CN117979993A - 用于诱导抗寨卡病毒的免疫反应的重组抗原 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及重组嵌含抗原，其在其多肽链中包含对应于寨卡病毒衣壳蛋白的氨基酸2至104的多肽或具有与这种衣壳蛋白的所述区域具有至少90％同一性的氨基酸序列的多肽。本发明还涉及包含所述重组嵌合抗原和药学上可接受的疫苗佐剂的疫苗组合物。本发明还涉及重组嵌合抗原用于生产用于诱导抗寨卡病毒的免疫反应的药物的用途，所述重组嵌合抗原在其多肽链中包含对应于寨卡病毒衣壳蛋白的氨基酸2至104的多肽或与所述区段具有至少90％同一性的氨基酸序列。本发明还公开了用于诱导抗寨卡病毒的免疫反应的方法，其中施用重组嵌合抗原。

Description

用于诱导抗寨卡病毒的免疫反应的重组抗原
技术领域
本发明涉及生物技术和制药工业领域，特别是涉及获得针对寨卡病毒的重组蛋白抗原和疫苗组合物。
背景技术
寨卡病毒属于黄病毒科黄病毒属(Kuno&Chang,2007,Arch Virol,152:687-696)，其包括如黄热病病毒、日本脑炎病毒、西尼罗病毒、蜱传脑炎病毒和登革热病毒等其它病原体。寨卡病毒通过伊蚊属被感染的蚊子的叮咬传播给人(Kindhauser等人,2016,BullWorld Health Organ,94:675-686C)，所述蚊子主要分布在热带和亚热带地区(Sharma&Lal,2017,Front Microbiol,8:110-)。寨卡病毒是具有正单链RNA的包膜病毒，所述正单链RNA被翻译成多蛋白，该多蛋白在翻译中和翻译后被切割成十种单独的蛋白(Kuno&Chang,2007,Arch Virol,152:687-696)：三种结构蛋白和七种非结构蛋白，所述蛋白参与病毒复制、病毒组装和免疫系统逃避(Sirohi等人,2016,Science,352:467-470)。结构蛋白是：衣壳蛋白(C)、包膜蛋白(E)和膜蛋白(M)或膜前体蛋白(PrM))。非结构蛋白被称为NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5。
迄今为止，已有三次寨卡病毒的重大疫情，第一次发生于2007年的密克罗尼西亚联邦，约有7,000人感染，但未出现严重并发症(Duffy等人,2009,N Engl J Med,360:2536-2543)。2013年，法属波利尼西亚爆发了第二次疫情，估计有28,000名居民感染了寨卡病毒(Musso等人,2014,Clin Microbiol Infect,20:0595-0596)。在这次爆发中，首次观察到诸如吉兰-巴雷综合征等神经学损伤病例的发病率上升(Cao-Lormeau等人,2016,Lancet,387:1531-1539)。第三次爆发是在2015年于巴西发生，有440,000-1,300,000例疑似寨卡病毒感染病例(Hennessey等人,2016,MMWR Morb Mortal Wkly Rep,65:55-58)。在那次爆发中，神经学损伤病例(特别是吉兰-巴雷综合征患者和小头畸形新生儿)的数量增加(Schuler-Faccini等人,2016,MMWR Morb Mortal Wkly Rep,65:59-62)。
2016年，世界卫生组织(WHO)宣布寨卡病毒引起的疾病为“国际关注的公共卫生紧急事件”。2017年，48个国家报告了该疾病通过蚊子感染的传播，累计510,000例疑似病例和超过170,000例确诊病例(Yun&Lee,2017,J Microbiol,55:204-219)。截至2019年，分布在六个WHO地区中的四个地区(非洲、东南亚、西太平洋和美洲)的87个国家报告了寨卡病毒通过受感染的蚊虫叮咬的本地传播。特别式对于这种病毒，除了病媒传播之外，其它传播途径诸如性传播、怀孕期间的母婴传播和输血也是可能的(Frank等人,2016,Euro Surveill,21)。
感染后，人会出现“登革热样综合征”的临床表现，所述临床表现可能是轻微的或无症状的，大约80％的感染是无症状的(Grossi-Soyster&LaBeaud,2017,Curr OpinPediatr,29:102-106)。一般来说，症状性病例是轻微的，并且可包括皮疹、发热状态、关节炎、关节痛、非化脓性结膜炎和四肢水肿(Calvet等人,2016,Curr Opin Infect Dis,29:459-466)。还可能出现其它症状，诸如：头痛、肌痛、眶后疼痛、下背痛、淋巴结肿大和呕吐(Brasil等人,2016,PLoS Negl Trop Dis,10:e0004636)。这种疾病通常是轻微的；然而，有死亡病例的报告(特别是在患有潜在疾患的人中)(Arzuza-Ortega等人,2016,EmergInfect Dis,22:925-927)。
