CN117959304A - Cvt-313在制备治疗流感病毒感染的药物中的应用 - Google Patents

Cvt-313在制备治疗流感病毒感染的药物中的应用 Download PDF

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CN117959304A CN202410136801.4A CN202410136801A CN117959304A CN 117959304 A CN117959304 A CN 117959304A CN 202410136801 A CN202410136801 A CN 202410136801A CN 117959304 A CN117959304 A CN 117959304A
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Abstract

本申请涉及CVT‑313的用途技术领域，具体涉及CVT‑313在制备治疗流感病毒感染的药物中的应用。该应用包括避免或降低流感病毒的感染；抑制流感病毒的复制；抑制流感病毒的增殖；抑制流感病毒RNA合成；抑制流感病毒NP蛋白合成；改善或避免感染流感病毒引起的机体的细胞损伤和组织损伤；改善或避免感染流感病毒引起的机体的肺泡结构损伤；改善或避免感染流感病毒引起的机体的心肌组织损伤；或消除、改善或避免感染流感病毒引起的机体的中耳炎。

Description

CVT-313在制备治疗流感病毒感染的药物中的应用
技术领域
本申请涉及CVT-313用途技术领域，具体涉及CVT-313在制备治疗流感病毒感染的药物中的应用。
背景技术
CVT-313(CAS：199986-75-9)是一种高选择性周期蛋白依赖性激酶2(cyclin-dependentkinase 2，CDK2)抑制剂。CDK2是CDK家族中的重要成员，已经证实CDK2在促进细胞周期进程中起着关键作用。CDK2是CDK中的一个高度保守的亚型，在真核细胞中，CDK2主要分布在细胞质、中心体、细胞核、高尔基体、细胞质膜以及核内体中。与其他蛋白激酶类似，CDK2具有典型的双叶结构，N端(残基1-82)和C端结构域(残基83-297)。CDK2为ATP和磷酸化受体蛋白底物提供了相邻的结合位点，使得ATP的γ-磷酸面对底物表面Ser/Thr的羟基侧链。CVT-313从嘌呤类似物库中鉴定出来，体外IC50为0.5μM，其抑制作用相对于ATP(Ki＝95nM)具有竞争性。当添加到CDK1或CDK4时，需要8.5倍和430倍的高浓度CVT-313才能达到酶活性的半数最大抑制。使用正常和肿瘤人/鼠细胞系，测量CVT-313对细胞增殖的影响，抑制生长的IC50范围为1.25至20μM。
发明内容
然而，本申请发明人发现CVT-313具有抗流感病毒的应用前景。
为此，本申请实施例至少公开了以下技术方案：
第一方面，实施例公开了CVT-313在制备抗流感病毒药物中的应用。术语“抗”，意为干扰流感病毒的感染进程；抑制流感病毒的生长；抑制流感病毒增殖；抑制流感病毒mRNA合成；抑制流感病毒NP蛋白合成；改善或避免感染流感病毒引起机体的细胞损伤；改善或避免感染流感病毒引起机体的肺泡结构损伤；改善或避免感染流感病毒引起机体的心肌组织损伤；或消除、改善或避免感染流感病毒引起机体的中耳炎中的至少一项。
在第一方面的实施例中，所述流感病毒选自甲、乙型流感病毒中的一种或多种。在一些实施例中，所述流感病毒选自甲型流感病毒H1N1亚型、H2N2亚型、H3N2亚型及所有亚型的禽流感病毒中的至少一种。
在第一方面的实施例中，所述应用选自：干扰流感病毒的感染进程；抑制流感病毒的生长；抑制流感病毒增殖；抑制流感病毒mRNA合成；抑制流感病毒NP蛋白合成；改善或避免感染流感病毒引起机体的细胞损伤；改善或避免感染流感病毒引起机体的肺泡结构损伤；改善或避免感染流感病毒引起机体的心肌组织损伤；或消除、改善或避免感染流感病毒引起机体的中耳炎中的至少一项。
