法包括：
在水凝胶基质中培养光合微生物，其中所述微生物将细胞外碳酸酐酶释放到所述水凝胶基质中，并且，
其中所述水凝胶基质包含：
i)水凝胶；
ii)骨料；
iii)生长培养基；以及，
iv)氯化钙(CaCl2)，
其中，所述细胞外碳酸酐酶将所述氯化钙转化为碳酸钙沉淀物，从而将所述骨料结合，以形成所述生物矿化材料。
这种生物制造方法具有许多优点。生物矿化材料(也可称为“工程活性材料”ELM)具有减少建筑业和制造业的碳足迹的潜力，使其无需使用水泥。微生物将溶解的二氧化碳转化为碳酸钙，而碳酸钙充当骨料的粘合剂。它可以在自然的室温条件下在几周内完成生长。有益的是，所得到的生物矿化材料使得蓝藻细菌等微生物或微生物的孢子样细胞具有长期生存力。因此，材料可以承受干燥时间段，并且可以通过添加更多的生长介质和钙来重新激活矿化过程，这意味着生物矿化材料可以自我修复。另外，旧的生物矿化材料样品可以与新的骨料和生长介质混合，并用作接种物，以生产新批次的材料，即该材料是可再生的。本发明提供了一种真正自下而上的方法来创建可大规模生产的、可再生的、具有光合作用活性的、生物矿化的工程活性材料，该材料克服了ELM领域目前存在的限制因素。该材料的一个优点是，它还可以保持从生产过程到生产后的使用过程中的固碳作用，并能够维持微生物的长期生存能力。该材料是非烧制的，可以根据骨料尺寸和所需的应用而调整为硬脆的或可延展的材料。该材料可以在生产过程中通过模具铸造，和/或可以通过机加工成型。所生产的材料可以是半透明的，这种半透明性不仅有利于生产工艺和持续的生存能力/再生能力，而且还为多种应用提供了独特的美学品质。
这种生物矿化材料最显著的影响可能是在建筑行业中作为水泥基材料的替代品。特别是，它可以作为建筑材料而实现大量的应用——它可以安装为光合立面外墙材料，或者可以用作填充材料来取代传统的砖料，具体取决于结构负载条件。该材料可以形成块料、瓷砖和面板的产品系列。根据联合国的估计，到2050年，将新造25亿座建筑物，以维持不断增长的世界人口。众所周知，作为当今建筑主要材料的水泥，其生产过程是二氧化碳排放的最大来源之一，累计占总污染的5-6％。鉴于全球气候危机的存在，这种活性生物矿化材料为未来几十年的建筑实现碳中和(甚至负碳)提供了可能性。它还可以用作其他各种行业的环保产品的材料，例如照明元件、固定装饰和家具等可持续的室内设计材料。
骨料
骨料可以具有足够的半透明度，以允许蓝藻细菌等光合微生物在生物矿化材料内进行光合生长。在优选实施例中，骨料是透明或半透明的。在一种实施方式中，骨料至少不是不透明的。骨料可具有与无定形二氧化硅基本相同或更大的总透射率值。或者，相对于以3:1的比例混合的无定形二氧化硅与活性炭，骨料具有基本相同或更大的总透射率值。在一个实施例中，骨料的总透射率值在无定形二氧化硅的总透射率的+/-20％范围内。在一个实施例中，骨料的总透射率值在无定形二氧化硅的总透射率的+/-10％范围内。在一个实施例中，骨料的总透射率值在无定形二氧化硅的总透射率的+/-5％范围内。技术人员可以理解，根据需要生产的材料的厚度可以确定骨料所需的半透明度水平，以实现光合作用。特别地，半透明度可设置为足以实现光合作用。还可以通过更高的光强度和/或集成照明来维持生产的进行。
半透明度或透明度还可取决于骨料是处于湿润状态还是干燥状态。技术人员可以理解，在水凝胶的内部，骨料是湿润的，并且无定形二氧化硅等骨料组分在湿润时可以更加透明，而在干燥时则为半透明状态。当骨料在水凝胶内呈湿润状态时，其半透明度或透明度可设置为足以维持光合作用。
技术人员可以理解，可以发生光合作用的区域被称为透光区(Zeu，英语为euphoric zone)。根据定义，透光区从表面延伸到可以检测到表面光强度的1％的深度。
例如，蓝藻细菌生长所需的最小光强度约为36μmol/m2/s。由于透射率取决于材料的深度，因此以铸造为例，骨料必须能够具有足够的透射率，使得在所需的有效深度位置，它还能够为诸如蓝藻细菌之类的光合微生物的生长提供其表面光照条件的1％，例如至少36μmol/m2/s。
在一种实施方式中，骨料包含无定形材料和/或结晶材料，或由无定形材料和/或结晶材料组成。骨料可以包括选自无定形二氧化硅(SiO2)、结晶石英二氧化硅、玻璃颗粒(例如回收玻璃颗粒)、透明陶瓷、聚丙烯酸酯和玻璃纤维材料中的一种或多种。
在一种实施方式中，骨料包含无定形二氧化硅(SiO2)。骨料还可包含活性炭颗粒和/或沸石。在一种实施方式中，骨料包含活性炭颗粒和无定形二氧化硅(SiO2)或由活性炭颗粒和无定形二氧化硅(SiO2)组成。
骨料可包含纳米纤维，例如纤维素纳米纤维。在一种实施方式中，骨料包含多孔颗粒或由多孔颗粒组成，所述多孔颗粒的例子有活性炭颗粒、无定形二氧化硅(SiO2)和纳米纤维，例如纤维素纳米纤维。在一个实施例中，骨料包含比例为1:3的多孔颗粒(例如活性炭颗粒)和无定形二氧化硅(SiO2)或由其组成。在另一个实施例中，骨料包含比例为1:2至1:4的多孔颗粒(例如活性炭颗粒)和无定形二氧化硅(SiO2)或由其组成。骨料可以是半透明固体颗粒和/或半透明纤维材料。还可以使用不同骨料进行组合。
骨料可以不包含砂粒或砾石。骨料也可包含不超过10％的砂粒和/或砾石。在另一个实施例中，骨料可包含不超过5％的砂粒和/或砾石。
有益地，半透明骨料的使用可增加蓝藻细菌等光合微生物的生存力。半透明骨料的使得还可使得到的生物矿化材料呈半透明且具有变化的颜色。例如，生物矿化材料可以根据光照和营养条件在黄色、绿色和蓝色之间动态改变颜色。
除了半透明或透明特性之外，技术人员可以理解，还可以基于生产得到的生物矿化材料的所需物理特性来选择骨料。例如，石英比无定形二氧化硅和玻璃纤维具有更高的抗压强度。然而，玻璃纤维可以为材料提供更大的拉伸强度。不同形式的骨料可以按不同的比例组合以形成所需的性能。
骨料可包含具有微孔表面的颗粒材料或由其组成。骨料的微表面比表面积可以是至少750m2/g。在另一个实施例中，骨料的微表面比表面积可以是至少1000m2/g。在另一个实施例中，骨料的微表面比表面积可以是至少1300m2/g。在另一个实施例中，骨料的微表面比表面积可以在750m2/g至约3000m2/g之间。在另一个实施例中，骨料的微表面比表面积可以在750m2/g至约1500m2/g之间。当骨料包含两种或更多种不同颗粒类型时，骨料的微表面比表面积指的是组合后的骨料的平均微表面比表面积。例如，如果骨料包含微表面比表面积为750m2/g的SiO2并包含微表面比表面积为约3000m2/g的活性炭颗粒，则以3:1的比率组合的骨料混合物的平均微表面比表面积为约1350m2/g。活性炭颗粒可以不呈粉末状，例如尺寸不在小于等于1mm的范围。活性炭颗粒的尺寸可以大于等于2mm，优选大于等于3mm。活性炭颗粒的尺寸可为约2-6mm，优选3-5mm。本文提及的颗粒尺寸指的是一种颗粒的平均尺寸。
在一个实施例中，骨料包含吸湿材料，优选半透明吸湿材料。在一个实施例中，骨料包含一种具有吸湿性的、半透明的微孔材料。
有益地，具有高微孔比表面积的骨料，例如活性炭颗粒和SiO2具有固有的与生物膜结合的倾向。微孔表面使得蓝藻毛状体通过相邻颗粒的孔隙交织在一起，形成连续的织物状结构。活性炭颗粒的微表面比表面积为3000m2/g，但它们不透明，不适合透光。因此，它们或更适合作为次要组件。SiO2的微表面比表面积较低，为800m2/g，但其在干燥时呈半透明状，在湿润时呈透明状。二氧化硅还具有天然吸湿性，并且由于其能够吸收空气中的水分而被广泛用作干燥剂。此外，与正在成为稀缺建筑资源的河沙相比，二氧化硅被称为地球上第二丰富的矿物，具有巨大的尚未被开发的资源潜力。因此，二氧化硅是ELM的理想骨料。
在一种实施方式中，骨料包含直径约5mm的颗粒或由直径约5mm的颗粒组成。在另一个实施例中，骨料包含直径在约2mm与约8mm之间的颗粒或由其组成。本文提及的颗粒的直径指的是单个颗粒的最大尺寸，或者一种骨料颗粒的平均直径。在一种实施方式中，骨料包含直径约3-5mm的颗粒或由直径约3-5mm的颗粒组成。骨料可以不呈粉末状，例如尺寸不在小于等于1mm的范围。骨料的尺寸可以大于等于2mm，或者大于等于3mm。骨料的尺寸可为约2-6mm，优选2-5mm。
应当理解，技术人员可以根据所得材料的应用方式选择不同的颗粒尺寸。例如，大于3mm(例如3-5mm)的较大直径的颗粒可实现更脆的材料，而较小直径的颗粒(例如3mm或更小)可以实现更具延展性的材料。
微生物
