CN117959442A - 预防或治疗肺纤维化的试剂及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种预防或治疗肺纤维化的试剂及应用，以囊泡蛋白分选蛋白(VPS33B)作为预防或治疗的靶标。VPS33B其本身或其上调剂能够用于抑制肺纤维化；也可基于VPS33B的上述功能，筛选抑制肺纤维化的药物。

Description

预防或治疗肺纤维化的试剂及应用

技术领域

本发明属于药物学领域，更具体地，本发明涉及预防或治疗肺纤维化的试剂及应用。

背景技术

肺纤维化的特征是成纤维细胞增殖和细胞外基质沉积，造成肺组织结构损伤，最终导致呼吸衰竭。肺纤维化(PF)是一种慢性进行性的肺间质疾病。

由于器官组织不同，肺纤维化与其它组织的纤维化(如肝纤维化)在临床上属于不同的疾病。肺纤维化与肝纤维化相比，二者的区别主要有症状不同、病因不同、治疗措施不同、预后不同等。在症状上，肺纤维化早期一般会出现刺激性干咳、呼吸困难、发热等症状；而肝纤维化早期一般持续长期不出现明显症状。在病因方面，肺纤维化主要是遗传因素、肺部疾病等引起的；而肝纤维化主要是病毒感染、长期饮酒、药物刺激等因素引起的。在临床治疗方案方面，目前肺纤维化的患者较常使用糖皮质激素、免疫抑制剂、抗氧化剂、抗纤维化药物、受体抑制剂、免疫调节剂等等药物治疗，有助于改善肺功能；而肝纤维化的临床上常常通过阻止肝脏损伤、阻断病毒感染、控制饮食、减轻体重、减轻肝脏负担以及运用一些保肝药物治疗以缓解或控制病情。在预后方面，诊断为肺纤维化的患者如果不积极治疗，可能会逐渐出现进行性加重的呼吸困难，较可能导致肝功能下降，甚至导致肝衰竭，进而可能会导致死亡(如突发性死亡)；而肝纤维化的患者经过积极治疗后，预后一般相对好。可见肺纤维化与肝纤维化两种疾病存在本质的不同。

在导致纤维化形成的诱因上，肺纤维化是由于肺部受感染或损伤后，肺泡上皮细胞和(或)血管内皮细胞受损，肺上皮损伤是引起肺纤维化的重要因素之一。I型肺上皮细胞受损，II型肺上皮细胞增生。增生的I型肺上皮细胞和受损的血管内皮细胞产生大量的细胞因子，刺激炎症细胞的聚集、活化，最终肺泡结构被破坏，肺组织变致密；而在肝纤维化中，当肝脏受到损伤产生炎症时，肝星状细胞被激活，使α-平滑肌肌动蛋白和I型胶原的表达增加，最终导致肝肌成纤维细胞增多，细胞外基质沉积。因此，肺纤维化和肝纤维化在诱因方面存在本质的不同。

目前，肺纤维化并没有特效药物，如果发展到一定程度将不能完全治愈，临床上往往采取稳固病情、延缓病情发展的措施。在大部分患者中，由于发病原因不明，被归类为特发性肺纤维化(IPF)，IPF的发病率和患病率且呈逐年上升趋势。肺移植是治疗IPF最基本的手段，但其预后效果差，尼达尼布和吡非尼酮两种药物已被批准用于治疗IPF患者，这两种药物虽然有减轻肺功能下降和减缓疾病进展的作用，但仍有副作用和耐受性问题。

肺纤维化的防治及愈后是目前临床迫切需要解决的热点问题之一。本领域还需要对该疾病进行进一步的研究，以期开发预防、缓解或治疗该疾病的有效药物。

发明内容

本发明的目的在于提供一种预防或治疗肺纤维化的试剂及应用；在优选的方式中，提供了将AAV介导的VPS33B在肺部过表达治疗肺纤维化的雾化给药试剂及应用。

在本发明的第一方面，提供VPS33B或其上调剂的应用，用于制备抑制肺纤维化的组合物。

在一种或多种实施方式中，所述的抑制肺纤维化包括：预防、缓解或治疗肺纤维化。

在一种或多种实施方式中，所述VPS33B的上调剂包括：增强VPS33B的表达、稳定性或有效作用时间的物质，增强VPS33B活性的物质。

在一种或多种实施方式中，所述VPS33B的上调剂包括：重组表达VPS33B的表达构建物(包括表达载体)，VPS33B的化学上调剂，促进VPS33B基因启动子驱动能力的上调剂。

