CN117980492A - 通过微生物发酵循环利用食物残余物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于生产微生物脂质的方法，任选地用于生产微生物脂质和蛋白质生物质和/或芳香化合物的方法。本发明还涉及微生物脂质的用途。本发明还涉及一种包含至少五种酶的组合物。

Description

通过微生物发酵循环利用食物残余物
技术领域
本发明涉及一种用于生产微生物脂质的方法，任选地用于生产微生物脂质和蛋白质生物质和/或芳香化合物的方法。本发明还涉及微生物脂质的用途。本发明还涉及一种包含至少五种酶的组合物。
背景技术
已知食用油和脂肪是人类的必需营养需求。健康成人每天需要大约5g亚麻酸和不饱和脂肪酸，这些酸不能在体内制造。2018年，全球食用油产量达到2.04亿吨。例如，棕榈油占所生产的总油的36％，并且其消耗已经达到大约6900万吨。根据食品和农业组织(FAO)，预计2050年对棕榈油的需求将达到1.56亿吨。鉴于土地使用过度、单一培养和有利于单一物种的生物多样性栖息地的清除而对基于植物的甘油三酯油生产所造成的潜在负面影响，此类对食物(诸如棕榈油)日益增长的需求是一种环境风险。
特别地，世界人口的增长导致对食物(诸如食用脂肪)的需求不可避免的增加。此外，此类对食物的增长需求与人均废弃物量的增加和环境影响有关。联合国食品和农业组织估计，全球生产的供人类消费的食物平均约三分之一被损失或浪费。
根据世界自然基金会(WWF)的一项研究，烘焙残余物是被丢弃最多的食物之一。2015年，约450万吨德国烘焙产品产生170万吨残余物。因此，不必要地使用了39.8万公顷农田，产生了246万吨温室气体。
因此，需要减少食物残余物(例如，食物废弃物)。还需要提供以环境友好的方式生产食品和食物原料的方法。此外，需要促进可持续的食物价值链的手段。
发明内容
下面将描述本发明的元素。这些元素与具体实施方案一起列出，然而，应当理解，它们可以以任何方式和任何数量组合以创建额外的实施方案。不应将各种描述的实施例和优选的实施方案解释为将本发明限制为仅明确描述的实施方案。本说明书应当被理解为支持和涵盖组合了明确描述的实施方案中的两个或更多个的实施方案，或者组合了明确描述的实施方案中的一个或多个与任意数量的所公开的和/或优选的元素的实施方案。此外，本申请中所有描述的元素的任何排列和组合应被认为是由本申请的描述所公开的，除非上下文另有指示。
在第一方面，本发明涉及一种用于生产微生物脂质，任选地用于生产微生物脂质和蛋白质生物质和/或芳香化合物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供第一底物，其中所述第一底物是食物残余物，优选食品级食物残余物；
b)用所述第一底物培养选自丝状真菌和细菌的第一微生物，并且由此允许所述第一微生物产生至少一种酶和经酶处理的第一底物，任选地进一步产生蛋白质生物质和/
或芳香化合物；任选地，用所述第一微生物共培养一种或多种微藻，并且由此允许所述一种或多种微藻产生蛋白质生物质、微生物脂质和/或芳香化合物；
c)任选地，获得所述至少一种酶，并用所述至少一种酶预处理第二底物，并且由此提供经酶处理的第二底物；其中所述第二底物是食物残余物，优选食品级食物残余物；其中优选地，所述第一底物和所述第二底物是相同类型的；
d)用包含所述经酶处理的第一底物的培养基和/或如果存在步骤c)，用包含所述经酶处理的第二底物的培养基培养第二微生物，其中所述第二微生物是产油微生物，并且由此允许所述产油微生物产生微生物脂质；
e)任选地，在没有任何基于溶剂的萃取或基于化学品的破乳的情况下对所述培养的第二微生物进行纯酶处理，以使步骤d)中产生的所述微生物脂质适于随后收获；以及
f)收获步骤d)中产生的所述微生物脂质，优选通过基于密度的分离方法。
在一个实施方案中，所述食物残余物在每次出现时独立地选自包含以下项或者由以下项组成的食物残余物：烘焙食物残余物，例如面包、面包卷、饼干、松饼、曲奇或蛋糕；水果食物残余物，例如果浆、果皮或果汁；蔬菜食物残余物，例如蔬菜皮、蔬菜浆或蔬菜汁；碾磨食物残余物，例如麸皮或麸皮面粉；鱼类食物残余物，例如鱼类加工残余物；海产食物残余物，例如海产食物加工残余物；啤酒酒糟；谷类食物残余物，例如大米、小麦、小米或玉米；餐馆食物残余物，例如餐馆剩余物；动物产品食物残余物，例如奶或奶酪；超市食物残余物，例如过期食物；或它们的任意组合；优选地包含烘焙食物残余物或由烘焙食物残余物组成，更优选地包含面包食物残余物或由面包食物残余物组成。
在一个实施方案中，所述丝状真菌选自长喙壳属(Ceratocystis sp.)，例如甘薯长喙壳(Ceratocystis fimbriata)、念珠长喙壳(Ceratocystis moniliformis)和奇异长喙壳(Ceratocystis paradoxa)，优选奇异长喙壳(Ceratocystis paradoxa)；木霉属(Trichoderma sp.)，例如里氏木霉(Trichoderma reesei)和哈茨木霉(Trichodermaharzianum)；曲霉属(Aspergillus sp.)，例如米曲霉(Aspergillus oryzae)、塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)、土曲霉(Aspergillus terreus)和黑曲霉(Aspergillusniger)；脉孢菌属(Neurospora sp.)，例如间型脉孢菌(Neurospora intermedia)；红曲霉属(Monascus sp.)，例如紫红曲霉(Monascus purpureus)；根霉属(Rhizopus sp.)，例如米根霉(Rhizopus oryzae)；镰刀菌属(Fusarium sp.)，例如镰孢霉(Fusarium venenatum)；嗜热真菌属(Thermomyces sp.)；青霉属(Penicillium sp.)；金芽孢杆菌属(Aureobasillium sp.)；皱皮菌属(Ischnoderma sp.)，例如芳香皱皮孔菌(Ischnodermabenzoinum)；多孔菌属(Polyporus sp.)，例如担子菌(Polyporus durus)；密孔菌属(Pycnoporus sp.)，例如朱红密孔菌(Pycnoporus cinnabarinus)；平革菌属(Phanerochaete sp.)，例如黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)；和炭角菌属(Xylaria sp)；优选选自长喙壳属(Ceratocystis sp.)、木霉属(Trichoderma sp.)、曲霉属(Aspergillus sp.)和镰刀菌属(Fusarium sp)；
所述细菌选自梭菌属(Clostridium sp.)，例如粪堆梭菌(Clostridiumstercorarium)、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)和丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)；盐芽孢杆菌属(Halobacillus sp.)，例如特氏盐芽孢杆菌(Halobacillus trueperi)和卡拉季喜盐芽孢杆菌(Halobacillus karajensis)；盐单胞菌属(Halomonas sp.)，例如南方盐单胞菌(Halomonas meridiana)和伸长盐单胞菌(Halomonas elongata)；红嗜热盐菌属(Rhodothermus sp.)，例如海洋红嗜热盐菌(Rhodothermus marinus)；链霉菌属(Streptomyces sp.)，例如灰链霉菌(Streptomycesgriseus)、产橄榄色链霉菌(Streptomyces olivochromogenes)、灰略红链霉菌(Streptomyces griseorubens)和马特链霉菌(Streptomyces matensis)；和芽孢杆菌属(Bacillussp.)，例如纳豆芽孢杆菌(Bacillus nato)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)和嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)；和/或
所述微藻选自小球藻属(Chlorella sp.)，例如普通小球藻(Chlorellavulgaris)和原壳小球藻(Chlorella protothecoides)；栅藻属(Scenedesmus sp.)，例如斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)；杜氏藻属(Dunaliella sp.)，例如盐生杜氏藻(Dunaliella salina)；红球藻属(Haematococcus sp.)，例如雨生红球藻(Haematococcuspluvialis)；隐甲藻属(Crypthecodinium sp.)，例如寇氏隐甲藻(Crypthecodiniumcohnii)；裂殖壶菌属(Schizochytrium sp.)，例如裂殖壶菌(Schizochytriumlimacinum)；和扁藻属(Tetraselmis sp.)，例如周氏扁藻(Tetraselmis chui)；优选选自小球藻属(Chlorella sp.)和栅藻属(Scenedesmussp.)。
在一个实施方案中，所述第二微生物是选自产油酵母、产油真菌、产油细菌和产油微藻的产油微生物；
其中优选地，
所述产油酵母选自皮状新毛孢子菌属(Cutaneotrichosporon sp.),例如产油皮状新毛孢子菌(Cutaneotrichosporon oleaginosus)；毛孢子菌属(Trichosporon sp.)，例如产油毛孢子菌(Trichosporon oleaginosus)、头状毛孢子菌(Trichosporon capitatu)和阿萨希毛孢子菌(Trichosporon asahii)；红螺菌属(Rhodospirillum sp.)；红冬孢酵母属(Rhodosporidium sp.)，例如圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)；红孢子菌属(Rhodosporon sp.)；假丝酵母属(Candida sp.)，例如维斯假丝酵母(Candidaviswanathii)和弗里斯假丝酵母(Candida freyschussii)；隐球菌属(Cryptococcussp.)，例如弯曲隐球菌(Cryptococcus curvatus)；油脂酵母属(Lipomyces sp.)，例如斯达油脂酵母菌(Lipomyces starkeyi)；耶氏酵母属(Yarrowiasp.)，例如解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)；红酵母属(Rhodotorula sp.)，例如禾本红酵母(Rhodotorulagraminis)、瘦弱红酵母(Rhodotorula gracilis)和黏红酵母(Rhodotorula glutinis)；和芹毛酵母属(Apiotrichum sp.)，例如弯曲芹毛酵母(Apiotrichum curvarum)；优选皮状新毛孢子菌属(Cutaneotrichosporon sp.)，更优选产油皮状新毛孢子菌(Cutaneotrichosporon oleaginosus)；
所述产油真菌选自小克银汉霉属(Cunninghamella sp.)，例如刺孢小克银汉霉(Cunninghamella echinulate)；曲霉属(Aspergillus sp.)，例如米曲霉(Aspergillusoryzae)、塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)、土曲霉(Aspergillus terreus)和黑曲霉(Aspergillus niger)；脉孢菌属(Neurospora sp.)，例如间型脉孢菌(Neurosporaintermedia)；红曲霉属(Monascussp.)，例如紫红曲霉(Monascus purpureus)；根霉属(Rhizopus sp.)，例如米根霉(Rhizopus oryzae)；镰刀菌属(Fusarium sp.)，例如镰孢霉(Fusarium venenatum)；毛霉属(Mucor sp.)，例如卵孢接霉(Mucor moelleri)；被孢霉属(Mortierella sp.)，例如深黄被孢霉(Mortariella isabellina)和高山被孢霉(Mortierella alpine)，优选高山被孢霉(Mortierella alpine)；和腐质霉属(Humicolasp.)；
所述产油细菌选自红球菌属(Rhodococcus sp.)、不动杆菌属(Acinetobactersp.)和芽孢杆菌属(Bacillus sp.)；并且
所述产油微藻选自小球藻属(Chlorella sp.)、新颖拟绿球藻属(Pseudochlorococcum sp.)、微绿球藻属(Nannochloris sp.)、微拟球藻(Nannochloropsis sp.)、等鞭金藻属(Isochrysis sp.)、黄丝藻属(Tribonema sp.)、杜氏藻属(Dunaliella sp.)、纤维藻属(Ankistrodesmus sp.)、葡萄藻属(Botryococcus sp.)、巴夫藻属(Pavlova sp.)、栅藻属(Scenedesmus sp.)、骨条藻属(Skeletonema sp.)和菱形藻属(Nitzschia sp.)；
其中更优选地，所述第二微生物是选自皮状新毛孢子菌属(Cutaneotrichosporonsp.)，例如产油皮状新毛孢子菌(Cutaneotrichosporon oleaginosus)的产油酵母。
在一个实施方案中，所述第二微生物是选自以下项的产油酵母：产油皮状新毛孢子菌(Cutaneotrichosporon oleaginosus)、产油毛孢子菌(Trichosporon oleaginosus)、头状毛孢子菌(Trichosporon capitatu)、阿萨希毛孢子菌(Trichosporon asahii)、斯达油脂酵母菌(Lipomyces starkeyi)、圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、禾本红酵母(Rhodotorula graminis)、瘦弱红酵母(Rhodotorula gracilis)、黏红酵母(Rhodotorula glutinis)、弯曲芹毛酵母(Apiotrichum curvarum)、弯曲隐球菌(Cryptococcus curvatus)、维斯假丝酵母(Candidaviswanathii)和弗里斯假丝酵母(Candida freyschussii)；优选产油皮状新毛孢子菌(Cutaneotrichosporon oleaginosus)。
在一个实施方案中，所述方法的所述步骤b)包括用所述第一底物培养选自丝状真菌和细菌的第一微生物，并且由此允许所述第一微生物产生至少一种酶、经酶处理的第一底物以及蛋白质生物质和/或芳香化合物；任选地，还包括用所述第一微生物共同培养一种或多种微藻，并且由此允许所述一种或多种微藻产生蛋白质生物质、微生物脂质和/或芳香化合物。
在一个实施方案中，所述方法还包括收获所述蛋白质生物质和/或所述芳香化合物的步骤，优选地使用离心、过滤、亲油性渗透汽化、固相微萃取、蒸馏以及它们的组合中的任一种。
在一个实施方案中，所述培养基还包含额外的碳源、氮源、痕量金属和/或维生素。
在一个实施方案中，所述方法还包括预处理所述第一底物的步骤和/或，如果存在步骤c)，预处理所述第二底物的步骤，通过：
-机械预处理，优选地通过研磨、混合、粉碎和/或筛分所述底物；
-将所述底物溶解在溶剂中，优选地溶解在水中；
-化学水解所述底物，优选地使用酸，例如硫酸；
-对所述底物进行热预处理，优选地在50℃至200℃的温度下进行10分钟至240分钟，更优选地在80℃至170℃的温度下进行30分钟至90分钟；
-对所述底物进行发酵预处理，优选厌氧发酵；和/或
-使用一种或多种酶，任选地可商购的酶，对所述底物进行酶预处理；
其中所述一种或多种酶选自蛋白酶，例如内肽酶和外肽酶、丝氨酸内肽酶、枯草杆菌蛋白酶A和胃蛋白酶；和水解酶，优选糖苷水解酶，更优选选自α-淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、木葡聚糖酶、半乳聚糖酶、阿拉伯糖酶、甘露聚糖酶、脂肪酶、葡糖淀粉酶和果胶酶的糖苷水解酶。
在一个实施方案中，所述方法包括在没有任何基于溶剂的萃取或基于化学品的破乳的情况下对所述培养的第二微生物进行所述纯酶处理的所述步骤e)，其中所述培养的第二微生物的所述纯酶处理是单独用水解酶或者与蛋白酶组合/随后用蛋白酶处理所述微生物。
在一个实施方案中，所述方法包括获得所述至少一种酶并且用所述至少一种酶预处理所述第二底物的步骤c)，其中所述预处理包括使所述第二底物与所述至少一种酶接触，所述至少一种酶为从培养所述第一微生物获得(优选直接获得)的液体酶制剂的形式，或者为冻干酶制剂的形式，任选为在溶液中重构的冻干酶制剂的形式。
在一个实施方案中，所述至少一种酶包含选自以下项的酶活性的一种或几种活性：纤维素酶；地衣多糖酶；木聚糖酶；阿拉伯聚糖酶；淀粉酶，例如α-淀粉酶；极限糊精酶；支链淀粉酶；蛋白酶；半乳聚糖酶；甘露聚糖酶；鼠李聚糖半乳糖醛酸水解酶；鼠李聚糖半乳糖醛酸裂解酶；木葡聚糖酶；半纤维素酶；淀粉葡糖苷酶；β-葡糖苷酶；果胶酶；和昆布多糖酶；
任选地选自以下项的酶活性：纤维素酶；地衣多糖酶；木聚糖酶；阿拉伯聚糖酶；淀粉酶，例如α-淀粉酶；极限糊精酶；支链淀粉酶；蛋白酶；半乳聚糖酶；甘露聚糖酶；鼠李聚糖半乳糖醛酸水解酶；和鼠李聚糖半乳糖醛酸裂解酶。
在一个实施方案中，所述方法是生产微生物脂质并由其制备食品的方法，其中所述方法还包括制备包含在步骤f)中收获的微生物脂质的食品的步骤g)，所述食品优选地为烘焙产品，例如面包、面包卷、饼干、松饼、曲奇或蛋糕；糖食产品，例如面粉糖食或糖制糖食；乳制品，例如冰淇淋或婴儿奶；涂抹料，例如人造黄油、蛋黄酱或软奶酪；方便食品，例如方便面、披萨、披萨面团或调味汁；饮料；素食或纯素食，例如肉类似物和奶类似物；糖果，例如无可可巧克力；和/或巧克力产品；
其中任选地，所述方法还包括通过使用所述食品的食物残余物作为所述第一底物和/或如果存在步骤c)，作为所述第二底物，回收所述食品的所述食物残余物的步骤h)。
在另一方面，本发明涉及微生物脂质(优选地使用如上文所定义的方法生产的微生物脂质)在生产食品中的用途，所述食品优选为烘焙产品，例如面包、面包卷、饼干、松饼、曲奇或蛋糕；糖食产品，例如面粉糖食或糖制糖食；乳制品，例如冰淇淋或婴儿奶；涂抹料，例如人造黄油、蛋黄酱或软奶酪；方便食品，例如方便面、披萨、披萨面团或调味汁；饮料；素食或纯素食，例如肉类似物和奶类似物；糖果，例如无可可巧克力；和/或巧克力产品。
在另一方面，本发明涉及一种组合物，优选地在如上文所定义的方法的步骤b)中产生的组合物，所述组合物包含至少五种，优选至少六种，更优选至少七种选自以下项的酶：纤维素酶；地衣多糖酶；木聚糖酶；阿拉伯聚糖酶；淀粉酶，例如α-淀粉酶；极限糊精酶；支链淀粉酶；蛋白酶；半乳聚糖酶；甘露聚糖酶；鼠李聚糖半乳糖醛酸水解酶；鼠李聚糖半乳糖醛酸裂解酶；木葡聚糖酶；半纤维素酶；淀粉葡糖苷酶；β-葡糖苷酶；果胶酶；和昆布多糖酶；
其中任选地，所述组合物包含
纤维素酶；淀粉酶；半纤维素酶；极限糊精酶，例如麦芽极限糊精酶；和果胶酶；或
纤维素酶；地衣多糖酶；木聚糖酶；阿拉伯聚糖酶；淀粉酶，例如α-淀粉酶；极限糊精酶；支链淀粉酶；蛋白酶；半乳聚糖酶；和甘露聚糖酶；或
纤维素酶；木聚糖酶；阿拉伯聚糖酶；淀粉酶，例如α-淀粉酶；极限糊精酶；支链淀粉酶；半乳聚糖酶；甘露聚糖酶；鼠李聚糖半乳糖醛酸水解酶；和鼠李聚糖半乳糖醛酸裂解酶。
在另一方面，本发明涉及一种用于生产微生物脂质和蛋白质生物质和/或芳香化合物的方法，其中所述方法包括如上文所定义的用于生产微生物脂质的方法，其中在步骤b)中，所述第一微生物进一步产生蛋白质生物质和/或芳香化合物，和/或如果步骤b)包括用所述第一微生物共培养一种或多种微藻，所述微藻产生蛋白质生物质和/或芳香化合物。
在一个实施方案中，在步骤d)中，所述第二微生物产生微生物脂质，并进一步产生蛋白质生物质和/或芳香化合物。
