CN117990911A - 一种用于检测抗cd22的单克隆抗体的活性的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测抗CD22的单克隆抗体的活性的方法，所述方法包括将待测抗CD22的单克隆抗体与RAMOS细胞共孵育，检测内吞的待测抗CD22的单克隆抗体的浓度，将内吞的待测抗CD22的单克隆抗体的浓度与待测抗CD22的单克隆抗体的原始浓度相比，得到待测抗CD22的单克隆抗体的活性。本发明的方法针对抗CD22抗体独特的作用机制，本发明提供了一种特异性的基于细胞的活性检测方法，适用于SM03、SM06等抗CD22的单克隆抗体的质量控制；通过测定抗体结合CD22的内化率来实现对抗CD22的单克隆抗体的活性检测。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测领域，具体的说，涉及一种用于检测抗CD22的单克隆抗体的活性的方法及其应用。
背景技术
CD22是BCR的共受体，通过能够区分病原体(“非自身”)或表达2,6-连接唾液酸配体的自体(“自身”)细胞上的抗原来调节有害的自身抗原信号转导，其中CD22将与2,6-连接唾液酸配体结合并调节有害的BCR信号转导(Nitschke et al.,1997,Cornall et al.,1999,Kawasaki et al.,2011)。CD22先前被证明存在于事先形成同源多聚体的纳米团簇中，其形成依赖于相邻CD22分子与2,6-连接唾液酸配体的顺式结合(Gasparrini et al.,2016)。CD22纳米团簇被覆盖从而限制BCR的调节。另一方面，当自体细胞(自身)上的自身抗原与BCR结合时，CD22优先与自体细胞的α2，6-连接唾液酸配体反式结合，增加B细胞活化的免疫调节，从而导致对自身抗原的免疫耐受(Courtney et al.,2009,Pfrengle et al.,2013,Lübbers et al.,2018,Kishimoto and Maldonado,2018)。B细胞上CD22的顺式配体和反式配体结合之间的平衡发生偏移将影响CD22的免疫调节功能，导致自身免疫反应发生。事实上，通过损伤唾液酸O-乙酰酯酶(SIAE)，使得CD22与唾液酸的结合失调，与自身免疫性障碍有关(Surolia et al.,2010)。而且，SIAE缺失的转基因小鼠容易发生SLE样自身免疫性疾病，突出了CD22和α2，6-连接唾液酸配体的结合在B细胞免疫调节功能中所起的重要作用(Surolia et al.,2010,Macauley and Paulson,2014,Kishimoto and Maldonado,2018)。
SM03是一种重组人CD22单克隆抗体注射液，于2006年8月首次获得CDE批准开展临床试验，目前已被CDE批准在非霍奇金氏淋巴瘤、系统性红斑狼疮和类风湿关节炎中开展临床试验。药理学研究发现，其能够高选择特异性的与人B细胞表面的CD22结合。
经人源化改造的SM03单抗被命名为SM06。SM03和SM06针对人CD22抗原上的同一个位点，且具有类似的亲和力。然而，在氨基酸序列和结构上，SM03和SM06只有抗原识别部位相同，这一相同部分由它们各自的互补决定区(CDR)序列构成。SM03和SM06都能特异性识别吸附人CD22抗原，而且结合后抗体-抗原复合体会发生明显的内化。这一特性使得对SM03和SM06单抗产品的生物活性检测变得十分困难。
