CN117959266A - 一种藏红花酸-聚乙二醇单甲醚偶联物纳米颗粒及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种藏红花酸‑聚乙二醇单甲醚偶联物纳米颗粒，所述偶联物纳米颗粒的结构式为：所述偶联物纳米颗粒在水溶液中自组装形成，形成三嵌段偶联物，该偶联物具有两亲性结构，再通过在水溶液中自组装形成偶联物纳米颗粒，显著提高水溶性，本发明还提供了藏红花酸‑聚乙二醇单甲醚偶联物纳米颗粒的制备方法及其应用。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体地，涉及一种藏红花酸-聚乙二醇单甲醚偶联物纳米颗粒及其制备方法与应用。
背景技术
藏红花酸(TC)具有多种药理作用，如抗氧化，抗炎，神经保护、心脏保护、肝保护、抗抑郁、抗血管生成、治疗烧伤、降血脂、改善哮喘、老年痴呆、糖尿病、结肠炎以及视网膜损伤，抗肿瘤等。近年来的研究证明藏红花酸具有较好的抗氧化活性，其通过良好的抗氧化活性在肝保护，肾保护，抗老年痴呆等病症中达到治疗效果。但是，藏红花酸是以异戊二烯为残基的具有共轭双键的多烯化合物，由于藏红花酸几乎不溶于水，水溶性差成为限制其药用的主要因素之一。
发明内容
本发明的目的是针对以上水溶性的不足，提供一种藏红花酸-聚乙二醇单甲醚偶联物纳米颗粒及其制备方法与应用，旨在通过酯化反应制备藏红花酸-聚乙二醇单甲醚偶联物，偶联物在水中自组装形成纳米颗粒，进一步改进藏红花酸-聚乙二醇单甲醚偶联物纳米颗粒水溶性，提高抗氧化能力和抗肿瘤活性。
本发明一方面提供了一种藏红花酸-聚乙二醇单甲醚偶联物纳米颗粒，所述偶联物的结构式为：
所述偶联物纳米颗粒在水溶液中自组装形成。
本发明第二方面提供了一种藏红花酸-聚乙二醇单甲醚偶联物纳米颗粒的制备方法，具体步骤为：
1)取藏红花酸溶解于有机溶剂中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、4-二甲氨基吡啶和三乙胺后搅拌、升温反应，得反应液1；
2)往上步反应液1中加入聚乙二醇单甲醚，继续反应，反应完成后旋蒸去除有机溶剂，得中间体1；
3)将中间体1加入蒸馏水中，使用超声溶解分散后，装入透析袋中透析，透析完成后，将透析袋内的混合物离心，分离沉淀和上清液，上清液用冻干机冻干，得到藏红花酸-聚乙二醇单甲醚偶联物纳米颗粒。
进一步的，所述步骤1)中有机溶剂为二氯甲烷、二氯乙烷、石油醚、环已烷中任一种或其组合。
进一步的，所述步骤1)中所述藏红花酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、4-二甲氨基吡啶和三乙胺的摩尔质量比为1:2.5:2.5:2.5，所述升温反应温度为35—50°，所述反应时间为30—60min。
进一步的，所述步骤2)中所述聚乙二醇单甲醚分子量为550—2000。
进一步的，所述步骤2)中所述聚乙二醇单甲醚和藏红花酸物质量比为1:2.5，所述反应时间为24—36h。
进一步的，所述步骤3)中所述蒸馏水与藏红花酸质量比为50—100:1。
进一步的，所述步骤3)中所述透析具体条件为：透析3—4天，一天更换3—4次水。
本发明第三方面还提供了一种藏红花酸-聚乙二醇单甲醚偶联物纳米颗粒的应用，所述偶联物纳米颗粒用于肝癌细胞的抑制增殖和抗氧化。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明利用疏水性藏红花酸的两端的羧基与亲水性聚合物聚乙二醇单甲醚通过酯化反应偶联，形成三嵌段偶联物，该偶联物具有两亲性结构，再通过在水溶液中自组装形成偶联物纳米颗粒，显著提高藏红花酸中活性基团的水溶性，由于水溶性提高，更易于捕获溶液中的活性氧自由基，因此可提高藏红花酸-聚乙二醇单甲醚偶联物纳米颗粒的抗氧化能力；同时藏红花酸-聚乙二醇单甲醚偶联物纳米颗粒可以通过内吞途径被肿瘤细胞摄取，有利于肿瘤细胞摄取，因此提高了藏红花酸-聚乙二醇单甲醚偶联物纳米颗粒的抗肿瘤活性。
附图说明
