CN117965349A - 枯草芽孢杆菌、利用其制备的微生物菌剂、生物有机肥及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物菌种及其应用，特别是指一种枯草芽孢杆菌、利用其制备的微生物菌剂、生物有机肥及应用。本发明提供了一株广泛应用于盐碱地多种植物的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC No.29208，该菌株耐盐度为5％，具有较高的溶磷、固氮、产嗜铁素、IAA和ACCD能力，对镰刀菌、小斑菌、腐霉菌、弯孢菌均有较强的拮抗作用，适于具有防病、促生、抗盐碱等多功能生物有机肥料的生产，应用于盐碱地粮食作物和牧草的生产上，其促进出苗、根系发育、防控根部病害、提高作物产量等效果显著，可减少化肥农药的使用，同时促进了养殖粪便的还田利用，应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明涉及微生物菌种及其应用，特别是指一种枯草芽孢杆菌、利用其制备的微生物菌剂、生物有机肥及应用。
背景技术
随着社会的发展和人口的增加，对耕地资源的需求越来越多。盐碱地是重要的潜在耕地资源。因不合理耕作和施肥用药，菜田普遍次生盐渍化，发生土壤退化。盐碱地和退化土壤生产性能低下，导致病害加剧，产量、品质下降，影响产业竞争力和消费者健康。加强盐碱地综合利用是实现耕地扩容和提高土地质量的有力措施，也是保障国家粮食安全和端牢中国饭碗的重要手段。我国盐碱地面积大、类型多、分布广，部分地区耕地盐碱化趋势加剧。目前可利用生物有机肥进行盐碱地的改良与利用，这种方式具有投资少，见效快，效益高的特点，并且可以促进养殖粪便的还田利用，促进种养循环，从而实现盐碱地耕地质量和产能提升。
芽孢杆菌易存活，抗逆性强，广泛分布在各类土壤、植物。目前已经有许多具有促生抗病的菌株制作成微生物肥料或微生物农药，但主要应用于常规土壤生产上，有机肥的载体多数为鸡粪，牛粪为载体的生物有机肥，特别是适用于盐碱地的优良芽胞杆菌生物有机肥还很少，亟待加强相应研发工作，挖掘应用潜力。
申请号为202211572815.8的发明专利申请中公开了一种碱蓬内生贝莱斯芽孢杆菌及其应用，菌种保藏编号为CCTCC NO.M20221277，该发明的贝莱斯芽孢杆菌对化学杀菌剂和盐具有较好的耐受性，能够显著降低土壤中的盐碱含量，并对番茄灰霉病菌、花生白绢病菌、番茄枯萎病菌、黄瓜枯萎病菌、草莓根腐病菌等病菌具有防治效果，抑制率在54.3％～65.7％以内,有助于盐碱地经济作物的增产增收但未进行量化效果的说明。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种具有高耐盐、促进植物生长，减少植物疾病的盐碱地应用的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC No.29028。
本发明中的菌种从河北省海兴县中度盐碱土壤(0.58％，pH＝8.28)苦菜根际分离得到。该菌株于2023年11月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，保藏编号为CGMCC No.29208，保藏机构的地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所(简称CGMCC)。
该菌种的菌落形态及生理生化特性如下：
该菌株菌落呈不规则圆形，白色不透明，菌落褶皱，无荚膜，通过革兰氏染色显微观察，为革兰氏阳性、杆状。通过菌株形态学特征，生理生化特征和16SrRNA序列分析将该菌株鉴定为枯草芽孢杆菌。可形成内生芽孢，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。
该菌株耐盐度为5％。
在自然条件下，该菌株可定殖于多种植物根际，能溶磷，固氮，产嗜铁素、IAA和ACCD促进植物生长以及抑制病原真菌的物质。
该菌株的培养：使用LB培养基(酵母粉5克，胰蛋白胨10克，氯化钠5克，琼脂15克，蒸馏水1000毫升)。
该菌株的扩培方法：
1、斜面菌种培养：将该菌株接入试管斜面，培养温度为30℃～35℃，pH值＝6.8～7.2，培养时间1～2天，用无菌水振荡30分钟后，10倍稀释后用血球计数板计数，活菌数≥109cfu/mL。
2、摇瓶培养：按照0.5％～2％的接种量将斜面菌种接种到装有培养基的三角瓶中，在温度为30℃～35℃，pH值＝6.8～7.2、转速200转/分钟的条件下培养24～48小时，使活菌数达到109cfu/ml。
上述培养基为：酵母粉5.0克；胰蛋白胨1.0克；葡萄糖2.0克；磷酸氢二钾0.5克；硫酸镁0.5克；蒸馏水1000毫升；pH＝6.8～7.2。
3、发酵：按照10％～30％的装液量在三角瓶内置入灭菌后的发酵培养基，按照接种量为1％～5％、温度30℃～35℃的条件培养24～48小时；或按40％～80％的装量在发酵罐内置入灭菌后的发酵培养基，按照种子液的接种量为2％～10％、温度为30℃～35℃，通气量0.4～0.6立方米/小时，搅拌速度150～200转/分钟，溶氧70％～75％，采用硅类消泡剂或食用豆油消泡，培养36～48小时，使活菌数达到1010cfu/ml。