SM03在体内可诱导恒河猴和食蟹猴特征性的外周血CD22+B细胞清除效应。安全药理学研究发现，SM03对呼吸系统、心血管系统及中枢神经系统均无影响。通过一系列体内外药代动力学研究表征SM03的药代动力学特征；并在相关种属食蟹猴中进行了单次及重复给药毒性研究，另外，还进行了组织交叉研究、体外溶血研究表征SM03的毒性特征。上述研究结果表明，SM03靶点明确，具有潜在治疗自身免疫性疾病的药效，且具有较好的药代特征及安全性。
CD22抗原为B细胞系限制性分化抗原，存在于分化成熟的B-细胞表面，作为抑制性受体，参与B细胞内及B细胞介导信号通路的功能性调节。SM03等单抗能够识别并吸附CD22抗原，理论上，SM03等单抗通过吸附成熟B细胞表面所表达的CD22抗原，参与调控B细胞介导的免疫反应，或改变B细胞本身的分化增殖特性，影响其下游的细胞信号通路。SM03对B细胞致炎性免疫产生抑制的作用机理尚未明确证实，申请人进行的拓展性研究显示，SM03是一种抗CD22的重组IgG1单克隆抗体，申请人提出SM03作为系统性自身免疫性疾病治疗药物的成功是通过利用SM03全新独特的作用机制。CD22是BCR的抑制性共受体，是抗自身免疫性疾病潜在的免疫治疗靶点。SM03通过干扰CD22与α2，6-连接唾液酸的顺式结合，干扰CD22同源多聚体构象，诱导CD22从人B细胞表面快速内化，并促进CD22与人自体细胞的反式结合。这导致增加了下游免疫调节分子Src同源区2结构域的磷酸酶1(SHP-1)的活性，结果降低了BCR诱导的人B细胞NF-κB活化和B细胞增殖(Wong et al.,2022)。该作用机制为支持临床试验中疾病的显著改善和良好的安全性提供了理论依据，如通过CD22反式结合自体细胞上的α2,6-唾液酸配体的“自身”识别机制，SM03特异性地恢复B细胞对宿主组织的免疫耐受，而不影响正常B细胞对病原体的免疫反应能力。
针对SM03等抗CD22的单克隆抗体与CD22结合之后会随着CD22一起被内吞至细胞内部的特性，本领域急需开发一项针对抗CD22的单克隆抗体内吞的活性检测方法。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种用于检测抗CD22的单克隆抗体的活性的方法及其应用。
本发明提供一种用于检测抗CD22的单克隆抗体的活性的方法，将待测抗CD22的单克隆抗体与RAMOS细胞共孵育，检测内吞的待测抗CD22的单克隆抗体的浓度，将内吞的待测抗CD22的单克隆抗体的浓度与待测抗CD22的单克隆抗体的原始浓度相比，得到待测抗CD22的单克隆抗体的活性。
其中，所述的用于检测抗CD22的单克隆抗体的活性的方法，其特征在于，所述抗CD22的单克隆抗体为单克隆抗体SM03或单克隆抗体SM06。
其中，所述检测内吞的待测抗CD22的单克隆抗体的浓度的方法包括如下步骤：
1)将待测样品与RAMOS细胞共孵育并诱导内吞；
2)将步骤1)中培养的细胞酸洗以去除剩余的表面结合抗体，然后固定；
3)将步骤2)固定后的细胞培养物中加入通透液以封闭并透化；
4)向步骤3)中透化好的细胞中加入具有HRP偶联物的抗IgG抗体的封闭液进行探测；
5)加入TMB和终止溶液，检测内吞的的待测抗CD22的单克隆抗体的浓度。
其中，所述步骤1)中的诱导温度为37℃，诱导时间为1小时；所述步骤1)中酸洗的酸洗使用的酸洗液的为甘氨酸、氯化钠的水溶液，配置方法为称取0.75g甘氨酸、0.44g氯化钠，溶于50ml超纯水中，pH调至3.0。
其中，所述步骤2)中固定使用的固定液为4％多聚甲醛溶液；固定时间为10min。
其中，所述步骤3)中使用的通透液为用1×PBS配制1％BSA溶液0.1％Triton-X100溶液，2～8℃保存；所述封闭并透化的时间为1小时。
其中，所述步骤4)中的HRP偶联物的抗IgG抗体在封闭液中的稀释比例为1:5000(体积比)；
所述步骤4)中的封闭液为用1×PBS配制1％BSA溶液；
所述探测时间为1小时。