在一个实施方案中，所述方法包括收获所述蛋白质生物质和/或芳香化合物的步骤。
在一个实施方案中，所述用于生产微生物脂质的方法、所述微生物脂质、所述蛋白质生物质、所述芳香化合物、所述第一微生物、所述共培养、所述微藻、所述第二微生物和所述收获如上文所定义。
在另一方面，本发明涉及一种制备食品的方法，该方法包括
a)使用如上文所定义的用于生产微生物脂质的方法提供微生物脂质；任选地进一步提供蛋白质生物质和/或芳香化合物，优选地使用如上文所定义的用于生产微生物脂质和蛋白质生物质和/或芳香化合物的方法；
b)制备包含所述微生物脂质的食品，任选地还包含所述蛋白质生物质和/或芳香化合物。
在一个实施方案中，所述食品、所述微生物脂质、所述用于生产微生物脂质的方法、所述蛋白质生物质、所述芳香化合物以及所述用于生产微生物脂质和蛋白质生物质和/或芳香化合物的方法如上文所定义。
具体实施方式
本发明的目的是提供一种用于可持续地生产食品，诸如微生物脂质和蛋白质生物质和/或芳香化合物的方法。在一个实施方案中，此类微生物脂质和蛋白质生物质可以由人或动物直接消耗，或者可以掺入食物产品(诸如烘焙产品)中。此外，本发明的目的是减少食物废弃物，例如通过使用食物残余物来制备有价值的产品，诸如微生物脂质和蛋白质生物质和/或芳香化合物。特别地，本发明的目的是将食物残余物再循环到食物价值链中。食物残余物的此类再循环允许提供可持续的食物价值链。
本发明的方法的优点在于，将食物价值链从具有食物残余物和/或食物损失的线性价值链转化为循环价值链，该循环价值链再循环食物残余物作为生产有价值的产品(诸如微生物油、蛋白质生物质和/或芳香化合物)的底物。本发明的方法提高了资源使用的效率，例如食物原料的使用。此外，本发明的方法允许对食物残余物进行增值。因此，通过本发明的方法成功地降低了食物废弃物的经济、环境和社会成本。
如本文所用，术语“微生物脂质”涉及由产油微生物产生的脂质，例如酵母油、细菌油和/或真菌油。在一个实施方案中，术语“微生物脂质”与“单细胞油”或“微生物油”可互换使用。通常，微生物脂质富含不饱和脂肪酸。在一个实施方案中，微生物脂质是可食用的微生物脂质。此类微生物脂质可以用于制备包含微生物脂质的食品。例如，微生物脂质可以用于替代具有高饱和脂肪酸含量的脂肪和/或环境不友好的脂肪，诸如棕榈油。微生物脂质具有与植物油的脂肪酸组成类似的脂肪酸组成，但是认为它们更可持续。事实上，微生物脂质的生产不受季节影响，它们可以大量生产并具有减少的空间需求，并且它们可以通过产油微生物从广泛的碳源生产。微生物被定义为产油的，这是由于它们能够积累脂质，例如积累多达它们的干细胞重量(DCW)的20％。例如，产油微生物包括几种真核微生物，诸如真菌、酵母、藻类和能够以甘油三酯(TAG)和游离脂肪酸(FA)的形式积累脂质的一些细菌物种。在一个实施方案中，用本发明的方法生产的微生物脂质的组成可以由技术人员通过选择合适的微生物和/或底物来定制。
在一个实施方案中，如本文所用，术语“蛋白质生物质”涉及具有高蛋白质含量的生物质，例如蛋白质含量为干生物质的至多60重量％或更多。在一个实施方案中，蛋白质生物质具有至少20重量％或至少50重量％，优选至少60重量％或至少80重量％，更优选至少90重量％或至少95重量％，甚至更优选至少99重量％的蛋白质含量，和/或由蛋白质组成。在一个实施方案中，蛋白质生物质包含真菌蛋白或者由真菌蛋白组成。在一个实施方案中，蛋白质生物质(例如包含真菌蛋白或者由真菌蛋白组成)作为本发明的用于生产微生物脂质的方法的副产物产生。在一个实施方案中，蛋白质生物质包含真菌蛋白或者由真菌蛋白组成，例如由镰孢霉(Fusarium venenatum)、间型脉孢菌(Neurospora intermedia)和/或米曲霉(Aspergillus oryzae)产生的真菌蛋白。在一个实施方案中，蛋白质生物质是可食用的蛋白质生物质。例如，此类蛋白质生物质可用于制备包含所述蛋白质生物质的食品。此外，微生物蛋白质生物质可进一步加工成富含蛋白质的饲料和食物补充剂。在一个实施方案中，所述蛋白质生物质被酶水解或直接用于进一步加工，例如加工成食品。在一个实施方案中，蛋白质生物质包含选自细胞壁蛋白、结构蛋白和膜蛋白的蛋白质。在一个实施方案中，例如作为本发明的用于生产微生物脂质的方法的副产物产生的蛋白质生物质包含真菌蛋白，例如由镰孢霉(Fusarium venenatum)、间型脉孢菌(Neurospora intermedia)和/或米曲霉(Aspergillus oryzae)产生的真菌蛋白。在一个实施方案中，第一微生物包括镰孢霉(Fusarium venenatum)、间型脉孢菌(Neurospora intermedia)和/或米曲霉(Aspergillus oryzae)。在一个实施方案中，第一微生物不包含米曲霉(Aspergillusoryzae)，或不由米曲霉(Aspergillus oryzae)组成。在一个实施方案中，蛋白质生物质由镰孢霉(Fusarium venenatum)、间型脉孢菌(Neurospora intermedia)和/或米曲霉(Aspergillus oryzae)产生。在一个实施方案中，蛋白质生物质，优选地由镰孢霉(F.venenatum)产生的蛋白质生物质，包含氨基酸含量：4重量％至6.5重量％范围内，例如约5.25重量％的丙氨酸；5.5重量％至6.5重量％范围内，例如约6.13重量％的精氨酸；5.0重量％至6.0重量％范围内，例如约5.75重量％的天冬氨酸；2.0重量％至4.5重量％范围内，例如约3.25重量％的胱氨酸；12.0重量％至14重量％范围内，例如约13.13重量％的谷氨酸；3.5重量％至5.5重量％范围内，例如约4.75重量％的甘氨酸；2.0重量％至4重量％范围内，例如约3.00重量％的组氨酸；3.5重量％至5.5重量％范围内，例如约4.25重量％的异亮氨酸；2.0重量％至3.5重量％范围内，例如约2.75重量％的亮氨酸；6.0重量％至8.5重量％范围内，例如约7.25重量％的赖氨酸；2.0重量％至4.0重量％范围内，例如约3.00重量％的甲硫氨酸；3.0重量％至6.0重量％范围内，例如约4.50重量％的苯丙氨酸；1.5重量％至3.5重量％范围内，例如约2.25重量％的脯氨酸；5.0重量％至6.5重量％范围内，例如约5.75重量％的丝氨酸；2.5重量％至4.5重量％范围内，例如约3.50重量％的苏氨酸；3.0重量％至6.0重量％范围内，例如约4.50重量％的酪氨酸；和/或4.0重量％至6.0重量％范围内，例如约5.00重量％的缬氨酸。在一个实施方案中，步骤b)中产生的所述蛋白质生物质包含以下物质或由以下物质组成
a)
例如由镰孢霉(Fusarium venenatum)产生的生物质；
b)
蛋白质： 91重量％
脂质 2重量％
葡聚糖 1重量％，
例如由里氏木霉(Trichoderma reesei)产生的生物质；或
c)
例如由黑曲霉(Aspergillus niger)产生的生物质。
在一个实施方案中，在步骤b)中，第一微生物产生蛋白质生物质和/或第一微生物与一种或多种产生蛋白质生物质的微藻共培养。在一个实施方案中，该方法包括获得步骤b)中产生的蛋白质生物质的步骤，例如通过离心、过滤、沉降、凝结、浮选以及它们的组合中的任一种，优选地通过离心、过滤以及它们的组合。在一个实施方案中，在步骤d)中，第二微生物进一步产生蛋白质生物质，作为微生物脂质生产的副产物。在一个实施方案中，该方法包括获得步骤d)中产生的蛋白质生物质的步骤，例如通过离心、过滤、沉降、凝结、浮选以及它们的组合中的任一种，优选地通过离心、过滤以及它们的组合。在一个实施方案中，术语“收获蛋白质生物质”和“获得蛋白质生物质”可互换使用。在一个实施方案中，所述方法是生产微生物脂质并用其制备食品的方法，其中所述制备食品还包括将所述蛋白质生物质掺入所述食品中。在一个实施方案中，本发明的方法是用于生产微生物脂质和蛋白质生物质的方法，第一微生物优选地是产生其生物质的至少30％作为蛋白质的微生物。
有利地，本发明的方法允许生产作为微生物脂质生产方法的副产物的微生物蛋白质生物质。因此，生产蛋白质的家畜密集养殖的替代方案是培养微生物以生产可食用的微生物蛋白质生物质。在一个实施方案中，用本发明的方法生产的蛋白质生物质可以作为生物质直接消耗，或者作为增加食品的蛋白质含量的补充剂消耗。本发明的方法的优点是蛋白质生物质的生产是经济上可行的，因此可以成功地与更成熟的肉类替代物竞争，例如豆腐和其他大豆衍生物，以及肉类本身。另一个优点是本发明的第一和第二微生物可以大规模培养，并提供大量的微生物脂质和蛋白质生物质和/或芳香化合物。
在一个实施方案中，如本文所用，术语“芳香化合物”涉及具有味道或气味，优选地令人愉快的味道或气味，例如气味剂、香味、芳香或风味的化合物。在一个实施方案中，芳香化合物是风味化合物。在一个实施方案中，产生芳香化合物作为本发明方法的副产物。在一个实施方案中，芳香化合物选自苯甲醛、丁子香酚、肉桂醛、乙基麦芽酚、香兰素、茴香醚、茴香脑、草蒿脑、百里酚、乙酸香叶酯、甲酸甲酯、乙酸甲酯、丙酸甲酯、丁酸甲酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸异丁酯、乙酸异戊酯、丁酸戊酯、戊酸戊酯、乙酸辛酯、乙酸苄酯、邻氨基苯甲酸甲酯、乙酸己酯、月桂烯、香叶醇、橙花醇、柠檬醛、香茅醛、香茅醇、芳樟醇、橙花叔醇、罗勒烯、柠檬烯、樟脑、薄荷醇、香芹酮、萜品醇、α-紫罗兰酮、崖柏酮、桉叶油素、茉莉酮、己酸乙酯、异戊醇、3-甲基-1-丁醇、1-辛烯-3-醇以及它们的组合；优选地选自香茅醇、香叶醇、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸异丁酯、乙酸异戊酯以及它们的组合。在一个实施方案中，芳香化合物是乙酸乙酯，其中芳香化合物由选自长喙壳属(Ceratocystis sp.)，例如甘薯长喙壳(Ceratocystis fimbriata)的丝状真菌产生，例如底物为咖啡外壳。在一个实施方案中，芳香化合物选自己酸乙酯、异戊醇、3-甲基-1-丁醇、1-辛烯-3-醇和/或乙酸乙酯，其中芳香化合物由选自脉孢菌属(Neurospora sp.)的丝状真菌产生，例如底物为大米(诸如预糊化大米)。
在一个实施方案中，使用蒸馏、亲油性渗透汽化、固相微萃取以及它们的组合中的任一种来获得芳香化合物。在一个实施方案中，芳香化合物被分泌到培养基中，并且所述芳香化合物从所述培养基中获得，例如通过蒸馏(诸如在真空下过冷蒸馏)、通过亲油性渗透汽化、通过固相微萃取以及它们的组合。香味是食物的最重要的属性之一，并且与消费者对产品的接受度直接相关。本发明的方法允许以有效的方式生产作为微生物脂质生产方法的副产物的此类芳香化合物。有利地，此类生物技术生产的芳香化合物是可持续的芳香化合物，例如用作食品工业的添加剂。
如本文所用，术语“第一底物”涉及食物残余物，优选地包含用于微生物(诸如第一微生物和/或第二微生物)的生长、代谢和/或活性的营养物质，例如碳水化合物、蛋白质、脂肪和矿物质。在一个实施方案中，第一底物是提供允许微生物生长的物质的材料。在一个实施方案中，第一底物选自包含以下项或者由以下项组成的食物残余物：烘焙食物残余物，例如面包、面包卷、饼干、松饼、曲奇或蛋糕；水果食物残余物，例如果浆、果皮或果汁；蔬菜食物残余物，例如蔬菜皮、蔬菜浆或蔬菜汁；碾磨食物残余物，例如麸皮或麸皮面粉；鱼类食物残余物，例如鱼类加工残余物；海产食物残余物，例如海产食物加工残余物；啤酒酒糟；谷类食物残余物，例如大米、小麦、小米或玉米；餐馆食物残余物，例如餐馆剩余物；动物产品食品残余物，例如奶或奶酪；超市食物残余物，例如过期食物；或它们的任意组合；优选烘焙食物残余物，更优选面包食物残余物。在一个实施方案中，第一微生物响应于第一底物的存在而产生至少一种酶。例如，该至少一种酶是被构造成酶作用于底物的组分的适应酶。在一个实施方案中，通过使第一微生物与第一底物接触，刺激第一微生物产生适于酶作用于底物的组分的酶，例如以消化底物和/或使用底物的组分用于生长。在一个实施方案中，第一底物是第一微生物的诱导系统，特别是用于产生对底物特异性的酶的诱导系统。在一个实施方案中，第一底物用于制备至少一种酶，优选酶混合物，该酶混合物被构造成预处理第二底物以由其提供生长培养基。在一个实施方案中，用所述至少一种酶，优选酶混合物预处理(例如，消化)第二底物，以获得包含用于第二微生物的营养物质的培养基。在一个实施方案中，经酶处理的第一底物和/或经酶处理的第二底物是用于生长第二微生物的培养基。
在一个实施方案中，所述第一底物是所述第一微生物的诱导系统，以刺激所述第一微生物产生被定制为消化底物的酶。然后，使用此类定制的酶系统来消化第二底物，该第二底物优选地与第一底物类型相同。例如，第一底物和第二底物两者是相同类型的食物残余物，例如，烘焙食物残余物。在一个实施方案中，从用所述诱导系统(即第一底物)培养第一微生物获得的所述酶被单独制备，并被用作液体制剂或冷冻干燥制剂，其任选地在溶液中重构以供进一步使用。
在一个实施方案中，如本文所用，术语“食物残余物”涉及任何生的或熟的食物物质，其被丢弃，或者预期或需要被丢弃。如本文所用，术语“残余物”包括单数形式的“残余物”和复数形式的“残余物”。在许多实施方案中，当将术语“残余物”与单数形式的动词组合使用时，动词和术语“残余物”的组合应理解为既涉及单数形式又涉及复数形式，即使该动词是单数形式。同样，当将术语“残余物”与复数形式的动词组合使用时，动词和术语“残余物”的组合应理解为既涉及单数形式又涉及复数形式，即使该动词是复数形式。食物残余物还涉及来自住宅和商业机构(诸如杂货店、餐馆、农产品摊位、机构自助餐厅和厨房)以及工业来源(例如，雇员餐厅)的未吃的食物和食物制备残余物。例如，食物残余物是未吃的或未被使用的食物，例如源自食物制造、食物物流、食物储存、食物零售和消费者食物残余物(诸如家庭、餐馆和餐饮)的食物残余物。在一个实施方案中，食物残余物独立地选自包含以下项或者由以下项组成的食物残余物：烘焙食物残余物，例如面包、面包卷、饼干、松饼、曲奇或蛋糕；水果食物残余物，例如果浆、果皮或果汁；蔬菜食物残余物，例如蔬菜皮、蔬菜浆或蔬菜汁；碾磨食物残余物，例如麸皮或麸皮面粉；鱼类食物残余物，例如鱼类加工残余物；海产食物残余物，例如海产食物加工残余物；啤酒酒糟；谷类食物残余物，例如大米、小麦、小米或玉米；餐馆食物残余物，例如餐馆剩余物；动物产品食物残余物，例如奶或奶酪；超市食物残余物，例如过期食物；或它们的任意组合；优选包含烘焙食物残余物或由烘焙食物残余物组成，更优选包含面包食物残余物或由面包食物残余物组成。在一个实施方案中，食物残余物是食品级食物残余物。在一个实施方案中，食物残余物不是分解的和/或腐烂的食物。在一个实施方案中，食物残余物不包含不可食用的霉菌。在一个实施方案中，食物残余物不包含任何对人类和/或动物的健康有毒和/或有害的组分。例如，水果或蔬菜食物残余物是果汁制备、方便食物制备和/或罐装过程的残余物，诸如水果或蔬菜(例如，胡萝卜、梨、苹果、马铃薯、香蕉或荔枝)的果肉或果皮。在一个实施方案中，所述食物残余物具有食品级。在一个实施方案中，所述食物残余物不包含肉类或者不由肉类组成。在一个实施方案中，所述食物残余物不含肉类。在一个实施方案中，术语“食物残余物”包括食物废弃物和食物损失，例如从收获开始沿着食物供应链的食物损失，例如收获后损失。在一个实施方案中，所述食物残余物包括食品级食物残余物或由食品级食物残余物组成，优选地所述食物残余物不包含化学污染物、传染原和/或病原体。在一个优选的实施方案中，食物残余物是烘焙产品食物残余物，例如面包食物残余物。在一个实施方案中，术语“烘焙食物残余物”和“烘焙产品食物残余物”同义使用。在一个实施方案中，烘焙食物残余物涉及在整个供应链的任何阶段(从最初的农业生产到最终的家庭消费)出现的任何食物残余物。在一个实施方案中，用作第一底物的食物残余物和用作第二底物的食物残余物是相同类型的食物残余物，例如第一底物和第二底物都是烘焙产品食物残余物，例如都是面包残余物。在一个实施方案中，第一底物是第一微生物产生所述至少一种酶的诱导系统，所述至少一种酶被定制为降解所述第一底物，优选所述第一和第二底物。在一个实施方案中，所述食物残余物是未变质的食物。
在一个实施方案中，如本文所用，术语“食品级食物残余物”涉及对于消费(例如，人消费和/或动物消费)是安全的和/或对于进一步加工成可消费的食物/饲料产品是安全的材料。例如，此类食品级食物残余物是未变质和/或未腐烂的食物残余物。在一个实施方案中，食品级食物残余物是可食用的食物残余物。在一个实施方案中，食品级食物残余物是未变质的食物残余物。在一个实施方案中，食品级食物残余物包含可食用的组分或者由可食用的组分组成。在一个实施方案中，食品级食物残余物不包含对人类和/或动物有毒的组分。在一个实施方案中，食品级食物残余物由无毒组分组成或者由无毒浓度的组分组成。在一个实施方案中，食品级食物残余物不包括食物废弃物。在一个实施方案中，食品级食物残余物不包含化学污染物、传染原和/或病原体。在一个实施方案中，食品级食物残余物不包含化学污染物和/或病原体。在一个实施方案中，所述食物残余物(优选所述食品级食物残余物)不包括未烹饪的食物、变质的食物、过期的食物和来自盘子(诸如顾客的盘子)的剩余物。在一个实施方案中，所述食物残余物(优选所述食品级食物残余物)由食物组成。在一个实施方案中，所述食物残余物(优选所述食品级食物残余物)不包含非食物组分。
如本文所用，术语“第一微生物”涉及选自丝状真菌和细菌的微生物。在一个实施方案中，第一微生物能够产生至少一种酶，优选酶混合物，适应于第一底物，例如，适应于消化第一底物。在一个实施方案中，第一微生物产生至少一种酶，该至少一种酶可用于随后消化第二底物以提供第二微生物的生长培养基，并且提供经酶处理的底物，该经酶处理的底物可用作第二微生物的生长培养基。在一个实施方案中，在步骤b)中，第一微生物产生至少一种酶，优选酶混合物，其在步骤c)中用于预处理第二底物，从而提供经酶处理的第二底物，该经酶处理的第二底物可以用作第二微生物的生长培养基。
在一个实施方案中，第一微生物选自丝状真菌和细菌，其中丝状真菌选自长喙壳属(Ceratocystis sp.)，例如甘薯长喙壳(Ceratocystis fimbriata)、念珠长喙壳(Ceratocystis moniliformis)和奇异长喙壳(Ceratocystis paradoxa)，优选奇异长喙壳(Ceratocystis paradoxa)；木霉属(Trichoderma sp.)，例如里氏木霉(Trichodermareesei)和哈茨木霉(Trichoderma harzianum)；曲霉属(Aspergillus sp.)，例如米曲霉(Aspergillus oryzae)、塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)、土曲霉(Aspergillusterreus)和黑曲霉(Aspergillus niger)；脉孢菌属(Neurospora sp.)，例如间型脉孢菌(Neurospora intermedia)；红曲霉属(Monascussp.)，例如紫红曲霉(Monascuspurpureus)；根霉属(Rhizopus sp.)，例如米根霉(Rhizopus oryzae)；镰刀菌属(Fusariumsp.)，例如镰孢霉(Fusarium venenatum)；嗜热真菌属(Thermomyces sp.)；青霉属(Penicillium sp.)；金芽孢杆菌属(Aureobasillium sp.)；皱皮菌属(Ischnoderma sp.)，例如芳香皱皮孔菌(Ischnoderma benzoinum)；多孔菌属(Polyporussp.)，例如担子菌(Polyporus durus)；密孔菌属(Pycnoporus sp.)，例如朱红密孔菌(Pycnoporuscinnabarinus)；平革菌属(Phanerochaete sp.)，例如黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)；和炭角菌属(Xylaria sp)；优选选自长喙壳属(Ceratocystissp.)、木霉属(Trichoderma sp.)、曲霉属(Aspergillus sp.)和镰刀菌属(Fusarium sp)；并且
