CN118005800A - 多特异性抗体结构 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及一种多特异性抗体结构，其包含靶向第一抗原的抗原结合片段和TCRα链的恒定区，以及靶向第二抗原的抗原结合片段和TCRβ链的恒定区。本申请还涉及所述分离的抗原结合蛋白的制备方法和用途。
Description
技术领域
本申请涉及生物医药领域，具体的涉及一种新型的双/多特异性抗体结构。
背景技术
随着生物技术的发展，双特异性抗体已成为一类新的治疗性抗体。它们可以结合两个不同的靶标或者一个靶标上的两个不同的表位，从而产生优于单个抗体作用的加成或协同作用。研究人员对设计新的双特异性形式(如DVD-Ig、CrossMab、BiTE等)做了许多抗体工程化的尝试。然而，这些形式可潜在地具有在稳定性、溶解性、短半衰期和免疫原性方面的各种限制。
因此，亟需开发新形式的双抗/多抗结构，以解决现有技术中的双抗存在的问题。
发明内容
本申请提供了一种新型双特异性抗体/多特异性抗体平台，分别将二个单链可变区抗体(scFv/VHH)连接到人或鼠T细胞受体alpha及beta链恒定区(TCR constantregion)，通过TCR alpha及beta链恒定区相互配对、结合和二硫键加固，形成新型双抗体/多抗体构架平台。
本申请所述的抗原结合蛋白具有下述性质中的一种或多种：(1)增加一对二硫键有助于形成异二聚体，减少错配和提高结构的稳定性；(2)提高了所述抗原结合蛋白的产量；(4)重定向特异性免疫效应细胞对肿瘤的杀伤；(5)靶向一种以上的细胞表面抗原，从而提高靶向特异性；(6)通过阻断免疫检查点，改善治疗效能和持久性；(7)通过原位分泌抗体，降低脱靶毒性；(8)向肿瘤递送药物。
一方面，本申请提供了一种分离的抗原结合蛋白，其包含靶向第一抗原的抗原结合片段和TCRα链的恒定区，以及靶向第二抗原的抗原结合片段和TCRβ链的恒定区。
在某些实施方式中，所述靶向第一抗原的抗原结合片段为scFv或VHH。
在某些实施方式中，所述靶向第二抗原的抗原结合片段为scFv或VHH。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白不包含TCRα链的可变区。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白不包含TCRβ链的可变区。
在某些实施方式中，所述靶向第一抗原的scFv/VHH和所述TCRα链的恒定区通过铰链区相连。
在某些实施方式中，所述靶向第二抗原的scFv/VHH和所述TCRβ链的恒定区通过铰链区相连。
在某些实施方式中，所述铰链区包含IgG铰链区。
在某些实施方式中，所述铰链区包含IgG4铰链区。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述TCRα链的恒定区和所述TCRβ链的恒定区通过二硫键相连接。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述TCRα链的恒定区和所述TCRβ链的恒定区通过连接子相连接。
在某些实施方式中，所述连接子包含肽接头。
在某些实施方式中，所述连接子的氨基酸序列为GGGGS。
在某些实施方式中，所述第一抗原选自下组：ROR1、CD3、TIM3、CD19、PD-1和CD16A。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述第二抗原选自下组：ROR1、CD3、TIM3、CD19、PD-1和CD16A。
在某些实施方式中，所述第一抗原与所述第二抗原为同一抗原的不同抗原结合表位。
在某些实施方式中，所述第一抗原和所述第二抗原不同。
在某些实施方式中，靶向第一抗原的抗原结合片段为scFv。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述靶向第一抗原的scFv包含靶向第一抗原的抗体轻链可变区VL和靶向第一抗原的抗体重链可变区VH。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述靶向第一抗原的VH的N端和所述靶向第一抗原的VL的C端相连。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述靶向第一抗原的VH的C端和所述靶向第一抗原的VL的N端相连。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述靶向第一抗原的VH的C端与所述TCRα链的恒定区的N端相连。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述靶向第一抗原的VL的C端与所述TCRα链的恒定区的N端相连。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述靶向第一抗原的VH的N端与所述TCRα链的恒定区的C端相连。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述靶向第一抗原的VL的N端与所述TCRα链的恒定区的C端相连。
在某些实施方式中，所述靶向第二抗原的抗原结合片段为scFv。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述靶向第二抗原的scFv包含靶向第二抗原的抗体轻链可变区VL和靶向第二抗原的抗体重链可变区VH。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述靶向第二抗原的VH的N端和所述靶向第二抗原的VL的C端相连。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述靶向第二抗原的VH的C端和所述靶向第二抗原的VL的N端相连。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述靶向第二抗原的VH的C端与所述TCRβ链的恒定区的N端相连。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述靶向第二抗原的VL的C端与所述TCRβ链的恒定区的N端相连。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述靶向第二抗原的VH的N端与所述TCRβ链的恒定区的C端相连。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述靶向第二抗原的VL的N端与所述TCRβ链的恒定区的N端相连。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白还包含靶向第三抗原的结合结构域。
在某些实施方式中，所述靶向第三抗原的结合结构域包括scFv。
在某些实施方式中，所述第三抗原选自下组：ROR1、CD3、TIM3、CD19、PD-1和CD16A。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白还包含靶向第四抗原的结合结构域。
在某些实施方式中，所述靶向第四抗原的结合结构域包括scFv。
在某些实施方式中，所述第四抗原选自下组：ROR1、CD3、TIM3、CD19、PD-1和CD16A
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述靶向第三抗原的scFv与所述TCRα链的恒定区直接或间接相连。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述靶向第三抗原的scFv与所述TCRα链的恒定区通过IgG4铰链区相连。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述靶向第四抗原的scFv与所述TCRβ链的恒定区直接或间接相连。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述靶向第四抗原的scFv与所述TCRβ链的恒定区通过IgG4铰链区相连。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述靶向第三抗原的scFv包含靶向第三抗原的VH和靶向第三抗原的VL。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述靶向第三抗原的VH的N端和所述靶向第三抗原的VL的C端直接或间接相连。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述靶向第三抗原的VH的C端和所述靶向第三抗原的VL的N端直接或间接相连。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述靶向第三抗原的VH的N端与所述TCRα链的恒定区的C端直接或间接相连。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述靶向第三抗原的VH的C端与所述TCRα链的恒定区的N端直接或间接相连。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述靶向第三抗原的VL的N端与所述TCRα链的恒定区的C端直接或间接相连。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述靶向第三抗原的VL的C端与所述TCRα链的恒定区的N端直接或间接相连。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述靶向第四抗原的scFv包含靶向第四抗原的VH和靶向第四抗原的VL。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述靶向第四抗原的VH的N端和所述靶向第四抗原的VL的C端直接或间接相连。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述靶向第四抗原的VH的C端和所述靶向第四抗原的VL的N端直接或间接相连。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述靶向第四抗原的VH的N端与所述TCRβ链的恒定区的C端直接或间接相连。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述靶向第四抗原的VH的C端与所述TCRβ链的恒定区的N端直接或间接相连。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述靶向第四抗原的VL的N端与所述TCRβ链的恒定区的C端直接或间接相连。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述靶向第四抗原的VL的C端与所述TCRβ链的恒定区的N端直接或间接相连。
在某些实施方式中，所述靶向第一抗原的抗原结合片段为VHH。
在某些实施方式中，所述靶向第一抗原的VHH与所述TCRα链的恒定区直接或间接相连
在某些实施方式中，所述靶向第一抗原的VHH的C端与所述TCRα链的恒定区的N端直接或间接相连。
在某些实施方式中，所述靶向第一抗原的VHH与所述TCRα链的恒定区通过IgG4铰链区相连。
在某些实施方式中，所述靶向第二抗原的抗原结合片段为VHH。
在某些实施方式中，所述靶向第二抗原的VHH与所述TCRβ链的恒定区直接或间接相连。
在某些实施方式中，所述靶向第二抗原的VHH的C端与所述TCRβ链的恒定区的N端直接或间接相连。
在某些实施方式中，所述靶向第二抗原的VHH的C端与所述TCRβ链的恒定区通过IgG4铰链区相连。
在某些实施方式中，所述的分离的抗原结合蛋白，其还包含靶向第三抗原的抗原结合片段。
在某些实施方式中，所述靶向第三抗原的抗原结合片段为VHH。
在某些实施方式中，所述靶向第三抗原的VHH与所述TCRα链的恒定区直接或间接相连。
在某些实施方式中，所述靶向第三抗原的VHH的N端与所述TCRα链的恒定区的C端直接或间接相连。
在某些实施方式中，所述靶向第三抗原的VHH与所述TCRα链的恒定区通过IgG4铰链区相连。
在某些实施方式中，所述的分离的抗原结合蛋白，其还包含靶向第四抗原的抗原结合片段。
在某些实施方式中，所述靶向第四抗原的抗原结合片段为VHH。
在某些实施方式中，所述靶向第四抗原的VHH与所述TCRβ链的恒定区直接或间接相连。
在某些实施方式中，所述靶向第四抗原的VHH的N端与所述TCRα链的恒定区的C端直接或间接相连。
在某些实施方式中，所述靶向第四抗原的VHH与所述TCRβ链的恒定区通过IgG4铰链区相连。
另一方面，本申请还提供了分离的抗原结合蛋白，其包含两条多肽链，其中第一条多肽链包含靶向第一抗原的抗原结合片段和TCRα链的恒定区；其中第二条多肽链包含靶向第二抗原的抗原结合片段和TCRβ链的恒定区。
在某些实施方式中，所述靶向第一抗原的抗原结合片段和靶向第二抗原的抗原结合片段包括Fab、Fab’、F(ab)2、Fv片段、F(ab’)2、scFv、di-scFv、VHH和/或dAb。
在某些实施方式中，所述靶向第一抗原的抗原结合片为scFv或VHH。
在某些实施方式中，所述靶向第二抗原的抗原结合片为scFv或VHH。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白还包含靶向第三抗原的抗原结合片段。
在某些实施方式中，所述靶向第三抗原的结合结构域包含scFv或VHH。
在某些实施方式中，所述第三抗原选自下组：ROR1、CD3、TIM3、CD19、PD-1和CD16A。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述靶向第三抗原的scFv包含靶向第三抗原的VH和靶向第三抗原的VL。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白还包含靶向第四抗原的抗原结合片段。
在某些实施方式中，所述靶向第四抗原的抗原结合片段包括scFv或VHH。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述靶向第四抗原的scFv包含靶向第四抗原的VH和靶向第四抗原的VL。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述第一条多肽链与所述第二条多肽链通过二硫键连接。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述第一条多肽链中，所述靶向第一抗原的scFv和TCRα链的恒定区直接或间接相连。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述靶向第一抗原的scFv和TCRα链的恒定区通过铰链区相连。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述靶向第一抗原的scFv和TCRα链的恒定区通过IgG铰链区相连。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述靶向第一抗原的scFv和TCRα链的恒定区通过IgG4的铰链区相连。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述靶向第一抗原的scFv包含靶向第一抗原的VH和靶向第一抗原的VL。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述第一条多肽链从N端到C端依次包含：靶向第一抗原的VL、靶向第一抗原的VH、以及TCRα链的恒定区。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述第一条多肽链从N端到C端依次包含：靶向第一抗原的VL、连接子、靶向第一抗原的VH、IgG4的铰链区、以及TCRα链的恒定区。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述第一条多肽链从N端到C端依次包含：靶向第一抗原的VL、连接子、靶向第一抗原的VH、IgG4的铰链区、TCRα链的恒定区、IgG4的铰链区、靶向第三抗原的VL、连接子、以及靶向第三抗原的VH。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述第一条多肽链从N端到C端依次包含：靶向第一抗原的VL、连接子、靶向第一抗原的VH、IgG4的铰链区、TCRα链的恒定区、IgG4的铰链区、靶向第三抗原的VH、连接子、以及靶向第三抗原的VL。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述第一条多肽链从N端到C端依次包含：靶向第一抗原的VH、靶向第一抗原的VL、以及TCRα链的恒定区。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述第一条多肽链从N端到C端依次包含：靶向第一抗原的VH、连接子、靶向第一抗原的VL、IgG4的铰链区、以及TCRα链的恒定区。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述第一条多肽链从N端到C端依次包含：靶向第一抗原的VH、连接子、靶向第一抗原的VL、IgG4的铰链区、TCRα链的恒定区、IgG4的铰链区、靶向第三抗原的VL、连接子、以及靶向第三抗原的VH。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述第一条多肽链从N端到C端依次包含：靶向第一抗原的VH、连接子、靶向第一抗原的VL、IgG4的铰链区、TCRα链的恒定区、IgG4的铰链区、靶向第三抗原的VH、连接子、以及靶向第三抗原的VL。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述第一条多肽链包含靶向第一抗原的scFv、TCRα链的恒定区以及靶向第三抗原的scFv。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述第二条多肽链中，所述靶向第二抗原的scFv和TCRβ链的恒定区直接或间接相连。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述靶向第二抗原的scFv和TCRα链的恒定区通过铰链区相连。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述靶向第二抗原的scFv和TCRβ链的恒定区通过IgG铰链区相连。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述靶向第二抗原的scFv和TCRβ链的恒定区通过IgG4的铰链区相连。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述靶向第二抗原的scFv包含靶向第二抗原的VH和靶向第二抗原的VL。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述第二条多肽链从N端到C端依次包含：靶向第二抗原的VL、靶向第二抗原的VH、以及TCRβ链的恒定区。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述第二条多肽链从N端到C端依次包含：靶向第二抗原的VL、靶向第二抗原的VH、IgG4的铰链区、以及TCRβ链的恒定区。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述第二条多肽链从N端到C端依次包含：靶向第二抗原的VL、靶向第二抗原的VH、IgG4的铰链区、TCRβ链的恒定区、IgG4的铰链区、靶向第四抗原的VH、以及靶向第四抗原的VL。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述第二条多肽链从N端到C端依次包含：靶向第二抗原的VL、靶向第二抗原的VH、IgG4的铰链区、TCRβ链的恒定区、IgG4的铰链区、靶向第四抗原的VL、以及靶向第四抗原的VH。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述第二条多肽链从N端到C端依次包含：靶向第二抗原的VH、靶向第二抗原的VL、以及TCRβ链的恒定区。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述第二条多肽链从N端到C端依次包含：靶向第二抗原的VH、靶向第二抗原的VL、IgG4的铰链区、以及TCRβ链的恒定区。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述第二条多肽链从N端到C端依次包含：靶向第二抗原的VH、靶向第二抗原的VL、IgG4的铰链区、TCRβ链的恒定区、IgG4的铰链区、靶向第四抗原的VH、以及靶向第四抗原的VL。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述第二条多肽链从N端到C端依次包含：靶向第二抗原的VH、靶向第二抗原的VL、IgG4的铰链区、以及TCRβ链的恒定区、IgG4的铰链区、靶向第四抗原的VL、以及靶向第四抗原的VH。