其中，所述步骤5)中检测内吞的的待测抗CD22的单克隆抗体的浓度的方法为，检测加入TMB和终止溶液后的细胞培养液的OD值，并将其与活性为100％的抗CD22的单克隆抗体的标准曲线相比较，得到检测内吞的的待测抗CD22的单克隆抗体的浓度。
其中，所述活性为100％的抗CD22的单克隆抗体的标准曲线的制备方法为：首先，配置不同梯度浓度的活性为100％的抗CD22的单克隆抗体溶液，分别按照上述1)-5)的方法进行实验，检测得到不同浓度的100％的抗CD22的单克隆抗体溶液的OD值，分别以活性为100％的抗CD22的单克隆抗体溶液的浓度和OD值为坐标，绘制曲线，得到活性为100％的抗CD22的单克隆抗体的标准曲线。
其中，所述步骤5)中的终止液为0.18M硫酸溶液。
上述的用于检测抗CD22的单克隆抗体的活性的方法在制备含有抗CD22的单克隆抗体的药物中的应用也应在本发明的保护范围之内。
本发明的有益效果在于：针对抗CD22抗体独特的作用机制，本发明提供了一种特异性的基于细胞的活性检测方法，适用于SM03、SM06等抗CD22的单克隆抗体的质量控制。该方法通过测定抗体结合CD22的内化率来实现对抗CD22的单克隆抗体的活性检测。经实验证明，该检测方法稳定、灵敏度高，适用于抗CD22的单克隆抗体的质量控制，可进一步与药品评价方法结合用于评价抗CD22的产品是否达到预期疗效。
附图说明
图1为SM03与IgG同种型抗体对照在RAMOS细胞上诱导的CD22内化的四参数拟合曲线。X轴表示抗体mAb的浓度(取Log10值)，Y轴表示吸光度值(O.D.450)。该图显示SM03特异性地诱导结合诱导的CD22内化的浓度依赖性增加。双向方差分析表明，两条曲线在统计学上不同，SM03比IgG(hIgG)具有更高的内化。此外，事后bonferroni检验显示内化水平在0.8、0.2、0.05和0.0125μg/ml存在显着差异。N＝2双向方差分析*，p<0.05；***，p<0.001。
图2为SM03在RAMOS细胞上诱导的CD22内化的3次独立测量的四参数拟合曲线。X轴表示SM03 mAb的浓度(取Log10值)，Y轴表示吸光度值(O.D.450)。这显示了该测定的稳健性，并表明其适合作为SM03功能的验证测定。
图3为SM03在37℃孵育0.5小时、1小时和2小时后诱导RAMOS上的CD22内化的四参数拟合曲线。X轴表示SM03 mAb的浓度(取Log10值)，Y轴表示吸光度值(O.D.450)。这显示了不同的孵育时间结果均应符合系统适用和性耐用性。
图4为SM03的三个独立测试被稀释至50％、100％和150％的活性滴度水平(分别为0.4、0.8和1.2μg/ml)，并且在RAMOS细胞上诱导的CD22内化的四参数拟合曲线。X轴表示SM03 mAb的浓度(取Log10值)，Y轴表示吸光度值(O.D.450)。该图显示用100％(0.8μg/ml)的参比样品对各浓度样品的EC50和％RSD进行归一化计算样品的回收率，应满足70-130％的要求。
图5为SM03与SM06在RAMOS细胞上诱导的CD22内化的四参数拟合曲线。X轴表示SM03和SM06 mAb的浓度(取Log10值)，Y轴表示吸光度值(O.D.450)。该图显示，SM06是SM03的人源化版本(Zhao et al.,2014)，具有与SM03相似的CD22结合诱导内化率。
图6为实施例2中浓度为0.48的SM03样品的测定值及其与SM03的标准曲线的对应图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中使用的设备包括：酶标仪、二氧化碳培养箱(设定为37℃、5％二氧化碳)、离心机(适配50ml、15ml离心管的转子和适配96孔板的转子)。
