CN118006692A - 一种miR-29b-3p过表达工程干细胞外泌体及其制备方法和应用 - Google Patents

一种miR-29b-3p过表达工程干细胞外泌体及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种miR‑29b‑3p过表达工程干细胞外泌体及其制备方法和应用，所述外泌体的制备方法，包括如下步骤：A、骨髓间充质干细胞的提取与培养；B、转染骨髓间充质干细胞，将传至第三代的骨髓间充质干细胞接种于六孔板，24小时后按照Lipofectamine 3000转染试剂盒的说明书将miR‑29b‑3p模拟物转入细胞中；C、外泌体分离，收集转染后的骨髓间充质干细胞培养上清液，离心后弃去沉淀，上清经超速离心后收集沉淀，PBS重悬，再次超速离心后弃上清，收集沉淀溶于PBS中，得到miR‑29b‑3p过表达工程干细胞外泌体溶液。本发明提供的miR‑29b‑3p过表达工程干细胞外泌体可以减轻眼角膜损伤修复中角膜组织炎症反应及角膜组织纤维化，有效改善角膜混浊，进行角膜损伤修复。

Description

一种miR-29b-3p过表达工程干细胞外泌体及其制备方法和 应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种miR-29b-3p过表达工程干细胞外泌体及其制备方法和应用。
背景技术
微小核糖核酸(microRNA,miR)已成为近年来一类公认的高度保守的短非编码核糖核酸，长约19至25个碱基，通过以序列特异性的方式控制靶向信使核糖核酸(mRNA)的稳定性和翻译，在各种生物过程中发挥重要作用。其中，miR-29b为miR-29家族成员之一，已经检测到miR-29b可通过靶向相关mRNA参与细胞外基质相关蛋白的翻译过程，包括胶原、纤维蛋白和弹性蛋白等，调节器官和组织的纤维化和细胞外基质重塑；且miR-29b也已被证实通过靶向抑制磷脂酰肌醇三羟基激酶(phosphoinositide-3kinase，PI3K)的85阿尔法亚基(p85α)来抑制经典通路PI3K/AKT通路的激活，进而调控细胞自噬调控的关键蛋白哺乳动物雷帕霉素靶蛋白的表达。
细胞自噬为机体内的一个正常生理过程，参与细胞稳态和生存机制。除此之外，细胞自噬也有其他广泛的生物功能，包括先天性免疫与适应性免疫的调节。细胞自噬激活似乎是细胞的一种自我保护机制，参与宿主对病原刺激的应答。此外，细胞自噬水平的损伤可导致组织纤维化。
临床上，角膜损伤是导致视力下降及盲的主要原因之一。角膜损伤愈合是一个复杂的过程，涉及细胞死亡、迁移、增殖、分化，先天性免疫反应和细胞外基质重塑。深层的角膜损伤则因严重的炎症反应及角膜基质层内肌成纤维细胞的增殖导致角膜混浊。目前针对角膜混浊的治疗方式主要是角膜移植术，但因供体有限等原因仍存在很多局限性。
骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是一种多能干细胞。研究发现，BMSCs来源的外泌体(Exosomes，Exos)是一种脂质双分子层结构囊泡，内涵DNA、RNA、miRNA等成分，可发挥生物调控作用。且其较易获得和保存，因此可以用作再生医学中基于BMSC的替代疗法，在药物递送及临床疑难问题的治疗中备受关注。目前，miR-29b-3p过表达工程外泌体在改善角膜损伤修复中的作用尚未见相关文献报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种miR-29b-3p过表达工程干细胞外泌体及其制备方法和应用。本发明提供的miR-29b-3p过表达工程干细胞外泌体可以减轻眼角膜损伤修复中角膜组织炎症反应及角膜组织纤维化，有效改善角膜混浊，进行角膜损伤修复。
本发明的第一方面，提供了一种miR-29b-3p过表达工程干细胞外泌体的制备方法，包括如下步骤：
A、骨髓间充质干细胞的提取与培养
B、转染骨髓间充质干细胞
将传至第三代的骨髓间充质干细胞以2×106个每毫升的密度接种于六孔板，24小时后按照Lipofectamine 3000转染试剂盒的说明书将miR-29b-3p模拟物转入细胞中；
C、外泌体分离