在一种或多种实施方式中，所述的表达构建物(表达载体)包括：病毒载体，非病毒载体；较佳地，所述的表达载体包括：腺相关病毒载体，慢病毒载体，腺病毒载体。

在一种或多种实施方式中，所述VPS33B以腺相关病毒递送和表达；或，所述的重组表达VPS33B的表达构建物是腺相关病毒载体或由其包装而成的病毒。

在一种或多种实施方式中，所述的抑制肺纤维化的组合物是气管给药制剂，包括气雾剂。

在一种或多种实施方式中，所述的VPS33B选自下组：(a)氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的多肽；(b)将(a)所示的氨基酸序列经过一个或多个(如1～20个，1-10个，1-5个，1-3个或1-2个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的具有(a)或(b)多肽功能的VPS33B衍生物，或其活性片段；(c)序列与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比，同源性≥90％(如同源性≥92％，≥94％，≥96％，≥98％或≥99％)的VPS33B衍生物，或其活性片段。

在本发明的另一方面，提供一种用于抑制肺纤维化的组合物，所述组合物中含有：

重组表达VPS33B的腺相关病毒载体或由其包装而成的病毒；和

药学或生理学上可接受的载体或赋形剂。

在一种或多种实施方式中，所述的抑制肺纤维化的组合物是气管给药制剂，包括气雾剂。

在本发明的另一方面，提供VPS33B的应用，用于筛选药物或化合物(即作为筛药靶点)，所述药物或化合物抑制肺纤维化。

在本发明的另一方面，提供一种筛选抑制肺纤维化的药物或化合物(或潜在的药物或化合物)的方法，包括：

(1)用候选物质处理一表达体系，该体系表达VPS33B；和

(2)检测所述体系中VPS33B的表达或活性；若所述候选物质在统计学上提高VPS33B的表达或活性，则表明该候选物质是所需的(感兴趣的)药物或化合物。

在一种或多种实施方式中，步骤(1)包括：在测试组中，将候选物质加入到所述表达体系中。

在一种或多种实施方式中，步骤(2)包括：检测所述体系中VPS33B的表达或活性，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的表达体系；若所述候选物质在统计学上提高(如提高20％以上，较佳的提高50％以上；更佳的提高80％以上)VPS33B的表达或活性，则表明该候选物质是所需的(感兴趣的)药物或化合物。

在一种或多种实施方式中，所述的体系选自：细胞体系(或细胞培养物体系)、亚细胞体系(或亚细胞培养物体系)、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。

在一种或多种实施方式中，所述的候选物质包括(但不限于)：针对VPS33B、其片段或变异体、其编码基因或其上下游分子或信号通路设计的过表达分子如构建体，活性促进分子，化学小分子，相互作用分子等。

在一种或多种实施方式中，所述方法还包括：对获得的药物或化合物(潜在药物或化合物)进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以从候选物质中进一步选择和确定对于抑制肺纤维化等有用的组合物。

在本发明的另一方面，提供一种抑制肺纤维化的方法，包括步骤：以VPS33B或其上调剂给予需要抑制的对象。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、VPS33B预防肺纤维化策略。

图2、肺中过表达VPS33B减轻肺纤维化程度(预防性)。A：苏木精-伊红(HE)分析；B：马松(Masson’s trichrome)染色分析。

图3、VPS33B治疗肺纤维化策略。

图4、肺部给药腺相关病毒过表达VPS33B的qPCR检测。

图5、肺中过表达VPS33B治疗肺纤维化效果。A：苏木精-伊红(HE)分析；B：马松(Masson’s trichrome)染色分析。

具体实施方式

本发明人经过深入研究，揭示了囊泡蛋白分选蛋白(VPS33B)在防治肺纤维化的组合物或药物中的应用。VPS33B其本身或其上调剂能够用于抑制肺纤维化；也可基于VPS33B的上述功能，筛选抑制肺纤维化的物质。

囊泡蛋白分选蛋白(VPS33B)是参与囊泡运输的重要分子，有报道VPS33B基因突变会引起关节痉挛-肾功能不全-胆汁淤积(ARC)综合征，主要临床表现涉及多个脏器功能障碍，尤其是在肝脏突变中，会引起肝细胞极性发生紊乱，胞内蛋白的囊泡运输在肝细胞极化过程中起作用。但是，本领域目前对于VPS33B的其它方面的了解还知之甚少。

人源VPS33B的氨基酸序列可以如SEQ ID NO:1所示；鼠源VPS33B的氨基酸序列可以如SEQ ID NO:3所示。本发明还包括来自其它物种的VPS33B同源物及其应用。

如本发明所用，所述的“抑制肺纤维化”包括了预防、缓解或治疗肺纤维化。

本发明所述VPS33B可以是天然存在的，比如其可被分离或纯化自哺乳动物。此外，所述的VPS33B也可以是人工制备的，比如可以根据常规的基因工程重组技术来生产重组VPS33B，以应用于实验或临床。在应用时，可采用重组的VPS33B。所述的VPS33B包括全长的VPS33B或其生物活性片段。优选的，所述的VPS33B的氨基酸序列可以与SEQ ID NO:1或SEQID NO:3所示的序列基本上相同。根据VPS33B的氨基酸序列可以方便地得出其相应的核苷酸编码序列。