下述实施例中的以参比品SM03-RefStd-202101(海南赛乐敏生物科技有限公司)作为样品进行方法开发及验证。SM06(中国抗体制药有限公司)。Human Serum IgG(Sigma)作为专属性样品。
下述实施例中的Ramos细胞(CRL-1596TM)、RPMI 1640培养基(GibcoTM,22400-089)、胎牛血清(GibcoTM,10099-141)、青霉素-链霉素溶液(GibcoTM,15140-122)、酶标抗体(anti-hIgG Fcγ-HRP)(Jackson ImmunoResearch,109-035-038)。
下述实施例中的磷酸盐缓冲液pH 7.40(1×PBS)：取磷酸二氢钠0.96g、磷酸氢二钠1.70g及氯化钠6.90g，加纯化水900ml搅拌溶解，调pH至7.40，再用纯化水定容至1000ml。0.2μm滤膜过滤，室温保存，有效期3个月。5.3.7酸洗液：称取0.75g甘氨酸、0.44g氯化钠，溶于50ml超纯水中，pH调至3.0。固定液：4％多聚甲醛溶液(PFA)。封闭液：用1×PBS配制1％BSA溶液，2～8C保存。通透液：用1×PBS配制1％BSA、0.1％Triton-X 100溶液，2～8C保存。洗涤液：取1ml Tween-20加入到1L的已过滤1×PBS中，摇匀即得，室温保存。显色液：四甲基联苯胺(TMB)，2～8C保存。终止液：取1ml浓硫酸加入100ml超纯水中，得0.18M硫酸溶液。
本发明提供一种用于检测抗CD22的单克隆抗体的活性的方法,将待测抗CD22的单克隆抗体与RAMOS细胞共孵育，检测内吞的待测抗CD22的单克隆抗体的浓度，将内吞的待测抗CD22的单克隆抗体的浓度与待测抗CD22的单克隆抗体的原始浓度相比，得到待测抗CD22的单克隆抗体的活性。
其中，所述的用于检测抗CD22的单克隆抗体的活性的方法，其特征在于，所述抗CD22的单克隆抗体为单克隆抗体SM03或单克隆抗体SM06。
其中，所述检测内吞的待测抗CD22的单克隆抗体的浓度的方法包括如下步骤：
1)将待测样品与RAMOS细胞共孵育并诱导内吞；
2)将步骤1)中培养的细胞酸洗以去除剩余的表面结合抗体，然后固定；
3)将步骤2)固定后的细胞培养物中加入通透液以封闭并透化；
4)向步骤3)中透化好的细胞中加入具有HRP偶联物的抗IgG抗体的封闭液进行探测；
5)加入TMB和终止溶液，检测内吞的的待测抗CD22的单克隆抗体的浓度。
其中，所述步骤1)中的诱导温度为37℃，诱导时间为1小时；所述步骤1)中酸洗的酸洗使用的酸洗液的配置方法为称取0.75g甘氨酸、0.44g氯化钠，溶于50ml超纯水中，pH调至3.0。
其中，所述步骤2)中固定使用的固定液为4％多聚甲醛溶液；固定时间为10分钟。
其中，所述步骤3)中使用的通透液为用1×PBS配制1％BSA溶液0.1％Triton-X100溶液，2～8℃保存；所述封闭并透化的时间为1小时。
其中，所述步骤4)中的HRP偶联物的抗IgG抗体在封闭液中稀释至1:5000体积比；所述步骤4)中的HRP偶联物的抗IgG抗体封闭液为用1×PBS配制1％BSA溶液；所述探测时间为1小时。
其中，所述步骤5)中检测内吞的的待测抗CD22的单克隆抗体的浓度的方法为，检测加入TMB和终止溶液后的细胞培养液的OD值，并将其与活性为100％的抗CD22的单克隆抗体的标准曲线相比较，得到检测内吞的的待测抗CD22的单克隆抗体的浓度。
其中，所述活性为100％的抗CD22的单克隆抗体的标准曲线的制备方法为：首先，配置不同梯度浓度的活性为100％的抗CD22的单克隆抗体溶液，分别按照上述1)-5)的方法进行实验，检测得到不同浓度的100％的抗CD22的单克隆抗体溶液的OD值，分别以活性为100％的抗CD22的单克隆抗体溶液的浓度和OD值为坐标，绘制曲线，得到活性为100％的抗CD22的单克隆抗体的标准曲线。