早期数据表明，对寨卡病毒的免疫反应与其它黄病毒相似，其中针对E蛋白的中和抗体(Fernandez&Diamond,2017,Curr Opin Virol,23:59-67)，构成了保护免受感染的主要要素(Sapparapu等人,2016年,Nature,540:443-447)。E蛋白在病毒体表面暴露最多的蛋白质，其参与病毒融合和进入宿主细胞(Larocca等人,2016,Nature,536:474-478)。然而，黄病毒之间，尤其是登革热病毒与寨卡病毒之间的高水平交叉反应性阻碍了抗体区分两种病毒感染的作用(Kostyuchenko等人,2016,Nature,533:425-428)。
到目前为止，还不确定针对寨卡病毒产生的抗体是否可通过抗体依赖性感染增强现象促进对另一种相关黄病毒的病毒感染，如对于登革病毒所充分记载的。也不知道针对寨卡病毒产生的免疫反应是否会影响随后的登革热病毒感染或反之亦然，也不知道神经学损伤(诸如在一些患者中观察到的吉兰-巴雷综合征)是直接病毒感染的后果还是免疫反应的继发效应(Poland等人,2018,Lancet Infect Dis,18:e211-e219)。
另一方面，最近的研究表明，T细胞对寨卡病毒感染的反应具有重要作用。使用来自对病毒免疫的人的外周血单核细胞(PBMC)，已经鉴定了细胞免疫反应的主要靶标。其主要针对结构蛋白C和prM以及非结构蛋白NS2和NS5(Xu等人,2016,PLoS Curr,8:,Elong等人,2017,Cell Host Microbe,21:35-46)。
目前，使用多种抗原递送方法开发超过40种抗寨卡病毒的候选疫苗，包括灭活病毒疫苗、减毒疫苗、DNA和mRNA疫苗、基于病毒载体的疫苗和亚单位疫苗(Barouch等人,2017,Immunity,46:176-182)。然而，其中一些方法存在诸如其生产成本高和安全性低等不利方面，这为亚单位疫苗开辟了道路。
在亚单位疫苗中，获得了含有80％的E蛋白(Liang等人,2018,PLoS One,13:e0194860-；Qu等人,2018,Antiviral Res,154:97-103)或E蛋白结构域III(EDIII)(Qu等人,2018,Antiviral Res,154:97-103)的重组变体。具体而言，根据将该区域作为其他黄病毒的候选区域所取得的结果，EDIII区域作为一种有前途的免疫原出现(Beltramello等人,2010,Cell Host Microbe,8:271-283)。使用重组EDIII区域的几项研究表明，在小鼠中诱导了抗病毒攻击的体液和细胞免疫反应并提供保护作用(Yang等人,2017,Sci Rep,7:7679-；Qu等人,2018,Antiviral Res,154:97-103)。然而，并非所有这些策略都能够在更接近人的动物模型中重现这些有希望的免疫原性结果。
为了增加产生的免疫反应，已经评估了新的制剂，其包括新抗原、改善对免疫系统的呈递或将重组亚单位与佐剂组合，从而改善诱导的体液和细胞免疫反应。
根据上述因素，开发能够诱导针对这种黄病毒的安全有效的免疫反应的抗寨卡病毒亚单位疫苗仍是未解决的问题。
发明内容
本发明通过提供重组嵌合抗原解决了上述问题，所述重组嵌合抗原在其多肽链中包含对应于寨卡病毒衣壳蛋白氨基酸2至104的多肽或与该病毒衣壳蛋白的这一区域具有至少90％同一性的氨基酸序列的多肽。通过这种方式，本发明的嵌合抗原含有潜在诱导细胞免疫应答的区域，其能够降低病毒载量并提供保护，而无需抗病毒的中和抗体的存在。
在本发明的一个实施方案中，嵌合抗原另外包含对应于寨卡病毒E蛋白EDIII结构域的多肽或与寨卡病毒包膜蛋白的该结构域具有至少90％同一性的氨基酸序列的多肽。在这种情况下，嵌合抗原包含两个潜在的保护区，能够同时诱导中和抗体和细胞免疫反应。这些区域由来自EDIII结构域的145个氨基酸和来自病毒衣壳蛋白的103个氨基酸组成。两个病毒区域在不同的分离株之间表现出高度的同源性，所述分离株包括已鉴定的寨卡病毒的两个谱系，亚洲/美洲谱系和非洲谱系(Haddow等人,2012,PLoS Negl Trop Dis,6:e1477-)。这些区域将本发明的嵌合抗原转化为有用的分子，以保护其免受不同寨卡病毒株的感染。
在本发明的一个实施方案中，嵌合抗原还在其多肽链的N-末端包含6个组氨酸残基的区段。在特定实施方案中，嵌合抗原具有被鉴定为SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的氨基酸序列。
本发明的目的是包含重组嵌合抗原的疫苗组合物，所述重组嵌合抗原在其多肽链中包含a)对应于寨卡病毒衣壳蛋白的氨基酸2至104的多肽或与该病毒衣壳蛋白的该区域具有至少90％同一性的氨基酸序列的多肽，和b)药学上可接受的疫苗佐剂。在本发明的一个实施方案中，佐剂是铝盐。
