CN118028343A - 一种快速将二倍体宿主转变为单倍体的方法及其在大片段dna转移中的应用 - Google Patents
一种快速将二倍体宿主转变为单倍体的方法及其在大片段dna转移中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN118028343A CN118028343A CN202410111954.3A CN202410111954A CN118028343A CN 118028343 A CN118028343 A CN 118028343A CN 202410111954 A CN202410111954 A CN 202410111954A CN 118028343 A CN118028343 A CN 118028343A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- chromosomes
- host
- sequence
- ura3
- chromosome
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 85
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title claims abstract description 65
- 238000012546 transfer Methods 0.000 title abstract description 17
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims abstract description 127
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims abstract description 92
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 52
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 claims abstract description 47
- 210000002230 centromere Anatomy 0.000 claims abstract description 45
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 claims abstract description 11
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 claims abstract description 10
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 7
- 208000036878 aneuploidy Diseases 0.000 claims abstract 2
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 claims description 88
- 230000013011 mating Effects 0.000 claims description 79
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 claims description 48
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 47
- 101150050575 URA3 gene Proteins 0.000 claims description 22
- 101100246753 Halobacterium salinarum (strain ATCC 700922 / JCM 11081 / NRC-1) pyrF gene Proteins 0.000 claims description 18
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims description 18
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 claims description 17
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 14
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 13
- XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M lithium acetate Chemical compound [Li+].CC([O-])=O XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 13
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 claims description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 10
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 10
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 claims description 9
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 claims description 9
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims description 8
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 claims description 7
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 claims description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 5
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 claims description 5
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 5
- 102100035102 E3 ubiquitin-protein ligase MYCBP2 Human genes 0.000 claims description 4
- 241000219470 Mirabilis Species 0.000 claims description 3
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 claims description 3
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 3
- 241000235649 Kluyveromyces Species 0.000 claims description 2
- 241000235648 Pichia Species 0.000 claims description 2
- 241000235015 Yarrowia lipolytica Species 0.000 claims description 2
- 230000005782 double-strand break Effects 0.000 claims description 2
- 230000003322 aneuploid effect Effects 0.000 claims 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 claims 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 8
- 238000012216 screening Methods 0.000 abstract description 6
- 208000031639 Chromosome Deletion Diseases 0.000 abstract description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 abstract description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 abstract description 4
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 abstract description 2
- SEHFUALWMUWDKS-UHFFFAOYSA-N 5-fluoroorotic acid Chemical compound OC(=O)C=1NC(=O)NC(=O)C=1F SEHFUALWMUWDKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract 1