所述微生物可以具有滑行移动能力(即能够进行滑行移动)、趋光反应和趋化反应中的一种或多种。在一种实施方式中，所述微生物具有滑行移动能力(即能够进行滑行移动)、以及具有趋光反应和/或趋化反应。在另一个实施方式中，所述微生物具有滑行移动能力(即能够进行滑行移动)、趋光反应和趋化反应。趋化反应可以响应于CO2、O2和HCO3离子浓度中的一种或多种或全部。趋光反应可以响应于定向光。
在优选的实施方案中，所述微生物是具有光合作用的，例如所述微生物可以包括蓝藻细菌。
使用光合微生物可以最大限度地减少用于维持异养微生物的高成本碳源的输入。
有益地，使用具有滑行移动能力以及趋光反应和/或趋化反应的微生物，例如丝状蓝藻细菌，可以控制其生长方向，以及针对设计应用对矿化过程进行编程。
在一个实施方式中，所述微生物是细菌，例如能够形成生物膜的细菌。所述微生物可包含蓝藻细菌或由蓝藻细菌组成。优选地，蓝藻细菌是丝状蓝藻细菌。
优选地，所述微生物例如蓝藻细菌可以形成孢子或孢子样细胞。在其中所述微生物是蓝藻细菌的实施例中，蓝藻细菌能够形成休眠细胞(也称为“孢子样细胞”)，其可包括厚壁孢子和/或异形细胞(即固氮细胞)。
有益地，能够形成孢子或孢子样细胞的能力使得生物矿化材料能够持续更新。例如，该材料可以应用于难以持续维持增殖细胞活力的环境中。而形成孢子或孢子样细胞的能力则使材料可以适应条件的变化、具有增殖生长期和休眠期，从而可以适应干燥和炎热的条件。
所述微生物可包括属于蓝藻细菌的念珠藻目的微生物，例如念珠藻属微生物。所述微生物可以包括颤藻科(蓝藻细菌分类学的一个科)的微生物。所述微生物可选自颤藻属(Oscillatoria spp.)、螺旋藻属(Spirulina spp.)、念珠藻属(Nostoc spp.)和单歧藻属(Tolypothrix spp.)中的一种或多种。所述微生物可包含颤藻属和/或螺旋藻属微生物。所述颤藻属微生物可为动物颤藻。所述螺旋藻属微生物可为钝顶螺旋藻。在一个优选的实施方案中，所述微生物包含动物颤藻或由动物颤藻组成。
有益地，蓝藻细菌中的颤藻目中的许多物种通过自然进化，可以在恶劣的陆地条件如沙漠和岩石表面中生存，使其成为理想的选择来用于本发明的材料。例如，本文证明，动物颤藻具有超过180天的极长的持续生长时间。颤藻科成员的一个独特的特征是滑行移动过程中细丝的旋转。因此，像颤藻科的成员等蓝藻细菌，在纯甲基纤维素(4％-15％)或含有不超过1％海藻酸钠的基于甲基纤维素的水凝胶组合物中滑动时，可以出现细丝的旋转。
在一个实施方式中，使用了两种或更多种微生物的共培养物，例如两种或更多种蓝藻细菌物种或菌株。
优选地，所述微生物是胞外碳酸酐酶的天然生产者。然而，技术人员可以理解，可以通过修饰微生物以使其表达胞外碳酸酐酶。在一个实施方案中，所述微生物通过修饰以产生碳酸酐酶，例如通过将重组碳酸酐酶进行核酸编码来实现基因转化。
所提供的微生物的量可以是，足以在整个水凝胶中提供碳酸钙沉淀，以粘合骨料。在一个实施方案中，所提供的微生物的量是足以在矿化期的21天内实现整个水凝胶内的完全生长。在一个实施方案中，作为接种物提供的微生物的量是，足以覆盖水凝胶表面积的至少75％。
优选地，所述微生物作为接种物提供并培养，以实现在水凝胶内的活跃生长。这种培养过程也可以称为矿化期。所述微生物并不是在与水凝胶分开的状态下完成培养、然后再和水凝胶混合的，这种先培养再混合的做法不会促进或实现其在混合后的进一步生长。
本发明提供的方法的优点是，不需要单独培养所述微生物，然后再混合到水凝胶组合物中。水凝胶基质与骨料本身可以充当所述微生物的3D生长支架。所述微生物，例如蓝藻细菌，作为其生长代谢活动的副产物会产生碳酸酐酶，这使得生长过程中能够有效地实现物矿化。
水凝胶
在一个实施例中，水凝胶具有触变性。具体地，水凝胶可以具有足够的粘度，以维持其3D形状，但在应力作用下，能够具有足够的蓝藻细菌流动性，以使得所述微生物(例如丝状蓝藻)可以进行滑行移动。
在一种实施方式中，水凝胶包含甲基纤维素。在另一个实施例中，水凝胶包含甲基纤维素和一种或多种其他有机凝胶复合物或由甲基纤维素和一种或多种其他有机凝胶复合物组成。水凝胶可包含主要组分(即重量比大于50％)的甲基纤维素和作为次要组分(即总重量比小于50％)的一种或多种其他有机凝胶复合物，或由上述组分组成。
水凝胶可以不包含明胶，或并不是由明胶组成。
所述的一种或多种其他有机凝胶复合物可包含海藻酸钠或由海藻酸钠组成。所述的一种或多种其他有机凝胶复合物可包含海藻酸钠、琼脂和角叉菜胶中的一种或多种，或由其中一种或多种组成。
甲基纤维素和一种或多种其他有机凝胶复合物的比例可以为约15:1至3:1。或者，甲基纤维素和一种或多种其他有机凝胶复合物的比例可以为约10:1至3:1。进一步可选地，甲基纤维素和一种或多种其他有机凝胶复合物的比例可以为约8:1至3:1。在另一个实施方案中，甲基纤维素和一种或多种其他有机凝胶复合物的比例为约6:1。
在优选的实施方案中，水凝胶包含甲基纤维素和海藻酸钠或由甲基纤维素和海藻酸钠组成。甲基纤维素和海藻酸钠的比例可以为约15:1至3:1。或者，甲基纤维素和海藻酸钠的比例可以为约10:1至3:1。进一步可选地，甲基纤维素和海藻酸钠的比例可以为约8:1至3:1。在一个优选的实施方案中，甲基纤维素和海藻酸钠的比例为约6:1。
已知甲基纤维素凝胶在较高温度下粘度会增加。将甲基纤维素和海藻酸钠以诸如6:1比例进行混合，形成混合物，则有利于提供热稳定的组合物，因为与甲基纤维素相反，海藻酸钠在较高温度下具有低的凝胶粘度。
在生长培养基中提供凝胶形成复合物，以形成水凝胶基质，例如甲基纤维素，其用量可足以形成水凝胶。可以在生长培养基中以约6％的重量体积比(w/v)提供甲基纤维素等凝胶形成复合物。水凝胶可包含4％-16％的重量体积比的甲基纤维素。在另一个实施例中，水凝胶可包含4％-16％的重量体积比的甲基纤维素和0.1-1％重量体积比的海藻酸钠。在另一个实施例中，水凝胶可包含4％-16％重量体积比的甲基纤维素和0.1-1％重量体积比的琼脂。在另一个实施例中，水凝胶可包含4％-16％重量体积比的甲基纤维素和0.1-1％重量体积比的角叉菜胶。
水凝胶基质可以例如通过以下方式成形，即在凝固为水凝胶之前，将水凝胶组合物倒入模具中(这在本文中也被称为“浇铸”)。在一个实施例中，水凝胶基质作为层状结构提供。该层状结构的厚度可以在0.2cm和5cm之间。该层状结构的厚度可为约1cm，例如用作结构件的时候。该层状结构的厚度也可以小于1cm。在一种实施方式中，水凝胶基质可被成形为砖块或瓦片(例如，矩形棱柱形状)。水凝胶基质的表面可以是不均匀的(即非平面状的)，例如可包含脊、凸缘、突台、凹口、凹槽、通道、隆起和起伏(例如波状图案)中的一种或多种。
在另一个实施例中，可以在生物矿化形成生物矿化材料之前对水凝胶进行3D打印以形成期望的形状。在另一个实施例中，生物矿化材料可以在生物矿化过程之后通过铣削或雕刻等方式来成形。
水凝胶基质的3D形状可以转化为生物矿化材料的最终3D形状。表面图案的设置可以为生物矿化材料提供美观的形式。不均匀/非平面的表面的好处是，所产生的脊、凸缘、突台、凹口、凹槽、通道、隆起和起伏可以提供一种功能，即取决于水凝胶基质和所述微生物的位置，使得水凝胶基质和所述微生物位于光强较高或光强较低的区域中。例如，凹槽、凹口或通道可以帮助部分地遮蔽水凝胶基质，以防止其干燥。
生长培养基
技术人员可以理解，所述生长培养基可以是任何生长培养基，其至少适于维持所述微生物的活力、并优选地能维持所述微生物的生长。在所述微生物是蓝藻细菌的实施例中，生长培养基可以是BG11培养基或其等同物。生长培养基中可以提供适当的微量元素。
氯化钙
技术人员可以理解，任何钙离子源均可应用。所述氯化钙可包含二水合氯化钙溶液(CaCl2·2H2O)或由二水合氯化钙溶液(CaCl2·2H2O)组成。或者，所述氯化钙可包含无水氯化钙。所述氯化钙可以按约0.01M至约1M之间的浓度提供。在另一个实施方案中，所述氯化钙可以按约0.1M至约1M之间的浓度提供。在一个实施例中，所述氯化钙以约1M的浓度提供。在另一个实施方案中，所述氯化钙以约0.1M的浓度提供。在另一个实施方案中，所述氯化钙以约0.01M的浓度提供。
生长条件