首先在具有免疫活性的小鼠(BALB/c)的临床前研究中评估疫苗组合物诱导免疫的能力，所述小鼠通过腹膜内途径免疫。在这些研究中，氧化铝被用作佐剂，因为它具有多功能性，可以随后用于人类。此外，还将疫苗组合与免疫增强剂脱氧核糖核酸(ssDNA)链(在本发明中称为SEQ ID NO:11)组合进行了测试。这允许产生新的疫苗组合物，其中当与没有免疫增强剂的制剂相比时，由于这些抗原的聚集体的形成，它们的免疫原性得到增强，与非聚集的变体相比，所述聚集体被更高效地呈递给免疫系统。
因此在本发明的一个实施方案中，基于嵌合抗原的疫苗组合物还包含具有被鉴定为SEQ ID NO:11的核苷酸序列的核酸。在本发明的一个实施方案中，在疫苗组合物中嵌合抗原的剂量范围为每剂10-150微克。
无论是可溶性的还是由于免疫增强剂ssDNA的存在而聚集在一起的，包含病毒衣壳区的疫苗组合物均在经免疫的小鼠中产生细胞免疫反应。这种免疫力在受到不同病毒株的攻击后为动物提供了部分保护。
在包含含有寨卡病毒EDIII区域和病毒衣壳蛋白区域的嵌合蛋白的疫苗组合物(呈可溶性形式和在与免疫增强剂ssDNA组合后呈聚集的形式)的情况下，它们能够在经免疫的小鼠中产生体液免疫反应以及有效的细胞免疫反应。这种免疫力在受到不同病毒株的攻击后为动物提供了部分保护。
随后选择包含两种分子的聚集变体的疫苗组合物，并在猕猴物种的非人灵长类动物中进行评估，对其进行皮下接种，也使用氧化铝作为佐剂。结果，在经免疫的动物中产生了抗寨卡病毒的中和抗体，以及在三剂后产生了细胞免疫反应。因此，在另一方面，本发明包括上述重组嵌合抗原用于制备用于诱导抗寨卡病毒的免疫反应的药物的用途。
此外，本发明还提供了用于在人体中诱导抗寨卡病毒的免疫反应的方法，其中施用了药物有效量的重组嵌合抗原和药学上可接受的佐剂，所述重组嵌合抗原在其多肽链中包含对应于寨卡病毒衣壳蛋白氨基酸2至104的多肽或具有与寨卡病毒衣壳蛋白的该区域具有至少90％同一性的氨基酸序列的多肽。
在本发明的一个实施方案中，佐剂是铝盐。在本发明的方法的一个实施方案中，重组嵌合抗原的药物有效量在每剂10-150微克的范围内。作为特定的实施方案，在本发明的方法中，额外地将具有被鉴定为SEQ ID NO:11的核苷酸序列的核酸与重组嵌合抗原一起施用。
尽管使用寨卡病毒EDIII区域的几项研究已显示在小鼠中诱导了体液和细胞免疫反应以及抗病毒攻击的保护作用，但这些策略还不能在灵长类动物中重现良好的免疫原性结果。与那些基于寨卡病毒亚单位的候选疫苗的开发尝试相比，本发明具有明显的有利方面。本发明的嵌合抗原在含有它们的疫苗组合物中，已被证明在非人灵长类动物中诱导细胞和体液反应。在某种程度上，这种针对寨卡病毒的有效反应是由于包含了病毒衣壳蛋白的103个氨基酸的片段以及向免疫系统呈递抗原的更好方式而引起的。
附图说明
图1.在表达载体pET-28AC中克隆ZC(A)和ZEC(B)蛋白的编码区。
图2.ZEC和ZC重组抗原的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离和蛋白质印迹表征：(A)12.5％ ZEC蛋白的SDS-PAGE；
(B)ZEC蛋白的蛋白质印迹；(C)12.5％ ZC蛋白的SDS-PAGE和(D)ZC蛋白的蛋白质印迹。
图3.ZC和ZEC重组蛋白与人多克隆抗体的ELISA抗原性表征，所述多克隆抗体来自感染寨卡病毒后的免疫者。该图显示了两种重组蛋白与人血清SH1和SH2(A)、SH6和SH7(B)、SH8和SH9(C)的系列稀释液的反应性。
图4.在用重组蛋白或寨卡病毒体外刺激后，从对寨卡病毒免疫的个体的PBMC提取干扰素γ(IFNγ)ELISpot。将10μg的ZC或ZEC重组蛋白用于体外刺激，将1或5的感染复数(MOI)用于体外病毒刺激。结果显示为来自两个独立实验的每百万PBMC的斑点形成单位(SFU)的平均值±标准偏差。虚线表示测定的阳性标准(50SFU/100万个细胞)。
图5.用包含ZC或ZEC蛋白的组合物免疫的BALB/c小鼠中的体液免疫反应。(A)通过ELISA测定的抗寨卡病毒抗体。(B)通过体外病毒中和试验测量的中和抗体。数据表示为平均值±标准偏差(n＝10)。不同字母表示各组间有统计上显著的差异(p<0.01)。水平虚线表示测定的阳性检测限。
图6.通过IFNγELISpot测定的用ZC或ZEC蛋白免疫的BALB/c小鼠中的细胞介导的免疫反应。数据表示为每百万脾细胞的平均SFU的平均值±标准误差(n＝10)。不同字母表示各组间有统计上显著的差异(p<0.001)。水平虚线表示测定的阳性检测限。
图7.用ZC或ZEC蛋白制剂免疫的BALB/c小鼠的体液免疫反应的评估。(A)通过ELISA测量的寨卡病毒抗体。(B)通过体外病毒中和试验测定的中和抗体。数据表示为平均值±标准偏差(n＝10)。不同字母表示各组间有统计上显著的差异(p<0.01)。水平虚线表示测定的阳性检测限。
