CN118019756A - 用于增强人心脏重编程的缩短的p63-蛋白质结构域 - Google Patents
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Abstract
本公开内容的实施方案包括用于原位心脏细胞再生的方法和组合物,其包括将心脏细胞转分化为心肌细胞。在特别的实施方案中,原位心脏细胞再生包括递送p63‑TID以及Hand2和心肌素(myocardin)之一或两者,并且在特别的实施方案中,进一步包括Gata4、Mef2c和Tbx5中的一种或多种,和/或ETV2和VEGF中的一种或多种。在本公开内容的特别方面,通过使用拥有p63‑TID以及转录因子Hand2和心肌素之一或两者的病毒载体来将成人心脏成纤维细胞重编程为心肌细胞。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年8月3日提交的美国临时专利申请系列号63/228,671(其通过提及而以其整体合并入本文)的优先权。
关于联邦资助的研究或开发的声明
本发明是按照由美国国立卫生研究所(National Institutes of Health)授予的HL152280在政府支持下完成的。政府在本发明中具有某些权利。
序列表
本申请包含序列表,其以XML格式以电子方式提交并且特此通过提及而以其整体合并。创建于2022年8月1日的所述XML副本名为BAYM_P0344WO_SequenceListing并且大小为51,424个字节。
技术领域
本公开内容的实施方案至少包括分子生物学、细胞生物学、细胞疗法和医学(包括心脏医学)的领域。
发明背景
尽管有医学和外科手术革新,但是心脏疾病仍然是世界上的第一死因。鉴于在心肌梗死后心脏的差的再生能力和心肌细胞的不可逆损失,通过形成诱导型多能干细胞或刺激直接细胞重编程来替换心肌细胞是潜在的具有巨大前景的治疗策略。这两种技术都根植于这样的想法,即在梗塞的心肌膜内的内源成纤维细胞可以被重编程为功能性心肌细胞。几个机构已报道了,转录因子(尤其是Gata4、Mef2c和Tbx5)的混合物可以用于在体外将成纤维细胞重编程为心肌细胞。然而,在实施这种疗法中的主要障碍是低的重编程效率。
本公开内容对于本领域中对心脏组织的高效和有效修复的盼望已久的需求提供了解决办法。
发明概述
本公开内容的实施方案包括用于治疗任何与哺乳动物心脏相关的医学状况的方法和组合物。在特别的实施方案中,本公开内容涉及用影响心脏中的内源细胞或组织的治疗性组合物治疗一种或多种心脏医学状况。在特别的实施方案中,向有此需要的个体提供疗法,例如当所述个体由于心脏医学状况或其风险而具有对于内源心脏组织的原位或体内疗法的需求时。在特别的实施方案中,所述个体具有来自心脏医学状况的心脏细胞或心脏组织损伤。
在特别的实施方案中,在所述个体中将某些组合物原位或体内递送至细胞允许心肌细胞的再生,这通过允许将内源非心肌细胞细胞重编程以成为心肌细胞来进行。在向所述个体递送治疗有效量的一种或多种组合物后,所述组合物至少部分地提供了所述状况的改善,例如通过允许心脏组织或其中的细胞再生。在特别的实施方案中,所述组合物包含一种或多种p63-反式激活抑制结构域(p63-TID)多肽(或者其功能性片段和/或功能性衍生物)和/或编码其的核酸,和/或其下调将会增强靶细胞的可重编程性或可塑性的其他因子。在某些实施方案中,还可以向个体提供一种或多种心脏细胞重编程因子(其可以是或可以不是转录因子),并且这些可以或可以不在与p63-TID相同的时间处提供或者在与p63-TID相同的组合物中提供。在特别的实施方案中,所述组合物包含Hand2、心肌素(myocardin)或两者。在某些实施方案中,还向个体提供一种或多种染色质去稳定剂。在特别的实施方案中,所述组合物包含p63-TID、Hand2、心肌素、VEGF和/或ETV2。在特别的实施方案中,VEGF和/或ETV2在p63-TID、Hand2和/或心肌素之前提供给细胞。在特别的实施方案中,VEGF和/或ETV2与p63-TID、Hand2和/或心肌素同时提供。在某些实施方案中,VEGF和/或ETV2与p63-TID、Hand2和/或心肌素协同地发挥功能以用于进行心脏细胞重编程。
在本公开内容的特别的实施方案中,p63-TID(或者其功能性片段和/或功能性衍生物)增加心脏细胞(例如成纤维细胞)转分化为心肌细胞的效率。如在本文中所描述的,提供p63-TID(或者其功能性片段和/或功能性衍生物)是一种新型治疗干预,其允许以更高的效率将成纤维细胞(例如)重编程为心肌细胞。提供p63-TID(或者其功能性片段和/或功能性衍生物)是一种独特的干预,其是一种用于治疗任何心脏医学状况(包括心力衰竭)的临床相关疗法。
在特别的实施方案中,任何p63-TID(或者其功能性片段和/或功能性衍生物),和/或一种或多种心脏细胞重编程因子,和/或一种或多种染色质去稳定剂,和/或一种或多种抗纤维化试剂,和/或一种或多种血管生成因子相互协同地起作用并且被提供给有此需要的个体,无论它们是否在与p63-TID相同的组合物中或者在与p63-TID相同的时间处提供。
在特别的实施方案中,有此需要的个体接受一种或多种抗纤维化试剂,例如一种或多种抗-Snail试剂(例如,siRNA、抗体、小分子例如ITD-1等)。
在一些实施方案中,存在心脏细胞的体内重编程的方法,所述方法包括向个体的心脏提供治疗有效量的一种或多种组合物的步骤,其中所述一种或多种组合物包含p63-TID(或者其功能性片段和/或功能性衍生物)。
在本公开内容的实施方案中,方法包括向所述个体提供有效量的一种或多种心脏细胞重编程因子的步骤,所述心脏细胞重编程因子可以为多肽、肽、核酸或其混合物。在特别的实施方案中,所述一种或多种心脏细胞重编程因子为Hand2、心肌素、Gata4、Mef2c、Tbx5、中胚层后部蛋白1(Mesp1)、miR-133、miR-1、Oct4、Klf4、c-myc、Sox2、Brachyury、Nkx2.5、ets变体2(ETS2;也称为ETV2)、VEGF、ESRRG、Mrtf-A、MyoD、ZFPM2、miR-590、miR-208、miR-499或其组合。在某些实施方案中,所述一种或多种心脏细胞重编程因子为Hand2和心肌素之一或两者的核酸或多肽。在一些情况下,所述Hand2和心肌素之一或两者的核酸或多肽与p63-TID(或者其功能性片段和/或功能性衍生物)在相同或不同的组合物中。在特别的实施方案中,所述一种或多种组合物包含p63-TID(或者其功能性片段和/或功能性衍生物)和Hand2的核酸,p63-TID(或者其功能性片段和/或功能性衍生物)和心肌素的核酸,和/或p63-TID(或者其功能性片段和/或功能性衍生物)、Hand2和心肌素的核酸。
在某些实施方案中,p63-TID(或者其功能性片段和/或功能性衍生物)在所述一种或多种心脏细胞重编程因子之前提供。在所述方法的特别的实施方案中,向所述个体提供有效量的一种或多种染色质去稳定剂。在特别的实施方案中,在向所述个体提供p63-TID(或者其功能性片段和/或功能性衍生物)之前向所述个体提供所述一种或多种染色质去稳定剂。在一些实施方案中,在向所述个体提供p63-TID(或者其功能性片段和/或功能性衍生物)之前向所述个体提供所述一种或多种染色质去稳定剂,并且在向所述个体提供所述一种或多种心脏细胞重编程因子之前向所述个体提供p63-TID(或者其功能性片段和/或功能性衍生物)。
在某些实施方案中,所述心脏细胞为成纤维细胞、内皮细胞、成肌细胞、祖细胞、干细胞、肌成纤维细胞或其组合。所述心脏细胞可以为分裂性细胞或非分裂性细胞。
在特别的实施方案中,所述p63-TID(或者其功能性片段和/或功能性衍生物)包含核酸,并且所述核酸被包含在一种或多种载体上。一种或多种心脏细胞重编程因子可以包含核酸,并且所述核酸可以被包含在一种或多种载体上。在特别的实施方案中,一种或多种染色质去稳定剂包含核酸,并且所述核酸被包含在一种或多种载体上。在一些实施方案中,所述核酸被包含在分开的载体上或在相同的载体上。在某些情况下,所述载体为病毒载体或非病毒载体,例如纳米颗粒、质粒、脂质体或其组合。在特别的实施方案中,所述病毒载体为腺病毒、慢病毒、逆转录病毒、腺伴随病毒载体,或附加体(非整合性)载体。在特别的实施方案中,p63-TID(或者其功能性片段和/或功能性衍生物)、Hand2和/或心肌素核酸被包含在慢病毒载体上,或者被包含在腺病毒载体上,或者是经修饰的mRNA分子。在由本公开内容所涵盖的任何载体中,可以存在细胞特异性启动子,例如成纤维细胞特异性启动子。
在特别的实施方案中,由本公开内容所涵盖的任何方法包括向所述个体递送额外的心脏疗法(例如,包括药物疗法、外科手术、心室辅助装置(VAD)植入、电视辅助胸廓切开术(VAT)、冠状动脉搭桥、经皮冠状动脉介入(PCI)或其组合的那种)的步骤。
可以以合适的递送途径(包括全身或局部递送)向所述个体提供由本公开内容所涵盖的组合物中的任一种。在特别的实施方案中,所述递送局部于心脏,并且在特别的实施方案中,将所述提供步骤进一步定义为将所述化合物注射到心脏中。
在某些实施方案中,存在包含一种或多种核酸载体的组合物,所述载体包含p63-TID(或者其功能性片段和/或功能性衍生物)并且包含一种或多种心脏细胞重编程因子。在一些情况下,包含p63-TID(或者其功能性片段和/或功能性衍生物)的载体与包含一种或多种心脏细胞重编程因子的载体是相同的载体。在某些实施方案中,包含p63-TID(或者其功能性片段和/或功能性衍生物)的载体与包含一种或多种心脏细胞重编程因子的载体是不同的载体。在特别的实施方案中,所述载体进一步包含一种或多种染色质去稳定剂。包含p63-TID(或者其功能性片段和/或功能性衍生物)的载体可以与包含一种或多种染色质去稳定剂的载体是相同的载体。包含p63-TID(或者其功能性片段和/或功能性衍生物)和包含一种或多种心脏细胞重编程因子的载体可以与包含一种或多种染色质去稳定剂的载体是相同的载体。包含p63-TID(或者其功能性片段和/或功能性衍生物)和包含一种或多种心脏细胞重编程因子的载体可以与包含一种或多种染色质去稳定剂的载体是不同的载体。包含载体的组合物可以包含p63-TID(或者其功能性片段和/或功能性衍生物)以及Hand2和心肌素之一或两者的核酸。在某些实施方案中,包含载体的组合物包含p63-TID(或者其功能性片段和/或功能性衍生物)和Hand2核酸。在一些实施方案中,包含载体的组合物包含p63-TID(或者其功能性片段和/或功能性衍生物)和心肌素核酸,或者可以包含p63-TID(或者其功能性片段和/或功能性衍生物)、Hand2和心肌素核酸。在特别的实施方案中,本公开内容的任何组合物可以包含一种或多种抗纤维化试剂。
在一些实施方案中,存在包含由本公开内容所涵盖的组合物的试剂盒,所述组合物被容纳在合适的容器中。
在某些实施方案中,在本文中提供了治疗心脏状况的方法,所述方法包括向个体的心脏提供治疗有效量的一种或多种组合物的步骤,其中所述一种或多种组合物包含下述组分、基本上由下述组分组成或由下述组分组成:A)p63-反式激活抑制结构域(p63-TID)多肽和/或其功能性衍生物和/或功能性片段,和/或编码其的核苷酸;其中所述p63-TID多肽包含下述序列、基本上由下述序列组成、由下述序列组成或者为下述序列:与SEQ ID NO:1至少或正好至少70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%同一的序列;B)Hand2多肽和/或其功能性衍生物和/或功能性片段,和/或编码其的核苷酸;C)心肌素多肽和/或其功能性衍生物和/或功能性片段,和/或编码其的核苷酸;D)ETV2多肽和/或其功能性衍生物和/或功能性片段,和/或编码其的核苷酸;和/或E)VEGF多肽和/或其功能性衍生物和/或功能性片段,和/或编码其的核苷酸。在一些实施方案中,所述方法包括下述部分、基本上由下述部分组成或由下述部分组成:提供A、B、C和D。在一些实施方案中,所述方法包括下述部分、基本上由下述部分组成或由下述部分组成:提供A、B、C和E。在一些实施方案中,D和/或E在与A、B和C在同一天提供。在一些实施方案中,D和/或E与A、B和C同时提供。在一些实施方案中,D和/或E在A、B和C之前提供。在一些实施方案中,D和/或E在A、B和C之前至少或正好1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28天或者其中可导出的任何范围提供。在一些实施方案中,A、B和C在D和/E之前提供。在一些实施方案中,A、B和C在D和/或E之前至少或正好1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28天或者其中可导出的任何范围提供。在一些实施方案中,在纳米颗粒、质粒、脂质体、病毒载体或其任何组合中提供A、B、C、D和/或E。在一些实施方案中,在病毒载体中提供A、B、C、D和/或E,其中所述病毒载体为腺病毒、慢病毒、逆转录病毒或腺伴随病毒载体。在一些实施方案中,所述病毒载体为腺病毒载体。在某些实施方案中,在体外向细胞提供一种或多种包含A、B、C、D和/或E的组合物。在某些实施方案中,向具有心脏状况的个体提供在体外被提供以A、B、C、D和/或E的细胞。在某些实施方案中,向具有心脏状况的个体的心脏直接提供在体外被提供以A、B、C、D和/或E的细胞。
上述内容已相当广泛地概述了本公开内容的特征和技术优点,以便可以更好地理解下面的对于本公开内容的详细描述。本公开内容的另外的特征和优点将会在下文中进行描述,其构成本公开内容的权利要求书的主题。本领域技术人员应当意识到,所公开的概念和具体实施方案可以容易地用作用于修饰或设计其他结构的基础,以实现本公开内容的相同目的。本领域技术人员还应当认识到,这样的等价建构不背离在所附的权利要求书中所陈述的本公开内容的精神和范围。被认为对于本公开内容来说特征性的新特征(无论是关于其组织还是操作方法),与进一步的目标和优点一起,都将会从下面的描述中得到更好理解,当与附图相联系地进行考虑时。然而,应当明确理解的是,附图中每一个仅是为了举例说明和描述的目的来提供,而非意欲作为本公开内容的限制的定义。
在本申请始终,术语“大约”用于表明,值包括关于测量或定量方法的固有误差变化。
当与术语“包含(包括)”相联合地使用时,单词“a”或“an”的使用可以意味着“一个(种)”,但它也与“一个(种)或多个(种)”、“至少一个(种)”和“一个(种)或多于一个(种)”的含义相一致。
短语“和/或”意味着“和”或“或”。为了举例说明,A、B和/或C包括:仅A,仅B,仅C,A和B的组合,A和C的组合,B和C的组合,或者A、B和C的组合。换言之,“和/或”作为包含性的“或”运作。
单词“包含”(和其任何形式)、“具有”(和其任何形式)、“包括”(和其任何形式)或“含有”(和其任何形式)是包含性的或开放式的,并且不排除另外的、未记述的要素或方法步骤。
所述组合物和关于其使用的方法可以“包含”下述项目、“基本上由下述项目组成”或“由下述项目组成”:在整个说明书中所公开的成分或步骤中的任一种。基本上由所公开的成分或步骤中的任一种组成的组合物和方法将权利要求书的范围限制于明确说明的材料或步骤,其不本质地影响所要求保护的发明的基本和新颖特征。
考虑了在本说明书中所讨论的任何实施方案可以关于本发明的任何方法或组合物来实施,反之亦然。此外,本发明的组合物可以用于实现本发明的方法。
本发明的其他目标、特征和优点将会从下面的详细描述中变得明显。然而,应当理解,所述详细描述和具体实施例(虽然指明了本发明的特定实施方案)仅以举例说明方式给出,因为在本发明的精神和范围内的各种变化和修改从该详细描述中对本领域技术人员来说将会变得明显。
附图简述
下面的附图构成本说明书的一部分,并且被包括以进一步显现本发明的某些方面。通过与在本文中所呈现的特定实施方案的详细描述相组合地参考这些附图中的一个或多个,可以更好地理解本发明。
图1A-B显示,p63同种型ΔNp63α和组蛋白脱乙酰酶1(HDAC1)在物理上相互作用,并且p63-TID破坏它们之间的结合。图1A,在无限增殖化大鼠心脏成纤维细胞中过表达(O.E)ΔNp63α-FLAG和HDAC1-GFP。通过下述方式来进行Co-IP:使用抗-FLAG抗体,随后为用针对HDAC1和p63的抗体进行免疫印迹。图1B,p63-TID的过表达干扰p63/HDAC1相互作用。将HDAC1-GFP、ΔNP63αFLAG与或不与TID载体一起在人293T细胞中共表达,并且通过使用所示的抗体来进行Co-IP。
图2A-J显示了关于人心脏成纤维细胞的分化的实验设计和其结果。图2A显示了用于测定p63-TID对于在人心脏细胞成纤维细胞中的iCM重编程的效应的实验设计的示意性描绘(实时定量逆转录PCR(qRT-PCR);免疫荧光(IF);荧光激活细胞分选术(FACS))。图2B为FACS数据,其显示了在人心脏成纤维细胞中转导所示的慢病毒载体后14天心脏肌钙蛋白T-阳性(cTnT+)细胞的百分比(n=3,数据呈现为平均值±SEM,**p<0.01Vs shNT*p<0.05VsGMT)。图2C展示了通过qRT-PCR评估的在上述经处理的细胞中心脏和成纤维细胞标志物基因的mRNA表达水平(n=3;误差棒是指平均值±SEM;*P<0.05Vs GMT,**P<0.001vs shNT)。图2D展示了关于(DAPI)(蓝色)、(FITC)(绿色)和心肌细胞标志物cTnT(红色)的代表性免疫荧光染色(比例条=100μm,以10X放大倍数捕获图像)。图2E展示了关于(DAPI)(蓝色)、(FITC)(绿色)和心肌细胞标志物α-辅肌动蛋白(红色)的代表性免疫荧光染色(比例条=100μm,以10X放大倍数捕获图像)。图2F展示了在所示的处理后通过qRT-PCR评估的心肌细胞标志物基因(cTnT、Gja1和Myh6)表达(n=3,****p<0.0001)。图2G展示了在所示的处理后通过qRT-PCR评估的成纤维细胞标志物基因(Col1a1和Postn)表达(n=3,****p<0.0001)。图2H展示了在具有或没有Hand2/心肌素(H/M)的情况下用shp63或p63-TID对其进行处理后2周关于心脏肌钙蛋白T阳性(cTnT+)人心脏成纤维细胞的代表性流式细胞术图(左图版),和如所示的那样进行处理的cTnT+细胞的百分比的定量,如通过流式细胞术所评估的(右图版)(n=3;****p<0.0001)。图2I展示了在所示的治疗后两周表达心肌细胞标志物cTnT+和α-辅肌动蛋白+的细胞(例如,在图2E中成像的)的定量,如通过免疫荧光标记所评估的(n=3,***p<0.001,**p<0.01)。图2J展示了在用p63-TID和H/M进行处理的细胞中cTnT和α-辅肌动蛋白染色的代表性高放大倍数图像,其显现了肌节结构,在经α-辅肌动蛋白标记的细胞中最清楚可见。比例尺=25μm(左图版),和在shp63+GMT、shp63+H/M或p63-TID+H/M转导4周后具有良好发展的肌节的细胞的定量,作为总α-辅肌动蛋白+细胞的百分比(右图版)(n=3;**p<0.01,***p<0.001)。
图3显示了在大鼠心脏成纤维细胞中的p63-TID施用产生了更好的iCM重编程后果。显示了通过qRT-PCR所评估的在大鼠心脏成纤维细胞中在如上面所指示的那样进行重编程因子施用后2周所示的心脏和成纤维细胞标志物基因mRNA表达的mRNA表达水平(n=3,所有数据都呈现为平均值±SEM。*P<0.05Vs GMT,**P<0.001vs shNT)。
图4A-B提供了示例性的p63-TID序列和示例性的关于包含其的载体的构建体设计。图4A描绘了包含p63-TID核酸序列(TID pp3018)的慢病毒载体图谱的一个例子。这样的载体例子可以用在重编程测定法中,例如qPCR、FACS和/或免疫荧光。图4B显示了在co-IP研究中所使用的载体,其中将TID核苷酸序列克隆在pcDNA3.1载体主链中。
图5展示了在与新生大鼠心肌细胞一起进行共培养后人心脏成纤维细胞重编程的功能功效。用表达GMT(左边)、与Hand2/心肌素(H/M)相组合的shp63(中间)或者p63-TID+Hand2/心肌素(H/M;p63TID+H/M)(右边)的慢病毒处理成人人心脏成纤维细胞。在初始转导后一周,将这些人心脏成纤维细胞与(未处理的)新生大鼠心肌细胞(对于GFP(绿色荧光蛋白)来说阴性的)一起进行共培养。最上面一排描绘了代表性免疫荧光,其显现了在与(未转导的)新生大鼠心肌细胞一起的共培养中4周后由用GMT(左边)、shp63+H/M(中间)或p63-TID+H/M(右边)进行处理的人心脏成纤维细胞进行的GFP表达(绿色)。比例条=100μm。中间一排和最下面一排描绘了在共培养4周后来自用GMT、shp63+H/M和p63-TID+H/M进行处理的GFP+人心脏成纤维细胞的代表性峰,其反映了收缩(最上面一排)和Ca2+瞬变(最下面一排)。在用单独的GMT进行处理的细胞中未观察到收缩性参数。比例条=1s。
图6A-D描绘了在增强人心脏重编程方面与shp63相比较的p63-TID的基于剂量的功效。图6A描绘了在以三种不同的p63-TID用量用HDAC1、p63-FLAG和/或p63-TID载体进行转染的293T细胞中的FLAG共免疫沉淀测定法,其显示了随着p63-TID用量而渐增的在p63-HDAC1结合中的干扰。使用β-肌动蛋白作为加载对照。IB=免疫印迹,IP=免疫沉淀。图6B描绘了在人心脏成纤维细胞中的p63-TID的用量筛选,在用20、50或100MOI的表达p63-TID的慢病毒载体处理人心脏成纤维细胞后2周心脏肌钙蛋白T(cTnT)标志物的qRT-PCR分析(n=3;***p<0.001,**p<0.01)。对照:慢病毒GFP载体,20MOI。图6C描绘了在所示的以50的感染复数(MOI)使用p63-TID载体进行处理后两周通过qRT-PCR评估的在人心脏成纤维细胞中的心肌细胞标志物基因表达(n=3,H/M=20MOI;*p<0.05vs shp63+H/M)。图6D描绘了在所示的以50的感染复数(MOI)使用p63-TID载体进行处理后两周通过qRT-PCR评估的在人心脏成纤维细胞中的成纤维细胞标志物基因表达(n=3,H/M=20MOI;*p<0.05vs shp63+H/M)。
图7A-D显示了关于人心脏成纤维细胞的分化的实验设计和其结果。图7A描绘了关于下列载体的延迟递送(即,顺次和在时间上不同的递送)的实验设计:编码GFP(adGFP;对照)、Ets变体2(ETV2)或血管内皮生长因子(VEGF)的腺病毒载体,和编码GFP(GFP;对照)、GMT(Gata4(GATA结合蛋白4)、Mef2c(肌细胞增强因子2c)和Tbx5(t-盒转录因子5))、GMTd(Gata4、Mef2c和TEAD1(TEA结构域家族成员1)或TIDH/M(p63-TID+H/M)的腺病毒载体。图7B描绘了遵循在图7A中所概括的实验设计,关于cTnT的相对mRNA表达(n=3)。图7C描绘了关于下列载体的同时递送(即在单一设置期间递送的单个或多个组合物)的实验设计:编码GFP(adGFP;对照)、Ets变体2(ETV2)或血管内皮生长因子(VEGF)的腺病毒载体,和编码GFP(GFP;对照)、GMT(Gata4、Mef2c和Tbx5)、GMTd(Gata4、Mef2c和TEAD1)或TIDH/M(p63-TID+H/M)的腺病毒载体。图7D描绘了遵循在图7C中所概括的实验设计,关于cTnT的相对mRNA表达(n=3)。
发明详述
本公开内容的一些实施方案可以由或基本上由本公开内容的一个或多个要素、方法步骤和/或方法组成。考虑了在本文中所描述的任何方法或组合物可以关于在本文中所描述的任何其他方法或组合物来实施。
在本文中所使用的术语“心脏医学状况”是指任何影响心脏组织(包括影响心脏功能)的医学状况。
在本文中所使用的术语“染色质去稳定剂”是指一种或多种推动一种或多种因子接近凝聚基因组DNA的化合物。
在本文中所使用的术语“心脏细胞重编程因子”是指一种或多种增强或推动心脏中的经分化的细胞转分化为心肌细胞的组合物。
本公开内容的实施方案包括用于治疗或预防任何其中增加心脏中的心肌细胞的数目将会是治疗性的心脏医学状况的方法和组合物。在特别的实施方案中,将心脏中的体内细胞进行重编程以成为心肌细胞。在特别的实施方案中,这至少部分地通过提供有效量的p63-TID(或者其功能性片段和/或功能性衍生物)来取得。在特别的实施方案中,将核酸和/或肽和/或多肽直接递送至心脏以允许对心脏中的非心肌细胞进行重编程以成为心肌细胞。
I.p63-TID组合物
本公开内容的实施方案包括与p63-反式激活抑制结构域(p63-TID)有关的方法和组合物。在特别的实施方案中,p63-TID(或者其片段和/或衍生物)作为任何种类的p63活性的显性失活抑制剂起作用。在特别的实施方案中,p63-TID(或者其片段和/或衍生物)作为同种型Tap63和/或ΔNp63的显性失活抑制剂起作用。在特别的实施方案中,p63-TID起作用以抑制和/或沉默p63的表观遗传效应,和/或增强心脏发生重编程基因激活。在特别的实施方案中,p63-TID促进已知阻碍心脏分化的纤维发生基因的下调。在特别的实施方案中,p63-TID提供了HDAC-指导的重编程策略,其避免与所希望的心脏分化效应无关的基因(包括但不限于,潜在的癌基因)的激活和/或沉默。将包含下述组分的组合物用于有效地治疗任何心脏医学状况:p63-TID(或者其片段和/或衍生物)和/或包含编码其的核酸序列的多核苷酸载体。
p63-TID多肽的例子如下:
MTTIYQIEHYSMDDLASLKIPEQFRHAIWKGILDHRQLHEFSSPSHLLRTPSSASTVSVGSSETRGERVIDA(SEQ ID NO:1)
可以编码p63-TID的核酸序列的例子如下:
ATGACCACCATCTATCAGATTGAGCATTACTCCATGGATGAT
CTGGCAAGTCTGAAAATCCCTGAGCAATTTCGACATGCGATC
TGGAAGGGCATCCTGGACCACCGGCAGCTCCACGAATTCTC
CTCCCCTTCTCATCTCCTGCGGACCCCAAGCAGTGCCTCTAC
AGTCAGTGTGGGCTCCAGTGAGACCCGGGGTGAGCGTGTTATTGATGCTTAA(SEQ ID NO:2)
在某些实施方案中,p63-TID可以分离自人细胞,并且因此不再存在于自然界中,或者它可以是重组的。如在本文中所提及的,当SEQ ID NO:1的天然序列通过重组方式来产生时,可以将所得的多肽称为重组p63-TID。重组p63-TID的另一个例子包含标记物或标签。p63-TID的实施方案包括其功能性衍生物和/或功能性片段,并且可以认为所述衍生物或片段是有功能的,如果它具有允许细胞在暴露于所述片段(单独地或者与一种或多种心脏细胞重编程因子相组合地)后进行重编程的能力。这样的活性可以通过任何合适的手段来测量,包括例如通过qPCR、流式细胞术、免疫荧光和/或搏动测定法(beating assay)。在特别的实施方案中,p63-TID或者其功能性片段和/或功能性衍生物是可溶的。所述p63-TID或者其功能性片段和/或功能性衍生物可以或可以不被包含在融合蛋白中。
p63-TID的蛋白质性质的组合物可以通过本领域技术人员已知的任何技术来制备,包括通过标准分子生物学技术来表达蛋白质、多肽或肽,从天然来源中分离蛋白质性质的化合物,或者化学合成蛋白质性质的材料。可以使用在本文中所公开的技术或者如本领域普通技术人员将会知晓的那样来扩增和/或表达p63-TID编码区。备选地,蛋白质、多肽和肽的各种商业制备物对于本领域技术人员来说是已知的。
在某些实施方案中,可以纯化p63-TID(或者其片段和/或衍生物)的蛋白质性质的化合物。通常,“经纯化的”将会是指特定的蛋白质、多肽或肽组合物,其已经历分级分离以去除各种其他蛋白质、多肽或肽,并且所述组合物实质上保持其活性,如可以评估的,例如通过蛋白质测定法,如本领域普通技术人员对于特定的或所希望的蛋白质、多肽或肽将会已知的。可以使用p63-TID的生物学功能等价物,包括这样的衍生物和片段。由于可以在根据本发明的p63-TID多核苷酸和/或蛋白质的结构中制造修饰和/或变化,而同时获得具有相似或经改善的特征的分子,因此此类在生物学上有功能的等价物也被涵盖在本发明之内。
在一些实施方案中,以蛋白质形式使用p63-TID,包括作为SEQ ID NO:1。在使用p63-TID的功能性衍生物或片段的情况下,p63-TID功能性衍生物或片段可以包含相比于SEQ ID NO:1而言1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20或者更多个氨基酸改变。所述p63-TID功能性衍生物或片段可以包含SEQ ID NO:1的N-末端截短,例如其中所述截短不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60个氨基酸,或者其中所述截短为至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60个氨基酸。所述p63-TID功能性衍生物或片段可以包含SEQ ID NO:1的C-末端截短,例如其中所述截短不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60个氨基酸,或者为至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60个氨基酸。所述p63-TID功能性衍生物或片段可以包含SEQ ID NO:1中的内部缺失,例如其中所述内部缺失不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60个氨基酸,或者为至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60个氨基酸。在特别的实施方案中,p63-TID功能性衍生物或片段可以包含与SEQ ID NO:1至少或正好70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%同一的序列。
在一些实施方案中,以核酸形式使用p63-TID,例如SEQ ID NO:2。在使用p63-TID核酸的功能性衍生物或片段的情况下,p63-TID功能性衍生物或片段可以包含相比于SEQID NO:2而言1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20或者更多个差异,并且这些可以或可以不在摇摆不定的位置。所述p63-TID功能性衍生物或片段可以包含在SEQ ID NO:2的5′末端处的截短,例如其中所述截短不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、75、90、100、110、125或更多个核苷酸,或者其中所述截短为至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、75、90、100、110、125或更多个核苷酸。所述p63-TID功能性衍生物或片段可以包含SEQ ID NO:2的3′截短,例如其中所述截短不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、75、90、100、110、125或更多个核苷酸,或者为至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、75、90、100、110、125或更多个核苷酸。所述p63-TID功能性衍生物或片段可以包SEQ ID NO:2中的内部缺失,例如其中所述内部缺失不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、75、90、100、110、125或更多个核苷酸,或者为至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、75、90、100、110、125或更多个核苷酸。在特别的实施方案中,p63-TID功能性衍生物或片段可以包含与SEQ ID NO:2至少或正好70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%同一的序列。任何功能性片段和/或功能性衍生物将会保持全长SEQ ID NO:1多肽的生物学活性。
在特别的实施方案中,本公开内容涵盖使用作为包含在重组载体中的核酸的p63-TID,所述重组载体包含编码作为多肽的p63-TID的核酸序列。在特别的实施方案中,所述重组载体包含编码SEQ ID NO:1(包括其中的所有连续氨基酸)的核酸序列。在特别的方面,所述重组载体为病毒载体(例如,慢病毒、腺病毒、腺伴随病毒或逆转录病毒载体)或非病毒载体(例如,质粒、转座子等)。
p63-TID的生物学功能等价物可以从已经进行了改造以包含不同的序列而同时保持编码“野生型”或标准蛋白质的能力的多核苷酸来产生。这可以通过遗传密码的简并性(即存在多个编码相同氨基酸的密码子)来实现。在一个例子中,本领域技术人员可能希望将限制酶识别序列引入到多核苷酸中而同时不扰乱该多核苷酸编码蛋白质的能力。
在另一个例子中,p63-TID多核苷酸成为(并且编码)具有更显著变化的生物学功能等价物。在蛋白质结构中某些氨基酸可以置换为其他氨基酸,而没有与结构(例如,抗体的抗原结合区、在底物分子上的结合位点、受体等)的相互作用结合能力的可觉察的损失。所谓的“保守”变化不破坏蛋白质的生物学活性,因为所述结构变化不是影响蛋白质执行其所设计的功能的能力的结构变化。因此,发明人考虑,可以在本文中所公开的基因和蛋白质的序列中进行各种变化,而仍然达到本发明的目标。
关于功能等价物,本领域技术人员充分理解,在“在生物学上有功能的等价物”蛋白质和/或多核苷酸的定义中固有的是这样的概念:对于这样的变化的数目存在限制,所述变化可以在所述分子的规定部分内做出,而同时保留具有可接受水平的等价生物学活性的分子。因此,在生物学上有功能的等价物在本文中被定义为其中所选择的氨基酸(或密码子)可以被置换的那些蛋白质(和多核苷酸)。
通常,分子的长度越短,可以在分子中做出而同时保持功能的变化就越少。较长的结构域可以具有中间数目的变化。全长蛋白质将会对于较大数目的变化具有最多耐受性。然而,必需意识到,某些高度依赖于其结构的分子或结构域可以耐受很少的修饰或不耐受修饰。
氨基酸置换通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性,例如其疏水性、亲水性、电荷、大小等。氨基酸侧链取代基的大小、形状和/或类型的分析揭示:精氨酸、赖氨酸和/或组氨酸都是带正电荷的残基;丙氨酸、甘氨酸和/或丝氨酸都具有相似的大小;和/或苯丙氨酸、色氨酸和/或酪氨酸都具有通常相似的形状。因此,基于这些考虑,精氨酸、赖氨酸和/或组氨酸;丙氨酸、甘氨酸和/或丝氨酸;和/或苯丙氨酸、色氨酸和/或酪氨酸在本文中被定义为在生物学上有功能的等价物。
为了实行更定量的变化,可以考虑氨基酸的亲水指数。基于其疏水性和/或电荷特征,给每个氨基酸分配了亲水指数,这些是:异亮氨酸(+4.5);缬氨酸(+4.2);亮氨酸(+3.8);苯丙氨酸(+2.8);半胱氨酸/胱氨酸(+2.5);甲硫氨酸(+1.9);丙氨酸(+1.8);甘氨酸(0.4);苏氨酸(0.7);丝氨酸(0.8);色氨酸(0.9);酪氨酸(1.3);脯氨酸(1.6);组氨酸(3.2);谷氨酸(3.5);谷氨酰胺(3.5);天冬氨酸(3.5);天冬酰胺(3.5);赖氨酸(3.9);和/或精氨酸(4.5)。
本领域中通常理解亲水氨基酸指数在将相互作用生物学功能赋予蛋白质中的重要性(Kyte&Doolittle,1982,其通过提及而合并入本文)。已知某些氨基酸可以被置换为具有相似的亲水指数和/或得分的其他氨基酸,并且/或者仍然保持相似的生物学活性。在基于亲水指数做出变化中,其亲水指数在±2内的氨基酸的置换是优选的,在±1内的那些是特别优选的,和/或在±0.5内的那些是更加特别考虑的。
在本领域中还理解的是,可以在亲水性的基础上有效地进行相像的氨基酸的置换,特别是在由此创建的生物学功能等价物蛋白质和/或肽意欲用于在免疫学实施方案中使用的情况下,如在本发明的某些实施方案中。美国专利4,554,101(其通过提及而合并入本文)叙述到,蛋白质的最大局部平均亲水性(由其邻近氨基酸的亲水性所支配的)与其免疫原性和/或抗原性(即与该蛋白质的生物学特性)相关。
如在美国专利4,554,101中所详细描述的,已将下列亲水性值分配给氨基酸残基:精氨酸(+3.0);赖氨酸(+3.0);天冬氨酸(+3.0±1);谷氨酸(+3.0±1);丝氨酸(+0.3);天冬酰胺(+0.2);谷氨酰胺(+0.2);甘氨酸(0);苏氨酸(0.4);脯氨酸(-0.5±1);丙氨酸(0.5);组氨酸(0.5);半胱氨酸(1.0);甲硫氨酸(1.3);缬氨酸(1.5);亮氨酸(1.8);异亮氨酸(1.8);酪氨酸(2.3);苯丙氨酸(2.5);色氨酸(3.4)。在基于相似的亲水性值做出变化中,其亲水性值在±2内的氨基酸的置换是优选的,在±1内的那些是特别优选的,和/或在±0.5内的那些是更加特别优选的。
在许多方面,本公开内容依赖于经由合适的多核苷酸的转录和翻译在细胞内合成肽和多肽。这些肽和多肽将会包含二十种“天然”氨基酸和其翻译后修饰。然而,体外肽合成允许使用经修饰的和/或不寻常的氨基酸。示例性的而非限制性的、经修饰的和/或不寻常的氨基酸是本领域中已知的。
除了上面所讨论的生物学功能等价物外,发明人还考虑了,可以制定在结构上或在功能上相似的化合物,以模拟本发明的肽或多肽的关键部分。此类化合物(其可以称为肽模拟物)可以以与本发明的肽相同的方式进行使用,并且因此也是功能等价物。
在Johnson等人(1993)中描述了某些模拟蛋白质二级和三级结构的要素的模拟物。在使用肽模拟物背后的基本原理是,蛋白质的肽主链存在主要是为了确定氨基酸侧链的方向以便推动分子相互作用,例如抗体和/或抗原的那些。因此,设计肽模拟物以允许与天然分子相似的分子相互作用。此类肽模拟物包括这样的化合物,其不掺入任何天然氨基酸或氨基酸侧链,但是基于p63-TID肽序列进行设计并且具有在功能上替代p63-TID的能力。
II.药学制备物
本公开内容的药学组合物包含有效量的p63-TID(或者其功能性片段和/或功能性衍生物),其溶解或分散在药学上可接受的载剂中。短语“药学上或药理学上可接受的”是指当施用给动物(例如人,视情况而定)时不产生不利的、变应性的或其他不合宜的反应的分子实体和组合物。按照本公开内容,包含至少一种p63-TID(或者其功能性片段和/或功能性衍生物)的药学组合物的制备将会是本领域技术人员已知的,如由Remington:The Scienceand Practice of Pharmacy,第21版,Lippincott Williams and Wilkins,2005(其通过提及而合并入本文)所例示的。此外,对于动物(例如,人)施用,将会理解的是,制备物应当符合无菌性、致热性、一般安全性和纯度标准,如由FDA生物标准办公室(Office ofBiological Standards)所要求的。
如在本文中所使用的,“药学上可接受的载剂”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如,抗细菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、药物、药物稳定剂、凝胶、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、矫味剂、染料等及其组合,如本领域普通技术人员将会已知的(参见,例如Remington's PharmaceuticalSciences,第18版,Mack Printing Company,1990,第1289-1329页,其通过提及而合并入本文)。除非任何常规载剂与活性成分不相容,否则考虑其在药学组合物中的使用
所述p63-TID(或者其功能性片段和/或功能性衍生物)可以包含不同类型的载剂,取决于它待以固体、液体还是气溶胶形式进行施用,和对于诸如注射这样的施用途径它是否需要是无菌的。本发明可以以下列方式进行施用:心肌内、心内膜、心外膜和/或冠状动脉内,通过直接的导管或冠状动脉内注射,静脉内,真皮内,经皮,鞘内,动脉内,腹膜内,鼻内,阴道内,直肠内,表面,肌内,皮下,粘膜,口服,表面,局部,吸入(例如,气溶胶吸入),注射,输注,连续输注,直接浸浴靶细胞的局部灌注,经由导管,经由灌洗,以霜剂,以液体组合物(例如,脂质体),或通过其他方法,或者前述各项的任何组合,如本领域普通技术人员将会已知的(参见,例如Remington'sPharmaceutical Sciences,第18版,Mack PrintingCompany,1990,其通过提及而合并入本文)。
可以将所述p63-TID(或者其功能性片段和/或功能性衍生物)以游离碱、中性或盐形式配制到组合物中。药学上可接受的盐包括酸加成盐,例如与蛋白质性质的组合物的游离氨基基团形成的那些,或者与无机酸(例如,盐酸或磷酸)或有机酸(例如,乙酸、草酸、酒石酸或扁桃酸)形成的那些。与游离羧基基团形成的盐也可以源自无机碱例如钠、钾、铵、钙或铁氢氧化物;或者有机碱例如异丙胺、三甲胺、组氨酸或普鲁卡因。在配制后,溶液将会以与剂量制剂相容的方式和以在治疗上有效的量进行施用。所述制剂以各种各样的剂型容易地进行施用,例如被配制成用于胃肠外施用,例如可注射溶液,或者用于递送至肺的气溶胶,或者被配制成用于消化道施用,例如药物释放胶囊,等等。
进一步根据本公开内容,适合于施用的本公开内容的组合物在药学上可接受的载剂中提供,具有或没有惰性稀释剂。所述载剂应当是可同化的,并且包括液体、半固体(即糊剂)或固体载剂。除非任何常规介质、试剂、稀释剂或载剂对于接受者或对于其中所包含的组合物的治疗有效性来说是有害的,否则其在用于在实践本发明的方法中使用的可施用组合物中的使用是合适的。载剂或稀释剂的例子包括脂肪、油、水、盐水溶液、脂质、脂质体、树脂、粘合剂、填充剂等,或者其组合。所述组合物也可以包含各种抗氧化剂以延缓一种或多种组分的氧化。另外,微生物的作用的防止可以通过防腐剂来导致,防腐剂例如为各种抗细菌剂和抗真菌剂,包括但不限于对羟基苯甲酸酯类(例如,羟苯甲酯、羟苯丙酯)、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞或其组合。
根据本公开内容,将所述组合物与所述载剂以任何方便和实际的方式相组合,即通过溶解、悬浮、乳化、混合、包囊、吸收等。此类操作程序对于本领域技术人员来说是常规的。
在本公开内容的一个特别的实施方案中,将所述组合物与半固体或固体载剂充分地组合或混合。所述混合可以以任何方便的方式例如研磨来进行。也可以在混合过程中添加稳定剂以便保护所述组合物免于治疗活性的丧失,即在胃中变性。用于在组合物中使用的稳定剂的例子包括缓冲液,氨基酸例如甘氨酸和赖氨酸,碳水化合物例如葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、山梨醇、甘露醇等。
在进一步的实施方案中,本公开内容可以涉及使用药学脂质载料组合物,其包含p63-TID(或者其功能性片段和/或功能性衍生物)、一种或多种脂质和水性溶剂。如在本文中所使用的,术语“脂质”将会被定义为包括宽范围的特征性地在水中不溶并且用有机溶剂可萃取的物质中的任一种。该广泛类别的化合物是本领域技术人员众所周知的,并且如在本文中使用术语“脂质”那样,它不限于任何特定结构。例子包括包含长链脂肪族烃及其衍生物的化合物。脂质可以是天然出现的或合成的(即,由人设计或产生的)。然而,脂质通常是生物物质。生物脂质是本领域中众所周知的,并且包括例如中性脂肪、磷脂、磷酸甘油酯、类固醇、萜类、溶血脂质、鞘糖脂、糖脂、硫苷脂、具有醚和酯连接的脂肪酸的脂质和可聚合脂质,以及其组合。当然,被本领域技术人员理解为脂质的除了在本文中特别描述的那些以外的其他化合物也由本发明的组合物和方法所涵盖。
本领域普通技术人员将会熟悉可以用于将组合物分散在液体载料中的一系列技术。例如,可以通过本领域普通技术人员已知的任何手段来将所述p63-TID(或者其功能性片段和/或功能性衍生物)分散在包含脂质的溶液中,用脂质溶解,用脂质乳化,与脂质相混合,与脂质相组合,共价键合至脂质,作为悬浮液包含在脂质中,用胶束或脂质体包含或复合,或者与脂质或脂质结构相缔合。所述分散可以或可以不导致脂质体的形成。
施用给动物患者的本公开内容的组合物的实际用量数量可以由身体和生理学因素(例如,体重、状况的严重度、正被治疗的疾病的类型、先前或同时的治疗干预、患者的特发病和施用途径)来决定。取决于施用的用量和途径,优选用量和/或有效量的施用次数可以根据受试者的应答而变化。无论如何,负责施用的医师将会确定在组合物中活性成分的浓度和用于个体受试者的合适剂量。
在某些实施方案中,药学组合物可以包含例如至少大约0.1%的活性化合物。在另一些实施方案中,所述活性化合物可以占所述单位的重量的大约2%至大约75%,或例如大约25%至大约60%,和其中可导出的任何范围。自然,可以这样来制备在每个在治疗上有用的组合物中的活性化合物的量,从而将会在所述化合物的任何给定的单位剂量中获得合适的用量。制备这样的药学制剂的本领域技术人员将会考虑诸如溶解度、生物利用率、生物半寿期、施用途径、产品架存期以及其他药理学考量的因素,并且因此各种各样的用量和治疗制度可以是合乎需要的。
在另一些非限制性例子中,剂量也可以为每次施用大约1μg/kg体重、大约5μg/kg体重、大约10μg/kg体重、大约50μg/kg体重、大约100μg/kg体重、大约200μg/kg体重、大约350μg/kg体重、大约500μg/kg体重、大约1mg/kg体重、大约5mg/kg体重、大约10mg/kg体重、大约50mg/kg体重、大约100mg/kg体重、大约200mg/kg体重、大约350mg/kg体重、大约500mg/kg体重至大约1000mg/kg体重或更多,和其中可导出的任何范围。从在本文中所列出的数字可导出的范围的非限制性例子中,基于上面所描述的数字,可以施用大约5mg/kg体重至大约100mg/kg体重、大约5μg/kg体重至大约500mg/kg体重等的范围。
A.消化道组合物和制剂
在本公开内容的实施方案中,将所述p63-TID(或者其功能性片段和/或功能性衍生物)配制成经由消化道途径进行施用。消化道途径包括所有可能的其中所述组合物与消化道直接接触的施用途径。特别地,可以将在本文中所公开的药学组合物直接施用至心脏,虽然在备选的实施方案中,以口服方式、以颊方式、以直肠方式或以舌下方式递送所述组合物。因此,可以用惰性稀释剂或用可同化的食用载剂配制这些组合物,或者可以将它们包封在硬或软壳明胶胶囊中,或者可以将它们压制为片剂,或者可以将它们直接与膳食食物相掺合。
在某些实施方案中,所述活性化合物可以与赋形剂相掺合,并且以可摄食片剂、口含片剂、糖锭剂、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆、糯米纸囊剂等的形式进行使用(Mathiowitz等人,1997;Hwang等人,1998;美国专利号5,641,515、5,580,579和5,792,451,其各自通过提及而以其整体特别地合并入本文)。所述片剂、糖锭剂、丸剂、胶囊等还可以包含下列成分:粘合剂,例如黄蓍胶、阿拉伯胶、玉米淀粉、明胶或其组合;赋形剂,例如磷酸二钙、甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁或其组合;崩解剂,例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、藻酸或其组合;润滑剂,例如硬脂酸镁;甜味剂,例如蔗糖、乳糖、糖精或其组合;矫味剂,例如欧薄荷、冬青油、樱桃调味料、橙调味料,等等。当剂量单位形式为胶囊时,除了上述类型的材料外,它还可以包含液体载剂。各种其他材料可以作为包衣或者为了修改剂量单位的物理形式而存在。例如,片剂、丸剂或胶囊可以用虫胶、糖或两者进行包覆。当所述剂型为胶囊时,除了上述类型的材料外,它还可以包含载剂例如液体载剂。明胶胶囊、片剂或丸剂可以包覆有肠溶包衣。肠溶包衣防止所述组合物在胃或上部肠道(在那里pH是酸性的)中变性。参见例如,美国专利号5,629,001。在到达小肠后,那里的碱性pH溶解包衣,并且允许所述组合物被释放并且被特化细胞(例如,上皮肠细胞和淋巴集结M细胞)吸收。酏剂的糖浆可以包含所述活性化合物、蔗糖(作为甜味剂)、羟苯甲酯和羟苯丙酯(作为防腐剂)、染料和调味料(例如,樱桃或橙调味料)。当然,在制备任何剂量单位形式中所使用的任何材料应当是在药学上纯的并且在所使用的量下是实质上无毒的。另外,可以将所述活性化合物掺入到持续释放制备物和制剂中。
对于口服施用,可以备选地将本公开内容的组合物以漱口剂、牙粉、口含片剂、口腔喷雾剂或舌下口服施用制剂的形式与一种或多种赋形剂相掺合。例如,漱口剂可以通过以所需的量将活性成分掺入到合适的溶剂例如硼酸钠溶液(多贝尔溶液)中来制备。备选地,可以将活性成分掺入到口服溶液(例如,包含硼酸钠、甘油和碳酸氢钾的口服溶液)中,或者分散在牙粉中,或者以治疗有效量添加至组合物,所述组合物可以包含水、粘合剂、磨料、矫味剂、起泡剂和湿润剂。备选地,可以将所述组合物制成可以放置在舌头下或者在口腔中溶解的片剂或溶液形式。
另外的适合于其他消化道施用方式的制剂包括栓剂。栓剂是具有各种重量和形状的固体剂型,通常含药物,用于插入直肠。在插入后,栓剂在腔液中软化、融化或溶解。通常,对于栓剂,传统的载剂可以包括例如聚亚烷基二醇、甘油三酯或其组合。在某些实施方案中,栓剂可以从例如以大约0.5%至大约10%,和优选地大约1%至大约2%的范围包含活性成分的混合物形成。
B.胃肠外组合物和制剂
在进一步的实施方案中,可以经由胃肠外途径施用p63-TID(或者其功能性片段和/或功能性衍生物)。如在本文中所使用的,术语“胃肠外”包括绕过消化道的途径。特别地,在本文中所公开的药学组合物可以通过例如但不限于下列的方式进行施用:心肌内、心内膜、心外膜和/或冠状动脉内,通过直接的导管或冠状动脉内注射,静脉内、真皮内、肌内、动脉内、鞘内、皮下或腹膜内。美国专利号6,7537,514、6,613,308、5,466,468、5,543,158、5,641,515和5,399,363(其各自通过提及而以其整体特别地合并入本文)。