在所述微生物具有光合作用和/或趋光性的实施例中，所述微生物在水凝胶基质中的矿化期可以通过设置光源来实现。光源可以是环境光或定向光。光源可以是自然光(即日光)或人造光。光源可以具有足够的强度和合适的波长以促进光合作用和/或趋光性。技术人员可以理解，可以根据诸如材料的厚度、骨料的半透明度和微生物的类型等因素来调节光照强度。可以使提供的光照强度能产生一个透光区(Zeu)，来使得整个材料中均可发生光合作用。可以按约360勒克斯和3200勒克斯之间的强度来提供光照。可以按约2200勒克斯的强度提供光照。可以按至少100μmol/m2/s的强度提供光照。在另一个实施例中，可以按至少200μmol/m2/s的强度提供光照。在另一个实施例中，可以按至少300μmol/m2/s的强度提供光照。在另一个实施例中，可以按至少400μmol/m2/s的强度提供光照。在另一个实施例中，可以按200μmol/m2/s和800μmol/m2/s之间的强度提供光照。在另一个实施例中，可以按400μmol/m2/s和800μmol/m2/s之间的强度提供光照。可以按不超过800μmol/m2/s的强度提供光照。光照强度可足以满足微生物的生长，并且，不能超过阻碍微生物生长的水平，例如由于来自光源的过多热能或过多的干燥效应而阻碍微生物的生长。
光的波长和强度可以决定生长和形成材料的特性。红色波长(例如750nm左右)的光可以触发蓝藻细菌的趋光运动，可以用来控制蓝藻细菌在材料内部的生长方向。因此，光照可以具有红色波长，例如在620nm和750nm之间(例如约750nm)。蓝色波长(例如约450nm)的光可以触发快速的细胞分裂和潜在的碳酸酐酶的产生，这可以帮助更多的生物矿物质的形成。因此，光照可以具有蓝色波长，诸如在450nm和495nm之间(例如，大约450nm)。此外，400-800μmol/m2/s的高强度光照可以增加生物矿物质的形成。
所述微生物的矿化期可以被认为是所述微生物的生长过程与该方法中的材料的矿化期相一致的时期。该矿化期也可称为微生物的培养过程。这种培养过程以不与水凝胶基质分离的方式进行。
所述微生物的矿化期可以处于适合微生物维持和/或生长的温度。在一种实施方式中，该温度是室内环境温度(例如约24℃)。在另一个实施例中，该温度是室外环境温度。在另一个实施例中，该温度在约4℃至约24℃之间。在另一个实施例中，该温度在约14℃和约24℃之间。在优选的实施方案中，该温度在约20℃和约25℃之间，以最适于生物矿物质的形成。
所述微生物的矿化期可以持续至少14天。在一种实施方式中，所述微生物的矿化期可以持续约21天。在另一个实施方案中，所述微生物的矿化期可为3周之内。在用微生物矿化21天后，或可充分形成生物矿化材料。在用微生物矿化21-45天后，或可充分形成生物矿化材料。
在一些环境条件下，所述微生物可以保持活力至少75天。在另一个实施方案中，在一些环境条件下，所述微生物可以保持活力至少180天。在所述微生物是蓝藻细菌的实施例中，蓝藻细菌可以在湿润条件下以增殖细胞状态保持活力至少75或180天。所述微生物是否保持活力可以通过微生物在营养物存在的条件下继续生长的能力来确定。
在生物矿化材料干燥之后，所述微生物可以通过孢子或类孢子细胞的形式保持活力，并且能够在补水之后重新进入增殖细胞状态，例如在干燥之后长达6个月的期间保持活力。
在一种实施方式中，水凝胶基质中的微生物的矿化期可以不在无菌条件下进行。
有益地，本发明已被证明，不管是否处于无菌状态(例如为了避免污染物而设置的无菌状态)，均能够形成生物矿化材料。这使得生产过程更加实用且资源消耗更少。
其他方面
根据本发明的另一方面，提供了一种生产包含碳酸钙结合骨料的生物矿化材料的方法，该方法包括：
在水凝胶基质中培养微生物，其中所述微生物将细胞外碳酸酐酶释放到所述水凝胶基质中，并且具有滑行移动能力以及趋光反应和趋化反应，并且，
其中所述水凝胶基质包含：
i)水凝胶，该水凝胶包含甲基纤维素和一种或多种其他有机凝胶复合物，或由甲基纤维素和一种或多种其他有机凝胶复合物组成；
ii)骨料；
iii)生长培养基；以及，
iv)氯化钙(CaCl2)，
其中，所述细胞外碳酸酐酶将所述氯化钙转化为碳酸钙沉淀物，从而将所述骨料结合，以形成所述生物矿化材料。
根据本发明的另一个方面，提供了一种用于生产包含碳酸钙结合骨料的生物矿化材料的组合物，该组合物包含水凝胶基质，其中该水凝胶基质包含：
i)水凝胶；
ii)骨料；
iii)生长培养基；
iv)氯化钙(CaCl2)；以及
v)微生物，其中该微生物能够表达胞外碳酸酐酶并将其释放到水凝胶基质中。
根据本发明的另一个方面，提供了一种用于生产包含碳酸钙结合骨料的生物矿化材料的组合物，该组合物包含水凝胶基质，其中该水凝胶基质包含：
i)水凝胶；
ii)骨料；
iii)生长培养基；
iv)氯化钙(CaCl2)；以及
v)微生物，其中该微生物能够表达胞外碳酸酐酶并将其释放到水凝胶基质中。
根据本发明的另一个方面，提供了一种生物矿化材料，其包含：
i)水凝胶或干燥水凝胶的生物矿物质；
ii)碳酸钙粘结的骨料；
iii)丝状蓝藻细菌或其能够形成丝状蓝藻增殖细胞的孢子样细胞，其中丝状蓝藻细菌能够表达胞外碳酸酐酶。
根据本发明的另一方面，提供了根据本发明的方法生产的生物矿化材料。
该生物矿化材料还可包含与上述iii)丝状蓝藻细菌不同的一种或多种另外的微生物。一种或多种另外的微生物可以是不同种类的蓝藻细菌。
有益地，该生物矿化材料可以提供半透明的再生/自修复材料，并且可以在长期的使用期间保持固碳功能。该材料可以根据美观要求和/或功能要求进行成形，例如通过对形成该材料的水凝胶进行预成形，或通过机械加工进行成形。丝状蓝藻细菌的持续活力可以使材料根据光照和营养条件在黄色、绿色和蓝色之间动态改变颜色。
根据本发明的另一方面，提供了颤藻属微生物在形成生物矿化材料中的应用。其中，该应用是在具有骨料、生长培养基和氯化钙(CaCl2)的水凝胶中，用以促进碳酸钙沉淀和所述骨料的结合，从而形成生物矿化材料。可选地，其特征在于，该水凝胶包含甲基纤维素和海藻酸钠，或由甲基纤维素和海藻酸钠组成。
根据本发明的另一方面，提供了本发明的生物矿化材料作为建筑物外墙材料的应用。
定义
术语“滑行移动能力”在本文中指的是，微生物使用的一种易位方法，其不依赖于推进结构，例如鞭毛、菌毛和纤毛。滑行移动使微生物能够沿着低水膜表面移动。
术语“趋光反应”在本文中指的是，整个生物体朝向或远离光刺激的方向移动的动作。这对于光合生物是有利的，因为它们可以最有效地调整自身方向以接收光进行光合作用。
术语“趋化反应”在本文中指的是，生物体响应于化学刺激的运动。
术语“半透明”在本文中指的是传输光的能力。半透明度可以包括光学透明度。
材料的透明度是通过其总透射率来测量的。总透射率是透射光与入射光的比率。影响因素有两个，即反射率和吸收率。例如：入射光＝100％-(吸收率＝-1％+反射率＝-5％)＝总透射率＝94％。
触变性被理解为某些凝胶的可逆行为，当它们被摇动、搅拌或以其他方式扰动时，这些凝胶会液化，并在静置后复原。触变性可以通过流变学测量来确定，该流变学测量涉及本领域技术人员已知的一种或多种剪切、流动和振荡测试。
技术人员可以理解，本发明的第一方面或任何方面或实施例的可选特征可以应用于本发明的所有方面。
现在参考以下实施例，将示例性地描述本发明的具体实施方式。
图1：动物颤藻生物膜与前述不同水凝胶组合物在7天的时间内的相互作用情况。
图2：在400倍放大倍数下，动物颤藻生物膜与河沙(左)、活性炭(中)和无定形二氧化硅(右)等高微孔骨料的结合相互作用。
图3：在400倍放大倍数下，在甲基纤维素凝胶基质的横截面中，可以看到动物颤藻毛状体的三维生长。
图4：光合工程活性材料(PB-ELM，英语为Photosynthetic Engineered LivingMaterial)原型在16天的时间内的生长情况。将SiO2骨料悬浮在培养皿中的、添加有0.1M的CaCl2·2H2O的、并接种有动物颤藻的、6:1的甲基纤维素-海藻酸钠水凝胶中。该样品在12天内完全生长，并在4天内脱水。
图5：展示了在日光(左)和人造光(右)下的光合生物矿化的工程活性材料。
图6：在400倍放大倍数下观察到的，成熟的ELM中的将SiO2骨料结合在一起的光合活性蓝藻生物膜。
图7：通过超绿指数(ExG)图对PB-ELM进行生长分析。从左侧开始的各列分别为：i)不同时间的生长图像，ii)ExG指数识别图，iii)ExG指数的图像分割，iv)显示分割阈值的直方图。
图8：生长分析图：RGB值的总色度(左)、总ExG指数(中)和总绿色面积(右)。
图9：A：ExG指数、体积和各种ELM样品生长所需天数的数据(上图)。B：时间(函数)与ExG指数和体积(自变量)的线性回归图。R(ExG)＝-
0.007且R(体积)＝0.210。
图10：通过HSV色彩分析对在4度和360勒克斯(上一行)、24度和3200勒克斯(中间行)以及在14度和2200勒克斯(下一行)条件下生长的样品在7天内进行的光合健康状况鉴定。
图11：中尺度原型的数字化设计，由基于数学模运算符的脚本生成，并通过PB-ELM分析的HSV色彩数据输入进行增强，以实现模拟结果的可视化。
