CN118055769A - 多胺在脑肿瘤治疗中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及脑肿瘤治疗的领域。本发明提供了一种使用高浓度的细胞毒性剂在这些组织中杀死脑肿瘤细胞的方法，该细胞毒性剂能够与正常脑细胞外基质(ECM)强结合，但与肿瘤环境中的细胞外基质成分的结合较弱。所述细胞毒性剂是一种多胺，例如精胺或腐胺。

Description

多胺在脑肿瘤治疗中的应用
技术领域
本发明涉及脑肿瘤治疗的领域。本发明提供了使用高浓度细胞毒性剂杀死脑肿瘤中的脑肿瘤细胞的方法，该细胞毒性剂能够与正常脑细胞外基质(ECM)强结合，但与肿瘤环境中细胞外基质成分结合较弱。所述细胞毒性剂为多胺，如亚精胺或腐胺。
背景技术
脑癌，以多形性胶质母细胞瘤(GBM)为例，特别难以治疗[M.Monticelli等，Clinical Neurol.Neurosurg.170(2018)120-126]。很少有抗癌药物能够以任何显著浓度穿过血脑屏障，因此目前对原发性GBM肿瘤的标准治疗方案从肿瘤切除开始。GBM肿瘤边缘的扩散性意味着在手术过程中不可能移除所有癌细胞。因此，GBM肿瘤不能通过手术治愈，并且在手术后，肿瘤在原发部位再生和转移到脑的其他区域是不可避免的。转移最常见于由MRI确定的原始肿瘤体2cm内的脑区域，但也可能包括更远处的转移，例如对侧半球(contralateral hemisphere)。
因此，目前的术后治疗的标准(或在不需要手术的情况下)，是对具有2-3cm边缘的原发肿瘤部位进行放射治疗，同时辅助化疗。这些治疗旨在减缓肿瘤复发和转移，但同样不能治愈。Oronsky等[B.Oronsky等，Frontier in Oncology，10(2021)574012]对新诊断的GBM肿瘤的综述，全面概述了GBM的当前标准治疗方案，包括讨论临床相关的生物标志物。
放射治疗虽然是目前GBM标准治疗方案中必不可少的，但不幸的是，它会对寿命较长的患者的脑功能造成长期严重影响[Y.W.Lee等，Biomol.Ther.20(2012)357-370；C.Turnquist等，Neuro-Oncology Advances，2(2020)vdaa057]。
替莫唑胺(一种DNA烷基化剂)是目前GBM的标准治疗辅助化疗药物，与放射治疗同时使用。DNA烷基化亚硝脲、洛莫司汀(CCNU)和卡莫司汀(BCNU或BiCNU)也用于GBM治疗，尽管目前不如替莫唑胺常用。卡莫司汀可以通过置于肿瘤切除腔内的晶片给药。单独使用时，洛莫司汀对O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(MGMT)启动子甲基化的患者显示治疗活性[M.Weller,E.Le Rhun，Cancer Treatment Rev.87(2020)102029]，也用作多药治疗方案(与丙卡巴肼和长春新碱一起)的一部分。然而，血脑屏障总是会限制到达脑癌细胞的化疗药物的浓度。可能正因为如此，耐药性是GBM的一个常见特征。因此，尽管采取积极治疗措施，最大限度切除肿瘤然后放射治疗加化疗，但是采用这种标准疗法进行治疗的GBM患者的中位生存期目前仅为从确诊起的14-16个月。
贝伐单抗是一种针对血管内皮生长因子(VEGF)的单克隆抗体，旨在抑制肿瘤的血管化[O.D.Arevalo等，Frontiers in Neurology，10(2019)]。GBM肿瘤是高度缺氧的环境，而新生血管化对肿瘤进展至关重要[B.Oronsky等，Frontiers in Oncology，10(2021)574012]。贝伐单抗作为一线治疗的III期试验表明，中位无进展生存期有所增加，但总生存期没有增加。因此，贝伐单抗在一些国家被批准用于复发性GBM，但不作为一线治疗。贝伐单抗与洛莫司汀联合使用，已经显示出复发性GBM患者中位无进展生存期(+0.23个月)和总生存期(+1.4个月)有所增加[Ren等，Frontiers in Neurology，11(2021)603947]，但这些生存时间的增加并不大。
GBM治疗的另一个近期进展是使用所谓的肿瘤治疗场(Tumour TreatmentFields)，即通过设备，在头皮上佩戴的紧贴头皮的帽子输送交变电场，以干扰癌细胞分裂[D.Fabian等，Cancers 11(2019)174]。在2015年，美国FDA批准/>作为替莫唑胺的辅助用于一线GBM治疗，因为III期试验的中期结果显示，与单独使用替莫唑胺的无进展生存期为16.6个月相比，这种组合的无进展生存期为19.6个月。
因此，特别是与其他实体癌相比，GBM的治疗选择仍然有限，而且无论采用何种治疗，在所有情况下，预后都很差。即使采用多模式干预，最近的研究表明，患者的中位生存期仍然只有14-16个月，其中26-33％的患者存活2年，5％的患者存活5年[M.R.Gilbert，JClin Oncol.31(2013)4085-91；B.Oronsky等，Frontiers in Oncology，10(2021)574012]。
由于整体生存时间如此之短，放射治疗对脑功能的不良影响被患者和那些它们治疗的人所接受，因为大多数患者活不到这些长期影响变得明显的时候。然而，如果GBM患者的长期生存成为一个现实的前景，那么对于对正常脑组织副作用最小的方法存在相当大的需求。因此，对于延长GBM患者的无进展生存期和总生存期，以及长期改善患者生活质量的新方法，存在一个重大的、临床上未满足的需求。
脑转移-因其他组织中来自肿瘤的癌细胞侵入而在脑中形成的继发性肿瘤-发生在约15％的癌症患者中，尤其常见于具有原发性乳腺癌、肺癌或黑色素瘤的患者中。脑转移癌的肿瘤环境与原发性脑癌有许多相似之处，并且血脑屏障同样严重限制了化疗治疗选择[A.Boire等，Nature Cancer Rev.20(2020)4-11]。手术切除很少能治愈，只有具有单一脑损伤的患者才会考虑手术。全脑照射是另一个采用的主要治疗。然而，即使经过治疗，具有脑转移的患者的中位生存时间也少于6个月。因此，对于转移性脑癌以及原发性脑肿瘤的新治疗策略，存在巨大的、未满足的需求。
发明内容
本发明人开发了一种新的治疗脑肿瘤(包括GBM肿瘤和其他脑癌，以及转移性脑疾病)的方法，该方法通过利用肿瘤和正常脑细胞外基质(ECM)之间的固有差异来选择性地杀死肿瘤细胞。
这种选择性是通过发现药物分子来实现的，这些分子被正常脑ECM强隔离，但是被肿瘤ECM仅弱隔离。这导致正常脑ECM中可用的游离的(未结合的)药物浓度过低而不具有细胞毒性(药物浓度低于EC50)，而在肿瘤环境中，游离药物浓度可以足够高以杀死细胞(浓度高于EC50)。因此，这些药物的浓度非常高，可以直接递送到肿瘤处，例如在手术切除或瘤内输注期间，以快速杀死肿瘤中的细胞，同时对正常脑组织具有相对较少的副作用。