作为游离碱或药理学上可接受的盐的活性化合物的溶液可以在与表面活性剂(例如,羟丙基纤维素)适当地混合的水中进行制备。也可以在甘油、液体聚乙二醇及其混合物中和在油中制备分散体。在平常的储存和使用条件下,这些制备物包含防腐剂以防止微生物的生长。适合于可注射用途的药学形式包括无菌水性溶液或分散体,和用于即时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末(美国专利5,466,468,其通过提及而以其整体特别地合并入本文)。在所有情况下,所述形式必须是无菌的,并且必须是流动的以致于可容易地注射。它必须是在制造和储存条件下稳定的,并且必须针对微生物(例如,细菌和真菌)的污染作用进行防护。所述载剂可以为溶剂或分散介质,其包含例如水、乙醇、多元醇(即甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等),其合适的混合物,和/或植物油。适当的流动性可以例如通过使用包衣(例如,卵磷脂),通过保持所需的颗粒大小(在分散体的情况下),和通过使用表面活性剂来维持。防止微生物的作用可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如,对羟基苯甲酸酯类、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等)来导致。在许多情况下,优选的将会是包括等渗剂,例如糖或氯化钠。可注射组合物的延长的吸收可以通过在所述组合物中使用延迟吸收的试剂(例如,单硬脂酸铝和明胶)来导致。
对于在例如水性溶液中的胃肠外施用,所述溶液如果需要应当进行适当缓冲,并且首先用足够的盐水或葡萄糖来使液体稀释剂成为是等渗的。这些特别的水性溶液尤其适合于静脉内、肌内、皮下和腹膜内施用。在这方面,按照本公开内容,可以采用的无菌水性介质将会是本领域技术人员已知的。例如,可以将一个用量溶解在等渗NaCl溶液中,并且添加皮下输液流体或者注射在所建议的输注部位处(参见例如,"Remington's PharmaceuticalSciences",第15版,第1035-1038和1570-1580页)。取决于正在治疗的受试者的状况,用量方面的一些变化将会必然发生。无论如何,负责施用的人员将会决定用于个体受试者的合适剂量。此外,对于人施用,制备物应当符合无菌性、致热性、一般安全性和纯度标准,如由FDA生物标准办公室所要求的。
无菌可注射溶液通过下述方式来制备:将活性化合物以所需要的量掺入到具有各种上面所列举的其他成分(如果需要)的合适溶剂中,随后进行过滤灭菌。通常,分散体通过下述方式来制备:将各种经灭菌的活性成分掺入到包含基础分散介质和所需要的来自上面所列举的那些的其他成分的无菌载料中。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下,优选的制备方法为真空干燥和冷冻干燥技术,这些技术从其事先经无菌过滤的溶液产生活性成分加上任何另外的所希望的成分的粉末。将粉末状的组合物与液体载剂(例如,水或盐水溶液)相组合,具有或没有稳定剂。
C.其他药学组合物和制剂
在本公开内容的另一些特别的实施方案中,可以将所述活性化合物p63-TID(或者其功能性片段和/或功能性衍生物)配制成用于经由各种其他途径的施用,例如表面(即,经皮)施用、粘膜施用(鼻内、阴道等)和/或吸入。
用于表面施用的药学组合物可以包括被配制用于含药物应用的活性化合物,例如软膏、糊剂、霜剂或粉剂。软膏包括所有用于表面应用的油质、吸附、乳状液和水溶性基质组合物,而霜剂和洗剂为仅包含乳状液基质的那些组合物。表面施用的药剂可以包含渗透增强剂以推动活性成分通过皮肤的吸附。合适的渗透增强剂包括甘油、醇类、烷基二甲亚砜、吡咯烷酮和月桂氮酮。关于用于表面应用的组合物的可能基质包括聚乙二醇、羊毛脂、冷霜和矿脂,以及任何其他合适的吸收、乳状液或水溶性软膏基质。表面制备物还可以包含乳化剂、胶凝剂和抗微生物防腐剂,如果需要保存活性成分并且提供均质混合物。本发明的经皮施用还可以包括使用“贴剂”。例如,所述贴剂可以在固定的时间段内以预先确定的速率和以连续方式提供一种或多种活性物质。
在某些实施方案中,所述药学组合物可以通过滴眼剂、鼻内喷雾剂、吸入和/或其他气溶胶递送载料来递送。用于经由鼻气溶胶喷雾剂将组合物直接递送至肺的方法已描述在例如美国专利号5,756,353和5,804,212(其各自通过提及而以其整体特别地合并入本文)中。同样,通过使用鼻内微颗粒树脂(Takenaga等人,1998)和溶血磷脂酰甘油化合物(美国专利号5,725,871,其通过提及而以其整体特别地合并入本文)来递送药物在制药领域中也是众所周知的。同样,以聚四氟乙烯支持基体的形式的经粘膜药物递送描述在美国专利号5,780,045(其通过提及而以其整体特别地合并入本文)中。
术语“气溶胶”是指分散在液化或加压气体推进剂中的细分固体或液体颗粒的胶体系统。用于吸入的本发明的典型气溶胶将会由在液体推进剂或液体推进剂和合适溶剂的混合物中的活性成分的悬浮液组成。合适的推进剂包括烃类和烃醚。合适的容器将会根据推进剂的压力要求而变化。气溶胶的施用将会根据受试者的年龄、体重以及症状的严重度和应答而变化。
III.治疗方法的实施方案
本公开内容的实施方案涉及与一种或多种心脏相关医学状况的治疗和/或预防有关的方法和/或组合物。本公开内容的实施方案涉及组织(包括肌肉组织,例如心肌组织)的再生,通过不是心肌细胞的在心脏中的现有细胞的重编程。某些实施方案涉及心脏医学状况的逆转(或至少一种其症状的改善),至少包括例如心脏疾病、心肌病、心脏毒性、充血性心力衰竭、缺血性心脏病、心肌梗死、冠状动脉疾病、肺原性心脏病、炎性心脏病、炎性心脏肥大、心肌炎、先天性心脏病、风湿性心脏病、心脏收缩功能障碍、心脏舒张功能障碍、绞痛、扩张型心肌病、特发性心肌病或其他导致心脏纤维化的状况。
在本公开内容的特别方面,心肌病是待治疗的心脏医学状况。所述心脏医学状况(包括例如心肌病)可以由各种各样的特征中的一种或多种引起,包括例如长期高血压;心瓣膜问题;心脏组织损伤(例如来自一次或多次先前的心脏病发作,或者慢性或急性和/或复发发作,或者缺血性心脏病的后遗症);慢性快速心率;代谢病症,例如甲状腺疾病或糖尿病;必需维生素或矿物质(例如,硫胺素(维生素B-1)、硒、钙和/或镁)的营养缺乏;妊娠;酒精滥用;药物滥用,包括麻醉品或处方药物,例如可卡因或抗抑郁药剂,例如三环类抗抑郁药;一些用于治疗癌症的化学疗法药物(包括阿霉素)的使用;某些病毒感染;血色素沉着病;和/或未知的原因或未被检出的原因,即特发性心肌病。
在一些情况下,本公开内容的方法和组合物用于治疗或预防一种或多种心脏医学状况,或者延迟一种或多种心脏医学状况的开始,或者减轻一种或多种心脏医学状况的一个或多个症状的程度。在特别的情况下,一个或多个症状的此类防止、开始延迟或程度减轻在处于心脏医学状况的风险中的个体中发生。示例性的风险因素包括下列中的一个或多个:年龄、性别(男性,虽然在女性中发生)、高血压、高血清胆固醇水平、吸烟、过量酒精消耗、糖消耗、家族或个人史、肥胖、缺乏体力活动、精神社会因素、糖尿病、超重、遗传易感性和/或暴露于空气污染。
本公开内容的特别方面涉及向心脏组织递送至少一种多核苷酸或多肽以使在所述组织中的某些细胞转分化。在特别的实施方案中,核酸为活性试剂,而在一些实施方案中,从所述核酸产生的多肽为活性试剂。所述组织可以是任何种类的,但是在特别的情况下,它是心脏肌肉和/或瘢痕组织。在特别的实施方案中,本公开内容的方法和组合物允许成人驻留心脏祖细胞分化和/或经非心肌细胞分化的细胞(例如,成纤维细胞)转分化为心脏肌肉细胞。
本公开内容的实施方案包括递送一种或多种多核苷酸(其在本文中也可以称为核酸)或从其产生的多肽,其刺激细胞(例如,肌细胞,包括心肌细胞)和/或组织(包括心脏组织)的转分化或直接重编程。关于此类实施方案的特别方面导致一种或多种心脏医学状况的逆转。关于此类实施方案的某些方面导致心脏医学状况的至少一个症状的改善。在示例性的实施方案中,所述心脏医学状况为心力衰竭。所述心力衰竭可以是一个或多个原因的结果,包括冠状动脉疾病和心脏病发作、高血压、心瓣膜故障、心肌病(例如由疾病、感染、酒精滥用和药物(例如,可卡因或用于化学疗法的一些药物)的毒性效应引起的)、特发性心肌病和/或遗传因素。
在某些实施方案中,将一种或多种多核苷酸包含在病毒载体中。在某些实施方案中,以至少或正好10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149或150或者其中可导出的任何范围的感染复数提供病毒载体。在某些实施方案中,以20、50或100的感染复数提供病毒载体。在某些实施方案中,以50的感染复数提供病毒载体。
本公开内容的实施方案的特别但示例性的适应症至少包括应用于下列方面:1)心力衰竭,包括充血性心力衰竭;2)心室重塑的阻止;和/或3)心肌病。其他适应症也可以包括冠状动脉疾病、缺血性心脏病、心脏瓣膜疾病等。在特别的实施方案中,本公开内容的方法和组合物提供了心肌细胞再生,其足以逆转已建立的心肌病、充血性心力衰竭和心室重塑的阻止。
在所述个体具有心肌病的情况下,所述心肌病可以是缺血性或非缺血性心肌病。所述心肌病可以由下述原因引起:长期高血压、心瓣膜问题、来自先前的心脏病发作的心脏组织损伤、慢性快速心率、代谢病症、营养缺乏、妊娠、酒精滥用、药物滥用、化学疗法药物、病毒感染、血色素沉着病、遗传状况、升高的胆固醇水平或其组合。心肌病也可以具有未鉴定的原因,即特发性心肌病。
在某些实施方案中,存在有在个体中在所希望的位置处使细胞再生的方法,其包括向所述位置递送有效量的至少一种p63-TID(或者其功能性片段和/或功能性衍生物)分子的步骤。在一些情况下,所述方法包括例如p63-TID与HDAC的机械相互作用。在特别的实施方案中,所述分子以核酸形式进行递送,虽然在特别的实施方案中,本公开内容的p63-TID(或者其功能性片段和/或功能性衍生物)的组合物中的一种或多种为多肽。在特别的实施方案中,所述组合物的递送位置在心脏区域。递送步骤例如可以包括:直接注射到心脏中,包括直接注射到受损组织的区域中;静脉内灌注;冠状动脉内心肌灌注;通过导管的动脉内器官灌注;或冠状窦灌注导管。
本公开内容的实施方案例如包括用于使心脏肌肉再生和逆转心肌缺血性损伤的方法和/或组合物。在特别的实施方案中,例如存在有用于在已经具有心脏医学状况(例如,急性或慢性缺血性损伤)的个体中在哺乳动物心脏中将心脏瘢痕细胞(成纤维细胞)重编程为成人心脏肌肉细胞的方法。在某些实施方案中,此类方法用这样的组合物来取得,所述组合物至少包含p63-TID(或者其功能性片段和/或功能性衍生物),和在一些情况下,一种或多种心脏细胞重编程因子,例如Hand2和/或心肌素。
虽然在特别的实施方案中,以体内或原位方式治疗个体,但是在备选的实施方案中,以离体方式用由本公开内容所涵盖的组合物治疗所述个体。在这样的实施方案中,从所述个体获得或者从另一个个体获得待经历本公开内容的核酸组合物的细胞。使这样的细胞在体外经历所述核酸组合物,从而它们被所述细胞吸收,然后将所述细胞递送至待治疗的个体。
在特别的方面,向个体提供额外的心脏医学状况疗法。
IV.心脏细胞重编程因子和染色质去稳定剂的实施方案
本公开内容的某些实施方案涉及核酸,和一些实施方案涉及多肽或肽。在某些方面,核酸包括p63-TID(或者其功能性片段和/或功能性衍生物)。在特别的实施方案中,以两者中任一种形式的p63-TID(或者其功能性片段和/或功能性衍生物)可以或可以不与一种或多种心脏细胞重编程因子一起进行使用,或者可以或可以不与一种或多种染色质去稳定剂一起进行使用。
A.心脏细胞重编程因子
在特别的实施方案中,在本公开内容的方法中采用一种或多种心脏细胞重编程因子,并且所述因子可以或可以不在与p63-TID(或者其功能性片段和/或功能性衍生物)相同的时间处提供。在特别的实施方案中,所述因子在所述个体已接受p63-TID(或者其功能性片段和/或功能性衍生物)后提供,虽然在一些情况下,它们在所述试剂之前或在与所述试剂相同的时间处提供。
所述心脏细胞重编程因子可以或可以不是转录因子。虽然可以使用标准方法来测试某种化合物是否作为心脏细胞重编程因子将会是有效的,但是在特别的实施方案中,所述因子为Hand2、心肌素、Gata4、Mef2c、Tbx5、中胚层后部蛋白1(Mesp1)、miR-133、miR-1、Oct4、Klf4、c-myc、Sox2、Brachyury、Nkx2.5、ETS2、ESRRG、Mrtf-A、MyoD、ZFPM2或其组合。可以通过下述方式来测试一种化合物是否作为心脏细胞重编程因子起作用:将它施用给成纤维细胞(例如,使用慢病毒)并且关于cTnT施行FACS,如在本文中别处举例说明的。所述因子可以作为核酸、多肽、该因子的特定结构域的肽或其组合来进行使用。在特别的实施方案中,使用Hand2和/或心肌素,包括核酸。在特别的方面,至少对于Hand2和/或心肌素,所述核酸编码或包含经转录的核酸。在另一些方面,Hand2和/或心肌素核酸分别包含Hand2和/或心肌素的核酸区段,或者其在生物学上有功能的等价物。在特别的方面,Hand2和/或心肌素核酸编码蛋白质、多肽或肽。一个示例性的人Hand2核酸在美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)的数据库中(登录号NM_021973),其通过提及而以其整体合并入本文。一个示例性的人心肌素在登录号AY764180中,其通过提及而以其整体合并入本文。
在特别的实施方案中,使用所述心脏细胞重编程因子核酸或多肽的功能性片段,以代替整个因子核酸或多肽。Hand2或心肌素(作为例子)的功能性片段为这样的功能性片段,即在暴露于所述片段后,其足以允许细胞的重编程,单独地用p63-TID(或者其功能性片段和/或功能性衍生物)或者与Hand2或心肌素和p63-TID(或者其功能性片段和/或功能性衍生物)相联合地。在特别的实施方案中,Hand2核酸的功能性片段编码Hand2多肽的至少200、180、175、160、150、140、125、110、100、90、80、75、70、60、55、50、40、30、25或19个氨基酸。在特别的实施方案中,心肌素核酸的功能性片段编码心肌素多肽的至少900、800、700、600、500、400、300、200、100或50个氨基酸。在一些实施方案中,在相同的核酸构建体和/或载体上编码Hand2多肽和心肌素多肽。在一些实施方案中,Hand2多肽和心肌素多肽通过2A元件分隔开。在某些实施方案中,Hand2多肽和心肌素多肽通过P2A元件分隔开。在某些实施方案中,一个示例性的Hand2多核苷酸序列为和/或被包含在SEQ ID NO:3中。在某些实施方案中,一个示例性的心肌素多核苷酸序列为和/或被包含在SEQ ID NO:4中。
ATGTCTCTCGTGGGCGGATTTCCTCACCACCCTGTGGTGCACCATGAGGGCTATCCTTTTGCTGCCGCTGCCGCAGCCGCCGCTGCTGCTGCAGCTAGTAGATGTAGCCACGAGGAAAACCCCTACTTCCACGGCTGGCTGATCGGCCACCCTGAGATGAGCCCTCCAGATTACAGCATGGCCCTGAGCTACAGCCCTGAGTATGCTTCTGGAGCCGCTGGACTGGATCACTCTCATTATGGCGGAGTGCCTCCAGGCGCTGGACCTCCTGGACTGGGAGGACCTAGACCTGTGAAGAGAAGAGGCACCGCCAACCGGAAAGAGCGGAGAAGAACCCAGAGCATCAATAGCGCCTTCGCCGAGCTGAGAGAATGCATCCCTAATGTGCCCGCCGACACCAAGCTGAGCAAGATCAAAACCCTGCGGCTGGCCACCAGCTATATCGCCTATCTGATGGACCTGCTGGCCAAGGACGATCAGAATGGCGAGGCCGAGGCCTTCAAGGCCGAGATCAAGAAAACCGACGTGAAAGAGGAAAAGCGCAAGAAAGAGCTGAACGAGATCCTGAAGTCCACCGTGTCCAGCAACGACAAAAAGACCAAGGGCAGAACCGGCTGGCCTCAGCATGTGTGGGCTCTGGAACTGAAACAGGGCAGCGGC(SEQ ID NO:3)
ATGACCCTGCTGGGCAGCGAGCACAGCCTGCTGATCAGATCCAAGTTCAGAAGCGTGCTGCAGCTGAGACTGCAGCAGAGAAGAACACAGGAACAGCTGGCCAACCAGGGCATCATCCCCCCACTGAAAAGACCTGCCGAGTTCCACGAGCAGAGAAAGCACCTGGACAGCGACAAGGCCAAGAACAGCCTGAAGCGGAAGGCCCGGAATAGATGCAATAGCGCCGACCTGGTGAACATGCACATCCTGCAGGCTTCCACCGCCGAGAGATCTATCCCTACAGCCCAGATGAAGCTGAAGAGAGCCAGACTGGCCGACGACCTGAATGAGAAGATTGCCCTGAGGCCTGGCCCCCTGGAACTGGTGGAAAAGAACATCCTGCCTGTGGACAGCGCCGTGAAAGAGGCCATCAAGGGCAATCAGGTGTCCTTCAGCAAGAGCACCGACGCCTTCGCCTTCGAGGAAGATTCTAGCTCTGACGGCCTGTCTCCTGATCAGACCAGATCTGAAGATCCTCAGAATAGCGCCGGCAGCCCTCCTGATGCCAAAGCCTCTGATACACCTTCTACCGGCAGCCTGGGCACCAATCAGGATCTGGCCTCTGGCAGCGAGAACGACAGAAATGATAGCGCCAGCCAGCCTAGCCACCAGTCTGATGCTGGAAAACAGGGCCTGGGCCCTCCTTCTACACCTATTGCTGTGCACGCCGCCGTGAAGTCTAAGAGCCTGGGCGACAGCAAGAACCGGCACAAGAAGCCTAAGGACCCCAAGCCCAAAGTGAAGAAGCTGAAGTACCACCAGTACATCCCCCCCGACCAGAAGGCCGAAAAGTCCCCTCCTCCTATGGATTCCGCCTACGCTAGACTGCTGCAACAGCAGCAGCTGTTCCTGCAGCTCCAGATCCTGTCTCAACAACAGCAACAGCAGCAGCACCGGTTCAGCTATCTGGGAATGCACCAGGCCCAGCTGAAAGAACCCAATGAGCAGATGGTCCGCAACCCCAATAGCAGCTCCACCCCTCTGAGCAATACCCCCCTGAGCCCTGTGAAGAATAGCTTTTCTGGCCAGACCGGCGTGTCCAGCTTTAAGCCTGGACCTCTGCCCCCCAACCTGGACGATCTGAAAGTGTCTGAACTGCGGCAGCAGCTGAGAATCAGAGGACTGCCTGTGTCTGGCACCAAGACCGCCCTGATGGATAGACTGAGGCCCTTTCAGGACTGCAGCGGCAACCCTGTGCCCAACTTTGGCGATATCACCACCGTGACCTTCCCCGTGACACCCAACACCCTGCCTAATTACCAGAGCAGCAGCTCTACCAGCGCCCTGAGCAATGGCTTCTACCACTTTGGCAGCACAAGCAGCAGCCCTCCAATCAGCCCTGCCTCTTCTGATCTGTCTGTGGCCGGAAGCCTGCCCGACACCTTTAATGATGCCAGCCCTAGCTTTGGCCTGCACCCTTCTCCAGTGCACGTGTGCACAGAGGAATCCCTGATGTCTAGCCTGAATGGCGGCTCTGTGCCTTCTGAGCTGGATGGCCTGGATTCCGAGAAGGACAAGATGCTGGTGGAAAAACAGAAAGTGATCAACGAGCTGACCTGGAAGCTGCAGCAGGAACAGAGACAGGTGGAAGAACTGCGGATGCAGCTGCAGAAGCAGAAGCGGAACAACTGCTCCGAGAAGAAGCCTCTGCCATTCCTGGCCGCCAGCATTAAGCAGGAAGAGGCCGTGTCAAGCTGCCCATTCGCCAGTCAGGTGCCAGTGAAGAGACAGAGCAGCTCCTCTGAATGTCACCCTCCTGCTTGTGAAGCTGCCCAGCTGCAGCCTCTGGGAAATGCCCATTGTGTGGAAAGCAGCGACCAGACCAATGTGCTGAGCAGCACCTTCCTGAGCCCTCAGTGTTCTCCTCAGCATTCTCCCCTGGGCGCTGTGAAGTCTCCACAGCACATTTCTCTGCCCCCTAGCCCCAACAACCCTCACTTTCTGCCATCTAGTTCTGGCGCCCAGGGCGAGGGACATAGAGTGTCTAGTCCTATCAGCAGCCAGGTCTGCACCGCTCAGAACTCTGGCGCTCATGATGGCCACCCTCCAAGCTTTAGCCCTCACTCTTCTAGCCTGCACCCACCTTTTAGCGGAGCCCAGGCTGATTCTTCTCATGGCGCTGGCGGCAATCCTTGCCCTAAGTCTCCTTGCGTGCAGCAGAAAATGGCCGGCCTGCACAGCTCTGACAAAGTGGGCCCTAAGTTCAGCATCCCCAGCCCCACCTTTAGCAAGTCTAGCAGCGCCATCAGCGAAGTGACCCAGCCTCCATCTTACGAGGATGCCGTGAAGCAGCAGATGACCAGATCCCAGCAGATGGACGAGCTGCTGGATGTGCTGATCGAGTCTGGCGAAATGCCTGCCGATGCCAGAGAGGATCACAGCTGTCTGCAGAAGGTGCCCAAGATCCCCAGAAGCTCCAGATCTCCTACCGCCGTGCTGACAAAGCCTAGCGCCTCTTTTGAGCAGGCCAGCAGCGGCAGCCAGATCCCTTTTGATCCTTACGCCACCGACAGCGACGAGCACCTGGAAGTGCTGCTGAATAGCCAGAGCCCTCTGGGCAAGATGAGCGACGTGACACTGCTGAAGATCGGCAGCGAGGAACCCCACTTCGATGGCATCATGGATGGCTTTTCTGGAAAGGCCGCCGAGGACCTGTTCAACGCCCACGAAATTCTGCCTGGCCCTCTGAGCCCTATGCAGACCCAGTTTAGCCCTAGCAGCGTGGACTCTAATGGCCTGCAGCTGTCCTTTACCGAGAGCCCCTGGGAGACAATGGAATGGCTGGACCTGACCCCCCCTAATAGCACACCTGGATTTTCTGCCCTGACCACCAGCAGCCCCTCTATCTTCAATATCGACTTCCTGGACGTGACCGACCTGAACCTGAACAGCAGCATGGACCTGCATCTGCAGCAGTGGTGA(SEQ ID NO:4)
在特别的实施方案中,在本公开内容的方法中使用SEQ ID NO:3和/或4的部分或全部。在特别的实施方案中,在本公开内容的方法中使用相关于SEQ ID NO:3和/或4而言具有特定的序列同一性的多核苷酸。在特别的情况下,使用SEQ ID NO:3和/或4的功能性片段,并且在本文中所使用的术语“功能性片段”是指编码具有能够将成纤维细胞转变为内皮细胞或内皮样细胞的活性的多肽的多核苷酸。在特别的情况下,所述片段具有SEQ ID NO:3和/或4的至少大约或不超过大约2900、2800、2700、2600、2500、2400、2300、2200、2100、2000、1900、1800、1700、1600、1500、1400、1375、1350、1325、1300、1275、1250、1225、1200、1175、1150、1125、1100、1075、1050、1025、1000、975、950、925、900、875、850、825、800、775、750、725、700、675、650、625、600、575、550、525、500、475、450、425、400、375、350、325、300、275、250、225、200、175、150、125或100个连续核苷酸的长度。另外,所述片段可以与在SEQID NO:3和/或4中的相应区域具有至少或正好100、99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、88、87、86、85、80、75或70%的序列同一性。可以使用与SEQ ID NO:3和/或4具有一定的序列同一性的多核苷酸,包括与SEQ ID NO:3和/或4的至少或正好100、99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、88、87、86、85、80、75或70%同一性。
在一些实施方案中,将Hand2和/或心肌素多肽递送至有此需要的个体,无论它以在载体上、与载剂相联合、在细胞内(包括在细胞中在载体上)等的形式。在特别的实施方案中,所述Hand2和/或心肌素多肽为哺乳动物Hand2和/或心肌素多肽,包括人的、小鼠的、大鼠的等。在特别的实施方案中,Hand2多肽序列的一个例子为和/或被包含在SEQ ID NO:5中。在特别的实施方案中,心肌素多肽序列的一个例子为和/或被包含在SEQ ID NO:6中。
MSLVGGFPHHPVVHHEGYPFAAAAAAAAAAAASRCSHEENPYFHGWLIGHPEMSPPDYSMALSYSPEYASGAAGLDHSHYGGVPPGAGPPGLGGPRPVKRRGTANRKERRRTQSINSAFAELRECIPNVPADTKLSKIKTLRLATSYIAYLMDLLAKDDQNGEAEAFKAEIKKTDVKEEKRKKELNEILKSTVSSNDKKTKGRTGWPQHVWALELKQGSG(SEQ ID NO:5)