其中所述细菌选自梭菌属(Clostridium sp.)，例如粪堆梭菌(Clostridiumstercorarium)、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)和丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)；盐芽孢杆菌属(Halobacillus sp.)，例如特氏盐芽孢杆菌(Halobacillus trueperi)和卡拉季喜盐芽孢杆菌(Halobacillus karajensis)；盐单胞菌属(Halomonas sp.)，例如南方盐单胞菌(Halomonas meridiana)和伸长盐单胞菌(Halomonas elongata)；红嗜热盐菌属(Rhodothermus sp.)，例如海洋红嗜热盐菌(Rhodothermus marinus)；链霉菌属(Streptomyces sp.)，例如灰链霉菌(Streptomycesgriseus)、产橄榄色链霉菌(Streptomyces olivochromogenes)、灰略红链霉菌(Streptomyces griseorubens)和马特链霉菌(Streptomyces matensis)；和芽孢杆菌属(Bacillussp.)，例如纳豆芽孢杆菌(Bacillus nato)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)和嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)。在一个实施方案中，第一微生物选自所述丝状真菌和所述细菌，其中第一微生物不是泡盛曲霉(Aspergillus awamori)和/或不是米曲霉(Aspergillusoryzae)。在一个实施方案中，第一微生物选自所述丝状真菌和所述细菌，其中所述丝状真菌不包括泡盛曲霉(Aspergillus awamori)和/或米曲霉(Aspergillus oryzae)。
在一个实施方案中，曲霉(Aspergillus)是黑曲霉(Aspergillus niger)，例如黑曲霉van Tiegheim ATCC 10535，或土曲霉(Aspergillus terreus)，例如土曲霉CBS117.37。在一个实施方案中，如果第一微生物是曲霉属(Aspergillus sp.)，则该曲霉属(Aspergillus sp.)选自黑曲霉(Aspergillus niger)，例如黑曲霉van Tiegheim ATCC10535，和土曲霉(Aspergillus terreus)，例如土曲霉CBS117.37。在一个实施方案中，黑曲霉(Aspergillus niger)是黑曲霉van Tieghem。在一个实施方案中，黑曲霉(Aspergillusniger)是黑曲霉van Tiegheim ATCC 10535。在一个实施方案中，曲霉(Aspergillus)不是泡盛曲霉(Aspergillus awamori)。在一个实施方案中，如果第一微生物是曲霉属(Aspergillus sp.)，则该曲霉属(Aspergillus sp.)不是泡盛曲霉(Aspergillusawamori)和/或不是米曲霉(Aspergillus oryzae)。在一个实施方案中，第一微生物不是泡盛曲霉(Aspergillus awamori)和/或不是米曲霉(Aspergillus oryzae)。
在一个实施方案中，奇异长喙壳(Ceratocystis paradoxa)是奇异长喙壳CBS374.83或奇异长喙壳DSM 63054。在一个实施方案中，所述第一微生物选自曲霉属(Aspergillus sp.)，优选黑曲霉(Aspergillus niger)，更优选地黑曲霉van TiegheimATCC 10535；和长喙壳属(Ceratocystis sp.)，优选奇异长喙壳(Ceratocystisparadoxa)，更优选奇异长喙壳CBS 374.83。在一个实施方案中，所述曲霉属(Aspergillussp.)不包括泡盛曲霉(Aspergillus awamori)和/或米曲霉(Aspergillus oryzae)。在一个实施方案中，第一微生物不是泡盛曲霉(Aspergillus awamori)。在一个实施方案中，第一微生物不是米曲霉(Aspergillus oryzae)。
在一个实施方案中，第一微生物是能够产生至少一种酶并且还能够产生蛋白质生物质的生物体，例如选自以下项的微生物：曲霉属(Aspergillus sp.)，例如米曲霉(Aspergillus oryzae)；脉孢菌属(Neurospora sp.)，例如间型脉孢菌(Neurosporaintermedia)；红曲霉属(Monascus sp.)，例如紫红曲霉(Monascus purpureus)；根霉属(Rhizopus sp.)，例如米根霉(Rhizopus oryzae)；木霉属(Trichoderma sp.)；和镰刀菌属(Fusarium sp.)，例如镰孢霉(Fusarium venenatum)，优选镰孢霉(Fusarium venenatum)。在一个实施方案中，所述第一微生物是产生至少一种酶和蛋白质生物质的微生物，并且所述微生物选自曲霉属(Aspergillus sp.)，例如米曲霉(Aspergillus oryzae)；脉孢菌属(Neurospora sp.)，例如间型脉孢菌(Neurospora intermedia)；红曲霉属(Monascussp.)，例如紫红曲霉(Monascus purpureus)；根霉属(Rhizopus sp.)，例如米根霉(Rhizopus oryzae)；木霉属(Trichodermasp.)；和镰刀菌属(Fusarium sp.)，例如镰孢霉(Fusarium venenatum)，优选镰孢霉(Fusarium venenatum)。
在一个实施方案中，第一微生物是能够产生至少一种酶并且还能够产生芳香化合物的生物体，并且选自长喙壳属(Ceratocystis)，例如甘薯长喙壳(Ceratocystisfimbriata)、念珠长喙壳(Ceratocystis moniliformis)和奇异长喙壳(Ceratocystisparadoxa)；曲霉属(Aspergillus sp.)，例如米曲霉(Aspergillus oryzae)、塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)和黑曲霉(Aspergillus niger)，优选黑曲霉(Aspergillusniger)；皱皮菌属(Ischnoderma sp.)，例如芳香皱皮孔菌(Ischnoderma benzoinum)；多孔菌属(Polyporus sp.)，例如担子菌(Polyporus durus)；密孔菌属(Pycnoporus sp.)，例如朱红密孔菌(Pycnoporus cinnabarinus)；平革菌属(Phanerochaete sp.)，例如黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)。在一个优选的实施方案中，第一微生物是能够产生至少一种酶并且还能够产生芳香化合物的生物体，并且选自黑曲霉(Aspergillusniger)、甘薯长喙壳(Ceratocystis fimbriata)、念珠长喙壳(Ceratocystismoniliformis)、奇异长喙壳(Ceratocystis paradoxa)、芳香皱皮孔菌(Ischnodermabenzoinum)；担子菌(Polyporus durus)；朱红密孔菌(Pycnoporus cinnabarinus)和黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)；优选地是奇异长喙壳(Ceratocystisparadoxa)或黑曲霉(Aspergillus niger)。在一个实施方案中，所述第一微生物是产生至少一种酶和芳香化合物的微生物，并且所述微生物选自长喙壳属(Ceratocystissp.)，例如奇异长喙壳(Ceratocystis paradoxa)，诸如奇异长喙壳CBS 374.83或奇异长喙壳DSM63054；和曲霉属(Aspergillus sp.)，例如黑曲霉(Aspergillus niger)，诸如黑曲霉vanTieghem。在一个实施方案中，第一微生物是能够产生至少一种酶并且还能够产生蛋白质生物质和芳香化合物的生物体，优选地选自曲霉属(Aspergillus sp.)，更优选米曲霉(Aspergillus oryzae)。
在一个实施方案中，第一微生物是能够产生至少一种酶并且还能够产生芳香化合物和蛋白质生物质的生物体，例如曲霉属(Aspergillus sp.)，诸如米曲霉(Aspergillusoryzae)。在一个实施方案中，第一微生物与产生蛋白质生物质的生物体共培养，例如微藻，诸如小球藻属(Chlorella)微藻。在一个实施方案中，在培养第一微生物的所述步骤b)中，产生至少一种酶和经酶处理的第一底物；并且任选地，产生蛋白质生物质、微生物脂质和/或芳香化合物，优选蛋白质生物质和/或芳香化合物。
在一个实施方案中，培养第一微生物包括使所述第一微生物经受合适的生长条件。在一个实施方案中，术语“培养”和“生长”可互换使用。在一个实施方案中，培养第一微生物包括使所述第一微生物与所述第一底物接触。在一个实施方案中，第一底物是第一微生物的生长底物。在一个实施方案中，在培养第一微生物的所述步骤b)中，所述第一微生物产生至少一种具有对第一底物特异性的酶活性的酶，优选酶混合物，并且任选地进一步产生蛋白质生物质和/或芳香化合物。在一个实施方案中，第一微生物与微藻共培养，该微藻产生蛋白质生物质、微生物脂质和/或芳香化合物。在一个实施方案中，如果本发明的方法是用于生产微生物脂质和蛋白质生物质和/或芳香化合物的方法，则选择第一微生物，使得第一微生物除了产生所述至少一种酶之外还能够产生蛋白质生物质和/或芳香化合物，和/或第一微生物与一种或多种能够产生蛋白质生物质和/或芳香化合物的微藻共培养。在一个实施方案中，当提及产生经酶处理的底物的微生物时，是指微生物产生一种或多种酶，优选酶混合物，其酶处理底物；例如，这意味着微生物通过产生所述至少一种酶，优选所述酶混合物来间接产生经酶处理的底物，其酶处理底物。在一个实施方案中，术语“至少一种”和“一种或多种”可互换使用。
如本文所用，术语“丝状真菌”涉及具有丝状结构，特别是具有菌丝的真菌。在一个实施方案中，丝状真菌选自长喙壳属(Ceratocystis sp.)，例如甘薯长喙壳(Ceratocystisfimbriata)、念珠长喙壳(Ceratocystis moniliformis)和奇异长喙壳(Ceratocystisparadoxa)(诸如奇异长喙壳CBS 374.83或奇异长喙壳DSM 63054)，优选奇异长喙壳(Ceratocystis paradoxa)；木霉属(Trichoderma sp.)，例如里氏木霉(Trichodermareesei)和哈茨木霉(Trichoderma harzianum)；曲霉属(Aspergillus sp.)，例如米曲霉(Aspergillus oryzae)、塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)、土曲霉(Aspergillusterreus)和黑曲霉(Aspergillus niger)(诸如黑曲霉van Tiegheim ATCC 10535)；脉孢菌属(Neurospora sp.)，例如间型脉孢菌(Neurospora intermedia)；红曲霉属(Monascussp.)，例如紫红曲霉(Monascus purpureus)；根霉属(Rhizopus sp.)，例如米根霉(Rhizopus oryzae)；镰刀菌属(Fusarium sp.)，例如镰孢霉(Fusarium venenatum)；嗜热真菌属(Thermomyces sp.)；青霉属(Penicillium sp.)；金芽孢杆菌属(Aureobasilliumsp.)；皱皮菌属(Ischnoderma sp.)，例如芳香皱皮孔菌(Ischnoderma benzoinum)；多孔菌属(Polyporus sp.)，例如担子菌(Polyporus durus)；密孔菌属(Pycnoporus sp.)，例如朱红密孔菌(Pycnoporus cinnabarinus)；平革菌属(Phanerochaete sp.)，例如黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)；和炭角菌属(Xylaria sp)；优选选自长喙壳属(Ceratocystis sp.)、木霉属(Trichoderma sp.)、曲霉属(Aspergillus sp.)和镰刀菌属(Fusarium sp)。在一个实施方案中，所述丝状真菌选自曲霉属(Aspergillus sp.)，优选黑曲霉(Aspergillus niger)，更优选黑曲霉van Tiegheim ATCC 10535；和长喙壳属(Ceratocystis sp.)，优选奇异长喙壳(Ceratocystis paradoxa)，更优选奇异长喙壳CBS374.83。
如本文在步骤b)的上下文中所用，术语“细菌”涉及当与第一底物一起培养时能够产生至少一种酶的任何细菌。在一个实施方案中，所述细菌选自梭菌属(Clostridiumsp.)，例如粪堆梭菌(Clostridium stercorarium)、拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)和丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)；盐芽孢杆菌属(Halobacillus sp.)，例如特氏盐芽孢杆菌(Halobacillus trueperi)和卡拉季喜盐芽孢杆菌(Halobacillus karajensis)；盐单胞菌属(Halomonas sp.)，例如南方盐单胞菌(Halomonas meridiana)和伸长盐单胞菌(Halomonas elongata)；红嗜热盐菌属(Rhodothermus sp.)，例如海洋红嗜热盐菌(Rhodothermus marinus)；链霉菌属(Streptomyces sp.)，例如灰链霉菌(Streptomyces griseus)、产橄榄色链霉菌(Streptomyces olivochromogenes)、灰略红链霉菌(Streptomyces griseorubens)和马特链霉菌(Streptomyces matensis)；和芽孢杆菌属(Bacillus sp.)，例如纳豆芽孢杆菌(Bacillus nato)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)和嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)。
如本文所用，术语“至少一种酶”涉及一种或多种酶，优选酶混合物。在一个实施方案中，所述至少一种酶具有靶向所述第一底物和/或第二底物，和/或靶向所述第一底物和/或第二底物的至少一种组分的活性。在一个实施方案中，所述至少一种酶能够酶处理底物以提供生长培养基和/或用于生长培养基的组分。在一个实施方案中，所述至少一种酶能够酶处理底物以将所述底物转化成营养物质和/或从所述底物释放营养物质，优选地用于第一和/或第二微生物生长的营养物质。在一个实施方案中，所述至少一种酶作用于所述底物，使得底物成为所述第一微生物和/或第二微生物的合适的生长培养基。在一个实施方案中，所述至少一种酶包含选自以下项的酶活性的一种或几种活性：纤维素酶；地衣多糖酶；木聚糖酶；阿拉伯聚糖酶；淀粉酶，例如α-淀粉酶；极限糊精酶；支链淀粉酶；蛋白酶；半乳聚糖酶；甘露聚糖酶；鼠李聚糖半乳糖醛酸水解酶；鼠李聚糖半乳糖醛酸裂解酶；木葡聚糖酶；半纤维素酶；淀粉葡糖苷酶；β-葡糖苷酶；果胶酶；和昆布多糖酶；任选地选自以下项的酶活性：纤维素酶；地衣多糖酶；木聚糖酶；阿拉伯聚糖酶；淀粉酶，例如α-淀粉酶；极限糊精酶；支链淀粉酶；蛋白酶；半乳聚糖酶；甘露聚糖酶；鼠李聚糖半乳糖醛酸水解酶；和鼠李聚糖半乳糖醛酸裂解酶。在一个实施方案中，所述至少一种酶是以下项中的任一种：纤维素酶；地衣多糖酶；木聚糖酶；阿拉伯聚糖酶；淀粉酶，例如α-淀粉酶；极限糊精酶；支链淀粉酶；蛋白酶；半乳聚糖酶；甘露聚糖酶；鼠李聚糖半乳糖醛酸水解酶；鼠李聚糖半乳糖醛酸裂解酶；木葡聚糖酶；半纤维素酶；淀粉葡糖苷酶；β-葡糖苷酶；果胶酶；昆布多糖酶；以及它们的组合。在一个实施方案中，所述至少一种酶是酶混合物。在一个实施方案中，酶混合物包含至少两种或三种，优选至少五种，更优选至少六种，甚至更优选至少七种酶。在一个实施方案中，酶混合物包含至少两种或三种，优选至少五种，更优选至少六种，甚至更优选至少七种选自以下项的酶：纤维素酶；地衣多糖酶；木聚糖酶；阿拉伯聚糖酶；淀粉酶，例如α-淀粉酶；极限糊精酶；支链淀粉酶；蛋白酶；半乳聚糖酶；甘露聚糖酶；鼠李聚糖半乳糖醛酸水解酶；鼠李聚糖半乳糖醛酸裂解酶；木葡聚糖酶；半纤维素酶；淀粉葡糖苷酶；β-葡糖苷酶；果胶酶；和昆布多糖酶。在一个实施方案中，所述至少一种酶适应于所述底物，即通过使所述第一微生物与所述底物接触，所述第一微生物产生特异性作用于所述底物的酶。例如，如果面包残余物用作所述底物，则本发明方法的步骤b)中产生的至少一种酶和/或本发明的组合物可以包含
纤维素酶；淀粉酶；半纤维素酶；极限糊精酶，例如麦芽极限糊精酶；和果胶酶；和/或
纤维素酶；地衣多糖酶；木聚糖酶；阿拉伯聚糖酶；淀粉酶，例如α-淀粉酶；极限糊精酶；支链淀粉酶；蛋白酶；半乳聚糖酶；和甘露聚糖酶；和/或
纤维素酶；木聚糖酶；阿拉伯聚糖酶；淀粉酶，例如α-淀粉酶；极限糊精酶；支链淀粉酶；半乳聚糖酶；甘露聚糖酶；鼠李聚糖半乳糖醛酸水解酶；和鼠李聚糖半乳糖醛酸裂解酶。
在一个实施方案中，本发明的组合物是在本发明的方法的步骤b)中产生的至少一种酶。在一个实施方案中，在本发明的方法的步骤b)中产生的至少一种酶是本发明的组合物。在一个实施方案中，所述至少一种酶具有食品级。在一个实施方案中，所述至少一种酶是食品级酶或食品级酶组合物。在一个实施方案中，所述至少一种酶包含至少一种食品级酶或由至少一种食品级酶组成。在一个实施方案中，如果所述第一底物是食品级食物残余物，则所述至少一种酶是食品级酶或食品级酶组合物。
在一个实施方案中，如本文所用，术语“经酶处理的第一底物”涉及已经与由所述第一微生物产生的所述至少一种酶接触的第一底物。在一个实施方案中，将经酶处理的第一底物或其组分用作所述第二微生物的生长培养基或用作所述第二微生物的生长培养基中的补充剂。在一个实施方案中，步骤d)中使用的所述培养基包含经酶处理的第一底物和/或经酶处理的第二底物或由经酶处理的第一底物和/或经酶处理的第二底物组成，和/或包含由所述经酶处理的第一底物和/或经酶处理的第二底物的组分(优选营养物质)或由所述经酶处理的第一底物和/或经酶处理的第二底物的组分(优选营养物质)组成。在一个实施方案中，经酶处理的第一底物是所述第一底物的水解产物。