本发明人利用的正常脑和脑肿瘤ECM的差异是双重的：ECM组成的差异；以及ECM体积相对于两种环境中的细胞体积的差异。
正常脑细胞外基质中最丰富的单一成分是透明质酸(占干重的10wt％)，它是一种聚阴离子；其次是蛋白聚糖(占15wt％；(硫酸软骨素蛋白聚糖(lectican)(聚蛋白聚糖(aggrecan)、多功能蛋白聚糖(versican)、神经蛋白聚糖(neurocan)和短小蛋白聚糖(brevican))和其他(核心蛋白聚糖(decorin)、双糖链蛋白聚糖(biglycan)、磷酸蛋白聚糖(phosphacan))，这些蛋白聚糖也必然因其糖胺聚糖聚阴离子翻译后修饰而带有负电荷。相比之下，脑肿瘤细胞外的环境富含更多疏水蛋白，例如纤连蛋白和胶原蛋白。
本发明人发现，由于正常脑ECM中相对于肿瘤ECM含有更丰富的带负电荷的大分子，因此带正电荷的药物分子与正常脑ECM组分强结合，而与肿瘤ECM组分的结合不那么强。因此，他们发现，基于ECM的组成，能够实现所需细胞杀伤选择性的候选药物分子是带正电荷的分子。
此外，脑肿瘤中的ECM/细胞的体积之比要远低于正常脑组织，与正常脑组织相比，肿瘤是一个细胞密集的环境，即与正常脑组织相比，脑肿瘤中细胞之间的ECM明显更少。因此，本发明人已经发现，即使在肿瘤ECM对药物具有结合亲和力的情况下，未结合的活性药物在肿瘤环境中的浓度可以保持较高。
此外，本发明人认为，因为带正电荷的药物与ECM中丰富的透明质酸和蛋白聚糖具有很强的结合，因此它们在正常脑细胞外基质中的扩散将会有限。相比之下，与肿瘤ECM的结合的相对缺乏表明，带电药物分子在肿瘤周围和肿瘤内部的细胞外区域的扩散将明显更容易。因此，如果将带正电荷的药物分子注射到脑肿瘤中，它们预计会在相对有限的距离内渗透到周围的正常脑ECM中，但在肿瘤环境中扩散会更自由，从而使药物接触到相当大比例的癌细胞。
本发明者很有洞察力地意识到，可以利用药物分子上的高正电荷来杀死细胞。已知较大的聚阳离子会在细胞质膜上打孔；这被认为是由于聚阳离子隔离膜阴离子磷脂所致。例如，这种效应用来帮助将DNA递送到细胞中。在较高浓度的聚阳离子下，细胞死亡发生，这是由于聚阳离子高水平的磷脂捕获导致细胞膜严重损伤。已知较小的聚阳离子(如精胺)会使细胞质膜去极化，导致水进入和细胞裂解/碎裂。这两种效应都是有效的细胞杀伤机制。
本发明人意识到，如果聚阳离子优先被捕获到细胞外基质而非结合细胞膜磷脂，那么这些细胞毒性机制就会被阻止。换句话说，本发明人意识到，如果药物与ECM和细胞膜磷脂结合的化学平衡在正常脑中倾向于与ECM结合，但在在肿瘤环境中倾向于与磷脂结合，那么该药物将具有选择性地杀死肿瘤中的细胞，而非健康组织中的细胞。
多胺是一种聚阳离子，已知许多多胺如果以足够的浓度存在，则具有细胞毒性。例如，多胺(如PAMAM)的细胞毒性被认为是由于其正电荷通过捕获磷脂破坏细胞膜，如上所述。
一些多胺药物之前曾被建议用于治疗癌症，但不是通过直接递送高浓度的多胺药物来导致细胞迅速死亡，而对宿主组织几乎没有副作用。事实上，那些本领域的技术人员会已经预料到，这样的高剂量对宿主是致命的，不管它们被注射到哪个组织中。
然而，本文表明，高浓度的多种多胺的毒性在富含透明质酸的环境中被抑制，这表明它们的毒性在正常脑ECM中也会被类似地抑制。
本发明有一些优点，包括以下几点：
(1)在癌症环境中杀死所有细胞类型的能力。这包括癌细胞的异质群体，其通常对其他治疗策略构成挑战。它还可能包括其他细胞类型，如癌症相关的成纤维细胞(CAF)和小胶质细胞，它们虽然不是癌细胞，但经常促进肿瘤进展。
(2)该方法不依赖于特定的癌细胞突变，因此在GBM中特别有利，已知GBM中癌细胞基因型存在相当大的异质性，这干扰了目前的化疗和放射治疗。
(3)通过本发明杀死癌细胞的方法(即通过捕获细胞膜磷脂和/或与细胞膜磷脂结合从而使细胞膜去极化)不太可能特别容易受到耐药性的影响，因为该药物不需要进入细胞就能杀死它。膜磷脂的隔离捕获和结合是物理过程，仅取决于磷脂-药物之间的化学结合的强度，如果药物和细胞膜处于近距离，则必然会发生。因此，这些药物不太可能受到已知的耐药途径的影响。
(4)本发明还可以用作用于去除脑肿瘤的大部分的肿瘤切除的一种替代方案，与常规手术选择相比，具有更少的潜在并发症和造成更少的应激反应。
因此，本发明的一个目的是提供一种杀死脑肿瘤细胞的方法，同时对正常脑环境中的细胞几乎没有影响。特别地，本发明的一个目的是杀死脑肿瘤切除后可能残留的癌细胞。
在多形性脑胶质母细胞瘤的手术切除后，已知几乎所有患者在原发肿瘤部位3-6个月内发生肿瘤再生；来源于这种肿瘤的细胞也经常会侵入脑的其他部位。因此，本发明的目的是提供方法以防止多形性胶质母细胞瘤和其他肿瘤中的这种肿瘤再生或侵入。
在一个实施方式中，本发明提供了一种杀死受试者中脑肿瘤中的脑肿瘤细胞或切除脑肿瘤的部位的脑肿瘤细胞的体内方法，所述方法包括以下步骤：
(a)将包含细胞毒性剂的组合物与脑肿瘤中的脑肿瘤细胞或切除脑肿瘤的部位的脑肿瘤细胞接触；
其中所述细胞毒性剂在以下之间的化学平衡：
(i)结合到ECM的细胞毒性剂，和
(ii)游离的、未结合的细胞毒性剂
在正常脑ECM中有利于ECM结合的状态，并且在肿瘤ECM中有利于游离、未结合的状态。
在另一实施方式中，本发明提供了一种细胞毒性剂，用于杀死脑肿瘤中的脑肿瘤细胞或切除脑肿瘤的部位的脑肿瘤细胞的体内方法，所述方法优选包括以下步骤：
(a)将包含所述细胞毒性剂的组合物与脑肿瘤中的脑肿瘤细胞或切除脑肿瘤的部位的脑肿瘤细胞接触；
其中所述细胞毒性剂在以下之间的化学平衡：
(i)结合到ECM的细胞毒性剂，和
(ii)游离的、未结合的细胞毒性剂
在正常脑ECM中有利于ECM结合的状态，并且在肿瘤ECM中有利于游离、未结合的状态。
在另一实施方式中，本发明提供了细胞毒性剂在制造药物中的用途，所述药物用于杀死脑肿瘤中的脑肿瘤细胞或切除脑肿瘤的部位的脑肿瘤细胞的方法，所述方法优选包括以下步骤：
(a)将包含细胞毒性剂的组合物与脑肿瘤中的脑肿瘤细胞或切除脑肿瘤的部位的脑肿瘤细胞接触；
其中所述细胞毒性剂在以下之间的化学平衡：
(i)结合到ECM的细胞毒性剂，和
(ii)游离的、未结合的细胞毒性剂
在正常脑ECM中有利于ECM结合的状态，并且在肿瘤ECM中有利于游离、未结合的状态。
在另一实施方式中，本发明提供了一种杀死受试者中脑肿瘤中的脑肿瘤细胞或切除脑肿瘤的部位的脑肿瘤细胞的体内方法，所述方法包括以下步骤：
(a)将包含细胞毒性剂的组合物与脑肿瘤中的脑肿瘤细胞或切除脑肿瘤的部位的脑肿瘤细胞接触，
其中所述细胞毒性剂是与透明质酸和/或脑细胞外基质蛋白聚糖强结合的试剂。
在另一实施方式中，本发明提供了一种细胞毒性剂，用于杀死脑肿瘤中的脑肿瘤细胞或切除脑肿瘤的部位的脑肿瘤细胞的体内方法，所述方法优选包括以下步骤：