- 231100001075 aneuploidy Toxicity 0.000 abstract 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 abstract 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 abstract 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 abstract 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 13
- 230000008569 process Effects 0.000 description 11
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 8
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 8
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 8
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 8
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 7
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 230000028070 sporulation Effects 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241001496687 Saccharomyces cerevisiae Y12 Species 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910013594 LiOAc Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000003491 array Methods 0.000 description 3
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 230000021121 meiosis Effects 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 3
- 238000010008 shearing Methods 0.000 description 3
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 3
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 3
- -1 5-aminouracil hydrochloride Chemical compound 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 101100495925 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) chr3 gene Proteins 0.000 description 2
- 239000002585 base Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000000861 blow drying Methods 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 244000153158 Ammi visnaga Species 0.000 description 1
- 235000010585 Ammi visnaga Nutrition 0.000 description 1
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000007702 DNA assembly Methods 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 229920002562 Polyethylene Glycol 3350 Polymers 0.000 description 1
- 101100010928 Saccharolobus solfataricus (strain ATCC 35092 / DSM 1617 / JCM 11322 / P2) tuf gene Proteins 0.000 description 1
- 101150001810 TEAD1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150074253 TEF1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100029898 Transcriptional enhancer factor TEF-1 Human genes 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 101150038500 cas9 gene Proteins 0.000 description 1
- 229920006317 cationic polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000002224 dissection Methods 0.000 description 1
- 238000011978 dissolution method Methods 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000009510 drug design Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 238000012268 genome sequencing Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000000703 high-speed centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012165 high-throughput sequencing Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 238000007500 overflow downdraw method Methods 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 238000002205 phenol-chloroform extraction Methods 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 239000007320 rich medium Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 238000012418 validation experiment Methods 0.000 description 1
- 238000012070 whole genome sequencing analysis Methods 0.000 description 1
- 108010082737 zymolyase Proteins 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
- C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
- C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
- C12N15/905—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in yeast
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
- C12R2001/84—Pichia
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
- C12R2001/85—Saccharomyces
- C12R2001/865—Saccharomyces cerevisiae
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明提供了一种将二倍体宿主向单倍体转变的方法及其在大片段DNA转移中的应用。该方法利用CRISPR/Cas9系统、着丝粒附近产生DSB诱导整条染色体删除技术以及URA3/5‑FOA反筛系统，实现了一次性多靶点地快速消除酵母16条染色体，从而在二倍体酵母中选择性消除一套基因组，最终保留另一套染色体，得到单倍体酵母，进一步基于该方法实现了1.024Mb DNA片段的转移。该方法具有操作简单、周期短、成本低的特点，有望为含有着丝粒型染色体的其他酵母等真核微生物及动植物提供实现快速单倍体化的便捷途径，在生物育种等方面具有广泛的应用潜力，亦可用于其他定制化多条染色体删除的非整倍体细胞构建和大片段DNA的转移。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及将一种快速将二倍体宿主转变为单倍体的方法及其在大片段DNA转移中的应用。
背景技术