经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的VPS33B的氨基酸序列也包括在本发明中。VPS33B或其生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述经氨基酸替换的序列并不影响其活性或保留了其部分的活性。适当替换氨基酸是本领域公知的技术，所述技术可以很容易地被实施并且确保不改变所得分子的生物活性。这些技术使本领域人员认识到，一般来说，在一种多肽的非必要区域改变单个氨基酸基本上不会改变生物活性。见Watson等，Molecular Biology of The Gene，第四版，1987，The Benjamin/Cummings Pub.Co.P224。

任何一种VPS33B的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，VPS33B的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持全长的VPS33B的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50％的全长VPS33B的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长VPS33B的60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。

本发明也可采用经修饰或改良的VPS33B，比如，可采用为了促进其半衰期、有效性、代谢、和/或蛋白的效力而加以修饰或改良的VPS33B。所述经过修饰或改良的VPS33B可以是一种VPS33B的共轭物，或其可包含被取代的或人工的氨基酸。所述经过修饰或改良的VPS33B可以是与天然存在的VPS33B具有较小的共同点，但也能防治肺纤维化。也就是说，多种不影响VPS33B的生物活性的变化形式都可用于本发明中。

在本发明的研究工作中，构建了过表达VPS33B基因的AAV病毒，通过气管给药的方式施予肺纤维化动物，显著抑制了肺纤维化的发展。

在动物纤维化模型的构建上，肺纤维化一般使用博来霉素作为诱导剂，其作用机制是靶向DNA酶，从而导致DNA链断裂和氧基自由基产生，最终引起细胞凋亡。当博来霉素进入肺部时，浸润于肺泡间质细胞的药物开始发挥作用，受到直接损伤的细胞包括产生胶原蛋白的肺泡上皮细胞。因此，在博来霉素注射之后，肺泡上皮细胞会因药物而死亡并释放出胶原蛋白，最终导致肺纤维化。博来霉素诱导的肺纤维化模型给药方式为滴鼻吸入或直接将药物通过气管递送到肺中。与之不同的是，肝纤维化模型的构建中，一般使用四氯化碳作为诱导剂，四氯化碳为一种选择性肝毒性药物，其进入机体后在肝内活化成自由基如三氯甲基自由基，后者可直接损伤质膜，启动脂质过氧化作用，破坏肝细胞的膜性结构等，造成肝细胞变性坏死和肝纤维化的形成。肝纤维化模型构建采用皮下注射、腹腔注射和灌胃法的给药方式。因此，肺纤维化和肝纤维化的动物疾病模型构建无论所基于的机理还是所呈现的发病特点均不同。

基于本发明人的新发现，本发明提供了VPS33B或其上调剂的应用，用于制备抑制肺纤维化的组合物或药物；或用于筛选抑制上述疾病或症状的物质。

如本文所用，所述的VPS33B的上调剂包括了促进剂、激动剂等。多种可提高VPS33B的活性、维持VPS33B的稳定性、促进VPS33B的表达、促进VPS33B的分泌、延长VPS33B有效作用时间、或促进VPS33B的转录和翻译的物质可用于本发明，作为具有上调功能的有效物质。

作为本发明的优选方式，所述的VPS33B的上调剂包括(但不限于)：在转入细胞后可表达(优选过表达)VPS33B的表达载体或表达构建物。通常，所述表达载体包含一基因盒，所述的基因盒含有编码VPS33B的基因及与之操作性相连的表达调控序列。所述的“操作性相连”或“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够调节或控制同一线性DNA序列其它部分的活性。例如，如果启动子控制序列的转录，那么它就是可操作地连于编码序列。

本发明中，VPS33B多核苷酸序列可插入到重组表达载体中，从而可将之转入到细胞中，过表达产生VPS33B。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用于本发明。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。例如，所述的表达载体包括：病毒载体，非病毒载体；例如，所述的表达载体包括：腺相关病毒载体，慢病毒载体，腺病毒载体。优选地，所述的表达载体书腺相关病毒(AAV)载体。

AAV载体是利用天然存在的腺相关病毒某些特性经过基因工程改造后产生的一种可供人工转基因的载体。在本发明的优选方式中，对AAV载体进行了优化构建。

本发明还提供了一种组合物，它含有有效量(如0.000001-20wt％；较佳的0.00001-10wt％)的所述的VPS33B、或其上调剂(优选过表达该VPS33B的表达载体，更优选AAV表达载体)、或其类似物，以及药学上可接受的载体。

本发明的组合物可直接用于防治肺纤维化。此外，还可同时与其它治疗剂或辅剂联合使用。

通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地，pH约为6-8。

如本文所用，术语“含有”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。

如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。

本发明的组合物含有安全有效量的VPS33B、或其上调剂(优选过表达该VPS33B的表达载体，更优选AAV表达载体)、或其类似物，以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。本发明的药物制剂还可制成缓释制剂。

本发明所述的VPS33B或其上调剂的有效量随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化，根据一些因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的VPS33B或其上调剂的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。