在某些实施方式中，所述靶向第一抗原的抗原结合片为VHH。
在某些实施方式中，在所述第一条多肽链中，所述靶向第一抗原的VHH和TCRα链的恒定区直接或间接相连。
在某些实施方式中，所述靶向第一抗原的VHH和TCRα链的恒定区通过铰链区相连。
在某些实施方式中，所述靶向第一抗原的VHH和TCRα链的恒定区通过IgG铰链区相连。
在某些实施方式中，所述靶向第一抗原的VHH和TCRα链的恒定区通过IgG4的铰链区相连。
在某些实施方式中，所述第一条多肽链从N端到C端依次包含：靶向第一抗原的VHH、以及TCRα链的恒定区。
在某些实施方式中，所述第一条多肽链从N端到C端依次包含：靶向第一抗原的VHH、IgG4的铰链区、以及TCRα链的恒定区。
在某些实施方式中，所述靶向第三抗原的抗原结合片段包括VHH。
在某些实施方式中，所述第一条多肽链从N端到C端依次包含：靶向第一抗原的VHH、IgG4的铰链区、TCRα链的恒定区、IgG4的铰链区、靶向第三抗原的VHH。
在某些实施方式中，所述第一条多肽链从N端到C端依次包含：靶向第一抗原的VHH、以及TCRα链的恒定区。
在某些实施方式中，所述第一条多肽链从N端到C端依次包含：靶向第一抗原的VHH、IgG4的铰链区、以及TCRα链的恒定区。
在某些实施方式中，所述靶向第二抗原的抗原结合片为VHH。
在某些实施方式中，所述第二条多肽链中，所述靶向第二抗原的VHH和TCRβ链的恒定区直接或间接相连。
在某些实施方式中，所述靶向第二抗原的VHH和TCRβ链的恒定区通过铰链区相连。
在某些实施方式中，所述靶向第二抗原的VHH和TCRβ链的恒定区通过IgG铰链区相连。
在某些实施方式中，所述靶向第二抗原的VHH和TCRβ链的恒定区通过IgG4的铰链区相连。
在某些实施方式中，所述第二条多肽链从N端到C端依次包含：靶向第二抗原的VHH、以及TCRβ链的恒定区。
在某些实施方式中，所述第二条多肽链从N端到C端依次包含：靶向第二抗原的VHH、IgG4的铰链区、以及TCRβ链的恒定区。
在某些实施方式中，所述靶向第四抗原的抗原结合片段包括VHH。
在某些实施方式中，所述第二条多肽链从N端到C端依次包含：靶向第二抗原的VHH、IgG4的铰链区、TCRβ链的恒定区、IgG4的铰链区、靶向第四抗原的VHH。
在某些实施方式中，所述第二条多肽链从N端到C端依次包含：靶向第二抗原的VHH、以及TCRβ链的恒定区。
在某些实施方式中，所述的分离的抗原结合蛋白，所述第二条多肽链从N端到C端依次包含：靶向第二抗原的VHH、IgG4的铰链区、以及TCRβ链的恒定区。
在某些实施方式中，所述第一抗原选自下组：ROR1、CD3、TIM3、CD19、PD-1和CD16A。
在某些实施方式中，所述第二抗原选自下组：ROR1、CD3、TIM3、CD19、PD-1和CD16A。
在某些实施方式中，所述第一抗原与所述第二抗原不同。
在某些实施方式中，所述第一抗原与所述第二抗原为同一抗原的不同抗原结合表位。
另一方面，本申请还提供了一种分离的抗原结合蛋白，其包含一条多肽链，所述多肽链包含靶向第一抗原的抗原结合片段和TCRα链的恒定区；以及靶向第二抗原的抗原结合片段和TCRβ链的恒定区。
在某些实施方式中，所述靶向第一抗原的抗原结合片段和靶向第二抗原的抗原结合片段包括Fab、Fab’、F(ab)2、Fv片段、F(ab’)2、scFv、di-scFv、VHH和/或dAb。
在某些实施方式中，所述靶向第一抗原的抗原结合片段为scFv或VHH。
在某些实施方式中，所述靶向第二抗原的抗原结合片段为scFv或VHH。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述多肽链从N端至C端依次包含：靶向第一抗原的scFv、TCRα链的恒定区、连接子、TCRβ链的恒定区和靶向第二抗原的scFv。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述多肽链从N端至C端依次包含：靶向第一抗原的scFv、TCRβ链的恒定区、连接子、TCRα链的恒定区和靶向第二抗原的scFv。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述靶向第一抗原的scFv包含靶向第一抗原的VH和靶向第一抗原的VL。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述靶向第二抗原的scFv包含靶向第二抗原的VH和靶向第二抗原的VL。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述多肽链从N端至C端依次包含：靶向第一抗原的VL、靶向第一抗原的VH、TCRα链的恒定区、连接子、TCRβ链的恒定区、靶向第二抗原的VH和靶向第二抗原的VL。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述多肽链从N端至C端依次包含靶向第一抗原的VL、靶向第一抗原的VH、TCRβ链的恒定区、连接子、TCRα链的恒定区、靶向第二抗原的VH和靶向第二抗原的VL。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述TCRα链的恒定区源自人TCRα链的恒定区。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述TCRα链的恒定区包含SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述TCRβ链的恒定区源自人TCRβ链的恒定区。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述TCRβ链的恒定区包含SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述靶向第一抗原的scFv包含SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:59中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述抗原结合蛋白的所述靶向第二抗原的scFv包含SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:59中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述多肽链从N端至C端依次包含：靶向第一抗原的VHH、TCRα链的恒定区、连接子、TCRβ链的恒定区和靶向第二抗原的VHH。
在某些实施方式中，所述多肽链从N端至C端依次包含：靶向第一抗原的VHH、铰链区、TCRβ链的恒定区、连接子、TCRα链的恒定区、铰链区和靶向第二抗原的VHH。
在某些实施方式中，所述多肽链从N端至C端依次包含：靶向第一抗原的VHH、铰链区、TCRα链的恒定区、连接子、TCRβ链的恒定区、铰链区、靶向第二抗原的VHH。
在某些实施方式中，所述多肽链从N端至C端依次包含：靶向第一抗原的VHH、铰链区、TCRβ链的恒定区、连接子、TCRα链的恒定区、铰链区、靶向第二抗原的VHH。
另一方面，本申请还提供了分离的一种或多种核酸分子，其编码所述的抗原结合蛋白。
在某些实施方式中，所述核酸分子包含编码靶向第一抗原的scFv的核酸序列、编码靶向第二抗原的scFv的核酸序列、编码TCRα链的恒定区的核酸序列，以及编码TCRβ链的恒定区序列/编码TCRβ链的恒定区反向氨基酸序列的核酸序列。
在某些实施方式中，所述核酸分子还包含编码IgG4铰链区的核酸序列。
在某些实施方式中，所述核酸分子还包含编码剪切肽的核酸序列。
在某些实施方式中，所述剪切肽包含2A肽。在某些实施方式中，所述剪切肽包含SEQ ID NO:50所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述核酸分子还包含编码连接子的核酸序列。
在某些实施方式中，所述连接子的氨基酸序列为GGGGS(SEQ ID NO:49)。
在某些实施方式中，所述核酸分子从5’端至3’端依次包含：编码靶向第一抗原的scFv的核酸序列、编码IgG4铰链区的核酸序列、编码TCRα链的恒定区的核酸序列、编码剪切肽的核酸序列、编码靶向第二抗原的scFv的核酸序列、编码IgG4铰链区的核酸序列和编码TCRβ链的恒定区序列。
在某些实施方式中，所述核酸分子还包含编码靶向第三抗原的scFv的核酸序列/编码靶向第三抗原的scFv的反向氨基酸序列的核酸序列。
在某些实施方式中，所述核酸分子还包含编码靶向第四抗原的scFv的核酸序列/编码靶向第四抗原的scFv的反向氨基酸序列的核酸序列。
在某些实施方式中，所述核酸分子从5’端至3’端依次包含：编码靶向第一抗原的scFv的核酸序列、编码IgG4铰链区的核酸序列、编码TCRα链的恒定区的核酸序列、编码IgG4铰链区的核酸序列、编码靶向第三抗原的scFv的反向氨基酸序列的核酸序列、编码剪切肽的核酸序列、编码靶向第二抗原的scFv的核酸序列、编码IgG4铰链区的核酸序列、编码TCRβ链的恒定区序列、编码IgG4铰链区的核酸序列、以及编码靶向第四抗原的scFv的反向氨基酸序列的核酸序列。
在某些实施方式中，所述核酸分子从5’端至3’端依次包含：编码靶向第一抗原的scFv的核酸序列、编码IgG4铰链区的核酸序列、编码TCRα链的恒定区的核酸序列、编码连接子的核酸序列、编码TCRβ链的恒定区反向氨基酸序列的核酸序列、编码IgG4铰链区的核酸序列和编码靶向第二抗原的scFv的核酸序列。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其包含编码靶向第一抗原的VHH的核酸序列、编码靶向第二抗原的VHH的核酸序列、编码TCRα链的恒定区的核酸序列，以及编码TCRβ链的恒定区序列/编码TCRβ链的恒定区反向氨基酸序列的核酸序列。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其还包含编码IgG4铰链区的核酸序列。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其还包含编码剪切肽的核酸序列。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其中所述剪切肽包含2A肽。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其还包含编码连接子的核酸序列。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其中所述连接子的氨基酸序列为GGGGS。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其从5’端至3’端依次包含：编码靶向第一抗原的VHH的核酸序列、编码IgG4铰链区的核酸序列、编码TCRα链的恒定区的核酸序列、编码剪切肽的核酸序列、编码靶向第二抗原的VHH的核酸序列、编码IgG4铰链区的核酸序列和编码TCRβ链的恒定区序列。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其还包含编码靶向第三抗原的VHH的核酸序。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其还包含编码靶向第四抗原的VHH的核酸序列。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其从5’端至3’端依次包含：编码靶向第一抗原的VHH的核酸序列、编码IgG4铰链区的核酸序列、编码TCRα链的恒定区的核酸序列、编码IgG4铰链区的核酸序列、编码靶向第三抗原的VHH氨基酸序列的核酸序列、编码剪切肽的核酸序列、编码靶向第二抗原的VHH的核酸序列、编码IgG4铰链区的核酸序列、编码TCRβ链的恒定区序列、编码IgG4铰链区的核酸序列、以及编码靶向第四抗原的VHH的氨基酸序列的核酸序列。
在某些实施方式中，所述的核酸分子，其从5’端至3’端依次包含：编码靶向第一抗原的VHH的核酸序列、编码IgG4铰链区的核酸序列、编码TCRα链的恒定区的核酸序列、编码连接子的核酸序列、编码TCRβ链的恒定区反向氨基酸序列的核酸序列、编码IgG4铰链区的核酸序列和编码靶向第二抗原的VHH的核酸序列。
另一方面，本申请还提供了载体，其包含所述核酸分子。
另一方面，本申请还提供了细胞，其包含所述核酸分子或所述载体。
另一方面，本申请还提供了药物组合物，其包含所述抗原结合蛋白、所述核酸分子、所述载体、或所述细胞，以及任选地药学上可接受的载体。
另一方面，本申请还提供了所述抗原结合蛋白、所述核酸分子、所述载体、所述细胞、和/或所述药物组合物在制备药物中的应用，所述药物用于预防和/或治疗疾病和/或病症。
另一方面，本申请还提供了一种预防和/或治疗疾病和/或病症的方法，其包含向有需要的受试者施用所述抗原结合蛋白、所述核酸分子、所述载体、所述细胞、和/或所述药物组合物。
另一方面，本申请还提供了所述抗原结合蛋白、所述核酸分子、所述载体、所述细胞、和/或所述药物组合物，启用于预防和/或治疗疾病和/或病症。
在某些实施方式中，所述疾病和/或病症包括肿瘤。
在某些实施方式中，所述肿瘤包括实体瘤和/或血液瘤。
本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本申请的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。
附图说明
本申请所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明如下：
图1A-1B显示的是以TCR恒定区开发的二抗和四抗示意图。(图1A)二抗结构图。左为Trans格式，右为Cis格式；(图1B)四抗结构图。
图2A-2C显示的是HEK293 T细胞稳定表达产生四种格式二抗，以及结合相应ROR1阳性肿瘤和T细胞的效果检测。
图3显示的是测试四种格式二抗的T细胞再定向试验。
图4A-4B显示的是测定针对CD19靶点的四种格式二抗的抗肿瘤试验。
图5显示的是ROR1/TIM3/PD1/CD3四抗结构示意。
图6显示的是通过流式验证与对应的靶点相结合。
图7显示的是四种基于TCRC的CD19xCD3双特异性抗体通过重定向PBMCs靶向Raji(CD19+)癌细胞诱导细胞因子产生。
图8A显示的是抗HA-APC、抗TCRb-APC/C7和抗His-PE的背景信号。
图8B显示的是评估基于TCRC、携带有CD16a结合臂的新型四抗结构示意。
图9显示的是Trans-TCRCab-RUCD16aP重组抗体能够重定向人PBMC靶向ROR1+肿瘤细胞系并诱导细胞因子产生。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。
术语定义
在本申请中，术语“分离的”通常指从天然状态下经人工手段获得的。如果自然界中出现某一种“分离”的物质或成分，那么可能是其所处的天然环境发生了改变，或从天然环境下分离出该物质，或二者情况均有发生。例如，某一活体动物体内天然存在某种未被分离的多聚核苷酸或多肽，而从这种天然状态下分离出来的高纯度的相同的多聚核苷酸或多肽即称之为分离的。术语“分离的”不排除混有人工或合成的物质，也不排除存在不影响物质活性的其它不纯物质。
在本申请中，术语“分离的抗原结合蛋白”通常指从天然状态下经人工手段获得的具有抗原结合能力的蛋白。该“分离的抗原结合蛋白”可以包含结合抗原的部分和任选地，允许抗原结合部分采用促进所述抗原结合部分结合抗原的构象的框架或构架部分。抗原结合蛋白可以包含例如抗体来源的蛋白框架区(FR)或具有移植的CDR或CDR衍生物的备选蛋白框架区或人工框架区。此类框架包括，但不限于包含被引入例如以稳定抗原结合蛋白的三维结构的突变的抗体来源的框架区以及包含例如生物相容性聚合物的完全合成的框架区。参见例如Korndorfer等,2003,Proteins:Structure,Function,andBioinformatics,53(1):121-129(2003)；Roque等,Biotechnol.Prog.20:639-654(2004)。抗原结合蛋白的实例包括但不限于：人抗体、人源化抗体；嵌合抗体；重组抗体；单链抗体；双功能抗体；三功能抗体；四功能抗体；Fab，Fab’，Fv片段，F(ab’)2，F(ab)2，scFv，di-scFv，dAb，IgD抗体；IgE抗体；IgM抗体；IgG1抗体；IgG2抗体；IgG3抗体；或IgG4抗体以及其片段。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可以包含不止一个抗原结合域。在本申请中，所述抗原结合域可以靶向不同的抗原。在本申请中，所述抗原结合域可以靶向相同抗原的不同表位。
在本申请中，术语“可变结构域”与“可变区”可以互换使用，通常指抗体重链和/或轻链的一部分。重链和轻链的可变结构域可以分别称为“VH”和“VL”(或者分别称为“VH”和“VL”)。这些结构域通常是抗体的变化最大的部分(相对于相同类型的其它抗体)，且包含抗原结合位点。