图8.通过IFNγELISpot测定的用ZC或ZEC蛋白免疫的BALB/c小鼠中的细胞介导的免疫反应的评估。数据表示为每百万脾细胞的平均SFU的平均值±标准误差(n＝10)。不同字母表示各组间有统计上显著的差异(p<0.01)。水平虚线表示测定的阳性检测限。
图9.用重组蛋白ZC或ZEC免疫并用寨卡病毒的不同神经适应株攻击的BALB/c小鼠脑中的病毒血症图。(A)用从古巴患者身上分离的毒株(ZIK16毒株)进行病毒攻击后的保护测定；(B)利用参考毒株MR766的病毒攻击；(C)利用参考毒株巴西ZKV2015进行病毒攻击后的保护测定。数据表示为平均值±平均值的标准误差(n＝10)。虚线表示测定的检测极限。不同字母表示各组间有统计上显著的差异(p<0.05)。
图10.用组合物ZEC+ssDNA或ZC+ssDNA免疫的非人灵长类动物中的体液免疫反应的动力学。(A)通过ELISA测量的抗重组蛋白抗体(ZC或ZEC)。(B)通过ELISA测量的抗寨卡病毒抗体。箭头表示每剂的施用时间。水平虚线表示测定的阳性检测限。
图11.通过IFNγELISpot测定在用组合物ZEC+ssDNA或ZC+ssDNA免疫的非人灵长类动物中的细胞介导的免疫反应动力学。数据表示为每百万PBMC的平均SFU的平均值±标准误差(n＝4)。水平虚线表示测定的阳性检测限。
图12.用组合物ZC+ssDNA或ZEC+ssDNA免疫并用感染性寨卡病毒(ZIK16毒株)攻击的非人灵长类动物中的病毒血症。数据表示为平均值±标准偏差(n＝4)。
实施方案/实施方案的示例的详细说明
实施例1.重组蛋白ZC和ZEC的克隆和表达。
在疾病发生3-7天期间收集的有寨卡病毒感染症状的志愿者的尿液和血清样本感染Vero细胞。孵育6-7天后，获得Vero细胞的连续传代，当观察到细胞病变效应(合胞体形成)时收集培养物上清液。连续传代7-8次后，在Vero细胞上滴定制品，获得7x106 PFU/mL的病毒滴度。在从感染的人样品中分离寨卡病毒的实验中描述了类似的结果(Musso等人,2015,J Clin Virol,68:53-55；Bonaldo等人,2016,PLoS Negl TropDis,10:e0004816)。
从感染的Vero细胞的培养物上清液中提取病毒RNA，并在逆转录反应中用作模板，用于扩增编码病毒衣壳和包膜蛋白(E)的DNA链。使用了与两种病毒蛋白附近的侧翼保守区结合的寡核苷酸作为引物，如表1所示。
表1.用于分离病毒衣壳和包膜蛋白(E)的编码区的寡核苷酸的DNA序列。
通过聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA序列，然后对这两个PCR片段进行测序并与之前描述的其它寨卡病毒分离株的所述片段进行比较，证明所获得的区域的身份。从古巴患者样品中分离出的寨卡病毒从现在开始被称为ZIK16。
随后，使用这些区域(具有用于进行随后的克隆步骤的特定限制性位点(表2))作为模板进行第二次PCR，用于扩增对应于ZC和EDIII区域的区域。
表2.用于扩增ZC蛋白和EDIII结构域的编码区的寡核苷酸的DNA序列，其具有用于在表达载体中克隆的限制性位点。
*寡核苷酸中包含的限制性位点用下划线和粗体标示。
将这两个片段都克隆到商购可得的载体pGEMt中，并转化到大肠杆菌(Escherichia coli)细胞的感受态JM-109菌株中。将转化的细胞在37℃下于补充有50μg/mL的抗生素氨苄青霉素的Luria Bertani(LB)培养基中生长10h。将这些转化的大肠杆菌细胞用于获得和纯化DNA质粒。分别用限制性酶BamHI/HindIII或BamHI消化中间构建体pGEMt-ZC和pGEMt-EDIII，以获得编码寨卡病毒的病毒衣壳和EDIII区域的DNA片段。
接下来，将对应于病毒衣壳的DNA条带插入表达载体pET-28AC中，该载体包含噬菌体T7启动子和N-末端区域的六个组氨酸残基的尾部。结果，获得了4个具有pET-28AC-ZC构建体的转化体(图1A)。对它们进行了测序，并确认了ZC蛋白的编码序列(SEQ ID NO:9)的身份。然后，选择载体pET-28AC-ZC(克隆2)中的一种克隆。用BamHI/CIP酶消化该克隆，用于插入预先用BamHI酶消化的EDIIIDNA条带，以获得所得表达载体pET-28AC-ZEC。该载体包括与病毒衣壳蛋白N末端融合的EDIII结构域的区域。结果，选择了pET-28AC-ZEC构建体的两个转化体(图1B)。ZEC蛋白的编码序列的身份通过测序来确认，并在序列表中被标识为SEQ IDNO:10。
ZC和ZEC嵌合重组蛋白的表达在大肠杆菌的BL-21(DE3)菌株中进行，所述菌株分别用质粒pET-28AC-ZC(克隆2)和pET-28AC-ZEC(克隆23)转化。重组蛋白的表达是在噬菌体T7启动子诱导后，加入1mm IPTG进行的。通过SDS-PAGE分析细胞生物质，获得了与每个重组蛋白相对应的过表达带：ZC(SEQ ID NO:9)和ZEC(SEQ ID NO:10))，分子量分别约为12.8kDa和28.5kDa。