如本文在步骤b)的上下文中所用，术语“微藻”涉及能够产生蛋白质生物质、微生物脂质和/或芳香化合物的任何微藻。在一个实施方案中，步骤b)中使用的所述微藻选自小球藻属(Chlorella sp.)，例如普通小球藻(Chlorella vulgaris)和原壳小球藻(Chlorella protothecoides)；栅藻属(Scenedesmus sp.)，例如斜生栅藻(Scenedesmusobliquus)；杜氏藻属(Dunaliella sp.)，例如盐生杜氏藻(Dunaliella salina)；红球藻属(Haematococcus sp.)，例如雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)；隐甲藻属(Crypthecodinium sp.)，例如寇氏隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)；裂殖壶菌属(Schizochytrium sp.)，例如裂殖壶菌(Schizochytrium limacinum)；和扁藻属(Tetraselmis sp.)，例如周氏扁藻(Tetraselmis chui)；优选选自小球藻属(Chlorellasp.)和栅藻属(Scenedesmus sp.)。在一个实施方案中，步骤b)包括共培养所述第一微生物和微藻，以除了获得所述至少一种酶和由所述第一微生物产生的所述经酶处理的第一底物之外，还获得由所述微藻产生的蛋白质生物质、微生物脂质和/或芳香化合物。由所述微藻产生的此类蛋白质生物质、微生物脂质和/或芳香化合物可用于制备包含所述蛋白质生物质、微生物脂质和/或芳香化合物的食品。在一个实施方案中，在步骤b)中用于产生蛋白质生物质的微藻选自普通小球藻(Chlorella vulgaris)、盐生杜氏藻(Dunaliella salina)、雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)和斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)。在一个实施方案中，一种能够产生蛋白质生物质的微藻选自普通小球藻(Chlorella vulgaris)、盐生杜氏藻(Dunaliella salina)、雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)和斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)。在一个实施方案中，在步骤b)中用于产生芳香化合物的微藻选自寇氏隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)、裂殖壶菌(Schizochytrium limacinum)、周氏扁藻(Tetraselmis chui)、普通小球藻(Chlorella vulgaris)和原壳小球藻(Chlorellaprotothecoides)。在一个实施方案中，一种能够产生芳香化合物的微藻选自寇氏隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)、裂殖壶菌(Schizochytrium limacinum)、周氏扁藻(Tetraselmis chui)、普通小球藻(Chlorella vulgaris)和原壳小球藻(Chlorellaprotothecoides)。
在一个实施方案中，步骤b)中所述培养第一微生物在25℃至37℃范围内的温度下进行。在一个实施方案中，步骤b)中所述培养第一微生物在pH 4至pH 8范围内的pH下进行。在一个实施方案中，步骤b)的所述培养第一微生物进行2天至12天，优选3天至10天。在一个实施方案中，步骤b)的所述培养第一微生物用pO2＞20％进行。在一个实施方案中，步骤b)的所述培养第一微生物在搅拌下进行，优选在以100rpm至800rpm范围内的旋转速度搅拌下进行。例如，可以使用桨式搅拌器。在一个实施方案中，步骤b)的所述培养第一微生物在25℃至37℃范围内的温度下，在pH 4至pH 8范围内的pH下，在搅拌下，优选在以100rpm至800rpm范围内的旋转速度搅拌下，用pO2＞20％进行3天至10天。
在一个实施方案中，步骤b)中的所述培养第一微生物包括在25℃至37℃范围内的温度下、在pH 4至pH 8范围内的pH下和/或在溶解氧(pO2)pO2＞20％下培养所述第一微生物2天至12天，优选3天至10天。
在一个实施方案中，本发明的方法的步骤b)包括用所述第一底物培养选自丝状真菌和细菌的第一微生物，并且由此允许所述第一微生物产生至少一种酶、经酶处理的第一底物以及蛋白质生物质和/或芳香化合物；任选地，还包括用所述第一微生物共培养一种或多种微藻，并且由此允许所述一种或多种微藻产生蛋白质生物质、微生物脂质和/或芳香化合物。
在一个实施方案中，如本文所用，术语“用所述第一微生物共培养一种或多种微藻”涉及所述第一微生物与所述微藻的组合培养，例如在同一容器中的培养。在一个实施方案中，共培养包括使所述第一微生物和所述微藻经受适用于第一微生物和微藻两者的培养条件。在一个实施方案中，如果适用于第一微生物的培养条件不同于适用于微藻的培养条件，则步骤b)中的所述共培养(如果存在)包括使所述第一微生物和微藻随后经受适合于第一微生物的培养条件和适合于微藻的培养条件，或反之亦然。
在一个实施方案中，所述方法包括获得步骤b)中由所述第一微生物产生的蛋白质生物质和/或芳香化合物的步骤；以及任选地，获得由所述一种或多种微藻产生的蛋白质生物质、微生物脂质和/或芳香化合物。在一个实施方案中，如果步骤b)包括用所述第一微生物共培养一种或多种微藻，则所述方法包括获得由所述一种或多种微藻产生的蛋白质生物质、微生物脂质和/或芳香化合物的步骤。在一个实施方案中，术语“获得”和“收获”可互换使用。在一个实施方案中，收获所述蛋白质生物质和/或所述芳香化合物使用离心、过滤、蒸馏、亲油性渗透汽化、固相微萃取以及它们的组合中的任一种来进行。在一个实施方案中，收获步骤b)中由所述微藻产生的所述微生物脂质包括离心、溶剂萃取(例如，用己烷)、无溶剂萃取(例如，包括微藻细胞壁的酶水解，随后离心(诸如破碎细胞的半连续离心))、冷压、破乳以及它们的任意组合中的任一种；优选地包括离心、无溶剂萃取(例如，包括微藻细胞壁的酶水解，随后离心(诸如破碎细胞的半连续离心))、冷压以及它们的任意组合中的任一种。在一个实施方案中，收获步骤b)中由所述微藻产生的所述微生物脂质无需基于溶剂的萃取和基于化学品的破乳。例如，使用离心和/或过滤收获蛋白质生物质。例如，使用蒸馏、亲油性渗透汽化、固相微萃取以及它们的组合来收获芳香化合物。
在一个实施方案中，如本文所用，术语“预处理第二底物”涉及使所述第二底物与所述至少一种酶接触，优选地用所述至少一种酶酶处理所述第二底物。在一个实施方案中，通过用至少一种酶预处理所述第二底物，所述第二底物被转化成和/或释放允许第二微生物生长的化合物，优选营养物质，例如第二底物被转化成用于所述第二微生物的生长培养基和/或用于所述第二微生物的生长培养基的组分。在一个实施方案中，用所述至少一种酶预处理所述第二底物包括使所述第二底物与所述至少一种酶，优选酶混合物，接触6小时至72小时，优选12小时至48小时，更优选20小时至30小时；例如，在20℃至80℃，优选30℃至60℃范围内的温度下，和/或在pH 3至pH 9，优选pH 4至pH 7范围内的pH下。在一个实施方案中，用所述至少一种酶预处理第二底物包括用所述至少一种酶酶处理所述第二底物或者由用所述至少一种酶酶处理所述第二底物组成。
在一个实施方案中，如果存在步骤c)，则步骤c)中的所述预处理第二底物在30℃至80℃范围内的温度下进行。在一个实施方案中，步骤c)中的所述预处理第二底物在pH 4至pH 9范围内的pH下进行。在一个实施方案中，步骤c)的所述预处理第二底物在搅拌下进行，优选在以200rpm至800rpm范围内的旋转速度搅拌下进行。在一个实施方案中，步骤c)的所述预处理第二底物在30℃至80℃范围内的温度下，在pH 4至pH 9范围内的pH下，在搅拌下，优选在以200rpm至800rpm范围内的旋转速度搅拌下进行。在一个实施方案中，如果存在，则步骤c)中的所述预处理第二底物包括用所述至少一种酶，优选酶混合物，任选地本发明的组合物，处理所述第二底物6小时至72小时，优选12小时至48小时，更优选20小时至30小时；例如，在20℃至80℃，优选30℃至60℃范围内的温度下，和/或在pH 3至pH 9，优选pH4至pH 7范围内的pH下。在一个实施方案中，如果存在，则步骤c)中的所述预处理第二底物包括在液体(例如，包含缓冲体系的培养基)中用所述至少一种酶处理所述第二底物。
在一个实施方案中，所述方法包括获得所述至少一种酶并且用所述至少一种酶预处理所述第二底物的步骤c)，其中所述预处理包括使所述第二底物与所述至少一种酶接触，所述至少一种酶为从培养所述第一微生物获得(优选直接获得)的液体酶制剂的形式，或者为冻干酶制剂的形式，任选地为在溶液中重构的冻干酶制剂的形式。在一个实施方案中，步骤c)的所述获得所述至少一种酶包括获得液体形式或冻干酶制剂形式的所述至少一种酶。在一个实施方案中，在用所述至少一种酶预处理第二底物之前，将所述至少一种酶的此类冻干酶制剂溶解。
在一个实施方案中，如本文所用，术语“经酶处理的第二底物”涉及已经与由所述第一微生物产生的所述至少一种酶接触的第二底物。在一个实施方案中，将经酶处理的第二底物或其组分用作所述第二微生物的生长培养基或用作所述第二微生物的生长培养基中的补充剂。在一个实施方案中，经酶处理的第二底物是所述第二底物的水解产物。
在一个实施方案中，如本文所用，术语“相同类型的”涉及第一底物和第二底物包含相同类型或基本上相同类型的食物残余物或者由相同类型或基本上相同类型的食物残余物组成，例如第一底物和第二底物均为烘焙产品食物残余物。例如，相同类型的第一和第二底物源自相同的来源，例如相同批次的食物残余物，和/或具有相同或相似的组成。在一个实施方案中，当第一底物和第二底物是相同类型时，第一底物和第二底物是相同的。在一个实施方案中，第一底物的组成和第二底物的组成至少50％，优选至少70％，更优选至少90％相似；即，组分以及任选地它们的浓度具有至少50％，优选至少70％，更优选至少90％的相似性。在一个实施方案中，当第一底物和第二底物为相同类型时，第一底物和第二底物均为烘焙食物残余物，例如面包、面包卷、饼干、松饼、曲奇或蛋糕；水果食物残余物，例如果浆、果皮或果汁；蔬菜食物残余物，例如蔬菜皮、蔬菜浆或蔬菜汁；碾磨食物残余物，例如麸皮或麸皮面粉；鱼类食物残余物，例如鱼类加工残余物；海产食物残余物，例如海产食物加工残余物；啤酒酒糟；谷类食物残余物，例如大米、小麦、小米或玉米；餐馆食物残余物，例如餐馆剩余物；动物产品食物残余物，例如奶或奶酪；超市食物残余物，例如过期食物；或它们的任意组合。在一个优选的实施方案中，当第一底物和第二底物为相同类型时，第一底物和第二底物均为烘焙食物残余物，优选面包食物残余物。
如本文所用，术语“第二微生物”涉及产油微生物，优选选自产油酵母、产油真菌、产油细菌和产油微藻。产油微生物是本领域技术人员已知的。产油酵母、产油真菌、产油细菌和产油微藻是通常能够产生微生物脂质的微生物。
在一个实施方案中，所述产油酵母选自皮状新毛孢子菌属(Cutaneotrichosporonsp.),例如产油皮状新毛孢子菌(Cutaneotrichosporon oleaginosus)；毛孢子菌属(Trichosporon sp.)，例如产油毛孢子菌(Trichosporon oleaginosus)、头状毛孢子菌(Trichosporon capitatu)和阿萨希毛孢子菌(Trichosporon asahii)；红螺菌属(Rhodospirillum sp.)；红冬孢酵母属(Rhodosporidium sp.)，例如圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)；红孢子菌属(Rhodosporon sp.)；假丝酵母属(Candidasp.)，例如维斯假丝酵母(Candida viswanathii)和弗里斯假丝酵母(Candidafreyschussii)；隐球菌属(Cryptococcus sp.)，例如弯曲隐球菌(Cryptococcuscurvatus)；油脂酵母属(Lipomyces sp.)，例如斯达油脂酵母菌(Lipomyces starkeyi)；耶氏酵母属(Yarrowia sp.)，例如解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)；红酵母属(Rhodotorula sp.)，例如禾本红酵母(Rhodotorula graminis)、瘦弱红酵母(Rhodotorulagracilis)和黏红酵母(Rhodotorula glutinis)；和芹毛酵母属(Apiotrichum sp.)，例如弯曲芹毛酵母(Apiotrichum curvarum)。在一个优选的实施方案中，所述产油酵母选自皮状新毛孢子菌属(Cutaneotrichosporon sp.)，优选产油皮状新毛孢子菌(Cutaneotrichosporon oleaginosus)。在一个实施方案中，产油酵母不是圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)。在一个实施方案中，所述红冬孢酵母属(Rhodosporidiumsp.)不包括圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)。在一个实施方案中，如果所述第二微生物是红冬孢酵母属(Rhodosporidium sp.)，则该红冬孢酵母属(Rhodosporidiumsp.)不是圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)。在一个实施方案中，如果所述产油酵母是红冬孢酵母属(Rhodosporidium sp.)，则该红冬孢酵母属(Rhodosporidium sp.)不是圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)。
在一个实施方案中，所述产油真菌选自小克银汉霉属(Cunninghamella sp.)，例如刺孢小克银汉霉(Cunninghamella echinulate)；曲霉属(Aspergillus sp.)，例如米曲霉(Aspergillus oryzae)、塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)、土曲霉(Aspergillusterreus)和黑曲霉(Aspergillus niger)；脉孢菌属(Neurospora sp.)，例如间型脉孢菌(Neurospora intermedia)；红曲霉属(Monascus sp.)，例如紫红曲霉(Monascuspurpureus)；根霉属(Rhizopus sp.)，例如米根霉(Rhizopus oryzae)；镰刀菌属(Fusariumsp.)，例如镰孢霉(Fusarium venenatum)；毛霉属(Mucor sp.)，例如卵孢接霉(Mucormoelleri)；被孢霉属(Mortierella sp.)，例如深黄被孢霉(Mortariella isabellina)和高山被孢霉(Mortierella alpine)，优选高山被孢霉(Mortierella alpine)；和腐质霉属(Humicola sp.)。
在一个实施方案中，所述产油细菌选自红球菌属(Rhodococcus sp.)、不动杆菌属(Acinetobacter sp.)和芽孢杆菌属(Bacillus sp.)。
在一个实施方案中，所述产油微藻选自小球藻属(Chlorella sp.)、新颖拟绿球藻属(Pseudochlorococcum sp.)、微绿球藻属(Nannochloris sp.)、微拟球藻(Nannochloropsis sp.)、等鞭金藻属(Isochrysis sp.)、黄丝藻属(Tribonema sp.)、杜氏藻属(Dunaliella sp.)、纤维藻属(Ankistrodesmus sp.)、葡萄藻属(Botryococcus sp.)、巴夫藻属(Pavlova sp.)、栅藻属(Scenedesmus sp.)、骨条藻属(Skeletonema sp.)和菱形藻属(Nitzschia sp.)。
在一个实施方案中，第二微生物是产油酵母，优选地选自产油皮状新毛孢子菌(Cutaneotrichosporon oleaginosus)、产油毛孢子菌(Trichosporon oleaginosus)、头状毛孢子菌(Trichosporon capitatu)、阿萨希毛孢子菌(Trichosporon asahii)、斯达油脂酵母菌(Lipomyces starkeyi)、圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、禾本红酵母(Rhodotorula graminis)、瘦弱红酵母(Rhodotorula gracilis)、黏红酵母(Rhodotorula glutinis)、弯曲芹毛酵母(Apiotrichum curvarum)、弯曲隐球菌(Cryptococcus curvatus)、维斯假丝酵母(Candidaviswanathii)和弗里斯假丝酵母(Candida freyschussii)；例如，产油皮状新毛孢子菌(Cutaneotrichosporon oleaginosus)。在一个实施方案中，第二微生物不是圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)。例如，第二微生物可以是选自以下项的产油酵母：产油皮状新毛孢子菌(Cutaneotrichosporon oleaginosus)、产油毛孢子菌(Trichosporonoleaginosus)、头状毛孢子菌(Trichosporon capitatu)、阿萨希毛孢子菌(Trichosporonasahii)、斯达油脂酵母菌(Lipomyces starkeyi)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、禾本红酵母(Rhodotorula graminis)、瘦弱红酵母(Rhodotorula gracilis)、黏红酵母(Rhodotorula glutinis)、弯曲芹毛酵母(Apiotrichum curvarum)、弯曲隐球菌(Cryptococcus curvatus)、维斯假丝酵母(Candida viswanathii)和弗里斯假丝酵母(Candida freyschussii)。在一个优选的实施方案中，第二微生物是产油酵母，优选地选自皮状新毛孢子菌属(Cutaneotrichosporon sp.)，更优选产油皮状新毛孢子菌(Cutaneotrichosporon oleaginosus)。根据本发明的一个实施方案，用于根据本发明的方法的产油微生物选自产油酵母、产油真菌、产油细菌和产油微藻；优选地是产油酵母。在一个优选的实施方案中，所述产油微生物/酵母是产油皮状新毛孢子菌(Cutaneotrichosporon oleaginosus，C.oleaginosus)。
如本文所用，术语“包含所述经酶处理的底物的培养基”涉及包含经酶处理的第一底物和/或经酶处理的第二底物和/或包含所述经酶处理的第一底物和/或第二底物的组分的培养基；例如，包含在步骤b)中获得的第一底物的水解产物和/或在步骤c)中获得的第二底物的水解产物或由步骤b)中获得的第一底物的水解产物和/或步骤c)中获得的第二底物的水解产物组成的培养基。在一个实施方案中，所述经酶处理的第一底物和/或所述经酶处理的第一底物的组分是在步骤b)中获得的水解产物，优选所述第一底物的水解产物。在一个实施方案中，所述经酶处理的第二底物和/或所述经酶处理的第二底物的组分是在步骤c)中获得的水解产物，优选所述第二底物的水解产物。在一个实施方案中，步骤d)中使用的培养基包含所述第一底物的水解产物和/或所述第二底物的水解产物。在一个实施方案中，所述培养基是用于所述第二微生物的生长培养基。在一个实施方案中，术语“培养基”和“生长培养基”可互换使用。在一个实施方案中，培养基包含例如允许生物体(例如，第二微生物)生长的组分/营养物质。在一个实施方案中，培养基包含至少经酶处理的第一底物和/或经酶处理的第二底物的组分，并且任选地还包含额外的碳源、氮源、有机酸(例如，乙酸)、痕量金属和/或维生素。在此上下文中，“额外的”意指培养基可包含源自所述经酶处理的第一底物和/或经酶处理的第二底物的碳源、氮源、有机酸、痕量金属和/或维生素，以及此外不源自所述经酶处理的第一底物和/或经酶处理的第二底物的进一步的碳源、氮源、有机酸、痕量金属和/或维生素。在一个实施方案中，所述碳源是食品级碳源。在一个实施方案中，术语“包含经酶处理的底物的培养基”涉及包含经酶处理的底物(例如，步骤b)的经酶处理的第一底物或步骤c)的经酶处理的第二底物)的培养基，和/或涉及包含经酶处理的底物的组分的培养基。例如，可以收获经酶处理的底物的组分，并且可以将所述组分掺入培养基中，或者可以将经酶处理的底物直接用作培养基。例如，在步骤b)中获得的经酶处理的第一底物和/或在步骤c)中获得的经酶处理的第二底物可以直接用作步骤d)中使用的培养基。可以将经酶处理的第一底物和经酶处理的第二底物混合以提供用于步骤d)的培养基。在一个实施方案中，步骤b)和/或步骤c)中使用的培养基分别包含经酶处理的第一和第二底物，并且在步骤d)中用作用于培养第二微生物的培养基。在一个实施方案中，步骤d)中使用的培养基包含步骤b)中使用的包含所述经酶处理的第一底物的培养基或由步骤b)中使用的包含所述经酶处理的第一底物的培养基组成，和/或包含步骤c)中使用的包含所述经酶处理的第二底物的培养基或由步骤c)中使用的包含所述经酶处理的第二底物的培养基组成。在一个实施方案中，术语“经酶处理的第一底物”和“第一底物的水解产物”可互换使用。在一个实施方案中，术语“经酶处理的第二底物”和“第二底物的水解产物”可互换使用。在一个实施方案中，此类水解产物，例如第一底物的水解产物和/或第二底物的水解产物在步骤d)中用作用于生长第二微生物的培养基。在一个实施方案中，将步骤b)和/或步骤c)的包含经酶处理的底物的细胞培养液用作步骤d)的培养基。在一个实施方案中，在步骤b)之后，或者如果存在步骤c)，在步骤c)之后，在步骤d)中于步骤b)或步骤c)中使用的培养基中分别培养第二微生物。例如，可以将第二微生物加入到其中已经进行了步骤b)和/或步骤c)的容器(例如，细胞培养容器)中。