在本申请中，术语“可变”通常指在抗体之间可变结构域的某些区段在序列上可能存在较大差异。可变结构域介导抗原结合并决定特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，可变性并非在整个可变结构域范围内均匀分布。它通常集中在轻链和重链可变结构域中称为高变区(CDR或HVR)的三个区段中。可变结构域的更高度保守的部分称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR区，大多数采用β-折叠构型，通过三个CDR连接，其形成环形连接，并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分。每条链中的CDR通过FR区紧密靠近地保持在一起，并且来自另一条链的CDR一同促进抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat et al,Sequences of Immunological Interest,Fifth Edition,NationalInstitute of Health,Bethesda,Md.(1991))。
在本申请中，术语“抗体”通常指免疫球蛋白或其片段或其衍生物，涵盖包括抗原结合位点的任何多肽，无论其是在体外还是体内产生的。该术语包括但不限于多克隆的、单克隆的、单特异性的、多特异性的、非特异性的、人源化的、单链的、嵌合的、合成的、重组的、杂化的、突变的和移植的抗体。除非另外被术语“完整的”修饰，如在“完整的抗体”中，为了本发明的目的，术语“抗体”也包括抗体片段，比如Fab、F(ab')2、Fv、scFv、Fd、dAb和保持抗原结合功能(例如，特异性结合CLDN18.2)的其它抗体片段。通常，这样的片段应当包括抗原结合结构域。基本的4链抗体单元是由两个相同的轻(L)链和两个相同的重(H)链组成的异四聚体糖蛋白。IgM抗体由5个基本的异四聚体单元与另外一个称为J链的多肽组成，且含有10个抗原结合位点，而IgA抗体包括2-5个可以与J链相结合聚合形成多价组合的基本4链单元。就IgG而言，4链单元一般为约150,000道尔顿。每个L链通过一个共价二硫键与H链连接，而两个H链通过一个或多个取决于H链同种型的二硫键相互连接。每个H和L链还具有规则间隔的链内二硫化桥键。每个H链在N末端具有可变结构域(VH)，对于α和γ链各自继之以三个恒定结构域(CH)、对于μ和ε同种型继之以四个CH结构域。每个L链在N末端具有可变结构域(VL)，在其另一端具有恒定结构域。VL与VH对应，且CL与重链的第一恒定结构域(CH1)相对应。特定的氨基酸残基被认为在轻链和重链可变结构域之间形成界面。VH和VL配对一起形成单个抗原结合位点。对于不同类别抗体的结构和性质，参见例如Basic and ClinicalImmunology,8th Edition,Daniel P.Sties,Abba I.Terr and Tristram G.Parsolw(eds),Appleton&Lange,Norwalk,Conn.,1994，第71页和第6章。来自任何脊椎动物物种的L链可以基于其恒定结构域的氨基酸序列被分为两种明显不同的类型中的一种，称为κ和λ。根据重链(CH)恒定结构域的氨基酸序列，可以将免疫球蛋白分为不同的类别或同种型。目前存在五类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，具有分别被命名为α、δ、ε、γ和μ的重链。基于CH序列和功能方面的相对小的差异，将γ和α类进一步分成亚类，例如，人表达下述亚类：IgG1、IgG2A、IgG2B、IgG3、IgG4、IgA1和IgK1。
在本申请中，术语“CDR”也称“互补决定区”，通常指抗体可变结构域中的区域，其序列是高度可变的和/或形成结构定义环。通常，抗体包括六个CDR；在VH中三个(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，和在VL中三个(LCDR1、LCDR2、LCDR3)。在某些实施方案中，仅由重链组成的天然存在的骆驼抗体在缺乏轻链的情况下，其功能也能够正常且稳定。参见，例如,Hamers-Casterman et al.,Nature 363:446-448(1993)；Sheriff et al,Nature Struct.Biol.3:733-736(1996)。
在本申请中，术语“抗原结合片段”可以与“结合结构域”互换地使用，通常指具有特异结合抗原能力的一个或多个片段。在本申请中，所述抗原结合片段可以包括Fab，Fab’，F(ab)2、Fv片段、F(ab’)2，scFv，di-scFv和/或dAb。
在本申请中，术语“scFv”通常指包含至少一个包括轻链的可变区抗体片段和至少一个包括重链的可变区的抗体片段的融合蛋白，其中所述轻链和重链可变区是邻接的(例如经由合成接头例如短的柔性多肽接头)，并且能够以单链多肽形式表达，且其中所述scFv保留其所来源的完整抗体的特异性。除非特别说明，否则如本申请中使用的那样，scFv可以以任何顺序(例如相对于多肽的N-末端和C末端)具有所述的VL和VH可变区，scFv可以包括VL-接头-VH或可以包括VH-接头-VL。
在本申请中，术语“VHH”通常是指包含重链抗体的可变抗原结合结构域的抗体。VHH也可称为纳米抗体(Nanobody)(Nb)和/或单域抗体。
在本申请中，术语“T细胞受体”或“TCR”指的是响应于抗原的呈递参与T细胞的活化的膜蛋白的复合体。TCR负责识别结合至主要组织相容性复合体分子的抗原。TCR通常由alpha(α)和beta(β)链的异质二聚体组成，但是在一些细胞中，TCR由gamma和delta(γ/δ)链构成。TCR可以以α/β和γ/δ形式存在，其在结构上是相似的，但是具有独特的解剖学位置和功能。每条链可以由两个结构域——可变结构域(可变区)和恒定结构域(恒定区)——组成。在一些实施方式中，TCR可以在包含TCR的任何细胞上被修饰，包含，例如，辅助性T细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞、调节性T细胞、自然杀伤T细胞和γδT细胞。
在本发明中，术语“恒定区”通常是指相对于TCR的含有抗原结合位点的可变区，具有更保守的氨基酸序列的区域。例如，所述的恒定区可以是人源的。
在本申请中，术语“直接相连”与术语“间接相连”相对，术语“直接相连”通常是指直接连接。例如，所述直接相连可以为物质间没有间隔子而直接相连的情况。所述间隔子可以是连接子。例如，所述连接子可以为肽连接子。术语“间接相连”通常是指物质间不直接相连的情况。例如，所述间接相连可以为通过间隔子而连接的情况。
在本申请中，术语“分离的核酸分子”通常指任何长度的分离形式的核苷酸，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或从其天然环境分离的或人工合成的类似物。
在本申请中，术语“载体”通常指可将编码某蛋白的多聚核苷酸插入其中并使蛋白获得表达的一种核酸运载工具。载体可通过转化、转导或转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内表达得以表达。举例来说，载体可以包括：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。用作载体的动物病毒种类可以包括逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可能含有多种控制表达的元件，包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。载体还有可能包括有协助其进入细胞的成分，如病毒颗粒、脂质体或蛋白外壳，但不仅仅只有这些物质。
在本申请中，术语“细胞”通常指可以是或已经是受试者质粒或载体的接受者的单个细胞、细胞系或细胞培养物，其包括本发明所述的核酸分子或本发明所述的载体。细胞可以包括单个细胞的后代。由于天然、偶然或有意的突变，后代可以不一定与原始母细胞完全相同(在总DNA互补体的形态上或在基因组上)。细胞可包括用本申请所述的载体在体外转染的细胞。细胞可以是细菌细胞(例如，大肠杆菌)、酵母细胞或其它真核细胞，例如COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、CHO-K1细胞、LNCAP细胞、HeLa细胞、HEK293细胞、COS-1细胞、NS0细胞。在某些实施方案中，细胞为哺乳动物细胞。在某些实施方案中，哺乳动物细胞为HEK293细胞。
在本申请中，术语“药物组合物”通常指用于预防/治疗疾病或病症的组合物。所述药物组合物可以包含本申请所述的分离的抗原结合蛋白、本申请所述的核酸分子、本申请所述的载体和/或本申请所述的细胞，以及任选地药学上可接受的佐剂。此外，所述药物组合物还可以包含一种或多种(药学上有效的)载剂、稳定剂、赋形剂、稀释剂、增溶剂、表面活性剂、乳化剂和/或防腐剂的合适的制剂。组合物的可接受成分在所用剂量和浓度下优选地对接受者无毒。本发明的药物组合物包括但不限于液体、冷冻和冻干组合物。
在本申请中，术语“药学上可接受的载剂”通常包括药剂学可接受的载体、赋形剂或稳定剂，它们在所采用的剂量和浓度对暴露于其的细胞或哺乳动物是无毒的。生理学可接受的载体可包括例如缓冲剂，抗氧化剂，低分子量(少于约10个残基)多肽，蛋白质，亲水性聚合物，氨基酸，单糖，二糖和其它碳水化合物，螯合剂，糖醇，成盐反荷离子，例如钠；和/或非离子表面活性剂。
在本申请中，术语“特异性结合”或“特异性的”通常指可测量的和可再现的相互作用，例如靶标和抗体之间的结合，可在分子(包括生物分子)的异质群体存在的情况决定靶标的存在。例如，特异性结合靶标(其可以为表位)的抗体可以是以比它结合其它靶标更大的亲和性、亲合力、更容易、和/或以更大的持续时间结合该靶标的抗体。在某些实施方案中，抗体特异性结合蛋白质上的表位，所述表位在不同种属的蛋白质中是保守的。在某些实施方案中，特异性结合可以包括但不要求排他性地结合。
在本申请中，术语“受试者”通常指人类或非人类动物，包括但不限于猫、狗、马、猪、奶牛、羊、兔、小鼠、大鼠或猴。
在本申请中，术语“肿瘤”通常指由异常细胞生长形成的赘生物或实体病变。在本申请中，肿瘤可以是实体瘤或非实体瘤。
在本申请中，涉及的蛋白质、多肽和/或氨基酸序列，还应理解为至少包含以下的范围：与该所述蛋白质或多肽具备相同或类似功能的变体或同源物。
在本申请中，所述变体可以为，例如在所述蛋白质和/或所述多肽(例如，特异性结合CLDN18.2和/或4-1BB蛋白的抗体或其片段)的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸的蛋白质或多肽。例如，所述功能性变体可包含已经通过至少1个，例如1-30个、1-20个或1-10个，又例如1个、2个、3个、4个或5个氨基酸取代、缺失和/或插入而具有氨基酸改变的蛋白质或多肽。所述功能性变体可基本上保持改变(例如取代、缺失或添加)之前的所述蛋白质或所述多肽的生物学特性。例如，所述功能性变体可保持改变之前的所述蛋白质或所述多肽的至少60％，70％，80％，90％，或100％的生物学活性(例如抗原结合能力)。例如，所述取代可以为保守取代。
在本申请中，所述同源物可以为与所述蛋白质和/或所述多肽(例如，特异性结合CLDN18.2和/或4-1BB蛋白的抗体或其片段)的氨基酸序列具有至少约85％(例如，具有至少约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更高的)序列同源性的蛋白质或多肽。
在本申请中，所述同源性通常是指两个或多个序列之间的相似性、类似或关联。可以通过以下方式计算“序列同源性百分比”：将两条待比对的序列在比较窗中进行比较，确定两条序列中存在相同核酸碱基(例如，A、T、C、G、I)或相同氨基酸残基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置的数目以得到匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗中的总位置数(即，窗大小)，并且将结果乘以100，以产生序列同源性百分比。为了确定序列同源性百分数而进行的比对，可以按本领域已知的多种方式实现，例如，使用可公开获得的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适宜参数，包括为实现正在比较的全长序列范围内或目标序列区域内最大比对所需要的任何算法。所述同源性也可以通过以下的方法测定：FASTA和BLAST。对FASTA算法的描述可以参见W.R.Pearson和D.J.Lipman的“用于生物学序列比较的改进的工具”，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)，85：2444-2448，1988；和D.J.Lipman和W.R.Pearson的“快速灵敏的蛋白质相似性搜索”，Science，227：1435-1441，1989。对BLAST算法的描述可参见S.Altschul、W.Gish、W.Miller、E.W.Myers和D.Lipman的“一种基本的局部对比(alignment)搜索工具”，分子生物学杂志，215：403-410，1990。
在本申请中，术语“包括”通常是指包含、总括、含有或包涵的含义。在某些情况下，也表示“为”、“由……组成”的含义。
在本申请中，术语“约”通常是指在指定数值以上或以下0.5％-10％的范围内变动，例如在指定数值以上或以下0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、或10％的范围内变动。
发明详述
抗体的CDR又称互补决定区，是可变区的一部分。该区域的氨基酸残基可以与抗原或抗原表位接触。抗体CDR可以通过多种编码系统来确定，如CCG、Kabat、Chothia、IMGT、综合考虑Kabat/Chothia等。这些编码系统为本领域内已知，具体可参见http://www.bioinf.org.uk/abs/index.html#kabatnum。本领域技术人员可以根据抗体的序列和结构，用不同的编码系统确定出CDR区。使用不同的编码系统，CDR区可能存在差别。在本申请中，所述CDR涵盖根据任何CDR划分方式划分得到的CDR序列；也涵盖其变体，所述变体包括所述CDR的氨基酸序列经过取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸。例如1-30个、1-20个或1-10个，又例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个氨基酸取代、缺失和/或插入；也涵盖其同源物，所述同源物可以为与所述CDR的氨基酸序列具有至少约85％(例如，具有至少约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更高的)序列同源性的氨基酸序列。
一方面，本申请提供一种分离的抗原结合蛋白，其包含靶向第一抗原的抗原结合蛋白和TCRα链的恒定区，以及靶向第二抗原的抗原结合蛋白和TCRβ链的恒定区。
在本申请中，所述靶向第一抗原的抗原结合片段和靶向第二抗原的抗原结合片段包括Fab、Fab’、F(ab)2、Fv片段、F(ab’)2、scFv、di-scFv、VHH和/或dAb。
在本申请中，述靶向第一抗原的抗原结合片段可以为scFv或VHH。
在本申请中，述靶向第二抗原的抗原结合片段为可以scFv或VHH。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可不包含可以TCRα链的可变区。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可不包含可以TCRβ链的可变区。
在本申请中，所述靶向第一抗原的scFv/VHH和所述TCRα链的恒定区可通过铰链区相连。
在本申请中，所述靶向第二抗原的scFv/VHH和所述TCRβ链的恒定区可通过铰链区相连。
在本申请中，所述铰链区可包含IgG的铰链区。
在本申请中，所述铰链区可包含IgG4的铰链区。例如，所述铰链区可包含SEQ IDNO:46所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白中的所述TCRα链的恒定区和所述TCRβ链的恒定区可以直接或间接相连。例如，所述相连可以包括以一种或多种方式相连。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白中所述TCRα链的恒定区和所述TCRβ链的恒定区可通过二硫键相连接。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白的所述TCRα链的恒定区和所述TCRβ链的恒定区可通过连接子相连接。例如，所述连接子可包含肽接头。例如，所述连接子的氨基酸序列可以为GGGGS(SEQ ID NO:49)。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白中的所述TCRα链的恒定区和所述TCRβ链的恒定区可通过二硫键和连接子相连接。
在本申请中，所述第一抗原可选自下组：ROR1、CD3、TIM3、CD19、PD-1和CD16A。
在本申请中，所述第二抗原可选自下组：ROR1、CD3、TIM3、CD19、PD-1和CD16A。
例如，在本申请中，所述第一抗原和所述第二抗原可以为同一抗原的不同抗原结合表位。例如，在本申请中，所述第一抗原和所述第二抗原可以为同一抗原的相同抗原结合表位。例如，在本申请中，所述第一抗原和所述第二抗原可以为不同的抗原。
在本申请中，所述靶向第一抗原的scFv可包含靶向第一抗原的抗体轻链可变区VL和靶向第一抗原的抗体重链可变区VH。例如，所述靶向第一抗原的VH的N端可以和所述靶向第一抗原的VL的C端直接或间接相连。又例如，所述靶向第一抗原的VH的C端可以和所述靶向第一抗原的VL的N端直接或间接相连。
在本申请中，所述靶向第一抗原的VH的C端与所述TCRα链的恒定区的N端直接或间接相连。例如，可以通过IgG4的铰链区相连。
在本申请中，所述靶向第一抗原的VL的C端可以与所述TCRα链的恒定区的N端直接或间接相连。例如，可以通过IgG4的铰链区相连。
在本申请中，所述靶向第一抗原的VH的N端可以与所述TCRα链的恒定区的C端直接或间接相连。例如，可以通过IgG4的铰链区相连。
在本申请中，所述靶向第一抗原的VL的N端可以与所述TCRα链的恒定区的C端直接或间接相连。例如，可以通过IgG4的铰链区相连。
在本申请中，所述靶向第二抗原的scFv包含靶向第二抗原的抗体轻链可变区VL和靶向第二抗原的抗体重链可变区VH。
在本申请中，所述靶向第二抗原的VH的N端可以和所述靶向第二抗原的VL的C端直接或间接相连。例如，可以通过连接子相连。例如，所述连接子可以是肽接头。
在本申请中，所述靶向第二抗原的VH的C端可以和所述靶向第二抗原的VL的N端直接或间接相连。例如，可以通过连接子相连。例如，所述连接子可以是肽接头。
在本申请中，所述靶向第二抗原的VH的C端可以与所述TCRβ链的恒定区的N端直接或间接相连。例如，可以通过铰链区相连。