本发明还提供了一种防治肺纤维化的方法，包括给予受试者有效量的VPS33B、或其上调剂(如过表达该VPS33B的表达载体)、或其类似物。

本发明的VPS33B或其上调剂、或其类似物的给药方式可以是全身的或局部的。例如，所述VPS33B或其上调剂可通过腹腔注射、静脉注射、口服、皮下注射、脊髓鞘内注射、皮内注射等的方式给予动物。

在得知了所述的VPS33B的用途后，可以采用多种方法来将所述的VPS33B或其编码基因、或其药物组合物给药于哺乳动物。优选的，可采用基因治疗的手段进行，比如可通过一定的途径将携带VPS33B基因的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，并使之表达活性的VPS33B。

作为本发明的一种实施方式，可将所述的VPS33B直接给药于哺乳动物(比如人)，或者，可将编码VPS33B的基因通过常规的方法克隆到适当的载体(优选地为腺相关病毒载体)中，将所述的载体导入到可表达所述VPS33B的细胞中，使所述的细胞表达VPS33B。可通过将适量的所述细胞引入到哺乳动物身体的适当部位，实现VPS33B的表达。

作为本发明的优选方式，所述的给药方式为气管给药方式，将本发明的VPS33B或其上调剂制成气雾剂，用于给药。

VPS33B作为药物筛选靶点

在得知了所述的VPS33B的功能和作用机制后，可以基于该特征来筛选促进VPS33B的表达或活性的物质。

因此，本发明提供一种筛选可用于抑制肺纤维化的潜在物质的方法，所述的方法包括：将候选物质与表达VPS33B的体系接触；和检测候选物质对VPS33B的影响；若所述候选物质可提高VPS33B的表达或活性或分泌，则表明该候选物质是可用于抑制肺纤维化的潜在物质。

所述的表达体系例如可以是细胞(或细胞培养物)体系，还可以是(但不限于)亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系(如动物模型)等。所述的细胞可以是内源性表达VPS33B的细胞；或可以是重组表达VPS33B的细胞。

作为本发明的优选方式，所述的方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以进一步选择和确定对于抑制肺纤维化等真正有用的物质。

本发明对于VPS33B的表达、活性、存在量或分泌情况的检测方法没有特别的限制。可以采用常规的蛋白定量或半定量检测技术，例如(但不限于)：SDS-PAGE法，Western-Blot法，ELISA等。

本发明涉及实验动物学中的动物模型构建、分子生物学中的荧光定量PCR(qPCR)，组织病理学中的苏木精-伊红(HE)和马松(Masson’s trichrome)染色技术。

在动物水平上，也可进行药物的筛选和分析。在优选的方式中，利用小鼠构建肺纤维化模型，作为靶向VPS33B治疗肺纤维化的动物实验模型。

在一种实施方式中，利用荧光定量PCR(qPCR)进行药物的筛选和分析验证，即荧光定量聚合酶链式反应，在PCR过程中加入荧光基团，根据荧光信号的变化实时监测扩增产物的变化。通过循环阈值(Ct值)和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。通过qPCR可以比较不同样本间的基因表达差异，为下游实验提供充分的实验数据。本发明实施例中，利用qPCR技术检测到VPS33B在小鼠肺组织中的过表达。

在一种实施方式中，利用苏木精-伊红(HE)染色进行药物的筛选和分析验证，其是石蜡切片技术里常用的染色法之一。苏木精染液为碱性，主要使细胞核内的染色质与胞质内的核酸着紫蓝色；伊红为酸性染料，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。本发明实施例中，通过HE染色观察肺组织的炎症程度。

在一种实施方式中，利用马松(Masson’s trichrome)染色进行药物的筛选和分析验证，该方法是结缔组织染色的一种经典方法，是胶原纤维染色的经典技术。该染色原理与阴离子染料分子的大小和组织的渗透有关：分子的大小由分子量来体现，小分子量易穿透结构致密、渗透性低的组织，而大分子量则只能进入结构疏松的、渗透性高的组织。然而，苯胺蓝的分子量很大，因此Masson染色后肌纤维呈红色，胶原纤维呈蓝色，主要用于区分胶原纤维和肌纤维。本发明实施例中，利用Masson染色观察肺组织胶原蛋白的沉积程度。

另一方面，本发明还提供了采用所述筛选方法获得的化合物、组合物或药物，或一些潜在物质。一些初步筛选出的物质可构成一个筛选库，以便于人们最终可以从中筛选出能够对于抑制肺纤维化等真正有用的物质，从而用于临床。

VPS33B作为诊断靶点

基于本发明人的上述新发现，也可以将VPS33B作为诊断肺纤维化的标志物：(i)进行肺纤维化的分型、鉴别诊断、和/或易感性分析；(ii)评估相关人群的肺纤维化治疗药物、药物疗效、预后，以及选择合适的治疗方法；(iii)早期评估相关人群肺纤维化患病风险，早期监测早期防治。比如，可分离出由VPS33B基因表达异常(显著低表达或不表达)而导致肺纤维化的人群，从而可进行更有针对性地治疗。