MTLLGSEHSLLIRSKFRSVLQLRLQQRRTQEQLANQGIIPPLKRPAEFHEQRKHLDSDKAKNSLKRKARNRCNSADLVNMHILQASTAERSIPTAQMKLKRARLADDLNEKIALRPGPLELVEKNILPVDSAVKEAIKGNQVSFSKSTDAFAFEEDSSSDGLSPDQTRSEDPQNSAGSPPDAKASDTPSTGSLGTNQDLASGSENDRNDSASQPSHQSDAGKQGLGPPSTPIAVHAAVKSKSLGDSKNRHKKPKDPKPKVKKLKYHQYIPPDQKAEKSPPPMDSAYARLLQQQQLFLQLQILSQQQQQQQHRFSYLGMHQAQLKEPNEQMVRNPNSSSTPLSNTPLSPVKNSFSGQTGVSSFKPGPLPPNLDDLKVSELRQQLRIRGLPVSGTKTALMDRLRPFQDCSGNPVPNFGDITTVTFPVTPNTLPNYQSSSSTSALSNGFYHFGSTSSSPPISPASSDLSVAGSLPDTFNDASPSFGLHPSPVHVCTEESLMSSLNGGSVPSELDGLDSEKDKMLVEKQKVINELTWKLQQEQRQVEELRMQLQKQKRNNCSEKKPLPFLAASIKQEEAVSSCPFASQVPVKRQSSSSECHPPACEAAQLQPLGNAHCVESSDQTNVLSSTFLSPQCSPQHSPLGAVKSPQHISLPPSPNNPHFLPSSSGAQGEGHRVSSPISSQVCTAQNSGAHDGHPPSFSPHSSSLHPPFSGAQADSSHGAGGNPCPKSPCVQQKMAGLHSSDKVGPKFSIPSPTFSKSSSAISEVTQPPSYEDAVKQQMTRSQQMDELLDVLIESGEMPADAREDHSCLQKVPKIPRSSRSPTAVLTKPSASFEQASSGSQIPFDPYATDSDEHLEVLLNSQSPLGKMSDVTLLKIGSEEPHFDGIMDGFSGKAAEDLFNAHEILPGPLSPMQTQFSPSSVDSNGLQLSFTESPWETMEWLDLTPPNSTPGFSALTTSSPSIFNIDFLDVTDLNLNSSMDLHLQQW(SEQ ID NO:6)
在特别的实施方案中,在本公开内容的方法中使用SEQ ID NO:5和/或6的部分或全部。在特别的实施方案中,在本公开内容的方法中使用相关于SEQ ID NO:5和/或6而言具有特定的序列同一性的多肽。在特别的情况下,使用SEQ ID NO:5和/或6的功能性片段,并且在本文中所使用的术语“功能性片段”是指具有能够将成纤维细胞转变为内皮细胞或内皮样细胞的活性的多肽。在特别的情况下,所述片段具有SEQ ID NO:5和/或6的至少大约或不超过大约975、950、925、900、875、850、825、800、775、750、725、700、675、650、625、600、575、550、525、500、475、450、425、400、375、350、325、300、275、250、240、235、230、225、220、215、210、205、200、195、190、185、180、175、170、165、160、155、150、145、140、135、130、125、120、115、110、105、100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25或20个连续氨基酸的长度。
B.染色质去稳定剂
在特别的实施方案中,与p63-TID(或者其功能性片段和/或功能性衍生物)一起使用一种或多种染色质去稳定剂。可以在与所述p63-TID(或者其功能性片段和/或功能性衍生物)相同的时间处向个体提供所述一种或多种染色质去稳定剂,虽然在特别的实施方案中,在p63-TID(或者其功能性片段和/或功能性衍生物)之后或之前使用所述一种或多种染色质去稳定剂。
虽然可以使用标准方法来测试某种化合物是否作为染色质去稳定剂将会是有效的,但是在特别的实施方案中,所述染色质去稳定剂为Oct4、DZNep、Sall4、SOX2、KLF4、MYC、SB431542、PD0325901、Parnate、CHIR99021、A-83-01、NaB、PS48、弗司扣林(FSK)、2-甲基-5-羟色胺(2-Me-5HT)、D4476、VPA、CHIR99021(CHIR)、616452、反苯环丙胺、前列腺素E2、咯利普兰、3-脱氮腺苷环戊基类似物A(3-deazaneplanocin A)(DZNep)、5-氮胞苷、丁酸钠、RG108或其组合。
V.核酸概述
术语“核酸”是本领域众所周知的。在本文中所使用的“核酸”通常将会是指DNA、RNA或者其衍生物或类似物的分子(即链),其包含核碱基。核碱基包括例如,在DNA(例如,腺嘌呤“A”、鸟嘌呤“G”、胸腺嘧啶“T”或胞嘧啶“C”)或RNA(例如,A、G、尿嘧啶“U”或C)中发现的天然出现的嘌呤或嘧啶碱基。术语“核酸”涵盖术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”,其各自作为术语“核酸”的亚类。术语“寡核苷酸”是指长度为大约3至大约100个核碱基的分子。在至少一些情况下,术语“多核苷酸”是指至少一个长度大于大约100个核碱基的分子。
这些定义通常是指单链分子,但是在特别的实施方案中将会也涵盖与所述单链分子部分地、实质上或完全地互补的另一条链。因此,核酸可以涵盖双链分子或三链分子,其包含具有包含分子的特定序列的一条或多条互补链或“互补物”。如在本文中所使用的,单链核酸可以用前缀“ss”来指示,双链核酸可以用前缀“ds”来指示,和三链分子可以用前缀“ts”来指示。
如在本文中所使用的,“野生型”是指在生物的基因组中在遗传基因座处天然出现的核酸序列,或者从这样的核酸转录或翻译出的序列。因此,术语“野生型”也可以是指由核酸所编码的氨基酸序列。由于遗传基因座可以在个体群体中具有多于一个序列或等位基因,因此术语“野生型”涵盖所有这样的天然出现的等位基因。如在本文中所使用的,术语“多态的”意味着,在群体的个体中在遗传基因座处存在变化(即,存在两个或更多个等位基因)。如在本文中所使用的,“突变体”是指在核酸或者其所编码的蛋白质、多肽或肽的序列中的变化,其是人工的结果。
本公开内容还涉及通过应用本领域技术人员已知的或在本文中所描述的重组核酸技术来分离或产生重组构建体或重组宿主细胞。重组构建体或宿主细胞可以包含核酸,并且可以表达蛋白质、多肽或肽,或者至少一种其在生物学上有功能的等价物。
在本文中,在某些实施方案中,“基因”是指被转录的核酸。在某些方面,所述基因包括在转录或者信使产生或组成中所牵涉的调控序列。在特别的实施方案中,所述基因包含编码蛋白质、多肽或肽的经转录的序列。如本领域技术人员将会理解的,该功能术语“基因”包括该两个基因组序列、RNA或cDNA序列,或者更小的经改造的核酸区段,包括基因的非转录部分的核酸区段,包括但不限于基因的非转录启动子或增强子区。更小的经改造的基因核酸区段可以表达,或者可以通过使用核酸操纵技术而适应于表达蛋白质、多肽、结构域、肽、融合蛋白、突变体等等。
“与其他编码序列实质上分离的”意味着,目的基因或其片段形成所述核酸的编码区的重大部分,或者所述核酸不包含天然出现的编码核酸的大的部分,例如大的染色体片段、其他功能基因、RNA或cDNA编码区。当然,这是指最初分离的核酸,并且不排除后来通过人工向所述核酸添加的基因或编码区。
无论序列本身的长度为何,可以将本公开内容的核酸与其他核酸序列(包括但不限于启动子、增强子、多腺苷酸化信号、限制酶位点、多克隆位点、编码区段等)相组合,以产生一种或多种核酸构建体。如在本文中所使用的,“核酸构建体”为通过人工改造或改变的核酸,并且通常包含通过人工进行组织的一个或多个核酸序列。
在一个非限制性例子中,可以制备一种或多种核酸构建体,其包含与p63相同或互补(至少部分地)的连续核苷酸链段。核酸构建体可以具有大约3、大约5、大约8、大约10至大约14、或大约15、大约20、大约30、大约40、大约50、大约100、大约115、大约200、大约500、大约600或大约650个核苷酸的长度,以及为具有更大尺寸的构建体,直至并且包括载体尺寸(包括所有中间长度和中间范围)。将会容易理解的是,如在本文中所使用的,“中间长度”和“中间范围”意指包括或在所引述的值之间的任何长度或范围(即,包括和在这样的值之间的所有整数)。中间长度的非限制性例子包括大约11、大约12、大约13、大约16、大约17、大约18、大约19等;大约21、大约22、大约23等;大约31、大约32等;大约51、大约52、大约53等;大约101、大约102、大约103等;大约151、大约152、大约153等;大约600、大约601、大约605、大约610等。中间范围的非限制性例子包括大约3至大约32、大约150至大约750等。
在某些实施方案中,所述核酸构建体为重组载体。在特别的实施方案中,本公开内容涉及一种或多种重组载体,其包含编码Hand2或心肌素蛋白质、多肽或肽的核酸序列。在特别的方面,所述重组载体为DNA载体。
术语“在生物学上有功能的等价物”是本领域中充分理解的,并且在本文中进一步作了详细定义。因此,具有70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的与分别由Hand2和心肌素核酸所编码的氨基酸相同或在功能上等价的氨基酸的序列,条件是保持了所述蛋白质、多肽或肽的生物学活性。
在某些其他实施方案中,本公开内容涉及至少一种这样的重组载体,其在其序列内包括表达p63-TID(或者其功能性片段和/或功能性衍生物)的核酸序列。在特别的实施方案中,本公开内容涉及至少一种这样的重组载体,其在其序列内包括表达Hand2核酸的核酸序列。在另一个实施方案中,存在有至少一种这样的重组载体,其在其序列内包括表达心肌素核酸的核酸序列。
在本文中使用术语“在功能上等价的密码子”来指编码相同氨基酸的密码子,例如对于精氨酸和丝氨酸的六个密码子,并且还指编码在生物学上等价的氨基酸的密码子。关于各种生物和细胞器的密码子使用可以在文献中找到。因此,考虑了,可以对于其他动物,以及其他生物例如原核生物(例如真细菌、古细菌)、真核生物(例如原生生物、植物、真菌、动物)、病毒等,以及包含核酸的细胞器例如线粒体、叶绿体等,优化密码子使用,基于本领域普通技术人员将会已知的优选密码子使用。
还将会理解,氨基酸序列或核酸序列可以包含额外的残基,例如额外的N-或C-末端氨基酸或者5'或3'序列,或者其各种组合,并且仍然是基本上如在本文中所公开的序列之一中所阐述的,只要所述序列满足上面所陈述的标准,包括在涉及蛋白质性质的组合物的表达的情况下保持蛋白质、多肽或肽的生物学活性。末端序列的添加特别适用于核酸序列,其可以例如包括各种在编码区的5'和/或3'部分中任一的侧翼的非编码序列,或者可以包括各种内部序列,即内含子,其已知出现在基因内。
除了内含子和侧翼区域外,并且允许遗传密码的简并性,在本公开内容中涵盖具有大约70%至大约79%;或更优选地,大约80%至大约89%;或更加特别地,大约90%至大约99%的与在本文中所公开的经注释的序列的核苷酸相同的核苷酸的核酸序列。
因此,重组载体和分离的核酸区段可以不同地包含Hand2或心肌素编码区本身,在基础编码区中携带所选择的改变或修饰的编码区,并且它们可以编码更大的多肽或肽(其仍然包含这样的编码区)或者可以编码具有变体氨基酸序列的在生物学上有功能的等价蛋白质、多肽或肽。
本公开内容的核酸可以涵盖关于Hand2或心肌素蛋白质、多肽或肽的在生物学上有功能的等价编码序列。此类序列可以作为已知在核酸序列或者如此编码的蛋白质、多肽或肽内天然出现的密码子冗余或功能等价的结果而产生。备选地,在功能上等价的蛋白质、多肽或肽可以经由应用重组DNA技术来产生,其中可以基于对于正进行交换的氨基酸的特性的考量来改造在蛋白质、多肽或肽结构中的变化。可以引入由人设计的变化,例如通过应用在本文中下面所讨论的位点定向诱变技术,例如以引入对于蛋白质、多肽或肽的抗原性的改善或改变,或者测试突变体以便在分子水平上检查蛋白质、多肽或肽活性。
A.核碱基
如在本文中所使用的,“核碱基”是指杂环碱基,例如在至少一种天然出现的核酸(例如,DNA和RNA)中发现的天然出现的核碱基(即A、T、G、C或U),和这样的核碱基的天然或非天然出现的衍生物和类似物。核碱基通常可以以下述方式与至少一个天然出现的核碱基形成一个或多个氢键(“退火”或“杂交”):即可以替换天然出现的核碱基配对(例如,在A和T之间,在G和C之间,和在A和U之间的氢键合)。
“嘌呤”和/或“嘧啶”核碱基涵盖天然出现的嘌呤和/或嘧啶核碱基和还有其衍生物和类似物,包括但不限于被烷基、羧烷基、氨基、羟基、卤素(即氟、氯、溴或碘)、硫羟基或烷基硫羟基部分中的一种或多种取代的那些嘌呤或嘧啶。优选的烷基(例如,烷基、羧烷基等)部分由大约1、大约2、大约3、大约4、大约5至大约6个碳原子组成。嘌呤或嘧啶的其他非限制性例子包括脱氮嘌呤、2、6-二氨基嘌呤、5-氟尿嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、8-溴鸟嘌呤、8-氯鸟嘌呤、溴胸腺嘧啶、8-氨基鸟嘌呤、8-羟基鸟嘌呤、8-甲基鸟嘌呤、8-硫鸟嘌呤、氮鸟嘌呤、2-氨基嘌呤、5-乙基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-乙基尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-丙基尿嘧啶、硫尿嘧啶、2-甲基腺嘌呤,甲基硫腺嘌呤、N,N-二甲基腺嘌呤、氮腺嘌呤、8-溴腺嘌呤、8-羟基腺嘌呤、6-羟基氨基嘌呤、6-硫嘌呤、4-(6-氨基己基/胞嘧啶)等。
可以通过使用在本文中所描述的或者本领域普通技术人员已知的任何化学或天然合成方法来将核碱基包含在核苷或核苷酸中。
B.核苷
如在本文中所使用的,“核苷”是指包含共价附接至核碱基连接体部分的核碱基的独个化学单元。“核碱基连接体部分”的非限制性例子为包含5个碳原子的糖(即,“5-碳糖”),包括但不限于脱氧核糖、核糖、阿拉伯糖或者5-碳糖的衍生物或类似物。5-碳糖的衍生物或类似物的非限制性例子包括2'-氟-2'-脱氧核糖,或者其中在糖环中碳原子被替换为氧原子的碳环糖。
不同类型的核碱基与核碱基连接体部分的共价附接是本领域中已知的。作为非限制性例子,包含嘌呤(即,A或G)或7-脱氮嘌呤核碱基的核苷典型地将嘌呤或7-脱氮嘌呤的9-位共价附接至5-碳糖的1'-位。在另一个非限制性例子中,包含嘧啶核碱基(即,C、T或U)的核苷典型地将嘧啶的1-位共价附接至5-碳糖的1'-位(Kornberg和Baker,1992)。
C.核苷酸
如在本文中所使用的,“核苷酸”是指进一步包含“主链部分”的核苷。主链部分通常将核苷酸共价附接至另一个包含核苷酸的分子,或者共价附接至另一个核苷酸以形成核酸。在天然出现的核苷酸中的“主链部分”典型地包含磷部分,其被共价附接至5-碳糖。主链部分的附接典型地发生在5-碳糖的3'-或5'-位处。然而,其他类型的附接是本领域中已知的,特别地当核苷酸包含天然出现的5-碳糖或磷部分的衍生物或类似物时。
D.核酸类似物
核酸可以包含可以在天然出现的核酸中存在的核碱基、核碱基连接体部分和/或主链部分的衍生物或类似物或者完全由其组成。如在本文中所使用的,“衍生物”是指天然出现的分子的经化学修饰或改变的形式,而术语“模拟物”或“类似物”是指可以或可以不在结构上类似于天然出现的分子或部分但是具有相似功能的分子。如在本文中所使用的,“部分(moiety)”通常是指较大的化学或分子结构的较小的化学或分子组分。核碱基、核苷和核苷酸类似物或类似物是本领域中众所周知的,并且已作了描述(参见例如,Scheit,1980,其通过提及而合并入本文中)。
包含5-碳糖和/或主链部分衍生物或类似物的核苷、核苷酸或核酸的另外的非限制性例子包括在下述文献中的那些:美国专利号5,681,947,其描述了包含嘌呤衍生物的寡核苷酸,其与dsDNA形成三股螺旋和/或阻止dsDNA的表达;美国专利5,652,099和5,763,167,其描述了掺入了发荧光的在DNA或RNA中发现的核苷的类似物的核酸,其特别地用于用作荧光核酸探针;美国专利5,614,617,其描述了在嘧啶环上具有取代的寡核苷酸类似物,其拥有增强的核酸酶稳定性;美国专利5,670,663、5,872,232和5,859,221,其描述了在核酸检测中使用的具有经修饰的5-碳糖(即,经修饰的2'-脱氧呋喃糖基部分)的寡核苷酸类似物;美国专利5,446,137,其描述了可以在杂交测定法中使用的包含至少一个用除了氢以外的其他取代基在4'位进行取代的5-碳糖部分的寡核苷酸;美国专利5,886,165,其描述了具有有着3'-5'核苷酸间连接的脱氧核糖核苷酸和有着2'-5'核苷酸间连接的核糖核苷酸两者的寡核苷酸;美国专利5,714,606,其描述了经修饰的核苷酸间连接,其中所述核苷酸间连接的3'-位氧被碳替代以增强核酸的核酸酶抗性;美国专利5,672,697,其描述了包含一个或多个增强核酸酶抗性的5'-亚甲基膦酸酯核苷酸间连接的寡核苷酸;美国专利5,466,786和5,792,847,其描述了将可以包含药物或标记物的取代基部分连接至寡核苷酸的2'碳,以提供增强的核酸酶稳定性和递送药物或检测部分的能力;美国专利5,223,618,其描述了具有2或3个碳主链连接的寡核苷酸类似物,所述碳主链连接附接邻近的5-碳糖部分的4'位和3'位以增强细胞摄取、对核酸酶的抗性和与靶RNA的杂交;美国专利5,470,967,其描述了包含至少一个氨基磺酸酯或磺酰胺核苷酸间连接的寡核苷酸,其作为核酸杂交探针是有用的;美国专利5,378,825、5,777,092、5,623,070、5,610,289和5,602,240,其描述了具有三或四个替代磷酸二酯主链部分的原子连接体部分的寡核苷酸,其用于经改善的核酸酶抗性、细胞摄取和调控RNA表达;美国专利5,858,988,其描述了附接至寡核苷酸的2'-O位的疏水承载试剂,用于增强其膜渗透性和稳定性;美国专利5,214,136,其描述了在5'末端处缀合至蒽醌的寡核苷酸,其拥有增强的与DNA或RNA的杂交、增强的对于核酸酶的稳定性;美国专利5,700,922,其描述了PNA-DNA-PNA嵌合体,其中所述DNA包含2'-脱氧-赤-戊呋喃糖基核苷酸,用于增强的核酸酶抗性、结合亲和力和激活RNA酶H的能力;和美国专利5,708,154,其描述了连接至DNA的RNA,以形成DNA-RNA杂合体。
E.聚醚和肽核酸
在某些实施方案中,考虑了可以在本公开内容的方法和组合物中使用包含核苷或核苷酸的衍生物或类似物的核酸。一个非限制性例子为在美国专利系列号5,908,845(其通过提及而合并入本文)中所描述的“聚醚核酸”。在聚醚核酸中,一个或多个核碱基被连接至在聚醚主链中的手性碳原子。
另一个非限制性例子为在美国专利系列号5,786,461、5,891,625、5,773,571、5,766,855、5,736,336、5,719,262、5,714,331、5,539,082和WO 92/20702(其各自通过提及而合并入本文)中所描述的“肽核酸”,也称为“PNA”、“基于肽的核酸类似物”或“PENAM”。相比于诸如DNA和RNA的分子而言,肽核酸通常具有增强的序列特异性、结合特性和对于酶促降解的抗性(参见例如,Egholm等人,1993;PCT/EP/01219)。肽核酸通常包含一个或多个这样的核苷酸或核苷,其包含核碱基部分,不是5-碳糖的核碱基连接体部分,和/或不是磷酸酯主链部分的主链部分。对于PNA所描述的核碱基连接体部分的例子包括氮杂氮原子、酰氨基和/或脲基系链(参见例如,美国专利号5,539,082)。对于PNA所描述的主链部分的例子包括氨乙基甘氨酸、聚酰胺、聚乙基、聚硫酰胺、聚亚磺酰胺或聚磺酰胺主链部分。
在某些实施方案中,核酸类似物例如肽核酸可以用于抑制核酸扩增,例如在PCR中,以减少假阳性并且区分单碱基突变体,如在美国专利序列号5,891,625中所描述的。核酸类似物的其他修饰和用途是本领域中已知的,并且涵盖在本文中。在一个非限制性例子中,美国专利5,786,461描述了这样的PNA,其具有附接至PNA主链的氨基酸侧链以增强分子的溶解度。在另一个例子中,通过附接亲脂基团来增加PNA的细胞摄取特性。美国申请系列号117,363描述了几个用于增强PNA的细胞摄取的烷基氨基部分。另一个例子描述在美国专利号5,766,855、5,719,262、5,714,331和5,736,336中,其描述了包含天然和非天然出现的核碱基和烷基胺侧链的PNA,这提供了相对于天然出现的核酸而言在序列特异性、溶解度和/或结合亲和力方面的改善。
F.核酸的制备
核酸可以通过本领域普通技术人员已知的任何技术来制备,例如化学合成、酶促产生或生物学产生。合成的核酸(例如,合成的寡核苷酸)的非限制性例子包括通过体外化学合成制备的核酸,通过使用磷酸三酯、亚磷酸酯或亚磷酰胺化学和固相技术(例如,在EP266,032(其通过提及而合并入本文)中所描述的),或者经由由Froehler等人,1986和美国专利系列号5,705,629(其各自通过提及而合并入本文)所描述的脱氧核苷H-膦酸酯中间物。在本公开内容的方法中,可以使用一种或多种寡核苷酸。寡核苷酸合成的各种不同机制已经公开在例如美国专利4,659,774、4,816,571、5,141,813、5,264,566、4,959,463、5,428,148、5,554,744、5,574,146、5,602,244中,其各自通过提及而合并入本文。
酶促产生的核酸的一个非限制性例子包括在扩增反应例如PCRTM(参见例如,美国专利4,683,202和美国专利4,682,195,其各自通过提及而合并入本文)中或者在美国专利号5,645,897(其通过提及而合并入本文)中所描述的寡核苷酸的合成中通过酶而产生的核酸。以生物学方式产生的核酸的一个非限制性例子包括在活细胞中产生(即,复制)的重组核酸,例如在细菌中复制的重组DNA载体(参见例如,Sambrook等人,1989,其通过提及而合并入本文)。
G.核酸的纯化
核酸可以在聚丙烯酰胺凝胶上、在氯化铯离心梯度上或通过本领域普通技术人员已知的任何其他手段来进行纯化(参见例如,Sambrook等人,1989,其通过提及而合并入本文)。
在某些方面,本公开内容涉及核酸,其是分离的核酸。如在本文中所使用的,术语“分离的核酸”是指这样的核酸分子(例如,RNA或DNA分子),其已被分离而不含或者以其他方式而不含一个或多个细胞的总基因组的和经转录的核酸的大部分。在某些实施方案中,“分离的核酸”是指这样的核酸,其已被分离而不含或者以其他方式而不含细胞组分或体外反应组分(例如,大分子例如脂质或蛋白质;小生物分子等)的大部分。
H.核酸区段
在某些实施方案中,所述核酸为核酸区段。如在本文中所使用的,术语“核酸区段”为核酸的较小片段,例如作为非限制性例子,仅编码肽或多肽序列的一部分的那些。因此,“核酸区段”可以包含基因序列的任何部分,其具有大约2个核苷酸至肽或多肽编码区的全长。
各种核酸区段可以基于特定的核酸序列来进行设计,并且可以具有任何长度。通过向序列分配数值,例如,第一个残基为1,第二个残基为2,等等,可以产生定义所有核酸区段的算法:
n至n+y
其中n为1至所述序列的最后一个数目的整数并且y为所述核酸区段的长度减一,其中n+y不超过所述序列的最后一个数目。因此,对于10-聚体,所述核酸区段相应于碱基1至10,2至11,3至12,...,等等。对于15-聚体,所述核酸区段相应于碱基1至15,2至16,3至17,...,等等。对于20-聚体,所述核酸区段相应于碱基1至20,2至21,3至22,...,等等。在某些实施方案中,所述核酸区段可以为探针或引物。如在本文中所使用的,“探针”通常是指在检测方法或组合物中使用的核酸。如在本文中所使用的,“引物”通常是指在延伸或扩增方法或组合物中使用的核酸。
VI.基于核酸的表达系统
在本公开内容的特别实施方案中,向有此需要的个体以核酸形式提供p63-TID(或者其功能性片段和/或功能性衍生物)(例如,多肽或核酸),在一些情况下一种或多种心脏细胞重编程因子(例如,Hand2和/或心肌素),和在有些情况下一种或多种去稳定剂和/或抗纤维化试剂和/或血管生成因子。虽然在一些情况下,所述核酸不被包含在载体上,但是在特别的实施方案中,所述核酸存在于一种或多种载体上。在特别的实施方案中,不同的核酸存在于相同的载体上,而在另一些情况下,它们存在于两种或三种分开的载体上。所述载体在性质上可以是病毒的或非病毒的。图4A-B提供了用于在本公开内容的方法中使用的载体的实施方案的图解说明。
在本公开内容的实施方案中所使用的载体可以具有一种或多种用于向心脏组织的靶向递送和/或在某些细胞中的靶向表达的手段。在一些情况下,通过局部递送至心脏来向所述个体提供所述载体,而在其他情况下,通过用于向心脏组织的靶向递送和/或在某些细胞(例如,心脏成纤维细胞)中的靶向表达的手段来全身性地向所述个体提供所述载体。在某些实施方案中,所述p63-TID(或者其功能性片段和/或功能性衍生物)以及心脏细胞重编程因子(例如,Hand2和心肌素)之一或两者的多核苷酸在相同的分子上,虽然在一些实施方案中,所述p63-TID(或者其功能性片段和/或功能性衍生物)以及心脏细胞重编程因子(例如,Hand2和心肌素)之一或两者的多核苷酸在不同的分子上。当所述p63-TID(或者其功能性片段和/或功能性衍生物)以及心脏细胞重编程因子之一或两者从相同的多核苷酸中表达时,它们可以具有相同或不同的用于其表达的调控区。在特别的实施方案中,所述p63-TID(或者其功能性片段和/或功能性衍生物)和一种或多种染色质去稳定剂的多核苷酸在相同或不同的分子上。