(a)将包含细胞毒性剂的组合物与脑肿瘤中的脑肿瘤细胞或切除脑肿瘤的部位的脑肿瘤细胞接触，
其中所述细胞毒性剂是与透明质酸和/或脑细胞外基质蛋白聚糖强结合的试剂。
在另一实施方式中，本发明提供了一种细胞毒性剂在制造药物中的用途，所述药物用于杀死脑肿瘤中的脑肿瘤细胞或切除脑肿瘤的部位的脑肿瘤细胞的体内方法，所述方法优选包括以下步骤：
(a)将包含细胞毒性剂的组合物与脑肿瘤中的脑肿瘤细胞或切除脑肿瘤的部位的脑肿瘤细胞接触，
其中所述细胞毒性剂是与透明质酸和/或脑细胞外基质蛋白聚糖强结合的试剂。
所述接触优选为直接接触。所述细胞毒性剂优选为多胺。
本发明的方法在体内(即在人或动物体内)进行。优选地，所述受试者为哺乳动物，更优选为人、小鼠、大鼠、马、猪、牛、绵羊、山羊。最优选地，所述受试者为人。在一些实施方式中，所述受试者为非人哺乳动物。例如，人可以是0-10岁、10-20岁、20-30岁、30-40岁、40-50岁、50-60岁、60-70岁、70-80岁、80-90岁、90-100岁或超过100岁。
所述脑肿瘤可以是良性的、恶性前期或恶性肿瘤。所述脑肿瘤可以是原发性或继发性的肿瘤。所述脑肿瘤优选为实体瘤。所述脑肿瘤包含脑肿瘤或脑癌细胞，以及它们在健康脑组织内的转移性扩张。所述脑肿瘤还可以包括与癌症相关的成纤维细胞和免疫细胞，例如小胶质细胞。
在一些实施方式中，所述肿瘤是之前尺寸或致癌(例如侵入性)能力已减小的肿瘤。例如，所述肿瘤可以是之前至少部分被切除(移除)的肿瘤。或者或另外地，所述肿瘤可以是之前已用另一种抗肿瘤治疗(例如化疗、免疫治疗或放射治疗，或其组合)治疗过的肿瘤。
正常脑实质细胞外基质(ECM)由透明质酸、蛋白聚糖(硫酸软骨素蛋白聚糖(lectican)(多功能蛋白聚糖(versican)、神经蛋白聚糖(neurocan)和短小蛋白聚糖(brevican))和其他(核心蛋白聚糖(decorin)、双糖链蛋白聚糖(biglycan)、磷酸蛋白聚糖(phosphacan)))、连接蛋白、ITIH2和肌腱蛋白R(以及少量其他肌腱蛋白(tenascins))组成。在脑周围的血管，所述ECM含有纤维糖蛋白，其中最丰富的是纤连蛋白和层粘连蛋白，基底膜蛋白(主要是胶原蛋白IV和层粘连蛋白，也有蛋白聚糖、聚集蛋白和串珠蛋白聚糖)。
正常脑细胞外基质的总重量组成为约以干重计10％透明质酸:15％蛋白聚糖(总共包含许多不同的蛋白聚糖):1％胶原蛋白IV(K.Koh,J.Cha,J.Park,J.Choi,S.-G.Kang,P.Kim.，Scientific Reports 8(2018)4608)，分别对应于以鲜重计3％:4.5％:0.3％，假设70％的脑组织是水。
因此，正常脑细胞外基质中最丰富的单一成分是带负电荷的聚阴离子透明质酸(占湿重3wt％)，其次是蛋白聚糖，由于它们的糖胺聚糖翻译后的修饰，蛋白聚糖也必然带负电荷。因此，这些成分可以很容易被聚阳离子(例如多胺)结合。
GBM和在脑中的转移性肿瘤的ECM通常比脑实质基质含有更多基底膜相关的蛋白质：纤连蛋白、胶原蛋白IV和一些糖胶原蛋白，例如胶原蛋白VI、VII或继发性肿瘤中的其他胶原蛋白，取决于它们的来源，如胶原蛋白I、II、III、V和其他次要胶原蛋白。在GBM中，基质连接蛋白肌腱蛋白R被肌腱蛋白C取代，或者在继发性脑肿瘤中可能完全缺失。在一些脑肿瘤中，癌来源的透明质酸的分子量和数量通常低于脑基质，并且蛋白聚糖通常具有少得多的氨基糖化。此外，脑肿瘤内ECM/细胞的相对体积明显小于正常脑，这意味着与正常脑实质ECM相比，每个细胞中捕获任何与基质结合的药物分子的ECM更少，这确保了这种环境中，游离的、未结合的聚阳离子药物分子的浓度比正常脑基质高。
已知胶质母细胞瘤会过度表达透明质酸酶(即将透明质酸切成更小分子单元的酶)。这可以减少肿瘤周围的透明质酸的量，因为小的透明质酸单元可能会被冲走。因此，在肿瘤为多形性胶质母细胞瘤(GBM)的实施方式中，脑ECM湿重中透明质酸的比例可能等于或低于1％。
GBM肿瘤的细胞外环境通常富含不带电的糖蛋白，特别是纤连蛋白和胶原蛋白。
本发明通过提供一种细胞毒性剂，利用正常脑ECM和肿瘤细胞周围的ECM在成分和体积上的差异，其中该细胞毒性剂在与ECM结合的试剂与游离的、未结合的试剂之间的化学平衡，在正常脑ECM中有利于与ECM结合的状态，而在肿瘤ECM中有利于游离的、未结合的(活性药物)状态。因此，与肿瘤接触(例如注射到肿瘤中)或应用于切除肿瘤的部位的细胞毒性剂的很大一部分是游离的(即不与异常ECM结合)，以杀死肿瘤或切除肿瘤的部位的肿瘤细胞。任何被发现超出肿瘤周围的细胞毒性剂都会与正常脑ECM接触，因此大部分细胞毒性剂会与正常脑ECM中的大量透明质酸和其他带负电荷的分子结合，即大量的透明质酸和带负电荷的ECM透明质酸与带正电荷的细胞毒性剂之间的强结合的组合确保了该化学平衡强烈地有利于细胞毒性-ECM结合状态。因此，细胞毒性剂基本上只会对在肿瘤或切除肿瘤的部位的肿瘤细胞发挥其细胞毒性作用，在这些地方，透明质酸和其他带负电荷的ECM分子(主要是蛋白聚糖)的净含量低，因此化学平衡有利于非结合(活性药物)状态。
脑肿瘤的特征可以在于脑肿瘤的近环境的细胞外基质(ECM)的组成。在一个实施方式中，脑肿瘤是这样一种脑肿瘤：脑肿瘤的近环境中ECM的透明质酸比例等于或低于脑ECM湿重的3wt％。例如，所述脑肿瘤可以是表达透明质酸酶的脑肿瘤。或者，脑肿瘤可以是其中ECM/细胞体积比比正常脑组织低5倍或更多的脑肿瘤。
如本文所用，术语“脑肿瘤的近环境”是指脑肿瘤周围区域中的ECM，该区域距离脑肿瘤表面小于20mm或在其侵入进展中。
透明质酸(HA)含量可以通过在浓硫酸中水解后测定糖醛酸含量或肿瘤切片上透明质酸的组织化学染色来检测[Cowman等，2015，Front Immunol，6:261]。测定HA含量的最灵敏、最特异、最准确的方法是基于酶联吸附检测。
癌症根据肿瘤细胞相似的细胞类型进行分类，被认为是肿瘤的起源。这些类型包括：
(i)恶性上皮肿瘤：源自上皮细胞的癌症。这一组包括许多最常见的癌症，并且包括几乎所有在乳腺、前列腺、肺、胰腺和结肠中的那些癌症。
(ii)肉瘤：由结缔组织(即骨、软骨、脂肪、神经)产生的癌症，每一种癌症都是由起源于骨髓外的间充质细胞的细胞发展而来的。
(iii)生殖细胞瘤：源自多能细胞的癌症，最常出现在睾丸或卵巢(分别为精原细胞瘤和无性细胞瘤)。
(iv)母细胞瘤：源自未成熟“前体”细胞或胚胎组织的癌症。
脑和神经系统癌症包括星形细胞瘤、脑干胶质瘤、毛细胞星形细胞瘤、室管膜瘤、原始神经外胚层肿瘤、小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤、神经胶质瘤、髓母细胞瘤、神经母细胞瘤、少突胶质细胞瘤、松果体星形细胞瘤、垂体腺瘤、视通路和下丘脑胶质瘤。
