CN117982680A - 一种多位点树突状硼酸功能化磁性纳米材料及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种多位点树突状硼酸功能化磁性纳米材料及其制备方法和应用，属于生物材料技术领域。所述多位点树突状硼酸功能化磁性纳米材料为聚乙烯亚胺通过静电作用包覆在三聚磷酸钠或多聚磷酸钠修饰的四氧化三铁磁性纳米粒子表面，形成聚乙烯亚胺修饰的四氧化三铁磁性纳米粒子，再在所述聚乙烯亚胺修饰的四氧化三铁磁性纳米粒子的表面通过酰胺反应接枝4‑羧基苯硼酸得到的。本发明中多位点树突状硼酸功能化磁性纳米材料与单一硼酸位点的低结合能力相比，树突状硼酸可以更灵敏的与CTCs过表达的唾液酸结合从而实现CTCs的高捕获率。
Description
技术领域
本发明属于生物材料技术领域，具体涉及一种多位点树突状硼酸功能化磁性纳米材料及其制备方法和应用。
背景技术
循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells,CTCs)是从原发肿瘤或转移部位脱离并在循环血液中存活的癌细胞，血液样本中CTCs数量的检测在早期癌症的诊断、癌症治疗的评估和监测癌症的复发方面都有非常重要的临床意义，被认为是肿瘤的重要生物标志物。但是，CTCs在血液中丰度极低，每毫升血液中有1-100个CTCs、大约几百万个白细胞和几十亿个红细胞。这些巨大数量的红细胞和粘附性极强的白细胞作为非靶细胞干扰，给分离CTCs的灵敏度和纯度带来了许多困难。
目前，基于抗原-抗体结合或利用CTCs与血细胞之间的大小、可变形性、密度以及介电性质的差异，建立了多种CTCs分离平台。最常见的表面分子之一是上皮细胞粘附分子(EpCAM)。然而，肿瘤转移过程中发生上皮-间质转化，导致CTCs上皮抗原性丧失，从而大幅下调EpCAM的表达。因此，以EpCAM为目标的捕获效率大大降低，甚至出现假阴性结果。
苯硼酸是一种路易斯酸，常被用作糖类、糖蛋白和多巴胺的有效传感器。大量研究表明，硼酸可以与癌细胞上过表达的唾液酸的顺式二醇分子共价结合，形成五元或六元环硼酯。基于硼酯共价键的形成，硼酸修饰的材料被广泛用于捕获和分离含有二醇的生物分子和癌细胞。此外，与常用的抗体和适配体相比，唾液酸与硼酸具有广谱识别能力，适用于多种癌症的CTCs捕获。但是，现有技术中利用单一的苯硼酸结合位点捕获CTCs，导致CTCs的捕获率较低。
发明内容
针对现有技术中的不足之处，本发明提出一种多位点树突状硼酸功能化磁性纳米材料及其制备方法和应用，与单一硼酸位点的低结合能力相比，树突状硼酸具有更多唾液酸的结合位点从而显著提高CTCs的捕获效率。
第一方面，本发明提供一种多位点树突状硼酸功能化磁性纳米材料，所述多位点树突状硼酸功能化磁性纳米材料为聚乙烯亚胺通过静电作用包覆在三聚磷酸钠或多聚磷酸钠修饰的四氧化三铁磁性纳米粒子表面，形成聚乙烯亚胺修饰的四氧化三铁磁性纳米粒子，再在所述聚乙烯亚胺修饰的四氧化三铁磁性纳米粒子的表面通过酰胺反应接枝4-羧基苯硼酸得到的。
采用上述方案，使用无机聚阴离子三聚磷酸钠或多聚磷酸钠对四氧化三铁磁性纳米粒子进行了预处理。三聚磷酸钠或多聚磷酸钠可以使四氧化三铁磁性纳米粒子通过形成稳定的P-O-Fe键，使四氧化三铁磁性纳米粒子表面带有强烈的负电荷。三聚磷酸钠或多聚磷酸钠修饰的四氧化三铁磁性纳米粒子更分散，更稳定，有利于与聚乙烯亚胺通过静电相互作用得到磁性纳米颗粒。
多位点树突状硼酸功能化磁性纳米材料以树突状聚乙烯亚胺功能化的磁性纳米粒子基体材料，表面修饰有硼酸配体。用于修饰的硼酸为含有羧基和硼酸基的化合物，优选为羧基苯硼酸，其分子结构中的羧基与氨基缩合成酰胺键，硼酸基可以与唾液酸中的糖基结合，树突状多位点的硼酸基团可以更灵敏的捕获CTCs。
第二方面，本发明提供一种多位点树突状硼酸功能化磁性纳米材料的制备方法，包括如下步骤：