在特别的实施方案中,用于在本公开内容中使用的表达载体可以包含一个或多个合适的限制酶消化序列、起始密码子、终止密码子、核定位信号、蛋白酶切割密码子、可选择标记、复制起点、调控区、多克隆位点及其组合。这样的部分可以以任何合适的次序安置在所述表达载体中。
A.载体
术语“载体”用于指这样的承载核酸分子,向其中可以插入核酸序列,用于引入到其中它可以进行复制的细胞。核酸序列可以是“外源的”,这意味着它对于向其中正引入所述载体的细胞来说是外来的,或者所述序列对于在所述细胞中的序列是同源的但是在其中通常找不到所述序列的在宿主细胞核酸内的位置处。载体包括质粒、粘粒、病毒(噬菌体、动物病毒和植物病毒)和人工染色体(例如,YAC)。本领域技术人员将会进行充分训练以通过标准重组技术来构建载体(参见例如,Maniatis等人,1988和Ausubel等人,1994,两者都通过提及而合并入本文)。
术语“表达载体”是指这样的任何类型的遗传构建体,其包含能够被转录的编码RNA的核酸。在一些情况下,RNA分子然后被翻译为蛋白质、多肽或肽。在另一些情况下,这些序列不被翻译,例如在反义分子或核酶的产生中。表达载体可以包含各种各样的“控制序列”,其是指对于在特定宿主细胞中转录和可能地翻译可操作地连接的编码序列所必需的核酸序列。除了支配转录和翻译的控制序列外,载体和表达载体可以包含还发挥其他功能并且在下文中进行描述的核酸序列。
1.启动子和增强子
“启动子”是在那里转录的起始和速率受到控制的核酸序列的区域。它可以包含这样的遗传元件,在那里调控蛋白质和分子可以结合例如RNA聚合酶和其他转录因子以起始核酸序列的特异性转录。短语“可操作地安置”、“可操作地连接”、“在...的控制之下”和“在...的转录控制之下”意味着,启动子相对于核酸序列而言处于正确的功能位置和/或方向,以控制那个序列的转录起始和/或表达。
在本公开内容的实施方案中,可以使用CMV启动子或组织特异性启动子。所述组织特异性启动子可以为心脏组织特异性启动子。心脏组织特异性启动子的例子包括但不限于,心室特异性肌球蛋白轻链-2(mlc-2v);和/或α-肌球蛋白重链(α-MHC)。在特别的实施方案中,使用成纤维细胞特异性启动子。成纤维细胞特异性启动子的例子包括但不限于Fsp1和/或骨膜蛋白(periostin)。
启动子通常包含发挥功能以安置关于RNA合成的起始位点的序列。这最为人所知的例子为TATA盒,但是在一些缺乏TATA盒的启动子中,例如对于哺乳动物末端脱氧核苷酸转移酶基因的启动子和对于SV40晚期基因的启动子,重叠在起始位点本身上的离散元件帮助固定起始的地点。另外的启动子元件调控转录起始的频率。典型地,这些位于起始位点上游30-110bp的区域中,虽然许多启动子已显示出也包含在起始位点下游的功能元件。为了使编码序列“在启动子的控制之下”,将转录阅读框的转录起始位点的5′末端安置在所选择的启动子的“下游”(即3′)。“上游”启动子刺激DNA的转录并且促进所编码的RNA的表达。
启动子元件之间的间隔经常是柔韧的,从而当元件相互倒置或移动时,启动子功能得以保留。在tk启动子中,在活性开始下降之前,启动子元件之间的间隔可以增加至相隔50bp。取决于启动子,看起来独个元件可以协作地或独立地发挥功能以激活转录。启动子可以或可以不与“增强子”相联合地进行使用,后者是指在核酸序列的转录激活中所牵涉的顺式作用调控序列。
启动子可以是与核酸序列天然地相关联的启动子,如可以通过分离位于编码区段和/或外显子上游的5′非编码序列而获得的。这样的启动子可以被称为是“内源的”。类似地,增强子可以是与核酸序列天然地相关联的增强子,位于那个序列的下游或上游。备选地,通过将编码核酸区段安置在重组或异源启动子的控制之下将会获得某些优点,所述重组或异源启动子是指在其天然环境中正常不与核酸序列相关联的启动子。重组或异源增强子也是指在其天然环境中正常不与核酸序列相关联的增强子。这样的启动子或增强子可以包括其他基因的启动子或增强子,和从任何其他病毒或者原核或真核细胞中分离的启动子或增强子,和不是“天然出现的”启动子或增强子,即其包含不同转录调控区的不同元件,和/或改变表达的突变。例如,在重组DNA构建中最常使用的启动子包括β-内酰胺酶(青霉素酶)、乳糖和色氨酸(trp)启动子系统。除了以合成方式产生启动子和增强子的核酸序列外,还可以通过使用重组克隆和/或核酸扩增技术,包括PCRTM,并结合在本文中所公开的组合物来产生序列(参见美国专利号4,683,202和5,928,906,其各自通过提及而合并入本文)。进一步地,考虑了也可以采用指导在非核细胞器(例如,线粒体、叶绿体等)内的序列的转录和/或表达的控制序列。
自然,将会重要的是,采用有效指导在为表达而选择的细胞器、细胞类型、组织、器官或生物体中的DNA区段的表达的启动子和/或增强子。分子生物学领域中的技术人员通常知晓使用启动子、增强子和细胞类型组合用于蛋白质表达(参见例如,Sambrook等人,1989,其通过提及而合并入本文)。所采用的启动子可以是组成性的、组织特异性的、可诱导的和/或在合适条件下有用的,以指导所引入的DNA区段的高水平表达,例如在重组蛋白质和/或肽的大规模产生中是有利的。所述启动子可以是异源的或内源的。
另外,任何启动子/增强子组合(按照例如真核启动子数据库(EukaryoticPromoter Data Base)EPDB,http://www.epd.isb-sib.ch/)也可以用于驱动表达。T3、T7或SP6细胞质表达系统的使用是另一个可能的实施方案。真核细胞可以支持从某些细菌启动子的细胞质转录,如果提供合适的细菌聚合酶,作为递送复合物的一部分或作为额外的基因表达构建体。
2.起始信号和内部核糖体结合位点
对于编码序列的有效翻译也可能需要特异性起始信号。这些信号包括ATG起始密码子或相邻序列。可能需要提供外源翻译控制信号,包括ATG起始密码子。本领域普通技术人员将会容易地能够确定此并且提供必需的信号。众所周知的是,起始密码子必须与所希望的编码序列的阅读框“符合读框”,以确保整个插入片段的翻译。所述外源翻译控制信号和起始密码子可以是天然的或合成的。表达效率可以通过包括合适的转录增强子元件来增强。
在本公开内容的某些实施方案中,使用内部核糖体进入位点(IRES)元件来产生多基因或多顺反子信使。IRES元件能够绕过5′甲基化帽依赖性翻译的核糖体扫描模式并且在内部位点处开始翻译(参见例如,Pelletier和Sonenberg,1988)。已描述了来自小RNA病毒科的两个成员(脊髓灰质炎和脑心肌炎)的IRES元件(Pelletier和Sonenberg,1988),以及来自哺乳动物信使的IRES(参见例如,Macejak和Sarnow,1991)。可以将IRES元件连接至异源开放阅读框。多个开放阅读框可以一起进行翻译,各自通过IRES来分隔开,从而产生多顺反子信使。借助于IRES元件,每个开放阅读框对于核糖体是可接近的以用于有效翻译。可以通过使用单个启动子/增强子以转录单个信使来有效地表达多个基因(参见美国专利号5,925,565和5,935,819,其各自通过提及而合并入本文)。
3.多克隆位点
载体可以包含多克隆位点(MCS),其是包含多个限制酶位点的核酸区域,所述限制酶位点中的任一个可以与标准重组技术相联合地用于消化所述载体(参见例如,Carbonelli等人,1999;Levenson等人,1998;和Cocea,1997,其通过提及而合并入本文)。“限制酶消化”是指用仅在核酸分子中的特定位置处发挥功能的酶来进行的核酸分子的催化切割。这些限制酶中的许多是商购可得的。此类酶的使用是本领域技术人员广泛理解的。经常,通过使用在MCS内进行切割的限制酶来使载体线性化或片段化,以使得外源序列能够连接至所述载体。“连接”是指在两个核酸片段(其可以或可以不是相互连续的)之间形成磷酸二酯键的过程。牵涉限制酶和连接反应的技术是重组技术领域的技术人员众所周知的。
4.剪接位点
大多数经转录的真核RNA分子将会经历RNA剪接以从初级转录物中去除内含子。包含基因组真核序列的载体可能需要供者和/或接纳体剪接位点,以确保转录物的正确加工以用于蛋白质表达(参见例如,Chandler等人,1997,其通过提及而合并入本文)。
5.终止信号
本公开内容的载体或构建体通常将会包含至少一个终止信号。“终止信号”或“终止子”由在通过RNA聚合酶的RNA转录物的特异性终止中所牵涉的DNA序列组成。因此,在某些实施方案中,考虑了结束RNA转录物的产生的终止信号。在体内可能需要终止子以取得所希望的信使水平。
在真核系统中,所述终止子区也可以包含特殊DNA序列,其允许新转录物的位点特异性切割,以便暴露多腺苷酸化位点。这发信号引导专门的内源聚合酶去将大约200个A残基的链段(polyA)添加至转录物的3’末端。用该polyA尾进行修饰的RNA分子看起来更稳定并且被更有效地翻译。因此,在牵涉真核生物的其他实施方案中,优选的是那个终止子包含用于RNA的切割的信号,和更优选的是所述终止子信号促进信使的多腺苷酸化。所述终止子和/或多腺苷酸化位点元件可以用于增强信使水平,并且使从所述盒进入其他序列的连读最小化。
被考虑用于在本公开内容中使用的终止子包括在本文中所描述的或者本领域普通技术人员已知的任何已知的转录终止子,包括但不限于例如,基因的终止序列,例如牛生长激素终止子,或病毒终止序列,例如SV40终止子。在某些实施方案中,所述终止信号可以缺乏可转录的或可翻译的序列,例如由于序列截短。
6.多腺苷酸化信号
在表达(特别是真核表达)中,典型地将会包括多腺苷酸化信号以实现转录物的正确多腺苷酸化。并不认为多腺苷酸化信号的性质对于本公开内容的成功实施来说是至关重要的,并且可以使用任何这样的序列。优选的实施方案包括SV40多腺苷酸化信号或牛生长激素多腺苷酸化信号,它们是方便的并且已知在各种靶细胞中很好地发挥功能。多腺苷酸化可以增加转录物的稳定性或者可以推动细胞质转运。
7.复制起点
为了在宿主细胞中增殖载体,它可以包含一个或多个复制起点位点(常常称为“ori”),其是在那里起始复制的一个特殊的核酸序列。备选地,如果所述宿主细胞是酵母,那么可以使用自主复制序列(ARS)。
8.可选择和可筛选标记
在本公开内容的某些实施方案中,可以通过在表达载体中包括标记来在体外或在体内鉴定包含本公开内容的核酸构建体的细胞。此类标记将会赋予细胞以可鉴定的变化,从而允许容易地鉴定包含所述表达载体的细胞。通常,可选择标记为赋予允许选择的特性的标记。正可选择标记为其中所述标记的存在允许其选择的标记,而负可选择标记为其中它的存在阻止其选择的标记。正可选择标记的一个例子为药物抗性标记。
通常,药物选择标记的包括有助于转化体的克隆和鉴定,例如赋予对于新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、zeocin和组氨醇的抗性的基因是有用的可选择标记。除了赋予允许基于条件的实行来区分转化体的表型的标记外,还考虑了其他类型的标记,包括可筛选标记例如GFP,其基础是比色分析。备选地,可以使用可筛选酶,例如单纯疱疹病毒胸苷激酶(tk)或氯霉素乙酰转移酶(CAT)。本领域技术人员还将会知道如何使用免疫标记,可能与FACS分析相联合地。不认为所使用的标记是重要的,只要它能够与编码基因产物的核酸同时进行表达。可选择和可筛选标记的进一步例子是本领域技术人员众所周知的。
9.另外的特征
在一些实施方案中,本公开内容的载体和/或核酸构建体可以包含2A元件或序列。在一些实施方案中,本公开内容的载体和/或核酸构建体可以包含一个或多个克隆位点。在一些这样的实施方案中,在进行制备以用于向受试者施用之前可以不完全去除克隆位点。在一些实施方案中,克隆位点可以具有功能作用,包括作为连接体序列,或作为Kozak位点的一部分。如本领域技术人员将会意识到的,克隆位点可以在一级序列中显著变化,而同时保持其所希望的功能。
在一些实施方案中,2A元件为T2A、P2A、E2A和/或F2A元件。在一些实施方案中,2A序列可以包含任选的5’连接体序列,例如但不限于GSG(甘氨酸、丝氨酸、甘氨酸)。
SEQ ID NO:7-示例性T2A氨基酸序列
EGRGSLLTCGDVEENPGP
SEQ ID NO:8-示例性P2A氨基酸序列
ATNFSLLKQAGDVEENPGP
SEQ ID NO:9-示例性E2A氨基酸序列
QCTNYALLKLAGDVESNPGP
SEQ ID NO:10-示例性F2A氨基酸序列
VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP
SEQ ID NO:11-示例性P2A核苷酸序列
GCCACAAACTTCAGCCTGCTGAAACAGGCTGGCGACGTGGAAGAGAACCCTGGCCCTTCTAGA
B.质粒载体
在某些实施方案,质粒载体被考虑用于转化宿主细胞。通常,包含源自与宿主细胞相容的物种的复制子和控制序列的质粒载体与这些宿主相联系地进行使用。所述载体通常携带复制位点,以及能够提供在经转化的细胞中的表型选择的标记序列。在一个非限制性例子中,经常使用pBR322(一种源自大肠杆菌(E.coli)物种的质粒)的衍生物来转化大肠杆菌。pBR322包含对于氨苄青霉素和四环素抗性的基因并且因此提供了用于鉴定经转化的细胞的容易手段。所述pBR质粒或者其他微生物质粒或噬菌体还必须包含或进行修饰以包含例如可以被该微生物用于表达其自身蛋白质的启动子。
另外,可以使用包含与宿主微生物相容的复制子和控制序列的噬菌体载体作为与这些宿主相联系的转化载体。例如,可以在制备可以用于转化宿主细胞(例如,大肠杆菌LE392)的重组噬菌体载体中使用噬菌体λGEMTM-11。
为了在心脏或其他器官中核酸的长期转基因表达,可以使用基因组整合型质粒,例如piggybac或睡美人转座子基因递送质粒。
进一步的有用的质粒载体包括pIN载体(Inouye等人,1985);和pGEX载体,其用于在生成谷胱甘肽S-转移酶(GST)可溶性融合蛋白(用于后来的纯化和分离或切割)中使用。其他合适的融合蛋白为具有β-半乳糖苷酶、泛素等的那些。
使包含表达载体的细菌宿主细胞(例如大肠杆菌)在许多合适的培养基中的任一种(例如LB)中生长。如本领域技术人员将会理解的,通过使宿主细胞与特异于某些启动子的试剂相接触,例如通过向培养基添加IPTG或通过使温育转换至更高的温度,可以诱导在某些载体中的重组蛋白质的表达。在将细菌培养进一步的一段时间(通常2至24小时)后,通过离心来收集细胞并且将其进行洗涤以去除残留的培养基。
C.病毒载体
某些病毒经由由受体介导的胞吞作用感染细胞或进入细胞并且整合到宿主细胞基因组中并且稳定和有效地表达病毒基因的能力已使得它们成为用于将外来核酸转移入细胞(例如,哺乳动物细胞)中的有吸引力的候选物。下面描述了可以用于递送本公开内容的核酸的病毒载体的非限制性例子。
1.腺病毒载体
一种特别的用于递送核酸的方法牵涉使用腺病毒表达载体。虽然已知腺病毒载体具有低的整合到基因组DNA中的能力,但是该特征通过由这些载体所提供的高的基因转移效率而得到弥补。“腺病毒表达载体”意味着包括包含足以进行下述项目的腺病毒序列的那些构建体:(a)支持构建体的包装;和(b)最终表达已被克隆在其中的组织或细胞特异性构建体。关于遗传组织或腺病毒(一种36kb的线性双链DNA病毒)的知识允许用直至7kb的外来序列替换大块的腺病毒DNA(Grunhaus和Horwitz,1992)。
2.AAV载体
可以通过使用腺病毒辅助转染来将核酸引入到细胞中。通过使用腺病毒偶联系统在细胞系统中已报道了增加的转染效率(Kelleher和Vos,1994;Cotten等人,1992;Curiel,1994)。腺伴随病毒(AAV)为用于在本公开内容的实施方案中使用的有吸引力的载体系统,因为它具有高的整合频率并且它可以感染非分裂性细胞,因此使得它可用于将基因递送到哺乳动物细胞中,例如在组织培养物中(Muzyczka,1992)或在体内。AAV具有宽的对于感染性的宿主范围(Tratschin等人,1984;Laughlin等人,1986;Lebkowski等人,1988;McLaughlin等人,1988)。关于rAAV载体的生成和用途的细节描述在美国专利号5,139,941和4,797,368(其各自通过提及而合并入本文)中。在某些实施方案中,AAV载体(例如,包括rAAV载体)对于肌肉细胞和/或心肌细胞是特异的,和/或具有增加的对于肌肉细胞和/或心肌细胞的特异性,当与适当的对照载体相比较时。
3.逆转录病毒载体
逆转录病毒具有作为递送载体的前景,这是由于其在下述方面的能力:将其基因整合到宿主基因组中,转移大量的外来遗传材料,感染广泛的物种和细胞类型,和在特殊细胞系中进行包装(Miller,1992)。
为了构建逆转录病毒载体,将核酸插入到病毒基因组中以代替某些病毒序列,从而产生复制缺陷型病毒。为了产生病毒粒子,构建包含gag、pol和env基因但是没有LTR和包装组分的包装细胞系(Mann等人,1983)。当将包含cDNA的重组质粒与逆转录病毒LTR和包装序列一起引入到特殊的细胞系中(例如,通过磷酸钙沉淀)时,所述包装序列允许将所述重组质粒的RNA转录物包装进病毒颗粒中,其然后被分泌到培养基中(Nicolas和Rubenstein,1988;Temin,1986;Mann等人,1983)。然后,收集包含所述重组逆转录病毒的培养基,任选地进行浓缩,并且用于基因转移。逆转录病毒载体能够感染广泛多样的细胞类型。然而,整合和稳定表达需要宿主细胞的分裂(Paskind等人,1975)。
慢病毒是复杂的逆转录病毒,其除了共同的逆转录病毒基因gag、pol和env外,还包含具有调控或结构功能的其他基因。慢病毒载体是本领域中众所周知的(参见例如,Naldini等人,1996;Zufferey等人,1997;Blomer等人,1997;美国专利号6,013,516和5,994,136)。慢病毒的一些例子包括人免疫缺陷型病毒(HIV-1、HIV-2)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。已通过减弱HIV毒力基因而生成了慢病毒载体,例如,缺失基因env、vif、vpr、vpu和nef,从而使所述载体是在生物学上安全的。
重组慢病毒载体能够感染非分裂性细胞,并且可以用于体内和离体基因转移和核酸序列的表达。例如,在美国专利号5,994,136(其通过提及而合并入本文)中描述了能够感染非分裂性细胞的重组慢病毒,其中用两种或更多种携带包装功能(即gag、pol和env,以及rev和tat)的载体转染合适的宿主细胞。可以通过包膜蛋白与抗体或用于靶向至特定细胞类型的受体的特定配体的连接来靶向重组病毒。通过将目的序列(包括调控区)连同例如编码对于在特定靶细胞上的受体的配体的另一基因一起插入到病毒载体中,所述载体现在是靶标特异性的。
4.其他病毒载体
可以使用其他病毒载体作为在本公开内容中的疫苗构建体。可以使用源自病毒例如痘苗病毒(参见例如,Ridgeway,1988;Baichwal和Sugden,1986;Coupar等人,1988)、辛德比斯病毒、巨细胞病毒和单纯疱疹病毒的载体。它们提供了对于各种哺乳动物细胞的几个有吸引力的特征(参见例如,Friedmann,1989;Ridgeway,1988;Baichwal和Sugden,1986;Coupar等人,1988;Horwich等人,1990)。
D.使用经修饰的病毒进行的递送
可以将待递送的核酸容纳在已被改造以表达特异性结合配体的感染性病毒内。因此,病毒颗粒将会特异性地结合至靶细胞的关联受体并且将内容物递送至所述细胞。基于通过将乳糖残基化学添加至病毒包膜对逆转录病毒进行的化学修饰,开发了被设计成允许逆转录病毒载体的特异性靶向的新方法。该修饰可以允许经由唾液酸糖蛋白受体的肝细胞的特异性感染。
设计了用于重组逆转录病毒的靶向的另一种方法,其中使用针对逆转录病毒包膜蛋白和针对特定细胞受体的经生物素化的抗体。通过使用链霉抗生物素蛋白经由生物素组分将所述抗体进行偶联(参见例如,Roux等人,1989)。通过使用针对I类和II类主要组织相容性复合物抗原的抗体,他们证明了在体外用亲嗜性病毒感染了各种各样的携带那些表面抗原的人细胞(参见例如,Roux等人,1989)。
E.载体递送和细胞转化
用于与本公开内容一起进行使用的用于核酸递送以转化细胞器、细胞、组织或生物体的合适方法被认为实际上包括任何通过其可以将核酸(例如,DNA)引入到细胞器、细胞、组织或生物体中的方法,如在本文中所描述的或者本领域普通技术人员将会已知的。这样的方法包括但不限于,DNA的直接递送,例如通过离体转染(参见例如,Wilson等人,1989;Nabel等人,1989)、通过注射(参见例如,美国专利号5,994,624、5,981,274、5,945,100、5,780,448、5,736,524、5,702,932、5,656,610、5,589,466和5,580,859,其各自通过提及而合并入本文),包括微量注射(参见例如,Harlan和Weintraub,1985;美国专利号5,789,215,其通过提及而合并入本文);通过电穿孔(参见例如,美国专利号5,384,253,其通过提及而合并入本文;Tur-Kaspa等人,1986;Potter等人,1984);通过磷酸钙沉淀(参见例如,Graham和Van Der Eb,1973;Chen和Okayama,1987;Rippe等人,1990);通过使用DEAE-葡聚糖和随后的聚乙二醇(参见例如,Gopal,1985);通过直接超声加载(参见例如,Fechheimer等人,1987);通过由脂质体介导的转染(参见例如,Nicolau和Sene,1982;Fraley等人,1979;Nicolau等人,1987;Wong等人,1980;Kaneda等人,1989;Kato等人,1991)和由受体介导的转染(参见例如,Wu和Wu,1987;Wu和Wu,1988);通过微粒轰击(参见例如,PCT申请号WO 94/09699和95/06128;美国专利号5,610,042、5,322,783、5,563,055、5,550,318、5,538,877和5,538,880,其各自通过提及而合并入本文);通过与碳化硅纤维一起进行搅拌(参见例如,Kaeppler等人,1990;美国专利号5,302,523和5,464,765,其各自通过提及而合并入本文);通过由土壤杆菌介导的转化(参见例如,美国专利号5,591,616和5,563,055,其各自通过提及而合并入本文);通过原生质体的PEG-介导的转化(参见例如,Omirulleh等人,1993;美国专利号4,684,611和4,952,500,其各自通过提及而合并入本文);通过由干燥和/抑制介导的DNA摄取(参见例如,Potrykus等人,1985),以及此类方法的任何组合。通过应用诸如这些的技术,可以稳定地或瞬时地转化细胞器、细胞、组织或生物体。
1.离体转化
用于在离体情景下转染从生物体中移出的血管细胞和组织的方法是本领域技术人员已知的。例如,已经通过体外逆转录病毒基因转移遗传改变了犬内皮细胞并且将其移植到犬中(参见例如,Wilson等人,1989)。在另一个例子中,在体外通过逆转录病毒转染了Yucatan小型猪内皮细胞并且通过使用双气囊导管将其移植到动脉中(参见例如,Nabel等人,1989)。因此,考虑了可以移出细胞或组织并且使用本公开内容的核酸对其进行离体转化。在特别的方面,可以将经移植的细胞或组织放置入生物体中。在优选的方面,在经移植的细胞或组织中表达核酸。
2.注射
在某些实施方案中,可以经由一次或多次注射(即,针注射),例如以心肌内方式、以心内膜方式、以心外膜方式、以冠状动脉内方式、通过直接注射或冠状动脉内注射、以皮下方式、以真皮内方式、以肌内方式、以静脉内方式、以腹膜内方式等,将核酸递送至细胞器、细胞、组织或生物体。在特别的实施方案中,通过注射将p63-TID直接递送至心脏。注射的方法是本领域普通技术人员众所周知的(例如,包含盐水溶液的组合物的注射)。本公开内容的进一步实施方案包括通过直接微量注射来引入核酸。
3.电穿孔
在本公开内容的某些实施方案中,经由电穿孔将核酸引入到细胞器、细胞、组织或生物体中。电穿孔牵涉将细胞和DNA的悬浮液暴露于高压放电。在该方法的一些变化形式中,使用某些细胞壁降解酶(例如果胶降解酶)来使靶受者细胞比未处理的细胞对于通过电穿孔进行的转化更易感(参见例如,美国专利号5,384,253,其通过提及而合并入本文)。备选地,可以使受者细胞对于通过机械创伤进行的转化更易感。
使用电穿孔的真核细胞的转染已经是相当成功的。已经用人κ-免疫球蛋白基因转染了小鼠pre-B淋巴细胞(参见例如,Potter等人,1984),并且已经以这种方式用氯霉素乙酰转移酶基因转染了大鼠肝细胞(参见例如,Tur-Kaspa等人,1986)。
为了在细胞例如植物细胞中通过电穿孔实施转化,可以使用易碎组织,例如细胞或胚胎发生愈伤组织的悬浮培养物,或者备选地可以直接转化未成熟胚胎或其他组织化组织。在该技术中,通过以受控方式将它们暴露于果胶降解酶(果胶溶解酶(pectolyase))或机械创伤将会部分地降解所选择的细胞的细胞壁。一些已通过完整细胞的电穿孔进行转化的物种的例子包括玉米(参见例如,美国专利号5,384,253;Rhodes等人,1995;D’Halluin等人,1992)、小麦(参见例如,Zhou等人,1993)、番茄(参见例如,Hou和Lin,1996)、大豆(参见例如,Christou等人,1987)和烟草(参见例如,Lee等人,1989)。