在第一方面的实施例中，浓度不低于5μM的CVT-313抑制流感病毒增殖。
在第一方面的实施例中，浓度不低于5μM的CVT-313抑制流感病毒mRNA合成。
在第一方面的实施例中，浓度不低于5μM的CVT-313抑制流感病毒NP蛋白合成。
第二方面，实施例公开了一种组合物。所述组合物包括具有抗流感病毒有效量的CVT-313或其与其它抗病毒药物或抗炎症药物和药学上可接受的辅料。在第二方面的一些实施例中，所述药学上可接受的辅料选自溶剂、分散剂、稀释剂、填充剂、润湿剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、防腐剂、助悬剂、乳化剂、赋形剂、调味剂和载体中一种或多种。在一些实施例中，所述组合物的剂型包括片剂、胶囊、颗粒剂、滴丸剂、液体制剂、煎膏剂、栓剂、凝胶剂、气雾剂或贴剂。
第三方面，实施例公开了一种组合物。该组合物包括CVT-313和其他组分。所述其他组分选自抗病毒药(金刚烷胺、金刚乙胺、巴洛沙韦、奥司他韦、扎那米韦、帕拉米韦、利巴韦林、干扰素、阿比多尔、瑞德西韦)；非甾体抗炎药(阿司匹林、布洛芬、萘普生、双氯芬酸、吲哚美辛、酮洛芬、美洛昔康、塞来昔布、吡罗昔康、舒林达)；糖皮质激素(强的松、甲强的松龙、地塞米松、氢化可的松、曲安奈德、倍他米松)；其它消炎药(秋水仙碱、别嘌呤醇、非布司他、甲氨蝶呤、TNF抑制剂、IL-6抑制剂、JAK抑制剂、选择性COX-2抑制剂)中的至少一种。
第四方面，实施例公开了一种抗流感病毒的药物。所述药物为包含浓度不低于0.01μM CVT-313的液体制剂。该药物能够为单剂量或者多剂量形式。可选地，所述CVT-313在该药物中的终浓度为0.01μM-500μM。该浓度是指如液体制剂的组合物中CVT-313的终浓度，治疗时服用的CVT-313量根据终浓度、剂量形式和待治疗的个体调整以保证达到治疗有效量。
在第四方面的一些实施例中，所述药物为包含浓度不低于5μM CVT-313的液体制剂。在一些实施例中，该药物为包含浓度不低于10μM CVT-313的液体制剂。在一些实施例中，该药物为包含浓度不低于15μMCVT-313的液体制剂。在一些实施例中，该药物为包含浓度不低于20μM CVT-313的液体制剂。在一些实施例中，该药物为包含浓度不低于25μM CVT-313的液体制剂。在一些实施例中，该药物为包含浓度不低于30μM CVT-313的液体制剂。在一些实施例中，所述药物为包含浓度不低于35μM CVT-313的液体制剂。在一些实施例中，所述药物为包含浓度不低于40μM CVT-313的液体制剂。在一些实施例中，所述药物为包含浓度不低于80μM CVT-313的液体制剂。
一个测试例发现，CVT-313对A549细胞存活几乎无影响。
一个测试例发现，CVT-313在5～20μM的浓度范围内对A549细胞中的流感病毒增殖有显著的抑制作用，且呈现良好的量效关系。
一个测试例发现，CVT-313在5～20μM的浓度范围内对A459细胞内流感病毒mRNA合成有显著的抑制作用，且呈现良好的量效关系。
一个测试例发现，CVT-313在5～10μM的浓度范围内对A549细胞内流感病毒蛋白合成有显著的抑制作用，且呈现良好的量效关系。
术语“药学上可接受的辅料”是指不干扰化合物CVT-313的生物活性的效力并在其施用的治疗有效量浓度下对机体不具有明显毒性的组分，包括溶剂、分散剂、稀释剂、填充剂、润湿剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、防腐剂、助悬剂、乳化剂、赋形剂、调味剂等和载体中的任意一种或至少两种的组合。将前述组分用于药学活性物质是本领域所熟知的。例如，所述溶剂包括但不限于：二甲基亚砜(DMSO)和乙醇。所述载体包括但不限于：聚乙二醇、聚羟基乙氧基化蓖麻油、花生油、橄榄油、明胶、乳糖、石膏粉、蔗糖、环糊精、直链淀粉、硬脂酸镁、果胶、阿拉伯胶、硬脂酸或纤维素的低级烷基醚。各组分能够单独使用或与多种混合使用。