其中，所述步骤5)中的终止液为0.18M硫酸溶液。
上述方法中的具体可以包括如下操作步骤：
1.检测方法
1.1按下表准备完全培养基，2～8℃保存，有效期3个月。可按需要等比例缩小或扩大体积。
| 试剂 | 体积(ml) |
| RPMI 1640 | 445 |
| 胎牛血清 | 50 |
| 青霉素-链霉素溶液 | 5(按需加入) |
1.2按《细胞计数及活率测定》测定Ramos细胞的活细胞数、细胞活率。只有细胞活率≥80％时，才能进行检测。计算总的细胞数以及传代所需的接种细胞数。
1.3将所需的接种细胞液离心(350rcf，5min，室温)，离心好后弃上清剩余大约0.2ml细胞液，用培养液稀释悬浮的细胞到浓度2×106/ml，1块96孔板大约需要6ml稀释后细胞液，即1.2×107的细胞数。
1.4把细胞悬液加到96孔板中，每孔50μl。
1.5样品稀释
1.5.1取活性100％的抗CD22的单克隆抗体作为参比品，在96孔深孔板内用完全培养基依次稀释至1mg/ml、100μg/ml和10μg/ml。然后进行梯度稀释，每个稀释浓度不少于150μl。建议的稀释方法如下表：
备注：配制后的药液与细胞悬液以1：1形式混合，因此反应体系中药液终浓度为配制浓度的1/2。
1.6加样
1.6.1样品孔：每个孔加50μl的样品(加到已加入细胞悬液的96孔板中)，每个样品做3个复孔。
1.6.2空白对照：在已加入细胞的孔中加入50μl完全培养基。(3个复孔)
1.6.3酸洗对照：在已加入细胞的孔中加入50μl1.6μg/ml的参比品。(3个复孔)
1.7拍打混匀后，放在37℃，CO2培养箱中孵育1h。
1.8孵育完成后，将96孔板放入离心机中离心(350rcf，5min，室温)，小心吸去上清。
1.9每孔加入100μl酸洗液，室温孵育5min。孵育完成需要用移液枪进行混匀。
1.10将96孔板放入离心机中离心(350rcf，5min，室温)，小心吸去上清。
1.11每孔加入100μl 4％多聚甲醛溶液，室温静置固定10min。
1.12小心吸去固定液后，每孔加入150μl洗涤液进行洗涤，之后小心吸去洗涤液，注意枪头不要破坏固定在孔底的细胞。洗涤重复三次。
1.13吸干孔中的洗涤液。样品孔和空白对照孔中每孔加入50μl通透液，酸洗对照孔中加入50μl封闭液进行封闭。室温孵育1h。
1.14用封闭液按1：5000的比例稀释anti-hIgG Fcγ-HRP抗体。在孔中存在通透液/封闭液的情况下，直接在每孔中加50μl稀释的二抗，使二抗终浓度为1:10000。室温放置1小时进行孵育。
1.15方法如6.12，洗涤重复三次。尽可能吸干孔中液体。
1.16每孔加入50μl TMB显色液，室温显色15-45min。
1.17终止：以50μl/孔加入终止液停止反应。
1.18使用酶标仪测量各孔OD450的值。
1.19数据处理
1.19.1各浓度计算用OD值为实测值OD值减去空白对照OD平均值。
1.19.2计算三复孔的平均值和变异系数(CV)。
1.19.3应用计算机软件进行拟合分析，以样品的OD对相应浓度分别拟合计量效应曲线，计算出样品的EC50。
2.方法验证
2.1线性
2.11应用计算机软件进行拟合分析，以样品的OD对相应浓度分别拟合计量效应曲线，通过曲线的R2结果对线性进行评估。
2.12可接受标准：曲线的R2应该≥0.95。
2.2准确度