也可以使用原生质体用于进行植物细胞的电穿孔转化(参见例如,Bates,1994;Lazzeri,1995)。例如,由Dhir和Widholm在国际专利申请号WO 9217598(其通过提及而合并入本文)中描述了通过源自子叶的原生质体的电穿孔来生成转基因大豆植物。对于其已描述了原生质体转化的物种的其他例子包括大麦(参见例如,Lazerri,1995)、高粱(参见例如,Battraw等人,1991)、玉米(参见例如,Bhattacharjee等人,1997)、小麦(参见例如,He等人,1994)和番茄(参见例如,Tsukada,1989)。
4.磷酸钙
在本公开内容的另一些实施方案中,使用磷酸钙沉淀来将核酸引入到细胞中。已经使用该技术用腺病毒5DNA转染了人KB细胞(参见例如,Graham和Van Der Eb,1973)。还以这种方式,用新霉素标记基因转染了小鼠L(A9)、小鼠C127、CHO、CV-1、BHK、NIH3T3和HeLa细胞(参见例如,Chen和Okayama,1987),并且用各种各样的标记基因转染了大鼠肝细胞(参见例如,Rippe等人,1990)。
5.DEAE-葡聚糖
在另一个实施方案中,通过使用DEAE-葡聚糖和随后的聚乙二醇来将核酸递送到细胞中。以这种方式,将报道质粒引入到小鼠骨髓瘤和红白血病细胞中(参见例如,Gopal,1985)。
6.超声处理加载
本公开内容的另外的实施方案包括通过直接超声加载来引入核酸。已经通过超声处理加载用胸苷激酶基因转染了LTK-成纤维细胞(参见例如,Fechheimer等人,1987)。
7.由脂质体介导的转染
在本公开内容的一个进一步的实施方案中,可以将核酸包载在脂质复合物例如脂质体中。脂质体是以磷脂双层膜和内部水性介质为特征的囊泡结构。多层脂质体具有多个由水性介质分隔开的脂质层。当将磷脂悬浮在过量的水性溶液中时,它们自发地形成。脂质组分在形成封闭结构之前经历自重排,并且在脂质双层之间包载水和所溶解的溶质(参见例如,Ghosh和Bachhawat,1991)。还考虑了与Lipofectamine(Gibco BRL)或Superfect(Qiagen)相复合的核酸。
在体外外来DNA的由脂质体介导的核酸递送和表达已是非常成功的(参见例如Nicolau和Sene,1982;Fraley等人,1979;Nicolau等人,1987)。还已证明了在培养的鸡胚、HeLa和肝细胞癌细胞中外来DNA的由脂质体介导的递送和表达的可行性(参见例如,Wong等人,1980)。
在本公开内容的某些实施方案中,脂质体可以与血凝病毒(HVJ)相复合。这已显示出推动与细胞膜的融合并且促进经脂质体包囊的DNA的细胞进入(参见例如,Kaneda等人,1989)。在另一些实施方案中,可以与核非组蛋白染色体蛋白(HMG-1)相联合地复合或使用脂质体(参见例如,Kato等人,1991)。在更进一步的实施方案中,可以与HVJ和HMG-1两者相联合地复合或使用脂质体。在另一些实施方案中,递送载料可以包含配体和脂质体。
8.由受体介导的转染
更进一步地,可以经由由受体介导的递送载料将核酸递送至靶细胞。这些利用了通过将会在靶细胞中出现的由受体介导的胞吞作用的对于大分子的选择性摄取。鉴于各种受体的细胞类型特异性分布,该递送方法为本公开内容增加了另一特异性程度。
某些由受体介导的基因靶向性载料包含细胞受体特异性配体和核酸结合试剂。其他包含细胞受体特异性配体,向其上已经可操作地附接了待递送的核酸。几种配体已经用于由受体介导的基因转移(参见例如,Wu和Wu,1987;Wagner等人,1990;Perales等人,1994;Myers,EPO 0273085),这建立了该技术的可操作性。已经描述了在另一种哺乳动物细胞类型的情景下的特异性递送(参见例如,Wu和Wu,1993,其通过提及而合并入本文)。在本公开内容的某些方面,将会选择配体以相应于在靶细胞群体上特异性地表达的受体。
在另一些实施方案中,细胞特异性核酸靶向性载料的核酸递送载料组分可以包含与脂质体相组合的特异性结合配体。将待递送的核酸容纳在脂质体内,并且将所述特异性结合配体功能性地掺入到脂质体膜中。因此,脂质体将会与靶细胞的受体特异性地结合并且将内容物递送至细胞。
在更进一步的实施方案中,靶向型递送载料的核酸递送载料组分可以是脂质体本身,其将会优选地包含一种或多种指导细胞特异性结合的脂质或糖蛋白。例如,已将乳糖苷神经酰胺(半乳糖末端无唾液酸神经节苷脂)掺入到脂质体中,并且观察到肝细胞对于胰岛素基因的摄取增加(参见例如,Nicolau等人,1987)。考虑了可以以相似方式将本公开内容的组织特异性转化构建体特异性地递送到靶细胞中。
9.微粒轰击
微粒轰击技术可以用于将核酸引入到至少一个细胞器、细胞、组织或生物体中(参见例如,美国专利号5,550,318;美国专利号5,538,880;美国专利号5,610,042;和PCT申请WO 94/09699,其各自通过提及而合并入本文)。该方法依赖于这样的能力,即将包被有DNA的微粒加速至高速度,从而允许它们刺穿细胞膜并且进入细胞而不杀死它们(参见例如,Klein等人,1987)。存在有广泛多样的本领域中已知的微粒轰击技术,其中许多可应用于本公开内容。
微粒轰击可以用于转化各种细胞、组织或生物体,例如任何植物物种。已通过微粒轰击进行转化的物种的例子包括:单子叶植物物种,例如玉米(参见例如,PCT申请WO 95/06128)、大麦(参见例如,Ritala等人,1994;Hensgens等人,1993)、小麦(参见例如,美国专利号5,563,055,其通过提及而合并入本文)、水稻(参见例如,Hensgens等人,1993)、燕麦(参见例如,Torbet等人,1995;Torbet等人,1998)、黑麦(参见例如,Hensgens等人,1993)、甘蔗(参见例如,Bower等人,1992)和高粱(参见例如,Casas等人,1993;Hagio等人,1991);以及许多双子叶植物,通常包括烟草(参见例如,Tomes等人,1990;Buising和Benbow,1994)、大豆(参见例如,美国专利号5,322,783,其通过提及而合并入本文)、向日葵(参见例如,Knittel等人,1994)、花生(参见例如,Singsit等人,1997)、棉花(参见例如,McCabe和Martinell,1993)、番茄(参见例如,VanEck等人,1995)和豆科植物(参见例如,美国专利号5,563,055,其通过提及而合并入本文)。
在该微粒轰击中,一个或多个颗粒可以用至少一种核酸进行包被并且通过推进力递送到细胞中。已开发出了几种用于加速小颗粒的装置。一个这样的装置依靠于高压放电以生成电流,而其则提供动力(参见例如,Yang等人,1990)。所使用的微粒由在生物学上惰性的物质例如钨或金颗粒或珠粒组成。示例性的颗粒包括由钨、铂和优选地金组成的那些。考虑了,在一些情况下,DNA沉淀到金属颗粒上对于使用微粒轰击来将DNA递送至受者细胞不会是必需的。然而,考虑了颗粒可以包含DNA而非用DNA进行包被。包被有DNA的颗粒可以增加经由微粒轰击的DNA递送的水平,但是它们本身不是必需的。
对于轰击,将悬浮中的细胞在过滤器或固体培养基上进行浓缩。备选地,可以将未成熟胚胎或其他靶细胞安排在固体培养基上。将待轰击的细胞安置在微粒停止板下方的适当距离处。
用于通过加速将DNA递送到细胞(例如,植物细胞)中的方法的一个举例说明性实施方案为生物射弹颗粒递送系统(Biolistics Particle Delivery System),其可以用于推进包被有DNA或细胞的颗粒通过筛网(例如,不锈钢或Nytex筛网)到覆盖有细胞(例如,悬浮培养的单子叶植物细胞)的过滤器表面。所述筛网分散所述颗粒,从而它们不以大聚集体被递送至所述受者细胞。认为插在射弹仪器和待轰击的细胞之间的筛网降低了射弹聚集体的大小,并且可以通过减小由过大的射弹在受者细胞上所施以的损害而对于更高的转化频率做出贡献。
VII.蛋白质、多肽和肽
在一些情况下,实施方案可以使用作为多肽的p63-TID,并且任选地可以使用一种或多种经纯化的心脏细胞重编程因子例如Hand2、心肌素、Gata4、Mef2c或Tbx5蛋白质、多肽或肽,或者一种或多种染色质去稳定剂蛋白质、多肽或肽,或者其他蛋白质、多肽或肽,并且可以除了使用各自的核酸形式外或者备选地来这么做。在本文中所使用的术语“经纯化的蛋白质、多肽或肽”意欲是指可从哺乳动物细胞或重组宿主细胞中分离的蛋白质性质的组合物,其中纯化所述至少一种蛋白质、多肽或肽至相对于其天然可获得的状态(即相对于其在细胞提取物内的纯度)的任何程度。因此,经纯化的蛋白质、多肽或肽也是指脱离在其中它天然出现的环境的野生型或突变体蛋白质、多肽或肽。
先前已经公开了关于各种基因的核苷酸以及蛋白质、多肽和肽序列,并且可以在本领域普通技术人员已知的计算机化数据库中找到它们。一个这样的数据库为美国国家生物技术信息中心的和/>数据库。可以使用在本文中所公开的技术或者通过本领域普通技术人员将会已知的任何技术来扩增和/或表达关于这些已知基因的编码区。另外,可以通过本领域普通技术人员已知的方法,例如使用自动化肽合成机器(例如,从Applied Biosystems(Foster City,CA)可得的那些)的肽合成,来合成肽序列。
通常,“经纯化的”将会是指特定的蛋白质、多肽或肽组合物,其已经历分级分离以去除各种其他蛋白质、多肽或肽,并且所述组合物实质上保持其活性,如可以评估的,例如通过蛋白质测定法,如在本文中下面所描述的,或者如本领域普通技术人员对于所希望的蛋白质、多肽或肽将会已知的。
当使用术语“实质上经纯化的”时,这将会是指这样的组合物,其中特定的蛋白质、多肽或肽形成所述组合物的主要组分,例如构成在所述组合物中的蛋白质的大约50%或更多。在优选的实施方案中,实质上经纯化的蛋白质将会构成在所述组合物中的蛋白质的多于60%、70%、80%、90%、95%、99%或甚至更多。
如应用于本公开内容的,“纯化至均一”的肽、多肽或蛋白质意味着,所述肽、多肽或蛋白质具有这样的纯度水平,其中所述肽、多肽或蛋白质实质上没有其他蛋白质和生物学组分。例如,经纯化的肽、多肽或蛋白质经常将会充分地没有其他蛋白质组分,从而可以成功地进行降解测序。
按照本公开内容,用于定量蛋白质、多肽或肽的纯化程度的各种方法将会是本领域技术人员已知的。这些包括例如,测定级分的比蛋白质活性,或者通过凝胶电泳来评估在级分内的多肽数目。
为了纯化所希望的蛋白质、多肽或肽,包含至少一些特定蛋白质、多肽或肽的天然或重组组合物将会经历分级分离以从所述组合物中去除各种其他组分。除了在本文中下面详细描述的那些技术外,适合于在蛋白质纯化中使用的各种其他技术将会是本领域技术人员众所周知的。这些包括例如,用硫酸铵、PEG、抗体等或者通过热变性来进行沉淀,随后为离心;色谱法步骤,例如离子交换、凝胶过滤、反相、羟磷灰石、凝集素亲和和其他亲和色谱法步骤;等电聚焦;凝胶电泳;以及这些和其他技术的组合。
另一个例子是使用特异性结合伙伴的特定融合蛋白的纯化。这样的纯化方法是本领域中常规的。由于本公开内容提供了关于特定蛋白质的DNA序列,因此现在可以实行任何融合蛋白纯化方法。这可以通过下述来例示:生成特定蛋白质-谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白,在大肠杆菌中表达,和使用在谷胱甘肽-琼脂糖上的亲和色谱法分离至均一,或者在所述蛋白质的N-或C-末端上生成多组氨酸标签,和随后使用Ni-亲和色谱法进行纯化。然而,鉴于许多DNA和蛋白质是已知的或者可以使用在本文中所描述的方法来鉴定和扩增,因而现在可以采用任何纯化方法。
虽然被考虑用于在某些实施方案中使用,但是并不存在总是以其最经纯化的状况来提供所述蛋白质、多肽或肽的一般要求。实际上,考虑了较不实质上经纯化的蛋白质、多肽或肽(然而,其富集在所希望的蛋白质组合物中,相对于天然状态而言)在某些实施方案中将会具有效用。
展示出较低的相对纯化程度的方法在蛋白质产物的总回收中或者在维持所表达的蛋白质的活性中具有优点。失活的产物在某些实施方案中也具有效用,例如在经由抗体生成来测定抗原性中。
VIII.宿主细胞
虽然在一些实施方案中本公开内容的核酸被直接提供给心脏组织并且被在该组织中的细胞摄取,但是在一些实施方案中首先离体在细胞中生成和操纵所述核酸,例如通过采用常规重组技术方法。
如在本文中所使用的,术语“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可以互换使用。所有这些术语也包括其子代,其是任何和所有随后的世代。应当理解的是,所有子代可能由于故意或无意的突变而不是相同的。在表达异源核酸序列的情景下,“宿主细胞”是指原核或真核细胞,并且它包括能够复制载体和/或表达由载体所编码的异源基因的任何可转化的生物。宿主细胞可以并且已被用作对于载体的受者。宿主细胞可以被“转染”或“转化”,这是指通过其将外源核酸转移或引入到宿主细胞中的过程。经转化的细胞包括原代受试细胞及其子代。如在本文中所使用的,术语“经改造的”和“重组的”细胞或宿主细胞意欲是指已向其中引入外源核酸序列(例如载体)的细胞。因此,重组细胞可区别于不包含以重组方式引入的核酸的天然出现的细胞。
在某些实施方案中,考虑了RNA或蛋白质序列可以与其他所选择的RNA或蛋白质序列一起在相同的宿主细胞中共表达。共表达可以通过用两种或更多种不同的重组载体共转染宿主细胞来取得。备选地,可以构建单个重组载体以包括多个不同的关于RNA或DNA(作为活性试剂)或者多肽(作为活性试剂)的编码区,其然后可以在用所述单个载体进行转染的宿主细胞中进行表达。
组织可以包含待用编码p63-TID(或者其功能性片段和/或功能性衍生物)、一种或多种心脏细胞重编程因子和/或一种或多种染色质去稳定剂的多核苷酸或核酸进行转化的宿主细胞。在特别的实施方案中,细胞可以拥有编码p63-TID(或者其功能性片段和/或功能性衍生物)、Hand2和/或心肌素的多核苷酸。所述组织可以是生物体的一部分或者与生物体分开。在某些实施方案中,组织可以包含但不限于,肌细胞、脂肪细胞、肺泡、成釉质细胞、轴突、基底细胞、血液(例如,淋巴细胞)、血管、骨、骨髓、大脑、乳房、心脏、软骨、宫颈、结肠、角膜、胚胎、子宫内膜、内皮、上皮、食道、筋膜、成纤维细胞、卵泡、神经节细胞、神经胶质细胞、杯形细胞、肾、肝、肺、淋巴结、肌肉、神经元、卵巢、胰腺、外周血,前列腺、皮肤、皮肤、小肠、脾脏、干细胞、胃、睾丸等。
在某些实施方案中,所述宿主细胞或组织可以被包含在至少一个生物中。在某些实施方案中,所述生物可以是但不限于原核生物(例如,真细菌、古细菌)或真核生物,如本领域普通技术人员将会理解的(参见例如,网页http://phylogeny.arizona.edu/tree/phylogeny.html)。
可得许多细胞系和培养物用于作为宿主细胞使用,并且它们可以通过美国典型培养物保藏中心(ATCC)(其是充当关于活培养物和遗传材料的档案馆的组织)获得。合适的宿主可以由本领域技术人员基于载体主链和所希望的结果来确定。例如,可以将质粒或粘粒引入到原核宿主细胞中以用于进行许多载体的复制。可得用于载体复制和/或表达的细胞类型包括但不限于细菌,例如大肠杆菌(例如,大肠杆菌菌株RR1、大肠杆菌LE392、大肠杆菌B、大肠杆菌X 1776(ATCCNo.31537)以及大肠杆菌W3110(F-、λ-、原养型的,ATCCNo.273325)、DH5α、JM109和KC8);杆菌,例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis);和其他肠杆菌科,例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)、各种假单胞菌属(Pseudomonas)物种,以及许多商购可得的细菌宿主例如感受态细胞和SOLOPACKTM Gold Cells(/>La Jolla)。在某些实施方案中,特别考虑了细菌细胞例如大肠杆菌LE392作为用于噬菌体的宿主细胞。
用于载体的复制和/或表达的真核宿主细胞的例子包括但不限于HeLa、NIH3T3、Jurkat、293、Cos、CHO、Saos和PC12。许多来自各种细胞类型和生物的宿主细胞是可得的,并且将会是本领域技术人员已知的。类似地,病毒载体可以与真核或原核宿主细胞(特别是允许所述载体的复制或表达的那种)相联合地进行使用。
一些载体可以采用允许它在原核和真核细胞两者中进行复制和/或表达的控制序列。本领域技术人员将会进一步理解在其下温育所有上面所描述的宿主细胞以维持它们并且允许载体复制的条件。还理解和知道将会允许载体的大规模产生以及由载体所编码的核酸及其关联多肽、蛋白质或肽的产生的技术和条件。
IX.联合疗法
在某些情况下,本公开内容的疗法与一种或多种用于心脏医学状况的其他疗法相联合地进行使用。p63-TID(或者其功能性片段和/或功能性衍生物)可以与一种或多种心脏细胞重编程因子相联合地,和/或与一种或多种染色质去稳定剂相联合地,和/或与一种或多种抗纤维化试剂或血管生成因子相联合地进行使用。在特别的实施方案中,p63-TID(或者其功能性片段和/或功能性衍生物)与Hand2和/或心肌素基因疗法相组合地进行使用,虽然它也可以与其他基因或基因产物(包括Gata4、Mef2c、Tbx5、miR-133、miR-1、Oct4、Klf4、c-myc、Sox2、Mesp1、Brachyury、Nkx2.5、ETS2、ESRRG、Mrtf-A、MyoD和/或ZFPM2)(以核酸或者多肽或肽形式,在特别的实施方案中)相组合地进行使用。所述一种或多种其他疗法可以是与所述心脏医学状况直接或间接相关的(间接相关的疗法的例子包括用于疼痛或感染的那些)。在特别的实施方案中,所述额外的与所述心脏医学状况相关的疗法为药物疗法、外科手术、心室辅助装置(VAD)植入、电视辅助胸廓切开术(VAT)、冠状动脉搭桥或其组合。
在特别的实施方案中,一种或多种防止纤维化和/或增强或促进血管生成的试剂可以用作对于本公开内容的实施方案的辅助物。它们可以在心脏的局部区域(包括具有组织损伤、心肌细胞损失、瘢痕组织等的区域)中提供给个体,或者它们可以全身性地提供。所述一种或多种试剂可以为任何适合于推动在所希望的区域中的血管生成的组合物。在特别的实施方案中,所述试剂可以为蛋白质、肽、小分子、核酸等。可以与本公开内容的方法相联合地使用诸如在US2003/0103943或US2001/0041679中所描述的那些的实施方案。可以与本公开内容的方法相联合地使用诸如在US2018/0066252A1或US2022/0143142A1(其各自以其整体合并入本文以用于在本文中所描述的目的)中所描述的那些的实施方案。特别的实施方案包括:成纤维细胞生长因子(FGF);血管内皮生长因子(VEGF);Ets变体2(ETV2);血管生成素,Ang1和Ang2;基质金属蛋白酶(MMP);δ-样配体4(DII4);或其肽;或其组合。ITD-1是抑制TGF-β和因此纤维化和心脏重塑的小分子(Willems E,Cabral-Teixeira J,Schade D等人,Cell Stem Cell.2012.pp.242-252),并且可以使用它。
在特别的实施方案中,增强血管生成的试剂为VEGF。在特别是实施方案中,增强血管生成的试剂为ETV2。在某些实施方案中,使用在本文中所描述的任何方法(例如但不限于,蛋白质/肽、载体、质粒载体和/或病毒载体)来施用VEGF和/或ETV2。在某些实施方案中,使用腺病毒载体来施用VEGF和/或ETV2。在某些实施方案中,与p63-TID和H/M同时地施用VEGF和/或ETV2。在某些实施方案中,在施用p63-TID和H/M之前施用VEGF和/或ETV2。在某些实施方案中,当与具有对照、GMT和/或GMTd治疗的VEGF和/或ETV2施用相比较时,具有p63-TID和H/M的VEGF和/或ETV2施用导致更优的心脏细胞重编程。
在某些实施方案中,示例性的ETV2多核苷酸序列为和/或被包含在登录号NM_001300974(SEQ ID NO:12)内:TTCCTGTTGCAGATAAGCCCAGCTTAGCCCAGCTGACCCCAGACCCTCTCCCCTCACTCCCCCCATGTCGCAGGATCGAGACCCTGAGGCAGACAGCCCGTTCACCAAGCCCCCCGCCCCGCCCCCATCACCCCGTAAACTTCTCCCAGCCTCCGCCCTGCCCTCACCCAGCCCGCTGTTCCCCAAGCCTCGCTCCAAGCCCACGCCACCCCTGCAGCAGGGCAGCCCCAGAGGCCAGCACCTATCCCCGAGGCTGGGGTCGAGGCTCGGCCCCGCCCCTGCCTCTGCAACTTGAGCCTGGCTGCGACCCCTGCTCTGACGTCTCGGAAAATTCCCCCTTGCCCAGGCCCTTGGGGGAGGGGGTGCATGGTATGAAATGGGGCTGAGACCCCCGGCTGGGGGCAGAGGAACCCGCCAGAGAAGGAGCCAAATTAGGCTTCTGTTTCCCTGATCTGGCACTCCAAGGGGACACGCCGACAGCGACAGCAGAGACATGCTGGAAAGGTACAAGCTCATCCCTGGCAAGCTTCCCACAGCTGGACTGGGGCTCCGCGTTACTGCACCCAGAAGTTCCATGGGGGGCGGAGCCCGACTCTCAGGCTCTTCCGTGGTCCGGGGACTGGACAGACATGGCGTGCACAGCCTGGGACTCTTGGAGCGGCGCCTCGCAGACCCTGGGCCCCGCCCCTCTCGGCCCGGGCCCCATCCCCGCCGCCGGCTCCGAAGGCGCCGCGGGCCAGAACTGCGTCCCCGTGGCGGGAGAGGCCACCTCGTGGTCGCGCGCCCAGGCCGCCGGGAGCAACACCAGCTGGGACTGTTCTGTGGGGCCCGACGGCGATACCTACTGGGGCAGTGGCCTGGGCGGGGAGCCGCGCACGGACTGTACCATTTCGTGGGGCGGGCCCGCGGGCCCGGACTGTACCACCTCCTGGAACCCGGGGCTGCATGCGGGTGGCACCACCTCTTTGAAGCGGTACCAGAGCTCAGCTCTCACCGTTTGCTCCGAACCGAGCCCGCAGTCGGACCGTGCCAGTTTGGCTCGATGCCCCAAAACTAACCACCGAGGTCCCATTCAGCTGTGGCAGTTCCTCCTGGAGCTGCTCCACGACGGGGCGCGTAGCAGCTGCATCCGTTGGACTGGCAACAGCCGCGAGTTCCAGCTGTGCGACCCCAAAGAGGTGGCTCGGCTGTGGGGCGAGCGCAAGAGAAAGCCGGGCATGAATTACGAGAAGCTGAGCCGGGGCCTTCGCTACTACTATCGCCGCGACATCGTGCGCAAGAGCGGGGGGCGAAAGTACACGTACCGCTTCGGGGGCCGCGTGCCCAGCCTAGCCTATCCGGACTGTGCGGGAGGCGGACGGGGAGCAGAGACACAATAAAAATTCCCGGTCAAACCTCAAAAAAAAAAAAAAA(SEQ ID NO:12)
在某些实施方案中,示例性的VEGF多核苷酸序列为和/或被包含在登录号AY047581(SEQ ID NO:13)内:TCGGGCCTCCGAAACCATGAACTTTCTGCTGTCTTGGGTGCATTGGAGCCTTGCCTTGCTGCTCTACCTCCACCATGCCAAGTGGTCCCAGGCTGCACCCATGGCAGAAGGAGGGGGGCAGAATCATCACGAAGTGGTGAAGTTCATGGATGTCTATCAGCGCAGCTACTGCCATCCAATCGAGACCCTGGTGGACATCTTCCAGGAGTACCCTGATGAGATCGAGTACATCTTCAAGCCATCCTGTGTGCCCCTGATGCGATGCGGGGGCTGCTGCAATGACGAGGGCCTGGAGTGTGTGCCCACTGAGGAGTCCAACATCACCATGCAGATTATGCGGATCAAACCTCACCAAGGCCAGCACATAGGAGAGATGAGCTTCCTACAGCACAACAAATGTGAATGCAGACCAAAGAAAGATAGAGCAAGACAAGAAAATCCCTGTGGGCCTTGCTCAGAGCGGAGAAAGCATTTGTTTGTACAAGATCCGCAGACGTGTAAATGTTCCTGCAAAAACACAGACTCGCGTTGCAAGGCGAGGCAGCTTGAGTTAAACGAACGTACTTGCAGATGTGACAAGCCGAGGCGGTGAGCCGGGCAGGAGGAAGGAGCCTCCCTCAGGGTTTCGGGAACCAGATCT(SEQ ID NO:13)