现有技术报道的获得酵母单倍体的方法是：将交配型为A和α的两种酿酒酵母在培养基中进行自发交配，形成携带两套基因组的二倍体，之后二倍体酵母将进行减数分裂，生成孢子。然后通过物理或化学的方法人为地将孢子拆分成四个各携带一套基因组的单倍体孢子。从两个不同的单倍体酵母株开始培养二倍体酵母，培养条件通常是富含氮源的培养基，需要1-2天的时间。之后诱导孢子形成，将二倍体酵母细胞转移到缺乏氮源的培养基中，刺激孢子形成途径的启动，需要7天的时间。检测孢子形成后进行提取，需要数天至一周的时间。综上，这个过程从酿酒酵母交配到拆分得到单倍体持续9天，时间周期长，操作繁琐。
目前，拆孢主要采用的化学方法和物理方法，除了上述时间周期长和操作繁琐的共性问题，各自还存在一些其他的缺点，具体过程和缺点如下：
(1)酶处理法
做法：使用酵母胰蛋白酶或Zymolyase等酶，对细胞壁进行水解，有选择性地破坏特定的结构。
缺点：酶处理可能需要一定时间，并且特定的酶可能对孢子产生不可逆的影响。此外，有些酵母株可能对特定酶不敏感。
(2)化学溶解法：
做法：使用酸或碱等化学溶剂，以破坏细胞壁，释放孢子。
缺点：需要小心控制溶液的pH和浓度，以避免对其他细胞组分造成损害。酵母细胞壁的化学成分可能因酵母株的不同而异，因此需要优化条件。
(3)超声波破碎法：
做法：使用超声波破碎仪，在样品中引入超声波，产生物理性的破碎作用。
缺点：超声波的强度和处理时间需要精确控制，以避免过度破坏孢子。此外，可能需要昂贵的实验室设备。
(4)机械破碎法：
做法：利用高速离心机或球磨机等设备，通过机械剪切和冲击来破裂细胞壁。
缺点：机械破碎可能导致孢子的机械损伤，尤其是在高速离心过程中。需要仔细优化条件，以平衡破裂效果和孢子的完整性。
随着基因组测序技术的发展和DNA组装规模的不断增加，微生物基因组理性设计改造的尺度不断增加，由单个基因到代谢路径，再到完整的基因组拓展，其中大片段DNA的组装和转移技术至关重要。高效的大片段DNA转移技术有助于保持转移的DNA片段的完整性，从而更好地模拟天然基因组结构。通常情况下，大片段DNA先在组装宿主内组装完毕，之后先提取出来进行富集、分离纯化，再通过物理或者化学的转移方法进行DNA转移，或者再酿酒酵母宿主体内直接转移到目标宿主两种形式。对于“先提取-再导入”的方法，DNA片段的提取方法主要是CTAB法、Phenol-Chloroform法、琼脂糖醇法、玻璃珠法、热碱法等。导入方法多是通过物理或化学方法，如细胞电穿孔转移、显微注射、脂质体转染和阳离子聚合物包埋转移法。这些方法操作繁琐，对于提纯的DNA质量要求高，而且由于常规提取方法提取酿酒酵母体内的DNA长度在百kb级别，使得这些方法难以实现大尺度DNA的转移，并且以上方法往往受到体外环境下剪切力的影响，大片段DNA的完整性常常受损。对于第二种宿主之间直接转移的方法，通常采用生物转移的方法，如酵母-酵母原生质体融合法，酵母交配以及细菌-酵母原生质体融合方法等。虽然该方法可以有效地避免剪切力影响，且不受DNA提取大小的影响，但获得的宿主包含两个原宿主的染色体，比如，采用酵母交配或原生质体融合法获得是包含大片段DNA的二倍体酵母，必须经过孢子形成和四分体解剖等操作，才能获得携带大片段DNA的单倍体菌株，同样面临操作过程复杂、操作难度高且周期较长的问题。
发明内容
针对现有技术从二倍体形成单倍体以及超长DNA片段转移的程序繁琐、操作难度高且周期长的问题，本发明提供了一种快速将酵母从二倍体转变为单倍体的方法，该方法操作简单、周期短、成本低。
本发明提供了一种快速将二倍体宿主转变为单倍体的方法，包括：
a)利用基因编辑技术，向二倍体宿主中待敲除的1～16号每条染色体中插入XT2片段和XT2-URA3片段，获得16条染色体被XT2-URA3修饰的二倍体宿主；
所述XT2-URA3片段包括XT2片段和URA3营养标签表达盒；
所述XT2片段由PAM序列和长度为20bp的随机序列K组成；所述随机序列K与宿主基因组序列不同源；
所述插入的位置为：每条染色体着丝粒的上游20～200bp和下游20～200bp的位置；
b)将携带靶向XT2片段的sgRNA-XT2的质粒和表达Cas9蛋白的质粒，转入二倍体宿主中，sgRNA-XT2引导Cas9蛋白分别在XT2-URA3修饰的染色体的着丝粒附近切割，发生双链DNA断裂，导致XT2-URA3修饰的染色体缺失，获得单倍体宿主。
步骤a)中，所述二倍体宿主由同属同种的不同交配型的供体宿主和受体宿主(如酿酒酵母A型或α型)通过交配获得时，所述利用XT2-URA3修饰的染色体的过程需要在交配前的供体宿主中提前完成。
步骤b)中，表达Cas9蛋白的质粒和携带靶向XT2片段的sgRNA-XT2的质粒的步骤除了可以在二倍体中完成，也可以在交配前一同转入供体宿主或受体宿主，也可将两个质粒分别转入供体宿主和受体宿主，本领域技术人员可根据实际情况和需要进行选择。将两个质粒转入同一宿主时，需要注意使用不同的筛选标签，便于目标菌株的筛选。
所述二倍体宿主、供体宿主以及受体宿主均选自含有着丝粒的微生物或动物细胞；所述含有着丝粒的微生物包括酵母或原生动物；所述酵母包括酿酒酵母、奇异酵母、解脂耶氏酵母、克鲁维酵母或毕赤酵母，包括但不局限于此。
本发明步骤a)中，所述随机序列K与宿主基因组序列不同源，是指随机序列K与宿主基因组序列不存在超过11个连续相同或连续11个互补的碱基。
一些实施例中，所述插入的位置具体可为：每条染色体着丝粒的上游20bp、50bp、80bp、110bp、140bp、170bp或200bp的位置和下游20bp、50bp、80bp、110bp、140bp、170bp或200bp的位置。
本发明步骤a)中，所述基因编辑技术包括CRISPR/Cas9技术。
本发明步骤a)中，所述PAM序列为SEQ ID NO:1所示序列：TGG；所述随机序列K具有如SEQ ID NO:2所示的核酸序列或与其至少具有80％同源性的核酸序列。其中，SEQ ID NO:2的序列为：GGTGTAACGTAGACTCACAG。一些具体实施例中，XT2序列具体为：GGTGTAACGTAGACTCACAGTGG(下划线所示的TGG为pam序列)。所述sgRNA-XT2靶向XT2片段的随机序列K，gRNA-XT与随机K序列相同或为随机K序列的反向互补序列。
一些实施方案中，所述步骤a)具体包括：
利用醋酸锂转化法将表达Cas9蛋白的质粒和携带sgRNA array*的质粒、16条染色体的donor DNA片段同时转化到单倍体宿主中，通过同源重组，获得16条染色体被XT2-URA3修饰的单倍体宿主；
所述sgRNA array*包括：分别靶向16条野生型染色体上距离着丝粒50-200bp的长度为20bp的16条gRNA序列。一些具体实施例中，sgRNA array*的序列为SEQ ID NO:35+SEQID NO:36+SEQ ID NO:37+SEQ ID NO:38。
所述donor DNA片段包括：染色体着丝粒下同源臂、URA3营养标签表达盒、XT2序列、着丝粒及其左右各50bp的序列、XT2序列和上同源臂。
本发明中，表达Cas9蛋白的质粒包括启动子、Cas9基因。本发明通过引入组成型启动子或者诱导型启动子控制Cas9蛋白的表达。本发明的一个实施例中，所述启动子为组成型启动子，如TEF1启动子。在本发明的实施另一个实施例中，在人工染色体转移的方案中，Cas9的启动子为诱导型启动子，如Gal启动子(见图11A中α交配型的菌株中)，在不含有半乳糖(Gal)的培养基中，Gal启动子处于关闭状态，Cas9蛋白不表达，在含有半乳糖的培养基中，Gal启动子开关开启，Cas9蛋白正常表达。
本发明中，所述URA3营养标签表达盒包括启动子和URA3基因，URA3营养标签表达盒的序列如SEQ ID NO:3所示。
具体地，1号染色体的donor DNA片段包括：1号染色体着丝粒下同源臂、URA3营养标签表达盒、XT2序列、着丝粒及其左右各50bp的序列、XT2序列和上同源臂。对于其他染色体的donorDNA片段，其包含的是对应染色体着丝粒下游同源臂，URA3营养标签表达盒由SEQID NO:4所示的下游引物URA3-R和SEQ ID NO:5～20对应染色体的上游引物URA3-CHR-F扩增获得；所述URA3-CHR-F(1～16号染色体)的核酸序列依次如SEQ ID NO:5～20中任一项所示。
本发明中，所述donorDNA片段可以直接采用基因合成的方式合成，也可按照本领域常规方法构建得到，如overlap PCR。本发明具体实施例中，所述donor DNA片段可按照如下方法构建获得：
1、初级片段的获取：将下同源臂、URA3营养标签表达盒、XT2-CEN(*)-XT2、上同源臂分别获取。
1)针对染色体着丝粒下同源臂片段，引物设计为左右两侧20bp左右，与URA3营养标签表达盒邻近的一侧引物加40bp与URA3 promoter同源的序列，命名为“D-CHR(*)-F”、“D-CHR(*)-R”；
2)针对URA3营养标签表达盒片段，引物设计为左右两侧20bp左右，与下同源臂邻近的一侧添加20-40bp的同源序列，命名为“URA3-CHR(*)-F”、“URA3-R”；以pRS416质粒为模板，使用引物URA3-CHR-F和URA3-R扩增获得；URA3-R的序列如SEQ ID NO:4所示；URA3-CHR-F的序列如SEQ ID NO:5～20中任一项所示。
3)针对XT2-CEN(*)-XT2片段，引物设计为CEN左右两侧20bp左右，每条引物各加23bp的XT2序列以及与毗邻片段相同的同源序列20-40bp，命名为“XT2-CEN(*)-F”、“XT2-CEN(*)-R”；
4)针对染色体着丝粒上同源臂片段，引物设计为左右两侧20bp左右，与XT2-CEN(*)-XT2邻近的一侧引物加40bp与其同源的序列，命名为“U-CHR(*)-F”、“U-CHR(*)-R”。
2、将四个初级片段：下同源臂片段、URA3营养标签表达盒片段、XT2-CEN(*)-XT2片段和上同源臂片段，利用overlap PCR方式按顺序连接，获得donor DNA片段。其中，*代表染色体序号，*为1～16中任意一个整数。
