CN117964694A - 一种特异性促进Nrf2基因表达的多肽及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种特异性促进Nrf2基因表达的多肽及其应用，属于生物技术领域。本申请通过构建Nrf2激动剂的筛选模型，筛选得到特异性激活Nrf2的活性肽PEP‑129，该多肽通过激活Nrf2的活性，有效保护脐带间充质干细胞免受氧化应激和各种内外源性有毒物质的损伤，进而有效的促进了人脐带间充质干细胞的增殖。同时，实验发现，该多肽还能使传代衰老的人脐带间充质干细胞恢复增殖能力，例如使P10代细胞增殖能力相较于P5代恢复至93.5％。此外，采用含有PEP‑29培养的人脐带间充质干细胞，具有较好的抗氧化活性，可发挥抗衰老效果，应用于制备具有抗衰老作用的化妆品或药物组合物中。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种特异性促进Nrf2基因表达的多肽及其应用。
背景技术
当人体达到一定的年纪后，人体的代谢功能和各项系统功能的运行就会变慢，从而导致了人体细胞的更新和复制功能变慢，这就导致了衰老。导致衰老的因素可分为内部因素和外部因素，其中最重要的一个因素就是身体里干细胞的数量在减少。干细胞能够进行广泛的自我更新和扩张，并有可能分化成任何类型的体细胞组织，从而对人体进行修复，以达到抗衰老的目的。干细胞可用于再生医学、重建手术和组织生物工程，并且可以源自各种组织。另外，干细胞是人体各种组织和器官的重要构成部分，其在维持人体的正常功能运行和修复受损组织器官上有着重要的作用。如果某个组织器官内的细胞受损，干细胞就会分化成为该组织器官的细胞对其进行修复；同时干细胞还具有自我更新复制功能。
其中，人脐带间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)疗法作为治疗不同疾病的治疗选择而备受关注。由于来自新鲜分离组织的细胞群不足，临床使用前需要进行体外增殖。然而，要获得足够数量的细胞供临床使用，需要进行体外增殖，这可能还会导致细胞老化，直接影响细胞治疗的成功。因此，如何控制人脐带间充质干细胞的质量并选择高质量的细胞进行应用对于细胞治疗具有重要意义。
人脐带间充质干细胞自身在培养过程中生长缓慢，如何获得高质量、高产量的人脐带充质干细胞是目前研究的重点方向。虽然研究中提高人脐带间充质干细胞的方法很多，如使用人参皂苷Rg1(Ginsenoside Rg1)来提高干细胞的增殖活性，但其昂贵的价格，限制了其大规模的应用。另外，分离的人脐带间充质干细胞本身容易出现复制衰老，需要进一步的提高人脐带间充质干细胞自身的活性，来提高利用价值。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明的提供一种特异性促进Nrf2基因表达的多肽及其应用。
本发明通过以下技术方案实现：
第一方面，本发明提供一种特异性促进Nrf2基因表达的多肽，该多肽的氨基酸序列为：Leu-Asp-Glu-Glu-Asn-Gly-Glu-Leu。
转录调控因子Nrf2是调控体内细胞氧化应急反应的关键因子，属于CNC-bZiP转录因子家族的核转录因子。它通过调控体内一系列的抗氧化蛋白及解毒保护基因，提高细胞的存活能力，因此Nrf2也被称为体内抗氧化、抗细胞衰老及保护细胞活度的总开关。大量的研究表明氧化应急反应是体内许多疾病发生发展的始发或关键因素。Nrf2通过调控氧化应急反应与糖尿病、肿瘤、肝脏疾病、肾脏疾病、呼吸系统疾病、神经系统疾病、皮肤疾病、代谢性疾病及重金属中毒等人体多种疾病的发生发展有密切的关系。同时，发明人发现，Nrf2激动剂本身可以促进人脐带间充质干细胞的增殖，抑制其衰老。
本申请通过构建的Nrf2激动剂筛选模型，筛选得到特异性促进Nrf2的多肽。筛选Nrf2激动剂的方法包括：
(1)将Keap1 Kelch结构域克隆到载体的Nde I位点和BamH I位点之间，表达并纯化重组的Keap1结构域蛋白。