在特别的实施方案中,在本公开内容的方法中使用SEQ ID NO:12和/或13的部分或全部。在特别的实施方案中,在本公开内容的方法中使用相关于SEQ ID NO:12和/或13而言具有特定的序列同一性的多核苷酸。在特别的情况下,使用SEQ ID NO:12和/或13的功能性片段,并且在本文中所使用的术语“功能性片段”是指编码具有能够将成纤维细胞转变为内皮细胞或内皮样细胞的活性的多肽的多核苷酸。在特别的情况下,所述片段具有SEQ IDNO:12和/或13的至少大约或不超过大约1375、1350、1325、1300、1275、1250、1225、1200、1175、1150、1125、1100、1075、1050、1025、1000、975、950、925、900、875、850、825、800、775、750、725、700、675、650、625、600、575、550、525、500、475、450、425、400、375、350、325、300、275、250、225、200、175、150、125或100个连续核苷酸的长度。另外,所述片段可以与在SEQID NO:12和/或13中的相应区域具有至少或正好100、99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、88、87、86、85、80、75或70%的序列同一性。可以使用与SEQ ID NO:12和/或13具有一定的序列同一性的多核苷酸,包括与SEQ ID NO:12和/或13的至少或正好100、99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、88、87、86、85、80、75或70%同一性。
在一些实施方案中,将ETV2和/或VEGF多肽递送至有此需要的个体,无论它以在载体上、与载剂相联合、在细胞内(包括在细胞中在载体上)等的形式。在特别的实施方案中,所述ETV2和/或VEGF多肽为哺乳动物ETV2和/或VEGF多肽,包括人的、小鼠的、大鼠的等。在特别的实施方案中,ETV2多肽序列的一个例子为和/或被包含在登录号NP_001287903(SEQ ID NO:14)内。
ACTAWDSWSGASQTLGPAPLGPGPIPAAGSEGAAGQNCVPVAG
EATSWSRAQAAGSNTSWDCSVGPDGDTYWGSGLGGEPRTDCTI
SWGGPAGPDCTTSWNPGLHAGGTTSLKRYQSSALTVCSEPSPQ
SDRASLARCPKTNHRGPIQLWQFLLELLHDGARSSCIRWTGNSR
EFQLCDPKEVARLWGERKRKPGMNYEKLSRGLRYYYRRDIVRKSGGRKYTYRFGGRVPSLAYPDCAGGGRGAETQ(SEQ ID NO:14)
在特别的实施方案中,VEGF多肽序列的一个例子为和/或被包含在登录号AAK95847(SEQ ID NO:15)内。
MNFLLSWVHWSLALLLYLHHAKWSQAAPMAEGGGQNHHEVV
KFMDVYQRSYCHPIETLVDIFQEYPDEIEYIFKPSCVPLMRCGG
CCNDEGLECVPTEESNITMQIMRIKPHQGQHIGEMSFLQHNKC
ECRPKKDRARQENPCGPCSERRKHLFVQDPQTCKCSCKNTDSRCKARQLELNERTCRCDKPRR(SEQID NO:15)
在特别的实施方案中,在本公开内容的方法中使用SEQ ID NO:14和/或15的部分或全部。在特别的实施方案中,在本公开内容的方法中使用相关于SEQ ID NO:14和/或15而言具有特定的序列同一性的多肽。在特别的情况下,使用SEQ ID NO:14和/或15的功能性片段,并且在本文中所使用的术语“功能性片段”是指具有能够将成纤维细胞转变为内皮细胞或内皮样细胞的活性的多肽。在特别的情况下,所述片段具有SEQ ID NO:14和/或15的至少大约或不超过大约245、240、235、230、225、220、215、210、205、200、195、190、185、180、175、170、165、160、155、150、145、140、135、130、125、120、115、110、105、100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25或20个连续氨基酸的长度。
可以将增强血管生成的试剂称为血管生成因子。可以在所述个体接受所述p63-TID(或者其功能性片段和/或功能性衍生物)之前和/或在所述心脏细胞重编程因子之前和/或在所述染色质去稳定剂之前向所述个体提供所述试剂。在某些实施方案中,使用多于一种试剂。
本公开内容的疗法可以在其他试剂治疗之前或之后,以从数分钟至数小时至数天至数周或数月变动的间隔。在其中向所述个体分开地施加其他试剂和本疗法的实施方案中,通常将会确保在每个递送的时间之间没有经过重大的时间段,从而本公开内容的疗法和额外的疗法仍然将会能够对所述个体发挥有利地组合的效应。在此类情况下,考虑了可以使所述个体与所述两种治疗方式相接触,同时地或者在相互数分钟内或在相互大约1-12、6-12或12-24小时内。然而,在一些情形下,可以希望显著地延伸治疗时间段,其中在各自施用之间经过几天(2、3、4、5、6或7)至几周(1、2、3、4、5、6、7或8)。
在特别的实施方案中,在相同的时间或在不同的时间提供本公开内容的疗法和额外的疗法。分开的实体可以在相同的组合物内,或者它们可以被包含在分开的组合物中。在不同的时间提供本公开内容的疗法和第二疗法的情况下,它们可以相隔任何合适的时间范围,例如数分钟、数小时、数天或数周。在其中分开提供它们的实施方案中,两个(或更多个)疗法的递送次序可以是任何合适的次序,包括在另一疗法之前或之后与Hand2和/或心肌素一起递送p63-TID(或者其功能性片段和/或功能性衍生物)。
待与本公开内容的疗法一起使用的其他治疗的例子包括下列中的一种或多种:ACE抑制剂,醛固酮抑制剂,血管紧张素II受体阻断剂(ARB),β-阻断剂,钙通道阻断剂,降胆固醇药物,地高辛,利尿药,变力疗法,钾或镁,血管舒张剂,抗凝血药剂,阿司匹林,外科手术,VAD植入,VAT,冠状动脉搭桥,经皮冠状动脉介入(PCI),或其组合。
X.本公开内容的试剂盒
可以将在本文中所描述的组合物中的任一种包含在试剂盒中。在一个非限制性例子中,可以将p63-TID(或者其功能性片段和/或功能性衍生物)、一种或多种心脏细胞重编程因子和/或一种或多种染色质去稳定剂或者用于扩增其的其他多核苷酸或引物包含在试剂盒中。在特别的实施方案中,所述试剂盒包含p63-TID(或者其功能性片段和/或功能性衍生物),具有或没有Hand2和/或心肌素多肽或肽。可以将用于生成p63-TID(或者其功能性片段和/或功能性衍生物)或者其他所提及的因子中的一种或多种的一种或多种试剂包括在所述试剂盒中,例如用于扩增所希望的序列的特异性引物。在这样的情况下,所述试剂盒可以或可以不包含用于这样的方法的标准试剂,例如核苷酸、缓冲液等。所述试剂盒另外还可以包含用于治疗心脏医学状况的额外试剂。
所述试剂盒的组分可以要么在水性介质中要么以冻干形式进行包装。所述试剂盒的容器工具通常将会包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射器或其他容器工具,向其中可以放置组分,并且优选地,适当地等分的。当在所述试剂盒中存在多于一种组分时,所述试剂盒通常还将会包含第二个、第三个或其他额外的容器,向其中可以分开地放置所述额外的组分。然而,可以在小瓶中包含组分的各种组合。本公开内容的试剂盒还将会典型地包括用于紧密密封地包含所述p63-TID(或者其功能性片段和/或功能性衍生物)和一种或多种组合物以用于商业销售的工具。此类容器可以包括注射或吹制成型的塑料容器,在其中保持所希望的小瓶。
当在一种和/或多种液体溶液中提供所述试剂盒的组分时,所述液体溶液为水性溶液,其中无菌水性溶液是特别考虑的。所述p63-TID(或者其功能性片段和/或功能性衍生物)组合物也可以配制成可注射组合物。在该情况下,所述容器工具可以本身是注射器、移液管和/或其他诸如此类的器械,从其中可以将该制剂施加至身体的受感染区域,注射入动物中,和/或甚至施加至所述试剂盒的其他组分和/或与所述试剂盒的其他组分相混合。然而,所述试剂盒的组分可以作为经干燥的粉末来提供。当作为干粉末来提供试剂和/或组分时,可以通过添加合适的溶剂来对粉末进行重构。想象到,所述溶剂也可以提供在另一个容器工具中。
本公开内容的试剂盒还将会典型地包括用于紧密密封地包含所述小瓶以用于商业销售的工具,例如注射或吹制成型的塑料容器,在其中保持所希望的小瓶。
在特别的实施方案中,所述试剂盒包含用于确定个体具有心脏医学状况的试剂和/或用具。在一些实施方案中,所述试剂盒包含一种或多种额外的用于心脏相关医学状况的疗法,例如下列中的一种或多种:ACE抑制剂,醛固酮抑制剂,血管紧张素II受体阻断剂(ARB),β-阻断剂,钙通道阻断剂,降胆固醇药物,地高辛,利尿药,变力疗法,钾,镁,血管舒张剂,抗凝血药剂,阿司匹林,TGF-β抑制剂,及其组合。在特别的实施方案中,个体在本公开内容的疗法之前、期间或之后接受血管生成疗法。血管生成疗法的例子包括:成纤维细胞生长因子(FGF);血管内皮生长因子(VEGF);Ets变体2(ETV2);血管生成素,Ang1和Ang2;基质金属蛋白酶(MMP);δ-样配体4(DII4);或其肽;或其组合。
实施例
下面的实施例被包括用于证明本发明的优选的实施方案。本领域技术人员应当意识到,在下面的实施例中所公开的技术代表了被发明人发现在本发明的实施中很好地起作用的技术,并因此可以被认为是对于其实施的优选模式。然而,按照本公开内容,本领域技术人员应当意识到,可以在所公开的特别的实施方案中进行许多变化,并且仍然获得相像或相似的结果,而不背离本发明的精神和范围。
方法
除非另有说明,否则在本文中所描述的实验和操作程序如下来进行。
组织收集和心脏成纤维细胞的分离
使用标准细胞分离技术分别从0-3日龄至6-8周龄大鼠(Harlan Sprague DawleyInc,Indianapolis,IN)中收获新生鼠和成年鼠心脏成纤维细胞(参见例如,引文9、10和27,其各自通过提及而合并入本文以用于在本文中所描述的目的)。所有动物实验得到了在贝勒医学院(Baylor College of Medicine)的机构动物照料和使用委员会(InstitutionalAnimal Care and Use Committee;IACUC)批准,并且所有方法按照NIH指导方针(关于实验室动物照料和使用的指南)并且在规程AN-6223下进行。这些研究依照ARRIVE指导方针的相关要素来进行和报告。
使用标准分离技术从心室心肌组织中分离成人人心脏成纤维细胞,所述心室心肌组织获得自在贝勒圣卢克医学中心(Baylor St.Luke’s Medical Center)经历机械辅助装置放置或心脏移植的心力衰竭患者的外植体(参见例如,引文9和10,其各自通过提及而合并入本文以用于在本文中所描述的目的)。在获得所述组织之前从所有受试者和/或其法定监护人获得书面知情同意书。所有实验方法都在由贝勒医学院机构审查委员会(BaylorCollege of Medicine Institutional Review Board)批准的规程(IRB H-33421)下按照相关的指导方针和规定来进行。简而言之,将外植的组织切碎,然后在DMEM、10%胎牛血清(FBS)和1%青霉素/链霉素中进行培养。由此允许成纤维细胞在2周的时间段内从这些外植体中迁移出,之后将它们在M106培养基(M106500;Thermo Fisher Scientific)、10% FBS和LSGS试剂盒补充物(S-003-K;Thermo Fisher Scientific)中传代三次。
细胞重编程
各自编码Gata4、Mef2、或Tbx5(GMT)、Hand2/心肌素(H/M)、非靶向性(NT)shRNA、p63短发夹RNA(Origene,Rockville,MD)、p63-反式激活抑制结构域(Vectorbuilder,Chicago,IL)(用绿色荧光蛋白(GFP)加标签的)的慢病毒载体或者GFP对照载体由贝勒医学院基因载体中心(Baylor College of Medicine Gene Vector Core)从相关质粒进行制备,如以前所描述的(参见例如,引文9、10、27和28,其各自通过提及而合并入本文以用于在本文中所描述的目的)。
将如上面所描述的那样进行分离的大鼠和人心脏成纤维细胞接种在6cm或10cm培养皿上以用于进行荧光激活细胞分选术[FACS]分析,接种在6-孔平板上以用于进行定量逆转录聚合酶链式反应[qRT-PCR]分析,或者接种在用Surecoat(SC-9035;Cellutron LifeTechnologies)预包被的24-孔平皿上以用于进行免疫细胞化学分析。在细胞为70%至80%汇合之后二十四小时,在与polybrene(最终浓度为5μg/μL)的混合物中,向细胞培养平板添加处于20的感染复数(MOI)(除非另有说明)的慢病毒载体。在用相关重编程因子进行细胞培养物处理后两天,用诱导培养基(iCM培养基)替换初始的转移培养基(DMEM/199[4:1],10% FBS,和1%青霉素/链霉素),如先前所描述的。将该培养基每两天用新鲜诱导培养基进行替换,直至收获细胞(参见例如,引文9和10,其各自通过提及而合并入本文以用于在本文中所描述的目的)。
对于细胞收缩性共培养研究,在规程AN-6223下从0至3日龄大鼠幼仔中分离心肌细胞,如以前所描述的(参见例如,引文28-30,其各自通过提及而合并入本文以用于在本文中所描述的目的)。用经GFP标记的重编程因子(例如,GMT、shp63+H/M、p63-TID+H/M)处理人心脏成纤维细胞,并且在如上面所描述的那样进行处理后一周,收获细胞并且以1:10的比率重铺板在新生大鼠心肌细胞上并且在DMEM/M-199/10% FBS培养基中进行培养(参见例如,引文31,其通过提及而合并入本文以用于在本文中所描述的目的)。
流式细胞术
如以前所描述的那样进行荧光激活细胞分选术(FACS)(参见例如,引文8-10、27和28,其各自通过提及而合并入本文以用于在本文中所描述的目的)。简而言之,首先用DPBS洗涤粘附至培养皿的细胞并且用0.25%胰蛋白酶/EDTA进行胰蛋白酶消化。然后,将细胞用固定缓冲液(BD Biosciences)进行固定,用Perm/Wash缓冲液(BD Biosciences)进行洗涤,并且然后与在Perm/Wash缓冲液中的小鼠单克隆抗心脏肌钙蛋白T(cTnT)抗体(ab8295;Abcam)一起进行温育。然后,将这些细胞与驴抗小鼠Alexa Fluor 647(ab150107;INVITROGENTM)一起进行温育,再次用Perm/Wash缓冲液洗涤3×,并且进一步地使用LSRFortessa细胞分选仪(BD Biosciences)用FlowJo软件(FlowJo,LLC,Ashland,Ore)和Diva软件(version 6.0)就cTnT表达进行分析。
免疫细胞化学
使用固定在4%低聚甲醛中并且用0.5% Triton-X溶液进行渗透化的细胞来进行免疫荧光(IF)染色,如以前所描述的(参见例如,引文8-10和28,其各自通过提及而合并入本文以用于在本文中所描述的目的)。在用10%山羊血清封闭这些细胞后,将它们与针对cTnT(1:300稀释度;Thermo Fisher Scientific)或α-辅肌动蛋白(1:300稀释度;Sigma-Aldrich)的一抗一起进行温育,随后与合适的Alexa荧光二抗(INVITROGENTM)一起进行温育。使用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI;INVITROGENTM)来对细胞核进行染色。为了定量cTnT和α-辅肌动蛋白阳性细胞,在由对于处理组不知情的研究者所选择的五个随机图像中计算表达相关IF标记物的细胞与通过DAPI标记的总细胞的比率。
qRT-PCR
定量实时聚合酶链式反应(qRT-PCR)分析通过下述方式来进行:首先使用TRIzol方法(INVITROGENTM)提取总RNA,如以前所描述的(参见例如,8-10、28、32)。RNA的相对定量通过使用PCR产物的SYBR green检测实时进行,其中采用ABI ViiA 7(Applied BiosystemsInc)。在该研究中所使用的关于qRT-PCR的引物在表1中列出(肌钙蛋白T的心脏肌肉同种型(cTnT);兰诺定受体(RyR);受磷蛋白(Pln);肌动蛋白α心脏肌肉1(Actc1);1型胶原蛋白α1链(Col1a1);Periostin(Postn);甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Gapdh);肿瘤蛋白p63的ΔN同种型(ΔNp63);肿瘤蛋白p63的反式激活(TA)同种型(TAp63);肌球蛋白重链6(Myh6);间隙连接α-1(Gja1))。通过比较ΔΔCT方法与甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)相比较来将mRNA水平标准化。
表1-qRT-PCR引物
共免疫沉淀(Co-IP)和Western分析
对于Western分析和Co-IP,在LIPOFECTAMINETM 3000转染试剂(L3000008,ThermoFisher Scientific)中用质粒载体pcDNA3.1,ΔNp63α-FLAG(p63-FLAG;#26979,Addgene)、HDAC1-GFP(#11054,Addgene)或p63-TID-HA(GenScriptR)转染293T细胞。收集细胞裂解物并且在细胞裂解缓冲液中均质化。通过使用Pierce BCA蛋白质检定试剂盒(23227;ThermoFisher Scientific)来定量蛋白质,并且按照制造商的实验方案通过使用免疫沉淀试剂盒(10007D;INVITROGENTM)用经定量的蛋白质来进行Co-IP。作为最后一个步骤,将样品加载到SDS-PAGE上,并且在分开后,将蛋白质条带转移至硝酸纤维素膜(IB301001;INVITROGENTM)。
用下面的一抗来进行免疫检测:FLAG标签(F1804-200UG;Sigma-Aldrich)、HDAC1(sc-7872;Santa Cruz Biotechnology,Inc)、β-肌动蛋白(sc-47778;Sigma-Aldrich)、HA标签(sc-57592;Santa Cruz Biotechnology,Inc,)或TP63(GTX 102425;GeneTex),随后为用合适的缀合有HRP的二抗(Millipore,Billerica,MA)进行处理。然后,用具有Tween 20的1×Tris缓冲盐水洗涤膜,并且通过化学发光检测(WBLUF0500;Millipore Sigma)来可视化。
收缩性和钙瞬变的测量
共培养研究中的细胞收缩性(细胞缩短)和钙瞬变在室温(22-23℃)下进行测量。为了进行这些研究,将细胞放置在有机玻璃室中,所述有机玻璃室被安置在倒置落射荧光显微镜(Nikon Diaphot2000)的载物台上,并且用1.8mmol/L Ca2+-Tyrode溶液(其包含(以mmol/L):NaCl 140、KCl 5.4、MgCl2 1、CaCl2 1.8、HEPES 5和葡萄糖10,pH 7.4)进行灌注。通过GFP荧光来鉴定事先已经用重编程因子进行处理的细胞。
通过Grass S5刺激器来提供场刺激,使用沿靠包含1.8mM Ca2+的细胞培养池放置的铂电极,采用以超过心肌细胞刺激阈值50%的电压进行递送的双极脉冲。对来自随机场的iCM的收缩进行录像并且在计算机上数字化。对于Ca2+信号测量,细胞用3μmol/L的Fura-2/AM(Life Technologies)进行加载,并且通过使用Delta Scan双束荧光分光光度计(Photon Technology International,Edison,NJ)在340和380nm处以0.5Hz交替地使其兴奋。将Ca2+瞬变表示为所得的510-nm发射的340/380-nm比。使用Felix软件(PhotonTechnology International)来分析数据(参见例如,引文8、9和28-30,其各自通过提及而合并入本文以用于在本文中所描述的目的)。
统计学分析
对于所有研究进行至少三个独立的生物学重复,每个以技术性三次重复进行测量。将所有数据表示为平均值±标准误差(SEM)。统计学分析通过使用SAS(9.4版)来进行。使用Student t-检验来确定两组之间的差异的显著性。当比较多于2个组时,使用单向ANOVA来确定差异的显著性。
实施例1
缩短的p63-蛋白质结构域增强人心脏重编程
直接重编程是一种用于通过促成心脏成纤维细胞原位转分化为有功能的心肌细胞样细胞(iCM)来治疗心力衰竭的有前景的新策略。值得注意的是,三种心脏转录因子Gata4、Mef2c和Tbx5的组合可以将成纤维细胞转变为iCM。然而,最近的发现暗示,人细胞相比于啮齿动物细胞而言对于重编程是抵抗的,这可能是因为对于重编程基因激活的表观遗传约束。本公开内容涉及通过调节(例如,抑制;例如表观遗传效应的沉默)表观遗传调控基因p63(其已显示出增强多能干细胞分化)来增强iCM的心脏重编程效率和成熟。数据显示,p63-反式激活抑制结构域(TID;p63-TID)发挥重编程益处。
组蛋白脱乙酰酶(HDAC)家族去除乙酰化基团,并且导致在转录上对于心脏转分化基因形成凝聚的和更沉默的染色质。事实上,存在有证据证明,HDAC抑制剂增强心脏重编程。在本公开内容中考虑的是,p63-HDAC1复合物是否能够在影响心脏转录因子的基因转录中发挥主要作用。
如在图1A中所显示的,发明人通过共免疫沉淀(co-IP)测定法验证了p63-HDAC1相互作用。进一步地,考虑的是过表达p63-TID是否起作用以竞争在p63和HDAC1之间的蛋白质-蛋白质相互作用,从而因此它们的表观遗传相互作用可以通过使用p63-TID来特异性地靶向。如在图1B中所看到的,通过co-IP pulldown测定法证明,p63-TID片段过表达通过竞争性地与HDAC1相结合而减少了在ΔNP63α和HDAC1之间的结合。
获得了包含任选的标签(例如,HA标签)的示例性p63-TID肽(例如,SEQ ID NO:1)核苷酸编码序列(SEQ ID NO:2)以及包含其的核苷酸载体,并且展示在图4A-B中。
然后,发明人通过用编码p63-TID±Hand2/心肌素的慢病毒处理人心脏成纤维细胞证实了p63-TID对于心脏重编程的效应。在14天的培养后,使用qRT-PCR、流式细胞术和免疫荧光测定法就心肌细胞特异性特征变化对细胞进行了评估。由慢病毒介导的p63-TID过表达以及与之相组合的向人心脏成纤维细胞的Hand2/心肌素施用上调了与用p63 shRNA+Hand2/心肌素所看到的相同的一组心脏基因((+H/M)图2A-J),并且观察到p63-TID过表达类似地增加了表达cTnT和α-辅肌动蛋白的人心脏成纤维细胞的百分比(图2A-J)。用p63-TID+H/M进行处理的细胞展示出与由shp63+H/M所诱导的那种相似的一组心肌细胞标志物基因(cTnT、Gja1、Myh6)的增加的表达(图2I),以及与用shp63+H/M处理所取得的那种相当的成纤维细胞标志物基因(col1a1、Postn)的减少的表达(图2G)。令人感兴趣的是,单独的p63-TID过表达上调有利于心脏分化的一组基因(例如,CTnT、Gja1、α-辅肌动蛋白和Myh6)的表达,并且同样地下调与成纤维细胞特征相关联的基因(例如,col1a1和Postn)。
还向大鼠心脏成纤维细胞施用了示例性p63-TID(例如,SEQ ID NO:1)并且产生了当与对照相比较时更好的iCM重编程后果。如在图3中所展示的,通过qRT-PCR测定了在重编程因子施用后两周所示的心脏标志物(例如,cTnT、RyR、Pln和Actc1)和成纤维细胞标志物基因(例如,col1a1)的mRNA表达水平。在p63-TID+H/M施用的情况下观察到心脏发生基因表达水平的显著增加,同时也观察到成纤维细胞标志物col1a1的减少。
另外,FACS分析类似地证明,相比于shp63+H/M处理而言,在用p63-TID+H/M进行处理后,表达cTnT的人心脏成纤维细胞的百分比类似地增加(12.5%±0.9%和15.2%±1.1%,图2H)。免疫荧光研究也证明了相对于用shp63+GMT进行处理的细胞而言,在用p63-TID+H/M或shp63+H/M进行处理后,表达心肌细胞标志物cTnT和α-辅肌动蛋白的细胞的数目的相似的三倍增加(p<0.001;图2D、E和I)。在重编程因子处理后四周,多至三倍的用p63-TID+H/M进行处理的细胞展现出α-肌节辅肌动蛋白+表达,并且经p63-TID+H/M处理的细胞展现出相比于用shp63和GMT进行处理的细胞而言前进的肌节组织结构(图2J)。
然后,发明人确定,p63沉默诱导了iCM收缩性。虽然未观察到用shp63+H/M或p63-TID+H/M进行处理的人心脏成纤维细胞独立地收缩,但是大约≈5%的用shp63+H/M或TID+H/M进行处理的人心脏成纤维细胞(如通过其GFP表达所验证的)在共培养4周后与周围的新生大鼠心肌细胞同步地收缩(图5)。相比而言,用GMT(具有或没有shp63)进行处理的人心脏成纤维细胞未能在共培养实验中收缩(参见例如,Pinnamaneni等人,p63 silencinginduces epigenetic modulation to enhance human cardiac fibroblast tocardiomyocyte-like differentiation.Scientific Reports(2022)12:11416;其通过提及而以其整体合并入本文以用于在本文中所描述的目的,Supplemental Videos S1、S2和/或S3)。用shp63+H/M或p63-TID+H/M进行处理的细胞也显现出在电刺激后的钙瞬变,其与它们的收缩功能是同步的,而在刺激用GMT(具有或没有shp63)进行处理的细胞后未观察到钙瞬变(图5,中间一排和最下面一排;和Pinnamaneni等人,2022,Supplemental Video S1、S2、S3,其通过提及而以其整体合并入本文以用于在本文中所描述的目的)。