在一个实施方案中，步骤d)中使用的经酶处理的第一底物包含步骤b)中使用的培养基；其中任选地，所述培养基已经过过滤和/或离心。在一个实施方案中，步骤d)中使用的经酶处理的第二底物包含步骤c)中使用的液体，例如培养基；其中任选地，所述液体已经过过滤和/或离心。在一个实施方案中，步骤d)中使用的培养基是步骤b)和/或步骤c)中使用的培养基；其中任选地，所述培养基已经过过滤和/或离心。在一个实施方案中，将步骤b)和/或步骤c)中使用的液体(例如，培养基)转移至步骤d)并用作步骤d)中的培养基。
在一个实施方案中，在步骤d)中在培养基中使用步骤b)中产生的所述经酶处理的第一底物之前，将所述经酶处理的第一底物离心。在一个实施方案中，将步骤b)中使用的包含产生的经酶处理的第一底物的生长培养基离心，并将此类离心的上清液用作步骤d)的培养基或用作步骤d)的培养基的组分。在一个实施方案中，在步骤d)中在培养基中使用步骤c)中产生的所述经酶处理的第二底物之前，将所述经酶处理的第二底物离心。在一个实施方案中，将步骤c)中使用的包含产生的经酶处理的第二底物的培养基离心，并将此类离心的上清液用作步骤d)的培养基或用作步骤d)的培养基的组分。例如，此类离心可以是在5,000rpm至20,000rpm范围内，例如14,000rpm，离心1分钟至60分钟，例如20分钟。在一个实施方案中，使用此类离心，可以通过将生物质与包含经酶处理的底物的上清液分离来收获蛋白质生物质。
在一个实施方案中，所述培养基还包含额外的碳源、氮源、有机酸、痕量金属和/或维生素。在一个实施方案中，所述培养基包含以下项中的任一种：碳水化合物，诸如单糖，优选戊糖或己糖，更优选葡萄糖、木糖、甘露醇、阿拉伯糖，以及寡糖；蛋白质水解产物，诸如寡聚氨基酸和氨基酸或其他肽水解产物；脂肪酸；有机酸，优选乙酸；矿物质；维生素和微量元素，以及它们的组合。在一个实施方案中，所述额外的碳源选自糖、甘油、糖醇、糖酸、脂肪酸、脂肪醇和脂肪酯。在一个实施方案中，氮源选自尿素、蛋白质水解产物、氨基酸、无机亚硝酸盐。在一个实施方案中，痕量金属选自V、Mo、Cu和Fe。在一个实施方案中，维生素选自维生素C、维生素B、维生素A和维生素E。在一个实施方案中，所述额外的碳源、氮源、有机酸、痕量金属和/或维生素具有食品级。
在一个实施方案中，所述碳源选自包含以下项的组：碳水化合物；氨基酸；脂肪酸；优选单糖，优选戊糖或己糖，更优选葡萄糖、木糖和/或甘露醇；寡糖；动物组织、植物组织或微生物的水解产物；以及前述的任意组合，其中更优选地，所述碳源是葡萄糖。在一个实施方案中，所述培养基中所述碳源的浓度范围为50mM至400mM，优选200mM至300mM。所述葡萄糖可以单独使用，或者可以例如与合适的水解产物(诸如蛋白胨、胰蛋白胨等)组合使用。在一个实施方案中，水解产物是藻类水解产物、木质纤维素水解产物、植物水解产物、海洋生物质水解产物，诸如海洋大型藻类和微藻的水解产物、玉米水解产物、小麦水解产物或其他水解产物。在根据本发明的方法的一些实施方案中，其涉及再循环步骤，水解产物也可以是微生物水解产物，例如酵母水解产物，该酵母水解产物源自产油微生物(例如，酵母本身)的水解，优选地在此类水解产物已经用于生产脂质之后。
在一个实施方案中，培养基中碳与氮的重量比(C:N)为(100-200):1，特别是如果它是限氮培养基。在另一个实施方案中，培养基中碳与氮的重量比(C:N)为(10-100):1，优选地(10-50):1，特别是当它不是限氮培养基时。在一个实施方案中，培养基是富氮培养基。上面和下面进一步指出的重量比是起始培养基中的重量比，即当步骤d)开始时的重量比。如本文所用，术语“富氮培养基”指不是限氮培养基的培养基。在一个实施方案中，“富氮培养基”指其中碳与氮的重量比(C:N)＜100，优选地≤80，更优选地为25至80的培养基。
在一个实施方案中，步骤d)中使用的所述培养基是富氮培养基。在一个实施方案中，步骤d)中使用的所述培养基还包含氮源，优选地以蛋白水解产物的形式，诸如蛋白胨、胰蛋白胨或其他肽水解产物，其中优选地，所述肽水解产物包含所述产油微生物的动物组织、植物组织和/或组分。在一个实施方案中，氮源选自蛋白质水解产物，诸如蛋白胨、胰蛋白胨或其他肽水解产物，其中优选地，所述肽水解产物包含所述产油微生物的动物组织、植物组织和/或组分。不希望受任何理论的束缚，本发明人相信，此类额外的氮源的存在允许总体上增加脂质和生物质的产生。
在一个实施方案中，所述有机酸选自包含以下项的组：乙酸、丙二酸、草酸、柠檬酸、丙酸、戊酸、丙烯酸、巴豆酸、丁酸、异丁酸、异戊酸、3-羟基丁酸、3-羟基丙酸、2-羟基丁酸、乳酸和此类酸的相应盐，以及前述有机酸中的任意有机酸的混合物。优选地，所述有机酸是乙酸或乙酸盐。在一个实施方案中，所述有机酸仅是乙酸或乙酸盐；在另一个实施方案中，所述有机酸是乙酸或乙酸盐与任何其他上述有机酸的组合。应当注意，如本文所用，术语“有机酸”意在涵盖相应的有机酸，而不管其质子化程度如何，即，其意在涵盖质子化状态以及去质子化状态的所述酸，例如当在水溶液中，在其质子化或去质子化的pH下时，分别取决于相应的pKa值。如本文所用，术语“有机酸”还意在涵盖有机酸的盐，例如此类有机酸的相应金属盐。此类金属盐的实例是相应有机酸的碱金属盐或碱土金属盐。盐可以是其解离形式或未解离形式。如本文所用，术语“有机酸的混合物”意在涵盖有机酸以其相应的酸形式，即与其他有机酸的混合物，有机酸以其酸形式与其盐形式的其他有机酸的混合物，以及有机酸的盐与有机酸的其他盐的混合物。还应注意，如本文所用，术语“有机酸”不涵盖脂肪酸或氨基酸。如本文所用，短语“碳源和有机酸”暗示“碳源”不同于“有机酸”。因此，这两种实体在化学上是不同的。在一个实施方案中，所述有机酸的浓度为20mM至200mM，优选30mM至100mM。在一个实施方案中，步骤d)中使用的培养基补充有有机酸。
在一个实施方案中，步骤d)的所述培养第二微生物在10℃至37℃，优选18℃至33℃范围内的温度下进行。在一个实施方案中，步骤d)的所述培养第二微生物在pH 3至pH 9范围内的pH下进行。在一个实施方案中，步骤d)的所述培养第二微生物进行1天至12天，优选2天至10天。在一个实施方案中，步骤d)的所述培养第二微生物用pO2＞20％进行。在一个实施方案中，步骤d)的所述培养第二微生物在搅拌下进行，优选在以20rpm至1000rpm，例如50rpm至800rpm范围内的旋转速度搅拌下进行。例如，可以使用桨式搅拌器。在一个实施方案中，步骤d)的所述培养第二微生物在10℃至37℃，优选18℃至33℃范围内的温度下，在pH3至pH 9范围内的pH下，在搅拌下，优选在以20rpm至1000rpm，例如50rpm至800rpm范围内的旋转速度搅拌下，用pO2＞20％进行1天至12天，优选2天至10天。在一个实施方案中，步骤d)的所述培养第二微生物包括在10℃至37℃，优选18℃至33℃范围内的温度下，在pH 3至pH9范围内的pH下，和/或在溶解氧(pO2)pO2＞20％下，优选地在包含任何经酶处理的第一底物或其组分、经酶处理的第二底物或其组分、YPD、YNB、Sabouraud bouillong以及它们的任意组合的培养基中，培养所述第二微生物1天至12天，优选2天至10天。
在一个实施方案中，所述方法适用于产生相对于总脂肪酸含量具有＞60％不饱和脂肪酸含量和/或具有在＜10℃，例如9℃至5℃范围内，诸如例如大约5℃的倾点的脂质。如果为步骤d)选择以下参数，则尤其如此：
在下列条件下，在包含经酶处理的底物，例如经酶处理的第一底物和/或经酶处理的第二底物的培养基中生长所述产油微生物：温度10℃至20℃，溶解氧含量10％至30％和/或加入巴豆酸(总有机酸的0％至10％)，并且由此允许所述产油微生物产生微生物脂质，其特征在于在＜10℃，例如9℃至5℃范围内，诸如例如大约5℃的“倾点”和/或相对于总脂肪酸含量＞60％的不饱和脂肪酸含量。如本文所用，“倾点”通常根据以下标准中的任一种来确定：DIN51597、DIN EN 23015:1994-05、DIN ISO 3015:1982-10、DIN ISO 3016:1982-10、ASTM D97、ASTM D5985，优选使用DIN ISO 3016。
在培养用于微生物油生产的微生物期间，在微生物油生产的脂质生产率或生物质生产率中存在偏移。通常，脂质在两相系统中产生，该两相系统包括在非限制性条件下用于生物质生产的第一步骤，随后是营养物质限制阶段，在该营养物质限制阶段期间生物质生长停止并且仅脂质积累。在这些条件下，脂质生产率不超过70％w/w。令人惊讶地，本发明公开了一种全新的脂质生产途径，其中可以同时实现生物质生长和脂质积累。这提供了生物质和脂质收率超过200g L-1生物质的选项，含有超过85％w/w的脂质。
在一个实施方案中，产油微生物在包含所述经酶处理的底物并且任选地还包含碳源、氮源、有机酸、痕量金属和/或维生素中的任意的培养基中生长。根据所述培养基的pH，有机酸在以盐/羧酸根阴离子形式存在的情况下被离解/去质子化，或者在以质子化形式的有机酸存在的情况下不被离解。在一个实施方案中，步骤d)中所述产油微生物在其中生长的培养基包含所述经酶处理的底物。在一个实施方案中，术语“培养”和“生长”同义使用。在一个实施方案中，当提及“经酶处理的底物”时，此类术语涉及“经酶处理的第一底物”和/或“经酶处理的第二底物”。不希望受任何理论的束缚，本发明人相信，有机酸的存在，例如乙酸/乙酸盐的存在允许甚至进一步增加脂质生产率，而碳源的存在允许总生物质的增加。应当注意，如上定义的“碳源”和有机酸是彼此不同的两种不同实体。
在一个实施方案中，术语“在没有任何基于溶剂的萃取或基于化学品的破乳的情况下对所述培养的第二微生物进行纯酶处理”意在指代其中a)不使用一种或多种溶剂萃取或b)不使用一种或多种(合适的)化学试剂破乳或者c)a)和b)都不存在的所述产油微生物的酶处理。优选地，该术语意在指代没有任何暴露于萃取溶剂和没有任何暴露于破乳化学试剂的酶处理。该术语还意在排除对所述生长的产油微生物进行任何其他预处理。应当注意，在本发明的实施方案中，“纯酶处理”排除对生长的产油微生物进行任何预处理，该预处理可以是化学的(使用生长的产油微生物将暴露于其的一种或几种化学试剂)或物理的(诸如物理条件的变化，例如温度、压力、超声、光、电磁辐射的照射等)。
在一个实施方案中，所述生长的产油微生物的所述纯酶处理是用水解酶单独处理所述微生物，或者与蛋白酶组合处理所述微生物/随后用蛋白酶处理所述微生物。在一个实施方案中，所述水解酶已从真菌，优选丝状真菌，更优选来自木霉属(Trichoderma)、曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)、金芽孢杆菌属(Aureobasillium)和镰刀菌属(Fusarium)的真菌获得。在一个实施方案中，所述水解酶从已经在诱导系统的存在下培养的真菌获得，其中优选地，所述诱导系统是所述产油微生物的组分，更优选用于产生微生物脂质的所述产油微生物的一种或几种细胞壁组分，以便获得允许所述产油微生物的细胞壁裂解的水解酶制剂。在一个实施方案中，所述诱导系统是在步骤e)和/或步骤f)期间产生的所述产油微生物的所述残余生物质，或者是所述残余生物质的一部分或组分。
在一个实施方案中，从所述真菌获得的所述水解酶是单独制备的(通过进行本发明的步骤d)至步骤-f)并且在步骤e)中作为直接从培养所述真菌获得的液体制剂使用，或者作为冻干制剂使用，该冻干制剂随后在溶液中重构以在步骤e)中使用。在一个实施方案中，所述水解酶含有一种或几种活性，例如但不限于选自纤维素酶活性、木葡聚糖酶活性、β-葡糖苷酶活性、甘露聚糖酶活性、木聚糖酶活性和昆布多糖酶活性的酶活性。在一个实施方案中，如果存在，所述蛋白酶选自由曲霉属(Aspergillus sp.)、链霉菌属(Streptomycessp.)或芽孢杆菌属(Bacillus sp.)产生的蛋白酶。在根据本发明的一个实施方案中，“纯酶处理”另外涉及用蛋白酶处理所述微生物(但是仍然排除预处理或基于溶剂的萃取或基于化学品的破乳)。应当注意，如果使用此类蛋白酶并且当使用此类蛋白酶时，在使用前述水解酶进行处理之后使用此类蛋白酶或者与使用前述水解酶进行处理组合使用此类蛋白酶。不希望受任何理论的束缚，本发明人相信涉及蛋白酶的处理允许将产生的脂质与任何与其相关的蛋白质分离，并因此有助于脂质的释放。在一个实施方案中，蛋白酶选自由曲霉属(Aspergillus sp.)、链霉菌属(Streptomyces sp.)或芽孢杆菌属(Bacillus sp.)产生的蛋白酶的组。
在一个实施方案中，在步骤e)期间，如果存在，“在没有任何基于溶剂的萃取的情况下对所述培养的第二微生物进行纯酶处理”是用水解酶处理所述微生物。优选地，此类水解酶从另一种微生物获得，优选地从真菌获得，更优选地从丝状真菌获得。在一个实施方案中，真菌选自木霉属(Trichoderma)、曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicillium)、金芽孢杆菌属(Aureobasillium)和镰刀菌属(Fusarium)。在更优选的实施方案中，丝状真菌是里氏木霉(Trichoderma reesei)，因为已经证明这产生了特别有效的水解酶，该水解酶允许产油微生物的细胞壁裂解。在一个实施方案中，所述水解酶从真菌，优选地已经在诱导系统的存在下培养的丝状真菌获得，其中优选地，所述诱导系统是所述产油微生物的组分，优选地，用于产生微生物脂质的所述产油微生物的一种或几种细胞壁组分，以便获得允许所述产油微生物的细胞壁裂解的水解酶制剂。在一个实施方案中，所述诱导系统是可以在步骤e)和步骤f)期间产生的所述残余生物质或其组分。优选地，此类水解酶通过在所述产油微生物的细胞壁片段的存在下培养所述丝状真菌来产生。不希望受任何理论的束缚，本发明人相信，将丝状真菌(例如，里氏木霉(T.reesei))暴露于所述产油微生物的此类细胞壁组分的存在允许此类丝状真菌精确地产生合适的酶以完成产油微生物的细胞壁的裂解。在一个特别优选的实施方案中，使用来自木霉属(Trichoderma)的丝状真菌，例如里氏木霉(Trichoderma reesei)，并且在一个特别优选的实施方案中，使用里氏木霉(Trichodermareesei)的突变体，例如具有ATCC保藏号56765和13631的突变体。一旦培养了丝状真菌，就可以对所得培养物进行进一步加工，诸如浓缩，并除去真菌本身的生物质，并且所得上清液可以以这种形式使用，或者可以冷冻干燥并保存，以便贮存，随后在适当的水溶液中重构。同样，不希望受任何理论的束缚，本发明人相信，如此产生的水解酶可以代表各种酶活性的组合，例如纤维素酶、木葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶和昆布聚糖酶，以及可能的其他酶活性。
在一个实施方案中，如本文所用，术语“适于随后收获”涉及促进微生物脂质的收获，例如通过使产生的微生物脂质易于随后回收，诸如易于随后从培养容器中回收。例如，通过对产油微生物进行纯酶处理，微生物脂质变得易于随后收获。在一个实施方案中，术语“适于”和“易于”可互换使用。
在一个实施方案中，通过在没有任何基于溶剂的萃取或基于化学品的破乳的情况下对产油微生物进行纯酶处理，使微生物脂质适于随后收获，例如通过基于密度的分离方法。在一个实施方案中，所述基于密度的分离方法选自基于自然重力的分离、重力辅助相分离和离心，其中所述基于自然重力的分离、重力辅助相分离和离心中的每一者单独进行或者与倾析、抽吸或其他机械收获方法组合进行。
产油微生物在包含经酶处理的底物的合适培养基中的生长允许所述产油微生物产生微生物脂质。然而，通常，这些微生物脂质仍然包含在产油微生物的细胞内，并且由此需要使其易于随后回收。因此，本发明的实施方案提供了一种对生长的产油微生物的酶处理，其使得产生的微生物脂质适于或易于随后从培养容器中回收。应当注意，根据本发明的方法涉及生长的产油微生物的纯酶处理，而不必依赖任何预处理步骤，例如化学预处理步骤，或随后或伴随的使用溶剂萃取所述脂质的步骤。此类化学预处理步骤或随后或伴随的萃取步骤的实例是基于溶剂的萃取或基于化学品的破乳。然而，此类排除的预处理步骤也可以是物理步骤，诸如温度变化、压力变化、离心、超声处理、照射等。如本文所用，术语“基于化学品的破乳”是指将生长的生物质暴露于破乳剂以便能够破坏任何乳液(其可能已经形成)。
根据本发明的实施方案，该方法不涉及基于溶剂的萃取、基于化学品的破乳或其他处理，诸如温度冲击、化学处理或高压均化或超声均化。这些将潜在地增加成本或方法的危险特性，并且通过本发明避免。此类不存在基于溶剂的萃取和基于化学品的破乳的优点是下游产物，特别是微生物油，适用于进一步加工成食品。特别地，例如由于微生物油中不存在溶剂和/或化学品残余物，用本发明的方法生产的微生物油可直接用于制备食品。本发明人已经惊奇地发现，此类苛刻的处理步骤不是严格必需的。
在根据本发明的实施方案中，使用基于密度的分离方法收获产生的微生物脂质。以其最简单的形式，此类基于密度的分离方法可以是这样的方法，其中简单地允许产油微生物的培养物静置一段时间，结果由于不同的密度和/或在水中的溶解度，脂质相将与水相分离。这可以与随后的倾析、抽吸或其他从培养物中机械除去脂质相组合。在其他实施方案中，分离可以通过重力辅助相分离、通过离心单独或者与随后的脂质相的机械去除(例如，倾析或抽吸)组合进行。
在一个实施方案中，所述方法包括在没有任何基于溶剂的萃取或基于化学品的破乳的情况下对所述培养的第二微生物进行所述纯酶处理的所述步骤e)，其中所述培养的第二微生物的所述纯酶处理是单独用水解酶或者与蛋白酶组合/随后用蛋白酶处理所述微生物。在一个实施方案中，步骤d)和步骤e)在同一反应容器内进行。这在本文中也被称为“一锅法”或“一锅法工艺”。在该实施方案中，根据本发明的方法可以被认为是用于制造微生物脂质，特别是食品级微生物脂质的一锅法工艺。
在一个实施方案中，步骤e)和/或步骤f)产生脂质相以及所述产油微生物的水解产物。在一些情况下，步骤e)和/或步骤f)还可以额外地产生所述产油微生物的残余生物质，所述残余生物质不同于所述脂质相和所述水解产物。在一个实施方案中，所述方法包括重复进行步骤d)至步骤f)，并且其中将由步骤e)和/或步骤f)产生的所述产油微生物的所述水解产物再使用/再循环用于进行步骤d)。在此类实施方案中，将由步骤e)和/或步骤f)产生的微生物水解产物再进料到步骤d)中使用的培养基中，并且可以充当额外的碳源(除了存在于经酶处理的底物中的碳源之外)。其中在步骤d)至步骤f)中再使用/再循环副产物的实施方案，例如其中在步骤d)中再使用/再循环由步骤e)和/或步骤f)产生的产物的实施方案，避免了废弃产物的出现。因此，此类实施方案在本文中有时也被称为“无废弃物工艺”或“无废弃物方法”。在一个实施方案中，步骤d)至步骤f)进行2次至n次，其中n为选自3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49和50的整数。在一个实施方案中，步骤d)至步骤f)进行2次至3次。重复再循环允许有效利用所涉及的各种培养基并且避免产生过量废弃物，因为由所述方法产生的产物，诸如产油微生物的水解产物，被再使用作为起始培养基以生长此类产油微生物。
在一个实施方案中，本发明的方法还包括收获所述蛋白质生物质和/或所述芳香化合物的一个或多个步骤，例如使用离心、过滤、蒸馏、亲油性渗透汽化、固相微萃取、沉降、凝结、浮选中的任一种以及它们的组合，优选地使用离心、过滤、蒸馏、亲油性渗透汽化、固相微萃取以及它们的组合中的任一种。在一个实施方案中，本发明的方法以分批补料、半连续或连续模式进行，其中任选地，所述方法涉及重复加入有机酸。
在一个实施方案中，本发明的方法包括预处理所述第一底物的步骤和/或，如果存在步骤c)，预处理所述第二底物的步骤，通过：
-机械预处理，优选地通过研磨、混合、粉碎和/或筛分所述底物；
-将所述底物溶解在溶剂中，优选地溶解在水中；
-化学水解所述底物，优选使用酸，例如硫酸；例如使用浓度在0.1体积％至10体积％范围内的酸，优选硫酸，在20℃至260℃，优选80℃至140℃范围内的温度下，持续1秒至24小时，优选30分钟至3小时；
-对所述底物进行热预处理，优选地在50℃至200℃的温度下进行10分钟至240分钟，更优选地在80℃至170℃的温度下进行30分钟至90分钟；