术语“有效量”、“治疗有效量”是指服用后足以在某种程度上缓解所治疗的疾病或病症的一个或多个症状所需的化合物、试剂、制剂或组合物的量，其预期目标能够为症状或病因的消减和/或缓解，或机体的任何其他所需变化。例如，治疗有效量是在临床上提供显著的病症缓解效果所需的包含本申请公开化合物的组合物的量，可使用诸如剂量递增试验的技术测定适合于任意个体病例中的有效量。治疗有效量将根据化合物活性、病毒感染引起的病症及其严重程度，以及待治疗的个体的大小和健康情况等而变化。示例性地，在小鼠模型中的治疗有效量能够为1mg/kg-150mg/kg，优选为1mg/kg-100mg/kg，更优地，为5mg/kg-30mg/kg，如10mg/kg或20mg/kg，2次/天。
术语”治疗”及其类似语涵盖对人类或人以外的动物的任何疗法，治疗能够针对已有的病症，或者能够是预防性的(预防性治疗)，其包括治愈、减轻或预防效果。治疗还能够包括治愈、减轻或预防与疾病有关的症状而不是作用于疾病的潜在起因。术语“预防”及其类似语包括使病患减少疾病或病症的发生或恶化的可能性，如针对暴露流感病毒环境后尚未出现流感病毒感染的服药期内，治疗能够是针对初次感染或潜伏病毒激活后的感染的治疗。
本申请所提供的组合物能够适应于任何形式的给药方式进行抗流感病毒的预防和/或治疗，包括但不仅限于口服、鼻腔、经皮、静脉内及肠胃给药，优选通过口服途径给药。本领域技术人员可根据给药方式，选择合适的制剂形式，例如，用于口服给药时，可制成常规的固体制剂及液体制剂。在一些具体的实施方式中，剂型包括但不限于：片剂、胶囊、颗粒剂、滴丸剂、液体制剂、煎膏剂、栓剂、凝胶剂、气雾剂或贴剂等。
附图说明
图1为实施例提供的不同浓度CVT-313对A549细胞存活率影响的结果图。“***”表示与未处理对照孔(Cell)的差异极显著(P<0.001)。“CVT-313+Concentration”为药物处理孔。
图2为实施例提供的不同浓度CVT-313在A549细胞上对流感病毒增殖的抑制作用结果图。“***”表示与病毒组的差异极显著(P<0.001)。“Mock”为不感染病毒的空白细胞组，“ND”表示未检出。“Virus”为病毒组，“Virus+CVT-313”为测试组。
图3为实施例提供的不同浓度CVT-313在A549细胞上对流感病毒mRNA合成的抑制作用结果图。“***”表示与病毒组的差异极显著(P<0.001)。“Mock”为不感染病毒的空白细胞组，“ND”表示未检出。“Virus”为病毒组，“Virus+CVT-313”为测试组。
图4为实施例提供的Western Blot分析不同浓度CVT-313在A549细胞上对流感病毒NP蛋白合成的抑制作用结果图。“IAV”表示流感病毒，“+”表示感染流感病毒，“-”表示未感染流感病毒。
具体实施方式
为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。本申请中未详细单独说明的试剂均为常规试剂，均可从商业途径获得；未详细特别说明的方法均为常规实验方法，可从现有技术中获知。