在本申请中，所述靶向第二抗原的VL的C端可以与所述TCRβ链的恒定区的N端直接或间接相连。例如，可以通过铰链区相连。
在本申请中，所述靶向第二抗原的VH的N端可以与所述TCRβ链的恒定区的C端直接或间接相连。例如，可以通过铰链区相连。
在本申请中，所述靶向第二抗原的VL的N端可以与所述TCRβ链的恒定区的N端直接或间接相连。例如，可以通过铰链区相连。
在本申请中，所述靶向第一抗原的抗原结合片段可以为VHH。
在本申请中，所述靶向第一抗原的VHH与所述TCRα链的恒定区可以直接或间接相连。
在本申请中，所述靶向第一抗原的VHH的C端与所述TCRα链的恒定区的N端可以直接或间接相连。
在本申请中，所述靶向第一抗原的VHH与所述TCRα链的恒定区可以通过IgG4铰链区相连。
在本申请中，所述靶向第二抗原的抗原结合片段可以为VHH。
在本申请中，所述靶向第二抗原的VHH与所述TCRβ链的恒定区可以直接或间接相连。
在本申请中，所述靶向第二抗原的VHH的C端与所述TCRβ链的恒定区的N端可以直接或间接相连。
在本申请中，所述靶向第二抗原的VHH的C端与所述TCRβ链的恒定区可以通过IgG4铰链区相连。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白还可以包含靶向第三抗原的结合结构域。例如，所述靶向第三抗原的结合结构域可以是抗原结合片段。例如，所述靶向第三抗原的结合结构域可以是靶向第三抗原的scFv。例如，所述靶向第三抗原的结合结构域可以是靶向第三抗原的VHH。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白还可以包含靶向第四抗原的结合结构域。例如，所述靶向第四抗原的结合结构域可以是抗原结合片段。例如，所述靶向第四抗原的结合结构域可以是靶向第四抗原的scFv。例如，所述靶向第四抗原的结合结构域可以是靶向第四抗原的VHH。
在本申请中，所述靶向第三抗原的scFv可以与所述TCRα链的恒定区直接或间接相连。
在本申请中，所述靶向第三抗原的scFv与所述TCRα链的恒定区通过IgG4铰链区相连。
在本申请中，所述靶向第四抗原的scFv可以与所述TCRβ链的恒定区直接或间接相连。
在本申请中，所述靶向第四抗原的scFv可以与所述TCRβ链的恒定区通过IgG4铰链区相连。
在本申请中，所述靶向第三抗原的scFv可包含靶向第三抗原的VH和靶向第三抗原的VL。
在本申请中，所述靶向第三抗原的VH的N端可以和所述靶向第三抗原的VL的C端直接或间接相连。例如，通过连接子相连。例如，所述连接子可以是肽接头。
在本申请中，所述靶向第三抗原的VH的C端可以和所述靶向第三抗原的VL的N端直接或间接相连。例如，通过连接子相连。例如，所述连接子可以是肽接头。
在本申请中，所述靶向第三抗原的VH的N端可以与所述TCRα链的恒定区的C端直接或间接相连。例如，通过铰链区相连。
在本申请中，所述靶向第三抗原的VH的C端可以与所述TCRα链的恒定区的N端直接或间接相连。例如，通过铰链区相连。
在本申请中，所述靶向第三抗原的VL的N端可以与所述TCRα链的恒定区的C端直接或间接相连。例如，通过铰链区相连。
在本申请中，所述靶向第三抗原的VL的C端可以与所述TCRα链的恒定区的N端直接或间接相连。例如，通过铰链区相连。
在本申请中，所述靶向第三抗原的抗原结合片段可以为VHH。
在本申请中，所述靶向第三抗原的VHH与所述TCRα链的恒定区可以直接或间接相连。
在本申请中，所述靶向第三抗原的VHH的N端与所述TCRα链的恒定区的C端可以直接或间接相连。
在本申请中，所述靶向第三抗原的VHH与所述TCRα链的恒定区可以通过IgG4铰链区相连。
在本申请中，所述靶向第四抗原的scFv可包含靶向第四抗原的VH和靶向第四抗原的VL。
在本申请中，所述靶向第四抗原的VH的N端可以和所述靶向第四抗原的VL的C端直接或间接相连。例如，通过连接子相连。
在本申请中，所述靶向第四抗原的VH的C端可以和所述靶向第四抗原的VL的N端直接或间接相连。例如，通过连接子相连。
在本申请中，所述靶向第四抗原的VH的N端可以与所述TCRβ链的恒定区的C端直接或间接相连。例如，通过铰链区相连。
在本申请中，所述靶向第四抗原的VH的C端可以与所述TCRβ链的恒定区的N端直接或间接相连。例如，通过铰链区相连。
在本申请中，所述靶向第四抗原的VL的N端可以与所述TCRβ链的恒定区的C端直接或间接相连。例如，通过铰链区相连。
在本申请中，所述靶向第四抗原的VL的C端可以与所述TCRβ链的恒定区的N端直接或间接相连。例如，通过铰链区相连。
在本申请中，所述靶向第四抗原的抗原结合片段可以为VHH。
在本申请中，所述靶向第四抗原的VHH与所述TCRβ链的恒定区可以直接或间接相连。
在本申请中，所述靶向第四抗原的VHH的N端与所述TCRα链的恒定区的C端可以直接或间接相连。
在本申请中，所述靶向第四抗原的VHH与所述TCRβ链的恒定区可以通过IgG4铰链区相连。
另一方面，本申请还提供了一种分离的抗原结合蛋白，其包含两条多肽链，其中第一条多肽链包含靶向第一抗原的抗原结合片段和TCRα链的恒定区；其中第二条多肽链包含靶向第二抗原的抗原结合片段和TCRβ链的恒定区。
在本申请中，所述靶向第一抗原的抗原结合片段和靶向第二抗原的抗原结合片段包括Fab、Fab’、F(ab)2、Fv片段、F(ab’)2、scFv、di-scFv、VHH和/或dAb。
在本申请中，所述靶向第一抗原的抗原结合片可以为scFv或VHH。
在本申请中，所述靶向第二抗原的抗原结合片可以为scFv或VHH。
在本申请中，所述第一条多肽链于所述第二条多肽链可通过二硫键连接。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白的第一条多肽链中，所述靶向第一抗原的scFv/VHH和TCRα链的恒定区直接或间接相连。例如，通过铰链区相连。例如，所述铰链区可以为IgG铰链区。例如，所述铰链区可以为IgG4铰链区。
在本申请中，所述靶向第一抗原的scFv可包含靶向第一抗原的VH和靶向第一抗原的VL。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白的第一条多肽链从N端到C端可依次包含：靶向第一抗原的VL、靶向第一抗原的VH、以及TCRα链的恒定区。其中，这三个结构域可直接或间接相连。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白的第一条多肽链从N端到C端可依次包含：靶向第一抗原的VL、连接子、靶向第一抗原的VH、IgG4的铰链区、以及TCRα链的恒定区。
在本申请中，所述第一条多肽链从N端到C端可以依次包含：靶向第一抗原的VHH、以及TCRα链的恒定区。
在本申请中，所述第一条多肽链从N端到C端可以依次包含：靶向第一抗原的VHH、IgG4的铰链区、以及TCRα链的恒定区。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白还可包含靶向第三抗原的结合结构域。例如，所述靶向第三抗原的结合结构域可以是抗原结合片段。例如，所述靶向第三抗原的结合结构域可以是靶向第三抗原的scFv。。例如，所述靶向第三抗原的结合结构域可以是靶向第三抗原的VHH。
在本申请中，所述靶向第三抗原的scFv包含靶向第三抗原的VH和靶向第三抗原的VL。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白的第一条多肽链从N端到C端依次包含：靶向第一抗原的VL、靶向第一抗原的VH、IgG4的铰链区、TCRα链的恒定区、IgG4的铰链区、靶向第三抗原的VL、以及靶向第三抗原的VH。其中，多肽链中的各部分可直接或间接相连。例如，通过连接子相连。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白的第一条多肽链从N端到C端可依次包含：靶向第一抗原的VL、靶向第一抗原的VH、IgG4的铰链区、TCRα链的恒定区、IgG4的铰链区、靶向第三抗原的VH、以及靶向第三抗原的VL。其中，多肽链中的各部分可直接或间接相连。例如，通过连接子相连。
在本申请中，所述分离的结合蛋白的第一条多肽链从N端到C端可依次包含：靶向第一抗原的VH、靶向第一抗原的VL、以及TCRα链的恒定区。其中，多肽链中的各部分可直接或间接相连。例如，通过连接子相连。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白的第一条多肽链从N端到C端可依次包含：靶向第一抗原的VH、靶向第一抗原的VL、IgG4的铰链区、以及TCRα链的恒定区。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白的第一条多肽链从N端到C端可依次包含：靶向第一抗原的VH、连接子、靶向第一抗原的VL、IgG4的铰链区、TCRα链的恒定区、IgG4的铰链区、靶向第三抗原的VL、连接子、以及靶向第三抗原的VH。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白的第一条多肽链从N端到C端可依次包含：靶向第一抗原的VH、连接子、靶向第一抗原的VL、IgG4的铰链区、TCRα链的恒定区、IgG4的铰链区、靶向第三抗原的VH、连接子、以及靶向第三抗原的VL。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白的第一条多肽链可包含靶向第一抗原的scFv、TCRα链的恒定区以及靶向第三抗原的scFv。其中，多肽链中的各部分可直接或间接相连。例如，通过连接子相连。例如，所述连接子可以为肽接头。例如，所述连接子可以为铰链区。
在本申请中，所述靶向第三抗原的抗原结合片段可以为VHH。
在本申请中，所述第一条多肽链从N端到C端可以依次包含：靶向第一抗原的VHH、IgG4的铰链区、TCRα链的恒定区、IgG4的铰链区、靶向第三抗原的VHH。
在本申请中，所述第一条多肽链从N端到C端可以依次包含：靶向第一抗原的VHH、以及TCRα链的恒定区。
在本申请中，所述第一条多肽链从N端到C端可以依次包含：靶向第一抗原的VHH、IgG4的铰链区、以及TCRα链的恒定区。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白的所述第二条多肽链中，所述靶向第二抗原的scFv和TCRβ链的恒定区可以直接或间接相连。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白的所述靶向第二抗原的scFv和TCRα链的恒定区可以通过铰链区相连。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白的所述靶向第二抗原的scFv和TCRβ链的恒定区可以通过IgG铰链区相连。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白的所述靶向第二抗原的scFv和TCRβ链的恒定区可以通过IgG4的铰链区相连。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白的所述靶向第二抗原的scFv可包含靶向第二抗原的VH和靶向第二抗原的VL。其中，所述VH和所述VL可以通过连接子相连。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白的第二条多肽链从N端到C端可依次包含：靶向第二抗原的VL、靶向第二抗原的VH、以及TCRβ链的恒定区。其中，多肽链中的各部分可直接或间接相连。例如，通过连接子相连。例如，所述连接子可以为肽接头。例如，所述连接子可以为铰链区。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白的所述第二条多肽链从N端到C端可依次包含：靶向第二抗原的VL、连接子、靶向第二抗原的VH、IgG4的铰链区、以及TCRβ链的恒定区。
在本申请中，所述靶向第二抗原的抗原结合片可以为VHH。
在本申请中，在所述第二条多肽链中，所述靶向第二抗原的VHH和TCRβ链的恒定区可以直接或间接相连。
在本申请中，所述靶向第二抗原的VHH和TCRβ链的恒定区可以通过铰链区相连。
在本申请中，所述靶向第二抗原的VHH和TCRβ链的恒定区可以通过IgG铰链区相连。
在本申请中，所述靶向第二抗原的VHH和TCRβ链的恒定区可以通过IgG4的铰链区相连。
在本申请中，所述第二条多肽链从N端到C端可以依次包含：靶向第二抗原的VHH、以及TCRβ链的恒定区。
在本申请中，所述第二条多肽链从N端到C端可以依次包含：靶向第二抗原的VHH、IgG4的铰链区、以及TCRβ链的恒定区。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白还可包含靶向第四抗原的结合结构域。例如，所述靶向第四抗原的结合结构域可以是抗原结合片段。例如，所述靶向第四抗原的结合结构域可以是靶向第四抗原的scFv。
在本申请中，所述靶向第四抗原的scFv可包含靶向第四抗原的VH和靶向第四抗原的VL。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白的第二条多肽链从N端到C端可依次包含：靶向第二抗原的VL、连接子、靶向第二抗原的VH、IgG4的铰链区、TCRβ链的恒定区、IgG4的铰链区、靶向第四抗原的VH、连接子、以及靶向第四抗原的VL。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白的第二条多肽链从N端到C端可依次包含：靶向第二抗原的VL、连接子、靶向第二抗原的VH、IgG4的铰链区、TCRβ链的恒定区、IgG4的铰链区、靶向第四抗原的VL、连接子、以及靶向第四抗原的VH。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白的第二条多肽链从N端到C端可依次包含：靶向第二抗原的VH、靶向第二抗原的VL、以及TCRβ链的恒定区。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白的第二条多肽链从N端到C端可依次包含：靶向第二抗原的VH、连接子、靶向第二抗原的VL、IgG4的铰链区、以及TCRβ链的恒定区。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白的第二条多肽链从N端到C端可依次包含：靶向第二抗原的VH、连接子、靶向第二抗原的VL、IgG4的铰链区、TCRβ链的恒定区、IgG4的铰链区、靶向第四抗原的VH、以及靶向第四抗原的VL。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白的第二条多肽链从N端到C端可依次包含：靶向第二抗原的VH、靶向第二抗原的VL、IgG4的铰链区、以及TCRβ链的恒定区、IgG4的铰链区、靶向第四抗原的VL、以及靶向第四抗原的VH。
在本申请中，所述靶向第四抗原的抗原结合片段可以为VHH。
在本申请中，所述第二条多肽链从N端到C端可以依次包含：靶向第二抗原的VHH、IgG4的铰链区、TCRβ链的恒定区、IgG4的铰链区、靶向第四抗原的VHH。
在本申请中，所述第二条多肽链从N端到C端可以依次包含：靶向第二抗原的VHH、以及TCRβ链的恒定区。
在本申请中，所述第二条多肽链从N端到C端可以依次包含：靶向第二抗原的VHH、IgG4的铰链区、以及TCRβ链的恒定区。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白的所述第一抗原可选自下组：ROR1、CD3、TIM3、CD19、PD-1和CD16A。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白的所述第二抗原可选自下组：ROR1、CD3、TIM3、CD19、PD-1和CD16A。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白的所述第一抗原与所述第二抗原相同。在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白的所述第一抗原与所述第二抗原为相同抗原的不同结合表位。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白的所述第一抗原与所述第二抗原不同。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白的所述第三抗原可选自下组：ROR1、CD3、TIM3、CD19、PD-1和CD16A。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白的所述第三抗原可选自下组：ROR1、CD3、TIM3、CD19、PD-1和CD16A。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白的所述第三抗原与所述第四抗原相同。在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白的所述第三抗原与所述第四抗原为相同抗原的不同结合表位。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白的所述第三抗原与所述第四抗原不同。
另一方面，本申请提供了一种分离的抗原结合蛋白，其包含一条多肽链，所述多肽链包含靶向第一抗原的scFv和TCRα链的恒定区；以及靶向第二抗原的scFv和TCRβ链的恒定区。
在本申请中，所述靶向第一抗原的抗原结合片段和靶向第二抗原的抗原结合片段包括Fab、Fab’、F(ab)2、Fv片段、F(ab’)2、scFv、di-scFv、VHH和/或dAb。
在本申请中，所述靶向第一抗原的抗原结合片段可以为scFv或VHH。
在本申请中，所述靶向第二抗原的抗原结合片段可以为scFv或VHH。
在本申请中，所述多肽链从N端至C端依次包含：靶向第一抗原的scFv、TCRα链的恒定区、连接子、TCRβ链的恒定区和靶向第二抗原的scFv。
在本申请中，所述多肽链从N端至C端可依次包含：靶向第一抗原的scFv、铰链区、TCRβ链的恒定区、连接子、TCRα链的恒定区、铰链区和靶向第二抗原的scFv。例如，所述靶向第一抗原的scFv包含靶向第一抗原的VH和靶向第一抗原的VL。例如，所述靶向第二抗原的scFv包含靶向第二抗原的VH和靶向第二抗原的VL。例如，所述VH和VL可以直接或间接相连。例如，所述VH和VL可以通过连接子相连。例如，所述连接子可以包含肽接头。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白的多肽链从N端至C端可依次包含：靶向第一抗原的VL、连接子、靶向第一抗原的VH、铰链区、TCRα链的恒定区、连接子、TCRβ链的恒定区、铰链区、靶向第二抗原的VH、连接子和靶向第二抗原的VL。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白的多肽链从N端至C端可依次包含：靶向第一抗原的VL、连接子、靶向第一抗原的VH、铰链区、TCRβ链的恒定区、连接子、TCRα链的恒定区、铰链区、靶向第二抗原的VH、连接子和靶向第二抗原的VL。