图12：数字化设计经过3D打印和真空成型来制作透明模具。模具与PB-ELM一起培养并生长30-45天。第1天、第10天和第20天的生长阶段(上图)以及第34天完全生长的中尺度PB-ELM模具的特写(下图)。
图13：在中尺度原型中观察到蓝藻成功生长至3.5厘米的厚度。
图14：脱模后的尺寸为16x8x1.5厘米的具有光合活性的PB-ELM中尺度面板/互锁砖块。
图15：具有不同骨料类型和比例的不同PB-ELM版本——5mm无定形二氧化硅、4:1的5mm无定形二氧化硅+5mm活性炭、2mm无定形二氧化硅、2:1的2mm无定形二氧化硅+无定形二氧化硅粉末。
图16：动物颤藻的典型生物膜模式(左)，在缺水条件下观察到的休眠细胞的形成——深色厚壁细胞(中)，400倍放大倍数下在6个月的脱水水凝胶中观察到的呈绿点状的分离的休眠细胞(右)。
图17：在退化阶段(左)、部分生长阶段之后(中)和完全生长阶段之后(右)测试的动物颤藻的趋光运动。
图18：不同种类的丝状蓝藻在6％甲基纤维素凝胶上42天的生长比较。
图19：FTIR图比较了ELM样品和对照样品的成分，并显示了碳酸钙矿物的存在。
图20：显示了ELM样品和对照样品之间的抗压强度比较的图表。
图21：ELM在333小时生长期的CO2的PPM水平图。
图22：ELM在333小时生长期的浇铸箱内的温度和湿度模式图。
图23：固化ELM样品1的CO2吸收趋势。
图24：固化ELM样品2和样品3的CO2吸收趋势。
图25：三个ELM样品的CO2吸收趋势比较。
图26：细胞活力和再生能力测试。50天的成熟PB-ELM原型保存在自然暴露的室温条件下，并添加有BG11营养培养基。14天后，观察到新的生物膜从PB-ELM中蔓延出来，表明细胞活力活跃。脱水6个月后观察到动物颤藻生物膜复活。完全生长的琼脂凝胶生物膜在6个月的时间内脱水。可见的生物膜模式消失，但发现了孤立的绿色休眠细胞。脱水凝胶补充营养后，新的生物膜在2个月内重新生长。
实施例1
自下而上的组织工程方法，受叠层石启发，用于开发可规模化、可再生的光合生物矿化工程活性材料(PB-ELM)。
1.简介
生物技术、材料科学和人工智能等领域的最新进展正在为新的跨学科研究领域开辟道路，而这些研究领域在以前是不可能出现的。工程活性材料(ELM)就是这样一个新兴且快速发展的领域。ELM是一类智能化生物增强材料，其构建和特性由活细胞控制[1,2]。从历史上看，人类文明中的材料一直被视为预先存在的无生命元素，它们可以通过纯粹的物理手段(例如加热或加压)来提取、重塑和重新组合。尽管这些工艺过程已经取得了巨大的成就，可以生产出当今存在的令人难以置信的各种材料，但这些方法最终得到的结果通常具有固定的物理和化学性质。此外，它们通常是单向能量转移机制，因此考虑到我们今天面临的全球环境挑战，它们是不可持续的。相反，所有生命系统都通过并行机制运行，其中维持其生存所需的生物材料，如蛋白质和组织，是通过生长或自下而上自主组装的方式形成的。生物材料是分级的，因此效率极高。它们会对环境条件做出反应，因此其特性具有固有的灵活性，或者具有自我修复和再生能力。这些材料适合更大的能量流循环，使其在环境问题上具有可持续性[3]。工程活性材料领域的目标是将迄今为止仅存在于生命系统中的这些复杂特性嵌入到功能设计材料中。在此过程中，还在生物医学、先进电子设备、软体机器人和建筑等领域发现了新的解决方案[4，5，6]。
由于这一研究领域最近才出现，并呈现出如此多样化的可能性，因此人们尝试了对其发展进行分类，来创建合理的分类系统，并确定具有挑战性的特定领域，以取得进一步的进展。Nguyen等人和W·Srubar在对最近ELM发展状态的详尽回顾中，根据开发ELM所采用的方法确定了两个主要的类别。第一类是工程蛋白质和生物膜，其中各种微生物产生的次生代谢物和化合物被利用、修饰[7]或合成引入，以实现所需的功能材料性能，例如自组装、表面图案结构或生物传感[8，9]。这一类ELM严重依赖合成生物学技术，并在微观尺度上进行操作[10,11]。第二类方法更加自上而下，其将细胞和生物膜悬浮在基质或支架中生长，并产生想要的结果。这类方法依赖于组织工程技术，并且生产出的ELM是一种人工生成的含有生物和非生物元素的活性复合材料[12,13]。
W·Srubar还指出，目前在各个ELM领域中均存在一些关键的限制因素和挑战。第一个挑战与扩大规模有关，因为大多数自下而上的方法都适用于微观结构。在微电子和机器人等某些领域，规模可能不是问题，但在建筑等其他行业，规模则至关重要[4，5，6]。第二个挑战是生产和活性材料生长所需的时间，这也和第一个挑战直接相关。由于生物过程速度缓慢，因此这些ELM可能无法在商业上可行的时间内完成生长。第三个挑战是如何维持细胞/生物体的长期活力[14]。基于化学营养系统的ELM需要维持在合适的环境条件下，并持续提供适当的营养物质。对于依赖转基因生物的系统，生物防护是应用过程中的另一个挑战[15]。尽管基于野生型生物体运作的ELM不会面临这一挑战，但自然生命系统通常需要在由其他细胞和微生物构成的复杂网络/综合体中运作。实现多物种共生运行的基于综合体的ELM可以极大地增强它们的特性或解决前面提到的一些限制[16,17]。最后，重要挑战之一在于，这是一个崭新的跨学科研究领域，因此缺乏经过跨学科培训的人力资源以及评估和分析这些材料的工具和方法。因此需要开发新的工具集和工艺来研究、生产和应用ELM。
本项研究旨在展示一种新型光合生物矿化工程活性材料(PB-ELM)，它克服了上述的所有现有的限制因素。这种PB-ELM的灵感来自于天然叠层石，这些叠层石是由光合蓝藻群落形成的生物矿化岩层[18]。已知此类系统中碳酸盐沉淀的过程与细胞外碳酸酐酶的释放有关，细胞外碳酸酐酶的是其固碳机制中的一种手段[19]。然而，丝状蓝藻在自然条件下形成的生物膜为二维膜，因此叠层石的生长过程需要数百年才能完成[20]。而采用组织工程原理衍生出的一种水凝胶组合物，则可以充当蓝藻生物膜的支架，以克服其二维性质，并实现三维生物膜的生长。可将如SiO2等天然且储量丰富的吸湿性透光骨料悬浮在水凝胶中。因此，生物矿化的光合活性材料在几周内即可自下而上地生长出来。此外，还开发了定制化的计算机视觉机器学习程序，来分析和研究ELM的健康状况，从而有助于材料的大规模生产。从分析程序中获得的数据通过数字化编码，可生成更大尺寸原型的算法设计。在制造模具中，使用了增材制造和真空成型等制造技术，并通过开发设计的中尺度原型的生长试验，成功验证了BP-ELM的规模化生产的可能性。这种材料坚硬、轻质、半透明，并且能进行活跃的光合作用，因此为开发负碳活性建筑以改变气候变化的进程提供了革命性的机会。
2.讨论
2.1蓝藻细菌、叠层石和生物矿化：
众所周知，地球在前寒武纪(45亿年前)的大气状态以二氧化碳为主，不利于任何生命形式的存在。蓝藻细菌是革兰氏阴性真核细菌，已知是太古代地球上最早出现的物种之一，具有非凡的光合作用能力[21]。它们可以利用太阳的能量来转化可用的环境元素作为营养物质，并维持生命的新陈代谢。众所周知，这种通过将富含二氧化碳的大气转化为维持当今所有其他生命形式的富氧环境的过程，在当今生物圈的进化中发挥了极其重要的作用[22]。蓝藻细菌对二氧化碳的固化有两种主要模式，第一种是通过光合作用期间的卡尔文·本森·巴萨姆(CCB)循环，其中二氧化碳被捕获并转化为有机化合物；第二种是通过碳酸盐矿化，其中二氧化碳被转化为碳酸盐矿物，这一模式可以明显地通过叠层石的出现来看出[23]。
叠层石是由蓝藻微生物的交织物形成的生物矿化活性岩层。叠层石中碳酸盐矿化的过程已知与蓝藻细菌的碳浓缩机制(CCM，英语为Carbon Concentration Mechanism)以及细胞外碳酸酐酶的产生有关[19，24]。CCM是蓝藻细菌进化出的一种普遍存在的策略，用于利用溶解在水中的二氧化碳。溶解的CO2以碳酸(H2CO3)的形式存在，分解后形成碳酸氢根离子(HCO3 -)，可被蓝藻吸收并用于光合作用(方程式1)。已知这些离子的平衡会受到介质的pH度的影响，较高的pH度使平衡向CO2移动，而较低的pH度使平衡向HCO3 -移动。本文的方法可以设置适合于产生HCO3 -的pH度。碳酸酐酶可催化CO2向HCO3 -的转化，从而导致微环境中出现过饱和状态[19，23，24]。碳酸酐酶的作用非常重要，因为它是已知作用最快的酶之一，每秒可进行106次转化，并且已发现它可使固碳量增加高达40％[24，25]。在环境中存在Ca+离子的情况下，这些碳酸氢根离子可以形成碳酸钙，但该反应的发生存在显著的动力学障碍[23](方程2,3)。已知蓝藻细菌的外膜和细胞外多糖层具有净负电荷。这种物理条件通过形成成核表面，克服了这些动力学障碍，从而实现碳酸钙矿物沉淀[23]。由于砂粒等无机惰性骨料颗粒被捕获在微生物交织物中，这种矿化过程会产生结合现象，从而形成石化岩层。