收集转染后的骨髓间充质干细胞培养上清液，离心后弃去沉淀，上清经超速离心后收集沉淀，PBS重悬，再次超速离心后弃上清，收集沉淀溶于PBS中，得到miR-29b-3p过表达工程干细胞外泌体溶液。
在其中一些优选的实施例中，所述miR-29b-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
在其中一些优选的实施例中，所述转染操作具体为：向试管中加入无血清细胞培养基、Lipofectamine 3000转染试剂，混匀后室温静置5分钟，然后再向其中加入无血清细胞培养基、miR-29b-3p模拟物、助转染试剂，混匀后室温静置20分钟；然后向其中补入无血清培养基，在孵箱中转染24小时。
本发明的第二方面，提供了根据上述的miR-29b-3p过表达工程干细胞外泌体的制备方法制备得到的miR-29b-3p过表达工程干细胞外泌体。
本发明的第三方面，提供了上述miR-29b-3p过表达工程干细胞外泌体在制备治疗眼角膜损伤药物中的应用。
在其中一些优选的实施例中，所述的眼角膜损伤为机械性外伤所致的眼角膜损伤。
在其中一些优选的实施例中，所述药物包括miR-29b-3p过表达工程干细胞外泌体以及药学上可接受的辅料。
在其中一些优选的实施例中，所述药物以miR-29b-3p过表达工程干细胞外泌体为唯一活性组分。
在其中一些优选的实施例中，所述药物为眼液剂或注射剂。
具体地，当所述药物为眼液剂或注射剂时，还包括稀释液，所述稀释液优选为PBS。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明针对眼角膜损伤修复治疗中无特效改善角膜混浊药物，减轻眼角膜损伤修复中角膜组织炎症反应及角膜组织纤维化是治疗角膜混浊的关键。根据细胞自噬在眼角膜组织损伤修复中发挥重要作用的特点，提供了miR-29b-3p过表达工程干细胞外泌体。通过实验证实，miR-29b-3p过表达工程小鼠骨髓间充质干细胞外泌体在动物水平上可有效缓解小鼠眼角膜机械性损伤修复中眼角膜组织炎症反应，抑制小鼠眼角膜组织纤维化，缓解了小鼠机械性损伤所致的角膜混浊，且治疗效果明显优于小鼠骨髓间充质干细胞外泌体，为机械性眼角膜损伤治疗提供了一种新思路，具有制备机械性眼角膜损伤救治药物的前景。
附图说明
为了更清楚的说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见的，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它附图。
图1A为原代小鼠骨髓间充质干细胞标志蛋白的流式细胞分析结果；
图1B为miR-29b-3p过表达工程小鼠骨髓间充质干细胞与对照小鼠骨髓间充质干细胞内miR-29b-3p的表达水平；
图1C为miR-29b-3p过表达工程小鼠骨髓间充质干细胞外泌体与对照小鼠骨髓间充质干细胞外泌体标志蛋白蛋白印迹结果；
图1D为miR-29b-3p过表达工程小鼠骨髓间充质干细胞外泌体与对照小鼠骨髓间充质干细胞外泌体透射电镜照片；
图1E为miR-29b-3p过表达工程小鼠骨髓间充质干细胞外泌体与对照小鼠骨髓间充质干细胞外泌体内miR-29b-3p的表达水平；
图1F为miR-29b-3p过表达工程小鼠骨髓间充质干细胞外泌体与对照小鼠骨髓间充质干细胞外泌体的纳米粒径追踪结果。
图2A为miR-29b-3p过表达工程小鼠骨髓间充质干细胞外泌体对机械损伤小鼠眼角膜炎症表现及角膜上皮愈合的影响；
图2B为miR-29b-3p过表达工程小鼠骨髓间充质干细胞外泌体对机械损伤小鼠眼角膜炎症评分的影响；
图2C为miR-29b-3p过表达工程小鼠骨髓间充质干细胞外泌体对机械损伤小鼠眼角膜miR-29b-3p表达量的影响；
图2D为miR-29b-3p过表达工程小鼠骨髓间充质干细胞外泌体对机械损伤小鼠眼角膜治疗3天后角膜组织病理切片的结果；
图2E为miR-29b-3p过表达工程小鼠骨髓间充质干细胞外泌体对机械损伤小鼠眼角膜自噬小体数量的影响；
图2F为miR-29b-3p过表达工程小鼠骨髓间充质干细胞外泌体对机械损伤小鼠眼角膜自噬相关蛋白表达量的影响；
图2G为miR-29b-3p过表达工程小鼠骨髓间充质干细胞外泌体对机械损伤小鼠眼角膜组织内PI3K及PI3K磷酸化表达量的影响；