S1、将四氧化三铁磁性纳米粒子分散至三聚磷酸钠或多聚磷酸钠溶液中，得到三聚磷酸钠或多聚磷酸钠修饰的四氧化三铁磁性纳米粒子；
S2、将聚乙烯亚胺分散至酸性磷酸盐缓冲液中，得到聚乙烯亚胺溶液；
S3、向所述聚乙烯亚胺溶液中加入所述三聚磷酸钠或多聚磷酸钠修饰的四氧化三铁磁性纳米粒子，反应后得到聚乙烯亚胺修饰的四氧化三铁磁性纳米粒子；
S4、将所述聚乙烯亚胺修饰的四氧化三铁磁性纳米粒子与4-羧基苯硼酸通过酰胺反应得到多位点树突状硼酸功能化磁性纳米材料。
进一步地，步骤S1中，所述四氧化三铁磁性纳米粒子与所述三聚磷酸钠或多聚磷酸钠溶液中溶质的质量比为(10.8～11.3)：(0.9～1.1)；所述三聚磷酸钠或多聚磷酸钠溶液的浓度为1.4～1.6mg/mL。
进一步地，步骤S2中，所述聚乙烯亚胺与所述酸性磷酸盐缓冲液加入量为1g：10～14mL，所述酸性磷酸盐缓冲液的pH为6.4～6.6。
进一步地，步骤S3中，所述聚乙烯亚胺溶液中的聚乙烯亚胺与所述三聚磷酸钠或多聚磷酸钠修饰的四氧化三铁磁性纳米粒子的质量比为(4～6)：1。
进一步地，步骤S3为：
S31、向所述聚乙烯亚胺溶液中加入所述三聚磷酸钠或多聚磷酸钠修饰的四氧化三铁磁性纳米粒子，再加入酸性磷酸盐缓冲液，超声25～35min，得到混合溶液；
S32、将所述混合溶液于55～65℃条件下反应22～26h，得到聚乙烯亚胺修饰的四氧化三铁磁性纳米粒子。
进一步地，步骤S4为：
S41、将所述聚乙烯亚胺修饰的四氧化三铁磁性纳米粒子于二甲基亚砜中超声，得到分散液；
S42、将4-羧基苯硼酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺溶解在二甲基亚砜中，在室温、黑暗条件下搅拌，得到活化混合液；
S43、将所述活化混合液加入到所述分散液中，在室温、黑暗条件下搅拌，得到多位点树突状硼酸功能化磁性纳米材料。
进一步地，所述聚乙烯亚胺修饰的四氧化三铁磁性纳米粒子、所述4-羧基苯硼酸、所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和所述N-羟基丁二酰亚胺的质量比为(7～9)：(8～10)：(11～13)：(5～7)。
采用上述方案，通过形成稳定的P-O-Fe化学键锚定在四氧化三铁磁性纳米粒子表面，使用三聚磷酸钠或多聚磷酸钠预处理获得了更分散，表面活性更好的三聚磷酸钠或多聚磷酸钠修饰的四氧化三铁磁性纳米粒子，接着使用聚乙烯亚胺作为支架来扩增硼酸基团的数量以此来提供更多的CTCs结合位点。制得了具有快速磁响应性能的多位点树突状硼酸功能化的磁性纳米材料，与单一硼酸位点的低结合能力相比，树突状硼酸具有更多唾液酸的结合位点从而显著提高CTCs的捕获效率。
第三方面，本发明提供一种所述的多位点树突状硼酸功能化磁性纳米材料或所述制备方法制得的多位点树突状硼酸功能化磁性纳米材料在捕获循环肿瘤细胞中的应用。
采用上述方案，本发明的有益效果是：
本发明采用三聚磷酸钠或多聚磷酸钠对合成的四氧化三铁磁性纳米粒子进行了预处理。三聚磷酸钠或多聚磷酸钠可以与四氧化三铁通过形成稳定的P-O-Fe键锚定在四氧化三铁磁性纳米粒子表面，使其分散性更好，表面活性更高，这有利于后续聚乙烯亚胺的包覆。
聚乙烯亚胺溶液的pH在6.5时，聚乙烯亚胺与三聚磷酸钠或多聚磷酸钠修饰的四氧化三铁磁性纳米粒子的静电相互作用最强，包覆效果最好，分散性更好。
聚乙烯亚胺具有树突网状结构和丰富的氨基，它包裹三聚磷酸钠或多聚磷酸钠修饰的四氧化三铁磁性纳米粒子后再偶联4-羧基苯硼酸就可以形成多位点的树突状硼酸功能化磁性纳米材料，使唾液酸的结合位点显著增加，进而大大提高捕获率。聚乙烯亚胺携带大量的氨基，可作为支架来扩增硼酸基团的数量以此来提供更多的CTCs结合位点，与单一硼酸位点的低结合能力相比，树突状硼酸可以更灵敏的与CTCs过表达的唾液酸结合从而实现CTCs的高捕获率。
