CN117965579B - 麦属特异转座子h2a.1及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种麦属特异转座子H2A.1及其应用，所述转座子H2A.1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。其可以起到增强子的作用，提高目的基因的表达。本发明通过构建转座子H2A.1的烟草瞬时转化载体，利用农杆菌侵染法转化本式烟草，获得瞬时过表达烟草，验证转座子激活基因的功能。分析结果表明该转座子可以激活目的基因的转录，并且不受到现有目的基因的影响，可以无差别的激活下游目的基因，并且激活的强弱与TSS位置成正相关，距离TSS位置越近激活效果越强，反之效果变弱。该结果提供了小麦过表达目的基因的新思路，仅通过引入一段221bp的片段就可以大幅度的提高目的基因的转录水平，提供了切实可用的过表达序列资源。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种可以作为增强子激活目的基因转录的麦属特异转座子H2A.1及其应用。
背景技术
普通小麦 (Triticumaestivum L., 2n=6x=42, AABBDD) 是世界三大作物之一，也是人类日常生活中的主要粮食作物，其广泛的世界分布显示了小麦强大的环境适应性，这被归因于三套适应不同环境基因组的融合，小麦的环境适应性和自身庞大的转座子序列息息相关，但是目前在小麦中对转座子的研究十分匮乏，还没有针对转座子功能的相关报道，而针对小麦转座子的功能研究不仅可以更好的解析小麦基因功能，也可以对小麦育种加以指导。
转座子（Transposable elements/TE）也被称作“跳跃基因”，是大多数真核生物基因组中最大的组成部分。在植物基因组中根据转座机制的不同，可以将转座子分为三大类：I类转座子，II类转座子和 Helitrons 转座子。I类转座子（逆转座子）是通过类似“复制粘贴”机制进行转座，是植物中最常见的一类转座子。首先通过RNA Polymerase II以该转座子的基因组序列为模板转录mRNA，mRNA 在逆转录酶的作用下逆转录合成extrachromosomalliner DNA（eclDNA），然后在整合酶的作用下插入植物基因组的其他位置完成转座。I类转座子又可以分为LTR逆转录转座子（长末端重复序列，Long TerminalRepeated）和非 LTR 逆转录转座子。II类转座子的作用机制类似“剪切粘贴”，转座子会在自身编码的转座酶的作用下从染色体特定位置“切除”，再重新插入到染色体新的位置上。而原位置因DNA转座酶的作用形成的断链完成自我的DNA修复，即完成转座。和I类转座子一样，II类转座子也分为自主型和非自主型两种。Helitrons 转座子是近年来发现的一种新型通过“滚环”机制转座的DNA 转座子，最初是利用基于重复序列的计算方法在拟南芥基因组中被鉴定出来的。Helitrons 转座子发生转座时通常会插入AT-repeat的区域。
转座子在跳跃的过程可能产生新基因或会导致功能基因表观修饰的变化，但是转座子一个最重要的功能是调节功能基因的表达，转座子会作为增强子或者抑制子激活或者沉默功能基因表达，如玉米中的TB1基因，逆转座子Hopscotch在TB1的上游，可能通过影响染色质开放程度影响到TB1的基因表达进而造成了玉米和蜀黍之间的性状分化。
转座子作为一种新型高效的转基因工具，正在被广泛地研究与应用于转基因育种了，基因功能研究等方面，具有广阔的前景。而在小麦中鉴定并研究转座子的生物学功能，除了可以进一步理解小麦功能基因的功能，另一方面也可以指导小麦育种，提供小麦育种所需的功能序列资源。总的来说，鉴定更多小麦转座子并探究其功能，对于基因功能研究、育种等具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一个可以增强目的基因转录水平的转座子。发明人在小麦中（Triticumaestivum L.）鉴定并克隆了一个麦属特异的转座子H2A.1，该转座子序列只在麦属植物中出现，如小麦，大麦，黑麦等等。通过烟草瞬时转化系统发现了转座子H2A.1可以作为增强子显著激活目的基因的表达水平，将转座子H2A.1插入启动子不同位置时发现可以H2A.1距离TSS（转录起始位点）位置越近激活转录的作用越强，反之激活转录的作用越弱。将H2A.1分成三段发现分段的转座子激活作用大幅度下降，这提示我们完整的转座子序列才能发挥最大的转录激活效果。