实施例2.重组蛋白ZC和ZEC的纯化和抗原性表征。
将从用构建体pET-28AC-ZC(克隆2)和pET-28AC-ZEC(克隆23)进行的大肠杆菌BL-21(DE3)菌株转化中获得的细胞生物质重悬于磷酸盐缓冲液中，并在三次超声波后裂解。破裂后，这两种重组蛋白主要分布在通过离心获得的不溶性级分中。从每种生物质的不溶性级分中，将重组蛋白溶解在含有7M尿素作为离液剂的Tris缓冲溶液中，并通过离子交换色谱过程，使用SP琼脂糖FF基质进行纯化。通过增强缓冲液的离子强度获得每种目标蛋白质。然后，在pH 8.0的10mM Tris缓冲液中，通过尺寸排阻色谱过程除去尿素并使蛋白质重新折叠。在两次色谱过程后，分别获得了纯度为85％和70％的ZC和ZEC蛋白(图2A和图2C)。
使用两种不同来源的抗体，通过蛋白质印迹对这两种蛋白进行抗原性表征(图2B和图2D)。所使用的抗体是来自对病毒免疫的人的多克隆抗体和识别六个组氨酸残基尾部的单克隆抗体(MAb抗His)。已经证实，ZEC蛋白被来自对寨卡病毒感染免疫的人的多克隆抗体识别。同时，用抗His Mab对该蛋白进行了免疫鉴定，所述抗His Mab识别存在于ZEC蛋白的N末端区域的表位。同样，较小的蛋白条带也用该抗体进行了免疫鉴定，这表明在ZEC蛋白的纯化过程中，降解发生在C-末端区域。
在重组蛋白ZC的蛋白质印迹表征中，由于寨卡病毒衣壳蛋白包裹在天然病毒颗粒中，因此人多克隆抗体无法识别对病毒感染免疫的人。然而，用抗His MAb获得了识别，所述抗His MAb识别存在于重组抗原的N-末端区域中的表位。
为了验证重组蛋白的一级结构以及二硫键在ZEC嵌合多肽的EDIII区域中的正确形成，通过质谱进行重组蛋白的分析。在SDS存在的情况下通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离对应于每种纯化的蛋白质的条带，并从凝胶中提取所述条带，然后用胰蛋白酶进行消化。表3概括了消化这两个样品后获得的谱的质量分配。在这两种制剂中都检测到了一定的信号，因为它们共用分子的C端。在这一分析后，可以分别验证62.7％和41.7％的ZEC(SEQ ID NO:10)和ZC(SEQ ID NO:9)蛋白质序列。此外，证实了存在于ZEC嵌合蛋白内的EDIII区域中的半胱氨酸残基(Cys27和Cys58)之间的二硫键的正确形成。该二硫键对于EDIII区域的正确构象至关重要，类似于其在蛋白质E的天然结构中的存在方式(Sirohi等人,2016,Science,352:467-470；Sirohi&Kuhn,2017,J Infect Dis,216:S935-S944)。令人惊讶的是，半胱氨酸残基Cys27与Cys58之间的二硫键被保留下来，即使该区域与病毒衣壳蛋白融合形成新型嵌合蛋白ZEC。
表3.所检测的肽的质荷比数值和序列分配。
a根据序列的编号。
此外，使用人血清通过ELISA对这两种重组蛋白进行抗原性表征。在测定中，将重组蛋白ZC或ZEC被固定在平板上，随后评估它们被人多克隆抗体识别的情况。在该测定中，使用了六名对寨卡病毒感染免疫的志愿者的人血清(SH)，所述血清是在疾病的急性期(SH1、SH6和SH8)或恢复期(SH2、SH7和SH9)收集的。如可从图3中看出的，与针对ZC蛋白检测到的低反应性相反，来自对该病毒免疫的人的多克隆抗体对ZEC蛋白的识别更强。这种行为对于所有测试的血清样品都是相似的，这是归因于ZEC嵌合蛋白中包含的EDIII结构域。该区域暴露在病毒颗粒的表面上(Sirohi等人,2016,Science,352:467-470；Sirohi&Kuhn,2017,J Infect Dis,216:S935-S944)。因此，自然感染过程中产生的抗体识别ZEC蛋白。相反地，病毒衣壳蛋白被包裹在成熟病毒体中，并且在寨卡病毒感染期间不会产生针对该区域的抗体(Mukhopadhyay等人,2005,Nat Rev Microbiol,3:13-22)。这解释了为什么只含有衣壳区的嵌合蛋白ZC不能被感染寨卡病毒的人的血清识别。
另一方面，使用IFNγELISpot测定评估了重组蛋白ZC和ZEC刺激针对寨卡病毒的记忆特异性T细胞的能力。这种细胞因子通过其针对各种黄病毒的抗病毒活性已被描述为细胞免疫反应的诱导子(mediator)(Shrestaa等人,2004,J Virol,78:2701-2710)。在该实验中，使用了来自对寨卡病毒免疫的志愿者的PBMC，用10μg/mL重组蛋白ZC或ZEC或寨卡病毒制剂(MOI为1和5)对所述PBMC进行体外刺激。然后，定量刺激后诱导的能够分泌抗病毒细胞因子IFNγ的记忆T细胞的数量。