图2H为miR-29b-3p过表达工程小鼠骨髓间充质干细胞外泌体对机械损伤小鼠眼角膜组织内AKT及AKT磷酸化表达量的影响；
图2I为miR-29b-3p过表达工程小鼠骨髓间充质干细胞外泌体对机械损伤小鼠眼角膜组织内mTOR/NF-κB/IL-1β通路表达量的影响；
图3A为miR-29b-3p过表达工程小鼠骨髓间充质干细胞外泌体对机械损伤小鼠眼角膜组织混浊表现及角膜上皮愈合的影响；
图3B为miR-29b-3p过表达工程小鼠骨髓间充质干细胞外泌体对机械损伤小鼠眼角膜组织混浊评分的影响；
图3C为miR-29b-3p过表达工程小鼠骨髓间充质干细胞外泌体对机械损伤小鼠眼角膜组织miR-29b-3p表达量的影响；
图3D为miR-29b-3p过表达工程小鼠骨髓间充质干细胞外泌体对机械损伤小鼠眼角膜组织肌成纤维细胞相关蛋白及细胞外基质相关蛋白表达的影响；
图3E为miR-29b-3p过表达工程小鼠骨髓间充质干细胞外泌体对机械损伤小鼠眼角膜治疗1周及2周后角膜组织病理切片的结果。
具体实施方式
下面将结合具体实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通的技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明的保护范围。
实施例1
过表达miR-29b-3p工程小鼠骨髓间充质干细胞外泌体的制备。
1、原代小鼠骨髓间充质干细胞(pBMSCs)的提取与培养
A、组织块培养法
三至五周龄的雄性C57BL/6J小鼠脱颈处死后立刻泡入75％的酒精中，并转移至无菌操作台内，解剖出髂骨、股骨以及胫骨并使用大量无菌PBS进行冲洗。剪去两端骨骺暴露出骨髓腔，使用1毫升无菌注射器吸取培养基将骨髓冲出，需反复冲洗骨髓腔直至所有骨髓组织被冲出。将冲出的骨髓组织及培养基吹打混匀，均匀的点在培养皿中，放入37℃，5％二氧化碳的孵箱中进行培养。培养基为Cyagen小鼠骨髓间充质干细胞完全培养基。最初的一周每天更换培养基，至细胞80％至90％融合度时进行传代。
B、细胞鉴定
将传至第三代的小鼠骨髓间充质干细胞制成细胞悬液，与间充质干细胞相关标记蛋白的抗体共同孵育，使用PBS(磷酸盐缓冲液)洗去多余抗体后将细胞用流式细胞仪进行鉴定检测。
结果如图1A所示，间充质干细胞的标志性蛋白CD90、CD105、CD44均阳性表达，而CD34、CD45为阴性表达。
2、细胞转染
miR-29b-3p的核苷酸序列如下：3′-UUGUGACUAAAGUUU-ACCACGAU-5′(SEQ IDNO.1)。
传至第三代的小鼠骨髓间充质干细胞以2×106每毫升的密度接种于6孔板中，当细胞达80％融合度时，使用按照Lipofectamine 3000转染试剂盒的说明书，将miR-29b-3p模拟物及对照序列分别转入细胞中，转染时使用HyClone无血清DMEM/F-12细胞培养基。具体方法：传至第三代的小鼠骨髓间充质干细胞以2×106个每毫升的密度接种于六孔板，24小时后按照Lipofectamine 3000转染试剂盒的说明书将miR-29b-3p模拟物转入细胞中。以每孔为单位转染方法如下，1.5毫升EP管中加入100微升无血清细胞培养基、2微升Lipofectamine 3000转染试剂，移液枪轻柔吹打混匀后室温静置五分钟，然后再向其中加入100微升无血清细胞培养基、2微升miR-29b-3p模拟物、2微升的助转染试剂，移液枪吹打混匀后室温静置20分钟。将以上体系加入孔中并加入800微升的无血清培养基将总体积补充至1毫升。37℃，5％二氧化碳，孵箱中转染24小时。转染24h后，更换为Cyagen小鼠骨髓间充质干细胞完全培养基培养基,24小时后收集培养基，再次更换培养基，再次于24小时后收集培养基。
3、细胞转染后细胞内miR-29b表达检测
A、细胞内总RNA的提取
收集培养基后，使用天根总RNA提取试剂盒提取小鼠骨髓间充质干细胞RNA。用无菌PBS缓冲液洗涤细胞两次后，每孔中加入Redzol溶液1毫升，并确定Redzol溶液覆盖全部细胞将6孔板平放在冰上再放置摇床上裂解15分钟。随后将细胞培养板移入无菌工作台中,用移液器轻柔吹打后移至DEPC水处理的1.5毫升的EP管中，随后严格按照试剂盒说明书进行操作，每孔细胞所提取得到的RNA溶于30微升的无菌无酶水中。