流感病毒属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)，流感病毒属。根据病毒粒子核蛋白(NP)和基质蛋白(M)的抗原特性及基因特性的不同，流感病毒分为A、B、C三型，也称甲、乙、丙三型。A型流感病毒全基因组由8条大小不等的单股负链RNA组成，分别以节段1至节段8命名。病毒基因组全长约13.6kb，编码10种结构蛋白(PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M1、M2、PB1-F2和NS2/NEP)和非结构蛋白(NS1)。根据病毒粒子表面糖蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的不同，A型流感病毒可进一步分为17个H(H1-H17)和10个N(N1-N10)亚型。人流感病毒主要是H1、H2和H3亚型。而目前危害严重的高致病性禽流感多为H5、H7和H9亚型，其中以H5N1亚型致死率最高。B型流感病毒常引起流感局部流行，不引起世界性流感大暴发，仅在人和海豹中发现。C型流感病毒多以散在形式存在，主要侵袭婴幼儿，一般不引起流感流行，可感染人类和猪。流感病毒自20世纪初发现以来已在全球范围内造成五次大流行，十年左右会产生一次暴发流行，在全球范围内造成了巨大的损失。流感流行每年可致25万～50万例死亡，300万～500万重病例，全球约共有5～15％的人被感染。流感暴发给全球经济带来巨大负担，严重威胁人类健康。尽管可以通过疫苗和现有抗流感病毒药物预防和治疗流感，但流感病毒的高度变异，使疫苗具有滞后性，无法预防新毒株的流行，并且使现有药物无法对耐药毒株产生抗病毒作用。因此，亟需开发新的抗流感病毒药物，尤其是开发针对新靶点的抗病毒药物。
本申请中，一些测试例测试了CVT-313对流感病毒增殖的抑制作用。一些测试例测试了CVT-313对流感病毒mRNA合成的抑制作用。一些测试例测试了CVT-313对流感病毒NP合成的抑制作用。
1、测试材料
A549细胞：购自美国菌种保藏中心(ATCC)；
病毒株：A型流感病毒H1N1亚型A/Puerto Rico/8/1934，由中国科学院武汉病毒研究所病毒保藏中心提供。
CVT-313购自陶术生物有限公司。
DMEM培养基，胎牛血清(FBS)均购于GIBCO公司。
CellLuminescent细胞增殖检测试剂盒购自Promega公司。
2、CVT-313无细胞毒性测试
(1)细胞培养
将冻存的A549细胞复苏并经过2次传代后，用含10％胎牛血清和双抗(青霉素100U/mL，链霉素100μg/mL)的DMEM培养基扩大培养，接种密度不低于5×105cell/mL，传代密度不高于2×106cell/mL。
(2)供试品溶液的配制
配制含10mM CVT-313的DMSO溶液，以作为供试品溶液。
(3)无细胞毒性测试
药物处理孔(CVT-313+Concentration)：A549细胞按2.5×105细胞/孔(体积100μL)接种于96孔细胞培养板中，用新鲜的DMEM对该供试品溶液进行稀释成10个浓度梯度，每个浓度梯度设3个复孔，使其终浓度为2.5μM、5μM、10μM、20μM、40μM和80μM。培养24h后，弃掉上清。向剩余细胞中加入含有30％Cell titer-glo试剂的磷酸盐缓冲液(PBS)100μL，室温孵育10min后用Varioskan LUX酶标仪检测OD450读数。
未处理对照孔(Cell)：与药物处理孔的区别在于，未添加供试品溶液。
计算细胞存活率(％)＝(药物处理孔的OD450/未处理对照孔的OD450)×100％
如图1可知，CVT-313对A549细胞的无细胞毒性。
3、病毒增殖抑制测试
(1)感染病毒的细胞液制备
将冻存的A549细胞复苏并经过2次传代后，用含10％胎牛血清和双抗(青霉素100U/mL，链霉素100μg/mL)的DMEM培养基扩大培养，接种密度不低于5×105cell/mL，传代密度不高于2×106cell/mL。
去除2×106cell/mL的A549细胞液中的培养基，用PBS清洗2遍后，加入新鲜DMEM稀释至0.3MOI(感染复数)的H1N1 PR8病毒进行感染，37℃孵育1h，弃去病毒上清，PBS清洗1遍，得到感染病毒的细胞液。
(2)分组测试