在本申请中，所述TCRα链的恒定区可源自人TCRα链的恒定区。例如，所述TCRα链的恒定区可包含SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述TCRβ链的恒定区可源自人TCRβ链的恒定区。例如，所述TCRβ链的恒定区可包含SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述靶向ROR1的scFv可包含HCDR1，HCDR2，HCDR3。例如，所述HCDR1可包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列，所述HCDR2可包含SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列，所述HCDR3可包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列。所述靶向ROR1的scFv可包含LCDR1，LCDR2和LCDR3。例如，所述LCDR1可包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列，所述LCDR2可包含SEQ ID NO:24(SGS)所示的氨基酸序列，且所述LCDR3可包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述靶向ROR1的scFv可包含VH和VL。例如，所述VH可包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列。例如，所述VL可包含SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列。例如，所述靶向ROR1的scFv可包含SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述靶向CD3的scFv可包含HCDR1，HCDR2，HCDR3。例如，所述HCDR1可包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，所述HCDR2可包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列，所述HCDR3可包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。所述靶向CD3的scFv可包含LCDR1，LCDR2和LCDR3。例如，所述LCDR1可包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列，所述LCDR2可包含SEQ ID NO:15(YTS)所示的氨基酸序列，且所述LCDR3可包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述靶向CD3的scFv可包含VH和VL。例如，所述VH可包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。例如，所述VL可包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列。例如，所述靶向CD3的scFv可包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述靶向TIM3的scFv可包含HCDR1，HCDR2，HCDR3。例如，所述HCDR1可包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列，所述HCDR2可包含SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列，所述HCDR3可包含SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列。所述靶向TIM3的scFv可包含LCDR1，LCDR2和LCDR3。例如，所述LCDR1可包含SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列，所述LCDR2可包含SEQ ID NO:42(KVS)所示的氨基酸序列，且所述LCDR3可包含SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述靶向TIM3的scFv可包含VH和VL。例如，所述VH可包含SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列。例如，所述VL可包含SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列。例如，所述靶向TIM3的scFv可包含SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述靶向PD-1的scFv可包含HCDR1，HCDR2，HCDR3。例如，所述HCDR1可包含SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列，所述HCDR2可包含SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列，所述HCDR3可包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列。所述靶向PD-1的scFv可包含LCDR1，LCDR2和LCDR3。例如，所述LCDR1可包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列，所述LCDR2可包含SEQ ID NO:33(RDS)所示的氨基酸序列，且所述LCDR3可包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述靶向PD-1的scFv可包含VH和VL。例如，所述VH可包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列。例如，所述VL可包含SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列。例如，所述靶向PD-1的scFv可包含SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述靶向CD19的scFv可包含HCDR1，HCDR2，HCDR3。例如，所述HCDR1可包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述HCDR2可包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，所述HCDR3可包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。所述靶向CD19的scFv可包含LCDR1，LCDR2和LCDR3。例如，所述LCDR1可包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，所述LCDR2可包含SEQ IDNO:6(HTS)所示的氨基酸序列，且所述LCDR3可包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述靶向CD19的scFv可包含VH和VL。例如，所述VH可包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。例如，所述VL可包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。例如，所述靶向CD19的scFv可包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述靶向CD16a的scFv可包含HCDR1，HCDR2，HCDR3。例如，所述HCDR1可包含SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列，所述HCDR2可包含SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列，所述HCDR3可包含SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列。所述靶向CD19的scFv可包含LCDR1，LCDR2和LCDR3。例如，所述LCDR1可包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列，所述LCDR2可包含SEQ ID NO:55(QDN)所示的氨基酸序列，且所述LCDR3可包含SEQ ID NO:56所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述靶向CD16a的scFv可包含VH和VL。例如，所述VH可包含SEQ IDNO:57所示的氨基酸序列。例如，所述VL可包含SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列。例如，所述靶向CD19的scFv可包含SEQ ID NO:59所示的氨基酸序列。
在本申请中，在同一分离的抗原结合蛋白中可包含一个至多个连接子。例如，所述连接子可以是相同的连接子。例如，所述连接子可以各不相同。例如，所述连接子也可以部分相同，部分不同。
在本申请中，所述IgG4的铰链区可包含SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列。在本申请中，所述连接子可包含SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述多肽链从N端至C端可以依次包含：靶向第一抗原的VHH、TCRα链的恒定区、连接子、TCRβ链的恒定区和靶向第二抗原的VHH。
在本申请中，所述多肽链从N端至C端可以依次包含：靶向第一抗原的VHH、铰链区、TCRβ链的恒定区、连接子、TCRα链的恒定区、铰链区和靶向第二抗原的VHH。
在本申请中，所述多肽链从N端至C端依次包含：靶向第一抗原的VHH、铰链区、TCRα链的恒定区、连接子、TCRβ链的恒定区、铰链区、靶向第二抗原的VHH。
在本申请中，所述多肽链从N端至C端可以依次包含：靶向第一抗原的VHH、铰链区、TCRβ链的恒定区、连接子、TCRα链的恒定区、铰链区、靶向第二抗原的VHH。
多肽分子、核酸分子、载体、细胞和药物组合物
另一方面，本申请提供了多肽分子，其可以包含本申请所述的分离的抗原结合蛋白。
另一方面，本申请提供了一种或多种核酸分子，其可以编码本申请所述的分离的抗原结合蛋白。例如，其可以是通过以下方法产生或合成的：(i)在体外扩增的，例如通过聚合酶链式反应(PCR)扩增产生的，(ii)通过克隆重组产生的，(iii)纯化的，例如通过酶切和凝胶电泳分级分离，或者(iv)合成的，例如通过化学合成。
另一方面，本申请提供了一种载体，其可以包含本申请所述的核酸分子。此外，所述载体中还可包含其他基因，例如允许在适当的宿主细胞中和在适当的条件下选择该载体的标记基因。此外，所述载体还可包含允许编码区在适当宿主中正确表达的表达控制元件。这样的控制元件为本领域技术人员所熟知的，例如，可包括启动子、核糖体结合位点、增强子和调节基因转录或mRNA翻译的其他控制元件等。所述载体可通过转化、转导或转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内表达得以表达。所述载体可以包括，例如质粒、粘粒、病毒、噬菌体或者在例如遗传工程中通常使用的其他载体。例如，所述载体为表达载体。此外，所述载体还可以包括有协助其进入细胞的成分，如病毒颗粒、脂质体或蛋白外壳，但不仅仅只有这些物质。
另一方面，本申请提供了一种细胞，其可以包含本申请所述的核酸分子或本申请所述的载体。在某些实施方式中，每种或每个宿主细胞可包含一个或一种本申请所述的核酸分子或载体。在某些实施方式中，每种或每个宿主细胞可包含多个(例如，2个或以上)或多种(例如，2种或以上)本申请所述的核酸分子或载体。例如，可将本申请所述的载体引入所述宿主细胞中，例如真核细胞，如来自植物的细胞、真菌或酵母细胞等。在某些实施方式中，所述细胞可以是细菌细胞(例如，大肠杆菌)、酵母细胞或其它真核细胞。可通过本领域已知的方法将本申请所述的载体引入所述宿主细胞中。
另一方面，本申请还提供了药物组合物，其可以包含本申请所述的分离的抗原结合蛋白、本申请所述的多肽分子、本申请所述的核酸分子、本申请所述的载体和/或本申请所述的细胞，以及任选地药学上可接受的载剂。
在某些实施方案中，所述药物组合物还可以包含一种或多种(药学上有效的)佐剂、稳定剂、赋形剂、稀释剂、增溶剂、表面活性剂、乳化剂和/或防腐剂的合适的制剂。组合物的可接受成分在所用剂量和浓度下优选地对接受者无毒。本发明的药物组合物包括但不限于液体、冷冻和冻干组合物。
在某些实施方案中，所述药物组合物还可含有多于一种活性化合物，通常为不会不利地影响彼此的具有互补活性的那些活性化合物。此类药物的类型和有效量可以取决于例如制剂中存在的拮抗剂的量和类型，以及受试者的临床参数。
在某些实施方案中，所述药学上可接受的载剂可以包括与药物给药相容的任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、等渗剂和吸收延迟剂，通常安全、无毒。
在某些实施方案中，所述药物组合物可以包含肠胃外、经皮、腔内、动脉内、鞘内和/或鼻内施用或直接注射到组织中。例如，所述药物组合物可以通过输注或注射施用于患者或者受试者。在某些实施方案中，所述药物组合物的施用可以通过不同的方式进行，例如静脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、局部或真皮内施用。在某些实施方案中，所述药物组合物可以不间断施用。所述不间断(或连续)施用可以通过患者佩戴的小泵系统来实现，以测量流入患者体内的治疗剂，如WO2015/036583所述。
制备方法
另一方面，本申请提供了制备所述的抗原结合蛋白的方法。所述方法可包括，在使得所述的抗原结合蛋白表达的条件下，培养所述本申请所述的宿主细胞。例如，可通过使用适当的培养基、适当的温度和培养时间等，这些方法是本领域普通技术人员所了解的。
方法和用途
另一方面，本申请还提供了所述分离的抗原结合蛋白、所述的多肽分子、所述的核酸分子、所述的载体、所述的细胞和/或所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防、缓解和/或治疗疾病和/或病症。
另一方面，本申请还提供了预防、缓解或治疗疾病和/或病症的方法，所述方法可以包括向有需要的受试者施用本申请所述分离的抗原结合蛋白、所述的多肽分子、所述的核酸分子、所述的载体、所述的细胞和/或所述的药物组合物。在本申请中，所述施用可以通过不同的方式进行，例如静脉内、瘤内、腹膜内、皮下、肌肉内、局部或真皮内施用。
另一方面，本申请所述分离的抗原结合蛋白、所述的多肽分子、所述的核酸分子、所述的载体、所述的细胞和/或所述的药物组合物，其可以用于预防、缓解或治疗疾病和/或病症。
在本申请中，所述疾病和/或病症可以包括肿瘤。
在本申请中，所述肿瘤可以包括实体瘤和/或非实体瘤。
本申请还提供以下的实施方式：
1.分离的抗原结合蛋白，其包含靶向第一抗原的抗原结合片段和TCRα链的恒定区，以及靶向第二抗原的抗原结合片段和TCRβ链的恒定区。
2.根据实施方式1所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第一抗原的抗原结合片段和靶向第二抗原的抗原结合片段包括Fab、Fab’、F(ab)2、Fv片段、F(ab’)2、scFv、di-scFv、VHH和/或dAb。
3.根据实施方式1-2中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第一抗原的抗原结合片段为scFv或VHH。
4.根据实施方式1-3中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第二抗原的抗原结合片段为scFv或VHH。
5.根据实施方式1-4中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其不包含TCRα链的可变区。
6.根据实施方式1-5中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其不包含TCRβ链的可变区。
7.根据实施方式1-6中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第一抗原的抗原结合片段和所述TCRα链的恒定区通过铰链区相连。
8.根据实施方式1-7中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第二抗原的抗原结合片段和所述TCRβ链的恒定区通过铰链区相连。
9.根据实施方式7-8中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述铰链区包含IgG铰链区。
10.根据实施方式7-9中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述铰链区包含IgG4铰链区。
11.根据实施方式1-10中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述TCRα链的恒定区和所述TCRβ链的恒定区通过二硫键相连接。
12.根据实施方式1-11中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述TCRα链的恒定区和所述TCRβ链的恒定区通过连接子相连接。
13.根据实施方式12所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述连接子包含肽接头。
14.根据实施方式12-13中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述连接子的氨基酸序列为GGGGS。
15.根据实施方式1-14中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述第一抗原选自下组：ROR1、CD3、TIM3、CD19、PD-1和CD16a。
16.根据实施方式1-15中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述第二抗原选自下组：ROR1、CD3、TIM3、CD19、PD-1和CD16a。
17.根据实施方式1-17中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述第一抗原与所述第二抗原为同一抗原的不同抗原结合表位。
18.根据实施方式1-17中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述第一抗原和所述第二抗原不同。