所述染色体着丝粒下同源臂和上同源臂分别为染色体上donorDNA片段插入位置两端的染色体序列。所述染色体着丝粒下同源臂和上同源臂的长度为300-1000bp，具体可为300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp或1000bp等。
本发明中，所述二倍体宿主中的两套染色体来源于同一宿主品种不同交配型的菌株时，步骤a)中所述16条染色体被XT2-URA3修饰的过程在交配前的待敲除的单倍体宿主中完成。
一些实施方案中，所述二倍体宿主中的两套染色体来源于酿酒宿主的A交配型和α交配型。
为高效实现染色体的修饰，本发明在交配前，分别将两株宿主中的一半染色体(即8条染色体)进行XT2-URA3修饰，之后通过宿主交配，消除所有野生型染色体，最终获得的宿主中仅含有16条XT2-URA3修饰的染色体。一些实施方案中，所述二倍体宿主由交配型A和交配型α的酿酒酵母交配获得，所述16条染色体被XT2-URA3修饰的单倍体酵母的制备方法具体包括如下步骤：
1)利用醋酸锂转化法将表达Cas9蛋白的质粒、携带sgRNAarray1的质粒和8条染色体的donorDNA片段同时转化A交配型酵母，经CRISPR/Cas9基因编辑和同源重组技术，向8条染色体中插入XT2片段和XT2-URA3片段，获得8条染色体被XT2-URA3修饰的A交配型酵母；
同时，将表达Cas9蛋白的质粒、携带sgRNA array2的质粒和8条染色体的donorDNA片段同时转化α交配型酵母，经CRISPR/Cas9基因编辑和同源重组技术，向8条染色体中插入XT2片段和XT2-URA3片段，获得8条染色体被XT2-URA3修饰的α交配型酵母；
所述sgRNA array1靶向A交配型酵母8条染色体距离着丝粒20-200bp的序列，所述sgRNA array2靶向α交配型酵母的8条染色体距离着丝粒20-200bp的序列；
所述A交配型酵母中被修饰的8条染色体和α交配型酵母中被修饰的8条染色体之间不存在同源染色体；
所述donor DNA片段包括：染色体着丝粒下同源臂、URA3营养标签表达盒、XT2序列、着丝粒及其左右各50bp的序列、XT2序列和上同源臂；
2)将表达Cas9蛋白的质粒和携带sgRNA array*的质粒分别转化修饰后的A交配型酵母和修饰后的a交配型酵母；然后将两株酵母进行交配，sgRNAarray*靶向A交配型酵母中8条野生型染色体和α交配型酵母中8条野生型染色体的着丝粒两端20-200bp的区域，交配后的酵母中sgRNAarray*引导Cas蛋白在野生型染色体的着丝粒附近切割，发生双链断裂，导致16条野生型染色体丢失，获得16条染色体被XT2-URA3修饰的单倍体酵母。
一些实施方案中，所述sgRNAarray*由顺序连接的sgRNAarray1和sgRNAarray2组成；所述sgRNAarray1、sgRNAarray2和sgRNAarray*的组成元件相同，包括tRNA、N20序列和structural crRNA；所述N20序列为靶向16条染色体着丝粒附近区域20-200bp的序列。所述tRNA是一种内源性的RNA加工元件，sgRNA前体上的可以被内源的自剪切机制识别并且切割，从而释放出能够执行功能的sgRNA，每个sgRNA前的tRNA序列尽量不同，减少阵列的重复性。
在本发明的一些具体实施例中，步骤1)中，利用醋酸锂转化法将表达Cas9蛋白的质粒、携带sgRNA array1的质粒和8条染色体的donor DNA片段同时转化A交配型酵母的过程分两步完成，第一步和第二步各修饰4条染色体。第一步中，利用醋酸锂转化法将表达Cas9蛋白的质粒、携带sgRNA array1a(靶向4条染色体着丝粒附近区域)的质粒和4条染色体的donor DNA片段同时转化A交配型酵母，挑选出同时实现四条染色体修饰的菌株转化表达Cas9蛋白的质粒、携带sgRNA array1b(靶向剩余4条染色体着丝粒附近区域)的质粒和剩余4条染色体的donor DNA片段。其中，sgRNA array1a+sgRNAarray1b＝sgRNAarray1(靶向8条染色体着丝粒附近区域)。
一些实施方案中，所述N20序列具有如SEQ ID NO:20～35所示的核酸序列。一些具体实施例中，所述sgRNA array*由顺序连接的sgRNA array1和sgRNA array2组成；所述sgRNA array1的序列由SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:37所示的序列顺序连接获得；所述sgRNA array2的序列由SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:39所示的序列顺序连接获得。sgRNAarray*由SEQ ID NO:36～39所示的sgRNA组成，其序列为SEQ ID NO:36+SEQ ID NO:37+SEQID NO:38+SEQ ID NO:39。
本发明中，携带sgRNA array*的质粒、携带sgRNA array1的质粒和sgRNAarray2的的构建方法为本领域常见的方法，如Gibson法；所述质粒的载体骨架为本领域常见的多拷贝质粒，如pRS426、pRS42H等。本发明具体实施例中，所述质粒的骨架为pRS42H。
针对现有的酵母交配从二倍体形成单倍体的程序繁琐、周期长的问题，本发明提供一种快速将酵母从二倍体转变为单倍体的方法，该方法利用CRISPR/Cas9技术通过将XT2-URA3片段插入野生型染色体的着丝粒附近，人为诱发菌株交配后，借助CRISPR/Cas9系统和着丝粒附近诱发DSB删除的原理(该原理图如图1所示)实现了所有XT2-URA3修饰染色体的丢失，最终仅保留一套野生型染色体，获得单倍体酵母。该方法操作简单、周期短、成本低，具有广泛应用潜力，有望为酵母细胞接受大片段DNA提供更便捷的途径，在大片段DNA操纵方面发挥关键作用。
附图说明
图1示着丝粒附近产生DSB诱发整条染色体丢失的原理示意图
图2donorDNAXT2-URA3的结构示意图
图3donor DNAXT2-URA3的构建流程
图4示sgRNAarray中gRNA表达盒的结构示意图；
图5示XT2-URA3修饰染色体的流程图。
图6示BY4741和BY4742 XT2-URA3交配触发DSB导致染色体缺失获得单倍体菌株的流程示意图；
图7示使用靶向野生型染色体的16对引物对单倍体菌株进行PCRtag验证的结果
图8示yYM080、yYM081、yYM082的DNA含量的测定结果；
图9示yYM080、yYM081、yYM082的基因组测序结果；
图10示本发明获得的单倍体化菌株的交配能力验证结果；
图11示1.024Mb合成型功能拓展染色体(synAC)进行转移的过程和原理示意图；
图12示PCR验证结果；12-a为验证所转移片段完整性的PCR结果；自上而下分别对应Y12、Y55、SK1、YJM987、CBS432、YPS138宿主菌。自左至右分别为Tans2K Marker，验证接口1-21；12-b为验证供体菌株整套染色体全部删除的PCR结果，自上而下分别对应Y12、Y55、SK1、YJM987、CBS432、YPS138宿主菌，自左至右分别为Tans2KMarker，对应BY4742染色体的验证引物1-16；
图13示被转入功能拓展染色体synAC的六种宿主菌的二代测序深度图；自上而下分别对应Y12、Y55、SK1、YJM987、CBS432、YPS138宿主菌，自左至右分别是受体菌株的16条染色体和所转移的功能拓展染色体；
图14示受体宿主菌株的转化克隆数、组装效率及单倍体效率。
具体实施方式
本发明提供了一种快速将酵母从二倍体转变为单倍体的方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
本发明涉及的部分序列信息如下：
URA3基因(SEQ ID NO:3)：
Atgtcgaaagctacatataaggaacgtgctgctactcatcctagtcctgttgctgccaagctatttaatatcatgcacgaaaagcaaacaaacttgtgtgcttcattggatgttcgtaccaccaaggaattactggagttagttgaagcattaggtcccaaaatttgtttactaaaaacacatgtggatatcttgactgatttttccatggagggcacagttaagccgctaaaggcattatccgccaagtacaattttttactcttcgaagacagaaaatttgctgacattggtaatacagtcaaattgcagtactctgcgggtgtatacagaatagcagaatgggcagacattacgaatgcacacggtgtggtgggcccaggtattgttagcggtttgaagcaggcggcagaagaagtaacaaaggaacctagaggccttttgatgttagcagaattgtcatgcaagggctccctatctactggagaatatactaagggtactgttgacattgcgaagagcgacaaagattttgttatcggctttattgctcaaagagacatgggtggaagagatgaaggttacgattggttgattatgacacccggtgtgggtttagatgacaagggagacgcattgggtcaacagtatagaaccgtggatgatgtggtctctacaggatctgacattattattgttggaagaggactatttgcaaagggaagggatgctaaggtagagggtgaacgttacagaaaagcaggctgggaagcatatttgagaagatgcggccagcaaaactaa。
BY4742和BY4741底盘来源为本实验室保存的S288C属酿酒酵母，具备高效的同源重组能力和天然的交配能力。