发酵培养基由如下原料组成：氮源5克～15克，碳源5克～15克，MgSO41克～5克，磷酸二氢钾1克～5克，NaCl 1克g～5克，水1000毫升，pH＝6.8～7.2。氮源选用豆粕粉、胰蛋白胨、酵母浸膏中的一种或其结合，碳源选用玉米淀粉，玉米浆，糖蜜中的一种或其结合。
本发明的目的之二是提供含有枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCCNo.29208的微生物菌剂。
本发明的目的之三是提供含有枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCCNo.29208的生物有机肥。
本发明的目的之四是提供含有枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCCNo.29208，含有其的发酵液、微生物菌剂或生物有机肥在促进盐碱地植物生长中的应用。
本发明的目的之五是提供含有枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCCNo.29208，含有其的发酵液、微生物菌剂或生物有机肥在防控植物病害中的应用，所述植物病害的病原菌为腐霉菌、镰刀菌、弯孢菌、小斑菌和疫霉菌。
具体地，所述的粮食作物选用粮食作物和牧草。
具体地，是将牛粪及蔗糖渣混合均匀后腐熟，将枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)CGMCC No.29028的菌悬液或含有其的发酵液与腐熟物料混合均匀，制成含活菌数达到2×108cfu/g的生物有机肥。
具体地，所述的生物有机肥是牛粪与蔗糖渣按7：3混合后充分腐熟，将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC No.29208的菌悬液或含有其的发酵液与腐熟后的物料混合均匀，制成活菌数≥2×108cfu/g的生物有机肥，用于调控盐碱地粮食作物和牧草的生长。
本发明所具备的实质性特点和取得的显著技术进步在于：
本发明筛选获得了一株可广泛应用于盐碱地多种植物的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)CGMCC No.29208，该菌株耐盐度为5％，经申请人实验证实，该菌种具有较高的溶磷、固氮、产嗜铁素、IAA和ACCD能力，对镰刀菌(Fusarium)、小斑菌(Bipolaria maydis)、腐霉菌(Pythium)、弯孢菌(Curvularia lunata)均有较强的拮抗作用，适于具有防病、促生、抗盐碱等多功能生物肥料的生产，应用于盐碱地粮食作物和牧草的生产上，其促进出苗、根系发育、防控根部病害、提高作物产量等效果显著，可减少化肥农药的使用，同时促进了养殖粪便的还田利用，应用前景广阔。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步描述，但不作为对本发明的限定，本发明的保护范围以权利要求记载的内容为准，任何依据本发明的说明书所做出的等效手段替换，均不脱离本发明的保护范围。
实施例1
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC No.29208的形态和鉴定
1、菌株的形态学特征
在LB平板上形成不规则圆形，白色不透明，菌落褶皱的菌落，LB液体培养基中混浊生长，表面有层菌皱膜。经革兰氏染色，镜下可见革兰阳性杆菌，位于菌体中央或稍偏的内生芽孢，芽孢形成后菌体不膨大。
2、菌株生理生化特性
实验证实该菌株可以在含盐量为5％的LB平板上生长。经实验发现，该菌株具备溶磷，固氮，产嗜铁素、IAA和ACCD的能力。IAA生成量为30.89μg/mL。ACCD酶活为8.05mM/mg/h。
3、菌株鉴定与保藏
通过16SrDNA序列分析、综合菌体形态、生理生化特性和16SrDNA基因序列，可知本申请中的菌种为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。该菌株于2023年11月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(该保藏机构简称CGMCC，位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.29208，分类名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
实施例2
含有枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC No.29208生物有机肥制备
将甘油管保存的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC No.29208菌液接种到LB固体培养基上进行活化，35℃培养1天，将单菌落接种到种子培养基中，35℃，200转/分钟，培养16小时到对数后期时，按质量比为1％的接种量再进行转接培养一次后获得的菌液即为种子液。以此种子液进行发酵。按60％的装量向发酵罐内投入灭菌后的发酵培养基，按照种子液的接种量为5％、温度为35℃，通气量0.5立方米/小时，搅拌速度200转/分钟，溶氧75％，食用豆油消泡，培养24～28小时制成发酵液，使活菌数达到1010cfu/ml。
发酵培养基由如下原料组成：
豆饼粉10克，酵母浸膏5克，玉米淀粉15克，硫酸镁1克，磷酸二氢钾2克，氯化钠2克，水1000毫升，pH＝7.2。