-对所述底物进行发酵预处理，优选厌氧发酵；和/或
-使用一种或多种酶，任选地可商购的酶，对所述底物进行酶预处理；其中所述一种或多种酶选自蛋白酶，例如内肽酶和外肽酶、丝氨酸内肽酶、枯草杆菌蛋白酶A和胃蛋白酶；和水解酶，优选糖苷水解酶，更优选选自α-淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、木葡聚糖酶、半乳聚糖酶、阿拉伯糖酶、甘露聚糖酶、脂肪酶、葡糖淀粉酶和果胶酶的糖苷水解酶。
在一个实施方案中，使用所述机械预处理、所述溶解、所述化学水解、所述热预处理、所述发酵预处理和所述酶预处理中的任意的组合预处理所述第一底物和/或第二底物。在一个实施方案中，此类预处理所述第一底物的步骤，如果存在，在用第一底物培养所述第一微生物之前进行。在一个实施方案中，所述使用所述机械预处理、所述溶解、所述化学水解、所述热预处理、所述发酵预处理、所述酶预处理或它们的任意组合中的任一种预处理所述第二底物的步骤是除了所述步骤c)的用所述至少一种酶预处理第二底物之外的另外的预处理。例如，所述使用所述机械预处理、所述溶解、所述化学水解、所述热预处理、所述发酵预处理、所述酶预处理或它们的任意组合中的任一种预处理所述第二底物的步骤在所述步骤c)的用所述至少一种酶预处理第二底物之前和/或之后进行。在一个实施方案中，此类预处理所述第二底物的步骤，如果存在，在用第二底物培养所述第二微生物之前进行，优选地在步骤c)的用所述至少一种酶预处理第二底物之前进行。在一个实施方案中，所述发酵预处理是使用厌氧微生物的厌氧发酵。在一个实施方案中，所述发酵预处理包括在pH2.5至pH 5.5，优选pH 3至pH 4范围内的pH下，在20℃至50℃，优选25℃至40℃范围内的温度下，在0％至30％，优选5％至10％范围内的pO2下，处理所述底物1天至5天，优选1天至3天，和/或在50rpm至500rpm的搅拌下。
在一个实施方案中，所述预处理所述第一底物和/或第二底物是酶预处理，该酶预处理是水解。在一个实施方案中，所述预处理所述第一底物和/或所述第二底物的步骤包括酶预处理，该酶预处理是水解。例如所述食物残余物中所含淀粉的水解可以包括两个阶段；在第一阶段，使用α-淀粉酶来液化淀粉，从而提供包含糊精和葡萄糖的溶液；在第二阶段中，液化淀粉经受葡糖淀粉酶处理。在一个实施方案中，所述预处理所述第一底物和/或所述第二底物的步骤包括酶预处理，所述酶预处理包括用α-淀粉酶和葡糖淀粉酶处理。在一个实施方案中，本发明的方法包括精制在步骤f)中收获的微生物脂质的步骤，例如通过物理精制。
在一个实施方案中，通过遗传修饰，例如通过非靶向或靶向遗传改变，进一步提高第一微生物或第二微生物产生酶、蛋白质生物质、微生物脂质和/或芳香化合物的能力。在一个实施方案中，所述非靶向遗传改变包括化学或辐射诱导的突变。在一个实施方案中，所述辐射诱导的突变包括UV、电离、γ射线、X射线和中子辐射中的任一种。在一个实施方案中，所述靶向遗传改变包括CRISPR-CAS系统、细菌转化和/或基于质粒的插入。
在一个实施方案中，本发明的方法是生产微生物脂质并用其制备食品的方法，其中所述方法包括制备包含在步骤f)中收获的微生物脂质的食品的步骤(例如，步骤g))，该食品优选为烘焙产品，例如面包、面包卷、饼干、松饼、曲奇或蛋糕；糖食产品，例如面粉糖食或糖制糖食；乳制品，例如冰淇淋或婴儿奶；涂抹料，例如人造黄油、蛋黄酱或软奶酪；方便食品，例如方便面、披萨、披萨面团或调味汁；饮料；素食或纯素食，例如肉类似物和奶类似物；糖果，例如无可可巧克力；和/或巧克力产品；其中任选地，所述方法还包括通过使用所述食品的食物残余物作为所述第一底物和/或如果存在步骤c)作为所述第二底物，回收所述食品的食物残余物的步骤(例如步骤h))。在一个实施方案中，该方法是用于再循环食物残余物的方法，即将食物残余物转化成食品级产品，例如微生物油、蛋白质生物质和/或芳香化合物，其被进一步加工成食品。随后可以使用本发明的方法将此类食品的残余物(例如，食物残余物)转化成食品级产品。有利地，本发明的方法提高了食物链的效率和食物资源的使用。本发明的方法和用途的优点是通过将食物残余物转化成可食用的原料(诸如微生物油以及任选的蛋白质生物质和/或芳香化合物)来减少此类食物残余物和/或食物损失。在一个实施方案中，当在产品(诸如微生物脂质)的上下文中提及“用其”或“由其”制备食品时，意指制备包含所述产品的食品。
本发明的方法的优点是所产生的微生物食物成分，特别是微生物脂质和蛋白质生物质和/或芳香化合物，允许产生包含所述微生物食物成分的食品，因为微生物食物成分是食品级成分。例如，通过面包残余物水解产物发酵产生的微生物脂质可以在烘焙应用中代替棕榈油，该烘焙应用包括诸如面包、果仁糖生产、冰淇淋、方便面、人造黄油、巧克力、披萨面团和饼干生产。根据第872/2012号委员会实施条例(欧盟)，芳香化合物可用于给食物加味，优选地乳制品和糖食产品。用本发明的方法生产的蛋白质生物质，优选地作为生产微生物脂质的方法的副产物，可以用作任何切碎的或形成的肉类应用(如汉堡肉饼、辣椒、肉块、肉酱和香肠)的肉类替代物。在一个实施方案中，在本发明的方法的整个过程中确保所涉及组分的食品级性质。因此，本发明的方法允许实现食物资源的可持续利用并且减少食物废弃物和食物损失。特别地，本发明的方法出乎意料地允许使用食物残余物，优选食品级食物残余物来生产有价值的原料，诸如微生物脂质、蛋白质生物质和/或芳香化合物，其随后可以用于生产食物；来自这样生产的食物的残余物继而可以被回收并在本发明的方法中用作底物以生产另外的食品。最后，有利地，本发明的方法可以用作循环。
本发明的方法的另一个优点是该方法不需要在两步法中培养产油微生物，其中第一步是在生物质形成的非限制性条件下，第二步是在脂质生产诱导的新趋势限制条件下。相反，本发明的方法允许其中脂质直接积累的培养。特别地，通过在步骤d)中向所述第二微生物提供包含所述经酶处理的第一底物和/或所述经酶处理的第二底物的培养基，实现了细胞内脂质的高积累。特别地，通过向所述第二微生物提供所述培养基，实现了高蛋白质生物质和脂质收率。例如，实现了干细胞重量的84.9％的脂质收率。此外，实现了至多达干真菌生物质的60％的蛋白质生物质收率。有利地，不需要营养物质限制步骤来用所述产油微生物制备微生物油。本发明的方法的更进一步的优点是仅需要温和的下游加工，例如可以进行纯酶处理以使微生物脂质适于随后收获，并且因此不涉及危险的化学品；因此，收获的微生物脂质不包含有害残余物并且是可食用的。
在一个实施方案中，如本文所用，术语“微生物脂质在食品生产中的用途”涉及生产包含微生物脂质的食品，所述微生物脂质优选为用根据本发明的方法获得的微生物脂质。在一个实施方案中，微生物脂质在食品生产中的用途包括用所述微生物脂质代替食品配方中的脂肪。例如，微生物脂质可以代替食物(例如，烘焙产品)中的脂肪(诸如棕榈油)。在一个实施方案中，微生物脂质在食品生产中的用途还包括在所述食品的生产中使用蛋白质生物质和/或芳香化合物，优选地使用通过本发明的方法获得的蛋白质生物质和/或芳香化合物。例如，可以提供包含所述微生物脂质和所述蛋白质生物质和/或芳香化合物的食物。在一个实施方案中，术语“食品”、“食物产品”和“食物”可互换使用。在一个实施方案中，本发明的用途包括如本文所定义的生产微生物脂质并由其制备食品的方法。在一个实施方案中，本发明的用途包括在食品的生产中使用利用如本文所定义的用于生产微生物脂质的方法所产生的微生物脂质。
在一个实施方案中，如本文所用，术语“包含至少五种，优选至少六种，更优选至少七种酶的组合物”涉及酶混合物。在一个实施方案中，所述组合物可通过实施本发明的方法的步骤b)获得。在一个实施方案中，本发明的方法的步骤b)使得所述第一微生物产生所述组合物。在一个实施方案中，组合物被定制为适合所述第一底物。在一个实施方案中，该组合物包含选自以下项的酶：纤维素酶；地衣多糖酶；木聚糖酶；阿拉伯聚糖酶；淀粉酶，例如α-淀粉酶；极限糊精酶；支链淀粉酶；蛋白酶；半乳聚糖酶；甘露聚糖酶；鼠李聚糖半乳糖醛酸水解酶；鼠李聚糖半乳糖醛酸裂解酶；木葡聚糖酶；半纤维素酶；淀粉葡糖苷酶；β-葡糖苷酶；果胶酶；和昆布多糖酶。在一个优选的实施方案中，组合物包含选自以下项的酶：纤维素酶；地衣多糖酶；木聚糖酶；阿拉伯聚糖酶；淀粉酶，例如α-淀粉酶；极限糊精酶；支链淀粉酶；蛋白酶；半乳聚糖酶；甘露聚糖酶；鼠李聚糖半乳糖醛酸水解酶；和鼠李聚糖半乳糖醛酸裂解酶。在一个实施方案中，组合物包含选自以下项的酶：纤维素酶；地衣多糖酶；木聚糖酶；阿拉伯聚糖酶；淀粉酶，例如α-淀粉酶；极限糊精酶；支链淀粉酶；蛋白酶；半乳聚糖酶；和甘露聚糖酶；或者选自纤维素酶；木聚糖酶；阿拉伯聚糖酶；淀粉酶，例如α-淀粉酶；极限糊精酶；支链淀粉酶；半乳聚糖酶；甘露聚糖酶；鼠李聚糖半乳糖醛酸水解酶；和鼠李聚糖半乳糖醛酸裂解酶。在一个优选的实施方案中，组合物，例如在本发明的方法的步骤b)中使用面包残余物作为第一底物产生的组合物，包含选自以下项的酶：纤维素酶；淀粉酶；半纤维素酶；极限糊精酶，例如麦芽极限糊精酶；和果胶酶。在一个实施方案中，本发明的组合物包含以下项或者由以下项组成：纤维素酶；淀粉酶；半纤维素酶；极限糊精酶，例如麦芽极限糊精酶；和果胶酶。在一个实施方案中，所述组合物是食品级组合物。
在一个实施方案中，所述组合物在如本文所定义的用于生产微生物脂质的方法的步骤b)中产生，其中优选地，所述组合物包含在如本文所定义的用于生产微生物脂质的方法的步骤b)中产生的所述至少一种酶或者由所述至少一种酶组成。在一个实施方案中，所述组合物可在如本文所定义的用于生产微生物脂质的方法的步骤b)中产生，其中优选地，所述组合物包含可在如本文所定义的用于生产微生物脂质的方法的步骤b)中产生的所述至少一种酶或者由所述至少一种酶组成。在一个实施方案中，在如本文定义的用于生产微生物脂质的方法的步骤b)中产生的所述至少一种酶包含本发明的组合物或者由本发明的组合物组成。在一个实施方案中，如果用于生产微生物脂质的方法的步骤b)中的所述第一底物是食品级食物残余物，则所述组合物是食品级组合物。
在一个实施方案中，所述组合物在如本文所定义的用于生产微生物脂质的方法的步骤c)中获得，其中优选地，所述组合物包含在如本文所定义的用于生产微生物脂质的方法的步骤c)中获得的所述至少一种酶或者由所述至少一种酶组成。在一个实施方案中，所述组合物可在如本文所定义的用于生产微生物脂质的方法的步骤c)中获得，其中优选地，所述组合物包含可在如本文所定义的用于生产微生物脂质的方法的步骤c)中获得的所述至少一种酶或者由所述至少一种酶组成。在一个实施方案中，在如本文定义的用于生产微生物脂质的方法的步骤c)中获得的所述至少一种酶包含本发明的组合物或者由本发明的组合物组成。在一个实施方案中，在如本文定义的用于生产微生物脂质的方法的步骤c)中获得的所述至少一种酶是本发明的组合物。在一个实施方案中，本发明的组合物是如本文所定义的用于生产微生物脂质的方法的副产物。
在一个实施方案中，步骤d)的所述培养第二微生物在18℃至37℃，优选18℃至33℃范围内的温度下进行。在一个实施方案中，步骤d)的所述培养第二微生物在pH 3至pH 9范围内的pH下进行。在一个实施方案中，步骤d)的所述培养第二微生物进行1天至12天，优选3天至10天。在一个实施方案中，步骤d)的所述培养第二微生物用pO2＞20％进行。在一个实施方案中，步骤d)的所述培养第二微生物在搅拌下进行，优选在以50rpm至800rpm范围内的旋转速度搅拌下进行。在一个实施方案中，步骤d)的所述培养第二微生物在10℃至37℃，优选18℃至33℃范围内的温度下，在pH 3至pH 9范围内的pH下，在搅拌下，优选地在以50rpm至800rpm范围内的旋转速度搅拌下，用pO2＞20％进行1天至12天，优选2天至10天。在一个实施方案中，步骤d)的所述培养第二微生物包括在18℃至37℃，优选18℃至33℃范围内的温度、在pH 3至pH 8范围内的pH下和/或在溶解氧(pO2)pO2＞30％下培养所述第二微生物2天至12天，优选3天至10天。
在一个实施方案中，所述方法特别适用于产生相对于总脂肪酸含量具有＞60％不饱和脂肪酸含量和/或具有在＜10℃，例如9℃至5℃范围内，诸如例如大约5℃的倾点的脂质。
如果为步骤d)选择以下参数，则尤其如此：
在下列条件下，在包含经酶处理的底物，例如经酶处理的第一底物和/或经酶处理的第二底物的培养基中生长所述产油微生物：温度10℃至20℃，溶解氧含量10％至30％和/或加入巴豆酸(例如，总有机酸的0％至10％)，并且由此允许所述产油微生物产生微生物脂质，其特征在于在＜10℃，例如9℃至5℃范围内，诸如例如大约5℃的“倾点”和/或相对于总脂肪酸含量＞60％的不饱和脂肪酸含量。如本文所用，“倾点”通常根据以下标准中的任一种来确定：DIN51597、DIN EN 23015:1994-05、DIN ISO 3015:1982-10、DIN ISO 3016:1982-10、ASTM D97、ASTM D5985，优选使用DIN ISO 3016。
在一个实施方案中，该方法适用于生产相对于总脂肪酸含量具有20％至65％饱和脂肪酸含量的脂质和/或相对于总甘油三酯含量具有40％至85％甘油三酯POP(C18:1-C16:0)、POS(C16:0-C18:1-C18:0)和SOS(C18:0-C18:1-C18:0)含量的脂质。在一个实施方案中，该方法适用于生产与可可脂类微生物油等同的脂质。如果为步骤d)选择以下参数，则尤其如此：
在下列条件下，在包含经酶处理的底物，例如经酶处理的第一底物和/或经酶处理的第二底物的培养基中生长所述产油微生物：温度20℃至33℃，溶解氧含量10％至30％，pH5至8，和/或加入丁酸和丙酸(例如，总有机酸的1％至60％)；任选地还包括脂肪酸合酶、Δ9去饱和酶和/或Δ12去饱和酶的遗传修饰；并且由此允许所述产油微生物产生微生物脂质，其特征在于相对于总甘油三酯含量40％至85％的高甘油三酯POP、POS和SOS含量。
在一个实施方案中，该方法适用于生产相对于总脂肪酸含量具有20％至55％饱和脂肪酸含量的脂质和/或相对于总甘油三酯含量具有1％至20％甘油三酯PPP、PPS、PSS和SSS含量的脂质。在一个实施方案中，该方法适用于生产与棕榈硬脂类微生物油和/或棕榈类微生物油等同的脂质。如果为步骤d)选择以下参数，则尤其如此：
在下列条件下，在包含经酶处理的底物，例如经酶处理的第一底物和/或经酶处理的第二底物的培养基中生长所述产油微生物：温度22℃至33℃，溶解氧含量＞10％至40％，pH 5至8，加入丁酸和丙酸(例如，总有机酸的1％至50％)；任选地还包括脂肪酸合酶、Δ9去饱和酶和/或Δ12去饱和酶中的任意的遗传修饰；并且由此允许所述产油微生物产生微生物脂质，其特征在于相对于总甘油三酯含量1％至20％的甘油三酯PPP、PPS、PSS和SSS含量。
在一个实施方案中，该方法适用于生产相对于总脂肪酸含量具有20％至55％饱和脂肪酸含量的脂质和/或相对于总甘油三酯含量具有1％至60％脂肪酸C10、C12和/或C14含量的脂质。在一个实施方案中，该方法适用于生产与棕榈仁油类微生物油等同的脂质。如果为步骤d)选择以下参数，则尤其如此：
在下列条件下，在包含经酶处理的底物，例如经酶处理的第一底物和/或经酶处理的第二底物的培养基中生长所述产油微生物：温度25℃至30℃，溶解氧含量＞30％，pH 6至8；任选地还包括脂肪酸合酶、硫酯酶、Δ9去饱和酶和/或Δ12去饱和酶中的任意的遗传修饰；并且由此允许所述产油微生物产生微生物脂质，其特征在于相对于总甘油三酯含量1％至20％的甘油三酯PPP、PPS、PSS和SSS含量。
在一个实施方案中，该方法适用于生产相对于总脂肪酸含量具有10％至45％多不饱和脂肪酸含量和/或相对于总脂肪酸含量具有10％至45％α-亚麻酸(ALA)、二十碳五烯酸(EPA)和/或二十二碳五烯酸(DPA)的脂肪酸含量的脂质。如果为步骤d)选择以下参数，则尤其如此：
在下列条件下，在包含经酶处理的底物，例如经酶处理的第一底物和/或经酶处理的第二底物的培养基中生长所述产油微生物：温度15℃至28℃，溶解氧含量＞40％，pH 6至8；任选地还包括脂肪酸合酶、硫酯酶、Δ4去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ6去饱和酶、Δ8去饱和酶、Δ9去饱和酶、Δ12去饱和酶和/或Δ15去饱和酶和/或Δ5延长酶、Δ6延长酶和/或Δ9延长酶中的任意的遗传修饰；并且由此允许所述产油微生物产生微生物脂质，其特征在于相对于总脂肪酸含量10％至45％的α-亚麻酸(ALA)、二十碳五烯酸(EPA)和/或二十二碳五烯酸(DPA)的脂肪酸含量。
在一个实施方案中，该方法特别适用于生产相对于总脂肪酸含量具有＞50％不饱和脂肪酸含量的脂质和/或相对于总甘油三酯含量具有50％ POO、OOS和OOO甘油三酯含量的脂质。在一个实施方案中，该方法适用于生产与棕榈油油精类微生物油、向日葵油类微生物油、菜籽油类微生物油等同的脂质。如果为步骤d)选择以下参数，则尤其如此：
在下列条件下，在包含经酶处理的底物，例如经酶处理的第一底物和/或经酶处理的第二底物的培养基中生长所述产油微生物：温度10℃至30℃，溶解氧含量10％至30％和/或加入巴豆酸(例如，总有机酸的0％至10％)，并且由此允许所述产油微生物产生微生物脂质，其特征在于在＜10℃，例如9℃至5℃范围内，诸如例如大约5℃的“倾点”和/或相对于总脂肪酸含量＞60％的不饱和脂肪酸含量。
如本文所用，术语“本发明的”、“根据本发明的”等旨在指本文描述和/或要求保护的本发明的所有方面和实施方案。
如本文所用，术语“包含”应被解释为涵盖“包括”和“由……组成”两者，这两种含义都是具体预期的，因此是根据本发明的单独公开的实施方案。本文所用的术语“和/或”应被认为是两个指定特征或组分中的每一者与或不与另一者的具体公开。例如，“A和/或B”应被认为是(i)A、(ii)B和(iii)A和B中的每一者的具体公开，就像每一者在本文中单独地陈述一样。在本发明的上下文中，术语“约”和“大约”表示本领域技术人员将理解的仍然确保所讨论的特征的技术效果的准确度区间。该术语通常表示与所示数值的偏差为±20％、±15％、±10％和例如±5％。如普通技术人员将理解的，对于给定技术效果的数值的具体的此类偏差将取决于技术效果的性质。例如，天然或生物技术效果通常可以具有比人造或工程技术效果更大的此类偏差。当提及单数名词时，在使用不定冠词或定冠词，例如“一个”、“一种”或“该”的情况下，除非另有明确说明，否则这包括该名词的复数。
附图说明
现在参考以下附图进一步描述本发明。
在以下附图描述中提及的所有方法均如实施例中详细描述的进行。
图1示出了本发明的方法的示意性流程图，该方法是生产可食用的微生物脂质的可持续方法。
图2示出了本发明的方法的流程图。第一底物，特别是食物残余物用作第一微生物的底物。第一微生物产生酶混合物以消化所述第一底物(所述酶混合物产生经酶处理的第一底物)，并且任选地进一步产生蛋白质生物质和/或芳香化合物。任选地，第一微生物可以与产生酶、蛋白质和/或芳香化合物的微藻共培养。经酶处理的第一底物可用作用于培养产生微生物油的第二微生物的生长培养基或者在该生长培养基中使用。另选地或除此之外，酶混合物用于酶处理第二底物，其优选地与第一底物类型相同，从而获得经酶处理的第二底物，该经酶处理的第二底物可以用作用于培养产生微生物油的第二微生物的生长培养基或者在该生长培养基中使用。经酶处理的第一底物和经酶处理的第二底物也可以组合以提供用于所述第二微生物的生长培养基。
图3示出了本发明的方法的实施方案的流程图。
图4示出了本发明的方法的实施方案的流程图。
图5示出了本发明的方法的实施方案的流程图。
下面，参考实施例，给出这些实施例是为了说明，而不是限制本发明。
实施例
实施例1：原料选择及成分分析-面包残余物
可用作第一底物和/或在本发明的用于生产微生物脂质的方法中使用的底物的示例性食物残余物是烘焙产品食物残余物，诸如面包残余物。如今，残余面包通常在工业上用于通过研磨得到面包粉，以用于面包生产或作为动物饲料。或者，以下实施例描述了用于选择由面包店供应的面包残余物作为微生物发酵的原料和该原料的成分分析的示例性方法。收集新鲜面包残余物并处理，以避免生物降解并保持食品级，其包括以下步骤：频繁的残余物拾取(例如，在残余物确定为不能销售的当天)，在烘箱中干燥细面包片(例如，起始温度160℃，不进一步加热过夜)，随后用陈面包粉碎机研磨成4mm的颗粒。这些面包屑在室温下储存长达2周或者在-20℃下冷冻长达3个月。面包残余物非常适合作为将在本发明的用于生产微生物脂质的方法中使用的底物，因为面包残余物富含营养物质，诸如蛋白质、碳水化合物、脂肪、矿物质和维生素(参见表1和表2)。