因此，本发明提供了VPS33B的用途，用于制备诊断(或检测)肺纤维化的试剂或试剂盒。

可采用各种本领域已知的技术来检测VPS33B基因的存在与否、表达情况、表达水平或活性，这些技术均包含在本发明中。例如可用已有的技术如Southern印迹法、Western印迹法、DNA序列分析、PCR等，这些方法可结合使用。

本发明还提供了用于在分析物中检测VPS33B基因的存在与否以及表达情况的试剂。优选的，当进行基因水平的检测时，可以采用特异性扩增VPS33B的引物；或特异性识别VPS33B的探针来确定VPS33B基因的存在与否；当进行蛋白水平的检测时，可以采用特异性结合VPS33B编码的蛋白的抗体或配体来确定VPS33B蛋白的表达情况。作为本发明的优选方式，所述的试剂是引物，其可特异性扩增出VPS33B基因或基因片段。针对VPS33B基因的特异性探针的设计是本领域人员熟知的技术，例如，制备一种探针，其可与VPS33B基因上特定位点发生特异性结合，而不与VPS33B基因以外的其它基因特异性结合，且所述探针带有可检测信号。此外，也可以利用特异性结合VPS33B蛋白的抗体来检测分析物中VPS33B蛋白表达情况。

本发明还提供了用于在分析物中检测VPS33B基因的存在与否以及表达情况的试剂盒，该试剂盒包括：特异性扩增VPS33B基因的引物；特异性识别VPS33B基因的探针；或特异性结合VPS33B蛋白的抗体或配体。

所述的试剂盒中还可包括用于提取DNA、PCR、杂交、显色等所需的各种试剂，包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液、洗液等。此外，所述的试剂盒中还可包括使用说明书和/或核酸序列分析软件等。

本发明通过靶向VPS33B抑制了肺纤维化的发展，为临床防治肺纤维化疾病开发有效的联合治疗方案探索到新的分子靶点，为新药开发提供了有效的转化方案。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