然后,发明人测定了p63-TID剂量应答,并且鉴定出了在增强人心脏分化中的增强的p63-TID效力,当与shp63相比较时。为了确定在增强心脏分化中p63-TID是否比shp63更强有力,发明人利用Co-IP分析来生成产生随着p63-TID过表达的p63与HDAC1结合的剂量-应答分析(图6A)。以20、50或100的MOI用p63-TID进行处理的人心脏成纤维细胞的qRT-PCR分析显现出以剂量依赖性方式的增加的cTnT表达,其中50的MOI提供了最高的cTnT表达而没有细胞毒性(p<0.001;图6B)。因此,发明人能够使用以50的MOI进行处理的人心脏成纤维细胞的qRT-PCR来证明相对于shp63+H/M处理而言在p63-TID+H/M处理后心脏发生和纤维发生基因表达的显著更大的变化(p<0.05,图6C-D)。
如在本文中和在Pinnamaneni等人,2022中所描述的,发明人显示,可以通过由p63的表观遗传效应的沉默介导的重编程策略来将啮齿动物以及人心脏成纤维细胞转变为收缩性iCM。特别地,发明人证明,与心脏分化因子Hand2和心肌素(H/M)相组合的shp63导致增强的新生、成年大鼠和成人人心脏成纤维细胞分化,相比于用单独的标准重编程混合物(即,Gata4、Mef2c和Tbx5[GMT])处理它们而言(参见例如,引文5、10和34,其各自通过提及而合并入本文以用于在本文中所描述的目的)。相比而言,无论shp63还是H/M(单独的)均未发挥显著的重编程效应。
在这些研究中所描述的对于p63的关注源自于这样的观察结果,即表观遗传调控蛋白的p53家族在阻碍诱导型多能干细胞(iPSC)重编程中发挥重要作用(参见例如,引文18-20、23、35和36,其各自通过提及而合并入本文以用于在本文中所描述的目的)。发明人假设,p63(其看起来在阻遏iPSC重编程中发挥与p53相似的作用,而没有它的致癌效应)的沉默可能是理想的用于增强心脏细胞转分化和iCM生成的重编程试剂(参见例如,引文24、37-43,其各自通过提及而合并入本文以用于在本文中所描述的目的)。在本文中和在Pinnamaneni等人,2022中所描述的结果确证了发明人的假设并且特别地将p63与表观遗传阻遏物HDAC1的相互作用鉴定为构成该效应的基础的潜在作用机制。p63与HDAC1相互作用以起始表观遗传重新模制(re-patterning)并且调节心脏分化基因启动子这一发现确证了表观遗传调节作为人心脏细胞重编程的重要调控物的作用(参见例如,引文44和45,其各自通过提及而合并入本文以用于在本文中所描述的目的)。
p63的两种主要同种型(TAp63、ΔNp63)的C-末端都包含反式激活抑制结构域(TID),其已被报道经由其与HDAC1的相互作用而在基因调控中发挥重要作用(参见例如,引文26,其通过提及而合并入本文以用于在本文中所描述的目的)。因此,发明人假设,TID的过表达可以替换shRNA的使用,以抑制p63的表观遗传效应以及相关联的细胞重编程的抑制。在本文中所提供的结果证明,p63-TID可以以这种方式进行使用,并且增强心脏发生重编程基因激活。虽然不受理论限制,但是可以将相比于使用标准重编程混合物而言p63沉默策略在诱导收缩性iCM中的效力与所观察到的其在影响不同的一组相关心脏发生和纤维发生基因的调控中的效应相关联。相比而言,标准重编程混合物要求施用这些作为组成部分的重编程因子中的每一种以便取得功效(参见例如,引文11、31、34和46-48,其各自通过提及而合并入本文以用于在本文中所描述的目的)。在该情景下,虽然不受理论限制,但是添加H/M作为对于p63沉默的补充物可能涉及H/M作为补足关键心脏分化因子例如GMT(其否则通过所描述的p63沉默策略上调)的“缺失的要素”的状态。同样令人感兴趣的是,p63沉默导致已知阻碍心脏分化的纤维发生基因的下调,其他人已通过向重编程混合物添加额外的可能不希望的抗纤维发生因子来解决这个问题(参见例如,引文9、10和46-48,其各自通过提及而合并入本文以用于在本文中所描述的目的)。
总之,在本文中所描述和所证明的结果显示,p63-反式激活抑制结构域(TID)(负责与表观遗传调节物组蛋白脱乙酰酶1(HDAC1)的结合的p63基序)的过表达是在增强人心脏分化中对于shp63的强有力的替代物。进一步地,在本文中所呈现的结果暗示,p63作为对于人心脏重编程的表观遗传屏障起作用,并且p63-TID提供了用于靶向心脏发生基因激活的表观遗传调控的新的潜在策略,作为用于增强人心脏重编程和/或治疗和/或预防在本文中所描述的疾病(例如但不限于,心脏相关适应症)的手段。
实施例2
与Hand2/心肌素和ETV2或VEGF一起的p63-TID增强人心脏重编程
如在图7A-B中所显示的,用编码GFP(adGFP)、ETV2(adETV2)或VEGF(adVEGF)的腺病毒处理人心脏成纤维细胞,并且在七天后用编码GFP、GMT、GMTd或TIDH/M的腺病毒处理细胞14天。结果显示,当与对照相比较时,cTnT标志物基因表达在TIDH/M处理组中显著地增加,如在所示的处理后通过qRT-PCR所评估的(n=3)。将数据呈现为倍数变化,并且内部对照为GAPDH。
如在7C-D中所显示的,用编码GFP(adGFP)、ETV2(adETV2)或VEGF(adVEGF)的腺病毒处理人心脏成纤维细胞,具有或没有同时的用编码GFP、GMT、GMTd或TIDH/M的腺病毒进行的处理。两周后,在所示的处理后通过qRT-PCR评估cTnT标志物基因表达(n=3),结果显示,当与对照相比较时,cTnT标志物基因表达在TIDH/M处理组中显著地增加。将数据呈现为倍数变化,并且内部对照为GAPDH。
总之,这些结果显示,TIDH/M与ETV2或VEGF的同时和/或延迟的施用显著地改善了心肌重编程。
参考文献
以它们提供作为对于在本文中所阐述的那些的补充的示例性的程序上或其他细节的程度,下面的参考文献通过提及而特别地合并入本文。
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按照本公开内容,可以进行和施行所有在本文中所公开和要求保护的方法,而无需过度的实验。虽然已依照优选的实施方案描述了本发明的组合物和方法,但是对于本领域技术人员来说将会明显的是,可以对所述方法和在本文中所描述的方法的步骤或步骤顺序中施加变化,而不背离本发明的构思、精神和范围。更特别地,将会明显的是,某些在化学上和在生理学上都相关的试剂可以替换在本文中所描述的试剂,而将会取得相同或相似的结果。所有对于本领域技术人员来说明显的此类相似的替换和修饰都被认为在由所附权利要求书所定义的本发明的精神、范围和构思之内。
Claims (109)
1.组合物,所述组合物包含重组蛋白质和/或编码其的重组核酸,所述重组蛋白质由或基本上由p63-反式激活抑制结构域(p63-TID)多肽或者其功能性衍生物和/或功能性片段组成;其中所述p63-TID多肽包含下述序列、基本上由下述序列组成、由下述序列组成或者为下述序列:与SEQ ID NO:1至少或正好70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%同一的序列。
2.根据权利要求1所述的组合物,其中所述p63-TID多肽包含下述序列、由下述序列组成或者基本上由下述序列组成:SEQ ID NO:1的序列。
3.根据权利要求1或2所述的组合物,其中所述多肽被包含在药学上可接受的载剂中。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的组合物,其中所述其功能性衍生物或片段包含相比于SEQ ID NO:1而言1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20或者更多个氨基酸改变。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的组合物,其中所述其功能性衍生物和/或功能性片段包含SEQ ID NO:1的N-末端截短。
6.根据权利要求5所述的组合物,其中所述截短不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60个氨基酸,或者其中所述截短为至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60个氨基酸。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的组合物,其中所述其功能性衍生物和/或功能性片段包含SEQ ID NO:1的C-末端截短。
8.根据权利要求7所述的组合物,其中所述截短不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60个氨基酸,或者为至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60个氨基酸。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的组合物,其中所述其功能性衍生物和/或功能性片段包含SEQ ID NO:1中的内部缺失。
10.根据权利要求9所述的组合物,其中所述内部缺失不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60个氨基酸,或者为至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60个氨基酸。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的组合物,其中所述p63-TID功能性衍生物和/或片段可以包含与SEQ ID NO:1至少或正好70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%同一的序列。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的组合物,其中所述多肽是经标记的。
13.根据权利要求1-11中任一项所述的组合物,其中所述氨基酸中的一个或多个包含翻译后修饰。
14.根据权利要求13所述的组合物,其中所述翻译后修饰包括磷酸化、乙酰化、泛素化、酰化、甲基化或其组合。
15.组合物,所述组合物包含一种或多种重组核酸,其中所述核酸编码根据权利要求1-14中任一项所述的多肽或者其功能性衍生物和/或功能性片段。
16.根据权利要求15所述的组合物,其中所述核酸为DNA。
17.根据权利要求15所述的组合物,其中所述核酸为RNA。
18.根据权利要求15-17中任一项所述的组合物,其中所述核酸被包含在一种或多种病毒载体中。
19.根据权利要求18所述的组合物,其中所述病毒载体为慢病毒载体。
20.根据权利要求18所述的组合物,其中所述病毒载体为腺病毒载体。
21.根据权利要求18所述的组合物,其中所述病毒载体为腺伴随病毒(AAV)病毒载体。
22.根据权利要求15-17中任一项所述的组合物,其中所述核酸被包含在非病毒载体中。
23.根据权利要求15-22中任一项所述的组合物,其中所述核酸被包含在药学上可接受的载剂中。
24.组合物,所述组合物包含一种或多种核酸载体,所述载体包含根据权利要求1-23中任一项所述的组合物,和任选地包含一种或多种心脏细胞重编程因子。
25.根据权利要求24所述的组合物,其中包含根据权利要求1-23中任一项所述的组合物的载体与包含一种或多种心脏细胞重编程因子的载体是相同的载体。
26.根据权利要求24所述的组合物,其中包含根据权利要求1-23中任一项所述的组合物的载体与包含一种或多种心脏细胞重编程因子的载体是不同的载体。
27.根据权利要求24-26中任一项所述的组合物,其进一步包含有包含一种或多种染色质去稳定剂的载体。
28.根据权利要求27所述的组合物,其中包含根据权利要求1-27中任一项所述的组合物的载体与包含一种或多种染色质去稳定剂的载体是相同的载体。
29.根据权利要求27所述的组合物,其中包含根据权利要求1-28中任一项所述的组合物和包含一种或多种心脏细胞重编程因子的载体与包含一种或多种染色质去稳定剂的载体是相同的载体。
30.根据权利要求27所述的组合物,其中包含根据权利要求1-27中任一项所述的组合物和包含一种或多种心脏细胞重编程因子的载体与包含一种或多种染色质去稳定剂的载体是不同的载体。
31.根据权利要求1-30中任一项所述的组合物,其中所述组合物包含编码Hand2和心肌素之一或两者的核酸。
32.根据权利要求1-31中任一项所述的组合物,其中所述组合物包含编码Hand2的核酸。
33.根据权利要求1-32中任一项所述的组合物,其中所述组合物包含编码心肌素的核酸。
34.根据权利要求1-33中任一项所述的组合物,其中所述组合物包含编码Hand2和心肌素的核酸。
35.根据权利要求1-34中任一项所述的组合物,其包含一种或多种抗纤维化试剂。
36.根据权利要求1-35中任一项所述的组合物,其中所述组合物包含编码Hand2、心肌素和ETV2和/或VEGF的核酸。
37.根据权利要求36所述的组合物,其中所述ETV2和/或VEGF是经由一种或多种病毒载体可递送的。
38.根据权利要求37所述的组合物,其中所述病毒载体为慢病毒载体、腺病毒载体、腺伴随病毒载体或逆转录病毒载体。
39.根据权利要求38所述的组合物,其中所述病毒载体为腺病毒载体。
40.试剂盒,所述试剂盒包含根据权利要求1-39中任一项所述的组合物,所述组合物被容纳在合适的容器中。
41.心脏细胞的体内重编程的方法,所述方法包括向个体的心脏提供治疗有效量的一种或多种组合物的步骤,其中所述一种或多种组合物包含根据权利要求1-39中任一项所述的组合物。
42.治疗心脏状况的方法,所述方法包括向个体的心脏提供治疗有效量的一种或多种组合物的步骤,其中所述一种或多种组合物包含根据权利要求1-39中任一项所述的组合物。
43.根据权利要求41或42所述的方法,其进一步包括向所述个体提供有效量的一种或多种心脏细胞重编程因子的步骤。
44.根据权利要求43所述的方法,其中所述一种或多种心脏细胞重编程因子为多肽、肽或核酸。
45.根据权利要求43或44所述的方法,其中所述一种或多种心脏细胞重编程因子为Hand2、心肌素、Gata4、Mef2c、Tbx5、中胚层后部蛋白1(Mesp1)、miR-133、miR-1、Oct4、Klf4、c-myc、Sox2、Brachyury、Nkx2.5、ETS2、ESRRG、Mrtf-A、MyoD、ZFPM2或其组合。
46.根据权利要求43-45中任一项所述的方法,其中所述一种或多种心脏细胞重编程因子为Hand2和心肌素之一或两者的核酸或多肽。
47.根据权利要求46所述的方法,其中所述Hand2和心肌素之一或两者的核酸和/或多肽与根据权利要求1-39中任一项所述的组合物处于相同的组合物中。
48.根据权利要求46所述的方法,其中所述Hand2和心肌素之一或两者的核酸和/或多肽与根据权利要求1-39中任一项所述的组合物处于不同的组合物中。
49.根据权利要求43-48中任一项所述的方法,其中所述一种或多种组合物包含根据权利要求1-39中任一项的组合物和Hand2。
50.根据权利要求43-48中任一项所述的方法,其中所述一种或多种组合物包含根据权利要求1-39中任一项所述的组合物和心肌素。
51.根据权利要求43-48中任一项所述的方法,其中所述一种或多种组合物包含根据权利要求1-39中任一项所述的组合物、Hand2和心肌素。
52.根据权利要求43-51中任一项所述的方法,其中所述一种或多种组合物包含根据权利要求1-39中任一项所述的组合物、Hand2和心肌素以及VEGF和/或ETV2。
53.根据权利要求43-52中任一项所述的方法,其中根据权利要求1-39中任一项所述的组合物在所述一种或多种心脏细胞重编程因子之前提供。
54.根据权利要求43-52中任一项所述的方法,其中根据权利要求1-39中任一项所述的组合物在所述一种或多种心脏细胞重编程因子之后提供。
55.根据权利要求43-54中任一项所述的方法,其中在根据权利要求1-39所述的组合物中的任一种之前或与之同时地向所述个体提供有效量的VEGF和/或ETV2。
56.根据权利要求43-55中任一项所述的方法,其中向所述个体提供有效量的一种或多种染色质去稳定剂。
57.根据权利要求56所述的方法,其中所述一种或多种染色质去稳定剂选自由下列各项组成的组:Oct4、DZNep、Sall4、SOX2、KLF4、MYC、SB431542、PD0325901、Parnate、CHIR99021、A-83-01、NaB、PS48、弗司扣林(FSK)、2-甲基-5-羟色胺(2-Me-5HT)、D4476、VPA、CHIR99021(CHIR)、616452、反苯环丙胺、前列腺素E2、咯利普兰、3-脱氮腺苷环戊基类似物A(DZNep)、5-氮胞苷、丁酸钠、RG108及其组合。
58.根据权利要求56或57所述的方法,其中在向所述个体提供根据权利要求1-39中任一项所述的组合物之前向所述个体提供所述一种或多种染色质去稳定剂。
59.根据权利要求56或57所述的方法,其中在向所述个体提供根据权利要求1-39中任一项所述的组合物之前向所述个体提供所述一种或多种染色质去稳定剂,并且其中在向所述个体提供所述一种或多种心脏细胞重编程因子之前向所述个体提供根据权利要求1-39中任一项所述的组合物。
60.根据权利要求41-59中任一项所述的方法,其中所述心脏细胞为成纤维细胞、内皮细胞、成肌细胞、祖细胞、干细胞或其组合。
61.根据权利要求41-60中任一项所述的方法,其中根据权利要求1-39中任一项的组合物包含核酸,并且所述核酸被包含在一种或多种载体上。
62.根据权利要求43-61中任一项所述的方法,其中所述一种或多种心脏细胞重编程因子包含核酸,并且所述核酸被包含在一种或多种载体上。
63.根据权利要求56-62中任一项所述的方法,其中所述一种或多种染色质去稳定剂包含核酸,并且所述核酸被包含在一种或多种载体上。
64.根据权利要求61-63所述的方法,其中所述根据权利要求1-39中任一项所述的组合物的核酸、所述心脏细胞重编程因子的核酸和所述染色质去稳定剂的核酸被包含在分开的载体上。
65.根据权利要求61-63所述的方法,其中所述根据权利要求1-39中任一项所述的组合物的核酸、所述心脏细胞重编程因子的核酸和所述染色质去稳定剂的核酸被包含在相同的载体上。
66.根据权利要求64或65所述的方法,其中所述载体为病毒载体或非病毒载体。
67.根据权利要求66所述的方法,其中所述非病毒载体为纳米颗粒、质粒、脂质体或其组合。
68.根据权利要求66所述的方法,其中所述病毒载体为腺病毒、慢病毒、逆转录病毒或腺伴随病毒载体。
69.根据权利要求68所述的方法,其中所述病毒载体处于大约20、大约50或大约100的感染复数(MOI)。
70.根据权利要求69所述的方法,其中所述病毒载体处于大约50的MOI。
71.根据权利要求66-70中任一项所述的方法,其中根据权利要求1-39中任一项所述的组合物、Hand2和/或心肌素核酸被包含在慢病毒载体上。
72.根据权利要求66-70中任一项所述的方法,其中根据权利要求1-39中任一项所述的组合物、Hand2和/或心肌素核酸被包含在腺病毒载体上。
73.根据权利要求41-59中任一项所述的方法,其中所述一种或多种心肌细胞重编程因子包含核酸,并且所述核酸为DNA或RNA分子。
74.根据权利要求56-59中任一项所述的方法,其中所述一种或多种染色质去稳定剂包含核酸,并且所述核酸为DNA或RNA分子。
75.根据权利要求41-74中任一项所述的方法,其进一步包括向所述个体递送额外的心脏疗法的步骤。
76.根据权利要求75所述的方法,其中所述额外的心脏疗法包括药物疗法、外科手术、心室辅助装置(VAD)植入、电视辅助胸廓切开术(VAT)、冠状动脉搭桥、经皮冠状动脉介入(PCI)或其组合。
77.根据权利要求41-76中任一项所述的方法,其中所述心脏细胞为分裂性细胞或非分裂性细胞。
78.根据权利要求61-74中任一项所述的方法,其中在所述载体上的启动子为细胞特异性启动子。
79.根据权利要求61-74中任一项所述的方法,其中在所述载体上的启动子为成纤维细胞特异性启动子。
80.根据权利要求41-79中任一项所述的方法,其中将所述提供步骤进一步定义为将根据权利要求1-39中任一项所述的组合物注射到心脏中。
81.根据权利要求43-80中任一项所述的方法,其中如果所述一种或多种组合物包含一种或多种心肌细胞重编程因子,那么将所述提供步骤进一步定义为将一种或多种心肌细胞重编程因子注射到心脏中。
82.根据权利要求43-81中任一项所述的方法,其中如果所述一种或多种组合物包含一种或多种染色质去稳定剂,那么将所述提供步骤进一步定义为将所述一种或多种染色质去稳定剂注射到心脏中。
83.根据权利要求41-82中任一项所述的方法,其进一步包括提供一种或多种抗纤维化试剂的步骤。
84.根据权利要求83所述的方法,其中所述一种或多种抗纤维化试剂包括至少一种抗-Snail试剂。
85.根据权利要求84所述的方法,其中所述抗-Snail试剂为siRNA、shRNA、抗体或小分子。
86.根据权利要求41-85中任一项所述的方法,其中将所述一种或多种组合物递送至心肌瘢痕组织的一个或多个区域。
87.根据权利要求41-85中任一项所述的方法,其中将所述一种或多种组合物递送至一个或多个不是心肌瘢痕组织的区域。
88.根据权利要求41-85中任一项所述的方法,其中将所述一种或多种组合物全局性地递送至心脏。
89.根据权利要求41-88中任一项所述的方法,其中所述一种或多种组合物局限于瘢痕细胞。
90.根据权利要求89所述的方法,其中所述瘢痕细胞为成纤维细胞。
91.根据权利要求89或90所述的方法,其中所述细胞形成肌节。
92.根据权利要求89-91中任一项所述的方法,其中所述细胞能够收缩。
93.根据权利要求89-92中任一项所述的方法,其中所述一种或多种组合物包含核酸,所述核酸包含成纤维细胞特异性启动子。
94.根据权利要求93所述的方法,其中所述成纤维细胞特异性启动子为periostin。
95.根据权利要求89-94中任一项所述的方法,其中所述递送直接至心脏。
96.根据权利要求89-95中任一项所述的方法,其中通过使用心脏特异性载体来使所述递送局部化。
97.根据权利要求96所述的方法,其中所述心脏特异性载体为AAV(9)。
98.治疗心脏状况的方法,所述方法包括向个体的心脏提供治疗有效量的一种或多种组合物的步骤,其中所述一种或多种组合物包含下述组分、基本上由下述组分组成或由下述组分组成:
A)p63-反式激活抑制结构域(p63-TID)多肽和/或其功能性衍生物和/或功能性片段,和/或编码其的核苷酸;其中所述p63-TID多肽包含下述序列、基本上由下述序列组成、由下述序列组成或者为下述序列:与SEQ ID NO:1至少或正好70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%同一的序列;
B)Hand2多肽和/或其功能性衍生物和/或功能性片段,和/或编码其的核苷酸;
C)心肌素多肽和/或其功能性衍生物和/或功能性片段,和/或编码其的核苷酸;
D)ETV2多肽和/或其功能性衍生物和/或功能性片段,和/或编码其的核苷酸;和/或
E)VEGF多肽和/或其功能性衍生物和/或功能性片段,和/或编码其的核苷酸。
99.根据权利要求98所述的方法,其包括下述部分、基本上由下述部分组成或由下述部分组成:提供A、B、C和D。
100.根据权利要求98所述的方法,其包括下述部分、基本上由下述部分组成或由下述部分组成:提供A、B、C和E。
101.根据权利要求98-100中任一项所述的方法,其中D和/或E与A、B和C在同一天提供。
102.根据权利要求98-101中任一项所述的方法,其中D和/或E与A、B和C同时提供。
103.根据权利要求98-100中任一项所述的方法,其中D和/或E在A、B和C之前提供。
104.根据权利要求98-100或103中任一项所述的方法,其中D和/或E在A、B和C之前至少或正好1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28天或者其中可导出的任何范围提供。
105.根据权利要求98-100中任一项所述的方法,其中A、B和C在D和/E之前提供。
106.根据权利要求98-100或105中任一项所述的方法,其中A、B和C在D和/或E之前至少或正好1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28天或者其中可导出的任何范围提供。
107.根据权利要求98-106中任一项所述的方法,其中在纳米颗粒、质粒、脂质体、病毒载体或其任何组合中提供A、B、C、D和/或E。
108.根据权利要求98-107中任一项所述的方法,其中在病毒载体中提供A、B、C、D和/或E,其中所述病毒载体为腺病毒、慢病毒、逆转录病毒或腺伴随病毒载体。
109.根据权利要求108所述的方法,其中所述病毒载体为腺病毒载体。
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