(2)高通量筛选反应体系：
使用96孔板进行高通量筛选。每个孔的最终体积为200μL，其中包含50μL10nMFITC-Nrf2肽和50μL 100nM Keap1蛋白。
50μL HEPES缓冲液作为对照组(Amax)；
50μL不同浓度的多肽样品作为测试组(Aobs)；
使用50μL HEPES缓冲液替换Keap1蛋白，并添加50μL HEPES缓冲液作为空白组(Amin)；
将96孔板以300g离心5分钟，以除去气泡并确保充分混匀。在室温下振荡孵育30分钟，测量前再次离心。使用FP荧光共振法，以485nm为激发波长测定535nm下的荧光强度值。按照下式计算抑制率：
抑制率＝((Amax-Aobs)/(Amax-Amin))×100％。
并使用y＝Amin+(Amax+Amin)/(1+10^(x-logIC50))公式进行拟合，计算IC50。
其中样品为计算机模拟构建的多肽库。通过高通量筛选，即可获得目标多肽。
第二方面，本申请提供一种上述多肽在制备提高人脐带间充质干细胞的生物活性的药物中的应用。
本申请提供的上述多肽，能够通过激活Nrf2的活性进而有效的促进了人脐带间充质干细胞的增殖，并可以使衰老的人脐带间充质干细胞恢复增殖活力。因此，可以应用在制备用于提高人脐带间充质干细胞的生物活性的药物中，其中，“生物活性”指促进人脐带间充质干细胞的增殖、恢复衰老的人脐带间充质干细胞的增殖活力、延长人脐带间充质干细胞的寿命、促进间充质干细胞的抗衰老能力。
第三方面，本申请还提供一种人脐带间充质干细胞的培养基，该培养基中包括上述多肽：Leu-Asp-Glu-Glu-Asn-Gly-Glu-Leu。
进一步地，上述培养基中所述多肽的浓度为100-1000ng/mL。
进一步地，上述培养基包括DMEM/F12基础培养基以及添加剂；
该添加剂包括8-12％的胎牛血清、浓度为100-1000ng/mL的上述多肽。
在这一方面的应用中，人脐带间充质干细胞培养在上述培养基中，由于该培养基中含有的上述多肽具有激活Nrf2的活性的作用，能够有效的促进了人脐带间充质干细胞的增殖，并可以使衰老的人脐带间充质干细胞恢复增殖活力。从而有效解决现有的培养方法在体外培养人脐带间充质干细胞过程中增殖活性低、细胞老化等问题，有效的控制了人脐带间充质干细胞的质量，并有助于选择高质量的细胞进行细胞治疗。
第四方面，本申请提供一种促进人脐带间充质干细胞增殖、活力的培养方法，其包括：
(1)将人脐带充质干细胞培养在含有8-12％胎牛血清的DMEM/F12培养基，生长至对数期；
(2)将对数期的所述人脐带充质干细胞培养液进行消化并处理成细胞悬液；
(3)将所述细胞悬液中的人脐带充质干细胞接种于细胞培养板，所述细胞培养板中含有上述培养基，进行增殖培养。
进一步地，在上述增殖培养过程中，细胞培养板上接种所述人脐带充质干细胞的密度为1000-3000个/孔，多肽的浓度为100-1000ng/mL，
上述增殖培养的条件参数为：
培养温度36-38℃，CO2浓度为4-6％，湿度为94-96％，培养时间为2-5天。
第五方面，本申请提供一种通过上述培养方法获得的人脐带间充质干细胞。
本申请通过上述培养方法，培养的人脐带间充质干细胞的细胞活力和增殖能力强，能够保持人脐带间充质干细胞良好的干细胞特性，该培养方法不仅可以用于人脐带间充质干细胞的大规模培养，所得到的人脐带间充质干细胞还可用于细胞疗法或抗衰老美容产品中，应用前景广阔。
第六方面，本申请提供一种上述人脐带间充质干细胞在制备具有抗衰老作用的化妆品中的应用。
第七方面，本申请提供一种特异性促进Nrf2基因表达的多肽在制备用于预防皮肤衰老的组合物中的应用，该多肽的氨基酸序列为：Leu-Asp-Glu-Glu-Asn-Gly-Glu-Leu。
与现有技术相比，本发明至少具有如下技术效果：