B、反转录合成cDNA
检测样本RNA浓度后，将RNA反转录合成cDNA，2微克mRNA样本中加入4微升的5×M-MLV反转录缓冲液、0.75微升dNTP混合物、0.5微升5×M-MLV反转录酶缓冲液,1.2微升U6反转录引物与1.2微升miR-29b-3p反转录引物，最后加入DEPC水将总体积补充至20微升。反转录程序设置如下：75℃(30分钟)，42℃(30分钟)，85℃(5分钟)，4℃保持。5×M-MLV反转录缓冲液、5×M-MLV反转录酶缓冲液、dNTP混合物为美国Invitrogen公司产品，引物为上海生工生物有限公司。
C、实时荧光定量聚合酶链式反应(Rt-PCR)
实时定量PCR反应体系如下：10微升SYBR Premix Ex TaqⅠ、0.5微升PCR上游引物、0.5微升PCR下游引物、2微升cDNA样品,最后加入DEPC水将总体积补充至20微升。Rt-PCR程序设置如：95℃(30秒)，59℃(30秒)，74℃(30秒，)以上程序反复进行55个循环；95℃(15秒)，60℃(30秒)，95℃(15秒)，4℃，终止。U6作为内参，2-ΔΔCt法对数据进行分析计算各组细胞miR-29b的相对表达量。
SYBR Premix Ex TaqⅠ为日本Takara大连宝生物公司产品，引物为上海生工生物有限公司。
miR-29b-3p的核苷酸序列如下：3′-UUGUGACUAAAGUUU-ACCACGAU-5′(SEQ IDNO.1)。miR-29b-3p正向引物序列(5′-3′)：CTGCCGTAGCACCATTTGA(SEQ ID NO.2)；miR-29b-3p反向引物序列(5′-3′)：TATCCTTGTTCACGACTCCTTCAC(SEQ ID NO.3)。
结果如图1B显示，过表达miR-29b-3p工程小鼠骨髓间充质干细胞(pBMSCs-29b)内miR-29b的表达量与对照组小鼠骨髓间充质干细胞(pBMSCs-NC)相比显著升高，差异有统计学意义。pBMSCs-NC内miR-29b的表达量与未经任何处理的原代小鼠骨髓间充质干细胞(pBMSCs)相比差异无统计学差异。
4、外泌体提取与鉴定
A、外泌体提取
收集转染后小鼠骨髓间充质干细胞培养上清液，采用超速离心法从中提取外泌体，步骤如下：1000g、4℃离心30分钟后弃去沉淀，上清经100000g、4℃离心70分钟后收集沉淀并用5毫升PBS重悬，再次经100000g、4℃，离心70分钟后收集沉淀溶于100微升PBS中，得到的外泌体溶液。
B、外泌体鉴定
通过透射电镜观察及纳米颗粒追踪技术检测发现外泌体进行外观及直径鉴定。外泌体总蛋白样本制备：直接向超速离心所得的外泌体中加入含有蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液并静置于冰上进行裂解，每5分钟涡旋10秒，重复3次。按照BCA蛋白定量试剂盒说明书对样本的蛋白浓度进行检测。在样本中加入5×蛋白上样缓冲液，使用移液枪轻柔吹打混匀后，100℃煮10分钟制得蛋白上样样本。蛋白印迹法对外泌体中的标志性蛋白HSP70、TSG101和Calnexin的表达进行检测。
通过电镜观察，如图1D所示，制备得到的外泌体呈囊泡状；如图1F所示，纳米颗粒追踪技术检测发现囊泡直径约40-100纳米；如图1C所示，过表达miR-29b-3p工程小鼠骨髓间充质干细胞外泌体(Exos-miR-29b)及对照组小鼠骨髓间充质干细胞外泌体(Exos-NC)中HSP70、TSG101呈阳性表达，Calnexin呈阴性表达。
C、外泌体中miR-29b-3p表达水平的鉴定
向所得外泌体溶液中直接加入Redzol溶液1毫升，随后严格按照说明书进行操作，最后所得RNA溶于20微升DEPC水中。随后如前所述进行RNA反转录为cDNA，步骤同实施例1的3-B部分。所得产物进行rt-PCR对miR-29b-3p表达水平的检测，步骤同实施例1的3-C部分。
结果如图1E所示，过表达miR-29b-3p工程小鼠骨髓间充质干细胞外泌体(Exos-miR-29b)内miR-29b的表达量与对照组小鼠骨髓间充质干细胞外泌体(Exos-NC)中相比显著升高，差异有统计学意义。