19.根据实施方式1-18中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第一抗原的抗原结合片段为scFv。
20.根据实施方式1-19中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第一抗原的scFv包含靶向第一抗原的抗体轻链可变区VL和靶向第一抗原的抗体重链可变区VH。
21.根据实施方式20所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第一抗原的VH的N端和所述靶向第一抗原的VL的C端相连。
22.根据实施方式20所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第一抗原的VH的C端和所述靶向第一抗原的VL的N端相连。
23.根据实施方式20-21中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第一抗原的VH的C端与所述TCRα链的恒定区的N端相连。
24.根据实施方式24所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第一抗原的VL的C端与所述TCRα链的恒定区的N端相连。
25.根据实施方式20-24中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第一抗原的VH的N端与所述TCRα链的恒定区的C端相连。
26.根据实施方式20-24中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第一抗原的VL的N端与所述TCRα链的恒定区的C端相连。
27.根据实施方式1-26中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第二抗原的抗原结合片段为scFv。
28.根据实施方式1-27中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第二抗原的scFv包含靶向第二抗原的抗体轻链可变区VL和靶向第二抗原的抗体重链可变区VH。
29.根据实施方式28所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第二抗原的VH的N端和所述靶向第二抗原的VL的C端相连。
30.根据实施方式28所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第二抗原的VH的C端和所述靶向第二抗原的VL的N端相连。
31.根据实施方式28-30中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第二抗原的VH的C端与所述TCRβ链的恒定区的N端相连。
32.根据实施方式28-30中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第二抗原的VL的C端与所述TCRβ链的恒定区的N端相连。
33.根据实施方式28-32中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第二抗原的VH的N端与所述TCRβ链的恒定区的C端相连。
34.根据实施方式28-32中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第二抗原的VL的N端与所述TCRβ链的恒定区的N端相连。
35.根据实施方式1-34中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其还包含靶向第三抗原的抗原结合片段。
36.根据实施方式35所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第三抗原的抗原结合片段为scFv。
37.根据实施方式1-36中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其还包含靶向第四抗原的抗原结合片段。
38.根据实施方式37所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第四抗原的抗原结合片段为scFv。
39.根据实施方式36-38中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第三抗原的scFv与所述TCRα链的恒定区直接或间接相连。
40.根据实施方式36-38中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第三抗原的scFv与所述TCRα链的恒定区通过IgG4铰链区相连。
41.根据实施方式37-40中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第四抗原的scFv与所述TCRβ链的恒定区直接或间接相连。
42.根据实施方式37-41中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第四抗原的scFv与所述TCRβ链的恒定区通过IgG4铰链区相连。
43.根据实施方式36-42中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第三抗原的scFv包含靶向第三抗原的VH和靶向第三抗原的VL。
44.根据实施方式43所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第三抗原的VH的N端和所述靶向第三抗原的VL的C端直接或间接相连。
45.根据实施方式44所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第三抗原的VH的C端和所述靶向第三抗原的VL的N端直接或间接相连。
46.根据实施方式43-45中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第三抗原的VH的N端与所述TCRα链的恒定区的C端直接或间接相连。
47.根据实施方式43-45中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第三抗原的VH的C端与所述TCRα链的恒定区的N端直接或间接相连。
48.根据实施方式43-47中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第三抗原的VL的N端与所述TCRα链的恒定区的C端直接或间接相连。
49.根据实施方式43-47中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第三抗原的VL的C端与所述TCRα链的恒定区的N端直接或间接相连。
50.根据实施方式41-49中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第四抗原的scFv包含靶向第四抗原的VH和靶向第四抗原的VL。
51.根据实施方式50所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第四抗原的VH的N端和所述靶向第四抗原的VL的C端直接或间接相连。
52.根据实施方式50所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第四抗原的VH的C端和所述靶向第四抗原的VL的N端直接或间接相连。
53.根据实施方式51-52中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第四抗原的VH的N端与所述TCRβ链的恒定区的C端直接或间接相连。
54.根据实施方式51-52中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第四抗原的VH的C端与所述TCRβ链的恒定区的N端直接或间接相连。
55.根据实施方式50-54中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第四抗原的VL的N端与所述TCRβ链的恒定区的C端直接或间接相连。
56.根据实施方式50-54中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第四抗原的VL的C端与所述TCRβ链的恒定区的N端直接或间接相连。
57.根据实施方式1-17中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第一抗原的抗原结合片段为VHH。
58.根据实施方式57中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第一抗原的VHH与所述TCRα链的恒定区直接或间接相连。
59.根据实施方式57-58中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第一抗原的VHH的C端与所述TCRα链的恒定区的N端直接或间接相连。
60.根据实施方式58-59中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第一抗原的VHH与所述TCRα链的恒定区通过IgG4铰链区相连。
61.根据实施方式1-26和57-60中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第二抗原的抗原结合片段为VHH。
62.根据实施方式61所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第二抗原的VHH与所述TCRβ链的恒定区直接或间接相连。
63.根据实施方式61-62中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第二抗原的VHH的C端与所述TCRβ链的恒定区的N端直接或间接相连。
64.根据实施方式61-63中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第二抗原的VHH的C端与所述TCRβ链的恒定区通过IgG4铰链区相连。
65.根据实施方式1-34和57-64中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其还包含靶向第三抗原的抗原结合片段。
66.根据实施方式65所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第三抗原的抗原结合片段为VHH。
67.根据实施方式65-66中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第三抗原的VHH与所述TCRα链的恒定区直接或间接相连。
68.根据实施方式67所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第三抗原的VHH的N端与所述TCRα链的恒定区的C端直接或间接相连。
69.根据实施方式67-68中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第三抗原的VHH与所述TCRα链的恒定区通过IgG4铰链区相连。
70.根据实施方式1-36和57-69中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其还包含靶向第四抗原的抗原结合片段。
71.根据实施方式70所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第四抗原的抗原结合片段为VHH。
72.根据实施方式71所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第四抗原的VHH与所述TCRβ链的恒定区直接或间接相连。
73.根据实施方式71-72中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第四抗原的VHH的N端与所述TCRα链的恒定区的C端直接或间接相连。
74.根据实施方式71-73中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第四抗原的VHH与所述TCRβ链的恒定区通过IgG4铰链区相连。
75.分离的抗原结合蛋白，其包含两条多肽链，其中第一条多肽链包含靶向第一抗原的抗原结合片段和TCRα链的恒定区；其中第二条多肽链包含靶向第二抗原的抗原结合片段和TCRβ链的恒定区。
76.根据实施方式75所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第一抗原的抗原结合片段和靶向第二抗原的抗原结合片段包括Fab、Fab’、F(ab)2、Fv片段、F(ab’)2、scFv、di-scFv、VHH和/或dAb。
77.根据实施方式75-76中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第一抗原的抗原结合片为scFv或VHH。
78.根据实施方式75-77中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第二抗原的抗原结合片为scFv或VHH。
79.根据实施方式75-78中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述第一条多肽链与所述第二条多肽链通过二硫键连接。
80.根据实施方式75-79中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第一抗原的抗原结合片为scFv。
81.根据实施方式80所述的分离的抗原结合蛋白，在所述第一条多肽链中，所述靶向第一抗原的scFv和TCRα链的恒定区直接或间接相连。
82.根据实施方式80-81中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第一抗原的scFv和TCRα链的恒定区通过铰链区相连。
83.根据实施方式80-82中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第一抗原的scFv和TCRα链的恒定区通过IgG铰链区相连。
84.根据实施方式80-83中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第一抗原的scFv和TCRα链的恒定区通过IgG4的铰链区相连。
85.根据实施方式80-84中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第一抗原的scFv包含靶向第一抗原的VH和靶向第一抗原的VL。
86.根据实施方式80-85中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，所述第一条多肽链从N端到C端依次包含：靶向第一抗原的VL、靶向第一抗原的VH、以及TCRα链的恒定区。
87.根据实施方式80-85中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，所述第一条多肽链从N端到C端依次包含：靶向第一抗原的VL、连接子、靶向第一抗原的VH、IgG4的铰链区、以及TCRα链的恒定区。
88.根据实施方式75-79中任一项所述的分离的的抗原结合蛋白，其中所述靶向第一抗原的抗原结合片为VHH。
89.根据实施方式88所述的分离的抗原结合蛋白，在所述第一条多肽链中，所述靶向第一抗原的VHH和TCRα链的恒定区直接或间接相连。
90.根据实施方式89所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第一抗原的VHH和TCRα链的恒定区通过铰链区相连。
91.根据实施方式89-90中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第一抗原的VHH和TCRα链的恒定区通过IgG铰链区相连。
92.根据实施方式89-90中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第一抗原的VHH和TCRα链的恒定区通过IgG4的铰链区相连。
93.根据实施方式52-58中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，所述第一条多肽链从N端到C端依次包含：靶向第一抗原的VHH、以及TCRα链的恒定区。
94.根据实施方式75-79和88-93中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，所述第一条多肽链从N端到C端依次包含：靶向第一抗原的VHH、IgG4的铰链区、以及TCRα链的恒定区。
95.根据实施方式75-94中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其还包含靶向第三抗原的抗原结合片段。
96.根据实施方式95所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述第三抗原选自下组：ROR1、CD3、TIM3、CD19、PD-1和CD16a。
97.根据实施方式95-96中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第三抗原的抗原结合片段包括scFv。
98.根据实施方式95-97中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第三抗原的scFv包含靶向第三抗原的VH和靶向第三抗原的VL。
99.根据实施方式75-98中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，所述第一条多肽链从N端到C端依次包含：靶向第一抗原的VL、靶向第一抗原的VH、IgG4的铰链区、TCRα链的恒定区、IgG4的铰链区、靶向第三抗原的VL、以及靶向第三抗原的VH。
100.根据实施方式75-98中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，所述第一条多肽链从N端到C端依次包含：靶向第一抗原的VL、靶向第一抗原的VH、IgG4的铰链区、TCRα链的恒定区、IgG4的铰链区、靶向第三抗原的VH、以及靶向第三抗原的VL。
101.根据实施方式75-98中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，所述第一条多肽链从N端到C端依次包含：靶向第一抗原的VH、靶向第一抗原的VL、以及TCRα链的恒定区。
102.根据实施方式75-98中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，所述第一条多肽链从N端到C端依次包含：靶向第一抗原的VH、连接子、靶向第一抗原的VL、IgG4的铰链区、以及TCRα链的恒定区。