在一个特别优选的实施方式中，所述脑肿瘤为原发性脑癌，优选地选自由多形性胶质母细胞瘤(GBM)、神经胶质瘤、弥漫性中线胶质瘤、混合性神经胶质瘤、星形细胞瘤、少突胶质胶质瘤、髓母细胞瘤、松果体区肿瘤、非典型畸胎样横纹肌样肿瘤(AT/RT)和原始神经外胚层肿瘤(PNETS)组成的组。最优选地，所述脑肿瘤为多形性胶质母细胞瘤(GBM)。
在另一个特别优选的实施方式中，所述肿瘤为任何来源的继发性肿瘤，其已转移到脑中。
所述细胞毒性剂(如多胺)必须能够杀死脑肿瘤中的肿瘤细胞(优选为脑肿瘤细胞)或切除肿瘤的部位的残留肿瘤细胞。所述细胞毒性剂(单独)的作用是能够杀死肿瘤细胞或诱导肿瘤细胞的凋亡细胞裂解或坏死。所述细胞毒性剂是一种能够靠自己杀死肿瘤细胞(优选脑肿瘤细胞)的试剂，即没有额外的癌细胞杀伤部分。
在一些实施方式中，所述细胞毒性剂(例如多胺)是能够通过使细胞的质膜去极化来杀死细胞的试剂。这导致进水和细胞裂解/碎裂。
优选地，所述细胞毒性剂(如多胺)是一种能够杀死脑肿瘤细胞和非来自脑肿瘤的肿瘤细胞的试剂，即细胞毒性剂的杀伤作用非特异于脑肿瘤。优选地，所述细胞毒性剂能够独立于那些癌细胞的基因型或表型而杀死癌细胞。
所述细胞毒性剂杀死肿瘤细胞的能力可以通过以下方式来确定：在光学显微镜下检查细胞全细胞裂解直至在光学显微镜下看不到细胞结构的程度，或细胞肿胀和破裂，或细胞破碎成凋亡结构，或膜完整性丧失，从而允许结合剂渗透(如DNA结合染料)，或在细胞内聚集活体染料(如台盼蓝或普莱斯托蓝(Presto Blue))，或细胞外出现凋亡或坏死的标记物，可通过荧光/发光/免疫化学手段检测到。
EC50的测量，细胞毒性剂在特定的暴露时间和特定的条件(例如细胞培养基)下诱导(在此情况下为特定细胞系的细胞死亡)处于基线(无试剂)和最大效应之间的半数响应时的浓度，在例如J.L.Seabaugh,Pharmaceut Statist.10(2011)128-134中进行了描述，同时在M.Niepel等，Curr.Protoc.Chem.Biol.9(2017)55-74进行了更多评论性综述。
例如，可以使用悬浮在PBS溶液中的U87细胞，在30-90分钟(例如60分钟)的孵育期间测量细胞毒性剂的EC50。细胞死亡可通过台盼蓝溶液检测，活/死细胞计数可在Neubauer改良血细胞计数室(来自Hawksley)进行。
在一些实施方式中，所述细胞毒性剂(如多胺)与透明质酸和/或脑细胞外基质蛋白聚糖强结合。所述细胞毒性剂与透明质酸结合的有效性可以通过以下方法来测量：将上述测定中已确定对细胞有毒的等效浓度的试剂混合到3wt％透明质酸凝胶(或更高wt％透明质酸凝胶)中，然后将细胞混合到透明质酸-细胞毒性剂凝胶中。
如本文所用，术语“与透明质酸和/或脑细胞外基质蛋白多糖强结合”意味着当在与细胞培养基混合的3wt％的透明质酸中测试时，所述细胞毒性剂(例如，从PBS中的U87细胞毒性试验中获得，例如，用台盼蓝测定活/死细胞计数)的EC50浓度增加了2倍或更多，并且自应用时起持续这样至少3天。
如本文所用，术语“与透明质酸和/或脑细胞外基质蛋白多糖强结合”也意味着在PBS中细胞毒性剂引起(50％)细胞死亡的EC50浓度，对在3wt％透明质酸的细胞引起低于20％(优选低于10％或5％)的细胞死亡。
在一些优选实施方式中，细胞毒性剂(例如多胺)是与在脑肿瘤中表现强烈的脑ECM成分不强烈结合的试剂。在脑肿瘤中，这些主要是基底膜的成分，例如纤连蛋白和胶原蛋白(例如胶原蛋白IV)。
所述细胞毒性剂与在脑肿瘤ECM中表现强烈的脑ECM成分的结合的有效性可以通过将细胞毒性剂与标准基底膜材料(例如)混合进行测量。如果在/>或其他标准基底膜材料中测试时，EC50值(例如，从PBS中的U87细胞毒性试验中获得，例如，使用台盼蓝测定法定量活/死细胞)较低，或相同，或仅高出50％，则所述细胞毒性剂不与在脑肿瘤ECM中表现强烈的脑ECM成分强结合。
基质(由/>生产)是从Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤中提取的一种可溶解基底膜制剂，该肿瘤富含细胞外基质蛋白，包括层粘连蛋白(主要成分)、胶原蛋白IV、硫酸肝素蛋白聚糖、巢蛋白(entactin)/巢蛋白(nidogen)和许多生长因子。
如本文所用，术语“不与在脑肿瘤中表现强烈的脑ECM成分强结合”也可能意味着在PBS中细胞毒性剂引起(50％)细胞死亡的EC50浓度，对在中的脑肿瘤细胞引起至少20％(优选至少40％、60％或80％)的细胞死亡。
正常脑ECM包含10％透明质酸和15％蛋白聚糖(按干重计)；这两种化合物都带负电荷。因此，聚阳离子将与正常脑ECM强结合，但与在肿瘤ECM环境中的不带电(糖)蛋白仅适度结合。
因此，在一个实施方式中，所述细胞毒性剂为一种聚阳离子。合适的聚阳离子的实例包括多胺、带正电荷的纳米粒子和用聚阳离子(包括多胺)功能化的纳米粒子。
在一个优选的实施方式中，所述细胞毒性剂为多胺，即具有两个或更多个氨基的有机化合物。在本发明中使用的多胺为细胞毒性多胺。已知有许多多胺具有细胞毒性。多胺(如PAMAM)的细胞毒性被认为是由于它们的正电荷从细胞膜中捕获带负电荷的磷脂所引起的，从而破坏了肿瘤细胞的细胞膜。在低浓度的多胺中，生物学家利用这种效应帮助细胞转染或帮助细胞吸收例如染料分子。在高浓度时，细胞膜破坏严重，导致细胞死亡。
在一些实施方式中，所述多胺为烷基多胺。在一些实施方式中，所述多胺具有2-10(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10)个胺基。优选地，所述多胺在对脑肿瘤细胞有毒的浓度下是水溶性的。
在一些实施方式中，所述多胺具有以下结构：
NH2-[(CH2)a-NH]-[(CH2)b-NH]x-[(CH2)c-NH]y-H
其中a、b和c各自独立地为3、4或5；并且x和y各自独立地为0或1。
在一些实施方式中，所述多胺具有1、2、3或4个氨基，例如至少两个伯胺、至多两个仲胺或至多两个叔胺。所述多胺可包含聚酰胺胺(PAMAM)，例如PAMAM-g0。
优选地，所述多胺选自由精胺、亚精胺、双(六亚甲基)三胺(BHMTA)、聚酰胺胺(PAMAM，例如PAMAM-g0)、热精胺、聚L-赖氨酸、聚R-赖氨酸、聚烯丙胺、聚烯丙胺盐酸盐、聚乙烯亚胺、壳聚糖和壳聚糖衍生物、腐胺和尸胺组成的组。
更优选地，所述细胞毒性剂为1,3-二氨基丙烷、腐胺、尸胺、亚精胺、精胺、热精胺或双(六亚甲基)三胺(BHMTA)。
最优选地，所述细胞毒性剂为精胺或亚精胺，或其衍生物；或亚精胺或腐胺。
在一些实施方案中，所述细胞毒性剂(例如多胺)另外包含靶向部分，所述靶向部分对要靶向的脑或脑肿瘤是特异性的。所述脑靶向部分可以是帮助细胞毒性剂保留在脑内的部分。例如，所述靶向部分可以是抗体，它可以特异性地与脑肿瘤细胞上的表位结合。