2.21将样品稀释为50％、100％、150％的活性效价水平，即对应的S1终浓度为0.4、0.8、1.2μg/ml进行样品系列稀释，再进行细胞内吞法检测。独立配制3份样品进行3次平行检验。计算每个浓度的样品EC50，以100％活性的样品为参比品，计算各浓度样品的相对活性EC50和％RSD。用相对活性除以理论活性得到每个样品的回收率。
2.22次平行检验回收率需满足70％-130％。
2.3重复性
2.31独立稀释三份样品，进行细胞内吞法检测。计算三份样品的EC50。
2.32三份样品的活性检测结果EC50％RSD应不大于30％。
2.4专属性
2.41用Human serum IgG作为专属性阴性对照样品，与参比品同时稀释，进行细胞内吞法检测。
2.5耐用性
2.51对孵育时间耐用性进行验证。SM03抗体与Ramos细胞的孵育时间分别为30min、1h、2h。
2.52不同的孵育时间结果均应符合系统适用性。
3.系统适用性
以上方法验证结果均应符合系统适用性。
3.1三个复孔的变异系数应小于30％(0.003125、0.00078、0.000196μg/ml的变异系数不限)。
3.2酸洗对照OD平均值不高于参比品S1点OD平均值的30％。
OD对相应浓度效应曲线R2≥0.95。
实施例2 SM03的检测
按照实施例1中步骤1所示的方法，在RAMOS细胞表面表达CD22。由于文献(Wong etal.,2022)表明SM03与CD22的独特表位特异性结合，从而增加CD22的内化和再循环，从而破坏CD22的同源多聚体构型并促进自体α2-6的“反式”结合唾液酸配体。这反过来又特异性地调节自身抗原诱导的B细胞过度活化，从而调节B细胞相关的自身免疫疾病表型。
1.活性为100％的SM03的标准曲线的制备
以SM03-RefStd-202101作为活性为100％的SM03的参比品，分别配置浓度为0.8、0.2、0.05、0.0125、0.003125、0.00078125和0.000195313μg/ml的参比品溶液，按照上述步骤1.1-1.19的方法进行检测，分别将参比品结合至RAMOS细胞表面CD22抗原并在96孔细胞培养板上于37℃诱导内吞作用1小时。将细胞酸洗以去除剩余的表面结合抗体，然后固定并透化。然后用具有HRP偶联物的抗IgG抗体封闭样品并探测1小时，然后加入TMB和终止溶液以测量内化的SM03结合CD22的水平。重复三次实验得到的如图2所示的三条曲线，分别为SM03-1、SM03-2和SM03-3。(后续选取SM03-1作为检测标准曲线。)
图2显示了SM03在RAMOS细胞上诱导的CD22内化的3次独立测量的四参数拟合曲线。X轴表示SM03 mAb的浓度(取Log10值)，Y轴表示吸光度值(O.D.450)。同时图2页显示了该测定的稳健性，并表明其适合作为SM03功能的验证测定。
2.SM03样品的检测
以将浓度为0.48μg/ml的SM03的作为的SM03样品1。
将SM03样品1按照实施例1中的1.1-1.4以及1.6-1.18的检测方法进行检测，得到对应的OD值，将这一OD值与标准曲线SM03-1，此时其对应的检测浓度为0.46μg/ml(如图6所示)。比较检测浓度与原始浓度，得到SM03样品1的检测活性为96％。
3.专属性验证
将步骤1中的SM03的参比品替换为Human Serum IgG，其他不变，得到如图1所示的Human Serum IgG的曲线，从图1中可以看出，图1显示了四参数拟合曲线。X轴表示抗体mAb的浓度(取Log10值)，Y轴表示吸光度值(O.D.450)。该图显示SM03特异性地诱导结合诱导的CD22内化的浓度依赖性增加。双向方差分析表明，两条曲线在统计学上不同，SM03比IgG(hIgG)具有更高的内化。此外，事后bonferroni检验显示内化水平在0.8、0.2、0.05和0.0125μg/ml存在显着差异。N＝2双向方差分析*，p<0.05；***，p<0.001。