该评估的结果在图4中显示为来自两个独立实验的每百万细胞的SFU的平均值±标准偏差。在该测定中，在用重组蛋白ZC和ZEC进行体外刺激后，在来自四名志愿者中的三名志愿者的样品中检测到了寨卡病毒特异性IFNγ分泌细胞。同样，在用病毒抗原刺激后，在所分析的四名志愿者中的三名志愿者的样品中检测到对寨卡病毒特异的IFNγ分泌细胞。总之，这些结果表明ZC和ZEC重组嵌合蛋白包括对寨卡病毒特异的记忆T细胞的表位。反过来，这些蛋白抗原能够刺激先前由病毒感染产生的细胞免疫反应。
实施例3.重组蛋白ZC和ZEC在BALB/c小鼠中的免疫原性和保护能力的评估。
重组蛋白ZC和ZEC的免疫原性评估在雌性BALB/c小鼠中进行，其中使用四组动物，每组10只动物。研究中包括的组示于表4中。
表4.用于评估重组蛋白ZC和ZEC在BALB/c小鼠中的免疫原性和保护能力的免疫方案的设计。
组 免疫原 佐剂 抗原的量 体积
1 安慰剂 氧化铝 - 100μL
2 蛋白ZC 氧化铝 10μg 100μL
3 蛋白ZEC 氧化铝 20μg 100μL
4 寨卡病毒 - 105PFU/mL 250μL
考虑到其分子量，使用重组蛋白ZC或ZEC对动物进行免疫接种，其中接种重组蛋白ZC的组接受10μg的重组蛋白，接种蛋白ZEC的组接受20μg的重组蛋白。这两种蛋白都以氢氧化铝(氧化铝)作为基础佐剂进行配制，终浓度为1.44mg/mL。在第0天、第15天和第45天通过腹膜内途径用三剂每种免疫原免疫所有组。
最后一次施用后15天，对每组动物进行放血，血清用于评估体液免疫反应。图5显示了抗寨卡病毒抗体(通过ELISA测量的)和中和抗体(通过体外病毒中和试验评估的)的体液免疫反应。
对于ELISA，用寨卡病毒(毒株ZIK16)包被平板，然后以几种稀释度孵育血清样品，然后加入商业抗小鼠IgG缀合物的适当稀释液。如图5A中所看到的，在用ZEC重组蛋白制剂免疫的组和病毒对照组中检测到高滴度的抗寨卡病毒抗体。它们之间无统计上显著的差异(p>0.05)。使用Tukey多重比较检验进行统计分析。在接受安慰剂和重组蛋白ZC的组中，未检测到抗该病毒的抗体，检测到的水平低于检测的阳性检测限。
在最后一次给药后30天，通过减少噬斑数量的体外病毒中和试验(PRNT)测量免疫后诱导的抗体的功能性。对于PRNT，将动物血清稀释液与寨卡病毒制剂(ZIK16毒株)混合。孵育一段时间后，将混合物涂在带有Vero细胞的24孔板上，因此剩余的未中和的病毒能够感染细胞并导致可见噬斑的形成。图5B显示了在经免疫动的物血清中估计的抗寨卡病毒中和抗体滴度的平均值±标准偏差。中和滴度定义为实现噬斑数目减少50％的最大稀释度。以与检测到的抗寨卡病毒的抗体反应相似的方式，在用蛋白ZEC制剂免疫的组和病毒对照组中，检测到中和抗体，其中几何平均滴度(GMT)大于1:200，它们之间没有统计上显著的差异(p>0.05)。
此外，在用不同制剂免疫的动物中，在最后一次免疫后30天，评估了该研究的对细胞免疫反应的诱导。对于该测定，在用寨卡病毒体外刺激脾细胞后，提取每组10只动物的脾细胞，并测定IFNγ分泌细胞的频率。图6显示了每组中分泌抗病毒细胞因子的细胞数量。在用ZC和ZEC重组蛋白制剂免疫的组中，在用寨卡病毒(ZIK16毒株)体外刺激脾细胞后检测到IFNγ分泌细胞，导致这些组中100％的反应动物。在接受ZC或ZEC重组蛋白的动物中检测到的IFNγ分泌细胞的值与在安慰剂组动物中检测到的IFNγ分泌细胞的数量之间存在统计上显著的差异(p<0.05)。在病毒对照组的动物中，与用重组蛋白免疫的动物中检测到的分泌IFNγ的细胞的水平相比，分泌抗病毒细胞因子的细胞数量更多(p<0.05)。使用ANOVA检验和Tukey多重比较进行统计分析。
实施例4.来自重组蛋白ZC和ZEC的核衣壳样颗粒的聚集或形成。
黄病毒的病毒衣壳是形成核衣壳的蛋白质，其在病毒颗粒组装过程中包围并保护基因组(Duffy等人,2009,N Engl J Med,360:2536-2543)。考虑到这些结构特征，通过将每种重组蛋白与具有免疫调节特性的单链DNA(本文称为ssDNA，并标识为SEQ ID NO:11)一起孵育，使用重组蛋白ZC和ZEC进行体外聚集过程或形成核衣壳样颗粒(NSP)。
根据每种分子的分子量，在聚集反应中使用蛋白质和ssDNA的不同组合。随后，将反应混合物在25℃孵育30分钟，随后在4℃孵育4小时，然后将反应混合物以10,000x g离心，并通过SDS-PAGE分析上清液。结果，根据聚集反应中使用的ssDNA量，观察到可溶性ZC或ZEC重组蛋白可以在评估的几种组合中形成不溶性高分子量聚集体。对于随后的研究，选择了特定的蛋白质:ssDNA比率，所述比率有利于聚集大约50％的重组目标蛋白质。对于每种重组蛋白，实现50％聚集所需的ssDNA的量根据其质量和氨基酸组成而不同。
实施例5.聚集的ZC和ZEC重组蛋白的组合物的免疫原性评估。