在一些实施方式中，所述细胞毒性剂(例如多胺)另外包含部分，其限制所述细胞毒性剂的扩散范围。这可以通过增加所述细胞毒性剂的分子量来实现，例如，通过添加一个或多个聚乙二醇(PEG)链(PEG化)或聚糖部分(例如，透明质酸或壳聚糖链，通过聚糖的氧化(例如，通过与碘化钠反应)和随后将氧化的聚糖链与适当的多胺反应)。
包含所述细胞毒性剂(例如多胺)的组合物可另外包含一种或更多种额外的药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体。所述组合物可包含如本文所定义的一种或多种细胞毒性剂。例如，所述组合物可包含如本文所定义的1、2、3或4种不同的细胞毒性剂。所述组合物还可包含一种或多种其他活性成分，例如抗癌剂或癌细胞杀伤部分。例如，所述组合物可额外包含一种或多种组分，所述组分选自由缓冲液、洗涤剂、谷胱甘肽代谢的抑制剂(例如丁硫氨酸亚砜亚胺)、胺氧化酶的抑制剂、蛋白酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、透明质酸酶抑制剂、渗透剂(osmolite)(例如NaCl、甘露醇等)和粘度调节剂组成的组。
在一些实施方案中，所述组合物不包含额外的癌细胞杀伤部分(即，所述细胞毒性剂能够单独杀死脑肿瘤细胞)。在一些实施方式中，所述组合物不包含额外的抗癌剂(即，所述细胞毒性剂能够单独杀死脑肿瘤细胞)。
所述组合物优选地包含有效量的细胞毒性剂(或细胞毒性试剂)。如本文所用，术语“有效量”是指足以杀死在肿瘤中或在切除肿瘤的部位中的所有或基本上所有(例如，与不含细胞毒性剂的对照相比，至少70％、80％、90％或95％)脑肿瘤细胞的量。每种细胞毒性剂的有效量可以容易地由本领域技术人员确定。
选择所述组合物中细胞毒性剂(例如多胺)的结构和/或浓度，使得以下之间的化学平衡：
(i)结合到ECM的细胞毒性剂，和
(ii)游离的、未结合的细胞毒性剂
在正常脑ECM中有利于ECM结合的状态，并且在肿瘤ECM中有利于游离、未结合的状态。
所述组合物中的细胞毒性剂(例如多胺)的浓度优选为100μM至50mM，例如100μM至1mM、1mM至10mM或10mM至50mM。在一些实施方式中，所述细胞毒性剂(例如多胺)的浓度为1-50mM或1-25mM，例如1-5mM、5-10mM、10-15mM、15-20mM、20-25mM、25-30mM、30-35mM、35-40mM、40-45mM或45-50mM。在一些实施方式中，所述细胞毒性剂(例如多胺)的浓度为4-25mM。在一些实施方式中，所述细胞毒性剂(如多胺)的浓度为6-15mM、1-12mM、4-12mM或2-10mM。
高浓度的亚精胺对脑肿瘤细胞是有毒的。如果将高浓度的亚精胺注射到脑中，脑的正常(健康)区域会受到保护，免受亚精胺毒性的影响，因为亚精胺会与这些区域的透明质酸和其他聚阴离子结合。在脑肿瘤的低透明质酸环境中，亚精胺发挥其毒性作用并杀死脑肿瘤细胞。本发明的组合物中亚精胺的浓度优选为1mM至50mM。
特别优选的多胺及它们的浓度在下表中给出：
多胺 优选的浓度 最优选的浓度
亚精胺 2-12mM 4-12mM
腐胺 2-12mM 4-10mM
尸胺 1-6mM 4-6mM
1,3-二氨基丙烷 2-12mM 4-6mM
精胺 2-10mM 4mM
BHMTA 1-6mM 4mM
上表中多胺的结构和浓度(除其他外)提供了以下之间的化学平衡：
(i)结合到ECM的细胞毒性剂，和
(ii)游离的、未结合的细胞毒性剂
在正常脑ECM中有利于ECM结合的状态，并且在肿瘤ECM中有利于游离、未结合的状态(优选其中所述肿瘤为GBM肿瘤)。
所述细胞毒性剂(例如多胺)在充足的体积中直接接触(即直接应用)以接触脑肿瘤或切除脑肿瘤的部位的所有或基本上所有脑肿瘤细胞。所述细胞毒性剂(如多胺)最初可接触脑肿瘤或切除脑肿瘤的部位的所有或基本上所有暴露的脑肿瘤细胞；然后，所述细胞毒性剂(如多胺)可在肿瘤环境中扩散以接触肿瘤中的所有脑肿瘤细胞。
例如，包含所述细胞毒性剂的组合物的体积可为50μL至150mL，例如50μL-100μL、100μL-500μL、500μL-1mL、1ml-5mL、5ml-10ml、10mL-50ml或50mL-150mL。更具体地，对于直径1.5cm的脑肿瘤，可使用大约15mL的体积；对于半径3cm的脑肿瘤，可使用大约115mL的体积。
步骤(a)是指将脑肿瘤或切除脑肿瘤的部位的脑肿瘤细胞与包含细胞毒性剂(例如多胺)的组合物接触(优选直接接触)。
所述组合物可应用于以下全部或部分的脑肿瘤细胞中的一些或全部：
(i)脑肿瘤；
(ii)脑肿瘤的附近；
(iii)切除脑肿瘤的部位；和/或
(iv)切除脑肿瘤的部位的附近。
所述组合物可直接或间接地应用于上述的一些或全部。例如，所述组合物可直接原位应用。例如，所述组合物可通过使用注射器输注、从凝胶或其他载体材料输注、通过喷涂或通过擦拭来应用。或者，所述组合物可以间接应用。例如，所述组合物可应用于肿瘤或切除肿瘤的部位的附近(例如，距离肿瘤的任何表面或切除肿瘤的部位1-50mm)，其中所述组合物扩散进入肿瘤或肿瘤边缘或切除肿瘤的部位。
优选地，在所述组合物在移除(切除)全部或部分肿瘤的手术步骤之前、期间或之后应用。所述切除肿瘤的部位可能仍含有一些脑肿瘤细胞。在一些实施方式中，所述组合物在移除全部或部分肿瘤的手术步骤之前应用。在这种情况下，所述组合物可以全身给药到受试者中，其中所述试剂包含对考虑的肿瘤特异的靶向部分。
在一些实施方式中，所述组合物在移除(切除)全部或部分肿瘤的手术步骤之前应用。在这种情况下，所述组合物可直接应用于肿瘤的全部或部分和/或肿瘤的附近的全部或部分。
在一些实施方式中，所述组合物在移除(切除)全部或部分肿瘤的手术步骤期间应用一次或多次。在这种情况下，所述组合物可直接应用于所述肿瘤的全部或部分，或所述肿瘤的附近的全部或部分或原肿瘤的部位。
在一些实施方式中，所述组合物在移除全部或部分肿瘤的手术步骤后应用。在这种情况下，所述组合物可直接应用于肿瘤原部位的全部或部分，或肿瘤原部位的附近的全部或部分。
或者或另外地，在移除肿瘤后，所述组合物可以全身给药到受试者中，其中所述试剂包含对被移除的肿瘤特异的靶向部分。
优选地，在移除肿瘤后，所述组合物局部给药到所述肿瘤腔中。
在本发明的特别优选的实施方式中，所述脑肿瘤为多形性胶质母细胞瘤，并且所述细胞毒性剂为多胺，例如亚精胺或精胺。最优选地，在切除全部或部分肿瘤后，将细胞毒性剂直接应用于肿瘤的原位。
优选地，所述方法按照指定的顺序进行。
本文所述的每个参考文献的公开内容通过引用以其整体明确并入本文。
附图说明