实施例2miR-29b-3p过表达工程小鼠骨髓间充质干细胞外泌体提高眼角膜机械损伤致眼角膜炎症水平
1、小鼠眼角膜机械性损伤动物模型的建立
使用戊巴比妥钠溶液(70mg/kg)和盐酸丙拉卡因滴眼液麻醉六至八周龄雄性C57BL/6J小鼠。在体式显微镜下进行后续操作，用2.5毫米环钻标记小鼠眼角膜后，用AlgerBrush II刮除标记范围内整个眼角膜上皮和浅层角膜基质。在眼角膜损伤后一周内，根据分组分别应用miR-29b-3p过表达工程小鼠骨髓间充质干细胞外泌体、对照小鼠骨髓间充质干细胞外泌体或PBS以眼液剂方式进行给药，每天3次，每次每只眼睛5微升。
2、小鼠眼角膜炎症临床表现
正常小鼠眼角膜受机械损伤后第三天，使用使用戊巴比妥钠溶液(70mg/kg)麻醉小鼠后使用裂隙灯对各组小鼠眼角膜进行观察。荧光色素钠染色观察小鼠角膜上皮愈合，在明场下进行炎症评分，评分标准如下(从轻度到重度)：睫状体充血(0-3分)、中央角膜水肿(0-3分)以及周边角膜水肿(0-3分)，以上三方面总分再除以9。
结果显示治疗后三天，裂隙灯明场结果如图2A显示，PBS组小鼠角膜中央及周边均有明显水肿，角膜呈云雾状，虹膜纹理不可见，明显的睫状充血并出现新生血管。Exos-NC组小鼠角膜中央水肿较明显，虹膜纹理尚可辨别，睫状充血。Exos-miR-29b组小鼠角膜轻微水肿，虹膜纹理清晰且可见瞳孔，轻度的睫状充血。进行角膜炎症评分的结果如图2B显示，PBS组小鼠角膜评分明显高于其他两组，Exos-29b组小鼠角膜评分又低于Exos-NC，差异有统计学意义。此外，如图2A显示，PBS组角膜上皮愈合显著慢于其他两组，而Exos-NC与Exos-29b两组间没有显著差异。
3、小鼠眼角膜病理切片的苏木素伊红染色
为进一步观察各组小鼠眼角膜组织内炎性细胞浸润情况，在正常小鼠眼角膜受机械损伤后第三天对各组小鼠行脱颈处死后立刻摘取眼球并在无菌生理盐水中冲洗掉血迹和动物毛发，随后将眼球浸泡入体积分数为4％的多聚甲醛中固定，4℃冰箱中固定24小时。随后使用二甲苯和不同浓度的乙醇对小鼠眼球进行常规梯度脱水后将眼球依次浸于下列溶液中：二甲苯石蜡混合液(1：1，30分钟)、石蜡Ⅰ(60分钟)、石蜡Ⅱ(60分钟)。随后进行包埋并切片，制成厚度为4微米厚的石蜡切片并在60℃的烘箱中进行烤干。苏木素伊红染色步骤如下：脱蜡，水化，去离子水浸泡，苏木精染色(5分钟)，去离子水洗去多余染液(可多次浸洗)，分化，伊红染色(2分钟)，脱水，透明，封片。使用正置显微镜进行观察。
结果如图2D所示，PBS组小鼠角膜伤口边缘处可见有1-2层上皮细胞迁移，上皮及基质中均有大量炎症细胞浸润。Exos-NC组角膜伤口边缘可见上皮增殖伴有炎症细胞浸润，基质亦可见炎性细胞浸润。Exos-29b组伤口处可见1-2层上皮细胞迁移，未见明显的炎症细胞浸润，仅基质层可见少量炎性细胞浸润
4、小鼠眼角膜内miR-29b的表达
为进一步观察miR-29b-3p过表达工程小鼠骨髓间充质干细胞外泌体对小鼠眼角膜组织内miR-29b表达的影响，在正常小鼠眼角膜受机械损伤后第三天对各组小鼠脱颈处死后立刻摘取完整眼角膜组织并在无菌生理盐水中冲洗掉血迹和动物毛发，置于1.5毫升EP管中，加入Redzol溶液1毫升，严格按照说明书进行操作，最后所得RNA溶于35微升DEPC水中。随后如前所述进行RNA反转录为cDNA，步骤同实施例1中的3B部分。所得产物进行rt-PCR对miR-29b-3p表达水平的检测，步骤同实施例1中3C部分。
结果如图2C所示，与正常组相比，PBS组小鼠角膜内miR-29b的表达下降，差异有统计学意义。Exos-NC组与正常组相比差异无统计学意义。Exos-miR-29b组小鼠角膜内miR-29b表达水平显著上升，与其他两组差异有统计学意义。以上结果显示，与其他两组相比，Exos-miR-29b点眼治疗后，小鼠角膜组织内miR-29b的表达显著升高。
5、小鼠眼角膜内NF-κB与白介素1-β的表达