本申请通过构建Nrf2激动剂的筛选模型，筛选得到特异性激活Nrf2的活性肽PEP-129，该多肽通过激活Nrf2的活性，有效保护脐带间充质干细胞免受氧化应激和各种内外源性有毒物质的损伤，进而有效的促进了人脐带间充质干细胞的增殖。同时，实验发现，该多肽还能使传代衰老的人脐带间充质干细胞恢复增殖能力，例如使P10代细胞增殖能力相较于P5代恢复至93.5％。此外，采用含有PEP-29培养的人脐带间充质干细胞，具有较好的抗氧化活性，可发挥抗衰老效果，应用于制备具有抗衰老作用的化妆品或药物组合物中。
附图说明
图1为本发明实施例3提供的PEP-129多肽对人脐带间充质干细胞的增殖影响结果图；
图2为本发明实施例4提供的PEP-129多肽对人脐带间充质干细胞的Nrf2mRNA表达的影响；
图3为本发明实施例5提供的PEP-129多肽对衰老人脐带间充质干细胞的增殖作用。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围，实施例中未注明的具体条件，按照常规条件或者制造商建议的条件进行，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
实施例1
本实施例提供一种Nrf2激动剂，其通过上述Nrf2激动剂高通量筛选方法筛选得到：Nrf2是细胞抗氧化反应的主要调节因子，在防止氧化应激方面发挥着关键作用。Keap1促进Nrf2的多泛素化，导致其蛋白酶体降解，因此，阻止Keap1的活性会阻碍泛素-蛋白酶体系统对Nrf2的降解。
(1)获得重组Keap1结构域蛋白
使用NCBI的Homo sapiens kelch like ECH associated protein 1(KEAP1)，transcript variant 2，mRNA序列(NM_012289.4)设计如下引物，并以合成序列为模版，具体序列如表1所示，按照下述程序进行PCR扩增：
表1.PCR的引物及模版序列
以限制性内切酶NdeI、XhoI切割目的片段及载体PET-15b(5708bp)，然后转化大肠杆菌BL21(DE3)，并使大肠杆菌生长至密度约为0.6时，添加终浓度为1mM的异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷来诱导Keap1 Kelch结构域的表达。收集大肠杆菌，洗涤后，超声破碎，收集上清液，采用Ni柱和Mono Q柱进行纯化，得到Keap1结构域蛋白。
(2)高通量筛选反应体系：
使用96孔板进行高通量筛选，每个孔的最终体积为200μL，其中包含50μL10nMFITC-Nrf2肽和50μL 100nM Keap1结构域蛋白。
分为三个组：
添加50μL HEPES缓冲液作为阴性对照组(Amax)；
添加50μL不同浓度(100μM、30μM、10μM、3μM、1μM、300nM、100nM、30nM、10nM、3nM、1nM、0.3nM)的样品(如表2所示的多肽)作为测试组(Aobs)；
使用50μL HEPES缓冲液替换Keap1蛋白，并添加50μL HEPES缓冲液作为空白组(Amin)。
将96孔板以300g离心5分钟，以除去气泡并确保充分混匀。在室温下振荡孵育30分钟，测量前再次离心。使用FP荧光共振法，以485nm为激发波长测定535nm下的荧光强度值。
采用下式计算样品对Keap1结构域蛋白抑制率：
抑制率＝((Amax-Aobs)/(Amax-Amin))×100％
并利用下式进行线性拟合，计算IC50：
y＝Amin+(Amax+Amin)/(1+10^(x-logIC50))
采用小分子抑制剂THIQ(CAS No.:312637-48-2，分子式为：C33H41ClN6O2)为阳性对照组，对上述高通量筛选模型进行验证，其IC50为2.15μM，证明了阳性对照组THIQ的抑制剂浓度与抑制效果具有剂量依赖性，模型可以用于后续的筛选。
(3)结果：
高通量筛选结果如表2所示：
表2.高通量筛选结果