图1.选定的线性多胺对神经上皮起源的癌细胞系的比较急性毒性。将U87细胞接种在24孔板中，并在液体培养基中生长约3天，直至达到50％融合度。在用多胺孵育60分钟后，通过CellToxGreen(Promega)荧光检测细胞死亡情况并归一化到裂解缓冲液中的对照。EC50在6mM(尸胺)到13-14mM(亚精胺)之间变化。(B)U87细胞悬液的亮场图像显示，由于严重的膜破坏，导致在与10mM和20mM精胺孵育60分钟内细胞碎裂(放大倍数5×，视野范围：2500μm×1800μm)。对所研究的其他多胺发现了类似的效果。
图2.蛋白质组学显示神经上皮癌细胞和健康脑的大量细胞外基质组成存在显著的差异。(A)将U87细胞接种在皮氏培养皿中，并在液体培养基中生长约21天，直至基质开始脱落，然后收集。(B)从屠夫处购买新鲜小牛脑；去除了大部分血管和小脑。在液氮中研磨后，用TCA将总蛋白颗粒化。用丙酮去除TCA，并将蛋白质溶回9M尿素中。通过1D SDS电泳分离尿素可溶的蛋白，并通过LC MS/MS进行鉴定。
图3.体外测定基质聚阴离子对多胺毒性的中和作用。将U87细胞以每个球体5K个细胞悬浮，然后在非粘附板上在培养基中生长7-10天，直到将它们接种到与多胺预混合的2％ HA凝胶中24小时。(A)在球体接种到凝胶后的第2天，拍摄了代表性显微图像(放大倍数5×，视野范围：1800μm×2500μm)。(B)通过测量在第1、2和3天的四个独立球体中心在四个方向上的侵入距离来确定侵入面积。每个点都提供了标准误差，但有时不可见。
图4.当细胞远离多胺注射点时，体外HA保护它们免受多胺毒性的影响。将贴壁细胞用3％HA凝胶在24孔板中培养，直到达到40-50％融合度。将无毒荧光染料-CellToxGreen(Promega)-预混到凝胶中。在孔板的6点钟位置注入30μL多胺(总凝胶体积的1/20)。CellToxGreen仅渗透到具有受损膜的死亡细胞中，与其DNA结合并发出绿色荧光，即荧光强度的增加量化了细胞死亡。使用荧光阅读器FLUOstar(BMG Labtech，德国)的孔扫描功能对细胞进行7天的监测。(A)绘制孔以显示多胺注射点和注射点附近细胞的命运；以及由44个扫描区域组成的孔的代表性图像。区域的荧光强度越高，死亡细胞的数量就越多。(B)孔的两个相对区域中的死亡细胞荧光的比率。比率＝[注射点附近22个区域的荧光强度]/[与注射点相对的22个区域的荧光强度]。荧光强度从每个浓度点的4个独立孔中取平均值，标准误差不超过强度值的15％。(C)用精胺孵育2天后，死亡细胞和活细胞之间形成边界(左图)，圆形细胞是死亡的并被台盼蓝染成深色(中图)，细长细胞是存活的并呈半透明(右图)。放大倍数5×，视野范围：2500μm×1800μm。
图5.单次脑内注射多胺后，NCr nu/nu小鼠的增重和存活。每组6只动物在第0天随机分组，并在第1天注射10μL的4mM和10mM的以下三种多胺：腐胺、亚精胺和尸胺。监测动物体重、存活和行为，持续14天。只有10mM尸胺表现出急性毒性，其他多胺和浓度是安全的，没有影响动物行为或体重增加。
具体实施方式
本发明通过以下实施例进一步说明，除非另有说明，否则其中的部分和百分比均以重量计，温度为摄氏度。应当理解的是，这些实施例仅作为说明给出，表明本发明的优选实施方式。从上述讨论和这些实施例中，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离其精神和范围的情况下，可以对本发明进行各种变更和修改，以使其适应各种用途和条件。因此，除了本文所示和描述的那些之外，根据前面的描述，本发明的各种修改对于本领域技术人员来说将是显而易见的。这些修改也旨在落入所附权利要求的范围内。
实施例1：高浓度的多胺对培养基中的细胞具有细胞毒性
我们首先测试了不同多胺对悬浮在培养液中的脑癌细胞的细胞毒性，并使用相差光学显微镜验证了细胞死亡是通过膜破坏发生的。当U87细胞(一种源于神经上皮的侵入性癌细胞系)在含有10％胎牛血清的全MEM培养基中接种和孵育时，我们测试了多胺对U87细胞的毒性。图1显示，在所采用的浓度下，所有测试的多胺都具有高毒性，并导致严重的细胞质膜破坏。
实施例2：正常脑的细胞外基质与脑肿瘤的细胞外基质显著不同。
蛋白质组学研究表明，源于神经上皮的侵入性癌细胞系产生基质，该基质主要由缺乏糖胺聚糖(GAG)修饰(即缺乏聚阴离子修饰)的蛋白质组成，但主要含有例如肌腱蛋白C、胶原蛋白VI和纤连蛋白等糖蛋白。相比之下，脑细胞外基质由蛋白聚糖组成，例如多功能蛋白聚糖、短小蛋白聚糖、神经蛋白聚糖、HAPLIN1、2和4，即富含GAG。先前的研究已经表明，脑中透明质酸(HA)(一种游离聚阴离子)的浓度约为3％w/w。
详细地，将U87细胞接种于皮氏培养皿中，并在液体培养基中生长约21天，直到细胞产生的基质开始从皮氏培养皿中脱落。然后收获ECM作为脑肿瘤ECM的模型。从屠夫处购买新鲜小牛脑作为正常脑ECM的模型；去除了大部分血管和小脑。对于体外和离体样品，均在液氮中研磨后，使用TCA将总蛋白颗粒化。用丙酮去除TCA，并将蛋白质溶回9M尿素中。通过1D SDS电泳分离尿素可溶的蛋白，并通过LC MS/MS进行鉴定。
图2展示了得到的蛋白质组学数据，表明正常脑和脑肿瘤ECM的成分之间的显著差异。因此，开发一种与正常脑基质强结合，而与脑肿瘤ECM结合不那么强的药物是可行的，从而在肿瘤内存在高浓度的游离活性药物，而在正常脑组织中几乎没有副作用。
实施例3：如果多胺与基质强结合，那么正常脑基质的模型消除高浓度多胺的细胞毒性。
多胺与(正常)脑ECM中聚阴离子(透明质酸，GAG)的结合强度是决定多胺作用于癌细胞而非脑细胞的决定性因素。当结合强时，多胺在到达被细胞外聚阴离子包围的细胞膜之前会被中和。当结合弱时，即使细胞被聚阴离子包围，足够浓度的多胺也可能杀死细胞。为了测试不同多胺的结合强度，我们开发了一种3D中和测定法：在预混有不同多胺的2wt％HA凝胶中，在体外监测来自神经上皮癌球体(U87细胞系)的侵入。来自球体的侵入表明细胞存活，因此预测多胺在体内与脑聚阴离子的强结合。多胺在体外与HA的弱结合表现为侵入的缺失，即细胞中毒，因此预测多胺在体内与脑聚阴离子的弱结合。
没有显示侵入的球状细胞通过Presto Blue代谢染料进一步测试了代谢活性，发现它们完全无代谢活性，因此很可能已经死亡。观察到从球状细胞扩散的细胞中存在明显差异，亚精胺是HA的最强结合剂(球状细胞的侵入没有受到多胺的影响)，而精胺是HA的最弱结合剂(侵入受到强烈抑制)。
详细地，将多胺和与含有10％胎牛血清的完全MEM培养基混合的2wt％透明质酸混合，以支持细胞生长，达到所需的多胺浓度，然后将所得的透明质酸/多胺凝胶放置在24孔板中。在每个孔中放置一个U87 GBM细胞的3D肿瘤球体。对周围富含透明质酸的基质的侵入进行数天的成像，并通过测量从肿瘤球状细胞中心沿四个正交方向的最大侵入距离来确定侵入面积，并将其与透明质酸基质中不含多胺的对照组进行比较。