为进一步观察miR-29b-3p过表达工程小鼠骨髓间充质干细胞外泌体对小鼠眼角膜组织内NF-κB与白介素1-β的表达的影响，在正常小鼠眼角膜受机械损伤后第三天、第七天对各组小鼠行脱颈处死后立刻摘取完整眼角膜组织并在无菌生理盐水中冲洗掉血迹和动物毛发，置于1.5毫升EP管中，加入含有蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液后，将眼角膜组织进行超声破碎后置于冰上，每5分钟涡旋10秒，重复6次。放入4℃预冷的高转速离心机5000g离心15分钟，取上清，检测蛋白浓度后，先样本中加入相应体积的碧云天5×蛋白上样缓冲液，移液枪轻柔吹打混匀，100℃煮10分钟，制得蛋白上样样品。随后使用蛋白印迹法检测各组眼角膜蛋白样品中NF-κB与白介素1-β的表达。
结果如图2I所示，治疗后第三天及第七天，PBS组NF-κB及IL-1β的表达水平较正常组升高，差异有统计学意义。Exos-miR-29b组NF-κB及IL-1β的表达水平较其他两组均下降，差异有统计学意义。
实施例3miR-29b-3p过表达工程小鼠骨髓间充质干细胞外泌体改善眼角膜机械损伤致细胞自噬水平
1、透射电镜
为进一步观察miR-29b-3p过表达工程小鼠骨髓间充质干细胞外泌体对小鼠眼角膜组织内自噬小体及自噬溶酶体数量的影响，在正常小鼠眼角膜受机械损伤后第七天对各组小鼠行脱颈处死后立刻摘取完整眼球并在无菌生理盐水中冲洗掉血迹和动物毛发，置于1.5毫升EP管中，加入2.5％戊二醛1毫升进行固定。在室温下固定24小时后，所有组的眼球用乙醇和丙酮脱水并包埋在环氧树脂中。使用Ultracut超微切片机对眼球切片，制成60纳米超薄矢状切片并放置在槽栅上。用1％乙酸铀对切片进行复染后通过透射电镜进行观察。
结果如图2E所示，与正常组相比，PBS组角膜上皮细胞中自噬小体增多，这意味着损伤后小鼠角膜上皮细胞内自噬一定程度的被激活。Exos-NC组小鼠角膜上皮细胞内也可见自噬小体，但与PBS组并无显著差异。Exos-miR-29b组小鼠角膜上皮细胞内的自噬小体及自噬溶酶体较其他两组均显著增多，该结果说明Exos-miR-29b治疗后，小鼠眼角膜组织中细胞自噬水平显著升高。
2、蛋白印迹法检测小鼠眼角膜组织中自噬标志蛋白表达量
为进一步观察miR-29b-3p过表达工程小鼠骨髓间充质干细胞外泌体对小鼠眼角膜组织内细胞自噬标志蛋白表达的影响，分别将正常小鼠眼角膜受机械损伤后第三天、第七天的小鼠行脱颈处死后立刻摘取完整眼角膜组织并在无菌生理盐水中冲洗掉血迹和动物毛发，后续步骤同实施例2中的5部分，对各组小鼠眼角膜蛋白样品中的p62及LC3BⅠ及LC3BⅡ的表达量进行检测。
蛋白印迹结果如图2F所示，治疗后3天，与正常组相比，三组LC3B-II/I的表达增加而p62表达均下降，但其中Exos-miR-29b组LC3B-II/I的表达水平最高，p62表达水平最低，与PBS组及Exos-NC组相比差异有统计学意义。治疗后7天，三组LC3BII/I的表达较三天时均有所下降，但仍是Exos-miR-29b组LC3BII/I的表达水平最高。同样，三个治疗组小鼠角膜组织中p62的表达水平较三天时均有所上升，Exos-miR-29b组p62的表达水平仍为三组中最低。以上结果表明，小鼠角膜受损后三天时，角膜上皮中自噬水平轻度上调，Exos-miR-29b治疗后角膜上皮中自噬水平显著升高，但PBS组及Exos-NC组在七天时自噬水平下降与正常组无差异，但Exos-miR-29b组中小鼠眼角膜组织中，细胞自噬水平仍较其他两组有所提高。
3、蛋白印迹法检测小鼠眼角膜组织中PI3K/AKT/mTOR通路的激活水平
因文献显示，PI3K为miR-29b-3p的靶向基因，为进一步探讨miR-29b-3p过表达工程小鼠骨髓间充质干细胞外泌体对小鼠眼角膜组织内细胞自噬调控的作用机制，分别将正常小鼠眼角膜受机械损伤后第三天、第七天的小鼠行脱颈处死后立刻摘取完整眼角膜组织并在无菌生理盐水中冲洗掉血迹和动物毛发，后续步骤同实施例2中的5部分，