有机肥的制作是将牛粪与蔗糖渣按7：3混合后，充分腐熟获得有机肥，氮磷钾含量5.0％，将发酵液喷洒在有机肥上混合均匀，制备成活菌含量大于2×108cfu/g的生物有机肥。
实施例3
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC No.29208抗镰刀菌、小斑菌、腐霉菌、弯孢菌试验
LB平皿中心接种供试真菌菌块，于距平皿中心2.5厘米处对称放置4张直径为6毫米的小滤纸片，每张纸片上滴加10微升枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCCNo.29208菌液，每个处理重复3次，30℃培养；对照为LB平皿中心接种供试真菌菌块，于距平皿中心2.5厘米处对称放置4张直径为6毫米的小滤纸片，每张纸片上滴加无菌水10微升，每个处理重复3次，30℃培养。待对照组真菌长满平板或长至纸片时取出平皿，测量真菌直径，计算抑制率。
抑制率(％)＝〔1-(试验组真菌直径/对照组真菌直径)〕×100
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC No.29208对镰刀菌、小斑菌、腐霉菌、弯孢菌均有抑制作用，具体结果见表1。
由表1可知，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC No.29208对病原真菌的抑菌率较高，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC No.29208对镰刀菌、小斑菌、腐霉菌、弯孢菌的抑制率分别为90.98％，73.43％，68.00％和88.28％。
表1枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC No.29208拮抗病原真菌的抑制结果
实施例4
含有枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC No.29208的生物有机肥在盐碱地小麦田间试验
田间试验地点设在河北省沧州市海兴县，土壤含盐度为0.21％。试验设4个处理，处理1为含枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC No.29208生物有机肥，160千克/亩，处理2为商品化的生物有机肥(菌株为地衣芽孢杆菌，载体为牛粪)，160千克/亩，处理3为不含枯草芽孢杆菌的有机肥，160千克/亩，处理4常规施肥，磷酸二铵(NP64％)15千克/亩。肥料先撒施，再翻地，采用常用的播种机，其它田间管理措施相同，最终测量玉米(郑单958)产量。
从表2中可以看出，处理1效果最佳，产量较处理4增产31.57％，较处理2增产14.79％。说明含有枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC No.29208的生物有机肥在盐碱地玉米田间应用效果佳，比施化学肥料的农民习惯施肥方式增产显著。
表2含有枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC No.29208的生物有机肥在盐碱地玉米应用效果
| 处理 | 处理1 | 处理2 | 处理3 | 处理4 |
| 平均产量(千克/亩) | 514.50±9.98 | 448.88±3.78 | 432.34±9.34 | 391.03±9.55 |
实施例5
含有枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC No.29208的生物有机肥在盐碱地小麦田间试验
田间试验的地点设在河北省沧州市海兴县，土壤含盐度为0.23％。本试验设4个处理，处理1为含枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC No.29208生物有机肥，160千克/亩，处理2为市场购买生物有机肥(菌株为枯草芽孢杆菌，载体为牛粪)，160千克/亩，处理3为不含枯草芽孢杆菌的有机肥，160千克/亩，处理4常规施肥，磷酸二铵(NP64％)15千克/亩。肥料先撒施，再翻地，采用常用的播种机，其它田间管理措施相同，最终测量小麦(中捷大红芒)的根干重和产量，具体结果见表3。
从表3可以看出，最终处理1效果最佳，处理2和处理3效果无显著差异，处理1较处理2、3、4的产量分别增加14.43％、12.76％和29.91％，差异显著。
表3含有枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC No.29208的生物有机肥在盐碱地小麦应用效果
| 处理 | 处理1 | 处理2 | 处理3 | 处理4 |
| 平均根干重(克) | 11.17±0.88 | 9.02±0.13 | 9.01±0.21 | 7.65±0.35 |
| 平均产量(千克/亩) | 269.55±7.60 | 235.55±9.69 | 239.01±3.41 | 207.48±5.60 |
实施例6
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC No.29208的生物有机肥在中度盐碱地田菁上的应用