下面以酿酒酵母BY4742(交配型α)与BY4741(交配型A)为例，结合实施例，对本发明将二倍体宿主向单倍体转变的方法进行详细阐述：
实施例1
1、首先设计gRNA和donor DNA序列，商业合成靶向野生型染色体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的gRNA阵列(以下简称“sgRNA array-wtChr1-4”，序列如SEQ ID NO:35中第1～1070位的核酸序列)、donor DNA，靶向染色体1-4的gRNA阵列示意图如图1所示，具体序列见表1，donorDNA的结构示意图如图2所示。
以1号染色体chrⅠ的donor DNA构建为例，阐明donor DNA构建的过程，具体见图3，采用的引物如表2所示。
靶向不同染色体的gRNA表达盒均委托公司直接进行基因合成。
表1
sgRNA array中包含多个串联的sgRNA表达盒，sgRNA表达盒由Ⅱ型酵母启动子、tRNA、N20序列(序列如表2)。structural crRNA和Terminator组成(图4)，其中“tRNA(***)-N20(chr1～16)-structural crRNA”为串联重复的序列，例如sgRNA array for wtChr1-4中各元件排列为：polⅡ-1-tRNA(Gly)-N20(chr1)-structural crRNAⅠ-tRNA(Ala)-N20(chr2)-structural crRNAⅡ-tRNA(Arg)-N20(chr3)-structural crRNAⅢtRNA(Asn)-N20(chr4)-structural crRNAⅠ-tRNA(Csy)-T1。
sgRNAarray forwtChr1-16的具体阵列排列情况为：
“polⅡ-1-tRNA(Gly)-N20(chr1)-structural crRNAⅠ-tRNA(Ala)-N20(chr2)-structural crRNAⅡ-tRNA(Arg)-N20(chr3)-structural crRNAⅢ-tRNA(Asp)-N20(chr4)-structural crRNAⅠ-tRNA(Cys)-T1-polⅡ-2-N20(chr5)-structural crRNAⅡ-tRNA(Glu)-N20(chr6)-structural crRNAⅢ-tRNA(Gln)-N20(chr7)-structural crRNAⅠ-tRNA(iMet)-N20(chr8)-structural crRNAⅡ-tRNA(Ser)-T2-polⅡ-3-N20(chr9)-structural crRNAⅢ-tRNA(His)-4-tRNA(Ile)-N20(chr10)-structural crRNAⅠ-tRNA(Leu)-N20(chr11)-structural crRNAⅡ-tRNA(Lys)-N20(chr12)-structural crRNAⅢ-tRNA(Met)-T3-polⅡ-4-tRNA(Gly)-N20(chr13)-structural crRNAⅠ-tRNA(Trp)-N20(chr14)-structural crRNAⅡ-tRNA(Leu)-N20(chr15)-structural crRNAⅡ-tRNA(Ala)-N20(chr16)-structural crRNA Ⅲ-tRNA(Arg)-T4”。
表2N20序列
其中，sgRNA array forwtChr1-4、sgRNAarray forwtChr5-8、sgRNA arrayforwtChr9-12、sgRNA array forwtChr13-16的核酸序列依次如SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40所示。sgRNAarray forwtChr1-8的核酸序列为SEQ ID NO:37+SEQ ID NO:38，sgRNA array for wtChr9-16的核酸序列为SEQ ID NO:39+SEQ ID NO:40，sgRNAarray for wtChr1-16核酸序列为SEQ ID NO:37+SEQ ID NO:38+SEQ ID NO:39+SEQ ID NO:40。
sgRNA array forwtChr1-4(SEQ ID NO:37)：
TGCATTTTTTTCACATCATTATGTACGGGGGTCTGGGTGCTGGCCAGGGGGGGTCACGCGATTTGTCAACTATATAAGTACAGGCGACGTGCGATACGGTTACGGCTGTTGCGCAAGTGGTTTAGTGGTAAAATCCAACGTTGCCATCGTTGGGCCCCCGGTTCGATTCCGGGCTTGCGCAGTACAGAACTCTTAAGCACTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCACAGAAAATCGGGCGTGTGGCGTAGTCGGTAGCGCGCTCCCTTAGCATGGGAGAGGTCTCCGGTTCGATTCCGGACTCGTCCATGGAAATATAGC TATTCAACGTTTTAGAGTGAGAAATCACAAGTTAAAATAAGGCTAGACCGTTATCAACTAGAAATAGTGGCACCGAGTCGGTGCACAAACAGTAGCTCGCGTGGCGTAATGGCAACGCGTCTGACTTCTAATCAGAAGATTATGGGTTCGACCCCCATCGTGAGTGGCGATCAGCGCCAAACAATAGTTTAAGAGCTAGAAATAGCACGTTTAAATAAGGCTAGTCCGTTTTCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCCTTTGTTTCTTCCGTGATAGTTTAATGGTCAGAATGGGCGCTTGTCGCGTGCCAGATCGGGGTTCAATTCCCCGTCGCGGAGTAGGAGCGGCCAAAATGCCGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCGTAATAGAAAGCTCGTATGGCGCAGTGGTAGCGCAGCAGATTGCAAATCTGTTGGTCCTTAGTTCGATCCTGAGTGCGAGCTTATATAACTGTCTAGAAATAAAGAGTATCATCTTTCAAA。
sgRNA array for wtChr5-8(SEQ ID NO:38)：
TGCATTTTTTTCACATCGAAGCCGACGCGAATGCATCAATTTTTTTTTTTTGGTGAGGAGTTTTGAAAAAAAATGAAAAAAAAAAAATTTTTATTCTGGTTACGGCTGTTTGTTTAGTGCAAGCCACTGTGTTTTAGAGTGAGAAATCACAAGTTAAAATAAGGCTAGACCGTTATCAACTAGAAATAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTAATTATCATCCGATATAGTGTAACGGCTATCACATCACGCTTTCACCGTGGAGACCGGGGTTCGACTCCCCGTATCGGAGTTAGCATT AACAACTTCGACGTTTAAGAGCTAGAAATAGCACGTTTAAATAAGGCTAGTCCGTTTTCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCATAATTAAGAGGTTTTATAGTGTAGTGGTTATCACTTTCGGTTTTGATCCGAACAACCCCGGTTCGAATCCGGGTAAGACCTTATTGGATAATTATAATGCAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTGTAATGTTGAGCGCCGTGGCGCAGTGGAAGCGCGCAGGGCTCATAACCCTGATGTCCTCGGATCGAAACCGAGCGGCGCTATGTTTATTTCACAAGCACTAGTTTTAGAGTGAGAAATCACAAGTTAAAATAAGGCTAGACCGTTATCAACTAGAAATAGTGGCACCGAGTCGGTGCATACAATTTTGGCAACTTGGCCGAGTGGTTAAGGCGAAAGATTAGAAATCTTTTGGGCTTTGCCCGCGCAGGTTCGAGTCCTGCAGTTGTCGTATATACTGATAAGAGAATAAAGTGTAGATTGTTTCAAA。
sgRNA array for wtChr9-12(SEQ ID NO:39)：
TGCATTTTTTTCACATCCCGAGAATACTTTGCGGCTCAAGCTTAAGTTTTTTTCAAAAATTTGGCCGAACTTAAAAAAAAAATTTTTTTTATATAAAGGTTACGGCTGTTTTTCACGAATACGAGATACAGTTTAAGAGCTAGAAATAGCACGTTTAAATAAGGCTAGTCCGTTTTCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCATATAAGTTCGCCATCTTAGTATAGTGGTTAGTACACATCGTTGTGGCCGATGAAACCCTGGTTCGATTCTAGGAGATGGCAGGTCTCTTGGCCCAGTTGGTTAAGGCACCGTGCTAATAACGCGGGGATCAGCGGTTCGATCCCGCTAGAGACCAAACTCTACTA ATTATTAAATGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTCATTTATACGGAGGGTTGGCCGAGTGGTCTAAGGCGGCAGACTTAAGATCTGTTGGACGGTTGTCCGCGCGAGTTCGAACCTCGCATCCTTCAACTAATACCTAATACCTCAAGTTTTAGAGTGAGAAATCACAAGTTAAAATAAGGCTAGACCGTTATCAACTAGAAATAGTGGCACCGAGTCGGTGCCAACGAAATAGCCTTGTTGGCGCAATCGGTAGCGCGTATGACTCTTAATCATAAGGTTAGGGGTTCGAGCCCCCTACAGGGCTCAAGCATAAAAATTTGTTTTGTTTAAGAGCTAGAAATAGCACGTTTAAATAAGGCTAGTCCGTTTTCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCACAAAACAAAGCTTCAGTAGCTCAGTAGGAAGAGCGTCAGTCTCATAATCTGAAGGTCGAGAGTTCGAACCTCCCCTGGAGCA。