蛋白印迹结果如图2G所示，治疗后三天时，与正常组对比其他三组中PI3K(p85α)的表达均下调，Exos-miR-29b组PI3K(p85α)的表达下调较其他两组尤为显著。且在PBS组中，与正常组相比，PI3K磷酸化水平增高，两个治疗组PI3K的磷酸化水平则有所下降，其中，Exos-miR-29b组PI3K磷酸化水平最低。而在治疗后七天时，三组PI3K及p-PI3K的表达水平较治疗后三天时整体升高，但仍以Exos-miR-29b组PI3K(p85α)的表达下调最为显著。下游的AKT、p-AKT、及mTOR的表达进行检测。如图2H和图2I所示，结果显示，与正常组相比，治疗三天后，PBS组AKT磷酸化水平及mTOR表达水平增高，Exos-miR-29b组AKT磷酸化水平及mTOR表达水平则下降最为明显。治疗后七天，三个治疗组小鼠角膜中p-AKT及mTOR的表达水平整体升高，但Exos-miR-29b组AKT磷酸化水平及mTOR的表达水平仍最低。以上结果说明，Exos-miR-29b治疗后，抑制了小鼠眼角膜组织内PI3K/AKT/mTOR通路的激活，进而激活小鼠眼角膜组织内细胞自噬的水平。
实施例4miR-29b-3p过表达工程小鼠骨髓间充质干细胞外泌体改善眼角膜机械损伤致角膜混浊
1、小鼠眼角膜机械性损伤动物模型的建立
步骤同实施例2中的1部分，不同的是在治疗的第二周，给药途径由眼液剂改为注射剂，以上外泌体及PBS的给药途径改为每两天结膜下注射一次，每只眼睛5微升。
2、小鼠眼角膜纤维化临床表现
正常小鼠眼角膜受机械损伤后第一周(1W)及第二周(2W)，使用戊巴比妥钠溶液(70mg/kg)麻醉小鼠后使用裂隙灯对各组小鼠眼角膜进行观察。荧光色素钠染色观察小鼠角膜上皮愈合，在明场下进行角膜混浊评分，评分标准如下：0分＝角膜完全透明，1分＝虹膜细节可见的角膜雾状混浊，2分＝轻度虹膜细节模糊的角膜混浊，3分＝中度虹膜细节模糊，4分＝虹膜细节和瞳孔不可见的角膜混浊。
结果如图3A所示，治疗一周(1W)后，各组角膜上皮均已愈合。PBS组角膜水肿、混浊呈白色且虹膜纹理不可见，角膜新生血管。Exos-NC组角膜轻微水肿、角膜混浊呈云雾状但虹膜纹理尚可辨别，角膜新生血管。Exos-miR-29b组有角膜云翳但虹膜纹理清晰可辨，角膜缘轻微充血但未见明显新生血管。治疗二周后，各组小鼠角膜水肿均有不同程度的减轻，PBS组小鼠角膜表面形成一层致密的角膜血管翳，虹膜及瞳孔不能辨别，Exos-NC组小鼠角膜有角膜云翳形成，虹膜纹理隐约可见。Exos-miR-29b组小鼠仅有轻微角膜云翳，虹膜纹理及瞳孔可见。经角膜混浊评分后，如图3B所示，与PBS组小鼠相比，Exos-NC与Exos-miR-29b组小鼠的角膜混浊评分降低，Exos-miR-29b与Exos-NC组相比，角膜混浊评分也显著下降且差异有统计学意义。
3、小鼠眼角膜病理切片的苏木素伊红染色
为进一步观察各组小鼠眼角膜组织内角膜基质内细胞增殖及角膜基质形态，在正常小鼠眼角膜受机械损伤后第一周、第二周对各组小鼠行脱颈处死后立刻摘取眼球并在无菌生理盐水中冲洗掉血迹和动物毛发，随后步骤同实施例2中的3部分。
结果如图3E显示，与正常组相比，治疗后一周时，PBS组中角膜基质层肿胀，浅层基质中角膜基质细胞增殖，少量炎性细胞浸润。Exos-NC组角膜基质层水肿较PBS组有所减轻，浅层基质中仍可见一定数量的角膜基质细胞增殖及炎性细胞浸润。Exos-miR-29b组中小鼠角膜基质厚度显著下降，基质层中仅有少量细胞增殖。一周时三组上皮厚度无差异。治疗后第二周时，各组角膜上皮均较一周时增厚，但角膜基质厚度均较一周时有所下降，但PBS组小鼠角膜基质中仍可见肿胀增殖的角膜基质细胞，其他两组小鼠角膜则基质内排列较为规则，且其中Exos-miR-29b组小鼠角膜基质中纤维未见肿胀且排列最为整齐。以上结果说明，过表达miR-29b-3p工程小鼠骨髓间充质干细胞外泌体能有效促进小鼠的角膜机械损伤后基质修复并有效抑制角膜混浊。
4、小鼠眼角膜内miR-29b的表达
为进一步观察miR-29b-3p过表达工程小鼠骨髓间充质干细胞外泌体对小鼠眼角膜组织内miR-29b表达的影响，分别在正常小鼠眼角膜受机械损伤后第一周、第二周对各组小鼠行脱颈处死后立刻摘取完整眼角膜组织并在无菌生理盐水中冲洗掉血迹和动物毛发，加入Redzol后对角膜组织进行超声破碎，随后步骤严格按说明书进行操作。随后如前所述进行RNA反转录为cDNA，步骤同实施例1中的3B部分。所得产物进行rt-PCR对miR-29b-3p表达水平的检测，步骤同实施例1中3C部分。
结果如图3C显示，较正常组相比，PBS组小鼠眼角膜组织中miR-29b的表达量下降。经点眼治疗后第一周、第二周的小鼠眼角膜组织内，Exos-29b组与其他组相比miR-29b的表达显著升高差异均具有统计学意义。