[方程式1]
[方程式2]
[方程式3]
碳酸钙的微生物沉淀已用于地质工程工艺以及用于开发建筑行业的工程活性材料[26,27]。然而，这些系统中的大多数均依赖于趋化脲酶诱导的途径[6]。Heveran等人首次(2020年)证明，可以利用这种化学过程，通过将砂粒悬浮在明胶凝胶中，并将其与预培养的单细胞聚球藻蓝藻细胞混合，来制造工程活性建筑材料[28]。通过电子显微镜和光谱学手段检测到了碳酸钙矿物的形成，结果表明，这些生物矿化ELM样品的断裂强度高于非生物样品。这是一种自上而下的方法，验证了该流程的可行性；然而，它不具备自然界存在的自下而上的叠层石形成过程的优点。叠层石主要是由可产生丝状交织物的蓝藻细菌物种形成的[18]。这些物种大多数具有滑行移动的能力，因此能够穿过叠层石来调节它们对光和营养的需求[29]。这使得蓝藻细菌能够在蓝藻中栖息极长的时间(数百年)，并赋予了叠层石的再生特性和活跃物理生长的特性[20]。在Heveran等人采用的方法中，通过在模拟的温度和湿度条件下培育样品，可以将ELM的活力维持最多30天，从而允许材料在维持期内连续再生。但由于细胞被物理固定，以及不透明骨料产生的固有的不利的光照条件，蓝藻细菌无法实现自然的长期生存。因此细胞需要单独培养，以及其要求的模拟条件在工业应用和生产上存在实用性的问题。本项研究的目的是利用相同的矿化过程，但代以自下而上的结构化策略，来实现和叠层石相同的特性。
2.2物种选择和研究方法
由于目标是实现自下而上的方法，因此第一步是确定合适的蓝藻细菌物种。我们测试了六种不同的可获得的丝状蓝藻物种——圆柱形鱼腥藻(Anabaena cylindrica)、念珠藻属(Nostoc sp)、单歧藻属(Tolypothrix sp)、(粘球藻属(Gloeocapsa sp)、动物颤藻(Oscillatoria Animalis)和钝顶螺旋藻(Spirulina Platensis)。已知每个物种都具有不同的形态和生理特征，如假分枝、形成异形细胞、产生胞外聚合物(EPS)和滑行移动能力等。这些物种在三种不同的条件下进行了培养——标准的琼脂BG11培养基、0.1M氯化钙浓度的琼脂BG11培养基和带有砂骨料的BG11液体培养基。最后，动物颤藻因其快速的生长速度、以及由于其滑行移动行为而形成的复杂的交织生物膜模式而被选为模型物种。复杂的交织生物膜模式表现出结合砂粒的固有倾向。
颤藻是一种丝状蓝藻细菌，因其运动时的振动而得名。它常见于淡水槽附近，但在陆地条件下也有报道。众所周知，它可以产生长毛丝并通过裂殖的方式进行繁殖[30]。生物膜模式被认为是其毛状体表面上的螺旋原纤维层造成的一种现象，在沿表面滑行时，该螺旋原纤维层会产生圆形分布的力[29]。然而，它并不是一个被广泛研究的物种，因而人们对其复杂的生长行为知之甚少。因此，我们在各种生化和生物物理条件下对其生长特性进行了观察，例如其在液体介质中与不同物理支架的相互作用。据了解，由于其二维成膜性质，传统的生长评估技术(例如光密度测量)并不适用。同时，由于我们的更广泛的目标是评估ELM在室外应用条件下的生长，因此针对前面提到的ELM领域的主要挑战，确定了需要定制设计的评估工具。
我们开发了两种计算机视觉图像分析工具作为评估动物颤藻生物膜的非破坏性方法。第一个工具通过计算培养图像的总绿色像素和超绿指数来评估生物膜的生长速度和范围。超绿指数(ExG)通常用于测量植物生物量对土壤和残留物的影响，用于生态研究中的遥感测量[31]。该函数定义为将图像的红色、绿色和蓝色的强度(也称为色坐标)进行标准化，并计算给定图像中每个像素的ExG指数。总绿色像素和ExG参数图都与实验观察结果相关，但通过测试来自不同培养物的图像，我们发现ExG指数构成的参数更加准确。本实施例的目的是评估生物膜/菌落水平的生长，因此该工具无法预测培养物的生物量的增长，但其得到的定量数据可以帮助了解培养物的生长速率并确定关键生长水平。
第二个工具用于评估生物膜的光合作用健康状况。众所周知，碳浓缩机制以及碳酸酐酶的产生与蓝藻细菌的光合活性密切相关[32]。据报道，碳酸酐酶的抑制会降低净光合生产率和总光合生产率[24]。光合活性还与光捕获藻胆体色素复合物相关，该复合物赋予蓝藻细菌其特有的蓝绿色[33,34]。我们在最初的实验中注意到，某些培养物在营养缺乏或不利的光照条件下会改变颜色，表明其光合作用健康状况出现了恶化。这种颜色变化的评价会受到人眼的主观感觉的影响，但可以通过对图像的色调、明度和饱和度(HSV)值进行数字分析来得出准确的值[35]。这些主要颜色的RGB和HSV值均已被分析[36]。可以注意到，在营养充足的条件下，色调值范围为60-80，而在营养缺乏的条件下，色调值高于80。这表明了最佳光合作用活性的阈值颜色，也就是最佳的产生碳酸酐酶的阈值颜色。
2.3假设和初步进展
Dupraz等人将生物矿化过程分为三种不同的类别。第一种是生物控制的矿化，发生在骨骼和贝壳中；第二种是生物诱导的矿化，例如叠层石中的矿化；第三种是生物影响的矿化，其中的矿化本身是一种地球物理现象，但有机质的存在会影响其晶体形态和组成[19]。尽管过程各不相同，但已知在各种条件下形成的生物矿物质都符合真正矿物质的标准，同时生物碳酸钙与无机碳酸钙相比又具有不同的特性。取决于具体的基质和结构，生物矿物质具有独特的晶体形态，它们是注入了有机物的晶体团聚体。与非生物碳酸钙相比，它们还表现出较高的纳米压痕硬度[37]。在人工组织工程领域，水凝胶(一种亲水性聚合物的三维网络)已被试验证实可用于生长矿化组织，其结果类似于骨骼等天然组织[38,39]。Nindiysari等人和Asenath-Smith等人已经展示，在水凝胶基质中形成的矿物质具有相似的仿生形态和有机-无机混合成分[40,41,42]。
基于人工微生物组织工程方法，我们提出了一种叠层石形成过程的替代过程。最重要的障碍之一是，蓝藻生物膜在自然条件下总是以二维片状生长的，因此叠层石每次形成一个微层，需要数百年才能达到显著的厚度。而作为替代过程，可以立即将所有骨料层悬浮在含有营养物和钙离子的水凝胶基质中，并接种蓝藻细菌。如果蓝藻细菌能够穿过水凝胶基质生长并包围骨料，则细胞外碳酸酐酶的释放将使骨料内的碳酸钙晶体沉淀，从而在很短的时间内获得生物矿化的活性材料。水凝胶通常用于固定细胞，因此我们测试了一系列不同的水凝胶复合物以观察相互作用——琼脂、明胶、壳聚糖、海藻酸钠、甲基纤维素、卡拉胶、丝素蛋白和聚丙烯酸钠(图1)。发现了动物颤藻和甲基纤维素具有独特的关系，以及蓝藻生物膜可以在基质的三维结构中生长，实现了重大突破(图3)。然而，已知甲基纤维素凝胶在较低温度下粘度会增加。另外在交联海藻酸钠中观察到了部分生物膜生长[43,44]。在所有其他水凝胶复合物中，仅存在生物膜的表面生长。经过后续测试，得到了甲基纤维素-海藻酸钠(6:1)的优化水凝胶组成比例，该比例可实现快速的三维生长，同时具有低粘度的均匀的凝胶结构。该组合物是热稳定的，因为与甲基纤维素相反，海藻酸钠在较低温度下具有高凝胶粘度[45]。目前尚无法确定这种独特相互作用的原因。可能的解释之一是，甲基纤维素-海藻酸钠水凝胶已知具有触变性，它对垂直力的反应像固体，但对平面力的反应像液体[46]。由于已知颤藻属细菌具有特有的振动倾向，而振动使水凝胶在其微环境中表现得像液体，这使得它可以按三维形式生长，但作为一个整体，它的行为像半固体凝胶。
下一步是测试动物颤藻生物膜与不同类型骨料的相互作用——棉纤维等纤维素基骨料、丝瓜、砂粒、活性炭和无定形二氧化硅(SiO2)。可以理解，具有高微孔表面比表面积的骨料(例如活性炭和SiO2)具有与生物膜固有的结合倾向。显微成像显示，蓝藻毛状体可以通过相邻颗粒的孔隙交织在一起，形成连续的交织物(图2)。活性炭的微表面比表面积为3000m2/g，但它是深色不透明的，不适合透光。SiO2的微表面比表面积较低，为800m2/g，但其在干燥时半透明，湿润时透明。二氧化硅还具有天然吸湿性，并且由于其能够吸收空气中的水分而被广泛用作干燥剂[47,48]。R·Ciriminna等人之前曾提出，无定形二氧化硅的这些固有特性非常适合作为开发先进材料的基础[49]。此外，与正在成为稀缺建筑资源的河沙相比，二氧化硅被称为地球上第二丰富的矿物，具有巨大的尚未开发的资源潜力。因此，我们选择二氧化硅作为ELM的理想骨料。