将得到的H1N1 PR8病毒液分别为测试组(Virus+CVT-313)和病毒组(Virus)。另外，以上述2×106cell/mL的A549细胞液作为空白细胞组(Mock)，不接种病毒和进行CVT-313处理。
其中，测试组分别用新鲜DMEM稀释并加入病毒液中至终浓度为5μM、10μM、20μM的CVT-313。病毒组和空白细胞组不进行CVT-313处理。将各组病毒液或细胞液继续培养，24h后终止培养收集样品。于-80℃和4℃反复冻融，使细胞充分裂解，致使细胞内的病毒全部释放进入细胞上清，然后收集各孔上清液。取出冻融好的样品置于冰上，用新鲜的DMEM持续10倍倍比稀释8次。取出A549细胞，PBS清洗。接种稀释后样品，100μL/孔，一列为一个稀释度，每一组均接种不含病毒的维持液作为阴性对照，继续培养。2h后，PBS洗2次，更换空白维持液，继续培养。72h后，记录细胞病变情况，计算病毒滴度(TCID50值)。
如图2可知，CVT-313在5～20μM的浓度范围内对A549细胞中的流感病毒增殖有显著的抑制作用，且呈现良好的量效关系。
4、对流感病毒mRNA合成抑制测试
(1)感染病毒的细胞液制备
将冻存的A549细胞复苏并经过2次传代后，用含10％胎牛血清和双抗(青霉素100U/mL，链霉素100μg/mL)的DMEM培养基扩大培养，接种密度不低于5×105cell/mL，传代密度不高于2×106cell/mL。
去除2×106cell/mL的A549细胞液中的培养基，用PBS清洗2遍后，加入新鲜DMEM稀释至0.3MOI(感染复数)的H1N1 PR8病毒进行感染，37℃孵育1h，弃去病毒上清，PBS清洗1遍，得到感染病毒的细胞液。
(2)分组测试
将得到的H1N1 PR8病毒液分别为测试组(Virus+CVT-313)和病毒组(Virus)。另外，以上述2×106cell/mL的A549细胞液作为空白细胞组(Mock)，不接种病毒和进行CVT-313处理。
其中，测试组分别用新鲜DMEM稀释并加入病毒液中至终浓度为5μM、10μM、20μM的CVT-313。病毒组和空白细胞组不进行CVT-313处理。将各组病毒液或细胞液继续培养，24h后终止培养收集样品。于-80℃和4℃反复冻融，使细胞充分裂解，致使细胞内的病毒全部释放进入细胞上清，然后收集各孔上清液。用总RNA极速抽提试剂盒(上海飞捷生物技术有限公司)推荐的操作方法，将收集到的细胞上清液进行总RNA抽提。提取RNA后立即进行反转录，以cDNA为模板，GAPDH为内参基因，Real Time PCR检测流感病毒NP基因的拷贝数；以正常对照组做参照，评价NP mRNA的变化情况。
其中，流感病毒NP基因上下游引物序列：
NSP9-F:AGCATTGTTCCAACTCCTTT，SEQ ID NO.1
NSP9-R:GACGATGCAACGGCTGGTCTG，SEQ ID NO.2
GAPDH基因上下游引物序列：
GAPDH-F:TGGGGAAGGTGAAGGTCG，SEQ ID NO.3
GAPDH-R:TAAAAGCAGCCCTGGTGACC，SEQ ID NO.4。
如图3可知，CVT-313在5～20μM的浓度范围内，对A459细胞内流感病毒mRNA合成有显著的抑制作用，且呈现良好的量效关系。
5、对流感病毒NP蛋白合成抑制测试
(1)感染病毒的细胞液制备
将冻存的A549细胞复苏并经过2次传代后，用含10％胎牛血清和双抗(青霉素100U/mL，链霉素100μg/mL)的DMEM培养基扩大培养，接种密度不低于5×105cell/mL，传代密度不高于2×106cell/mL。
去除2×106cell/mL的A549细胞液中的培养基，用PBS清洗2遍后，加入新鲜DMEM稀释至0.3MOI(感染复数)的H1N1 PR8病毒进行感染，37℃孵育1h，弃去病毒上清，PBS清洗1遍，得到感染病毒的细胞液。