4.耐用性验证
将步骤1中的孵育时间由1小时更改为0.5小时、1小时和2小时，其他步骤不变，结果如图3所示，图3显示了SM03在37℃孵育0.5小时、1小时和2小时后诱导RAMOS上的CD22内化的四参数拟合曲线。X轴表示SM03 mAb的浓度(取Log10值)，Y轴表示吸光度值(O.D.450)。这显示了不同的孵育时间结果均应符合系统适用和性耐用性。
5.适用性验证
将步骤1中的参比品的浓度梯度由0.8、0.2、0.05、0.0125、0.003125、0.00078125和0.000195313μg/ml修改为0.4、0.1、0.025、0.00625、0.00156、0.00039和0.00009μg/ml或者1.2、0.3、0.075、0.01875、0.004687、0.001171和0.0002929μg/ml，其他步骤不变，按照实施例1中步骤2.2的方法进行准确度的评估，结果如图4所示，图4显示了SM03的三个独立测试被稀释至50％、100％和150％的活性滴度水平(分别为0.4、0.8和1.2μg/ml)，并且在RAMOS细胞上诱导的CD22内化的四参数拟合曲线。X轴表示SM03 mAb的浓度(取Log10值)，Y轴表示吸光度值(O.D.450)。该图显示用100％(0.8μg/ml)的参比样品对各浓度样品的EC50和％RSD进行归一化计算样品的回收率，应满足70-130％的要求。
实施例3 SM06的检测
按照实施例1中步骤1所示的方法，在RAMOS细胞表面表达CD22。由于文献(Wong etal.,2022)表明SM03与CD22的独特表位特异性结合，从而增加CD22的内化和再循环，从而破坏CD22的同源多聚体构型并促进自体α2-6的“反式”结合唾液酸配体。这反过来又特异性地调节自身抗原诱导的B细胞过度活化，从而调节B细胞相关的自身免疫疾病表型。由于诱导的内化率增加是SM03对B细胞进行免疫调节的初始和至关重要的步骤。SM06是SM03的人源化版本(Zhao et al.,2014)，具有与SM03相似的CD22结合诱导内化率并显示出针对B细胞活化的相似和更好的治疗性MOA表型(数据未显示)。由此，本发明的方法应该也可以用于SM06的活性检测。
1.活性为100％的SM06的标准曲线的制备
以SM06作为活性为100％的SM06的参比品，分别配置浓度为2、0.4、0.08、0.016、0.0032 0.00064、0.000128和0.0000256μg/ml的参比品溶液，按照上述步骤1.1-1.19的方法进行检测，分别将参比品结合至RAMOS细胞表面CD22抗原并在96孔细胞培养板上于37℃诱导内吞作用1小时。将细胞酸洗以去除剩余的表面结合抗体，然后固定并透化。然后用具有HRP偶联物的抗IgG抗体封闭样品并探测1小时，然后加入TMB和终止溶液以测量内化的SM06结合CD22的水平。标准曲线如图5中的SM06所示。
2.SM06样品的检测
取浓度为0.016μg/ml的SM06样品1。将SM06样品1按照实施例1中的1.1-1.4以及1.6-1.18的检测方法进行检测，得到对应的OD值，将这一OD值与标准曲线SM06比对，此时其对应的检测浓度为0.013μg/ml。比较检测浓度与原始浓度，得到SM06样品1的检测活性为81.25％。