结合这两项研究的观察结果，我们将SiO2晶体悬浮在具有BG11介质和0.1M浓度的氯化钙溶液的甲基纤维素-海藻酸钠凝胶中。体积为2.94立方米的材料在室温下生长了12天，并脱水了4天(图4)。实现了一种刚性、轻质、半透明、吸湿的具有活跃光合作用的生物矿化工程活性材料原型(图5)。这种方法是自下而上的，因为细胞不需要单独培养后再混合到任意选择的骨料基质中。三维生物膜的生长是有机的，并且微观结构的相互作用和骨料的生物矿化均受到蓝藻细菌的控制。显微图像显示，活跃的蓝藻生物膜在骨料之间形成了结合桥(图6)。
2.4规模的扩大和中尺度原型
ELM样品的生长受两个因素的影响：接种量和样品体积。利用前面提到的计算机视觉图像分析程序，导出基于回归分析的机器学习模型来预测较大原型的生长和行为。由于动物颤藻具有成膜倾向，因此很难根据细胞生物量来量化ELM生长所添加的接种物的准确的量。但是，可以通过分析ExG指数来量化ELM接种的表面积(图7、8)。通过绘制时间因变量与体积和ExG指数自变量的关系，可以绘制多元回归分析图，并确定因素之间的关系(图9)。根据9个样品的数据，确定回归系数R(ExG)＝-0.007和R(体积)＝0.210。通过分析更多的样品，可以使这些数值更加准确，并且可以准确估计出，在所需时间范围内，给定体积的ELM的生长所需的接种量的ExG值。
同时，对BP-ELM样品进行了HSV颜色分析，以了解ELM的光合健康状况(图10)。据观察，蓝藻细菌的色素表达取决于营养物质的可获得性以及光照的量和持续时间。该数据可以与样品的材料强度分析数据相关联，并且可以进行类似的回归分析，以导出光合色素的表达和材料强度之间的关系。这有助于直观地识别较大原型中的矿化程度，并在需要时添加营养补充剂。同时，可以使用环境模拟软件来分析ELM安装时的光照和温度条件，并可以设计ELM理想的形态表达，以实现所需的生长和矿化。
上述分析是在名为Houdini-SideFx的软件中进行测试的。首先，使用基于模运算符的数学算法来生成设计表达式。通过分析室外条件下表面的曲率来确定设计的表面暴露量。然后将HSV颜色数据添加到脚本中，以生成生长完成后的BP-ELM的可视化结果(图11)。我们创建了各种不同的迭代结果。然后对设计结果进行3D打印，并使用真空成型来制作尺寸为16x8x2厘米的透明模具(图12)。测试的最大模具厚度为3.5厘米(图13)。然后将这些模具与BP-ELM一起培养，并在室温和光照条件下完成35天的生长周期(平均温度＝15度，平均光强度＝2400勒克斯)。最后成功地生长和得到数字化设计的BP-ELM样品(图14)。
2.5BP-ELM特性
物理特性——该BP-ELM具有刚性、坚硬且重量轻，密度约为3g/cm3。可以更改骨料类型，例如无定形和结晶SiO2(石英)及其比例，以获得不同物理特性的版本(图15)。这使得BP-ELM成为理想的包覆材料，并且能够以所需的数字化生成的形状进行铸造，因此可以用作光合作用建筑的外墙。尽管Heveran等人证实了光合生物矿化可实现矿物的形成和断裂强度的增强，但其BP-ELM并未用电子显微镜扫描并用动态材料分析仪进行分析。而在确定了准确的抗压强度、断裂强度和弯曲应力之后，就可以设计出理想的应用场景，并采用适当的加固措施来实现更高承重能力的建筑结构。
细胞活力——本实施例的BP-ELM预计将具有超越之前的ELM的活力，并由于多种原因，可在自然条件下长期保持活性。据报道，与单细胞物种不同，动物颤藻是一种在水槽和陆地条件下都有发现的有韧性的物种。初始的骨料，如非晶态SiO2具有自然吸湿性和透明性。完全湿润后则会变得透明。这种固有的特性为蓝藻细菌维持自身的新陈代谢创造了理想的微湿和透光条件。同时，已知有许多丝状蓝藻物种能够固定空气中的氮并形成休眠细胞，这些休眠细胞可以在恶劣条件下生存极长得时间[50]。为了测试活力，将保存在室温条件下且不含任何营养补充剂的50天的BP-ELM样品浸入BG11液体培养基中。可以注意到，蓝藻生物膜在14天内从材料中蔓延开来(图37)。这证实了该材料在自然条件下具有自愈和再生能力。与Heveran等人报道的聚球藻、Achal等人报道的巨大芽孢杆菌和Bundur等人报道的巴氏孢子八菌的生存期相比，在自然的非模拟的条件下，上述生存期明显更长。同时，为了测试动物颤藻的休眠细胞的形成，我们让蓝藻细菌在5mm直径的标准BG11琼脂培养皿上生长。生物膜生长至表面饱和。显微图像显示，形成了较暗、细胞壁较厚的细胞，这是蓝藻休眠细胞(孢子样细胞)的典型识别特征[51,52]。然后让琼脂板完全脱水6个月。可以注意到，2个月后，生物膜随着细胞的死亡而消失，但分离的圆形休眠细胞仍保持绿色(图16)。6个月后，将脱水的凝胶膜浸入BG11培养基中，可以看到，补充营养1个月后，整个表面变绿，表明实现了休眠细胞的生物膜再生(图37)。
光学特性——除了这些特性之外，BP-ELM的通过湿度可逆的半透明性还可提供其他建筑活性材料中不存在的额外光学特性(图15)。此特性可以为建筑应用的设计增加一个额外的维度。
趋光生物编程——ELM最突出的特征之一是它们是生物可编程的。目前大多数ELM系统都依赖于合成基因工程方法来对其属性进行编程。然而，这在生物防护和自然应用方面造成了限制。在本文提供的方法中，我们提出了一种自然的方法来编程控制蓝藻细菌的外部刺激，以引导生物膜的生长。已知蓝藻细菌表现出趋光行为，并对光的方向、强度和波长做出反应。因此，通过对BP-ELM的曝光进行设计，可以控制动物颤藻生物膜的生长方向，从而实现程序化的生物矿化。我们通过选择性地将颤藻生物膜培养物暴露在琼脂培养皿上，来测试了该假设的可行性。为了测试上述趋光行为，将培养皿的一半用黑色胶带覆盖，并测试了三个阶段：接种阶段、部分生长阶段和完全生长阶段。在接种阶段，观察到生物膜只会向光照区域生长，并且区域之间有一条可明显看出的分隔线。在部分生长阶段，可以注意到被覆盖的生物膜部分略有减少，并且朝向暴露区域的生长率明显更高。在完全生长阶段，覆盖区域和暴露区域之间的生物膜密度存在明显可区分的变化线(图17)。这些变化在14天内就可被注意到。之后还进行了类似的测试，只需使培养物远离阳光直射，并面向单向窗户光源即可。在介质从液体到固体的过渡阶段，以及固体到液体的过渡阶段可注意到趋光反应。这证实了通过趋光操作对BP-ELM进行生物编程的可能性。
生物综合体——最后，ELM领域的挑战之一是，如何实现多物种的共生相互作用。天然叠层石虽然主要由蓝藻细菌形成，但已知其由复杂的微生物交织物组成，其中有许多自养生物和化能生物作为一个群落而发挥作用。这些相互作用已被充分记录，并且可以在BP-ELM上进行测试。然而，作为测试综合体可能性的一种手段，我们在相同的ELM条件下测试了其他五种丝状蓝藻——圆柱形鱼腥藻、念珠藻属、单歧藻属、粘球藻属和钝顶螺旋藻。值得注意的是，在相同的BP-ELM原型条件下，螺旋藻在短时间内表现出显著的生长，而鱼腥藻则在短时间内表现出部分生长。然而，超过21天后，它们的生长就不再持续。单歧藻属表现出缓慢而稳定的生长，但它具有以团块而非薄膜形式生长的自然趋势(图18)。因此，这些物种展示了设计具有可变寿命的生物体综合体的可能性。有些物种生长速度快，而另一些物种生长缓慢，有些物种可以形成薄膜、休眠细胞和异形细胞，使BP-ELM可长期生存。
3.实验和评估程序
初步研究实验
动物颤藻和所有其他蓝藻物种均从Sciento培养实验室获得。随后在离心管(Falcon管)中使用35ml的BG11培养基(补充有BG11微量元素)对每个物种进行液体培养。这些培养物在15度的室温和2400勒克斯的阳光下生长。在生长速率研究实验中，制作了一组1.5％琼脂平板，并分别使用BG11培养基和0.1M浓度的二水氯化钙作为对照组和测试组。每个位置接种了1ml不同的蓝藻菌种培养物。每72小时通过数字和显微图像记录一次观察结果。在砂粒粘合测试中，采购了1.8毫米直径(平均)的河沙并在高压灭菌器中经过灭菌。将8克砂粒倒入9毫米直径的培养皿中，以形成一层厚的砂粒表面层。向平板中补充4ml的BG11培养基，直到砂层明显湿润，并且每个平板接种1ml的各种蓝藻细菌培养物。每72小时通过数字和显微图像记录一次观察结果。
水凝胶实验