麦属特异的转座子H2A.1，其中，来源于小麦品种中国春的转座子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其DNA长度为211bp，在小麦中的位置为：chr2A：759451668-759451888，属于Helitrons 转座子。
本发明还提供了野生一粒小麦（Triticummonococcum.），栽培一粒小麦（Triticummonococcum L.），野生二粒小麦（Triticumturgidum var. dicoccoides），栽培二粒小麦（Triticumdicoccoides Korn），乌拉尔图小麦（Triticumurartu Thum.ex Gandil.），大麦（Hordeumvulgare.），黑麦（Secalecereale L.），长穗偃麦草（Elytrigiaelongata (Host) Nevski）的转座子H2A.1同源转座子的序列，该序列一并在本发明的保护范围之内。其中野生一粒小麦中H2A.1同源转座子的序列如SEQ ID NO.2所示，栽培一粒小麦中H2A.1同源转座子的序列如SEQ ID NO.3所示，硬粒小麦中H2A.1同源转座子的序列如SEQ ID NO.4所示，栽培二粒小麦中H2A.1同源转座子的序列如SEQID NO.5所示，乌拉尔图小麦中H2A.1同源转座子的序列如SEQ ID NO.6所示，大麦中H2A.1同源转座子的序列如SEQ ID NO.7所示，长柄偃麦草中H2A.1同源转座子的序列如SEQ ID NO.8所示，黑麦中H2A.1同源转座子的序列如SEQID NO.9所示。
本发明还公开还提供了一种促进基因表达的转座子的应用，该应用包括：将所述转座子用于作物分子遗传改良，具体地，将所述转座子H2A.1插入到目的基因的启动子的上游位置用于增加目的基因的表达量。更加具体地，将转座子插入报告基因的TSS（转录起始位点）上游可以显著激活目的基因的转录，可以通过基因编辑的方法将这段序列插入小麦的基因组中提高目的基因的转录水平。
本发明的转座子可用于在单子叶植物（小麦）和双子叶植物（本式烟草）中。
本发明的转座子可通过常规的合成方法制备。
本发明的转座子H2A.1可以应用于小麦和烟草的功能基因的激活当中，具有普适性。
本发明的转座子可添加于单子叶和双子叶植株中过表达表达载体，用于增强启动子转录活性，促进目的基因的表达。所述表达载体的启动子可以是35Smini启动子、小麦功能基因启动子等。如本发明实施例列举的，所述表达载体包括单子叶植物中常用的35Smini启动子，同时也测试了小麦MYB转录家族一个基因的启动子。
利用本发明的转座子在植物中过表达目的基因的方法为：将本发明所示的转座子H2A.1的DNA序列插入装有植物目的基因DNA序列的过表达载体启动子的靠近TSS的位置，而后将该过表达载体通过农杆菌转染至小麦或烟草中表达目的蛋白。
一种利用转座子H2A.1提高小麦中目的基因转录水平的方法，所述方法为以下（1）或（2）：
（1）通过基因编辑手段，将转座子H2A.1导入目的基因的启动子位置，获得目的基因高表达的小麦植株，增强目的基因的表达，获得对应的转基因小麦植株；
（2）通过无缝克隆方法，将转座子H2A.1体外构建至过表达载体中，通过农杆菌侵染转入小麦植株当中，直接增强目的基因的表达。
另外，还可以通过无缝克隆方法，将转座子H2A.1体外构建至过表达载体中，通过农杆菌侵染转入瞬时转化受体植物，在受体植物中过表达目的基因。所述受体植物可以为任何可以适合转化的植物，包括但不仅仅限于本式烟草。
本发明提供了转座子应尽量靠近TSS位置以获得更大的转录激活水平的证据。我们把221的转座子分成了三段（66bp，98bp，103bp），发现其中第一段（66bp）和第三段（103bp）都有转录激活的作用，但是激活倍数比221bp的片段低（图5A，B），提示我们转座子需要完整的片段来发挥增强子的功能。
本发明还提供了单子叶植物和双子叶植物的激活实例，所述受体植物使用农杆菌进行转染。所述的植物包括普通小麦和本式烟草。
本发明的优点：
本发明找到了一段麦属特异的Helitrons转座子H2A.1，所述转座子H2A.1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。其可以起到增强子的作用，提高目的基因的表达。本发明通过构建转座子H2A.1的烟草瞬时转化载体，利用农杆菌侵染法转化本式烟草，获得瞬时过表达烟草，验证转座子激活基因的功能。分析结果表明该转座子可以激活目的基因的转录，并且不受到现有目的基因的影响，可以无差别的激活下游目的基因，与未插入转座子H2A.1的启动子相比，插入转座子H2A.1的启动子相比可以大幅度的增强目的基因的转录水平，并且激活的强弱与TSS位置成正相关，距离TSS位置越近激活效果越强，反之效果变弱。该结果提供了小麦过表达目的基因的新思路，仅通过引入一段221bp的片段就可以大幅度的提高目的基因的转录水平，提供了切实可用的过表达序列资源。