为了评估重组聚集的蛋白ZC和ZEC的免疫原性，使用六组雌性BALB/c小鼠，每组包括30只动物。表5中显示了研究中包括的组。
表5.用于重组聚集的蛋白ZC和ZEC的免疫学评估的免疫方案设计。
组 免疫原 佐剂 抗原量 体积
1 安慰剂(阴性对照) 氧化铝 - 100μL
2 ZC 氧化铝 10μg 100μL
3 ZC+ssDNA 氧化铝 10μg 100μL
4 ZEC 氧化铝 20μg 100μL
5 ZEC+ssDNA 氧化铝 20μg 100μL
6 寨卡病毒 - 105UFP/mL 250μL
对于动物的免疫接种，使用了在与ssDNA一起孵育后呈可溶和聚集形式的重组嵌合蛋白ZC或ZEC。同样，每种分子的分子量也被考虑在内，其中接种ZC重组蛋白的组接受10μg蛋白，接种ZEC蛋白的组接受20μg重组蛋白。以氧化铝作为佐剂制备所有制剂，终浓度为1.44mg/mL。各组在第0天、第15天和第45天通过腹膜内途径接受三剂制剂。
最后一次给药后15天，将每组10只动物放血，血清用于通过ELISA测定抗寨卡病毒抗体。如图7所示，在接受含有嵌合蛋白ZEC的制剂的组中检测到高滴度的抗病毒抗体，这些滴度与在病毒对照组的动物中检测到的滴度相似(p>0.05)。这一结果表明，由于ssDNA的存在，ZEC嵌合蛋白的聚集不影响抗病毒抗体的产生。反过来，在用ZC和ZC+ssDNA制剂免疫的动物中，未检测到抗寨卡病毒的抗体滴度(图7A)。使用Kruskal-Wallis检验进行统计分析，使用Dunn检验进行后验多重比较。
在最后一次给药后30天，通过PRNT分析免疫引发的抗体的功能性。图7B显示了抗寨卡病毒的中和抗体滴度的平均值±标准偏差。中和滴度定义为实现50％的噬斑数量减少的最大稀释度。如可看到的，在ZEC和ZEC+ssDNA组的动物中，检测到了中和抗体，其中TPG大于1:200；其与接受寨卡病毒制剂的组中检测到的滴度没有统计学差异(p>0.05)。
此外，在该免疫方案中，评估了ZC和ZEC蛋白制剂在经免疫的动物中诱导细胞介导的免疫反应的能力。为此，在最后一次给药后30天，在用寨卡病毒体外刺激脾细胞后，从每组的10只动物中提取脾细胞并测定IFNγ分泌细胞的频率。图8显示了每组中抗病毒细胞因子的分泌细胞的数量。如可看到的，在用ZC和ZEC重组蛋白制剂免疫的组中，100％的动物具有IFNγ分泌细胞，与安慰剂组相比具有显著差异(p<0.01)。使用ANOVA检验和Tukey多重比较进行统计分析。在接受可溶性蛋白质制剂和包含ssDNA的聚集制剂的组间观察到分泌细胞数量的差异(p<0.01)。反过来，用具有聚集的蛋白质的制剂免疫的组的动物中的IFNγ分泌细胞水平与用寨卡病毒接种的组中检测到的水平相似(p>0.05)。
实施例6.通过聚集的重组蛋白ZC和ZEC制剂评估在BALB/c小鼠中诱导的保护能力。评估了用聚集的重组蛋白ZC和ZEC免疫的BALB/c小鼠中抗病毒攻击的保护能力。保护作用被测量为在用神经适应毒株进行病毒攻击后，在经免疫的动物中控制或降低脑病毒载量的能力。
对于攻击实验，在最后一次免疫后一个月，将每组10只动物颅内接种50半数致死量(LD50)的三种神经适应的不同寨卡病毒株(ZIK16毒株、MR766毒株和巴西ZKV2015毒株)。病毒攻击七天后，在无菌条件下提取动物的大脑。将大脑浸软，并在于Vero细胞上感染后将这些样品的上清液用于病毒载量定量。
对于使用不同寨卡病毒株的三个实验，在用安慰剂制剂免疫的动物中，在大脑样品中观察到高病毒载量(大于104PFU/ml)。这些结果如图9所示。相反，在接种了不同制剂(其包括重组蛋白ZC、ZC+ssDNA和ZEC)的各组动物中，与安慰剂组相比，观察到病毒载量的降低，根据所用的病毒株，某些组达到了统计显著性(图9A-图9C)。然而，与安慰剂组中的动物相比，接受重组蛋白ZEC+ssDNA或寨卡病毒的制剂的动物在三次攻击试验中均实现了病毒载量的显著降低(p<0.001)(图9A-图9C)。使用ANOVA检验和Tukey多重比较进行统计分析。
实施例7.嵌合蛋白ZC和ZEC在非人灵长类动物中的免疫原性和保护能力的评估。
基于BALB/c小鼠的临床前研究结果，在寨卡病毒阴性非人类灵长类动物中评估了与ssDNA组合并以氧化铝为佐剂的重组蛋白ZC和ZEC。此外，还包括安慰剂组，该组接受与重组蛋白聚集过程中所用量相同的量的ssDNA和作为佐剂的氧化铝。该方案的每组中包括四只动物。分别用50μg或100μg剂量的ZC+ssDNA或ZEC+ssDNA聚集制剂对非人灵长类动物免疫三次。每隔两个月(方案的第0天、第60天和第120天)皮下施用制剂。在每次给药时(第0天、第60天和第120天)和每次给药后30天(方案的第30天、第90天和第150天)从动物中采集血样，以评估诱导的体液免疫反应。