选择了九种不同的水凝胶复合物——琼脂、明胶、壳聚糖、海藻酸钠、甲基纤维素、卡拉胶、丝素蛋白、合成锂皂石和聚丙烯酸钠。在单独的烧杯中用BG11培养基制备100ml的每种凝胶。由于这些复合物中的每一种都具有不同的胶凝条件，因此称量各复合物的量之后在表2中提到的条件下进行添加。将0.1M的CaCl2·2H2O溶液添加到每种凝胶中，并且将每种凝胶一式三份地用颤藻属细菌在5mm直径的培养皿中进行接种。另外将每种胶凝复合物接种到一个未添加二水合氯化钙的对照培养皿中。为了接种大约相同量的细胞，通过手动摇动5分钟来使离心管培养物中的生物膜解体，并将1ml培养物添加到微型离心管(Eppendorph管)中并在3000rpm下离心15分钟。接种后的培养皿在相同的环境室温和光强度下生长。连续10天通过数字图像每48小时记录一次观察结果。进行第二组实验，通过去除培养皿盖，在暴露的非无菌条件下生长凝胶，以研究每种凝胶的污染趋势，因为最终目标是获得可用于户外应用的凝胶。
仅在6％甲基纤维素凝胶中观察到了三维生物膜的生长，在3％交联海藻酸钠中观察到了部分生长(在不含氯化钙的对照组海藻酸钠凝胶中则未观察到)。在后续实验中，为了优化胶凝复合物，将1％、2％和3％的海藻酸钠添加到含有0.1M浓度的CaCl2·2H2O的6％甲基纤维素凝胶中，并用上述相同的方式进行接种。据观察，用6％甲基纤维素和1％海藻酸钠的交联实现了三维生物膜的生长。因此我们选择了这种凝胶混合物，因为它能够实现最佳的凝胶一致性和最佳的生长率。
骨料实验
根据初步观察结果，测试了六种不同的骨料。早期研究实验表明，颤藻表现出与2毫米直径的砂粒的结合倾向，因此选择了活性炭(5毫米直径)和二氧化硅(SiO2)(5毫米直径)等多孔骨料。从水凝胶实验中观察到，动物颤藻表现出对甲基纤维素的亲和力，因此选择了3种基于纤维素的骨料——纤维素海绵、丝瓜络和棉芯。这些骨料中的每一种都经过灭菌并修整，以适合直径为5mm的培养皿的体积。向骨料中补充5-10ml的BG11培养基，直至明显湿润，并在前述的离心处理后用动物颤藻进行接种。每48小时后通过数字图像和显微图像记录一次观察结果。为此使用了克恩(Kern)光学显微镜。在砂粒、活性炭和二氧化硅所有这三种多孔骨料中均观察到了生物膜的生长，并且也在基于纤维素的骨料中观察到了生物膜生长。虽然活性炭因其高微孔隙率而表现出最佳的粘合趋势，但二氧化硅被选为理想的骨料，因为其吸湿性和半透明性的附加特性为长期生长提供了理想的条件。
原型和细胞活力实验
根据水凝胶和骨料实验的观察结果，建立了原型实验。将8g的5mm直径的SiO2骨料添加到12ml的6:1甲基纤维素及海藻酸钠凝胶与0.1M浓度的CaCl2·2H2O的混合物中，并用1ml离心分离的细胞进行动物颤藻细胞的接种。在环境室温和光照条件下进行一式三份的样品的培养。12天后，发现生物膜已完全生长至整个体积。除去盖子，并让样品在室温下暴露的条件下干燥。干燥4天后，样品完全脱水并从培养皿中脱模。获得了BP-ELM原型。
将原型在室温下且暴露的条件下保存50天，不添加任何营养培养基。观察到样品保持了绿色。将样品采集到直径为9mm的较大的培养皿中，并添加5ml营养培养基，将其浸没。14天后，观察到原型样品中出现的生物膜生长覆盖了9毫米培养皿的表面，证明了材料内蓝藻细菌的生存能力。
趋光性实验
为了测试趋光行为，使用了15％琼脂凝胶和补充有0.1M浓度的二水氯化钙的BG11培养基。目的是测试是否只有生长过程对光照有反应，或者生长完成的生物膜也能对光照做出反应。在间隔14天和7天后对三组平板分别进行接种。在第21天，第一组平板含有完全生长的颤藻生物膜，第二组具有部分生长的生物膜，第三组则仅含有接种物。平板的一半沿着整个直径上覆盖有黑色胶带。平板的暴露部分面向单向的窗户光源。再生长21天后，除去胶带覆盖物，以评估生长情况。
生物综合体实验
使用了与颤藻共同培养的BP-ELM的相同条件，来测试其他五种物种的生长——圆柱形鱼腥藻、念珠藻属、单歧藻属、粘球藻属和钝顶螺旋藻。使用BG11培养基制备6:1的甲基纤维素-海藻酸钠凝胶，并补充0.1M浓度的CaCl2·2H2O，对每个物种接种一式三份。持续30天，每72小时记录一次生长情况。螺旋藻和鱼腥藻最初实现了生长，但在21天后发生情况变差。单歧藻属则实现了30多天的非常缓慢且稳定的生长。
图像分析
设置和设备——为了使一段时间内图像数据的几个方面(例如分辨率、亮度和对比度)保持一致，使用了POLAMD迷你便携式摄影帐篷作为图像采集空间。三星M30被用作主数码相机。显微图像是通过Kern显微镜获取的，后来又通过JUISON便携式显微镜获取。Python用作主要编程语言来创建图像分析程序，并使用了Skimage、Matplotlib、OpenCV、Pandas和Skipy等程序库来获得各种函数。Anaconda发行的Spyder和Jupyter笔记本集成开发环境(IDE)用于主要脚本的编写。
生长分析——由于蓝藻细菌呈鲜绿色，并且数字图像将图像数据存储在三维阵列中，因此可以分析生长培养物的像素数据以估计其生长情况。为此，进行了两项测量：总绿色面积和超绿指数。
超绿指数通常用于测量植物生物量对土壤和残留物的影响，用于生态研究中的遥感测量。该函数定义为将图像的红色、绿色和蓝色(也称为色度坐标)的强度进行标准化，并根据下面给出的公式计算给定图像中每个像素的ExG指数。
标准化RGB值(或色度坐标)由下式给出：
其中R、G和B是以浮点数据形式给出的RGB值，即介于0和1之间的像素值。
超绿指数定义为：
ExG＝2g-r-b。
一组按时间顺序标记的图像被读入脚本中。将图像分为红色、绿色和蓝色强度通道，并计算总绿色面积。ExG指数被定义为一个函数，并同时对这些图像进行操作。结果绘制在图表上。绘制ExG指数数据的直方图，并从中选择阈值，以直观地显示生物膜面积，并定义总绿色面积。
ExG函数可以准确识别生物膜的区域。总ExG指数和绿色像素面积图都与培养物的时间顺序相关，即其数值随着生长时间的增加而增加。对于每个参数，获取像素总数的具体数值。
光合作用健康分析——数字屏幕中的颜色是通过RGB模型中产生的，该模型将图像分为红、绿和蓝三种基色强度，所有最终的颜色都是由基色相加而产生的。因此，每种颜色都有红、绿、蓝3个数值组成的一组数值。尽管该模型非常适合以数字方式再现栩栩如生的颜色，但人类是根据色调、饱和度和明度来感知颜色的。数字图像可以转换为通常以圆柱形格式表示的HSV模型。色调在一个圆周上表示，每个值的范围为0-360。饱和度在径向上用0-1表示，数值也沿着径向轴从0-1表示。HSV模型在屏幕中显示时，通过转换而产生视觉上不同的颜色，但它返回单个色调值。如果在相同的照明条件下拍摄图像，则可以将该值视为常数，而饱和度则反映密度。因此，选择了HSV模型作为分析培养物颜色变化的理想模型。
选择了随时间推移表现出颜色变化的培养物图像作为对象数据来测试了该计算工具。一组按时间顺序排列的图像被读入脚本，并转换为HSV颜色空间数据。然后根据色调、饱和度和明度值将所有像素排列在三维图像中，以识别图像之间的主要差异(图28和31)。在营养缺乏的条件下的细胞比标准条件下的细胞具有更大的色调值范围。然后为色调、饱和度和明度的每个数据集绘制单独的直方图。最后，使用K均值聚类方法对五种最主要颜色下的像素进行分组，并将它们在图像中各自的出现频率绘制在颜色条中。这些主要颜色的RGB值和HSV值均进行了提取。
表2.水凝胶制备过程和相应的生物膜的生长观察记录。
4.结论
在本项工作中，我们展示了一种真正自下而上的方法来创建可规模化的、可再生的、具有光合作用活性的、生物矿化的工程活性材料，该材料克服了目前ELM领域中存在的所有限制因素。从物种选择，到基质配置，再到骨料组成的每个阶段的决策都是根据第一手实验的观察结果确定的。生物矿化的化学过程在叠层石研究中众所周知，之前也已被尝试用于制造ELM，但从未通过本文所展示的组织工程方法进行适配调整。本文提供的材料由活细胞、有机衍生水凝胶复合物和天然丰富的骨料组成，使该PB-ELM具有环境可持续性。蓝藻细菌的快速生长速度使得能够在工业上可行的时间跨度内生产该材料。该材料可以作为一个集成系统进行培养和生长，不需要单独的大规模细胞培养生物反应器或混合设施。该材料固有的透光性和吸湿性以及蓝藻细菌在恶劣条件下生存的能力确保了该材料在自然条件下的长期生存能力。所开发的定制化的计算机视觉分析和机器学习工具有助于材料的设计应用。
众所周知，当今的建筑业是全球温室气体排放的最大贡献者之一。到2050年，世界人口或将增至98亿，预计将需要额外建造20亿座建筑物[53]。因此，迫切需要寻找新的方法来满足这些需求并同时减缓气候变化。为了设计能够改变气候变化进程的负碳活性建筑，本文提供的这种PB-ELM提供了革命性的机会。与此同时，由于蓝藻细菌被认为是地球生态进化过程中的主要生物，因此正在探索这些生物在外太空计划中的应用潜力[54,55]。因此，从长远来看，这种材料也为开发外星人类居住区的应用提供了可能性。