5、小鼠眼角膜内肌成纤维细胞相关蛋白及细胞外基质相关蛋白的表达
为进一步观察miR-29b-3p过表达工程小鼠骨髓间充质干细胞外泌体对小鼠眼角膜组织内miR-29b表达的影响，分别在正常小鼠眼角膜受机械损伤后第一周、第二周对各组小鼠行脱颈处死后立刻摘取完整眼角膜组织并在无菌生理盐水中冲洗掉血迹和动物毛发，加入Redzol后对角膜组织进行超声破碎，随后步骤严格按说明书进行操作。RNA反转录为cDNA步骤如下，首先25微升RNA样品中加入2微升Oligo dT primer混匀后进行预变性(70℃，5分钟)，随后迅速置于冰上。再向其中补充8微升的5×M-MLV反转录缓冲液、4微升dNTP混合物、1微升5×M-MLV反转录酶缓冲液，反转录程序设为：42℃(60分钟)，94℃(10分钟)，4℃保持。所得产物进行rt-PCR对miR-29b-3p表达水平的检测，步骤同实施例1中3C部分，选用细胞骨架基因β-actin为内参。引物序列如下：
结果如图3D所示，PBS组在治疗后一周、二周时以上指标均显著上调，第二周时整体水平要低于第一周。而Exos-NC组及Exos-29b组以上指标与PBS组相比均下降，差异有统计学意义。且Exos-29b组与Exos-NC组相比以上指标也均表达下降，差异有统计学意义。综上所述，Exos-miR-29b治疗后，小鼠角膜内纤维化相关基因的表达下调，进而抑制小鼠角膜纤维化，缓解机械损伤所致小鼠眼角膜混浊。
以上借助具体实施例对本发明做了进一步描述，但是应该理解的是，这里具体的描述，不应理解为对本发明的实质和范围的限定，本领域内的普通技术人员在阅读本说明书后对上述实施例做出的各种修改，都属于本发明所保护的范围。

Claims (9)

1.一种miR-29b-3p过表达工程干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
A、骨髓间充质干细胞的提取与培养
B、转染骨髓间充质干细胞
将传至第三代的骨髓间充质干细胞以2×106个每毫升的密度接种于六孔板，24小时后按照Lipofectamine 3000转染试剂盒的说明书将miR-29b-3p模拟物转入细胞中；
C、外泌体分离
收集转染后的骨髓间充质干细胞培养上清液，离心后弃去沉淀，上清经超速离心后收集沉淀，PBS重悬，再次超速离心后弃上清，收集沉淀溶于PBS中，得到miR-29b-3p过表达工程干细胞外泌体溶液。
2.根据权利要求1所述的miR-29b-3p过表达工程干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，所述miR-29b-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
3.根据权利要求1所述的miR-29b-3p过表达工程干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，所述转染操作具体为：向试管中加入无血清细胞培养基、Lipofectamine 3000转染试剂，混匀后室温静置5分钟，然后再向其中加入无血清细胞培养基、miR-29b-3p模拟物、助转染试剂，混匀后室温静置20分钟；然后向其中补入无血清培养基，在孵箱中转染24小时。
4.根据权利要求1-3任一项所述的miR-29b-3p过表达工程干细胞外泌体的制备方法制备得到的miR-29b-3p过表达工程干细胞外泌体。
5.权利要求4所述的miR-29b-3p过表达工程干细胞外泌体在制备治疗眼角膜损伤药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的眼角膜损伤为机械性外伤所致的眼角膜损伤。
7.一种治疗眼角膜损伤的药物，其特征在于，所述药物包括miR-29b-3p过表达工程干细胞外泌体以及药学上可接受的辅料。
8.根据权利要求7所述的治疗眼角膜损伤的药物，其特征在于，所述药物以miR-29b-3p过表达工程干细胞外泌体为唯一活性组分。
9.根据权利要求7所述的治疗眼角膜损伤的药物，其特征在于，所述药物为眼液剂或注射剂。
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