表1示出了小麦混合面包的示例性平均营养价值[1]；配料：小麦粉54％、水、天然酵母12％(黑麦粉、水)、黑麦粉、盐、菜籽油、酵母、酸度调节剂乙酸钠。
表2详细示出了小麦和黑麦面包的成分分析数据[2,3]。
实施例2：通过用面包残余物作为诱导系统培养真菌生产酶溶液-曲霉属
在该实验中，本发明人研究了通过用黑曲霉van Tiegheim ATCC 10535和面包残余物作为单一培养基组分的深层发酵生产示例性酶混合物，例如酶溶液。因此，在5L带挡板锥形烧瓶中，将如前面实施例1所述获得的大约100g面包屑与ddH2O混合，总体积为2L(5％w/v)，一式两份。随后通过在121℃下高压灭菌20分钟进行灭菌，然后加入接种物(黑曲霉van Tiegheim ATCC 10535的孢子悬浮液)。培养物在28℃下以100rpm在旋转振荡器中孵育。每日目测检查观察到培养基因真菌细胞而变黑，且观察到面包屑的液化，表明生长良好且底物酶水解。发酵持续3周以使真菌应激并诱导最大水解酶分泌。用滤纸过滤液体培养物，以随后除去营养细胞。通过用75,600×g的最大离心(Beckman Coulter Avanti JXN-26)，然后用0.2μm孔径的瓶顶或交叉流过滤除去孢子。之后应用10kDa交叉流过滤和缓冲液交换(使用由再生纤维素制成的膜，具有以下参数：入口压力(P1)4巴，滞留压力(P2)1巴，并且渗透物对大气压开放)，以浓缩、富集和纯化酶混合物。最终的酶溶液为约350ml。对于酶混合物，首先使用包埋在琼脂基质中的有色碳水化合物聚合物进行定性酶活性预筛选。脱色的程度和所得的围绕所施用的酶溶液的脱色晕圈的直径是与该预筛选测试中底物的转化相关的当前酶量和相对活性的量度。表3给出了具有相关酶活性的底物的概述。
表3：不同底物和相应酶活性的概述。
酶活性由无活性(“-”)、活性(“+”)、良好活性(“++”)、高活性(“+++”)、非常高活性(“++++”)直至底物大部分转化(“高”)来评价。酶筛选的结果如表4所示。
表4：酶活性筛选的结果。由Aspergillus niger(黑曲霉)产生的酶混合物包含如下所示的各种酶。
酶筛选显示了预期酶的高活性，其中面包残余物作为诱导系统。在该预筛选之后，随后可以进行具有高活性的酶的靶向定量筛选。
作为测定α-淀粉酶的酶活性的方法，可以举出下述方法。使α-淀粉酶作用于可溶性淀粉的内切-1,4-α-葡聚糖键，以产生糊精和还原糖(特别是麦芽糖)的混合物。在酒石酸钾钠四水合物的存在下，在95℃下，使溶解的3,5-二硝基水杨酸(DNS)(通过加入2M NaOH)作用于产生的还原糖，以产生3,5-氨基硝基水杨酸。在540nm处测定吸光度，利用校准曲线获得3-氨基-5-硝基水杨酸的量，并计算酶活性。在25℃和pH 6.9下1分钟内从可溶性淀粉中释放出1μmol还原糖的酶量被定义为1U(1单位)。
作为测定淀粉葡糖苷酶的酶活性的方法，可以举出下述方法。使淀粉葡糖苷酶作用于麦芽糖的1,4-α-葡聚糖键，以产生D-葡萄糖。在氧的存在下使葡萄糖氧化酶作用于作为底物的所产生的葡萄糖，以产生过氧化氢。在氨基安替比林和苯酚的存在下，使过氧化物酶作用于所产生的过氧化氢，以产生醌亚胺染料。在500nm处测定吸光度，利用校准曲线获得醌亚胺染料的量，并计算酶活性。在25℃和pH 4.3下1分钟内氧化1μmol麦芽糖的酶的量被定义为1U(1单位)。
作为测定半纤维素酶的酶活性的方法，可以举出下述方法。使半纤维素酶作用于木糖以产生还原糖。在酒石酸钾钠四水合物的存在下，在95℃下，使溶解的3,5-二硝基水杨酸(DNS)(通过加入2M NaOH)作用于产生的还原糖，以产生3,5-氨基硝基水杨酸。在540nm处测定吸光度，利用校准曲线获得3-氨基-5-硝基水杨酸的量，并计算酶活性。在40℃和pH4.5下1分钟内从木糖中释放出1μmol还原糖的酶量被定义为1U(1单位)。
作为测定蛋白酶的酶活性的方法，可以举出下述方法。使蛋白酶作用于酪蛋白以产生氨基酸。通过加入三氯乙酸终止反应。随后通过使用0.45μm聚醚砜注射器过滤器过滤测试溶液，并且在过滤后使Folin&Ciolcaltea's或Folin's Phenol试剂作用于氨基酸以产生可测量的颜色变化，该颜色变化将与蛋白酶的活性直接相关。在660nm处测定吸光度，利用酪氨酸校准曲线获得氨基酸的量，并计算酶活性。在37℃和pH 8.0下1分钟内从酪蛋白中产生相当于10μg酪氨酸的氨基酸的酶的量被定义为1U(1单位)。
作为测定蛋白酶的酶活性的方法，可以举出下述方法。使蛋白酶作用于酪蛋白以产生氨基酸。通过加入三氯乙酸终止反应。随后通过使用0.45μm聚醚砜注射器过滤器过滤测试溶液，并且在过滤后使Folin&Ciolcaltea's或Folin's Phenol试剂作用于氨基酸以产生可测量的颜色变化，该颜色变化将与蛋白酶的活性直接相关。在660nm处测定吸光度，利用酪氨酸校准曲线获得氨基酸的量，并计算酶活性。在37℃和pH 8.0下1分钟内从酪蛋白中产生相当于10μg酪氨酸的氨基酸的酶的量被定义为1U(1单位)。如表4所示，示例性酶混合物，即本发明的示例性组合物，包含纤维素、地衣多糖酶、木聚糖酶、阿拉伯聚糖酶、淀粉酶例如α-淀粉酶、极限糊精酶、支链淀粉酶、蛋白酶、半乳聚糖酶和甘露聚糖酶。
实施例3：通过用面包残余物作为诱导系统培养真菌生产酶溶液-长喙壳属
在该实验中，本发明人研究了通过用奇异长喙壳CBS 374.83和面包残余物作为单一培养基组分的深层发酵生产酶溶液。因此，如实施例2所述进行培养和下游处理。最终的酶溶液为约30ml。按照实施例2所述进行酶预筛选的结果示于表5。
表5：酶活性筛选的结果。由奇异长喙壳(Ceratocystis paradoxa)产生的酶混合物包含如下所示的各种酶。
酶筛选显示了预期酶的高活性，其中面包残余物作为诱导系统。用于具有高活性的酶的靶向定量筛选的方法的示例在实施例2中给出。如表5所示，示例性酶混合物，即本发明的示例性组合物，包含纤维素酶、木聚糖酶、阿拉伯聚糖酶、淀粉酶例如α-淀粉酶、极限糊精酶、支链淀粉酶、半乳聚糖酶、甘露聚糖酶、鼠李聚糖半乳糖醛酸水解酶和鼠李聚糖半乳糖醛酸裂解酶。
实施例4：食物残余物的水解-面包
如实施例1所述的面包残余物中所含的糖类、蛋白质和其他营养物质适用于发酵。微生物将其转化为有益的产品，诸如微生物油，这是食品工业的有用产品。在发酵前对面包残余物等底物进行预处理，使微生物易于获取营养物质。一种典型的预处理方法是酶水解。面包残余物含有高浓度的淀粉(基于干物质大于70％)和蛋白质(基于干物质多达14％)，并且用α-淀粉酶、葡糖淀粉酶和蛋白酶处理容易导致释放可用于微生物生长的化合物。面包干重的主要成分所含淀粉的水解包括两个阶段。在第一阶段，α-淀粉酶用于液化淀粉，得到包含消去蛋白产物和少量葡萄糖的溶液。液化淀粉用葡糖淀粉酶进行糖化阶段，以获得最大的末端葡萄糖转化。已发现两个阶段是相互关联的，并且在后续步骤中存在充分糖化所需的最佳液化程度。以下方法是使用一种或多种酶对所述底物进行的示例性酶预处理，例如淀粉(例如，面包残余物中所含的淀粉)的水解。制备水悬浮液中的均质面包残余物用于实验。面包颗粒的尺寸小于4mm。为了液化，加入α-淀粉酶(例如SUG-001，CreativeEnzymes，Shirley，纽约；美国)。液化在具有特定pH(例如，pH 6)和特定温度(例如，80℃)的恒温器或水浴中进行。悬浮液的pH通过例如1％(w/v)H2SO4溶液和1％(w/v)NaOH溶液调节。通过冷冻悬浮液结束液化。液化时间为约180分钟。糖化在液化悬浮液中通过加入葡糖淀粉酶(例如SUG-002；DIS-1013，Creative Enzymes，Shirley，纽约；美国)进行。糖化在具有特定pH(例如，pH 4.2)和特定温度(例如，60℃)的经调节摇床中进行并摇晃(例如，130rpm)。通过在80℃下加热悬浮液5分钟终止酶活性。糖化时间为至少90分钟。半纤维素酶(例如DIS-1023Creative Enzymes，Shirley，纽约；美国)和蛋白酶(例如，Neutase，Novozymes，丹麦)在糖化步骤中加入以产生最高含量的转化糖和氨基酸。代替使用可商购的酶，如实施例2和3中所述产生的酶混合物或前述物质的任意组合是合适的。例如，水解可以在一个步骤中进行，其中延长孵育时间(例如，24小时)，其中采用特定pH(例如，pH 5.5)、特定温度(例如，55℃)并摇晃(例如，130rpm)。该方法也可以适用于生物反应器。
孵育后，离心混合物(例如，14,000rpm，20分钟)以分离未水解的固体残余物，收集包含营养物质的上清液。此时，上清液可以表征为面包残余物水解产物。从该方案获得的水解产物可以被冷冻干燥以评估营养物质被重新水化的适宜性。对于发酵，水解产物可以是新鲜制备的或重新水化的，可以直接应用或通过任选地单独或以混合物形式加入补充剂来应用。
实施例5：微生物食物成分的生产-微生物脂质
产油微生物(例如产油酵母)代表了令人感兴趣的微生物脂质工厂。它们的快速生长，以及利用多种原料的能力和它们易于在大型发酵罐中培养的特点，使得它们成为生物精炼工艺的高度合适的候选物。产油微生物(例如产油酵母)能够生长和积累高水平的脂质。已经研究了菌株ATCC 20509产油皮状新毛孢子菌(Cutaneotrichosporonoleaginosus，C.oleaginosus)积累至多达70％ DCW TAG的能力，并且有利地具有与可可脂或棕榈油的脂肪酸组成非常相似的脂肪酸组成。产油皮状新毛孢子菌(C.oleaginosus)具有使用高度多样的碳源(例如，来自食物残余物的碳源)的能力。发明人已经令人惊讶地发现，食物残余物(例如面包残余物)可以用作获得用于产油微生物的生长培养基的营养物质的底物。例如，发明人已经使用丝状真菌和细菌成功地将食物残余物转化成营养物质，并且这些营养物质可以用作产油微生物的生长培养基。特别地，经酶处理的食物残余物可用作营养物质(例如碳源)，用于用产油微生物(例如，产油皮状新毛孢子菌(C.oleaginosus))生产微生物脂质。如实施例4中所述获得的水解产物被认为是用于以产油皮状新毛孢子菌(C.oleaginosus)发酵生产微生物脂质的潜在替代碳源。
用产油生物的常规脂质生产是2步法，其中第一步在非限制性条件下提供生物质形成(指数生长期)，第二脂质诱导步骤(营养物质限制期)在停滞的细胞计数下提供高的细胞内脂质积累。也可以用有机酸和碳源进行产油皮状新毛孢子菌(C.oleaginosus)共发酵，从而实现同时高的生物质和脂质收率(84.9％的DCW)，而不需要营养物质限制，该营养物质限制能够同时同化例如面包残余物水解产物和乙酸。温和的下游加工也有利于生产可食用的微生物脂质。因此，进行例如产油皮状新毛孢子菌(C.oleaginosus)的纯酶处理而没有任何基于溶剂的萃取或基于化学品的破乳是合适的，以使所产生的微生物脂质适用于随后收获。通过基于密度的分离方法，例如用半连续离心机，进行所产生的微生物脂质的收获。精炼微生物脂质是进行加工以获得食用油(例如物理精炼)的最后步骤。图1示出了可以作为生产可食用的微生物脂质的可持续方法的示例的方法。
作为甲基化后使用带火焰离子化检测器的气相色谱法(GC-FID)分析最终产物的脂肪酸谱的方法，可以举例如下方法。甲基化通过将大约1mg油与1ml NaOCH3孵育(在80℃下孵育20分钟)来简略地完成。然后加入1ml HCl(37％在甲醇中)，混合物在80℃下再孵育20分钟。所得的脂肪酸甲酯(FAME)用己烷在注射的GC-FID中萃取。使用三聚甘油C19:0作为内标。表6中示出了产油皮状新毛孢子菌(C.oleaginosus)的示例性微生物脂质组成。
表6：使用产油皮状新毛孢子菌(C.oleaginosus)生产的示例性微生物脂质组成。
脂肪酸 相对％
C14:0(肉豆蔻酸) 2.0
C16:0(棕榈酸) 24.0
C16:1(棕榈油酸) 1.0
C18:0(硬脂酸) 10.0
C18:1(油酸) 40.0
C18:2(亚油酸) 20.0
C18:3(亚麻酸) 3.0
实施例6：微生物食物成分的生产-微生物蛋白质
发明人已经证明，食物残余物(例如，冻干面包)可以用作底物以产生微生物蛋白质生物质。当培养第一微生物时，产生作为副产物的蛋白质生物质。
实施例7：微生物食物成分的生产-芳香化合物
发明人已经惊奇地发现，当在食物残余物中培养时，微生物(诸如长喙壳属(Ceratocystis))产生芳香化合物。例如，长喙壳属(Ceratocystis)，如甘薯长喙壳(Ceratocystis fimbriata)和念珠长喙壳(Ceratocystis moniliformis)，产生广泛的复合香味，诸如：桃、香蕉、梨、玫瑰或柑橘，这取决于菌株和环境条件。使用这些真菌的优点在于它们相对快速的生长和合成的多种复杂的芳香混合物。发明人发现，在如实施例2所述的发酵实验过程中，奇异长喙壳CBS 374.83产生芳香化合物，其通过上清液的强烈果味检测到。上清液包含至少一种芳香化合物。因此，本发明的方法令人惊讶地不仅提供微生物脂质，而且提供芳香化合物。为了获得芳香化合物，使用温和的分离技术来提供具有尽可能接近完整产物的感官特征的提取物。例如，使用作为基于膜的技术的亲油性渗透汽化(O-PV)来温和地回收天然芳香化合物，以及使用固相微萃取(SPME)，固相微萃取是一种非穷举的萃取技术，其中将涂覆有吸附剂材料的纤维暴露于样品。发明人已经发现，通过使用温和的分离技术在加工过程中保持香料的配料功能是有利的。
发明人进一步进行了香气分馏以从芳香化合物的混合物中回收特定的香气或一组芳香化合物。此外，发明人通过将样品的保留指数与对应的可靠参比化合物的保留指数进行比较，或者通过气相色谱-嗅觉测量法(GC-O)，仅通过毛细管气相层析(GC)分析了萃取的芳香化合物。GC-O使得能够利用人的鼻子作为检测器来实现挥发性有机化合物与其感知之间的相关性。因此，GC毛细管柱的出口安装到柱分流器中。柱分流器具有两个出口，其将气流引导到破坏性检测器，例如火焰离子化检测器(FID)或质谱仪(MS)中，和引导到非破坏性嗅觉检测部件(ODP)中。利用这种设备，可以直接将气味印象分配给MS谱或FID峰。
实施例8：微生物组分在食品工业中的用途-烘焙产品中的微生物脂质
在食品工业中对微生物组分的广泛应用是可能的。发明人示例性地将用本发明的方法获得的微生物脂质用于不同的烘焙产品：
a)凯撒卷
成分：
-100％的550型或650型面粉
-2％至3％的酪乳
-3％至4％的面包酵母
-10％至15％的微生物脂质
-2％至3％的发酵剂
-1.8％至2.2％的盐
-55％至63％的水
捏合：
-酵头面团
使用和面机将20％的面粉、2％的酪乳、10％的水和1％的面包酵母在最低水平下混合3分钟至4分钟，然后快速混合2分钟至3分钟，以得到光滑的面团。随后用保鲜膜覆盖酵头面团并将其在冰箱(4℃)中静置6小时至24小时。
-主面团
用螺旋捏合机将80％的面粉、3％的发酵剂、2％的盐、15％的微生物脂质、3％的面包酵母和酵头面团充分地缓慢捏合5分钟至7分钟，随后快速捏合5分钟至8分钟，直到面团成型。
面团温度为23℃至26℃。
在将面团从螺旋捏合机中取出后，面团放置最多10分钟。
加工：
-使1800克至2100克的部分成圆并随后用保鲜膜覆盖。
-静置15分钟至20分钟，使面团短暂地发酵起发。
-模制该部分，随后成圆。
-放在食品载体上，使其在醒发室中发酵(温度30℃至35℃，
相对湿度75％至85％)50分钟至75分钟。
烘烤：
烘箱温度：230℃至240℃
蒸汽输入：标准
阻尼器：封闭
烘烤时间：大约20分钟
凯撒卷成功地用本发明的方法生产的微生物脂质生产。使用微生物脂质生产的面包卷具有与常规凯撒卷相同的气味、味道和质地。
b)椒盐卷饼
成分：
-100％的550型小麦粉
-2％至3％的烘焙麦芽
-1.8％至2.2％的盐
-10％至15％的微生物脂质
-1.5％至2％的面包酵母
-45％至48％的水
捏合：
-酵头面团
使用和面机将20％的面粉、0.2％的面包酵母和12％的水(10℃)在最低水平下混合3分钟至4分钟，随后在最高水平下快速混合3分钟。随后用保鲜膜覆盖酵头面团并将其在室温下放置1小时。然后静置12小时至14小时使其发酵。
-主面团
用螺旋捏合机在最低水平下缓慢捏合80％的面粉、2％的面包麦芽、2％的盐、1.5％的面包酵母、10％的微生物脂质、10％的水(10℃)和酵头面团4分钟，然后在最高水平下快速捏合5分钟。
面团温度为大约24℃。
在将面团从螺旋捏合机中取出后，将覆盖的面团放置大约20分钟。
加工：
-使1800克至2100克的部分成圆并随后用保鲜膜覆盖。
-让其静置15分钟至20分钟。
-对各个部分进行捏塑造型。
-将卷团在撒了面粉的工作面上分份擀成大约60厘米长的长条，
使长条的最大直径在中心，长条
向外侧变窄，尖端变圆。
-将每个直条面团搓揉成椒盐卷饼形。
-将面团块放在覆盖有烘烤布的烤盘上。
-随后用保鲜膜覆盖各个部分，在室温下放置1小时至2小时，
使得面团体积增至两倍。
-提供椒盐卷饼碱液，戴上护目镜和防护手套上。
-将椒盐卷饼在碱液中浸泡大约5秒钟，取出，放在
覆盖有烤纸的烤盘上。
-在球根部分处切割椒盐卷饼，并在其中撒一些盐。
烘烤：
烘箱温度：将顶部和底部预热至230℃
烘烤时间：12分钟至14分钟，直至金棕色
随后使椒盐卷饼在金属丝架上冷却。
椒盐卷饼成功地用本发明的方法生产的微生物脂质生产。用微生物脂质生产的椒盐卷饼具有与常规生产的椒盐卷饼相同的气味、味道和质地。
c)Bismarck披萨
成分：
-100％的550型或405型面粉
-20％至30％的牛奶
-5％至8％的面包酵母
-20％的鸡蛋
-8％的蛋黄
-10％至15％的微生物脂质
-10％的糖
-1.8％至2.2％的盐
-60g的水
-香料：香草和柠檬皮
捏合：
-酵头面团
使用和面机将30％的面粉、20％的牛奶、5％的面包酵母和60g的水(10℃)在最低水平下混合3分钟至4分钟，以得到光滑的面团。随后用保鲜膜覆盖酵头面团并将其在室温下放置30分钟。
-主面团
用螺旋捏合机将70％的面粉、20％的鸡蛋、8％的蛋黄、10％的微生物脂质、10％的糖、7％的牛奶、2％的盐、香料和酵头面团充分地缓慢捏合5分钟至7分钟，随后快速捏合10分钟至12分钟，直到面团成型。
在将面团从螺旋捏合机中取出后，面团放置20分钟至30分钟。
加工：
-使1200克至1500克的部分成圆并随后用保鲜膜覆盖。
-静置15分钟至20分钟，使面团短暂地发酵起发。
-模制该部分，随后成圆。
-放在食品载体上，使其在醒发室中发酵(温度30℃至35℃，
相对湿度60％至70％)50分钟至75分钟。
加劲：
中断面团片的醒发，使得表面完全干燥和坚固。
煮制：
-将微生物脂质填充在炸锅中并将其加热至150℃至175℃。
-检查温度。
-将面团块以圆形部分向上的方式烘烤。
-然后将它们转动，并用格栅将它们向下压，直到烘烤时间结束。
-烘烤时间：6分钟至8分钟，最佳间隔为3分钟/2分钟/30秒和30秒。
灌装：
在Bismarck披萨的中间放入杏酱等馅料。
打顶：
在仍然热的Bismarck披萨上撒上例如糖或糖霜。
用本发明的方法生产的微生物脂质成功地生产了Bismarck披萨(德国炸面包圈，没有中心孔)。用微生物脂质生产的Bismarck披萨具有与常规生产的Bismarck披萨相同的气味、味道和质地。
d)水果面包
成分：
-30％的550型小麦粉
-20％至30％的牛奶
-1.5％的面包酵母
-8.5％的水
-13％的微生物脂质
-3％的糖
-2％的杏仁蛋白糖
-1.8％至2.2％的盐
-0.3％的酸奶油
-0.3％的香辛料
-1％的奶粉
-0.3％的朗姆酒香料
-0.3％的香草香料
-0.3％的苦杏仁
-0.3％的柠檬皮
-19％的小葡萄干
-0.4％的杏仁糖棍
-0.4％的蜜桔和柠檬皮
-4.5％的进口朗姆酒
捏合：
-酵头面团
将10％的小麦粉、1.5％的面包酵母、7％的水和0.3％的盐用和面机在最低水平下混合2分钟，然后快速捏合3分钟至4分钟以得到凉的(面团温度为24℃)和半固体酵头面团。随后用保鲜膜覆盖酵头面团并将其在室温下放置30分钟。从螺旋捏合机中取出面团后，将其在冰箱(5℃)中静置10小时至15小时。
-主面团
将除面粉外的主面团的所有其他成分混合，得到光滑的面团。随后加入酵头面团和面粉，并将其缓慢混合5分钟，随后快速揉捏3分钟。在短暂的面团松驰之后，填充水果面包混合物。
加工：
-将配重部分捏圆，
-随后面团松弛并拉长15分钟。
-盖上，在室温下醒发。
-模制该部分，随后成圆。
-放在食品载体上，使其在醒发室中发酵(温度30℃至35℃，
相对湿度60％至70％)50分钟至75分钟。
烘烤：
烘箱温度：开始210℃，降至200℃
蒸汽输入：无
阻尼器：5分钟烘烤时间后打开
烘烤时间：780g面团块大约50分钟
仍然热时用液体黄油包被，随后将其在香草糖中翻转。
冷却后，将水果面包撒上“糖霜”。