附图说明
图1是鉴定转座子H2A.1的位置和明确激活功能；图1A显示MYB转录因子两种不同等位基因启动子区不同变异位点及对应激活报告基因的能力；图1B显示A中对应启动子载体在本式烟草中的报告基因的转录水平展示。
图2是转座子H2A.1在麦属不同物种中的进化树，该转座子序列只在麦属中存在。
图3是转座子起到了增强子的作用；图3A显示转座子（TE）与启动子35Smini融合后的载体图；图3B显示转座子和两段随机的200bp左右的序列插入启动子同一位置的激活效果。
图4是在同一启动子不同位置插入转座子H2A.1的激活效果展示；显示在启动子不同位置插入转座子H2A.1（距离转录起始位点TSS的距离越近激活效果越强）。
图5是转座子H2A.1分段激活作用展示；图5A显示转座子H2A.1分段长度和载体展示；图5B显示分段序列对报告基因的激活作用。
具体实施方式
下面将通过具体实施例对本发明进行详细的描述。提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。如无特殊说明，所采用的试剂及材料，均可以通过商业途径获得。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
除非另有说明，本发明的实施将使用本领域技术人员显而易见的植物学常规技术、组织培养、分子生物学、化学、生物化学、DNA重组技术。这些技术均在已经公开的文献中进行了充分解释，另外，本发明所采用的系统发育树的构建、瞬时表达植物获得等方法，除了下述实施例采用的方法外，采用现有文献中已经公开的方法均能实现。
生物材料
瞬时表达的本式烟草在实验室温室种植；
烟草瞬时转化系统的瞬时表达载体MYBs-Pro-CS/KN9204/Vector1/ Vector2/Vector3/ Vector4，CP462空白载体，CP462+TE，KN-KN92404/KN9204+TE/KN9204+2A/KN9204+2B,KN-KN9204+Nru/KN9204+Stu，KN-KN+TE/KN+TE1/KN+TE2/KN+TE3为实验室所保存。
大肠杆菌DH5α和农杆菌GV3101为实验室保存；
引物合成及测序，由华大基因公司和睿博公司完成。
实验试剂
烟草瞬时转化测试试剂购买自promaga公司；
各种核酸内切酶购买自莫纳生物科技有限公司；
一步克隆酶购买自金沙生物生物科技有限公司；
质粒小量提取试剂盒和凝胶回收试剂盒购买自北京天根生物技术有限公司；
扩增片段mix购买自诺维赞生物科技有限公司；
T4连接酶购买自碧云天生物科技有限公司。
实施例1来自小麦品种中国春的转座子H2A.1的鉴定和激活作用的验证
转座子H2A.1插入提供了两个等位基因之间的表达量差异：为了探究不同等位基因表达差异的原因，发明人组合两个等位基因的启动子序列通过烟草瞬时转化报告系统进行验证。通过构建对应的报告载体，转化农杆菌瞬时转化本式烟草，24℃三天后使用酶标仪测量荧光虫荧光强度和海参荧光素强度（内参）。通过对小麦目标基因不同单倍型的代表性的品种CS和KN9204的启动子（~2.2Kb），并且根据不同的转座子H2A.1的位置组合CS和KN9204的启动子序列与报告基因融合，测试不同组合的启动子与转录活性的关系，以确定关键的变异位点。通过烟草瞬时表达系统我们发现221bp的转座子插入与转录活性紧密相关，含有转座子插入的启动子序列可以显著的提高报告基因的转录活性，提示我们这段221bp的转座子片段可能是关键的变异位点（图1A，B），经过测序，这个221片段的核苷酸序列为：
TATATGGGTGTGTCTAGGGCACATCTAGATATGCTCTAATTATTGCACATCTAAGTGAGTGAATCAAGCATAAAAGAAAAAGAAAAAAATATTGACACGAATCTTAATGTAAGATCAATGACATATGGCTTAGATGTGCAATACTTATGGCACATCTTTATGTGCTTTAGCAAAACTGTATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATAT（如SEQ ID NO.1所示）。