由表2可见，通过高通量筛选的诸多样品多肽中，Peptide-129对Keap1有很好的抑制效果，其IC50仅为31nM，显著高于阳性小分子人参皂苷Rg1(简称Rg1)对照组(IC50为2450nM)。由此提示，Peptide-129可以作为Nrf2激动剂，用于Nrf2介导的疾病治疗中，例如制备用于治疗由Nrf2介导的疾病的药物中的应用；或者，可用于促进人脐带间充质干细胞的增殖，抑制其衰老。
实施例2
人脐带间充质干细胞的分离与鉴定
取健康脐带，无菌环境下，在生物安全柜中，使用剪刀将其剪成约2cm小段。使用镊子小心撕除脐带外膜并除胶。用添加0.1％双抗的生理盐水进行多次冲洗以出去残留血块后的脐带段，并剪成0.5厘米小块后转移至培养皿上，然后置于37℃细胞培养箱中约1小时，使组织块紧贴于培养皿上。其后分别向培养皿中沿壁缓慢注入含10％胎牛血清(FBS)的DMEM/F12培养液，刚刚浸没组织块一半即可。然后放于培养箱中培养，在初培养时候，每三天换一次液。大约7～14天内可获得细胞。间充质干细胞约90％融合的培养皿，使用PBS缓冲溶液清洗2遍后，加入0.25％胰酶EDTA溶液消化，再终止消化，离心弃上清。加入DMEM/F12重悬细胞，以1:2的比例传代。
人脐带间充质干细胞免疫表型鉴定：取第3代对数生长期细胞，细胞分离液消化，PBS清洗细胞3次。分别加CD34、CD45、CD73、CD90单抗进行标记，以相同浓度的FITC或者PE结合的小鼠IgG同型抗体作为阴性对照，室温反应孵育30min，离心除去未标记抗体。对照管为阴性(1.2％)。细胞表面阳性表达CD73(96.3％)、CD90(97.4％)，阴性表达CD34(0.7％)和CD45(0.4％)，鉴定结果符合间充质干细胞表面标志物的特征。
实施例3
Peptide-129对人脐带间充质干细胞的增殖以及Nrf2基因的表达的影响
将实施例2鉴定的人脐带充质干细胞培养在含有10％胎牛血清的DMEM/F12培养基，生长至对数期，消化并处理成悬液。将人脐带间充质干细胞接种于96孔板(2000个/孔)，对照组加入培养液，实验组加入含不同浓度PEP-129的培养液(0、100、200、500、1000ng/mL)，培养72h后使用MTT法分析细胞增殖，MTT测试前使用DMEM清洗细胞。
结果如图1所示：
采用MTT法检测不同浓度PEP-129多肽72h对细胞增殖的效果显示，PEP-129多肽浓度为100、200、500和1000ng/mL时，与对照组相比，在72h时均可以具有很有的促进增殖的效果，在1000ng/mL时，相对增殖率达130.322±2.425％(p≤0.001)，即使100ng/mL时相对增殖率也有110.40±2.08％(P≤0.01)。阳性对照组Rg1在使用浓度100μg/mL，相对增值率虽然高于浓度为100ng/mL和200ng/mL时的PEP-129多肽，但却低于500ng/mL和1000ng/mL时的PEP-129多肽,。由此说明，本申请提供的PEP-129多肽对人脐带间充质干细胞的增殖的促进作用大于阳性对照组Rg1。
实施例4
Peptide-129对Nrf2基因的表达的影响
通过反转录实时荧光定量PCR法(qRT-PCR)对Nrf2的mRNA表达情况进行了检测：
将实施例2鉴定的人脐带充质干细胞培养在含有10％胎牛血清的DMEM/F12培养基，生长至对数期，消化并处理成悬液。将人脐带间充质干细胞分三次接种于96孔板(2000个/孔)，对照组加入培养液，实验组加入含不同浓度PEP-129的培养液(0、500、1000ng/mL)，培养4h后，使用RNeasy Mini试剂盒从细胞中提取总mRNA。经DNAse I处理后，RNA样品用反转录酶试剂盒进行反转录。使用SYBRgreenPCR MasterMix(ABI)进行qRT-PCR来检测Nrf2的mRNA的表达情况。采用已验证的管家基因TBP作为内标。并使用2-△△CT方法计算基因的相对表达量。所使用的引物如表3所示：
表3.qRT-PCR的引物及模版序列
结果如图2所示：