图1为本发明实施例1中制备的TC-mPEG550的核磁图；
图2为本发明实施例2中制备的TC-mPEG1000的核磁图；
图3为本发明实施例3中制备的TC-mPEG2000的核磁图；
图4为本发明中藏红花酸(TC)，TC-mPEG550、TC-mPEG1000、TC-mPEG2000的红外图；
图5为本发明中藏红花酸(TC)的标准曲线图；
图6为本发明中藏红花酸(TC),TC-mPEG550、TC-mPEG1000、TC-mPEG2000的DPPH自由基清除率图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明，所述方法如无特别说明均为常规方法，所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径而得。
此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
在实施例中所述药品和试剂来源如下：
藏红花酸(TC)：TCI，＞99.0％
1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐：安耐吉化学，＞98.0％
4-二甲氨基吡啶：安耐吉化学，＞98.0％
二氯甲烷：上海凌峰化学试剂有限公司，≥99.9％
二氯乙烷：上海凌峰化学试剂有限公司，≥99.9％
正已烷：上海凌峰化学试剂有限公司，≥99.9％
三乙胺：国药集团化学试剂有限公司，≥99.5％
聚乙二醇单甲醚(mPEG550)：TCI，＞99.0％
聚乙二醇单甲醚(mPEG1000)：TCI，＞99.0％
聚乙二醇单甲醚(mPEG2000)：TCI，＞99.0％
1,1-二苯基-2-三硝基苯肼：TCI，＞99.0％
乙醇：国药集团化学试剂有限公司，≥99.9％
具体制备方法如下：
1)取藏红花酸溶解于有机溶剂中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、4-二甲氨基吡啶和三乙胺后搅拌、升温反应，得反应液1；
2)往上步反应液1中加入聚乙二醇单甲醚，继续反应，反应完成后旋蒸去除有机溶剂，得中间体1；
3)将中间体1加入蒸馏水中，使用超声溶解分散后，装入透析袋中透析，透析完成后，将透析袋内的混合物离心，分离沉淀和上清液，上清液用冻干机冻干，得到藏红花酸-聚乙二醇单甲醚偶联物纳米颗粒。此步骤根据使用的不同分子量的聚乙二醇单甲醚选择不同型号的透析袋，使用mPEG550和mPEG1000时选用截留分子量1000的透析袋，使用mPEG2000时选用截留分子量3500的透析袋。
下面结合原料的投料量和具体的反应条件在实施例1-3中详细阐述，并通过实验例1-5中水溶性评价、粒径电位测定、藏红花酸标准曲线测定、DPPH自由基清除能力、肿瘤细胞抑制活性的实验来验证本发明的有益效果。
实施例1
1)取藏红花酸(TC)100mg溶解于100mL二氯甲烷中，以藏红花酸(TC)计按摩尔比例顺序加入10倍量1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、2.5倍量4-二甲氨基吡啶和2.5倍量三乙胺后搅拌、升温至35°左右反应，持续反应30min，得反应液1；
2)往上步反应液1中加入以藏红花酸(TC)计2.5倍摩尔量聚乙二醇单甲醚，保持在35°左右，继续反应24h，反应完成使用旋转蒸发仪减压去除二氯甲烷，得中间体1；
3)将中间体1加入5ml蒸馏水中，使用超声溶解分散后，装入截留分子量1000的透析袋中透析，透析3天，一天更换三次水，透析完成后，将透析袋内的混合物离心，分离沉淀和上清液，上清液用冻干机冻干，得到藏红花酸-聚乙二醇单甲醚偶联物纳米颗粒TC-mPEG550。
如图1核磁图所示1-4ppm处有信号，这是藏红花酸共轭多烯烃链上四个甲基以及聚乙二醇单甲醚上的甲基的信号；2.5ppm处是二甲基亚砜的信号；3.3ppm是水的信号；3.6ppm是聚乙二醇单甲醚的亚甲基信号；6-7ppm处是藏红花酸共轭多烯烃链的信号。如图4中TC-mPEG550曲线所示红外图中约1700cm-1的吸收峰为酯键特征峰，由此证明，藏红花酸与聚乙二醇单甲醚(mPEG550)成功偶联。