并且，经过验证，野生一粒小麦（Triticummonococcum.），栽培一粒小麦（Triticummonococcum L.），野生二粒小麦（Triticumturgidum var. dicoccoides），栽培二粒小麦（Triticumdicoccoides Korn），乌拉尔图小麦（Triticumurartu Thum.ex Gandil.），大麦（Hordeumvulgare.），黑麦（Secalecereale L.），长穗偃麦草（Elytrigiaelongata (Host) Nevski）的转座子H2A.1同源转座子的序列均具有同样的功能。其中野生一粒小麦中H2A.1同源转座子的序列如SEQ ID NO.2所示，栽培一粒小麦中H2A.1同源转座子的序列如SEQ ID NO.3所示，硬粒小麦中H2A.1同源转座子的序列如SEQID NO.4所示，栽培二粒小麦中H2A.1同源转座子的序列如SEQ ID NO.5所示，乌拉尔图小麦中H2A.1同源转座子的序列如SEQ ID NO.6所示，大麦中H2A.1同源转座子的序列如SEQIDNO.7所示，长柄偃麦草中H2A.1同源转座子的序列如SEQ ID NO.8所示，黑麦中H2A.1同源转座子的序列如SEQ ID NO.9所示。
实施例2转座子H2A.1是麦属的特异转座子
得到转座子的具体位置和序列之后，通过Blast在Ensembl genome（ https://ensemblgenomes.org/）网站中与水稻，拟南芥，小麦，大麦，燕麦，玉米的基因组进行比对发现，在麦属植株（小麦，大麦，燕麦等）中存在与H2A.1相似的转座子序列，但是在玉米，水稻，拟南芥等物种并没有相似序列（图2）。表明转座子H2A.1是麦属特异的转座子，可以应用于麦属物种当中，不仅限于普通小麦。
实施例3转座子作为增强子激活目的基因的表达
构建相应的表达载体转化农杆菌之后侵染本式烟草（与上述转化和处理方法相同）。结果发现将转座子和35S mini融合启动报告基因，可以发现转座子同样可以显著的提高报告基因的表达（图3A），同时我们将转座子和两段小麦基因组的随机序列插入KN启动子的相同位置，同样只有转座子可以激活报告基因表达，进一步证明了转座子作为增强子的作用（图3B），同时也提示我们转座子H2A.1既可以激活小麦的功能基因，也可以激活烟草的功能基因，具有普适性。同时我们发现转座子插入的位置和启动效果有明显的相关性，通过将转座子插入启动子的不同位置发现，转座子位置距离TSS越近转录激活效果越强，这表明转座子作为增强子作用可以受到位置的影响（图4）。为了进一步探究转座子本身的激活作用来源，我们把221的转座子分成了三段（66bp，98bp，103bp），发现其中第一段（66bp）和第三段（103bp）都有转录激活的作用，但是激活倍数比221bp的片段低（图5A，B），提示转座子需要完整的片段来发挥增强子的功能。
Claims (7)
1.麦属特异转座子H2A.1，其特征在于，所述转座子H2A.1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述的转座子H2A.1在提高植物目的基因转录水平中的应用，其特征在于，将所述转座子 H2A.1 插入目的基因的启动子区，距离转录起始位点178bp处，所述植物为小麦或烟草。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，通过构建转座子目的基因载体，获得转录激活目的基因表达的瞬时表达小麦或烟草植株。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述转录激活表现为：在转座子H2A.1插入目的基因启动子区时，含有转座子的目的基因的蛋白水平显著高于启动子不存在转座子H2A.1的对照目的基因。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述转座子H2A.1作为增强子激活目的基因的表达。
6.一种利用权利要求1所述的转座子H2A.1提高小麦中目的基因转录水平的方法，其特征在于，所述方法为以下（1）或（2）：
（1）通过基因编辑手段，将转座子H2A.1导入目的基因的启动子区，距离转录起始位点178bp处，获得目的基因高表达的小麦植株，增强目的基因的表达，获得对应的转基因小麦植株；
（2）通过无缝克隆方法，将转座子H2A.1体外构建至过表达目的基因的载体中，将转座子H2A.1导入目的基因的启动子区，距离转录起始位点178bp处，通过农杆菌侵染转入小麦植株当中，直接增强目的基因的表达。
7.一种利用权利要求1所述的转座子H2A.1提高受体植物中目的基因转录水平的方法，其特征在于，所述方法为：通过无缝克隆方法，将转座子H2A.1体外构建至过表达目的基因的载体中，将转座子H2A.1导入目的基因的启动子区，距离转录起始位点178bp处，通过农杆菌侵染转入瞬时转化受体植物，在受体植物中过表达目的基因，所述受体植物为烟草。
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