根据图2的结果可以看出，PEP-129多肽与对照组相比，Nrf2的mRNA表达下降显著升高且呈剂量效应，1000ng/mL时候可将Nrf2基因的相对表达能力显著提升2.42±0.22倍(p≤0.001)，具有比阳性对照(1.23±0.25)更好的促进效果。由此说明，通过高通量体外筛选平台获得的PEP-129多肽在人脐带间充质干细胞上也能有效促进Nrf2基因的表达，从而有效保护脐带间充质干细胞免受氧化应激和各种内外源性有毒物质的损伤。
实施例5
PEP-129多肽对衰老的人脐带间充质干细胞的影响
将实施例2鉴定的人脐带充质干细胞进行连续传代。然后将P5、P10、P15人脐带间充质干细胞消化并处理成悬液，接种于96孔板(2000个/孔)。分为9组：
P5代：P5对照组、P5+Rg1、P5+PEP-129；
P10代：P10对照组、P10+Rg1、P10+PEP-129；
P15代：P15对照组、P15+Rg1、P15+PEP-129。
对照组加入培养液，实验组对应加入含500ng/mL的PEP-129或100μg/mL的Rg1的培养液，培养72h后使用MTT法分析细胞增殖，MTT测试前使用DMEM清洗细胞。
结果如图3所示：
根据图3的结果可以看出，随着传代次数的增加，人脐带间充质干细胞逐渐发生复制性衰老，增值能力逐渐减弱。P10代时的增殖能力，为P5代的82.9％，P15代时仅为P5代的64.5％。而在培养基中添加500ng/mL的PEP-129后，P10代细胞增殖能力相较于P5代恢复至93.5％，即使P15代也能恢复至75.0％。而Rg1并不能使传代衰老的细胞恢复增殖能力。由此说明，PEP-129多肽能够使衰老的人脐带间充质干细胞恢复活力。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种特异性促进Nrf2基因表达的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列为：Leu-Asp-Glu-Glu-Asn-Gly-Glu-Leu。
2.一种如权利要求1所述的多肽在制备提高人脐带间充质干细胞的生物活性的药物中的应用。
3.一种人脐带间充质干细胞的培养基，其特征在于，所述培养基中包括如权利要求1所述的多肽：Leu-Asp-Glu-Glu-Asn-Gly-Glu-Leu。
4.根据权利要求3所述的人脐带间充质干细胞的培养基，其特征在于，所述培养基中所述多肽的浓度为100-1000ng/mL。
5.根据权利要求3所述的人脐带间充质干细胞的培养基，其特征在于，所述培养基包括DMEM/F12基础培养基以及添加剂；
所述添加剂包括8-12％的胎牛血清、浓度为100-1000ng/mL的所述多肽。
6.一种促进人脐带间充质干细胞增殖、活力的培养方法，其特征在于，其包括：
将人脐带充质干细胞培养在含有8-12％胎牛血清的DMEM/F12培养基，生长至对数期；
将对数期的所述人脐带充质干细胞培养液进行消化并处理成细胞悬液；
将所述细胞悬液中的人脐带充质干细胞接种于细胞培养板，所述细胞培养板中含有如权利要求3-5任一项所述的培养基，进行增殖培养。
7.根据权利要求6所述的促进人脐带间充质干细胞增殖、活力的培养方法，其特征在于，在所述增殖培养过程中，所述细胞培养板上接种所述人脐带充质干细胞的密度为1000-3000个/孔，所述多肽的浓度为100-1000ng/mL，
所述增殖培养的条件参数为：
培养温度36-38℃，CO2浓度为4-6％，湿度为94-96％，培养时间为2-5天。
8.一种根据权利要求6-7所述的培养方法获得的人脐带间充质干细胞。
9.一种根据权利要求8所述的人脐带间充质干细胞在制备具有抗衰老作用的化妆品中的应用。
10.一种特异性促进Nrf2基因表达的多肽在制备用于预防皮肤衰老的组合物中的应用，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列为：Leu-Asp-Glu-Glu-Asn-Gly-Glu-Leu。
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