田间试验的地点设在河北省沧州市海兴县，土壤含盐度为0.51％。本试验设4个处理，4次重复，采用长方形，完全随机区组设计，小区面积10.0米×3.0米＝30.0平方米。其中供试肥料为实施例2中生产的含枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC No.29208，市场购买生物有机肥(菌株为枯草芽孢杆菌，载体为鸡粪)，含活菌数量为2×108cfu/g的生物有机肥(其中氮磷钾含量5.0％)。不含枯草芽孢杆菌的有机肥为实施例2中的有机肥，每亩40kg，空白对照不施肥，其它田间管理措施相同。
试验处理：
处理1：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC No.29208生物有机肥
处理2：市场购买生物有机肥
处理3：不含枯草芽孢杆菌的有机肥
处理4：空白对照
播种后80天进行刈割，统一留茬高度为离地20公分。收割前直接观察可见，处理1地块的田菁长势最佳，平均株高213cm，1m2平均株数135株，表现为根多茎粗，草群密度更大，平均高度最高，达2m左右，处理2茎最细，叶色浅绿，略发黄，生长势最弱，平均株高175cm，1m2平均株数106株，处理3和处理4长势好，叶色深绿，茎粗，处理3平均株高198cm，1m2平均株数118株，处理4平均株高190cm，1m2平均株数110株。具体结果见表4。
表4小区生物量统计表(产量单位：千克)
由表4可知，试验地施用本发明中的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCCNo.29208生物有机肥比不含枯草芽孢杆菌的有机肥分别亩增产558.61公斤，增产率为23.01％，增产效果极显著；比施用市场购买生物有机肥增产1008.84公斤，增产率为51.01％，增产效果极显著；比空白对照亩增产835.42公斤，增产率为38.84％，增产效果极显著。从以上结果说明重度盐碱地上使用鸡粪为载体的生物有机肥(处理2)对田菁的生长有抑制作用，相反使用牛粪为载体的生物有机肥(处理1)或者有机肥(处理3)都对田菁的生长有促进作用。
Claims (10)
1.一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，其保藏编号为CGMCC No.29028。
2.含有权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC No.29028的微生物菌剂。
3.含有权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC No.29028的生物有机肥。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于生物有机肥是将牛粪及蔗糖渣混合均匀后腐熟，将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC No.29028的菌悬液或含有其的发酵液与腐熟物料混合均匀，制成含活菌数达到2×108cfu/g的生物有机肥。
5.如含有权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCCNo.29028或含有其的发酵液或权利要求2所述的微生物菌剂或权利要求3所述的生物有机肥在促进盐碱地植物生长中的应用。
6.如含有权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCCNo.29028或含有其的发酵液或权利要求2所述的微生物菌剂或权利要求3所述的生物有机肥在防控植物病害中的应用，所述植物病害的病原菌为腐霉菌、镰刀菌、弯孢菌、小斑菌和疫霉菌。
7.根据权利要求4～6中任一项所述的应用，其特征在于所述的植物为粮食作物及牧草。
8.根据权利要求4～6中任一项所述的应用，其特征在于所述的含有枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC No.29028的发酵液是将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC No.29028接种于灭菌后且含有碳源、氮源及无机盐的培养基中通气发酵后获得，培养基中的氮源选用豆粕粉、胰蛋白胨、酵母浸膏、酵母粉中的一种或其结合，碳源选用玉米淀粉、玉米浆、糖蜜、葡萄糖、酵母膏、酵母粉中的一种或其结合。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述的培养条件如下：按照10％～30％的装量在三角瓶内放入灭菌后的发酵培养基，按照接种量为1％～5％、温度30℃～35℃的条件培养24～48小时；或按照40％～80％的装量在发酵罐内放入灭菌后的发酵培养基，按照种子液的接种量为2％～10％，温度为30℃～35℃，搅拌速度150～200转/分钟，溶氧70％～75％，培养36～48小时，使活菌数达到1010cfu/ml。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于所述的发酵罐培养中通气量为培养过程中通气量0.4～0.6立方米/小时，培养过程中采用食用油或硅类消泡剂消泡。
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