我们发现，对于富含透明质酸的基质中的细胞，在培养基中观察到的亚精胺和腐胺的细胞毒性几乎完全消失。相比之下，精胺、BHMTA和尸胺浓度高于～4mM时，在富含透明质酸的基质中显示出细胞毒性作用，这表明当多胺浓度>4mM时，这些多胺不能充分地与透明质酸结合，以减轻它们对细胞膜的破坏作用。
实施例4：在注射多胺的正常脑基质的模型中，多胺对细胞的差异细胞毒性。
当脑癌发展时，它是在富含聚阴离子(透明质酸和GAG)的正常脑基质的环境中，而在肿瘤附近，这种环境会被降解并被水肿稀释，而肿瘤本身则会合成具有与正常脑完全不同组成的新的专门基质(见实施例2)。为了在体外证明直接将多胺注入脑肿瘤仅能消除注射附近的细胞，而不会影响远离注射点的细胞，即如实施例3所示健康的脑细胞在体内会受到富含聚阴离子的脑ECM的保护，我们开发了一种2D扫描细胞毒性测定法。首先，将源于神经上皮的癌细胞系(U87)接种，给细胞一天的时间附着在孔板底部，然后用HA凝胶覆盖，作为富含聚阴离子的正常脑ECM的模型。然后，在每孔的6点钟位置注入多胺(见图4)。在注射点附近，细胞预计会死亡，因为初始多胺浓度在该区域最大，并且该区域的HA凝胶被载体溶剂(PBS)稀释。然而，远离注射点的细胞仍然被未稀释的HA包围，当多胺通过HA凝胶扩散时，HA凝胶预计隔离多胺，前提是多胺与HA强结合，并且有足够的HA(即HA未被稀释)结合足够的多胺，以降低有效多胺浓度至低于EC50值。因此，只要多胺与HA凝胶保持强结合，预计离注射点较远的细胞就会免受多胺的影响。通过扫描孔板底部寻找死亡染料的荧光，在孔板上对细胞死亡进行成像，死亡染料结合具有膜完整性受损的细胞的DNA。
发现对于不同多胺远处细胞的HA的保护水平不同(腐胺最高，尸胺最低；图4)，但总是存在一定程度的保护：在至少2天和最多7天内(实验结束)，远离注射点的细胞死亡远低于注射点附近。除注射后的第一个小时外，在缺乏HA的液体培养基中细胞死亡(对照组)在孔板中均匀分布。
详细地，U87胶质母细胞瘤细胞在含有10％胎牛血清的全MEM培养基的24孔板中生长，直到一层融合的细胞覆盖每孔的底部(图4)。然后除去该液体培养基，留下粘附在每个孔底部的一层细胞。然后用3wt％透明质酸水凝胶覆盖那些细胞(与人类成年脑中透明质酸的wt％相当)，该水凝胶与含有10％胎牛血清的全MEM培养基(以支持细胞生长)和CellToxTMGreen Dye(Promega)混合。这种透明质酸加蛋白凝胶代表了人类脑细胞外基质的模型。CEllToxGreen是一种无毒分子，只能进入死亡细胞，在那里它与DNA结合并发出绿色荧光。因此，CEllToxGreen使我们能够在该测定中通过监测绿色荧光跟踪细胞随时间的死亡情况。
在每个孔板的6点钟位置注射30μL不同浓度的多胺，并绘制每个孔中死亡细胞含量随时间的函数。具体来说，每个孔绘制为44个一致的、连续的小方块(图4A)，并且小方块中的细胞死亡被测定为来自小方块的净绿色荧光强度。正如预期的那样，靠近每个孔6点钟位置的小方块从第一个测量时间点(24小时)开始就表现出高水平的细胞死亡，并且持续上升直到实验结束(144小时)。相比之下，在每个孔的12点钟位置周围的小方块中(即在注射精胺的孔的相对侧)，即使在144小时后，细胞死亡的程度也比多胺注射点周围的小方块低2至7倍。
发现，在实施例3中我们发现在2wt％的透明质酸中是无毒的4-12mM的亚精胺浓度(图4B)对于每个孔板中靠近亚精胺注射点的U87细胞是高毒性的，导致细胞迅速死亡(对4-12mM的亚精胺浓度48-72小时)。然而，在每个孔板的相对侧的细胞仍然存活了至少7天(图4)。这些结果意味着，亚精胺对注射位置周围的GBM细胞仍然具有高度的细胞毒性，但游离亚精胺的扩散速率和局部浓度可能受到其与透明质酸的结合的强烈限制。这两种效应的结合是，每个孔板中12点钟位置周围的亚精胺的局部浓度不会达到足够高的值，以造成足够的细胞损伤而导致细胞死亡。
用相差显微镜观察经台盼蓝染色的孔板，发现活细胞(细长形貌，染色后呈半透明)和死细胞(圆形形貌，染色后呈深蓝色)之间形成了明显的边界(图4C)。这样的边界与我们对死细胞绘图的解释是一致的。
我们还发现，4-6mM的精胺浓度虽然对注射点附近的细胞有毒，但对距离注射点仅几毫米的细胞是无害的(图4B)。与培养基中相同细胞类型相比，在富含透明质酸的环境中，即使是10mM精胺对细胞的毒性也降低了3倍。与实施例3相比，本实施例中精胺的毒性降低可以通过本实施例中使用的透明质酸浓度(3wt％)比实施例3(2wt％)更高来解释，并证实了多胺的细胞毒性取决于多胺被细胞外基质隔离的程度。
实施例5：体内多胺对脑组织的细胞毒性
为了检验多胺在体内的安全性，并评估其对脑功能的影响，选择向NCr nu/nu小鼠脑中单次注射10μL作为模型。小鼠脑中10μL的体积与人脑中直径3cm的肿瘤相关性很好，这是典型大小，例如，对于初始胶质母细胞瘤诊断来说。因此，注射体积与可能需要注射到人类脑肿瘤中的体积相似。选择了三种多胺进行测试：腐胺、亚精胺和尸胺。多胺在两种浓度下进行了测试：最低浓度4mM(根据体外测定预计是安全的)，以及最高浓度10mM(至少对尸胺来说显示出一定的毒性)。在缺乏HA的培养基中，所有多胺在4mM浓度下都表现出一定的毒性(图1)，但与HA的结合强度相对较高(图3)，并且在HA凝胶中对远处细胞具有持久的保护作用(图4)。所有多胺在10mM浓度下都表现出明显的毒性；所测试的多胺的EC50值在6mM到15mM之间，这取决于特定的多胺(图1)。在我们的体外研究中(见实施例4，图4)，远离腐胺和亚精胺注射点的HA凝胶中的细胞在4mM和10mM多胺浓度下未免受了多胺的毒性影响，但未能免受10mM尸胺注射的毒性影响。因此，我们预计尸胺在高(10mM)浓度下在体内是有毒的，但腐胺或亚精胺不是这样。体内实验证实，10mM尸胺具有急性毒性：6只动物中有3只在注射30min后死亡，并且另外2只在24小时内死亡。只有一只动物存活下来，并且在第3天体重下降18％后，它完全恢复，体重迅速增加。腐胺和亚精胺在这两种浓度下都没有表现出急性毒性，并且4mM尸胺也是安全的
长期来看，用多胺治疗的动物没有记录到奇怪的行为或临床观察结果，因此发现多胺注射对脑功能是安全的。用任一浓度的多胺处理的动物数量足以得出结论：多胺可以被脑基质中的HA充分中和，从而对动物的生长和行为没有长期影响，除了10mM的尸胺，这正如我们在体外工作中预期的那样，10mM的尸胺是高毒性的(图3和4)。因此，我们的体外实验(实施例3和4)显示出良好的预测水平，并转化为“真实大脑”的情况。

Claims (23)

1.一种杀死受试者中脑肿瘤中的脑肿瘤细胞或切除脑肿瘤的部位的脑肿瘤细胞的体内方法，所述方法包括以下步骤：
(a)将包含细胞毒性剂的组合物与脑肿瘤中的脑肿瘤细胞或切除脑肿瘤的部位的脑肿瘤细胞直接接触；
其中所述细胞毒性剂为多胺并且其中在以下之间的化学平衡：
(i)结合到ECM的细胞毒性剂，和
(ii)游离的、未结合的细胞毒性剂