然而，要应用这种材料，必须针对特定的现场环境，对其复杂的行为进行编程。本研究进行的初步测试表明，可以进一步探索蓝藻细菌的趋光行为，以对材料的生物矿化模式，以及其代谢对环境的影响从外部进行编程。蓝藻细菌还可以响应趋化信号，例如CO2、O2和HCO3 -离子的浓度，这些信号也可以用作材料编程参数。
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实施例2
生物矿化和结构性能：
参考图19，对四个ELM样品进行傅里叶变换红外光谱分析，并与三个对照样品进行了比较，以确定碳酸钙的沉淀情况。已知方解石矿物中碳酸键的吸光度范围为1410-1490cm-1[2]。可以看出，与对照样品相比，所有四个ELM样品在1450cm-1处的红外光谱吸光度均高出约5％。这表明蓝藻催化了ELM样品中的生物矿化。
参考图20和表1，为了评估结构性能，将六个直径为5cm、厚度为1cm的ELM样品在通用压缩试验机中承受压缩力直至失效，并与六个非生物对照样品进行比较。从初步数据可以看出，ELM样品的兆帕斯卡抗压承载能力比非生物样品高2％。这可能与之前测试中发现的碳酸钙含量增加5％相关。然而，可以注意到，骨料尺寸为3-5mm的样品比骨料尺寸为1mm的样品更脆，破坏值通常较低。同时，较小的1mm骨料尺寸的样品比较大的骨料的样品更具延展性。需要根据塑性体的标准测试程序进行进一步的测试，并且需要评估变形和屈服应力等其他性能。
表1：抗压测试条件和结果的数据记录
光合作用和二氧化碳封存(图31-36)：
在两个阶段(生长阶段和固化后的应用阶段)对ELM的二氧化碳封存能力进行了研究。
为了确定生长阶段的二氧化碳吸收量，将尺寸为60厘米x 35厘米x 3.5厘米、重4公斤的大型样品浇铸在透明箱子中。箱子的盖子是密封的，里面放置了一个KKmoon高灵敏度CO2传感器。记录了ELM生长333小时内的CO2PPM、湿度和温度数据。据观察，尽管蓝藻细菌的昼夜节律存在12小时的CO2水平周期[3]，但回归趋势图显示，在生长阶段，箱内CO2总体下降了1000PPM。
为了研究固化后阶段的CO2吸收量，制备了直径9毫米的小样品。设置了一个实验箱，以便可以将材料作为分区插入。放置了两块Arduino的MQ135型CO2传感器板，一块用于在通过ELM之前测试空气中的CO2水平，另一块在通过ELM之后测试空气中的CO2水平。每两秒收集一次实时数据，持续两个半小时。从下面的数据可以看出，吸收率恒定为每分钟0.6PPM，测试期间ELM样品的平均吸收率为29PPM。
细胞活力和再生能力：
为了测试ELM材料内蓝藻细菌的活力的持续性，采集了两个样品，将其固化并保存在环境条件下，不带任何额外的维持措施。样品1保存时间为60天，样品2保存时间为180天。然后将两个样品用新鲜的BG11培养基溶液补充营养，并记录蓝藻细菌在2个月内的生长活性。可以看出，虽然保存了180天的样品的生长激活存在较长的滞后，但两个样品在新鲜培养基下2个月后都表现出了显著的生物膜生长。这证实了细胞的活力以及材料的再生性(图26)。
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Claims (22)
1.一种包含碳酸钙结合骨料的生物矿化材料的生产方法，所述方法包括：
在水凝胶基质中培养光合微生物，其中所述微生物将细胞外碳酸酐酶释放到所述水凝胶基质中，并且，
其中所述水凝胶基质包含：
i)水凝胶；
ii)骨料；
iii)生长培养基；以及，
iv)氯化钙(CaCl2)，
其中，所述细胞外碳酸酐酶将所述氯化钙转化为碳酸钙沉淀物，从而将所述骨料结合，以形成所述生物矿化材料。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述骨料是半透明的。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述骨料包含具有微孔表面的颗粒材料或由具有微孔表面的颗粒材料组成。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述骨料包含无定形二氧化硅(SiO2)、结晶石英二氧化硅、玻璃颗粒、透明陶瓷、聚丙烯酸酯和玻璃纤维材料中的一种或多种，或，由其中一种或多种组成。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述骨料包含无定形二氧化硅(SiO2)。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述骨料还包含活性炭颗粒和/或沸石。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述骨料包含比例为1:2至1:4的活性炭颗粒和无定形二氧化硅(SiO2)，或由其组成。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述微生物具有滑行移动能力，以及趋光反应和/或趋化反应。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述微生物包括丝状蓝藻。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述微生物包括能够形成休眠细胞和/或能够在陆地条件下存活的丝状蓝藻。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述微生物属于颤藻科。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述微生物包含动物颤藻或由动物颤藻组成。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述水凝胶具有触变性。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述水凝胶包含甲基纤维素。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述水凝胶包含甲基纤维素以及海藻酸钠、琼脂和角叉菜胶中的一种或多种，或由甲基纤维素和海藻酸钠、琼脂和角叉菜胶中的一种或多种组成。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，在所述甲基纤维素与海藻酸钠、琼脂和角叉菜胶中的一种或多种中，所述甲基纤维素相对于其余凝胶组分总量的比例为约15:1至3:1。
17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述水凝胶基质的表面被成形为具有脊、凸缘、突台、凹口、凹槽、通道、隆起和起伏中的一个或多个。
18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，以约0.01M至约1M之间的浓度提供所述氯化钙。
19.一种用于生产包含碳酸钙结合骨料的生物矿化材料的组合物，所述组合物包含水凝胶基质，其中所述水凝胶基质包含：
i)水凝胶；
ii)骨料；
iii)生长培养基；
iv)氯化钙(CaCl2)；和
v)微生物，其中所述微生物能够表达胞外碳酸酐酶并将其释放到所述水凝胶基质中。
20.一种生物矿化材料，其包含：
i)水凝胶或干燥水凝胶的生物矿物质；
ii)通过碳酸钙结合的骨料；
iii)丝状蓝藻或其能够形成丝状蓝藻增殖细胞的孢子样细胞，其中所述丝状蓝藻能够表达胞外碳酸酐酶。
21.颤藻属在形成生物矿化材料中的应用，其中，所述应用在具有骨料、生长培养基和氯化钙(CaCl2)的水凝胶中，用以促进碳酸钙沉淀和所述骨料的结合，从而形成所述生物矿化材料。
22.一种根据权利要求1-18中任一项所述的方法生产的生物矿化材料。
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2022
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| Publication number | Publication date |
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| EP4402115A1 (en) | 2024-07-24 |
| WO2023041933A1 (en) | 2023-03-23 |
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