103.根据实施方式75-98中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，所述第一条多肽链从N端到C端依次包含：靶向第一抗原的VH、连接子、靶向第一抗原的VL、IgG4的铰链区、TCRα链的恒定区、IgG4的铰链区、靶向第三抗原的VL、连接子、以及靶向第三抗原的VH。
104.根据实施方式75-98中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，所述第一条多肽链从N端到C端依次包含：靶向第一抗原的VH、连接子、靶向第一抗原的VL、IgG4的铰链区、TCRα链的恒定区、IgG4的铰链区、靶向第三抗原的VH、连接子、以及靶向第三抗原的VL。
105.根据实施方式75-98中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，所述第一条多肽链包含靶向第一抗原的scFv、TCRα链的恒定区以及靶向第三抗原的scFv。
106.根据实施方式95-96中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第三抗原的抗原结合片段包括VHH。
107.根据实施方式75-79，95-96和106中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，所述第一条多肽链从N端到C端依次包含：靶向第一抗原的VHH、IgG4的铰链区、TCRα链的恒定区、IgG4的铰链区、靶向第三抗原的VHH。
108.根据实施方式75-79，95-96和106中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，所述第一条多肽链从N端到C端依次包含：靶向第一抗原的VHH、以及TCRα链的恒定区。
109.根据实施方式75-79，95-96和106中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，所述第一条多肽链从N端到C端依次包含：靶向第一抗原的VHH、IgG4的铰链区、以及TCRα链的恒定区。
110.根据实施方式75-79中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第二抗原的抗原结合片为scFv。
111.根据实施方式110所述的分离的抗原结合蛋白，在所述第二条多肽链中，所述靶向第二抗原的scFv和TCRβ链的恒定区直接或间接相连。
112.根据实施方式110-111中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第二抗原的scFv和TCRα链的恒定区通过铰链区相连。
113.根据实施方式110-112中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第二抗原的scFv和TCRβ链的恒定区通过IgG铰链区相连。
114.根据实施方式110-113中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第二抗原的scFv和TCRβ链的恒定区通过IgG4的铰链区相连。
115.根据实施方式110-114中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第二抗原的scFv包含靶向第二抗原的VH和靶向第二抗原的VL。
116.根据实施方式75-79和110-116中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，所述第二条多肽链从N端到C端依次包含：靶向第二抗原的VL、靶向第二抗原的VH、以及TCRβ链的恒定区。
117.根据实施方式75-79和110-116中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，所述第二条多肽链从N端到C端依次包含：靶向第二抗原的VL、连接子、靶向第二抗原的VH、IgG4的铰链区、以及TCRβ链的恒定区。
118.根据实施方式75-79和中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第二抗原的抗原结合片为VHH。
119.根据实施方式75-79和88-94中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，在所述第二条多肽链中，所述靶向第二抗原的VHH和TCRβ链的恒定区直接或间接相连。
120.根据实施方式119所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第二抗原的VHH和TCRβ链的恒定区通过铰链区相连。
121.根据实施方式118-120中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第二抗原的VHH和TCRβ链的恒定区通过IgG铰链区相连。
122.根据实施方式118-121中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第二抗原的VHH和TCRβ链的恒定区通过IgG4的铰链区相连。
123.根据实施方式119-122中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，所述第二条多肽链从N端到C端依次包含：靶向第二抗原的VHH、以及TCRβ链的恒定区。
124.根据实施方式119-122中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，所述第二条多肽链从N端到C端依次包含：靶向第二抗原的VHH、IgG4的铰链区、以及TCRβ链的恒定区。
125.根据实施方式75-94所述的分离的抗原结合蛋白，其还包含靶向第四抗原的抗原结合片段。
126.根据实施方式125所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述第四抗原选自下组：ROR1、CD3、TIM3、CD19、PD-1和CD16a。
127.根据实施方式125-126中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第四抗原的抗原结合片段包括scFv。
128.根据实施方式127所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第四抗原的scFv包含靶向第四抗原的VH和靶向第四抗原的VL。
129.根据实施方式125-128中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，所述第二条多肽链从N端到C端依次包含：靶向第二抗原的VL、连接子、靶向第二抗原的VH、IgG4的铰链区、TCRβ链的恒定区、IgG4的铰链区、靶向第四抗原的VH、连接子、以及靶向第四抗原的VL。
130.根据实施方式125-128中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，所述第二条多肽链从N端到C端依次包含：靶向第二抗原的VL、连接子、靶向第二抗原的VH、IgG4的铰链区、TCRβ链的恒定区、IgG4的铰链区、靶向第四抗原的VL、连接子、以及靶向第四抗原的VH。
131.根据实施方式125-128中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，所述第二条多肽链从N端到C端依次包含：靶向第二抗原的VH、靶向第二抗原的VL、以及TCRβ链的恒定区。
132.根据实施方式125-128所述的分离的抗原结合蛋白，所述第二条多肽链从N端到C端依次包含：靶向第二抗原的VH、连接子、靶向第二抗原的VL、IgG4的铰链区、以及TCRβ链的恒定区。
133.根据实施方式125-128中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，所述第二条多肽链从N端到C端依次包含：靶向第二抗原的VH、靶向第二抗原的VL、IgG4的铰链区、TCRβ链的恒定区、IgG4的铰链区、靶向第四抗原的VH、以及靶向第四抗原的VL。
134.根据实施方式125-128中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，所述第二条多肽链从N端到C端依次包含：靶向第二抗原的VH、靶向第二抗原的VL、IgG4的铰链区、以及TCRβ链的恒定区、IgG4的铰链区、靶向第四抗原的VL、以及靶向第四抗原的VH。
135.根据实施方式125-126中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第四抗原的抗原结合片段包括VHH。
136.根据实施方式75-79，88-94，95-96和106-109中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，所述第二条多肽链从N端到C端依次包含：靶向第二抗原的VHH、IgG4的铰链区、TCRβ链的恒定区、IgG4的铰链区、靶向第四抗原的VHH。
137.根据实施方式75-79，88-94，95-96和106-109中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，所述第二条多肽链从N端到C端依次包含：靶向第二抗原的VHH、以及TCRβ链的恒定区。
138.根据实施方式75-79，88-94，95-96和106-109中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，所述第二条多肽链从N端到C端依次包含：靶向第二抗原的VHH、IgG4的铰链区、以及TCRβ链的恒定区。
139.根据实施方式75-138中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述第一抗原选自下组：ROR1、CD3、TIM3、CD19、PD-1和CD16a。
140.根据实施方式75-138中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述第二抗原选自下组：ROR1、CD3、TIM3、CD19、PD-1和CD16a。
141.根据实施方式75-138中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述第一抗原与所述第二抗原不同。
142.根据实施方式75-138中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述第一抗原与所述第二抗原为同一抗原的不同抗原结合表位。
143.分离的抗原结合蛋白，其包含一条多肽链，所述多肽链包含靶向第一抗原的抗原结合片段和TCRα链的恒定区；以及靶向第二抗原的抗原结合片段和TCRβ链的恒定区。
144.根据实施方式143所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第一抗原的抗原结合片段和靶向第二抗原的抗原结合片段包括Fab、Fab’、F(ab)2、Fv片段、F(ab’)2、scFv、di-scFv、VHH和/或dAb。
145.根据实施方式143-144中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第一抗原的抗原结合片段为scFv或VHH。
146.根据实施方式143-145中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第二抗原的抗原结合片段为scFv或VHH。
147.根据实施方式143-146中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述多肽链从N端至C端依次包含：靶向第一抗原的scFv、TCRα链的恒定区、连接子、TCRβ链的恒定区和靶向第二抗原的scFv。
148.根据实施方式143-146中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述多肽链从N端至C端依次包含：靶向第一抗原的scFv、铰链区、TCRβ链的恒定区、连接子、TCRα链的恒定区、铰链区和靶向第二抗原的scFv。
149.根据实施方式146-148中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第一抗原的scFv包含靶向第一抗原的VH和靶向第一抗原的VL。
150.根据实施方式146-148中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第二抗原的scFv包含靶向第二抗原的VH和靶向第二抗原的VL。
151.根据实施方式149-150中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述多肽链从N端至C端依次包含：靶向第一抗原的VL、靶向第一抗原的VH、铰链区、TCRα链的恒定区、连接子、TCRβ链的恒定区、铰链区、靶向第二抗原的VH和靶向第二抗原的VL。
152.根据实施方式149-150中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述多肽链从N端至C端依次包含：靶向第一抗原的VL、连接子、靶向第一抗原的VH、铰链区、TCRβ链的恒定区、连接子、TCRα链的恒定区、铰链区、靶向第二抗原的VH、连接子、和靶向第二抗原的VL。
153.根据实施方式1-152中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述TCRα链的恒定区源自人TCRα链的恒定区。
154.根据实施方式1-153中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述TCRα链的恒定区包含SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列。
155.根据实施方式1-154中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述TCRβ链的恒定区源自人TCRβ链的恒定区。
156.根据实施方式1-155所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述TCRβ链的恒定区包含SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列。
157.根据实施方式1-156中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第一抗原的scFv包含SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:59中任一项所示的氨基酸序列。
158.根据实施方式1-156中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第二抗原的scFv包含SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:59中任一项所示的氨基酸序列。
159.根据实施方式143-146中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述多肽链从N端至C端依次包含：靶向第一抗原的VHH、TCRα链的恒定区、连接子、TCRβ链的恒定区和靶向第二抗原的VHH。
160.根据实施方式143-146中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述多肽链从N端至C端依次包含：靶向第一抗原的VHH、铰链区、TCRβ链的恒定区、连接子、TCRα链的恒定区、铰链区和靶向第二抗原的VHH。
161.根据实施方式143-146中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述多肽链从N端至C端依次包含：靶向第一抗原的VHH、铰链区、TCRα链的恒定区、连接子、TCRβ链的恒定区、铰链区、靶向第二抗原的VHH。
162.根据实施方式143-146中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述多肽链从N端至C端依次包含：靶向第一抗原的VHH、铰链区、TCRβ链的恒定区、连接子、TCRα链的恒定区、铰链区、靶向第二抗原的VHH。
163.分离的一种或多种核酸分子，其编码实施方式1-162中任一项所述的抗原结合蛋白。
164.根据实施方式163所述的核酸分子，其包含编码靶向第一抗原的scFv的核酸序列、编码靶向第二抗原的scFv的核酸序列、编码TCRα链的恒定区的核酸序列，以及编码TCRβ链的恒定区序列/编码TCRβ链的恒定区反向氨基酸序列的核酸序列。
165.根据实施方式163-164中任一项所述的核酸分子，其还包含编码IgG4铰链区的核酸序列。
166.根据实施方式163-165中任一项所述的核酸分子，其还包含编码剪切肽的核酸序列。
167.根据实施方式166所述的核酸分子，其中所述剪切肽包含2A肽。
168.根据实施方式163-167中任一项所述的核酸分子，其还包含编码连接子的核酸序列。
169.根据实施方式168所述的核酸分子，其中所述连接子的氨基酸序列为GGGGS。
170.根据实施方式163-169中任一项所述的核酸分子，其从5’端至3’端依次包含：编码靶向第一抗原的scFv的核酸序列、编码IgG4铰链区的核酸序列、编码TCRα链的恒定区的核酸序列、编码剪切肽的核酸序列、编码靶向第二抗原的scFv的核酸序列、编码IgG4铰链区的核酸序列和编码TCRβ链的恒定区序列。
171.根据实施方式163-170中任一项所述的核酸分子，其还包含编码靶向第三抗原的scFv的核酸序列/编码靶向第三抗原的scFv的反向氨基酸序列的核酸序列。
172.根据实施方式163-171中任一项所述的核酸分子，其还包含编码靶向第四抗原的scFv的核酸序列/编码靶向第四抗原的scFv的反向氨基酸序列的核酸序列。
173.根据实施方式163-172中任一项所述的核酸分子，其从5’端至3’端依次包含：编码靶向第一抗原的scFv的核酸序列、编码IgG4铰链区的核酸序列、编码TCRα链的恒定区的核酸序列、编码IgG4铰链区的核酸序列、编码靶向第三抗原的scFv的反向氨基酸序列的核酸序列、编码剪切肽的核酸序列、编码靶向第二抗原的scFv的核酸序列、编码IgG4铰链区的核酸序列、编码TCRβ链的恒定区序列、编码IgG4铰链区的核酸序列、以及编码靶向第四抗原的scFv的反向氨基酸序列的核酸序列。
174.根据实施方式163-172中任一项所述的核酸分子，其从5’端至3’端依次包含：编码靶向第一抗原的scFv的核酸序列、编码IgG4铰链区的核酸序列、编码TCRα链的恒定区的核酸序列、编码连接子的核酸序列、编码TCRβ链的恒定区反向氨基酸序列的核酸序列、编码IgG4铰链区的核酸序列和编码靶向第二抗原的scFv的核酸序列。