附图说明
图1为本发明多位点树突状硼酸功能化磁性纳米材料的制备过程。
图2为磁性纳米材料的透射电镜图；其中，A为裸四氧化三铁磁性纳米粒子，B为聚乙烯亚胺修饰的磁性纳米粒子，C为4-羧基苯硼酸修饰的磁性纳米粒子。
图3为本发明裸四氧化三铁磁性纳米粒子，聚乙烯亚胺修饰以及4-羧基苯硼酸修饰后的傅里叶变换红外光谱图。
图4为本发明裸四氧化三铁磁性纳米粒子，聚乙烯亚胺修饰以及4-羧基苯硼酸修饰后的X-射线能谱图。
图5为本发裸四氧化三铁磁性纳米粒子，聚乙烯亚胺修饰以及4-羧基苯硼酸修饰后的磁滞回线。
图6为多位点树突状硼酸修饰的纳米材料和单一位点硼酸修饰的纳米材料对4T1细胞的捕获率。
图7为硼酸功能化磁性纳米材料对PBS缓冲液和模拟血样中不同数量的4T1细胞的捕获率。
具体实施方式
下面结合具体实施案例，对本发明的纳米磁性亲和材料及其制备、应用方法进行介绍，但不作为对本发明方法的具体限定。
实施例1：多位点树突状硼酸功能化磁性纳米材料的制备
如图1所示，本发明多位点树突状硼酸功能化磁性纳米材料的制备方法，包括如下步骤：
(1)四氧化三铁纳米粒子的预处理：将0.5g四氧化三铁磁性纳米粒子在30mL含45mg三聚磷酸钠的纯水中超声40分钟，得到三聚磷酸钠或多聚磷酸钠修饰的四氧化三铁磁性纳米粒子；
该步骤采用超声的手段，一方面可以提高分散性，另一方面是三聚磷酸钠可以与四氧化三铁磁性纳米粒子通过形成稳定的P-O-Fe化学锚定在四氧化三铁磁性纳米粒子表面，使四氧化三铁磁性纳米粒子表面带有强烈的负电荷。
(2)聚乙烯亚胺的改性：将2.5g聚乙烯亚胺在30mL pH 6.5的磷酸盐缓冲液中超声60分钟，得到聚乙烯亚胺溶液。然后，将三聚磷酸钠或多聚磷酸钠修饰的四氧化三铁磁性纳米粒子加入聚乙烯亚胺溶液中并补充30mL pH 6.5的磷酸盐缓冲液，随后将混合溶液超声30分钟。最后将超声好的溶液在60℃剧烈搅拌下维持反应24小时后，磁力收集聚乙烯亚胺包覆的沉淀物，用纯水洗涤，然后在40℃的烘箱中干燥12小时，得到聚乙烯亚胺修饰的四氧化三铁磁性纳米粒子；
该步骤通过对聚乙烯亚胺超声分散至酸性磷酸盐缓冲溶液中，一方面可以提高分散性，另一方面是在酸性条件下，聚乙烯亚胺分子链上的氨基会发生质子化，表面带有较多的正电荷。此时，三聚磷酸钠或多聚磷酸钠修饰的四氧化三铁磁性纳米粒子表面带有负电荷，静电相互作用时最为强烈，包覆效果最好。
(3)接枝4-羧基苯硼酸：将80mg聚乙烯亚胺修饰的四氧化三铁磁性纳米粒子溶于4mL二甲基亚砜中超声分散20分钟，得到聚乙烯亚胺修饰的四氧化三铁磁性纳米粒子的分散液。然后，将90mg 4-羧基苯硼酸、120mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和60mg N-羟基丁二酰亚胺溶解在3mL二甲基亚砜中，在室温、黑暗条件下搅拌30分钟，得到活化后的混合溶液。最后，将活化后的混合溶液缓慢加入到聚乙烯亚胺修饰的四氧化三铁磁性纳米粒子的分散液中，在室温下、黑暗中再搅拌24小时，磁分离后得到多位点树突状硼酸功能化磁性纳米材料，置于40℃干燥箱中干燥1小时。
实施例2：磁性材料的表征
(1)形貌表征
采用透射电镜观察实施例1制备的多位点树突状硼酸功能化磁性纳米材料的形貌。由图2可知，四氧化三铁磁性纳米颗粒类似球形，粒径为11.30±4.38nm。聚乙烯亚胺修饰后没有明显改变尺寸，保持在12.61±4.01nm。这可能是由于聚乙烯亚胺的修饰是无定形的，导致透射电镜很难观察到。4-羧基苯硼酸改性后，粒径增大至15.65±4.59nm，粒径变化不明显，这可能与纳米颗粒本身的尺寸较小有关。
(2)化学成分和元素的表征