材料和方法

VPS33B(人)的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)：

MAFPHRPDAPELPDFSMLKRLARDQLIYLLEQLPGKKDLFIEADLMSPLDRIANVSILKQHEVDKLYKVENKPAL

SSNEQLCFLVRPRIKNMRYIASLVNADKLAGRTRKYKVIFSPQKFYACEMVLEEEGIYGDVSCDEWAFSLLPLDV

DLLSMELPEFFRDYFLEGDQRWINTVAQALHLLSTLYGPFPNCYGIGRCAKMAYELWRNLEEEEDGETKGRRPEI

GHIFLLDRDVDFVTALCSQVVYEGLVDDTFRIKCGSVDFGPEVTSSDKSLKVLLNAEDKVFNEIRNEHFSNVFGF

LSQKARNLQAQYDRRRGMDIKQMKNFVSQELKGLKQEHRLLSLHIGACESIMKKKTKQDFQELIKTEHALLEGFN

IRESTSYIEEHIDRQVSPIESLRLMCLLSITENGLIPKDYRSLKTQYLQSYGPEHLLTFSNLRRAGLLTEQAPGD

TLTAVESKVSKLVTDKAAGKITDAFSSLAKRSNFRAISKKLNLIPRVDGEYDLKVPRDMAYVFGGAYVPLSCRII

EQVLERRSWQGLDEVVRLLNCSDFAFTDMTKEDKASSESLRLILVVFLGGCTFSEISALRFLGREKGYRFIFLTT

AVTNSARLMEAMSEVKA

VPS33B(人)的核苷酸序列(SEQ ID NO:2)：

ATGGCTTTTCCCCATCGGCCGGACGCCCCTGAGCTGCCTGACTTCTCCATGCTGAAGAGGCTGGCTCGAGACCAG

CTCATCTATCTGCTGGAGCAGCTTCCTGGAAAAAAGGATTTATTCATTGAGGCAGATCTCATGAGCCCTTTGGAT

CGAATTGCCAATGTCTCCATCCTGAAGCAACACGAAGTAGACAAGCTATACAAGGTGGAGAACAAGCCAGCCCTC

AGCTCCAATGAACAATTGTGCTTCTTGGTCAGACCCCGCATCAAGAATATGCGATACATTGCCAGTCTTGTCAAT

GCTGACAAATTGGCTGGCCGAACTCGCAAATACAAAGTGATCTTCAGCCCTCAAAAGTTCTATGCGTGTGAGATG

GTGCTTGAGGAAGAGGGAATCTATGGAGATGTGAGCTGTGATGAATGGGCCTTCTCTTTGCTGCCTCTTGATGTG

GATCTGCTGAGCATGGAACTACCAGAATTTTTCAGGGATTACTTTCTGGAAGGAGATCAGCGTTGGATCAACACT

GTAGCTCAGGCCTTACACCTTCTCAGCACTCTCTATGGACCCTTTCCAAACTGCTATGGAATTGGCAGGTGCGCC

AAGATGGCATATGAATTGTGGAGGAACCTGGAGGAGGAGGAGGATGGCGAAACCAAGGGCCGAAGGCCAGAGATT

GGACATATCTTTCTCTTGGACAGAGATGTGGACTTTGTGACAGCACTTTGCTCCCAAGTGGTTTATGAGGGCCTA

GTAGATGACACCTTCCGCATCAAGTGTGGGAGTGTCGACTTTGGCCCAGAAGTCACATCCTCTGACAAGAGCCTG

AAGGTGCTACTCAATGCCGAGGACAAGGTGTTTAATGAGATTCGGAACGAGCACTTCTCCAATGTCTTTGGCTTC

TTGAGCCAGAAGGCCCGGAACTTGCAGGCCCAGTATGATCGCCGGAGAGGCATGGACATTAAGCAGATGAAGAAT

TTCGTGTCCCAGGAGCTCAAGGGCCTGAAACAGGAGCACCGCCTGCTGAGTCTCCATATTGGGGCCTGTGAATCC

ATCATGAAGAAGAAAACCAAGCAGGATTTCCAGGAGCTAATCAAGACTGAGCATGCACTGCTAGAGGGGTTCAAC

ATCCGGGAGAGCACCAGCTACATTGAGGAACACATAGACCGGCAGGTGTCGCCTATAGAAAGCCTGCGCCTCATG

TGCCTTTTGTCCATCACTGAGAATGGTTTGATCCCCAAGGATTACCGATCTCTGAAAACACAGTATCTGCAGAGC

TATGGCCCTGAGCACCTGCTAACCTTCTCCAATCTGCGAAGAGCTGGGCTCCTAACGGAGCAGGCCCCCGGGGAC

ACCCTCACAGCCGTGGAGAGTAAAGTGAGCAAGCTGGTGACCGACAAGGCTGCAGGAAAGATTACTGATGCCTTC

AGTTCTCTGGCCAAGAGGAGCAATTTTCGTGCCATCAGCAAAAAGCTGAATTTGATCCCACGTGTGGACGGCGAG

TATGATCTGAAAGTGCCCCGAGACATGGCTTACGTCTTCGGTGGTGCTTATGTGCCCCTGAGCTGCCGAATCATT

GAGCAGGTGCTAGAGCGGCGAAGCTGGCAGGGCCTTGATGAGGTGGTACGGCTGCTCAACTGCAGTGACTTTGCA

TTCACAGATATGACTAAGGAAGACAAGGCTTCCAGTGAGTCCCTGCGCCTCATCTTGGTGGTGTTCTTGGGTGGT

TGTACATTCTCTGAGATCTCAGCCCTCCGGTTCCTGGGCAGAGAGAAAGGCTACAGGTTCATTTTCCTGACGACA

GCAGTCACAAACAGCGCTCGCCTTATGGAGGCCATGAGTGAGGTGAAAGCCTGA

VPS33B(小鼠)的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)：

MAFPHRLDAPELPDFSMLKRLARDQLIYLLEQLPGKKDLFIEADLMSPLDRIANVSILKQHEVDKLYKVENKPAL

SANEQLCFLVRPRIKNMRYIASLVNADKLAGRIRKYKVILSPQKFYACEMVLEEEGVYGDVSCDEWAFSLLPLDV

DLLSMELPEFFRDYFLEGDQRWINTVAQALHLLSTLYGPFPNCYGIGRCAKMSYDLWRKLEEEEDSETKGRKPEI

GHIFLLDRDVDFVTALCSQVVYEGLVDDTFRIKCGSVDFGPEVTSSDKSLKVLLNAEDKVFSEIRNEHFSNVFGF

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VPS33B(小鼠)的核苷酸序列(SEQ ID NO:4)：