175.根据实施方式163所述的核酸分子，其包含编码靶向第一抗原的VHH的核酸序列、编码靶向第二抗原的VHH的核酸序列、编码TCRα链的恒定区的核酸序列，以及编码TCRβ链的恒定区序列/编码TCRβ链的恒定区反向氨基酸序列的核酸序列。
176.根据实施方式175所述的核酸分子，其还包含编码IgG4铰链区的核酸序列。
177.根据实施方式175-176中任一项所述的核酸分子，其还包含编码剪切肽的核酸序列。
178.根据实施方式177所述的核酸分子，其中所述剪切肽包含2A肽。
179.根据实施方式175-178中任一项所述的核酸分子，其还包含编码连接子的核酸序列。
180.根据实施方式179所述的核酸分子，其中所述连接子的氨基酸序列为GGGGS。
181.根据实施方式175-180中任一项所述的核酸分子，其从5’端至3’端依次包含：编码靶向第一抗原的VHH的核酸序列、编码IgG4铰链区的核酸序列、编码TCRα链的恒定区的核酸序列、编码剪切肽的核酸序列、编码靶向第二抗原的VHH的核酸序列、编码IgG4铰链区的核酸序列和编码TCRβ链的恒定区序列。
182.根据实施方式175-181中任一项所述的核酸分子，其还包含编码靶向第三抗原的VHH的核酸序。
183.根据实施方式175-182中任一项所述的核酸分子，其还包含编码靶向第四抗原的VHH的核酸序列。
184.根据实施方式175-183中任一项所述的核酸分子，其从5’端至3’端依次包含：编码靶向第一抗原的VHH的核酸序列、编码IgG4铰链区的核酸序列、编码TCRα链的恒定区的核酸序列、编码IgG4铰链区的核酸序列、编码靶向第三抗原的VHH氨基酸序列的核酸序列、编码剪切肽的核酸序列、编码靶向第二抗原的VHH的核酸序列、编码IgG4铰链区的核酸序列、编码TCRβ链的恒定区序列、编码IgG4铰链区的核酸序列、以及编码靶向第四抗原的VHH的氨基酸序列的核酸序列。
185.根据实施方式175-183中任一项所述的核酸分子，其从5’端至3’端依次包含：编码靶向第一抗原的VHH的核酸序列、编码IgG4铰链区的核酸序列、编码TCRα链的恒定区的核酸序列、编码连接子的核酸序列、编码TCRβ链的恒定区反向氨基酸序列的核酸序列、编码IgG4铰链区的核酸序列和编码靶向第二抗原的VHH的核酸序列。
186.载体，其包含实施方式163-185中任一项所述的核酸分子。
187.细胞，其包含实施方式163-185中任一项所述的核酸分子，或实施方式186所述的载体。
188.药物组合物，其包含实施方式1-162中任一项所述的抗原结合蛋白、实施方式163-185中任一项所述的核酸分子、实施方式186所述的载体，或实施方式187所述的细胞，以及任选地药学上可接受的载体。
189.实施方式1-162中任一项所述的抗原结合蛋白、实施方式163-185中任一项所述的核酸分子、实施方式186所述的载体、实施方式187所述的细胞、或实施方式188所述的药物组合物在制备药物中的应用，所述药物用于预防和/或治疗疾病和/或病症。
190.根据实施方式189所述的用途，其中所述疾病和/或病症包括肿瘤。
191.根据实施方式189所述的用途，其中所述肿瘤包括实体瘤和/或血液瘤。
不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请的抗原结合蛋白、制备方法和用途等，而不用于限制本申请发明的范围。
实施例
实验材料和方法
细胞系和培养
HEK293T、Jurkat E6、Jurkat-Luc、Raji、JeKo-1、MEC、MEC-ROR1、A549、HCC827、H1975和MDA-MB-231、HL60、K562细胞系获自美国ATCC。HEK293T-PD1细胞系是内部生成的。所有这些细胞系均保持在全培养基(IDMEM含有10％热灭活FCS、100U/mL青霉素/链霉素和2mM L-谷氨酰胺)中。使用Ficoll-Paque从健康供体的全血中分离PBMC，并在液氮罐中以1mL等分试样的2x107个细胞/mL的浓度冷冻保存在冷冻培养基[10％DMSO(vol/vol)中的热灭活FCS]。
实施例1构建、克隆、表达双抗/四抗重组抗体
所有基因结构均由GeneWiz合成。通过Apa1/Nhe1克隆位点将编码ROR1scFvxUCHT1scFv和ROR1 scFv和UCHT1 scFv单臂对照的基因域插入到带有sffv启动子的表达质粒pALD中。从这个克隆过程中去除了eGFP标记。ROR1 scFv由由28个氨基酸接头融合的VL和VH组成。为了产生cis双抗，ROR1 scFv和UCHT1 scFv通过Gly4Ser接头连接。添加了N端Kozac序列、IL2信号肽(SPIL2，SEQ ID NO:51)和C端V5标签。
为了产生基于TCR C的trans双抗，编码ROR1 scFv-IgG4hinge-TCRCa和UCHT1scFv-IgG4hinge-TCRCb的基因结构域通过P2A序列连接。为了产生基于顺式格式TCRC的双抗，编码ROR1 scFv-IgG4hinge-TCRCa和UCHT1 scFv-IgG4-TCRCb的基因域(以反向序列)通过GGGS序列连接。每个Trans或Cis格式都有两个子格式，其中TCRCa和TCRCb在两个链之间交换。类似地制备了四种基于CD19 scFcxUCHT1 scFv TCRC的双抗格式。
另外，为了产生基于TCRCab的trans四抗，编码ROR1 scFv-IgG4hinge-TCRCa-IgG4hinge-UCHT1 scFv和TIM3 scFv-IgG4hinge-TCRCb-IgG4hinge-PD1 scFv的基因域通过P2A序列连接。基于TCRC的双抗和基于TCRC的四抗均通过Ecor1/Not1克隆位点克隆到表达质粒pCDH中。
实施例2生产由裂解物衍生的双抗/四抗
从瞬时转染(lipofectamine-2000促进)或稳定建立的HEK293T和Jurkat细胞系(慢病毒载体)产生重组抗体。在冰冷的PBS中洗涤细胞后，用含有2mM PMSF的冰冷PBS重悬细胞，细胞密度为5x108/mL。细胞悬液经受三个冷冻(-80℃)/解冻(37℃)循环，并使用台式离心机在4℃下以14,800RPM离心10分钟。吸出澄清的上清液，加载最终浓度为5％的甘油，并在使用前以10uL等分试样在-20℃下储存。
本申请所构建的双抗/四抗的设计如表1所示。本申请所述双抗/四抗的结构示意图如图1所示。
表1以TCR恒定区开发的二抗和四抗设计
流式细胞测定法
使用流式细胞仪(Beckman Coulter)以平板模式进行流式细胞测定，并使用FlowJo软件分析数据。细胞用FACS缓冲液(含0.5％ BSA、0.1％ NaN3、2mM EDTA、pH7.0的PBS)洗涤一次，重悬至5x107个细胞/mL，染色前置于冰上。对于一抗染色，将1.5uL BsAb和对照分配到96孔圆底组织培养板的孔中。然后，将4.5uL制备的细胞加入孔中。将板在4℃下孵育45分钟后，向每个孔中加入150uL FACS缓冲液用于洗涤细胞。以300xg离心3分钟后，去除上清液。对于二抗染色，将细胞沉淀与20uL稀释的抗体偶联物在4℃下孵育45分钟。在用FACS缓冲液洗涤和悬浮后，通过流式细胞术分析细胞。
免疫印迹法
将细胞裂解物和4至10倍浓缩的上清液溶解在含有5％巯基乙醇的裂解缓冲液[50mM Hepes(pH 7.4)、150mM NaCl、1％ NP-40和1mM EDTA]中，并在12.5％ SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，并使用半干转移系统(Bio-Rad)转移到聚偏二氟乙烯膜(Pall)上。用PBS中的2％ BSA封闭膜，并用辣根过氧化物酶偶联的抗V5或抗HA抗体(室温2小时，抗体稀释度1:500)探测。使用iBright成像系统(Thermo Scientific)通过增强化学发光底物(Bio-Rad)检测膜上的特定条带。
免疫荧光法
将5uL瞬时转染或稳定建立的HEK293T细胞(1×105)通过风干(室温，30分钟)固定在载玻片上，并在100％甲醇中固定和渗透(4℃，15分钟)。用PBS中的2％ BSA封闭后，用FITC偶联抗体对细胞进行染色(37℃，45分钟)。使用的抗体包括同种型IgG1-FITC对照、抗V5-FITC抗体和抗HA-FITC抗体。将载玻片洗涤两次并浸没在PBS中。使用40X物镜通过荧光显微镜(Bio-Rad)对染色的细胞进行可视化并捕获图像。
利用抗HA-FITC免疫荧光法测定四种格式二抗在HEK293 T细胞中表达，结果如图2A所示。利用抗HA-HRP在还原条件下作免疫印迹试验，测定HEK293 T细胞裂解物中的四种格式二抗表达，结果如图2B所示。利用流式测定四种格式二抗结合相应ROR1阳性肿瘤和T细胞情况,使用抗HA-APC荧光标记抗体，结果如图2C所示。
结果显示，HEK293 T细胞均可稳定表达产生四种格式二抗，其二抗蛋白都能结合相应ROR1阳性肿瘤和T细胞。
实施例3本申请所述双抗的重定向试验
通过将裂解物衍生的双抗/四抗与T细胞和肿瘤细胞的混合物共同孵育来确定细胞裂解物衍生的双抗/四抗在重定向T细胞活化方面的效力。简而言之，将100uL效应细胞(1x105细胞、未转导的Jurkat T细胞或新鲜解冻的PBMC)与100uL靶肿瘤细胞(2x105细胞、Raji、JeKo-1、MEC、MEC-ROR1、A549、HCC827、H1975或MDA-MB-231)，在圆底96孔组织培养板中，以每孔200uL的最终体积以1:2的效应物与靶标的比例。然后以1:100至1:1600的最终稀释度在细胞混合物中加载2uL细胞裂解物衍生的BsAb。以300xg离心3分钟后，将板在37℃和5％ CO2下孵育16小时。将150uL上清液转移到新的圆底96孔组织培养板中。上清液用于使用商业人体IL-2ELISA试剂盒测量IL-2浓度，并使用内部开发的IFN-g ELISA试剂盒测量IFN-g浓度，其中2G1单克隆抗体(Cat.No.:M700A,ThermoFisher Scientific)用作捕获抗体，生物素化B133.5抗体(Cat.No.M701B,ThermoFisher Scientific)用作开发抗体。
利用含Trans-TCRCab,Trans-TCRCba,Cis-TCRCab,and Cis-TCRCba二抗的裂解物加入效靶比为1:2的PBMC和MEC-ROR1肿瘤细胞混液，经16小时的培养，获取上清液，测定IL2和IFNγ分泌情况。同时，非转染的HEK293T裂解物用于阴性对照。MEC(ROR1-)为阴性肿瘤细胞对照。共测试过四人的PBMC，编号为1840，5583,1753,1142。重定向试验结果如图3所示。
按trans和cis结构，再设计四种格式针对CD19二抗，通过瞬转HEK293T细胞产生二抗蛋白。最后将含Trans-TCRCab,Trans-TCRCba,Cis-TCRCab和Cis-TCRCba二抗的裂解物加入效靶比为1:2的Jurkat细胞(图4A)或健康人1840PMBC(图4B)和CD19+肿瘤细胞(MEC,MEC-ROR1)混液，经16小时的培养，获取上清液，测定IL2分泌情况。HL60(CD19-)为阴性肿瘤细胞对照。ROR1xUCHT-Cis-TCRCab二抗作为阳性对照，当它与MEC-ROR1细胞一起时会产生IL2分泌。非转染的HEK293T裂解物则为阴性对照。
实施例4本申请所述四抗结构与靶点相结合的效果检测
ROR1/TIM3/PD1/CD3四抗的结构如图5所示。使用抗HA-APC荧光抗体和TIM3-His-tag-PE测试四抗结合相应细胞系MEC-ROR1(表达ROR1+),Jurkat(表达CD3+),和HEK-PD1(表达PD1+),而MEC作为阴性对照细胞株。流式验证结果(图6)显示，本申请所述四抗通过四臂分别结合细胞表面抗原和融合蛋白。
在效靶比为1：2的PBMC和Raji(CD19+)癌细胞共培养体系中加入裂解物衍生的抗体培养16小时，重组抗体Trans-TCRCab，Trans-TCRCba，Cis-TCRCab，Cis-TCRCba都能诱导IL2(左)和IFNg(右)的产生。HL60(CD19-)用作靶细胞的阴性对照，PBS(例如图中的Noantibody)用作刺激物的阴性对照。共培养实验重复了两次，结果展示为均值+标准差。实验使用捐赠者1840的PBMC。实验结果如图7所示，替换CD19-CD3双抗后，所有四种结构均有靶点识别和杀伤功能。
使用抗HA-APC、抗TCRCb-APC/Cy7和抗His-PE的抗体，通过流式细胞仪来分析四抗与细胞系MEC-ROR1(ROR1+)、Jurkat(CD3+)和HEK-PD1(PD1+)以及游离蛋白CD16a-His的结合。图8A为抗HA-APC、抗TCRb-APC/C7和抗His-PE的背景信号，图8B为四抗分子示意图。竖直箭型代表同一轴上的结合，图中同一轴上结合的百分比标注为下方峰形的标注。MEC-ROR1xHA-APC(99.4％)、JurkatxHA-APC(95.6％)、HEK-PD1xTCRb-APC/Cy7(85.7％)和HEK-PD1xCD16a-His-PE(92.4％)，同轴结合证明四个结合臂可以独立地结合到各自的细胞表面受体或游离蛋白(CD16a)。倾斜箭型代表了交叉轴上的结合，图中交叉轴上的结合百分比标注为上方峰形的标注。HEK-PD1xHA-APC(97.0％)、MEC-ROR1xTCRb-APC/Cy7(70.2％)、MEC-ROR1xCD16a-His-PE(96.2％)，交叉轴结合证明四抗是由TCRCa和TCRCb两条链结合形成的完整分子。
实施例5本申请所述四抗结构对肿瘤癌细胞的杀伤效果检测
在效靶比为2：1的PBMC和ROR1+癌细胞(MEC-ROR1)共培养体系中加入HEK裂解物衍生的抗体培养16小时，重组四抗-Trans-TCRCab-RUCD16aP能诱导IL2(左)和IFNg(右)的产生。K562(ROR1-)和MEC(ROR1-)用作阴性对照细胞系。HEK293T裂解物和无抗体(即添加PBS)用作阴性试剂对照。仅使用PBMC(即不添加靶细胞和也无抗体)用作阴性对照。实验重复两次，使用捐赠者8407的PBMC进行实验。实验结果如图9所示，四抗-Trans-TCRCab-RUCD16aP重组抗体能够重定向人PBMC靶向ROR1+肿瘤细胞系并诱导细胞因子产生。
Claims (10)
1.分离的抗原结合蛋白，其包含两条多肽链，其中第一条多肽链包含靶向第一抗原的抗原结合片段和TCRα链的恒定区；其中第二条多肽链包含靶向第二抗原的抗原结合片段和TCRβ链的恒定区。
2.根据权利要求1所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第一抗原的抗原结合片段和靶向第二抗原的抗原结合片段包括Fab、Fab’、F(ab)2、Fv片段、F(ab’)2、scFv、di-
scFv、VHH和/或dAb。
3.根据权利要求1所述的分离的抗原结合蛋白，所述第一条多肽链还包含靶向第三抗原的抗原结合片段。
4.根据权利要求1所述的分离的抗原结合蛋白，所述第二条多肽链还包含靶向第四抗原的抗原结合片段。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，所述第一条多肽链从N端到C端依次包含：(1)靶向第一抗原的VL、靶向第一抗原的VH、以及TCRα链的恒定区，(2)靶向第一抗原的VL、连接子、靶向第一抗原的VH、IgG4的铰链区、以及TCRα链的恒定区，(3)靶向第一抗原的VHH、以及TCRα链的恒定区，(4)靶向第一抗原的VHH、IgG4的铰链区、以及TCRα链的恒定区，(5)靶向第一抗原的VL、靶向第一抗原的VH、IgG4的铰链区、TCRα链的恒定区、IgG4的铰链区、靶向第三抗原的VL、以及靶向第三抗原的VH，(6)靶向第一抗原的VL、靶向第一抗原的VH、IgG4的铰链区、TCRα链的恒定区、IgG4的铰链区、靶向第三抗原的VH、以及靶向第三抗原的VL，(7)靶向第一抗原的VH、连接子、靶向第一抗原的VL、IgG4的铰链区、TCRα链的恒定区、IgG4的铰链区、靶向第三抗原的VL、连接子、以及靶向第三抗原的VH，或者(8)靶向第一抗原的VH、连接子、靶向第一抗原的VL、IgG4的铰链区、TCRα链的恒定区、IgG4的铰链区、靶向第三抗原的VH、连接子、以及靶向第三抗原的VL。
6.根据权利要求1-4中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，所述第一条多肽链从N端到C端依次包含：(1)靶向第一抗原的VHH、IgG4的铰链区、TCRα链的恒定区、IgG4的铰链区、靶向第三抗原的VHH，(2)靶向第一抗原的VHH、以及TCRα链的恒定区，或者(3)靶向第一抗原的VHH、IgG4的铰链区、以及TCRα链的恒定区。
7.根据权利要求1-4中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，所述第二条多肽链从N端到C端依次包含：(1)靶向第二抗原的VL、靶向第二抗原的VH、以及TCRβ链的恒定区，(2)靶向第二抗原的VL、连接子、靶向第二抗原的VH、IgG4的铰链区、以及TCRβ链的恒定，(3)靶向第二抗原的VL、连接子、靶向第二抗原的VH、IgG4的铰链区、TCRβ链的恒定区、IgG4的铰链区、靶向第四抗原的VH、连接子、以及靶向第四抗原的VL，(4)靶向第二抗原的VL、连接子、靶向第二抗原的VH、IgG4的铰链区、TCRβ链的恒定区、IgG4的铰链区、靶向第四抗原的VL、连接子、以及靶向第四抗原的VH，(5)靶向第二抗原的VH、靶向第二抗原的VL、以及TCRβ链的恒定区，
(6)靶向第二抗原的VH、连接子、靶向第二抗原的VL、IgG4的铰链区、以及TCRβ链的恒定区，(7)靶向第二抗原的VH、靶向第二抗原的VL、IgG4的铰链区、TCRβ
链的恒定区、IgG4的铰链区、靶向第四抗原的VH、以及靶向第四抗原的VL，或者(8)靶向第二抗原的VH、靶向第二抗原的VL、IgG4的铰链区、以及TCRβ链的恒定区、IgG4的铰链区、靶向第四抗原的VL、以及靶向第四抗原的VH。
8.根据权利要求1-4中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，所述第二条多肽链从N端到C端依次包含：(1)靶向第二抗原的VHH、IgG4的铰链区、TCRβ链的恒定区、IgG4的铰链区、靶向第四抗原的VHH，(2)靶向第二抗原的VHH、以及TCRβ链的恒定区，或者(3)靶向第二抗原的VHH、IgG4的铰链区、以及TCRβ链的恒定区。
9.根据权利要求1-4中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第一抗原的scFv包含SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:45和SEQID NO:59中任一项所示的氨基酸序列。
10.根据权利要求1-4中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述靶向第二抗原的scFv包含SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:45和SEQID NO:59中任一项所示的氨基酸序列。
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