用本发明的方法生产的微生物脂质成功地生产了水果面包。用微生物脂质生产的水果面包具有与常规生产的水果面包相同的气味、味道和质地。
实施例9：微生物组分在食品工业中的用途-巧克力产品
使用本发明的方法生产的微生物脂质可以生产许多食物产品。例如，可以生产以 下产品：
巧克力酱
巧克力棒
黑巧克力棒
人造黄油
实施例10：通过模拟工艺参数改变甘油三酯含量。
通过模拟工艺参数改变甘油三酯含量。酵母油的TAG组合物(％)
P；棕榈酸，St；硬脂酸，O；油酸，Li；亚油酸，
参考文献
[1]Lieken.(2021年4月12日).Lieken Brot-und Backwaren GmbH.Retrievedfrom www.lieken-urkorn.de:https://www.lieken-urkorn.de/produkte/produkt/bauernmild-500g
[2]USDA1.(2021年4月12日).USDA,Agricultural Research Service,Fooddatacentral.Retrieved from https://fdc.nal.usda.gov/fdc-app.html#/food-details/172686/nutrients
[3]USDA2.(2021年4月12日).USDA,Agricultural Research Service,Fooddatacentral.Retrieved from https://fdc.nal.usda.gov/fdc-app.html#/food-details/172684/nutrients
在说明书、权利要求书和/或附图中公开的本发明的特征可以单独地或以它们的任意组合成为用于以其各种形式实现本发明的材料。

Claims (15)

1.一种用于生产微生物脂质，任选地用于生产微生物脂质和蛋白质生物质和/或芳香化合物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供第一底物，其中所述第一底物是食物残余物，优选食品级食物残余物；
b)用所述第一底物培养选自丝状真菌和细菌的第一微生物，并且由此允许所述第一微生物产生至少一种酶和经酶处理的第一底物，任选地进一步产生蛋白质生物质和/或芳香化合物；任选地，用所述第一微生物共培养一种或多种微藻，并且由此允许所述一种或多种微藻产生蛋白质生物质、微生物脂质和/或芳香化合物；
c)任选地，获得所述至少一种酶，并用所述至少一种酶预处理第二底物，并且由此提供经酶处理的第二底物；其中所述第二底物是食物残余物，优选食品级食物残余物；其中优选地，所述第一底物和所述第二底物是相同类型的；
d)用包含所述经酶处理的第一底物的培养基和/或如果存在步骤c)，用包含所述经酶处理的第二底物的培养基培养第二微生物，其中所述第二微生物是产油微生物，并且由此允许所述产油微生物产生微生物脂质；
e)任选地，在没有任何基于溶剂的萃取或基于化学品的破乳的情况下对所述培养的第二微生物进行纯酶处理，以使步骤d)中产生的所述微生物脂质适于随后收获；以及
f)收获步骤d)中产生的所述微生物脂质，优选通过基于密度的分离方法。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述食物残余物在每次出现时独立地选自包含以下项或者由以下项组成的食物残余物：烘焙食物残余物，例如面包、面包卷、饼干、松饼、曲奇或蛋糕；水果食物残余物，例如果浆、果皮或果汁；蔬菜食物残余物，例如蔬菜皮、蔬菜浆或蔬菜汁；碾磨食物残余物，例如麸皮或麸皮面粉；鱼类食物残余物，例如鱼类加工残余物；海产食物残余物，例如海产食物加工残余物；啤酒酒糟；谷类食物残余物，例如大米、小麦、小米或玉米；餐馆食物残余物，例如餐馆剩余物；动物产品食物残余物，例如奶或奶酪；超市食物残余物，例如过期食物；或它们的任意组合；优选地包含烘焙食物残余物或由烘焙食物残余物组成，更优选地包含面包食物残余物或由面包食物残余物组成。
3.根据权利要求1或2所述的方法，
其中所述丝状真菌选自长喙壳属(Ceratocystis sp.)，例如甘薯长喙壳(Ceratocystis fimbriata)、念珠长喙壳(Ceratocystis moniliformis)和奇异长喙壳(Ceratocystis paradoxa)，优选奇异长喙壳菌(Ceratocystis paradoxa)；木霉属(Trichoderma sp.)，例如里氏木霉(Trichoderma reesei)和哈茨木霉(Trichodermaharzianum)；曲霉属(Aspergillus sp.)，例如米曲霉(Aspergillus oryzae)、塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)、土曲霉(Aspergillus terreus)和黑曲霉(Aspergillusniger)；脉孢菌属(Neurospora sp.)，例如间型脉孢菌(Neurospora intermedia)；红曲霉属(Monascus sp.)，例如紫红曲霉(Monascus purpureus)；根霉属(Rhizopus sp.)，例如米根霉(Rhizopus oryzae)；镰刀菌属(Fusarium sp.)，例如镰孢霉(Fusarium venenatum)；嗜热真菌属(Thermomyces sp.)；青霉属(Penicillium sp.)；金芽孢杆菌属(Aureobasillium sp.)；皱皮菌属(Ischnoderma sp.)，例如芳香皱皮孔菌(Ischnodermabenzoinum)；多孔菌属(Polyporus sp.)，例如担子菌(Polyporus durus)；密孔菌属(Pycnoporus sp.)，例如朱红密孔菌(Pycnoporus cinnabarinus)；平革菌属(Phanerochaete sp.)，例如黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)；和炭角菌属(Xylaria sp)；优选选自长喙壳属(Ceratocystis sp.)、木霉属(Trichoderma sp.)、曲霉属(Aspergillus sp.)和镰刀菌属(Fusarium sp)；
其中所述细菌选自梭菌属(Clostridium sp.)，例如粪堆梭菌(Clostridiumstercorarium)、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)和丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)；盐芽孢杆菌属(Halobacillus sp.)，例如特氏盐芽孢杆菌(Halobacillus trueperi)和卡拉季喜盐芽孢杆菌(Halobacillus karajensis)；盐单胞菌属(Halomonas sp.)，例如南方盐单胞菌(Halomonas meridiana)和伸长盐单胞菌(Halomonas elongata)；红嗜热盐菌属(Rhodothermus sp.)，例如海洋红嗜热盐菌(Rhodothermus marinus)；链霉菌属(Streptomyces sp.)，例如灰链霉菌(Streptomycesgriseus)、产橄榄色链霉菌(Streptomyces olivochromogenes)、灰略红链霉菌(Streptomyces griseorubens)和马特链霉菌(Streptomyces matensis)；和芽孢杆菌属(Bacillussp.)，例如纳豆芽孢杆菌(Bacillus nato)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)和嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)；和/或
其中所述微藻选自小球藻属(Chlorella sp.)，例如普通小球藻(Chlorellavulgaris)和原壳小球藻(Chlorella protothecoides)；栅藻属(Scenedesmus sp.)，例如斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)；杜氏藻属(Dunaliella sp.)，例如盐生杜氏藻(Dunaliella salina)；红球藻属(Haematococcus sp.)，例如雨生红球藻(Haematococcuspluvialis)；隐甲藻属(Crypthecodinium sp.)，例如寇氏隐甲藻(Crypthecodiniumcohnii)；裂殖壶菌属(Schizochytrium sp.)，例如裂殖壶菌(Schizochytriumlimacinum)；和扁藻属(Tetraselmis sp.)，例如周氏扁藻(Tetraselmis chui)；优选选自小球藻属(Chlorella sp.)和栅藻属(Scenedesmussp.)。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第二微生物是选自产油酵母、产油真菌、产油细菌和产油微藻的产油微生物；
其中优选地，
所述产油酵母选自皮状新毛孢子菌属(Cutaneotrichosporon sp.),例如产油皮状新毛孢子菌(Cutaneotrichosporon oleaginosus)；毛孢子菌属(Trichosporon sp.)，例如产油毛孢子菌(Trichosporon oleaginosus)、头状毛孢子菌(Trichosporon capitatu)和阿萨希毛孢子菌(Trichosporon asahii)；红螺菌属(Rhodospirillum sp.)；红冬孢酵母属(Rhodosporidium sp.)，例如圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)；红孢子菌属(Rhodosporon sp.)；假丝酵母属(Candida sp.)，例如维斯假丝酵母(Candidaviswanathii)和弗里斯假丝酵母(Candida freyschussii)；隐球菌属(Cryptococcussp.)，例如弯曲隐球菌(Cryptococcus curvatus)；油脂酵母属(Lipomyces sp.)，例如斯达油脂酵母菌(Lipomyces starkeyi)；耶氏酵母属(Yarrowiasp.)，例如解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)；红酵母属(Rhodotorula sp.)，例如禾本红酵母(Rhodotorulagraminis)、瘦弱红酵母(Rhodotorula gracilis)和黏红酵母(Rhodotorula glutinis)；和芹毛酵母属(Apiotrichum sp.)，例如弯曲芹毛酵母(Apiotrichum curvarum)；优选皮状新毛孢子菌属(Cutaneotrichosporon sp.)，更优选产油皮状新毛孢子菌(Cutaneotrichosporon oleaginosus)；
所述产油真菌选自小克银汉霉属(Cunninghamella sp.)，例如刺孢小克银汉霉(Cunninghamella echinulate)；曲霉属(Aspergillus sp.)，例如米曲霉(Aspergillusoryzae)、塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)、土曲霉(Aspergillus terreus)和黑曲霉(Aspergillus niger)；脉孢菌属(Neurospora sp.)，例如间型脉孢菌(Neurosporaintermedia)；红曲霉属(Monascussp.)，例如紫红曲霉(Monascus purpureus)；根霉属(Rhizopus sp.)，例如米根霉(Rhizopus oryzae)；镰刀菌属(Fusarium sp.)，例如镰孢霉(Fusarium venenatum)；毛霉属(Mucor sp.)，例如卵孢接霉(Mucor moelleri)；被孢霉属(Mortierella sp.)，例如深黄被孢霉(Mortariella isabellina)和高山被孢霉(Mortierella alpine)，优选高山被孢霉(Mortierella alpine)；和腐质霉属(Humicolasp.)；
所述产油细菌选自红球菌属(Rhodococcus sp.)、不动杆菌属(Acinetobacter sp.)和芽孢杆菌属(Bacillus sp.)；并且
所述产油微藻选自小球藻属(Chlorella sp.)、新颖拟绿球藻属(Pseudochlorococcumsp.)、微绿球藻属(Nannochloris sp.)、微拟球藻(Nannochloropsis sp.)、等鞭金藻属(Isochrysis sp.)、黄丝藻属(Tribonema sp.)、杜氏藻属(Dunaliella sp.)、纤维藻属(Ankistrodesmus sp.)、葡萄藻属(Botryococcus sp.)、巴夫藻属(Pavlova sp.)、栅藻属(Scenedesmus sp.)、骨条藻属(Skeletonema sp.)和菱形藻属(Nitzschia sp.)；
其中更优选地，所述第二微生物是选自皮状新毛孢子菌属(Cutaneotrichosporonsp.)，例如产油皮状新毛孢子菌(Cutaneotrichosporon oleaginosus)的产油酵母。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第二微生物是选自以下项的产油酵母：产油皮状新毛孢子菌(Cutaneotrichosporon oleaginosus)、产油毛孢子菌(Trichosporon oleaginosus)、头状毛孢子菌(Trichosporon capitatu)、阿萨希毛孢子菌(Trichosporon asahii)、斯达油脂酵母菌(Lipomyces starkeyi)、圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、禾本红酵母(Rhodotorula graminis)、瘦弱红酵母(Rhodotorula gracilis)、黏红酵母(Rhodotorulaglutinis)、弯曲芹毛酵母(Apiotrichum curvarum)、弯曲隐球菌(Cryptococcuscurvatus)、维斯假丝酵母(Candida viswanathii)和弗里斯假丝酵母(Candidafreyschussii)；优选产油皮状新毛孢子菌(Cutaneotrichosporon oleaginosus)。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法的所述步骤b)包括用所述第一底物培养选自丝状真菌和细菌的第一微生物，并且由此允许所述第一微生物产生至少一种酶、经酶处理的第一底物以及蛋白质生物质和/或芳香化合物；任选地，还包括用所述第一微生物共同培养一种或多种微藻，并且由此允许所述一种或多种微藻产生蛋白质生物质、微生物脂质和/或芳香化合物。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述方法还包括收获所述蛋白质生物质和/或所述芳香化合物的步骤，优选地使用离心、过滤、亲油性渗透汽化、固相微萃取、蒸馏以及它们的组合中的任意。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述培养基还包含额外的碳源、氮源、痕量金属和/或维生素。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括预处理所述第一底物的步骤和/或，如果存在步骤c)，预处理所述第二底物的步骤，通过：
-机械预处理，优选地通过研磨、混合、粉碎和/或筛分所述底物；
-将所述底物溶解在溶剂中，优选地溶解在水中；
-化学水解所述底物，优选地使用酸，例如硫酸；
-对所述底物进行热预处理，优选地在50℃至200℃的温度下进行10分钟至240分钟，
更优选地在80℃至170℃的温度下进行30分钟至90分钟；
-对所述底物进行发酵预处理，优选厌氧发酵；和/或
-使用一种或多种酶，任选地可商购的酶，对所述底物进行酶预处理；
其中所述一种或多种酶选自蛋白酶，例如内肽酶和外肽酶、丝氨酸内肽酶、枯草杆菌蛋白酶A和胃蛋白酶；和水解酶，优选糖苷水解酶，更优选选自α-淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、木葡聚糖酶、半乳聚糖酶、阿拉伯糖酶、甘露聚糖酶、脂肪酶、葡糖淀粉酶和果胶酶的糖苷水解酶。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法包括在没有任何基于溶剂的萃取或基于化学品的破乳的情况下对所述培养的第二微生物进行所述纯酶处理的所述步骤e)，其中所述培养的第二微生物的所述纯酶处理是单独用水解酶或者与蛋白酶组合/随后用蛋白酶处理所述微生物。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法包括获得所述至少一种酶并且用所述至少一种酶预处理所述第二底物的步骤c)，其中所述预处理包括使所述第二底物与所述至少一种酶接触，所述至少一种酶为从培养所述第一微生物获得(优选直接获得)的液体酶制剂的形式，或者为冻干酶制剂的形式，任选为在溶液中重构的冻干酶制剂的形式。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述至少一种酶包含选自以下项的酶活性的一种或几种活性：纤维素酶；地衣多糖酶；木聚糖酶；阿拉伯聚糖酶；淀粉酶，例如α-淀粉酶；极限糊精酶；支链淀粉酶；蛋白酶；半乳聚糖酶；甘露聚糖酶；鼠李聚糖半乳糖醛酸水解酶；鼠李聚糖半乳糖醛酸裂解酶；木葡聚糖酶；半纤维素酶；淀粉葡糖苷酶；β-葡糖苷酶；果胶酶；和昆布多糖酶；
任选地选自以下项的酶活性：纤维素酶；地衣多糖酶；木聚糖酶；阿拉伯聚糖酶；淀粉酶，例如α-淀粉酶；极限糊精酶；支链淀粉酶；蛋白酶；半乳聚糖酶；甘露聚糖酶；鼠李聚糖半乳糖醛酸水解酶；和鼠李聚糖半乳糖醛酸裂解酶。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法是生产微生物脂质并由其制备食品的方法，其中所述方法还包括制备包含在步骤f)中收获的所述微生物脂质的食品的步骤g)，所述食品优选地为烘焙产品，例如面包、面包卷、饼干、松饼、曲奇或蛋糕；糖食产品，例如面粉糖食或糖制糖食；乳制品，例如冰淇淋或婴儿奶；涂抹料，例如人造黄油、蛋黄酱或软奶酪；方便食品，例如方便面、披萨、披萨面团或调味汁；饮料；素食或纯素食，例如肉类似物和奶类似物；糖果，例如无可可巧克力；和/或巧克力产品；
其中任选地，所述方法还包括通过使用所述食品的食物残余物作为所述第一底物和/或如果存在步骤c)，作为所述第二底物，回收所述食品的所述食物残余物的步骤h)。
14.微生物脂质(优选地使用根据权利要求1至13中任一项所述的方法生产的微生物脂质)在生产食品中的用途，所述食品优选为烘焙产品，例如面包、面包卷、饼干、松饼、曲奇或蛋糕；糖食产品，例如面粉糖食或糖制糖食；乳制品，例如冰淇淋或婴儿奶；涂抹料，例如人造黄油、蛋黄酱或软奶酪；方便食品，例如方便面、披萨、披萨面团或调味汁；饮料；素食或纯素食，例如肉类似物和奶类似物；糖果，例如无可可巧克力；和/或巧克力产品。
15.组合物，所述组合物包含至少五种，优选至少六种，更优选至少七种选自以下项的酶：纤维素酶；地衣多糖酶；木聚糖酶；阿拉伯聚糖酶；淀粉酶，例如α-淀粉酶；极限糊精酶；支链淀粉酶；蛋白酶；半乳聚糖酶；甘露聚糖酶；鼠李聚糖半乳糖醛酸水解酶；鼠李聚糖半乳糖醛酸裂解酶；木葡聚糖酶；半纤维素酶；淀粉葡糖苷酶；β-葡糖苷酶；果胶酶；和昆布多糖酶；
其中任选地，所述组合物包含
纤维素酶；淀粉酶；半纤维素酶；极限糊精酶，例如麦芽极限糊精酶；和果胶酶；或
纤维素酶；地衣多糖酶；木聚糖酶；阿拉伯聚糖酶；淀粉酶，例如α-淀粉酶；极限糊精酶；支链淀粉酶；蛋白酶；半乳聚糖酶；和甘露聚糖酶；或
纤维素酶；木聚糖酶；阿拉伯聚糖酶；淀粉酶，例如α-淀粉酶；极限糊精酶；支链淀粉酶；半乳聚糖酶；甘露聚糖酶；鼠李聚糖半乳糖醛酸水解酶；和鼠李聚糖半乳糖醛酸裂解酶。
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