实施例2
1)取藏红花酸(TC)100mg溶解于100mL二氯乙烷中，以藏红花酸(TC)计按摩尔比例顺序加入10倍量1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、2.5倍量4-二甲氨基吡啶和2.5倍量三乙胺后搅拌、升温至40°左右反应，持续反应30min，得反应液1；
2)往上步反应液1中加入以藏红花酸(TC)计2.5倍摩尔量聚乙二醇单甲醚，保持在35°左右，继续反应36h，反应完成使用旋转蒸发仪减压去除二氯乙烷，得中间体1；
3)将中间体1加入8ml蒸馏水中，使用超声溶解分散后，装入截留分子量1000的透析袋中透析，透析3天，一天更换三次水，透析完成后，将透析袋内的混合物离心，分离沉淀和上清液，上清液用冻干机冻干，得到藏红花酸-聚乙二醇单甲醚偶联物纳米颗粒TC-mPEG1000。
如图2所述1-4ppm处有信号，这是藏红花酸共轭多烯烃链上四个甲基以及聚乙二醇单甲醚上的甲基的信号；2.5ppm处是二甲基亚砜的信号，3.3ppm是水的信号；3.6ppm是聚乙二醇单甲醚的亚甲基信号；6-7ppm处是藏红花酸共轭多烯烃链的信号。如图4中TC-mPEG1000曲线所示红外图中约1700cm-1的吸收峰为酯键特征峰，由此证明，藏红花酸与聚乙二醇单甲醚(mPEG1000)成功偶联。
实施例3
1)取藏红花酸(TC)100mg溶解于100mL正已烷中，以藏红花酸(TC)计按摩尔比例顺序加入10倍量1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、2.5倍量4-二甲氨基吡啶和2.5倍量三乙胺后搅拌、升温至40°左右反应，持续反应30min，得反应液1；
2)往上步反应液1中加入以藏红花酸(TC)计2.5倍摩尔量聚乙二醇单甲醚，保持在45°左右，继续反应28h，反应完成使用旋转蒸发仪减压去除正已烷，得中间体1；
3)将中间体1加入8ml蒸馏水中，使用超声溶解分散后，装入截留分子量1000的透析袋中透析，透析3天，一天更换三次水，透析完成后，将透析袋内的混合物离心，分离沉淀和上清液，上清液用冻干机冻干，得到藏红花酸-聚乙二醇单甲醚偶联物纳米颗粒TC-mPEG2000。
如图3所述1-4ppm处有信号，这是藏红花酸共轭多烯烃链上四个甲基以及聚乙二醇单甲醚上的甲基的信号；2.5ppm处是二甲基亚砜的信号，3.3ppm是水的信号；3.6ppm是聚乙二醇单甲醚的亚甲基信号；6-7ppm处是藏红花酸共轭多烯烃链的信号。如图4中TC-mPEG2000曲线所示红外图中约1700cm-1的吸收峰为酯键特征峰，由此证明，藏红花酸与聚乙二醇单甲醚(mPEG2000)成功偶联。
实验例1
水溶性评价
取过量的藏红花酸和藏红花酸-聚乙二醇单甲醚偶联物纳米颗粒(M1)于容量瓶中,分别加入一定量的蒸馏水得到过饱和溶液，将其置于水浴恒温振荡器(37C.120r min)饱和24h后经0.2um微孔滤膜过滤,计算未溶解的样品质量(M0)，按照下式计算其水溶性。
C＝(M1-M0)/V
各样品的饱和溶液平行配制3份样品，计算平均值。各样品的饱和水溶性结果见表1。从水溶性结果可以看出藏红花酸-聚乙二醇单甲醚偶联物纳米颗粒相比藏红花酸水溶性大大提高。水溶性大小依次是TC-mPEG2000，TC-mPEG1000，TC-mPEG550。
表1各样品的饱和水溶解度
实验例2
粒径电位测定
用Zetasizer Nano ZS90激光粒度仪测定TC-mPEG550、TC-mPEG1000、TC-mPEG2000的粒径，多分散性系数和Zeta电位。结果如表2所示。表2结果显示各藏红花酸-聚乙二醇单甲醚偶联物纳米颗粒均在水溶液中自组装形成纳米颗粒，粒径大小都在400-500nm之间，TC-mPEG550粒径大小为485nm，TC-mPEG1000粒径大小为429nm，TC-mPEG2000的粒径大小为462nm。分散系数最好的是TC-mPEG550，分散系数为0.4，其次是TC-mPEG2000，分散系数为0.595，TC-mPEG1000分散系数最差，其值为0.985。各偶联物自组装纳米粒均带有正电荷，其中TC-mPEG550的电荷最低，TC-mPEG2000电荷最高。