傅里叶变换红外光谱图如图3所示，聚乙烯亚胺改性后光谱的吸收带在3430cm-1处增强且在1632cm-1出现新的吸收峰，进一步的4-羧基苯硼酸修饰后在1120cm-1处出现B-O键的吸收峰。X-射线能谱图如图4所示，谱图中出现的四个峰，结合能分别为191.6、284.8、400.1和532.4eV，分别对应于B1s、C1s、N1s和O1s，这些峰也表明了4-羧基苯硼酸成功连接。
(3)磁性的表征
磁滞回线如图5所示，三者矫顽力和剩余磁化强度均为零，4-羧基苯硼酸改性后的磁性纳米粒子为超顺磁性。没有修饰的磁性纳米粒子的饱和磁化强度值为48.05emu g-1。经过非磁性聚乙烯亚胺和4-羧基苯硼酸修饰后，磁化强度值值分别下降到46.52emu g-1和43.98emu g-1。表明改性后的材料具有良好的磁响应性能，能够在外加磁场下实现快速分离。
实施例3：多位点树突状硼酸修饰的磁性纳米材料和单一位点硼酸修饰的纳米材料对4T1细胞的捕获率
将75μl(2mg mL-1)实施例1制备的多位点树突状硼酸功能化磁性纳米材料和单一位点硼酸修饰的纳米材料分别加入925μl含有1.0×105个4T1细胞的PBS溶液中，孵育20分钟。最后，磁分离上清液，在显微镜下计数上清液中未结合的细胞，捕获效率定义为：(总细胞数量-上清液中未捕获的细胞数量)/总细胞数量。
由图5可知单一位点硼酸修饰的纳米材料对4T1细胞的捕获率仅能达到62.9％，而多位点树突状硼酸功能化磁性纳米材料的捕获效率可以达到93.1％。
实施例4：多位点树突状硼酸功能化磁性纳米材料对PBS缓冲液和模拟血样中不同数量的4T1细胞的捕获率。
将75μl(2mg mL-1)多位点树突状硼酸功能化磁性纳米材料分别加入925μl含有20、50、100、500、1000个红色荧光染料预染色的4T1细胞的PBS溶液和去除红细胞的小鼠血液中来制备模拟临床样本。材料与细胞孵育20分钟后，磁分离上清液，在荧光显微镜下计数上清液中未结合的细胞。捕获效率定义为：(总细胞数量-上清液中未捕获的细胞数量)/总细胞数量。
由图6可知，PBS溶液中的捕获率约83％，人工血液样本中的捕获约80％，因此，制备的多位点树突状硼酸功能化磁性纳米材料具有较高的灵敏度。这表明，即使在复杂的生理环境中，它也能有效捕获低浓度的CTCs，在临床血样中CTCs的分离中具有巨大的应用潜力。
综上所述，本发明提供了一种高效捕获循环肿瘤细胞的多位点树突状硼酸功能化磁性纳米材料的制备方法。首先，在利用三聚磷酸钠预处理后，形成了一种更稳定，分散性更好的磁性纳米粒子，接着通过静电相互作用得到聚乙烯亚胺修饰的材料，最后通过酰胺反应接枝4-羧基苯硼酸，得到了一种多位点树突状硼酸功能化磁性纳米材料。此改性材料对唾液酸过表达的4T1细胞具有特异性，捕获率高达93.1％，在模拟的临床样本中捕获率也能达到80％。
需要说明的是，附图1中，PEI为聚乙烯亚胺，4-CPBA为4-羧基苯硼酸，MNP为经三聚磷酸钠修饰的四氧化三铁磁性纳米粒子，MNP@PEI为聚乙烯亚胺修饰的四氧化三铁磁性纳米粒子，MNP@PEI@4-CPBA为4-羧基苯硼酸修饰的四氧化三铁磁性纳米粒子(即本发明所述的多位点树突状硼酸功能化磁性纳米材料)。
需要说明的是，附图6中，APTES为(3-氨丙基三乙氧基硅烷)作为支架得到的单一位点硼酸修饰的纳米材料，PEI为聚乙烯亚胺作为支架得到的多位点树突状硼酸功能化磁性纳米材料。
应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请技术方案构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。
Claims (9)
1.一种多位点树突状硼酸功能化磁性纳米材料，其特征在于，所述多位点树突状硼酸功能化磁性纳米材料为聚乙烯亚胺通过静电作用包覆在三聚磷酸钠或多聚磷酸钠修饰的四氧化三铁磁性纳米粒子表面，形成聚乙烯亚胺修饰的四氧化三铁磁性纳米粒子，再在所述聚乙烯亚胺修饰的四氧化三铁磁性纳米粒子的表面通过酰胺反应接枝4-羧基苯硼酸得到的。