(2)分组测试
将得到的H1N1 PR8病毒液分别为测试组(Virus+CVT-313)和病毒组(Virus)。另外，以上述2×106cell/mL的A549细胞液作为空白细胞组(Mock)，不接种病毒和进行CVT-313处理。
其中，测试组分别用新鲜DMEM稀释并加入病毒液中至终浓度为5μM、10μM、20μM的CVT-313。病毒组和空白细胞组不进行CVT-313处理。将各组病毒液或细胞液继续培养，24h后终止培养收集样品。弃去上清液，用PBS洗2遍。将细胞培养板放置在冰上，使用RIPA裂解液裂解后，经12000转/分钟离心10分钟，取上清液用BCA法测定各样品蛋白浓度后，采用Western Blot检测流感病毒的NP蛋白和内参蛋白GAPDH的条带，实验所需试剂均购于上海碧云天生物科技有限公司。
如图4可知，CVT-313在5～10μM的浓度范围内，对A549细胞内流感病毒蛋白合成有显著的抑制作用，且呈现良好的量效关系。
综上结果可以看出，CVT-313在A549细胞上有良好的抗流感病毒活性，可以用于开发治疗流感病毒感染的药物，具有广阔的应用前景。
以上所述，仅为本申请较佳的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.CVT-313在制备抗流感病毒药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其中，所述流感病毒选自甲、乙型流感病毒中的一种或多种。
3.根据权利要求2所述的应用，其中，所述流感病毒选自甲型流感病毒H1N1亚型、H2N2亚型、H3N2亚型及所有亚型的禽流感病毒中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的应用，其中，所述应用选自：
避免或降低流感病毒的感染率；
抑制流感病毒生长；
抑制流感病毒增殖；
抑制流感病毒RNA合成；
抑制流感病毒NP蛋白合成；
改善或避免感染流感病毒引起机体的细胞损伤；
改善或避免感染流感病毒引起机体的肺泡结构损伤；
改善或避免感染流感病毒引起机体的心肌组织损伤；或
消除、改善或避免感染流感病毒引起机体的中耳炎
中的至少一项。
5.根据权利要求3所述的应用，
可选地，浓度不低于5μM的CVT-313抑制流感病毒增殖；
可选地，浓度不低于5μM的CVT-313抑制流感病毒mRNA合成；
可选地，浓度不低于5μM的CVT-313抑制流感病毒NP蛋白合成。
6.一种组合物，包括：具有抗流感病毒有效量的CVT-313和药学上可接受的辅料。
7.根据权利要求5所述的组合物，其中，所述药学上可接受的辅料选自溶剂、分散剂、稀释剂、填充剂、润湿剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、防腐剂、助悬剂、乳化剂、赋形剂、调味剂和载体中一种或多种。
8.根据权利要求5所述的组合物，所述组合物的剂型包括片剂、胶囊、颗粒剂、滴丸剂、液体制剂、煎膏剂、栓剂、凝胶剂、气雾剂或贴剂。
9.一种抗流感病毒的组合物，其包含CVT-313和其他组分；
所述其他组分选自抗病毒药(金刚烷胺、金刚乙胺、巴洛沙韦、奥司他韦、扎那米韦、帕拉米韦、利巴韦林、干扰素、阿比多尔、瑞德西韦)；非甾体抗炎药(阿司匹林、布洛芬、萘普生、双氯芬酸、吲哚美辛、酮洛芬、美洛昔康、塞来昔布、吡罗昔康、舒林达)；糖皮质激素(强的松、甲强的松龙、地塞米松、氢化可的松、曲安奈德、倍他米松)；其它消炎药(秋水仙碱、别嘌呤醇、非布司他、甲氨蝶呤、TNF抑制剂、IL-6抑制剂、JAK抑制剂、选择性COX-2抑制剂)中的至少一种。
10.一种抗流感病毒的药物，其为包含浓度不低于0.01μM的液体制剂。
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