在正常脑ECM中有利于ECM结合的状态，并且在肿瘤ECM中有利于游离、未结合的状态。
2.一种细胞毒性剂，用于杀死脑肿瘤中的脑肿瘤细胞或切除脑肿瘤的部位的脑肿瘤细胞的体内方法，所述方法包括以下步骤：
(a)将包含所述细胞毒性剂的组合物与脑肿瘤中的脑肿瘤细胞或切除脑肿瘤的部位的脑肿瘤细胞直接接触；
其中所述细胞毒性剂为多胺并且其中在以下之间的化学平衡：
(i)结合到ECM的细胞毒性剂，和
(ii)游离的、未结合的细胞毒性剂
在正常脑ECM中有利于ECM结合的状态，并且在肿瘤ECM中有利于游离、未结合的状态。
3.细胞毒性剂在制造组合物中的用途，所述组合物用于杀死脑肿瘤中的脑肿瘤细胞或切除脑肿瘤的部位的脑肿瘤细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)将包含所述细胞毒性剂的组合物与脑肿瘤中的脑肿瘤细胞或切除脑肿瘤的部位的脑肿瘤细胞直接接触；
其中所述细胞毒性剂为多胺并且其中在以下之间的化学平衡：
(i)结合到ECM的细胞毒性剂，和
(ii)游离的、未结合的细胞毒性剂
在正常脑ECM中有利于ECM结合的状态，并且在肿瘤ECM中有利于游离、未结合的状态。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法、细胞毒性剂或用途，其中所述细胞毒性剂为多胺，其与透明质酸和/或脑细胞外基质蛋白聚糖(优选强)结合。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法、细胞毒性剂或用途，其中所述多胺是这样一种多胺：EC50浓度在与细胞培养基混合的3wt％的透明质酸中测试时，提高2倍或更多，并且自应用时起持续这样至少4天。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法、细胞毒性剂或用途，其中所述多胺是这样一种多胺：在PBS中多胺引起细胞死亡的EC50浓度，对在3wt％透明质酸/PBS的细胞引起低于20％(优选低于10％或5％)的细胞死亡。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法、细胞毒性剂或用途，其中所述多胺是这样一种多胺：在中(任选地在PBS中)测试时，EC50浓度更低、或相同、或仅高出至多50％。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法、细胞毒性剂或用途，其中所述多胺是这样一种多胺：在PBS中多胺引起细胞死亡的EC50浓度，在中(任选地在PBS中)对脑肿瘤细胞造成至少20％(优选至少40％、60％或80％)的细胞死亡。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法、细胞毒性剂或用途，其中所述多胺具有以下结构：
NH2-[(CH2)a-NH]-[(CH2)b-NH]x-[(CH2)c-NH]y-H
其中a、b和c各自独立地为3、4或5；并且x和y各自独立地为0或1。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法、细胞毒性剂或用途，其中：
(a)所述多胺具有2、3、4、5、6、7、8、9或10个胺基；或
(b)所述多胺具有至少两个伯胺、至多两个仲胺或至多两个叔胺。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法、细胞毒性剂或用途，其中所述细胞毒性剂选自由精胺、亚精胺、双(六亚甲基)三胺(BHMTA)、聚酰胺胺(PAMAM，例如PAMAM-g0)、热精胺、聚L-赖氨酸、聚R-赖氨酸聚烯丙胺、聚烯丙胺盐酸盐、聚乙烯基亚胺、壳聚糖和壳聚糖衍生物、腐胺和尸胺组成的组。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法、细胞毒性剂或用途，其中所述细胞毒性剂为精胺、腐胺、尸胺、1,3-二氨基丙烷或亚精胺，优选为腐胺或亚精胺。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法、细胞毒性剂或用途，其中所述组合物中的所述细胞毒性剂的浓度为100μM至50mM，优选为1-25mM。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法、细胞毒性剂或用途，其中所述脑肿瘤是这样一种脑肿瘤：脑肿瘤的近环境中ECM的透明质酸比例等于或低于脑ECM湿重的3wt％。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法、细胞毒性剂或用途，其中所述脑肿瘤选自由星形细胞瘤、脑干胶质瘤、毛细胞星形细胞瘤、室管膜瘤、原始神经外胚层肿瘤、小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤、神经胶质瘤、髓母细胞瘤、神经母细胞瘤、少突胶质细胞瘤、松果体星形细胞瘤、垂体腺瘤、视通路和下丘脑胶质瘤组成的组。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法、细胞毒性剂或用途，其中所述脑肿瘤选自由多形性胶质母细胞瘤(GBM)、神经胶质瘤、弥漫性中线胶质瘤、混合性神经胶质瘤、星形细胞瘤、少突胶质胶质瘤、髓母细胞瘤、松果体区肿瘤、非典型畸胎样横纹肌样肿瘤(AT/RT)和原始神经外胚层肿瘤(PNETS)组成的组。
17.根据权利要求16中所述的方法、细胞毒性剂或用途，其中所述脑肿瘤为多形性胶质母细胞瘤(GBM)。
18.根据前述权利要求中任一项所述的方法、细胞毒性剂或用途，其中所述细胞毒性剂的细胞毒性作用非特异于脑肿瘤细胞。
19.根据前述权利要求中任一项所述的方法、细胞毒性剂或用途，其中所述细胞毒性剂还包含一种对要靶向的脑或脑肿瘤特异的靶向部分。
20.根据前述权利要求中任一项所述的方法、细胞毒性剂或用途，其中所述细胞毒性剂还包含一种限制所述细胞毒性剂的扩散范围的部分。
21.根据前述权利要求中任一项所述的方法、细胞毒性剂或用途，其中所述组合物应用于以下全部或部分的脑肿瘤细胞中的一些或全部：
(i)脑肿瘤；
(ii)脑肿瘤的附近；
(iii)切除脑肿瘤的部位；和/或
(iv)切除脑肿瘤的部位的附近。
22.根据前述权利要求中任一项所述的方法、细胞毒性剂或用途，其中所述组合物通过使用注射器输注、从凝胶或其他载体材料输注、通过喷涂或通过擦拭来应用。
23.根据前述权利要求中任一项所述的方法、细胞毒性剂或用途，其中所述脑肿瘤为多形性胶质母细胞瘤，并且所述细胞毒性剂为亚精胺、精胺或腐胺。
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