2.一种权利要求1所述的多位点树突状硼酸功能化磁性纳米材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、将四氧化三铁磁性纳米粒子分散至三聚磷酸钠或多聚磷酸钠溶液中，得到三聚磷酸钠或多聚磷酸钠修饰的四氧化三铁磁性纳米粒子；
S2、将聚乙烯亚胺分散至酸性磷酸盐缓冲液中，得到聚乙烯亚胺溶液；
S3、向所述聚乙烯亚胺溶液中加入所述三聚磷酸钠或多聚磷酸钠修饰的四氧化三铁磁性纳米粒子，反应后得到聚乙烯亚胺修饰的四氧化三铁磁性纳米粒子；
S4、将所述聚乙烯亚胺修饰的四氧化三铁磁性纳米粒子与4-羧基苯硼酸通过酰胺反应得到多位点树突状硼酸功能化磁性纳米材料。
3.根据权利要求2所述的多位点树突状硼酸功能化磁性纳米材料的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述四氧化三铁磁性纳米粒子与所述三聚磷酸钠或多聚磷酸钠溶液中溶质的质量比为(10.8～11.3)：(0.9～1.1)；所述三聚磷酸钠或多聚磷酸钠溶液的浓度为1.4～1.6mg/mL。
4.根据权利要求2所述的多位点树突状硼酸功能化磁性纳米材料的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述聚乙烯亚胺与所述酸性磷酸盐缓冲液加入量为1g：10～14mL，所述酸性磷酸盐缓冲液的pH为6.4～6.6。
5.根据权利要求2所述的多位点树突状硼酸功能化磁性纳米材料的制备方法，其特征在于，步骤S3中，所述聚乙烯亚胺溶液中的聚乙烯亚胺与所述三聚磷酸钠或多聚磷酸钠修饰的四氧化三铁磁性纳米粒子的质量比为(4～6)：1。
6.根据权利要求2所述的多位点树突状硼酸功能化磁性纳米材料的制备方法，其特征在于，步骤S3为：
S31、向所述聚乙烯亚胺溶液中加入所述三聚磷酸钠或多聚磷酸钠修饰的四氧化三铁磁性纳米粒子，再加入酸性磷酸盐缓冲液，超声25～35min，得到混合溶液；
S32、将所述混合溶液于55～65℃条件下反应22～26h，得到聚乙烯亚胺修饰的四氧化三铁磁性纳米粒子。
7.根据权利要求2所述的多位点树突状硼酸功能化磁性纳米材料的制备方法，其特征在于，步骤S4为：
S41、将所述聚乙烯亚胺修饰的四氧化三铁磁性纳米粒子于二甲基亚砜中超声，得到分散液；
S42、将4-羧基苯硼酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺溶解在二甲基亚砜中，在室温、黑暗条件下搅拌，得到活化混合液；
S43、将所述活化混合液加入到所述分散液中，在室温、黑暗条件下搅拌，得到多位点树突状硼酸功能化磁性纳米材料。
8.根据权利要求7所述的多位点树突状硼酸功能化磁性纳米材料的制备方法，其特征在于，所述聚乙烯亚胺修饰的四氧化三铁磁性纳米粒子、所述4-羧基苯硼酸、所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和所述N-羟基丁二酰亚胺的质量比为(7～9)：(8～10)：(11～13)：(5～7)。
9.一种如权利要求1所述的多位点树突状硼酸功能化磁性纳米材料或如权利要求2～8任意一项所述制备方法制得的多位点树突状硼酸功能化磁性纳米材料在捕获循环肿瘤细胞中的应用。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| CN202410165041.XA CN117982680A (zh) | 2024-02-05 | 2024-02-05 | 一种多位点树突状硼酸功能化磁性纳米材料及其制备方法和应用 |
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