sgRNAarrayforwtChr13-16：(40)
TGCATTTTTTTCACATCGTGGCGAGAAAACCCGAAATGAAAAAAAAAAAAGGAGAATTATCGCGGAAAAAAAGTATATAAATGGAAAAAATATAAAAGGTTACGGCTGTTGCGCAAGTGGTTTAGTGGTAAAATCCAACGTTGCCATCGTTGGGCCCCCGGTTCGATTCCGGGCTTGCGCAGAGATTTAGATTTCAACGACGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCATTTCAAGATGAAGCGGTGGCTCAATGGTAGAGCTTTCGACTCCAATTAAATCTTGGAAATTCCACGGAATAAGATTGCAATCGAAGGGTTGCAGGTTCAATTCCTGTCCGTTTCACTTCACATCTACTTGCTTATGTTTTAGAGTGAGAAATCACAAGTTAAAATAAGGCTAGACCGTTATCAACTAGAAATAGTGGCACCGAGTCGGTGCACAGGGAGGGTTGGCCGAGTGGTCTAAGGCGGCAGACTTAAGATCTGTTGGACGGTTGTCCGCGCGAGTTCGAACCTCGCATCCTTCATTCCGATGCCCTCATATTTTGTTTTAGAGTGAGAAATCACAAGTTAAAATAAGGCTAGACCGTTATCAACTAGAAATAGTGGCACCGAGTCGGTGCAAAATCGGGCGTGTGGCGTAGTCGGTAGCGCGCTCCCTTAGCATGGGAGAGGTCTCCGGTTCGATTCCGGACTCGTCCACTTCACATCTACTTGCTTATGTTTAAGAGCTAGAAATAGCACGTTTAAATAAGGCTAGTCCGTTTTCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCACAAACAGTAGCTCGCGTGGCGTAATGGCAACGCGTCTGACTTCTAATCAGAAGATTATGGGTTCGACCCCCATCGTGAGTGTATATAAGTTTCTGATAATAAAGTAACCGATTTTTCAAA。
2、利用酿酒酵母醋酸锂转化法，将表达Cas9蛋白的质粒和携带sgRNA array-wtChr1-4的质粒(载体骨架为pRS42H)、四条donor DNA片段同时转化进BY4742。酿酒酵母醋酸锂转化法如下所述：
(1)挑单菌落至5.0mL液体培养基，30℃摇床过夜培养。
(2)100.0μL菌液转接至5.0mL液体培养基，30℃摇床培养至OD660＝1.0。
(3)取1.0mL菌液于1.5mL离心管，3000g离心1min收集细胞。
(4)1.0mL无菌水洗涤两次。
(5)1.0mL 0.1M LiOAc重悬菌体，并置于冰上静置5min。
(6)配置酵母转化体系：620.0μL 50％PEG3350，40.0μL ssDNA,90.0μL 1.0MLiOAc依次加入体系并涡旋混匀。(ssDNA预先100℃煮沸10min，置于冰上冷却后使用。)
(7)将菌液3000g离心1min收集细胞，100.0μL 0.1M LiOAc重悬菌体，将菌液加入转化体系，多次倒置离心管至混合均匀。
(8)30℃培养箱孵育30min。
(9)加入90.0μL DMSO，多次倒置离心管混匀，42℃水浴锅中热激18min。
(10)3000g离心1min收集细胞，400.0μL CaCl2重悬，静置5-10min。
(11)3000g离心1min收集细胞，100.0μL无菌水重悬，将菌液涂布至相应筛选的平板上，30℃培养箱培养。(该次转化使用不包含5-氨基尿嘧啶盐酸盐的Sc-U营养缺陷型培养基)
在筛选平板上随机挑取转化子，使用靶向修饰后区域的四对引物进行PCR tag验证，挑选出同时实现四条染色体修饰的菌株BY4742-Chr1-4XT2-URA3。随后将靶向野生型染色体Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ的gRNA阵列(以下简称“sgRNA array-wtChr5-8”)和含有XT2-URA3的四条修复染色体Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ的donor DNA采用上述的酿酒酵母醋酸锂转化法转化进BY4742-Chr1-4XT2-URA3，筛选验证后获得BY4742-Chr1-8XT2-URA3，该菌株中包含被XT2-URA3序列修饰后的染色体1-8号和未被修饰的野生型染色体9-16号。相似地，平行构建出菌株BY4741-Chr9-16XT2-URA3，该菌株包含被XT2-URA3序列修饰后的染色体9-16号和未被修饰的野生型染色体1-8号(构建流程见图2)。
以BY4742基因组为模板，分别扩增Chr1～16的上同源臂片段和下同源臂片段，扩增引物如表3和4所示，以pRS416质粒为模板，扩增URA3营养标签表达盒片段，扩增引物如表5所示，以BY4742基因组为模板，利用表6所示的引物扩增，XT2-CEN(1～16)-XT2片段。
表3下游同源臂的扩增引物
表4上同源臂扩增引物
表4URA3营养标签表达盒片段的扩增引物
表5XT2-CEN(1～16)-XT2片段的扩增引物
PCR验证中使用的引物为：
表6BY4742XT2-URA3染色体缺失的验证引物
PCR的反应体系为：2×Rapid Taq Mix的PCR反应体系，如表7所示。
表7
| 组分 | 体积 |
| ddH2O | 4.5μL |
| 2×RapidTaqMix | 7.5μL |
| 引物1(10μM) | 0.5μL |
| 引物2(10μM) | 0.5μL |
| 模板 | 2μL |
PCR的反应程序为：2×RapidTaqMix的PCR反应程序，结果见表8：
表8
3、BY4742-Chr1-8XT2-URA3和BY4741-Chr9-16XT2-URA3菌株交配构建BY4742XT2-URA3菌株
上述两种菌株验证(验证引物如表)成功后，进行菌株交配。
先通过酿酒酵母醋酸锂转化法将靶向16条野生型染色体的sgRNA array*导入BY4742-Chr1-8XT2-URA3，同时将Cas9质粒导入BY4741-Chr9-16XT2-URA3。使用无菌牙签从BY4742-Chr1-8XT2-URA3平板和BY4741-Chr9-16XT2-URA3上分别挑取菌体接到两管5ml的Sc-U液体培养基中，30℃、220rpm条件下过夜培养，使用分光光度计测量OD600，稀释至OD600＝0.5，之后吸取等菌量的两种菌液各10μl，接入YPD液体培养基中，30℃、220rpm条件下过夜培养，此时两株菌因交配型不同自发进行交配，并且在gRNA的引导下，Cas9蛋白将对BY4742-Chr1-8XT2-URA3和BY4741-Chr9-16XT2-URA3中的所有野生型染色体着丝粒附近进行DSB的触发，从而导致BY4742-Chr1-8XT2-URA3的野生型染色体9-16号和BY4741-Chr9-16XT2-URA3的野生型染色体1-8号丢失，由于决定交配型的基因位于3号染色体，因此最终得到含有16条被XT2-URA3修饰染色体的BY4742XT2-URA3菌株(构建流程见图5)。
4、BY4741和BY4742XT2-URA3的交配、单倍体菌株的获得、筛选和验证
其中，包含靶向XT2的sgRNA-XT2的质粒和表达Cas蛋白的质粒可以在获得二倍体酵母之后进行转入，也可以在交配之前分别转入待交配的两个不同交配型的宿主中，构建流程如图6所示。
具体包括如下步骤1)～2)或步骤a)～b)：
1)将步骤3)获得的BY4742XT2-URA3与不同交配型的酵母BY4741-wtChr1-16进行交配，获得二倍体酵母(包含的染色体为：BY4742-Chr1-16XT2-URA3、BY4741-wtChr1-16)；
2)向所述二倍体酵母中转化靶向XT2的gRNA-XT2质粒和表达Cas蛋白的质粒，在sgRNA-XT2的引导下，Cas9蛋白将对BY4742-Chr1-16XT2-URA3的所有染色体着丝粒附近进行DSB的触发，从而导致BY4742-Chr1-16XT2-URA3的1-16号丢失，获得野生型BY4741-wtChr1-16菌株。
a)获得BY4742XT2-URA3菌株后，采用酿酒酵母醋酸锂转化法向BY4741中引入靶向XT2序列的sgRNA-XT2的质粒，向BY4742XT2-URA3菌株中引入表达Cas蛋白的质粒。按照步骤3中的方法诱导两种交配型不同的酵母自发交配；