综上所述，从图1-4中的结果可以观察到SM03能够以0.02μg/ml的log10 EC50诱导CD22的剂量依赖性内化。该图还表明SM03诱导CD22依赖性内化的特异性，因为hIgG抗体同种型对照显示出比SM03显着更低的内化检测。该测定被证明是可靠的，因为以非常相似的EC50水平和超过0.95的R2进行了三个独立的测定。对SM03在37℃下对RAMOS细胞的0.5、1和2小时孵育时间的分析表明，较长的孵育时间产生了较低的EC50，表明内吞作用的量较高，这与我们的内部数据相对应。根据这些数据，我们决定使用1小时作为孵育时间。最后，在该测定中，由50％、100％和150％的SM03起始剂量产生的剂量依赖性曲线的EC50显示出非常相似的范围和回收率。通过将较低或较高剂量范围的Ec50标准化为100％剂量范围来计算恢复率，以观察其是否与降低的范围一致。结果表明该测定具有良好的准确性。从图5中的结果可以得出结论，SM03和SM06在与CD22结合后对B细胞诱导相似水平的内吞，并显示相似的log10EC50(分别为0.015和0.018)，因此该测定也可以应用于SM06作为功能测定。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
Claims (10)
1.一种用于检测抗CD22的单克隆抗体的活性的方法，其特征在于，包括将待测抗CD22的单克隆抗体与RAMOS细胞共孵育，检测内吞的待测抗CD22的单克隆抗体的浓度，将内吞的待测抗CD22的单克隆抗体的浓度与待测抗CD22的单克隆抗体的原始浓度相比，得到待测抗CD22的单克隆抗体的活性的步骤。
2.根据权利要求1所述的用于检测抗CD22的单克隆抗体的活性的方法，其特征在于，所述检测内吞的待测抗CD22的单克隆抗体的浓度的方法包括如下步骤：
1)将待测样品与RAMOS细胞共孵育并诱导内吞；
2)将步骤1)中培养的细胞酸洗以去除剩余的表面结合抗体，然后固定；
3)将步骤2)固定后的细胞培养物中加入通透液以封闭并透化；
4)向步骤3)中透化好的细胞中加入具有HRP偶联物的抗IgG抗体的封闭液进行探测；
5)加入TMB和终止溶液，检测内吞的的待测抗CD22的单克隆抗体的浓度。
3.根据权利要求2所述的用于检测抗CD22的单克隆抗体的活性的方法，其特征在于，所述步骤1)中的诱导温度为37℃，诱导时间为1小时；所述步骤1)中酸洗的酸洗使用的酸洗液的为甘氨酸、氯化钠的水溶液。
4.根据权利要求2所述的用于检测抗CD22的单克隆抗体的活性的方法，其特征在于，所述步骤2)中固定使用的固定液为4％多聚甲醛溶液；室温静置固定10分钟。
5.根据权利要求2所述的用于检测抗CD22的单克隆抗体的活性的方法，其特征在于，所述步骤3)中使用的通透液为用1×PBS配制1％BSA溶液0.1％Triton-X 100溶液，2～8℃保存；所述封闭并透化的时间为1小时。
6.根据权利要求2所述的用于检测抗CD22的单克隆抗体的活性的方法，其特征在于，所述步骤4)中的HRP偶联物的抗IgG抗体在封闭液中的稀释比例为1:5000；所述探测时间为1小时。
7.根据权利要求2所述的用于检测抗CD22的单克隆抗体的活性的方法，其特征在于，所述步骤5)中检测内吞的的待测抗CD22的单克隆抗体的浓度的方法为，检测加入TMB和终止溶液后的细胞培养液的OD值，并将其与活性为100％的抗CD22的单克隆抗体的标准曲线相比较，得到，检测内吞的的待测抗CD22的单克隆抗体的浓度。
8.根据权利要求2所述的用于检测抗CD22的单克隆抗体的活性的方法，其特征在于，所述步骤5)中的终止液为硫酸溶液。
9.根据权利要求1-8任一所述的用于检测抗CD22的单克隆抗体的活性的方法，其特征在于，所述抗CD22的单克隆抗体为单克隆抗体SM03或单克隆抗体SM06。
10.权利要求1-9任一所述的用于检测抗CD22的单克隆抗体的活性的方法在制备含有抗CD22的单克隆抗体的药物中的应用。
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