图10A显示了通过ELISA测定的抗ZC或ZEC重组蛋白的抗体反应动力学。可以看出，用ZC+ssDNA和ZEC+ssDNA聚集物制剂免疫的非人灵长类动物中的抗重组蛋白抗体滴度在第一剂后30天开始被检测到，并且它们随着随后的接种而增加。在安慰剂组的动物中，在评估的任何时间都未检测到抗重组蛋白抗体。
通过ELISA测定抗寨卡病毒的抗体反应，图10B显示了检测到的滴度的动力学。用ZEC蛋白+ssDNA的制剂免疫的非人灵长类动物中的抗病毒抗体反应在第二次给药后30天被检测到，并且其随着第三次施用而增加。相反，在用ZC蛋白+ssDNA的制剂免疫的非人灵长类动物中，在评估的任何时间都未检测到抗病毒抗体，这与先前在小鼠中获得的结果相似。这一结果主要是由于寨卡病毒衣壳蛋白被包裹在天然病毒颗粒内而导致的。类似地，在安慰剂组中，在评估的任何时间都未检测到抗病毒抗体滴度。
另一方面，通过在Vero细胞和寨卡病毒(ZIK16)中进行体外病毒中和试验来确定诱导的抗体的功能。这些测定的结果如表6所示。根据寨卡病毒抗体反应，在第二次给药后30天，仅在用聚集制剂ZEC+ssDNA免疫的组中检测到中和抗体滴度，所述滴度在第三次施用后增强。在接受ZEC+ssDNA制剂(100％血清转化)的所有动物中都检测到了中和抗体，所述中和抗体在第180天(病毒攻击的时间)之前一直保持血清阳性。正如预期的那样，在用ZC+ssDNA制剂免疫的非人灵长类动物中，在病毒攻击前的任何评估时间都未检测到中和抗体。这与在该组中观察到的不存在抗病毒的抗体反应一致。
表6.用重组嵌合抗原制剂免疫的非人灵长类动物中抗寨卡病毒中和抗体的几何平均滴度。
研究中测量的另一个参数是细胞免疫反应，因为PBMC是在以下研究的三个时刻从以免疫的非人灵长类动物中获得的：第三次给药当天(第120天)、第三次给药后一个月(第150天)和病毒攻击当天(第180天)。然后，将PBMC在体外培养并用病毒抗原(ZIK16病毒株)刺激，然后通过ELISpot测定法来测定IFNγ分泌细胞的数量。图11显示了每次测试时获得的值。结果，在用ZC和ZEC重组蛋白制剂免疫的组的所有非人灵长类动物中检测到IFNγ分泌细胞，这与接受安慰剂制剂的动物不同，在接受安慰剂制剂的动物中未检测到抗病毒细胞因子分泌细胞。
为了评估经免疫的动物中抗寨卡病毒的保护能力，在最后一次免疫后两个月(第180天)，用感染性病毒(ZIK16病毒株，103UPF/mL)攻击所有动物。通过使用动物血清在Vero细胞中直接定量来确定寨卡病毒血症。图12显示了获得的结果，其表示为平均值±SEM。如可看到的，接受安慰剂制剂的动物平均9天出现病毒血症，并且平均病毒载量为400PFU/ml。在用组合制剂ZC+ssDNA免疫的组的情况下，其中一只灵长类动物得到完全保护，其余三只动物平均为6天出现病毒血症，并且与安慰剂组相比病毒载量较低(具有统计显著性)。相反地，用ZEC+ssDNA制剂免疫的动物没有出现病毒血症，并且受到完全保护(病毒载量<10PFU)。总的来说，嵌合抗原ZC和ZEC(在其与ssDNA和作为佐剂的氧化铝组合后以聚集形式存在)诱导了能够在非人灵长类动物中控制寨卡病毒复制的免疫反应。

Claims (13)

1.一种重组嵌合抗原，其在其多肽链中包含对应于寨卡病毒衣壳蛋白的第2至第104个氨基酸的多肽或具有与寨卡病毒衣壳蛋白的所述区域具有几乎90％的同一性的氨基酸序列的多肽。
2.根据权利要求1的嵌合抗原，所述嵌合抗原额外包含对应于包膜蛋白结构域III的多肽或具有与寨卡病毒包膜蛋白的该结构域具有几乎90％的同一性的氨基酸序列的多肽。
3.根据权利要求1的嵌合抗原，所述嵌合抗原在其多肽链的N末端中额外包含六个组氨酸残基的区段。
4.根据权利要求1的嵌合抗原，所述嵌合抗原具有标识为SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的氨基酸序列。
5.一种疫苗组合物，其包含根据权利要求1至4的重组嵌合抗原和药学上批准的疫苗佐剂。
6.根据权利要求5的疫苗组合物，其中所述佐剂是铝盐。
7.根据权利要求5的疫苗组合物，其中所述抗原以每剂量10-150微克的量存在。
8.根据权利要求5的疫苗组合物，所述疫苗组合物额外包含具有标识为SEQ ID NO:11的核苷酸序列的核酸。
9.根据权利要求1至4中任一项的重组嵌合抗原用于制备用于诱导抗寨卡病毒的免疫反应的药物的用途。
10.一种用于在人中诱导抗寨卡病毒的免疫反应的方法，其中施用药物有效量的根据权利要求1至4中任一项的重组嵌合抗原和药学上批准的佐剂。
11.权利要求10的方法，其中所述佐剂是铝盐。
12.权利要求10的方法，其中所述重组嵌合抗原的药物有效量在每剂量10-150微克的范围内。
13.权利要求10的方法，其中与所述重组嵌合抗原组合额外施用具有标识为SEQ IDNO:11的核苷酸序列的核酸。
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