b)交配后，Cas蛋白将会在sgRNA-XT2的引导下在XT2-URA3修饰的染色体着丝粒附近触发DSB，从而导致所有被XT2-URA3序列修饰过的染色体丢失，酵母中仅含有一套野生型染色体，由于决定交配型的基因位于3号染色体，最终得到一套野生型染色体中3号染色体来源于BY4741，因此，获得的菌株为含有16条野生型染色体的BY4741菌株，最终获得单倍体酿酒酵母。
PCRtag验证的结果如图7所示。yYM080、yYM081、yYM082均为获得的单倍体转化子，这三个菌株在使用靶向野生型染色体的16对引物进行扩增时可得到正确长度的目的条带，在使用靶向修饰型染色体的16对引物进行扩增时均无条带；yYM079为对照的二倍体菌株，交配时未触发DSB，含有野生型染色体和修饰型染色体各一套，在32对引物扩增时均可得到正确长度的目的条带。根据电泳结果可知，采用本发明的方法获得的菌株实现了快速单倍体化。
为进一步验证单倍体化的效果和对菌株自身的影响，本发明随后使用流式细胞仪进行了DNA含量的测定，单倍体化后的菌株进行了高通量测序，以及验证交配能力的点板实验。结果见图8。
图8流式细胞仪测试结果显示，单倍体化后的菌株yYM080、yYM081、yYM082的DNA含量与对照组的单倍体野生型菌株一致，证实单倍体化的菌株中仅含有一套染色体。随后全基因组测序验证了yYM080、yYM081、yYM082的16条野生型染色体的完整性，每株菌株每条染色体的测序深度一致，证明单倍体化的菌株中删除了所有的修饰后的染色体。(见图9)
本发明后续利用点板实验验证单倍体化菌株的交配能力(见图9)。所使用的固体培养基中不添加任何氨基酸盐酸盐，仅添加葡萄糖、无氨基酵母氮源和琼脂粉。将固体培养基倾倒在平板上室温下静置过夜干燥后，取适量(20μl OD600＝0.5)野生型菌株BY4742菌液、野生型菌株BY4741涂布在两个平板上，命名为“Testerα”和“TesterA”，将两个平板开盖放置在超净工作台中吹干(根据不同设备风速决定吹干时间，本发明中采用苏净安泰超净工作台，风速调至二档位吹30分钟)。之后使用移液枪吸取3μl OD600＝0.5的测试菌液，点至测试平板上，待室温下晾干后，30℃，220rpm下静置培养过夜，观察实验结果。在测试平板“Testerα”上，对照组中野生型菌株BY4741因与所铺设菌交配，可以生长；BY4742与所铺设菌交配型相同，无法生长；
BY4743为二倍体菌株不能与所铺设菌交配，无法生长。实验组中，我们测试了18株单倍体化后的菌株，它们均保留了BY4741的16条野生型菌株，因此交配型与野生型菌株BY4741一致，也可以生长。在测试平板“Tester a”上，结果则相反。本验证实验说明基于染色体删除的单倍体化菌株保有再次与互补交配型菌株交配的能力。
实施例2基于单倍体化方法对1.024Mb合成型功能拓展染色体(synAC)进行转移
将1.024Mb的合成型功能拓展染色体(synAC)由酿酒酵母BY4742分别转移到酿酒酵母Y12、SK1、Y55、和YJM987，奇异酵母CBS432和YPS138中。下述描述中，将6种工业酵母统称为“受体宿主酵母”。
1)以包含1.024Mb synAC的酿酒酵母BY4742作为出发菌株，按照实施例1的方法构建获得16条染色体被XT2-URA3修饰的BY4742XT2-URA3菌株，该修饰菌株中携带大片段DNA，获得供体菌。
2)将步骤1获得的供体菌与受体菌酿酒酵母Y12进行交配获得二倍体酵母，向二倍体酵母中转化表达Cas9蛋白的质粒和靶向XT2片段的sgRNA-XT2，sgRNA-XT2引导Cas9蛋白分别在XT2-URA3修饰的染色体的着丝粒附近切割，发生双链DNA断裂，导致XT2-URA3修饰的16条染色体(即供体菌的BY4742XT2-URA3菌株的1～16号染色体)缺失，获得包含synAC的单倍体酿酒酵母Y12。
分别以SK1、Y55、YJM987、CBS432、YPS138作为受体菌按照以上方法步骤1)～2)进行操作，最终获得包含大片段DNA的单倍体酵母SK1、Y55、YJM987、CBS432和YPS138。synAC转移的过程和原理见图11。
为了验证供体菌株整套染色体全部删除，采用表6的引物对菌株进行PCR鉴定、为了验证所转移片段完整性，使用表9所示的引物对synAC的21个接口进行PCR检测，结果见图12。经过PCR tag检测，按照本发明的方法成功地将BY4742+AC中长达1.024Mb的合成型功能拓展染色体(synAC)分别转移到了不同的受体菌(Y12、SK1、Y55、YJM987、CBS432和YPS138)中，受体菌无需经过减数分裂和拆孢操作，迅速成为单倍体，并且保留了自身的16条天然野生型染色体(见图12)。
表9接口1～21的引物列
由二代测序结果可知，最终获得的菌株中包含受体菌株的16条染色体和所转移的synAC(见图13)，进一步说明功能拓展染色体被完整转移进六种宿主菌中。
以受体菌为酿酒酵母Y12为例，统计synAC的递送效率和单倍体化效率，结果显示，递送效率为100％，单倍体化效率为80％左右(见图14)。
以上结果表明，本发明提供的快速单倍体化方法，能够在二倍体酵母中选择性的消除其中一套基因组，成功地实现了不经减数分裂过程的单倍体化，赋予了酿酒酵母持续交配的能力。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (14)
1.一种快速将二倍体宿主转变为单倍体宿主的方法，其特征在于，包括：
a)利用基因编辑技术，向二倍体宿主中待敲除的每条染色体中插入XT2片段和XT2-URA3片段，获得染色体被XT2-URA3修饰的二倍体宿主；
所述XT2-URA3片段包括XT2片段和URA3营养标签表达盒；
所述XT2片段由PAM序列和长度为20bp的随机序列K组成；所述随机序列K与宿主基因组序列不同源；
所述插入的位置为：每条染色体着丝粒的上游20～200bp和下游20～200bp的位置；
b)将携带靶向XT2片段的sgRNA-XT2的质粒和表达Cas9蛋白的质粒，转入二倍体宿主中，sgRNA-XT2引导Cas9蛋白分别在XT2-URA3修饰的染色体的着丝粒附近切割，发生双链DNA断裂，导致XT2-URA3修饰的染色体缺失，获得单倍体宿主。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述二倍体宿主为含有着丝粒的微生物或动物细胞；所述含有着丝粒的微生物包括酵母或原生动物；所述酵母包括酿酒酵母、奇异酵母、解脂耶氏酵母、克鲁维酵母或毕赤酵母。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PAM序列具有如SEQ ID NO:1所示的核酸序列；所述随机序列K具有如SEQ ID NO:2所示的核酸序列或与其至少具有80％同源性的核酸序列。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a)中所述基因编辑技术包括CRISPR/Cas9技术。
5.根据权利要求1～4任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤a)具体包括：
利用醋酸锂转化法将表达Cas9蛋白的质粒和携带sgRNA array*的质粒、donor DNA片段同时转化二倍体宿主，或分别转化供体宿主和受体宿主，经CRISPR/Cas9基因编辑和同源重组技术，向供体宿主的每条染色体中插入XT2片段和XT2-URA3片段，获得染色体被XT2-URA3修饰的供体宿主；
所述sgRNA array*包括：分别靶向供体宿主每条染色体上距离着丝粒20-200bp的gRNA序列；
所述donor DNA片段包括：下同源臂染色体序列、URA3营养标签表达盒、XT2序列、着丝粒及其左右各50bp的序列、XT2序列和染色体上同源臂序列。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述URA3营养标签表达盒包括启动子和URA3基因，所述URA3基因的核酸序列如SEQ ID NO:3所示。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述染色体下同源臂和上游同源臂的长度为300～1000bp。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述二倍体宿主中的两套染色体来源于同一种不同交配型的宿主时，步骤a)中所述16条染色体被XT2-URA3修饰的步骤在交配前的待敲除的单倍体宿主中完成。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述二倍体宿主由交配型A和交配型α的酿酒酵母交配获得，所述16条染色体被XT2-URA3修饰的供体酵母的制备方法包括：
1)利用醋酸锂转化法将表达Cas9蛋白的质粒、携带sgRNAarray1的质粒和8条染色体的donorDNA片段同时转化A交配型酵母，经CRISPR/Cas9基因编辑和同源重组技术，向8条染色体中插入XT2片段和XT2-URA3片段，获得8条染色体被XT2-URA3修饰的A交配型酵母；
同时，将表达Cas9蛋白的质粒、携带sgRNA array2的质粒和8条染色体的donor DNA片段同时转化α交配型酵母，经CRISPR/Cas9基因编辑和同源重组技术，向8条染色体中插入XT2片段和XT2-URA3片段，获得8条染色体被XT2-URA3修饰的α交配型酵母；
所述sgRNA array1靶向A交配型酵母8条染色体着丝粒两端20-200bp，所述sgRNAarray2靶向α交配型酵母的8条染色体着丝粒两端20-200bp；
所述A交配型酵母中被修饰的8条染色体和α交配型酵母中被修饰的8条染色体之间不存在同源染色体；
所述donor DNA片段包括：染色体着丝粒下同源臂、URA3营养标签表达盒、XT2序列、着丝粒及其左右各50bp的序列、XT2序列和上同源臂；