表2藏红花酸-聚乙二醇单甲醚偶联物的粒径，电位，PDI数据
实验例3
藏红花酸标准曲线测定
取一定量的藏红花酸完全溶解在无水乙醇中，将其稀释成10ug/ml、20ug/ml、30ug/ml，使用酶标仪测量其OD值，绘制其标准曲线，如图5所示。
载药量
将适量的藏红花酸-聚乙二醇单甲醚偶联物纳米颗粒(M1)溶解于无水乙醇中，测定其OD值在标准曲线OD值范围内，带入得到藏红花酸-聚乙二醇单甲醚偶联物纳米颗粒中藏红花酸的含量(M2)。
载药量＝M2/M1
载药量如表3所示。表3结果显示TC-mPEG550的载药量为12.5％，TC-mPEG的载药量为6.2％，TC-mPEG2000的载药量为1.2％，随着偶联的mPEG分子量增大，其载药量也逐渐变低，推测原因是因为mPEG分子量增大导致与藏红花酸偶联更加困难。
表3各样品的载药量
实验例4
DPPH自由基清除能力
称取1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)6mg，用无水乙醇配置成100mL溶液，超声5分钟，避光保存。将藏红花酸(TC)、TC-mPEG550、TC-mPEG1000、TC-mPEG2000分别稀释成1.06ug/mL，3.12ug/mL，6.25ug/mL，12.5ug/mL，25ug/mL的样品溶液。各取2mL装入5mL试管中，再分别精密加入DPPH溶液2mL，混合均匀，于25℃条件下避光保存40min后，用酶标仪在波长517nm处测定其吸光度(Ai)，同时分别测定样品溶液2mL+无水乙醇2mL的吸光度(Aj)，无水乙醇2mL+DPPH溶液2mL吸光度(A0)，按下式计算对自由基的清除率。
清除率(％)＝[1－(Ai－Aj)/A0]×100％
得到图6DPPH自由基清除率。从图6中可以看出，TC-mPEG550、TC-mPEG1000的DPPH自由基清除率在不同浓度下均高于TC，TC-mPEG2000的DPPH自由基清除率略高于TC。DPPH自由基清除率由高到低依次为TC-mPEG550、TC-mPEG1000、TC-mPEG2000、TC。
实验例5
肿瘤细胞抑制活性
1.实验药品
藏红花酸(TC)，TC-mPEG550,TC-mPEG1000，TC-mPEG2000。
2.细胞株
人肝癌细胞(HepG2)购自中国科学院上海细胞库。用10％胎牛血清的DMEM培养基在37℃、5％CO2、培养箱中常规培养，48h更换培养基，细胞生长达饱和状态时，用0.25％胰蛋白酶消化传代，2-3天传代1次，实验选用对数生长期细胞。
3.DMEM培养液的配制
胎牛血清5mL，青霉素溶液(20万U/mL)链霉素溶液(20万U/mL)0.5mL,加DMEM培养基最后定容至50mL。
4.细胞活性检测
采用MTT[3-(4,5)-双甲基-2-噻唑-(2,5)-苯基溴化四氮唑蓝]法来测定藏红花酸以及藏红花酸-聚乙二醇单甲醚偶联物对人肝癌细胞HePG2的增殖活性的影响。
加药:将测试药液按照最终浓度的浓度梯度分别加入到各个孔中，每个浓度设4个平行孔。实验分为药物试验组(分别加入不同浓度的测试药)，对照组(只加培养液和细胞，不加测试药)和空白组(只加培养液，不加细胞和测试药)。将加药后的96孔板置于37℃，5％CO2培养箱中培养24h。
存活细胞的测定:在培养了24h后的96孔板中，每孔加MTT 20u1(用PBS缓冲液配成5mg/mL)。在37℃放置4h后，移去上清液。每孔加200u1DMSO,振荡30min。最后利用自动酶标仪在490nm波长处检测各孔的光密度(OD值)。
抑制率的计算:细胞生长的抑制率按照下列公式计算:
生长抑制率＝(1-存活率)×100％＝[1-(OD实验—OD空白)/(OD对照-OD空白)]×100％(OD实验表示测试药物组的平均光密度,OD对照表示对照组的平均光密度,OD空白表示对照组的平均光密度)。
藏红花酸-聚乙二醇单甲醚偶联物对HepG2细胞增殖抑制活性见表4。表4结果显示藏红花酸-聚乙二醇单甲醚偶联物对HepG2细胞具有较强的增殖抑制作用，且呈现浓度依赖性。TC-mPEG550、TC-mPEG1000的IC50值分别是18.51ug/mL、19.28ug/mL。TC-mPEG2000的抑制效果不如TC-mPEG550,TC-mPEG1000，没有IC50值。但所有偶联物的抑制效果都大于藏红花酸。
表4各样品不同浓度对肿瘤细胞的抑制率
以上已经描述了本发明的各实施例和实验例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和技术原理的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的，这些修改和变更也应视为本发明的保护。
Claims (9)
1.一种藏红花酸-聚乙二醇单甲醚偶联物纳米颗粒，其特征在于，所述偶联物纳米颗粒的结构式为：
所述偶联物纳米颗粒在水溶液中自组装形成。
2.一种如权利要求1所述的藏红花酸-聚乙二醇单甲醚偶联物纳米颗粒的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
1)取藏红花酸溶解于有机溶剂中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、4-二甲氨基吡啶和三乙胺后搅拌、升温35—50°,反应30—60min，得反应液1；
2)往上步反应液1中加入聚乙二醇单甲醚，继续反应24—36h，反应完成后旋蒸去除有机溶剂，得中间体1；
3)将中间体1加入蒸馏水中，使用超声溶解分散后，装入透析袋中透析，透析完成后，将透析袋内的混合物离心，分离沉淀和上清液，上清液用冻干机冻干，得到藏红花酸-聚乙二醇单甲醚偶联物纳米颗粒。
3.如权利要求2所述的藏红花酸-聚乙二醇单甲醚偶联物纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中有机溶剂为二氯甲烷、二氯乙烷、石油醚、环已烷中任一种或其组合。
4.如权利要求2所述的藏红花酸-聚乙二醇单甲醚偶联物纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中所述藏红花酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、4-二甲氨基吡啶和三乙胺的摩尔质量比为1:2.5:2.5:2.5。
5.如权利要求2所述的藏红花酸-聚乙二醇单甲醚偶联物纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中所述聚乙二醇单甲醚分子量为550—2000。
6.如权利要求2所述的藏红花酸-聚乙二醇单甲醚偶联物纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中所述聚乙二醇单甲醚和藏红花酸物质量比为1:2.5。
7.如权利要求2所述的藏红花酸-聚乙二醇单甲醚偶联物纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述步骤3)中所述蒸馏水与藏红花酸质量比为50—100:1。
8.如权利要求2所述的藏红花酸-聚乙二醇单甲醚偶联物纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述步骤3)中所述透析具体条件为：透析3—4天，一天更换3—4次水。
9.一种如权利要求1-8任一项所述的藏红花酸-聚乙二醇单甲醚偶联物纳米颗粒的应用，其特征在于，所述偶联物纳米颗粒用于肝癌细胞的抑制增殖和抗氧化。
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