ATGGCTTTTCCCCATCGGCTGGACGCCCCTGAGCTTCCCGACTTCTCTATGCTCAAGAGGCTGGCTCGGGACCAG

CTCATCTATCTGCTAGAACAGCTTCCTGGAAAAAAGGATTTGTTCATTGAGGCAGATCTCATGAGCCCTTTGGAT

CGAATTGCTAACGTCTCTATCCTGAAGCAACATGAAGTGGACAAGCTGTACAAGGTGGAGAACAAACCTGCCCTC

AGCGCCAATGAACAACTGTGCTTCTTGGTCAGACCTCGAATCAAGAATATGCGCTACATTGCCAGTCTTGTCAAT

GCTGACAAGCTGGCTGGCAGAATTAGAAAATACAAAGTCATCCTAAGCCCTCAGAAGTTTTATGCATGTGAGATG

GTGCTTGAGGAAGAGGGAGTCTATGGAGATGTGAGCTGTGATGAGTGGGCCTTTTCTCTGCTGCCTCTTGATGTC

GATCTGCTGAGCATGGAACTGCCAGAATTTTTCAGGGATTACTTCCTGGAAGGTGATCAGCGTTGGATCAACACT

GTGGCTCAGGCCTTACACCTTCTCAGTACTCTCTATGGGCCCTTTCCTAACTGCTATGGCATTGGCAGATGTGCA

AAGATGTCATATGACCTGTGGAGGAAACTGGAGGAGGAAGAAGACAGTGAAACCAAAGGTCGGAAACCAGAGATT

GGACACATCTTTCTCCTGGACAGAGATGTGGACTTTGTGACAGCACTTTGCTCCCAAGTGGTTTACGAGGGCTTG

GTAGATGACACCTTCCGAATCAAGTGTGGAAGTGTTGACTTTGGCCCAGAAGTCACATCCTCTGACAAGAGCCTG

AAGGTGCTACTCAACGCTGAGGACAAGGTGTTCAGTGAGATCCGCAATGAGCACTTCTCCAATGTCTTTGGCTTC

TTGAGCCAGAAGGCCCGGAACTTGCAGGCCCAATATGACCGCCGGAGAGGCATGGACATAAAGCAGATGAAGAAC

TTCGTGTCGCAAGAGCTCAAGGGACTGAAGCAGGAGCACCGCCTTCTGAGTCTCCATATTGGGGCTTGTGAATCA

ATCATGAAGAAGAAAACCAAGCAGGACTTCCAGGAGCTAATCAAGACCGAGCATGCGCTGCTGGAGGGCTTCAAC

ATCCGAGAGAGCACTAGCTACATTGAAGAGCACATAGACCGGCAGGTGTCGCCCATAGAGAGCCTACGCCTCATG

TGCCTTTTGTCCATCACTGAGAATGGTTTGATACCCAAGGATTATCGGTCCCTGAAAACACAGTATCTGCAGAGC

TATGGCCCCGAGCACCTGCTAACCTTCTCCAACCTGCGGAGAGCCGGGCTTCTAACAGAGCAGGCTCCTGGGGAC

ACCCTCACAGCAGTAGAGAGTAAAGTGAGCAAGCTGGTGACGGACAAGGCTGCAGGGAAAATCACTGACGCCTTC

AGTTCTCTGGCCAAGAGGAGCAATTTTCGTGCCATCAGCAAAAAGCTGAATTTGATCCCACGTGTAGATGGGGAG

TATGACCTGAAAGTGCCCCGAGACATGGCTTATGTCTTCAGTGGTGCCTATGTGCCTCTGAGCTGCCGAATCATT

GAGCAGGTGCTGGACCGGCGGAGTTGGCAGGGCCTTGATGAAGTGGTACGGCTGCTAAACTGCAGTGAGTTTGCA

TTCACAGACACGGCTAAGGAAGACAAGGCTTCCAGTGAGTCACTGCGCCTCATCTTGGTGGTGTTCCTGGGGGGC

TGCACGTTCTCAGAGATATCAGCCCTGCGCTTCCTGGGTAGAGAGAAAGGGTACAGATTTATTTTTCTGACAACT

GCTGTTACAAACAGTGCTCGCCTCATGGAAGCCATGAGTGAGGTGAAATCCTGA

根据上述，鼠源和人源的核苷酸序列均有1854bp，编码617个氨基酸。鼠和人的VPS33B氨基酸序列的相似度在97.24％。本发明中，来源于人或鼠的VPS33B，均可以作为肺纤维化治疗靶点，指导人的肺纤维化的防治。除非另外说明，实施例中使用鼠源序列。

AAV-VPS33B的建立

以pHBAAV-CMV-MCS-3flag-T2A-ZsGreen作为基础质粒，在其741/2608位点插入VPS33B的核苷酸编码序列，获得重组质粒。

将上述重组质粒与编码rep和cap蛋白编码基因的pAAV-RC和替代腺相关病毒所依赖的腺病毒的pHelper辅助质粒共转293细胞株，在细胞中进行细胞的包装，在细胞裂解液中获得携带目的基因的AAV-VPS33B。

气雾剂给药

用雾化器将液体药物雾化成微小的雾滴或微粒，给药时通过气管直接进入肺部。

实施例1、预防性表达VPS33B减轻肺纤维化的发展

1、动物给药

取同窝6-8周龄，体重25g左右的雄性C57BL/6小鼠，随机分组，进行如下处理(图1)：

在第0天，用雾化器将AAV-VPS33B及对照病毒AAV-ZsGreen通过气管给药的方式注入小鼠肺部，剂量为7.5×10¹⁰vg，单次注射。

在第21天，同样以气管给药将博来霉素(Bleomycin；BLM)注入小鼠肺部，诱导小鼠的肺纤维化，剂量为1.5μg/g体重。

在第42天，将小鼠麻醉后进行心脏灌流并对肺组织取样，对左肺进行苏木精-伊红(HE)和马松(Masson’s trichrome)染色分析。

2、苏木精-伊红(HE)染色分析

HE是石蜡切片技术里常用的染色法之一。苏木精染液为碱性，主要使细胞核内的染色质与胞质内的核酸着紫蓝色；伊红为酸性染料，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。本实施例中，利用HE染色观察肺组织的炎症程度。

HE染色结果显示，AAV-ZsGreen小鼠淋巴细胞浸润程度显著高于AAV-VPS33B小鼠，如图2A。

3、马松(Masson’s trichrome)染色分析

Masson染色是结缔组织染色的一种经典方法，是胶原纤维染色的经典技术。该染色原理与阴离子染料分子的大小和组织的渗透有关：分子的大小由分子量来体现，小分子量易穿透结构致密、渗透性低的组织，而大分子量则只能进入结构疏松的、渗透性高的组织。然而，苯胺蓝的分子量很大，因此Masson染色后肌纤维呈红色，胶原纤维呈蓝色，主要用于区分胶原纤维和肌纤维。本实施例中，利用Masson染色观察肺组织胶原蛋白的沉积程度。

Masson’s trichrome染色结果显示，AAV-ZsGreen小鼠肺组织中的胶原沉积程度也显著高于AAV-VPS33B组，如图2B。

上述HE染色以及Masson染色的结果说明，过表达VPS33B可以减轻肺纤维化的发展。

实施例2、治疗性表达VPS33B抑制肺纤维化的发展

1、动物给药

选用8-12周龄、体重为20-25g的雄性C57BL/6小鼠，用雾化器将BLM通过气管给药的方式靶向小鼠肺部，诱导小鼠的肺纤维化，博来霉素剂量为1.5μg/g体重。

博来霉素给药后第10天，通过气管给药感染AAV-VPS33B及对照AAV-ZsGreen，剂量为7.5×10¹⁰vg。继续观察至第31天(图3)。

第31天，在小鼠麻醉后进行心脏灌流并对肺组织取样，进行荧光定量PCR(qPCR)，或进行HE或Masson’s trichrome染色。

2、q-PCR分析

利用荧光定量PCR(qPCR)，检测VPS33B在肺组织中的表达情况。

如图4，Q-PCR结果显示，腺相关病毒均靶向定位于肺部，并且VPS33B在肺组织中稳定过表达(与对照相比，****P<0.0001)。

3、HE染色分析

利用HE染色检测淋巴细胞浸润程度。结果显示，AAV-ZsGreen小鼠淋巴细胞浸润程度显著高于AAV-VPS33B小鼠，如图5A。

4、Masson’s trichrome染色分析

利用Masson’s trichrome染色分析肺组织胶原蛋白的沉积程度。结果显示，AAV-VPS33B组小鼠肺组织中的胶原沉积程度非常显著地低于AAV-ZsGreen组，如图5B。

上述结果表明，利用AAV重组表达VPS33B可以有效减轻肺纤维化的发展。并且，本发明提供了吸入给药的方案，实现好的治疗效果的同时安全性高。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。同时，在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。

Claims (10)

1.VPS33B或其上调剂的应用，用于制备抑制肺纤维化的组合物。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述VPS33B的上调剂包括：增强VPS33B的表达、稳定性或有效作用时间的物质，增强VPS33B活性的物质。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述VPS33B的上调剂包括：重组表达VPS33B的表达构建物，VPS33B的化学上调剂，促进VPS33B基因启动子驱动能力的上调剂。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述VPS33B以腺相关病毒递送和表达；或，所述的重组表达VPS33B的表达构建物是腺相关病毒载体或由其包装而成的病毒。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的抑制肺纤维化的组合物是气管给药制剂，包括气雾剂。

6.一种用于抑制肺纤维化的组合物，其特征在于，所述组合物中含有：

重组表达VPS33B的腺相关病毒载体或由其包装而成的病毒；和

药学或生理学上可接受的载体或赋形剂。

7.如权利要求6所述的用于抑制肺纤维化的组合物，其特征在于，所述的抑制肺纤维化的组合物是气管给药制剂，包括气雾剂。

8.VPS33B的应用，用于筛选药物或化合物，所述药物或化合物抑制肺纤维化。

9.一种筛选抑制肺纤维化的药物或化合物的方法，包括：

(1)用候选物质处理一表达体系，该体系表达VPS33B；和

(2)检测所述体系中VPS33B的表达或活性；若所述候选物质在统计学上提高VPS33B的表达或活性，则表明该候选物质是所需的药物或化合物。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤(1)包括：在测试组中，将候选物质加入到所述表达体系中；

步骤(2)包括：检测所述体系中VPS33B的表达或活性，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的表达体系；若所述候选物质在统计学上提高VPS33B的表达或活性，则表明该候选物质是所需的药物或化合物。