2)将表达Cas9蛋白的质粒和携带sgRNA array*的质粒分别转化修饰后的A交配型酵母和修饰后的α交配型酵母；然后将两株酵母进行交配，交配后的酵母中sgRNA array*引导Cas蛋白在野生型染色体的着丝粒附近切割，发生双链断裂，导致16条野生型染色体丢失，获得16条染色体被XT2-URA3修饰的单倍体酵母；
所述sgRNA array*靶向A交配型酵母中剩余未被修饰的8条染色体和α交配型酵母中剩余未被修饰的8条染色着丝粒两端20-200bp的区域。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述sgRNAarray*包括tRNA、N20序列和structural crRNA；所述N20序列为靶向16条染色体着丝粒附近区域的序列。
11.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述N20序列具有如SEQ ID NO:21～36所示的核酸序列。
12.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述sgRNAarray*由顺序连接的sgRNAarray1和sgRNAarray2组成；
所述sgRNA array1的序列由SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38所示的序列顺序连接获得；
所述sgRNA array2的序列由SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:40所示的序列顺序连接获得。
13.权利要求1～12任一项所述方法在构建多条染色体删除的非整倍体宿主中的应用，所述宿主为含着丝粒的微生物或动物细胞。
14.权利要求1～12任一项所述的方法在大尺度DNA迁移中的应用，包括：
将携带大尺度DNA的供体宿主和受体宿主进行交配，获得二倍体宿主，按照权利要求1～12任一项所述的方法删除二倍体宿主中被XT2-URA3修饰的供体宿主的染色体，获得包含大尺度DNA和受体宿主染色体的单倍体宿主。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410111954.3A CN118028343A (zh) | 2024-01-26 | 2024-01-26 | 一种快速将二倍体宿主转变为单倍体的方法及其在大片段dna转移中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410111954.3A CN118028343A (zh) | 2024-01-26 | 2024-01-26 | 一种快速将二倍体宿主转变为单倍体的方法及其在大片段dna转移中的应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN118028343A true CN118028343A (zh) | 2024-05-14 |
Family
ID=90997703
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202410111954.3A Pending CN118028343A (zh) | 2024-01-26 | 2024-01-26 | 一种快速将二倍体宿主转变为单倍体的方法及其在大片段dna转移中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN118028343A (zh) |
-
2024
- 2024-01-26 CN CN202410111954.3A patent/CN118028343A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Philippsen et al. | [11] DNA of Saccharomyces cerevisiae | |
| CN107858346B (zh) | 一种敲除酿酒酵母染色体的方法 | |
| US5869239A (en) | Library screening method | |
| CN106222177B (zh) | 一种靶向人STAT6的CRISPR-Cas9系统及其用于治疗过敏性疾病的应用 | |
| Delneri et al. | Exploring redundancy in the yeast genome: an improved strategy for use of the cre–loxP system | |
| RU2706562C2 (ru) | Мультиплексная геномная инженерия, направляемая рнк | |
| Fairhead et al. | New vectors for combinatorial deletions in yeast chromosomes and for gap‐repair cloning using ‘split‐marker’recombination | |
| US20170088845A1 (en) | Vectors and methods for fungal genome engineering by crispr-cas9 | |
| Nielsen et al. | Mapping the double‐strand breaks at the mating‐type locus in fission yeast by genomic sequencing. | |
| NO177269B (no) | Autonome replikasjonssekvenser (PARS) for gjærarter av slekten Pichia og plasmid inneholdende disse | |
| EP0539490B1 (en) | Library screening method | |
| Priebe et al. | Induction of recombination between homologous and diverged DNAs by double-strand gaps and breaks and role of mismatch repair | |
| Ferris et al. | Transcription of novel genes, including a gene linked to the mating-type locus, induced by Chlamydomonas fertilization | |
| Nakagawa et al. | Involvement of the MRE2 gene of yeast in formation of meiosis‐specific double‐strand breaks and crossover recombination through RNA splicing | |
| Kloeckener-Gruissem et al. | Nuclear functions required for cytochrome c oxidase biogenesis in Saccharomyces cerevisiae: multiple trans-acting nuclear genes exert specific effects on expression of each of the cytochrome c oxidase subunits encoded on mitochondrial DNA | |
| AU2017238212A1 (en) | Generation of synthetic genomes | |
| Huang et al. | Disruption of six novel yeast genes reveals three genes essential for vegetative growth and one required for growth at low temperature | |
| Xu et al. | A CRISPR/Cas9 cleavage system for capturing fungal secondary metabolite gene clusters | |
| CN118028343A (zh) | 一种快速将二倍体宿主转变为单倍体的方法及其在大片段dna转移中的应用 | |
| Kouprina et al. | Specific isolation of human rDNA genes by TAR cloning | |
| Wellinger et al. | Use of non-denaturing Southern hybridization and two dimensional agarose gels to detect putative intermediates in telomere replication in Saccharomyces cerevisiae | |
| Naumova et al. | Molecular polymorphism of α-galactosidase MEL genes of Saccharomyces yeasts | |
| CN111548980B (zh) | 一种重组红霉素工程菌及其构建方法和筛选方法和应用 | |
| AU693712B2 (en) | Library screening method | |
| Colleaux et al. | Rapid physical mapping of YAC inserts by random integration of I-Sce I sites |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |