CN117957322A - 免疫原性降低的病毒载体 - Google Patents

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Abstract

本文中描述了经修饰的病毒载体的组合物和方法，所述组合物和方法减轻了病毒载体的免疫原性，使得能够多次施用基于病毒的基因递送病毒载体。所述病毒载体有利地具有低免疫原性并且包括至少一个免疫抑制部分。本文中还描述了用于将遗传物质引入到细胞中的方法。另外，本文中描述了制备经修饰的病毒载体的方法。最后，本文中描述了治疗受试者的方法，所述方法包括向受试者施用如上文所描述的经修饰的病毒载体组合物。

Description

免疫原性降低的病毒载体
相关申请的交叉引用
本申请要求于2021年3月26日提交的美国临时专利申请第63/166,417号的权益，所述美国临时专利申请的内容通过引用整体并入本文。
政府资助声明
本公开的主题是在政府支持下根据国家科学基金会(National ScienceFoundation)授予的授权号DMR-2002940进行的。政府拥有本发明的某些权利。
背景技术
病毒载体介导的基因疗法是用于治疗各种遗传性和获得性疾病的最有前途的方法之一。单次AAV施用通常持续数月至数年，使基因表达超过治疗水平。参见例如Verdera,H.C.；Kuranda,K.；Mingozzi,F.,AAV载体在人类中的免疫原性：成功基因转移的漫长旅程(AAV Vector Immunogenicity in Humans:A Long Journey to Successful GeneTransfer.)《分子疗法(Mol.Ther.)》2020,28(3),723-746。然而，许多遗传性疾病需要终身治疗，以避免不可逆的组织损伤(Jackson,M.等人,疾病的遗传基础(The genetic basisof disease.)《生物化学论文(Essays Biochem.)》2018,62(5),643-723)。增加施用剂量可能会延长治疗窗口，但对潜在毒性的担忧也会增加(Khabou,H.等人,腺相关病毒相关毒性中的转基因盒的阈值和影响(Thresholds and Influence of Transgene Cassette inAdeno-Associated Virus-Related Toxicity.)《人类基因疗法(Hum.Gene Ther.)》2018,29(11),1235-1241；以及Hinderer,C.等人,在非人灵长类动物和仔猪中高剂量静脉内施用表达人SMN的腺相关病毒载体后的严重毒性(Severe Toxicity in Nonhuman Primatesand Piglets Following High-Dose Intravenous Administration of an Adeno-Associated Virus Vector Expressing Human SMN.)《人类基因疗法》2018,29(3),285-298)。因此，重新施用AAV的能力对于实现随时间持续的治疗功效是至关重要的。然而，载体免疫原性是重新施用病毒载体的主要限制。多次载体施用会引发持续的高滴度抗体，这使得重复的基于病毒载体的治疗没有任何益处。
在一些情况下，当将常规病毒载体引入到受试者体内时，受试者会表现出不期望的免疫原性应答。尽管与其它病毒载体相比，AAV被认为是低免疫原性和安全的，但衣壳的免疫原性仍然是AAV载体的重新施用的主要障碍(Verdera,H.C.等人,AAV载体在人类中的免疫原性：成功基因转移的漫长旅程)《分子疗法》2020,28(3),723-746)。在临床前动物研究和人类患者中观察到体液免疫和细胞介导的免疫两者(Boutin,S.等人,健康群体中的血清IgG和抗腺相关病毒(AAV)1、2、5、6、8和9型中和因子的患病率：使用AAV载体进行基因疗法的意义(Prevalence ofSerum IgG and Neutralizing Factors Against Adeno-Associated Virus(AAV)Types 1,2,5,6,8,and 9in the Healthy Population:Implications for Gene Therapy Using AAV Vectors.)《人类基因疗法》2010,21(6),704-712；以及Calcedo,R.；Wilson,J.M.,对AAV的体液免疫应答(Humoral ImmuneResponse to AAV.)《免疫学前沿(Front.Immunol.)》2013,4,341)。本文公开了减少这种针对病毒载体介导的治疗的不期望的免疫原性应答的方法和组合物。本文公开了组合物和方法，所述组合物和方法集中于减轻病毒载体的免疫原性并且实现基于病毒的基因递送的多次施用。
发明内容
本公开首先涉及减轻病毒载体的免疫原性的组合物和方法，使得能够多次施用如基因递送病毒载体等病毒载体。本文中所描述的病毒载体有利地具有低免疫原性并且包括至少一个免疫抑制部分(ISM)。
在第一方面，本公开涉及经修饰的病毒载体，所述经修饰的病毒载体含有至少一种病毒载体(VV)；以及至少一种免疫抑制部分(ISM)，所述至少一种ISM直接或通过连接子与所述病毒载体共价连接。
在一些实施例中，所述病毒载体是选自由以下组成的组的病毒：逆转录病毒、慢病毒、腺病毒和腺相关病毒(AAV)。在一些实施例中，所述病毒载体是选自由以下组成的组的AAV：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV6.2、AAVrh10、AAV-DJ、AAV-DJ/8、AAV-PHP.B、AAV-PHP.eB、AAV-PHP.S、AAV2-retro、AAV2-QuadYF、AAV2.7m8和其经基因工程化的衍生物。
在一些实施例中，所述免疫抑制部分(ISM)包括一种或多种选自由以下组成的组的化合物：小分子、聚合物分子和肽，其中所述小分子、所述聚合物分子和所述肽的分子量为100-10,000g/mol。
在一些实施例中，所述ISM包括磷酸丝氨酸(PS)，所述PS具有以下结构：
其中波浪线表示与连接子键合的键或与所述病毒载体直接键合的键。
在一些实施例中，所述ISM包括聚唾液酸(PSA)。在一些实施例中，所述PSA包括以下结构：
其中Ac表示乙酰基；并且n至少为2。
在一些实施例中，所述ISM是一种或多种mTOR抑制剂，例如雷帕霉素(Rapamycin)、替西罗莫司(Temsirolimus)、依维莫司(Everolimus)、乌米莫司(Umirolimus)以及其组合等。
在一些实施例中，所述ISM包括选自由以下组成的组的一个或多个：芳香烃受体(AHR)配体、维生素D3、视黄酸、具有CxxC/CxxS侧接表位的肽，其中x是任何氨基酸，以及其组合。
在一些实施例中，所述ISM包括一种或多种来自凋亡细胞的分子，例如磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine)、染色质寡核苷酸以及其组合等。
在一些实施例中，所述ISM包括一个或多个次级淋巴器官(脾脏或淋巴结)靶向部分或肝脏靶向部分，例如N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、N-乙酰神经氨酸(NeuAc或唾液酸)、半乳糖和岩藻糖以及其组合等。
在一些实施例中，所述ISM包括一种或多种炎症减少部分，例如Z2-Y12、Z1-Y15、Z1-Y19、地塞米松(dexamethasone)、淋巴细胞功能相关抗原拮抗剂、d-甘露糖以及其组合等。
在一些实施例中，所述病毒载体和所述免疫抑制部分彼此直接共价连接。
在一些实施例中，所述病毒载体和所述免疫抑制部分通过连接子共价连接。在第十四组实施例中，所述连接子包括连接子肽和/或交联剂化合物。
在一些实施例中，所述连接子肽是25个氨基酸的肽或25个氨基酸以下的肽。在一些实施例中，所述连接子肽包括交替的Glu-Lys(EK)肽或Lys-Lys(KK)肽。在一些实施例中，所述连接子肽包括(KK)8-C-NH2或其衍生物。
在一些实施例中，所述交联剂化合物包括N-羟基琥珀酰亚胺酯-马来酰亚胺异双官能脂肪族试剂，例如AMAS、BMPS、GMBS、Sulfo-GMBS、MBS、Sulfo-MBS、SMCC、Sulfo-SMCC、EMCS、Sulfo-EMCS、SMPB、Sulfo-SMPB、SMPH、LC-SMCC和Sulfo-KMUS等。
在一些实施例中，所述经修饰的病毒载体包括多个所述连接子。在一些实施例中，每个连接子包括多个肽连接子和/或多个交联剂化合物。
在一些实施例中，病毒载体包括表面位点，所述免疫抑制部分或所述连接子与所述表面位点共价结合，所述表面位点例如有衣壳蛋白、gag蛋白、包膜蛋白和/或脂质层等。
在一些实施例中，所述经修饰的病毒载体包括以下结构：
其中：
VV是所述病毒载体；
L是直链或支链连接子，所述直链或支链连接子选自由以下组成的组：肽、糖、脂质和非生物分子和聚合物，其中y是0或1，其分别对应于所述连接子的不存在或存在；
ISM是所述免疫抑制部分；并且
z至少为1，其中z对应于与L连接的ISM的数量；
其中连接VV、Ly和ISM的线表示共价键。
在一些实施例中，所述连接子或所述ISM通过所述病毒载体的氨基基团与所述病毒载体连接。在一些实施例中，所述氨基基团位于所述病毒载体的衣壳或包膜上。
在一些实施例中，所述连接子存在，并且所述经修饰的病毒载体包括以下结构：
在一些实施例中，所述连接子通过所述病毒载体的氨基基团与所述病毒载体连接。在一些实施例中，所述氨基基团位于所述病毒载体的衣壳或包膜上。
在一些实施例中，所述经修饰的病毒载体包括以下结构：
其中：
VV是所述病毒载体；
L1和L2是所述直链或支链连接子L的部分，其中L1表示具有氨基反应性基团和巯基反应性基团的双官能交联剂，其中所述氨基反应性基团与所述病毒载体的氨基基团结合；并且L2表示含有与L1的所述巯基反应性基团结合的巯基基团的连接部分，其中L2也与所述ISM结合，并且L2选自由以下组成的组：肽、糖、脂质和非生物分子和聚合物；
ISM是所述免疫抑制部分；并且
z至少为1，其中z对应于与L连接的ISM的数量。
在一些实施例中，所述经修饰的病毒载体包括以下结构：
其中：
VV是所述病毒载体；
L1、L2和L3是所述直链或支链连接子L的部分，其中L1表示具有氨基反应性基团和巯基反应性基团的双官能交联剂，其中所述氨基反应性基团与所述病毒载体的氨基基团结合；L2表示含有与L1的所述巯基反应性基团结合的巯基基团的连接部分，并且L2选自由以下组成的组：肽、糖、脂质和非生物分子和聚合物；并且L3表示具有氨基反应性基团和巯基反应性基团的双官能交联剂，其中所述氨基反应性基团与L2的氨基基团结合，并且所述巯基反应性基团与所述ISM的巯基基团结合，或者其中所述氨基反应性基团与所述ISM的氨基基团结合并且所述巯基反应性基团与L2的巯基基团结合；
ISM是所述免疫抑制部分；并且
z至少为1，其中z对应于与L连接的ISM的数量。
在一些实施例中，所述经修饰的病毒载体包括以下结构：
其中：
VV是所述病毒载体；
L1和L2是所述直链或支链连接子L的部分，其中VV被修饰以包含巯基基团，并且L1表示与VV的所述巯基基团结合的巯基反应性基团，其中L2与L1和所述ISM结合，并且L2选自由以下组成的组：肽、糖、脂质和非生物分子和聚合物；
ISM是所述免疫抑制部分；并且
z至少为1，其中z对应于与L连接的ISM的数量。
在一些实施例中，所述经修饰的病毒载体包括以下结构：
其中：
VV是所述病毒载体；
L1、L2和L3是所述直链或支链连接子L的部分，其中VV被修饰以包含巯基基团，并且L1表示与VV的所述巯基基团结合的巯基反应性基团；L3表示具有氨基反应性基团和巯基反应性基团的双官能交联剂，其中所述氨基反应性基团与L2的氨基基团结合，并且所述巯基反应性基团与所述ISM的巯基基团结合，或者所述氨基反应性基团与所述ISM的氨基基团结合，并且所述巯基反应性基团与L2的巯基基团结合；其中L2选自由以下组成的组：肽、糖、脂质和非生物分子和聚合物；
ISM是所述免疫抑制部分；并且
z至少为1，其中z对应于与L连接的ISM的数量。
在一些实施例中，所述经修饰的病毒载体包括以下结构：
其中：
VV是所述病毒载体；
L1和L2是所述直链或支链连接子L的部分，其中VV和L2被修饰以包含叠氮基团或炔烃基团，以便VV和L2通过叠氮-炔环加成点击化学(cycloaddition click chemistry)连接；
L1表示连接VV和L2的1,2,3-三唑基团，其中所述1,2,3-三唑基团是所述VV上的所述叠氮基团或炔烃基团分别与L2上的炔烃基团或叠氮基团之间的叠氮-炔环加成点击化学反应的结果；其中L2与L1和所述ISM结合，并且L2选自由以下组成的组：肽、糖、脂质和非生物分子和聚合物；
ISM是所述免疫抑制部分；并且
z至少为1，其中z对应于与L连接的ISM的数量。
在一些实施例中，所述经修饰的病毒载体包括以下结构：
其中：
VV是所述病毒载体；
L1和L2是所述直链或支链连接子L的部分，其中L1和ISM被修饰以包含叠氮基团或炔烃基团，以便L1和ISM通过叠氮-炔环加成点击化学连接；
L1选自由以下组成的组：肽、糖、脂质和非生物分子和聚合物；L2表示连接L1和ISM的1,2,3-三唑基团，其中所述1,2,3-三唑基团是L1上的所述叠氮基团或炔烃基团分别与ISM上的炔烃基团或叠氮基团之间的叠氮-炔环加成点击化学反应的结果；
ISM是所述免疫抑制部分；并且
z至少为1，其中z对应于与L连接的ISM的数量。
在一些实施例中，所述连接子包括肽。
在一些实施例中，所述肽包括聚赖氨酸。在一些实施例中，所述肽包含不超过25个氨基酸单位。
在一些实施例中，所述经修饰的病毒载体包括多于一个与所述病毒载体共价结合的免疫抑制部分。在一些实施例中，所述经修饰的病毒载体包括1-10,000个与所述病毒载体共价结合的免疫抑制部分。在一些实施例中，所述经修饰的病毒载体包括1-5,000个与所述病毒载体共价结合的免疫抑制部分。在一些实施例中，所述经修饰的病毒载体包括1-2,000个与所述病毒载体共价结合的免疫抑制部分。在一些实施例中，所述经修饰的病毒载体包括100-2,000个与所述病毒载体共价结合的免疫抑制部分。在一些实施例中，所述经修饰的病毒载体实现的转染效率是未经修饰的病毒载体实现的转染效率的至少30％。在一些实施例中，所述经修饰的病毒载体实现的转染效率是未经修饰的病毒载体实现的转染效率的至少40％。在一些实施例中，所述经修饰的病毒载体实现的转染效率是未经修饰的病毒载体实现的转染效率的至少50％。在一些实施例中，所述经修饰的病毒载体实现的转染效率是未经修饰的病毒载体实现的转染效率的至少60％。在一些实施例中，所述经修饰的病毒载体实现的转染效率是未经修饰的病毒载体实现的转染效率的至少70％。
在一些实施例中，对于上文所提供的式中的任何式，所述ISM是或者包括磷酸丝氨酸(PS)。
在特定实施例中，所述经修饰的病毒载体具有以下结构：
其中：VV是所述病毒载体；磷酸丝氨酸(phosphoserine，PS)被修饰以包含巯基基团，并且存在多个PS部分；z大于1并且对应于通过L3与L2连接的PS部分的数量；L1、L2和L3是所述直链或支链连接子L的部分，其中L1表示具有氨基反应性基团和巯基反应性基团的双官能交联剂，其中所述氨基反应性基团与所述病毒载体的氨基基团结合；L2表示含有与L1的所述巯基反应性基团结合的巯基基团的连接部分，并且L2是含有多个氨基基团的多肽；并且L3表示多个双官能交联剂，每个双官能交联剂具有氨基反应性基团和巯基反应性基团，其中所述氨基反应性基团与L2的所述氨基基团结合，并且所述巯基反应性基团与所述多个PS部分的所述巯基基团结合。
在其它特定实施例中，所述经修饰的病毒载体具有以下结构：
其中：VV是所述病毒载体，磷酸丝氨酸(PS)被修饰以包含巯基基团；L1、L2和L3是所述直链或支链连接子L的部分，其中L1表示具有氨基反应性基团和巯基反应性基团的双官能交联剂，其中所述氨基反应性基团与所述病毒载体的氨基基团结合；L2表示含有与L1的所述巯基反应性基团结合的巯基基团的连接部分，并且L2是多肽；L2和PS被修饰以包含叠氮基团或炔烃基团，以便L2和PS通过叠氮-炔环加成点击化学连接，并且L3表示连接L2和PS的1,2,3-三唑基团，其中所述1,2,3-三唑基团是L2上的所述叠氮基团或炔烃基团分别与PS上的炔烃基团或叠氮基团之间的叠氮-炔环加成点击化学反应的结果；并且z至少为1，其中z对应于与L2连接的PS的数量。
在一些实施例中，对于上文所提供的式中的任何式，所述ISM是或者包括聚唾液酸(PSA)。
在特定实施例中，所述经修饰的病毒载体具有以下结构：
其中：VV是所述病毒载体，所述病毒载体被修饰以包含巯基基团；PSA是聚唾液酸；L是连接VV和PSA的连接子并且包括与VV的所述巯基基团结合的巯基反应性基团。
在其它特定实施例中，所述经修饰的病毒载体具有以下结构：
其中：VV是所述病毒载体，所述病毒载体被修饰以包含炔烃基团或叠氮基团；PSA是聚唾液酸，所述聚唾液酸被修饰以包含炔烃基团或叠氮基团；L是连接VV和PSA的1,2,3-三唑基团，其中所述1,2,3-三唑基团是VV上的所述叠氮基团或炔烃基团分别与PSA上的炔烃基团或叠氮基团之间的叠氮-炔环加成点击化学反应的结果。
另一方面，本公开涉及一种制备经修饰的病毒载体的方法，所述方法使免疫抑制部分与病毒载体连接，以获得本文所描述的经修饰的病毒载体。
在仍另一方面，本公开涉及一种将遗传物质引入到细胞中的方法，所述方法包括使细胞与本文所描述的经修饰的病毒载体接触。在一些实施例中，所述方法包括使所述细胞与本文所描述的经修饰的病毒载体接触多次。在一些实施例中，所述方法包括使所述细胞与多于一种本文所描述的经修饰的病毒载体接触多次。
另一方面，本公开涉及一种治疗受试者的方法，所述方法包括向受试者施用本文所描述的经修饰的病毒载体。在一些实施例中，与施用未经修饰的病毒载体的对照受试者相比，所述受试者在所述受试者施用本文所描述的经修饰的病毒载体之后表现出降低的免疫应答。在一些实施例中，所述方法包括向受试者多次施用单一的本文所描述的经修饰的病毒载体。在一些实施例中，所述方法包括施用多于一种本文所描述的经修饰的病毒载体。在一些实施例中，与施用未经修饰的病毒载体的对照受试者相比，所述受试者表现出降低的免疫应答。在一些实施例中，在第一时间点向所述受试者施用(i)经修饰的病毒载体，并且随后在第二时间点向所述受试者施用(ii)所述经修饰的病毒载体，并且与在所述第一时间点和所述第二时间点施用未经修饰的病毒载体的对照受试者相比，所述受试者表现出降低的免疫应答。在一些实施例中，在第一时间点向所述受试者施用(i)经修饰的病毒载体，并且随后在第二时间点向所述受试者施用(ii)不同的经修饰的病毒载体；并且与在所述第一时间点和所述第二时间点施用未经修饰的病毒载体的对照受试者相比，所述受试者表现出降低的免疫应答。在一些实施例中，所述第二时间点在所述第一时间点之后1天与49天之间。在一些实施例中，所述第二时间点是在所述第一时间点之后至少21天。
附图说明
图1A是用于制备含PS肽缀合的AAV载体的缀合策略的说明。
图1B是来自AAV血清型8(PDB编号：2qa0)的VP3蛋白的结构的俯视图。
图2A是表示体外研究中AAV8和KKPS-AAV8载体的转染百分比的图。
图2B示出了在单剂量注射AAV8-CAG-GFP 3周之后获取的小鼠肝脏切片中的GFP表达。
图2C示出了在单剂量注射KKPS-AAV8-CAG-GFP 3周之后获取的小鼠肝脏切片中的GFP表达。
图3A示出了由KKPS-AAV php.eb-CAG-eGFP载体递送的全脑eGFP表达。
图3B示出了表达由KKPS-AAV php.eb-CAG-eGFP载体递送的eGFP的大脑皮质区中的细胞和神经元。
图3C示出了表达由KKPS-AAV php.eb-CAG-eGFP载体递送的eGFP的大脑海马体区中的细胞和神经元。
图3D示出了表达由KKPS-AAV php.eb-CAG-eGFP载体递送的eGFP的大脑丘脑区中的细胞和神经元。
图3E和图3F示出了由AAV php.eb-CAG-eGFP载体(图3E)和由KKPS-AAV php.eb-CAG-eGFP载体(图3F)递送的全脑eGFP表达的表示的比较。
图4A示出了分别使用未经修饰的AAV8和KKPS-AAV8在C57bl/6小鼠中荧光素酶表达的IVIS图像。在第1天向小鼠IV注射单剂量的天然或经修饰的AAV8-CMV-Fluc(4*1012vg/kg)。在第21和28天，向小鼠i.p.注射D-荧光素(150mg/kg)并在IVIS系统(珀金埃尔默公司(PerkinElmer))中成像。
图4B是总结如图4A所示的总发光数据的图。
图5A示出了用于免疫原性研究的两剂量队列的施用途径。
图5B是抗AAV8 IgG滴度的流式细胞术分析的图示，其中KKPS的缀合成功地减轻了抗AAV8抗体(滴度：800)的产生，而天然AAV8显示出最高抗体滴度(>6400)。
图5C是CD4+CD25+脾细胞中Treg表型(Foxp3+)细胞的百分比的总结。
图5D是活化的Gemina中心B细胞的百分比的总结。
图5E AAV8特异性小鼠干扰素γELISPOT；
图5F示出了分泌抗AAV8 IgG的B细胞ELISPOT。
图6A示出了编码人B结构域缺失的FVIII的rAAV构建体。
图6B示出了A型血友病小鼠(FVIII敲除)中的FVIII基因递送。在第1天将编码荧光素酶的模型AAV8载体(4*1012vg/kg)i.v.注射到小鼠体内。小鼠接受编码hFVIII的第2AAV8载体(4*1012vg/kg)。在49天和第56天采集血浆。在第56天也进行了尾出血测试。之后，立即将所有小鼠处死。
图6C是表示血浆中的FVIII活性的图，其中数据用从合并的健康人血浆中测试的标准FVIII活性归一化。
图7是示出了PSA-NH2和经修饰的AAV的制备的示意图。
具体实施方式
尽管要求保护的主题将通过某些实例进行描述，但包括不提供本文所阐述的所有益处和特征的实例在内的其它实例也在本公开的范围内。在不脱离本公开的范围的情况下，可以进行各种结构、逻辑和方法步骤改变。
本文公开了值的范围。所述范围陈述下限值和上限值。除非另有说明，否则范围包括下限值、上限值以及介于下限值与上限值之间的所有值，包括但不限于到最小值(下限值或上限值)的数量级的所有值。
在一些情况下，当将常规病毒载体引入到受试者体内时，受试者会表现出不期望的免疫原性应答。本申请公开了减少这种不期望的免疫原性应答的方法和组合物。在一些实施例中，本申请公开了经修饰的病毒载体，所述经修饰的病毒载体包括具有共价连接的免疫抑制部分(ISM)的病毒载体。在一些实施例中，所述病毒载体直接与所述免疫抑制部分连接。在一些实施例中，所述病毒载体通过连接子与所述免疫抑制部分连接。在一些实施例中，与未经修饰的病毒载体(即，不含免疫抑制部分的病毒载体)相比，当将所述经修饰的病毒载体施用于受试者时，所述经修饰的病毒载体可以减少和/或预防所述受试者中不期望的免疫应答。本文所公开的方法还包括制备所述经修饰的病毒载体。本文所公开的方法还包括向受试者施用经修饰的病毒载体。
病毒包括病毒基因组、衣壳，并且有时还包括包围衣壳的外包膜。衣壳包括衣壳粒、蛋白质亚基，所述衣壳粒、蛋白质亚基包括六邻体、五邻体基底蛋白质和纤维。包膜包括蛋白质和磷脂膜。衣壳和包膜两者有助于病毒通过如糖蛋白和基质蛋白等其表面组分与宿主细胞连接。
病毒载体
如本文所使用的，“病毒载体”是指能够充当如异源核酸等所关注异源分子的载剂的基于病毒的组合物或病毒源性组合物。可以将异源核酸插入引入受体的病毒的基因组核酸中。在一些实施例中，病毒载体是一种病毒，其中病毒基因组已被操作以容纳相对于病毒基因组而言非天然的核酸序列。典型地，通过将一个或多个突变(例如，缺失、插入或取代)引入到病毒的病毒基因组中来产生病毒载体，以容纳非天然核酸序列(例如用于基因转移)插入到病毒中。在本公开的上下文中，病毒载体包括病毒或病毒颗粒，所述病毒或病毒颗粒包括病毒基因组。可以修饰病毒的基因组，使其含有组装功能性重组病毒或病毒颗粒的最少组分，所述功能性重组病毒或病毒颗粒装载有期望的有效载荷或被工程化成表达或递送期望的有效载荷，所述期望的有效载荷可以被递送至靶细胞、组织、器官或生物体。
在一些实施例中，病毒基因组包括充当治疗剂的异源多核苷酸，例如RNA或DNA分子。在一些实施例中，异源多核苷酸编码或以其它方式产生多核苷酸，所述多核苷酸被加工成靶向所关注基因的小双链RNA(dsRNA)分子(小干扰RNA、siRNA、miRNA、前miRNA)。在一些实施例中，异源多核苷酸包括所关注基因，例如，已知与如血液疾病和癌症、囊性纤维化、肌营养不良和包括帕金森氏病(Parkinson's)、阿尔茨海默氏病(Alzheimer's disease)、巴藤病(Batten disease)、弗里德希共济失调(Friedreich's Ataxia)和遗传性肌萎缩性侧索硬化(ALS)的几种中枢神经系统(CNS)病症等靶向疾病相关的基因。在一些实施例中，所述所关注基因在功能上被分类为信息存储和处理基因。在一些实施例中，所述所关注基因在功能上被分类为细胞过程和信号传导基因。在一些实施例中，所述所关注基因在功能上被分类为代谢基因。在一些实施例中，所述所关注基因被称为蛋白质编码基因。在一些实施例中，所述所关注基因是芳香族l-氨基酸脱羧酶(AADC)、包括CLN2和CLN6的神经元蜡样脂褐质沉积症(NCL)、N-乙酰-α-氨基葡萄糖苷酶(NAGLU)、神经胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、神经秩蛋白(NRTN)、存活运动神经元(SMN)、巨轴突蛋白(GAN)、环核苷酸门控通道亚基β3(CNGB3)、人细小病毒腺相关病毒(AAV)的复制(REP)基因、CHM Rab护送蛋白(CHM)、类视黄醇异构水解酶RPE65(RPE65)、NADH脱氢酶亚基4(ND4)、视黄醛结合蛋白1(RLBP1)、视网膜色素变性GTP酶调节剂(RPGR)、视网膜劈裂素1(RS1)、UDP葡萄糖醛酸基转移酶家族1成员A1(UGT1A1)、低密度脂蛋白受体(LDLR)、葡萄糖-6-磷酸酶催化亚基编码基因(G6PC、G6PC2和G6PC3)、FVIII基因、FIX基因、锌指核酸酶(ZFN1和ZFN2)、N-磺基葡糖胺磺基水解酶(SGSH)、芳基硫酸酯酶B(ARSB)、SERPINA1基因、神经营养因子3(NTF3)、肌管蛋白1(MTM1)和酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)。在一些实施例中，异源多核苷酸包括转录Cas核酸酶mRNA和/或向导RNA核酸的DNA。向导RNA核酸可以是例如单向导RNA(sgRNA)。在一些实施例中，异源多核苷酸包括转录编码SARS-CoV-2的病毒刺突(S)蛋白的单链5'加帽信使RNA(mRNA)的DNA模板。
在一些实施例中，病毒载体是选自逆转录病毒、慢病毒、腺病毒(Ad)、腺相关病毒(AAV)或其经基因工程化的衍生物的病毒。
病毒的“经基因工程化的衍生物”意指通过基因修饰产生的病毒，所述基因修饰涉及使用本领域技术人员已知的生物技术方法在病毒基因组中定向插入、缺失、人工合成或改变核苷酸序列。病毒的“经基因工程化的衍生物”是指经修饰的病毒(相对于天然或起始病毒)或在结构和/或功能上类似于天然或起始病毒的分子或部分。与天然或起始病毒相比，病毒变体或衍生物的氨基酸序列、组成或结构可能发生改变。
如本文所使用的，术语“变体(variants或variant)”是指不同于参考核酸或多肽但保留其基本性质的核酸或多肽。通常，变体总体上非常类似，并且在许多区中与参考核酸或多肽相同。
在一些实施例中，病毒载体是逆转录病毒或其经基因工程化的衍生物。逆转录病毒是双链RNA包膜病毒，其主要特征在于能够将其基因组从RNA“逆转录”为DNA。逆转录病毒含有与核衣壳蛋白复合的相同的正RNA链的二聚体基因组。基因组被包裹在蛋白质衣壳中，所述蛋白质衣壳还含有病毒感染所需的酶蛋白，即逆转录酶、整合酶和蛋白酶。基质蛋白在衣壳核心外形成层，所述衣壳核心与包膜相互作用，所述包膜是源自宿主细胞膜的脂质双层，其围绕病毒核心颗粒。锚定在该双层上的是负责识别宿主细胞上的特定受体并启动感染过程的病毒包膜糖蛋白。包膜蛋白由两个亚基形成，一个是将蛋白锚定在脂膜中的跨膜(TM)，另一个是与细胞受体结合的表面(SU)。逆转录病毒编码四种基因：gag(组特异性抗原)、pro(蛋白酶)、pol(聚合酶)和env(包膜)。gag序列编码三种主要结构蛋白：基质蛋白、核衣壳蛋白和衣壳蛋白。pro序列编码在颗粒组装、出芽和成熟期间负责切割Gag和Gag-Pol的蛋白酶。pol序列编码逆转录酶和整合酶，前者在感染过程期间催化病毒基因组从RNA到DNA的逆转录，并且后者负责将前病毒DNA整合到宿主细胞基因组中。env序列编码包膜糖蛋白的SU和TM亚基两者。
在一些实施例中，病毒载体是慢病毒或其经基因工程化的衍生物。慢病毒是复杂的逆转录病毒，其除常见的逆转录病毒基因gag、pol及env外还含有具有调节或结构功能的其它基因。慢病毒具有整合到非分裂细胞中的能力。慢病毒基因组和前病毒DNA具有在逆转录病毒中发现的三种基因；gag、pol和env，其侧接两个LTR序列。gag基因编码内部结构(基质、衣壳和核衣壳)蛋白；pot基因编码RNA引导的DNA聚合酶(逆转录酶)、蛋白酶和整合酶；并且env基因编码病毒包膜糖蛋白。
在一些实施例中，所述病毒载体是腺病毒(或“Ad”)。腺病毒是含有大约36kb的双链DNA的中等大小(90-100nm)的非包膜二十面体病毒。腺病毒衣壳介导病毒感染细胞早期阶段的关键相互作用。腺病毒衣壳是在腺病毒生命周期结束时包装腺病毒基因组所必需的。衣壳包括衣壳粒，所述衣壳粒包括六邻体、五邻体基底蛋白质和纤维。六邻体包括三个相同的蛋白质，即多肽II。五邻体基底包括五个相同的蛋白质并且纤维包括三个相同的蛋白质。蛋白质IIIa、VI和IX存在于腺病毒外壳中并且被认为稳定病毒衣壳。除pIX外，衣壳蛋白的表达依赖于腺病毒聚合酶蛋白。因此，只有当聚合酶蛋白基因存在并表达时，腺病毒颗粒的主要组分才会从基因组中表达出来。
在一些实施例中，所述病毒载体是腺相关病毒(AAV)病毒或其经基因工程化的衍生物。AAV载体可以包括任何天然存在的和/或重组的AAV血清型核苷酸序列或变体的全部或部分病毒基因组。AAV的血清型包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV6.2、AAVrh10、AAV-DJ、AAV-DJ/8、AAV-PHP.B、AAV-PHP.eB、AAV-PHP.S、AAV2-retro、AAV2-QuadYF、AAV2.7m8和其经基因工程化的衍生物。AAV变体可以在核酸(基因组或衣壳)和氨基酸水平(衣壳)具有显著同源性的序列，以产生通常在物理和功能上等同的构建体，通过类似的机制复制，并通过类似的机制组装。在一些实施例中，所述AAV是AAV空衣壳。在一些实施例中，所述AAV是单链AAV。在某些实施例中，所述AAV是自身互补AAV。在一些实施例中，所述AAV包括感染人的AAV。在一些实施例中，所述AAV包括感染非人灵长类动物的AAV。在一些实施例中，所述AAV包括感染哺乳动物的AAV。在一些实施例中，Ad的血清型包括但不限于人腺病毒A、B、C、D、E和F。在一些实施例中，Ad的血清型包括但不限于腺病毒1-51。自然界中已经鉴定出许多AAV菌株。基于病毒表面上的衣壳蛋白的不同抗原性，所述菌株分为不同的血清型。不同的血清型可以使病毒具有不同的组织嗜性(即，感染的组织特异性)。
在一些实施例中，病毒载体包括如病毒的基因组核酸等核酸，任选地具有异源多核苷酸。在一些实施例中，核酸包括DNA、RNA和/或其杂交体。在一些实施例中，核酸包括单链或双链形式的多核苷酸。在一些实施例中，多核苷酸包括质粒DNA或线性化DNA。在一些实施例中，多核苷酸包括信使RNA(mRNA)、小干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、环状RNA(circRNA)、长非编码RNA(lncRNA)和反义寡核苷酸(ASO)。在一些实施例中，核酸编码包括保护结构域和功能结构域的融合生物部分。在一些实施例中，功能结构域直接或通过由氨基酸组成的连接子与保护结构域融合。在一些实施例中，融合生物部分的保护结构域是一个或多个结构域，所述结构域包括：a)多个带负电荷的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸和其衍生物)；以及b)多个带正电荷的氨基酸(例如，赖氨酸、组氨酸、精氨酸和其衍生物)；和/或独立地选自由以下组成的组的另外的氨基酸：脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、甘氨酸和其衍生物。在一些实施例中，带负电荷的氨基酸的数量与带正电荷的氨基酸的数量的比率为约1:0.5至约1:2。在一些实施例中，融合生物部分的保护结构域包括XTEN和/或脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸和弹性蛋白样多肽。在一些实施例中，生物部分的保护结构域包括像Fc片段和白蛋白等天然半衰期延长结构域。
免疫抑制部分
如本文所使用的，术语“免疫抑制部分”包括能够抑制(inhibit)、抑制(suppress)或预防受试者的免疫系统的一种或多种功能或活性的任何分子或部分。在一些实施例中，免疫抑制部分通过抑制细胞免疫来抑制免疫系统。由于经修饰的病毒载体抑制细胞免疫的能力，与未经修饰的病毒载体相比，由病毒载体在接受者中诱导的任何免疫应答降低(免疫原性降低)。在一些实施例中，免疫抑制部分抑制T细胞的活化。在一些实施例中，免疫抑制部分上调调节性T细胞(Treg)，例如，通过增强Treg的功能，如通过例如减少效应T细胞的诱导和增殖所反映的。在一些实施例中，免疫抑制部分减少抗病毒载体的抗体的产生。在一些实施例中，免疫抑制部分减少抗AAV抗体的产生。在一些实施例中，免疫抑制部分减少受试者的炎症。在一些实施例中，免疫抑制部分靶向次级淋巴和肝脏。在一些实施例中，免疫抑制部分抑制哺乳动物雷帕霉素靶标(mTOR)。在一些实施例中，免疫抑制部分包括抑制T细胞活化、上调Treg和/或减少针对病毒载体的抗体的组合。在一些实施例中，免疫抑制部分包括细胞免疫抑制剂、炎症减轻剂(inflammation reducer)、次级淋巴和肝脏靶向部分和/或mTOR抑制剂的组合。
在一些实施例中，免疫抑制部分通过抑制细胞免疫来抑制免疫系统。在一些实施例中，抑制细胞免疫包括抑制T细胞活化。在一些实施例中，抑制细胞免疫包括抑制细胞因子释放。在一些实施例中，抑制细胞免疫的免疫抑制部分包括以下中的一种或多种：淋巴细胞功能相关抗原拮抗剂、唾液酸、芳香烃受体(AHR)配体、地塞米松、维生素D3、d-甘露糖、视黄酸、具有侧接表位CxxC/CxxS的肽和磷酸丝氨酸(PS)，其中x可以是任何氨基酸。
在一些实施例中，免疫抑制部分减少受试者的炎症。在一些实施例中，减少炎症的部分是减少或抑制免疫系统炎症应答的部分。在一些实施例中，免疫抑制部分包括炎症减少部分，所述炎症减少部分包括例如Z2-Y12、Z1-Y15和Z1-Y19(参见《自然生物技术(NatBiotechnol.)》2016年3月；34(3):345-352，所述文献通过引用并入本文)。
在一些实施例中，免疫抑制部分包括靶向次级淋巴器官和肝脏的部分。如本文所使用的，“次级淋巴器官”是指维持成熟的幼稚淋巴细胞并启动适应性免疫应答的淋巴系统的器官。在一些实施例中，次级淋巴系统包括淋巴结和脾脏。在一些实施例中，靶向次级淋巴器官和肝脏的免疫抑制部分是N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、N-乙酰神经氨酸(NeuAc或唾液酸)、半乳糖和岩藻糖以及其组合。在特定实施例中，靶向次级淋巴器官和肝脏的免疫抑制部分是磷酸丝氨酸(PS)。在一些实施例中，免疫抑制部分包括N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、N-乙酰神经氨酸(NeuAc或唾液酸)、半乳糖、岩藻糖和PS。
在特定实施例中，所述ISM是磷酸丝氨酸(PS)部分。所述PS部分是或者包括以下结构：
其中波浪线表示与连接子键合的键或与所述病毒载体直接键合的键。
在另一个实施例中，所述ISM是聚唾液酸(PSA)部分。PSA是或者包括以下结构：
其中Ac表示乙酰基；并且n至少为2。上述结构中最右边的键表示与连接子键合的键或与所述病毒载体的直接键合的键。在不同实施例中，n的值可以精确地为或至少为例如2、5、10、20、30、40、50、100、200、300、400或500或由前述值(例如，2-500、2-200、2-100、2-50、2-20、10-500、10-200、10-100、10-50或10-20)中的任何两个界定的范围内的值。
在一些实施例中，免疫抑制部分包括一类被称为mTOR抑制剂的化合物。在此类实施例中，所述免疫抑制部分可以包括一种或多种mTOR抑制剂。在一些实施例中，所述mTOR抑制剂是雷帕霉素、替西罗莫司、依维莫司和乌米莫司。在一些实施例中，免疫抑制部分包括所列mTOR抑制剂的组合。
在一些实施例中，所述免疫抑制部分(ISM)选自小分子、聚合物分子和肽，其中所述小分子、所述聚合物分子和所述肽的分子量通常为至少100g/mol、200g/mol或500g/mol、1000g/mol、2000g/mol以及至多5,000g/mol、10,000g/mol、20,000g/mol、50,000g/mol或100,000g/mol(例如，100-50,000g/mol、100-10,000g/mol)。在一些实施例中，所述免疫抑制部分(ISM)的分子量不超过50,000g/mol。在一些实施例中，所述免疫抑制部分(ISM)的分子量不超过30,000g/mol。在一些实施例中，所述免疫抑制部分(ISM)的分子量不超过20,000g/mol。在一些实施例中，所述免疫抑制部分(ISM)的分子量不超过10,000g/mol。在一些实施例中，所述免疫抑制部分(ISM)的分子量介于500g/mol至50,000g/mol之间。在一些实施例中，所述免疫抑制部分(ISM)的分子量介于1000g/mol至30,000g/mol之间。在一些实施例中，所述ISM的分子量介于5000g/mol至20,000g/mol之间。
在一些实施例中，所述免疫抑制部分包括来自凋亡细胞的分子。来自凋亡细胞的分子的实例是但不限于磷脂酰丝氨酸和染色质寡核苷酸。
在一些实施例中，所述免疫抑制部分包括来自脾细胞的分子。
需要注意的，免疫抑制部分可以选自上述所列出的中的一个或多个。另外，免疫抑制部分分类的列示不是限制性的。上文列出的类别之一的成员也可以是上文列出的其它类别的成员并且在其在类别上的位置不是固定的。
一些示例性免疫抑制剂部分的结构如下所示：
病毒载体与免疫抑制部分之间的连接
在一组实施例中，病毒载体(VV)直接与免疫抑制部分(ISM)连接，即不具有连接子。直接连接可以通过例如使ISM天然的一个或多个基团与VV天然的一个或多个基团反应，以在ISM与VV之间形成一个或多个共价键、离子键或氢键来实现。VV天然的基团可以包括在蛋白质或脂质中发现的基团，例如氨基(或铵)、巯基、羧酸和羟基基团。ISM天然的基团可以包括例如氨基基团(例如，在ISM是磷酸丝氨酸或聚唾液酸的情况下)、羧酸基团(例如，视黄酸)或羟基基团(例如，N-乙酰半乳糖胺)。例如，ISM的天然羧酸基团可以通过本领域公知的方法活化，以与VV的天然氨基基团反应并形成酰胺键。在一些实施例中，VV天然的基团由病毒载体的表面上的一种或多种分子提供，如病毒的表面上的蛋白质或脂质(例如，病毒的衣壳或包膜的蛋白质或脂质)，在这种情况下，免疫抑制部分可以与VV的表面位点连接。如本文所使用的，术语“表面位点”是指病毒载体的表面上的组分或分子，如提供一个或多个用于形成共价键的反应基团的蛋白质或脂质(例如，病毒的衣壳或包膜的蛋白质或脂质)。可以提供表面位点的病毒载体的分子的实例包括但不限于衣壳蛋白、gag蛋白、包膜蛋白和/或脂质。
在另一组实施例中，VV通过连接子(L)与ISM间接连接，所述连接子可以是直链或支链的，如下文进一步所描述。在一些实施例中，ISM通过连接子与VV的表面位点(即，VV的表面上的分子组分)共价连接。如果存在的话，连接子(L)可以是或者包括肽、糖、脂质或非生物分子或聚合物。在一些实施例中，L是短连接子，所述短连接子可以与不大于或小于1.5nm、1.0nm或0.5nm(分别为15、10或)的长度相对应。在其它实施例中，L是长连接子，所述长连接子可以与至少为或大于1.5nm、2nm、3nm、4nm、5nm、10nm、15nm、20nm、30nm、40nm、50nm或100nm的长度相对应。长度也可以在由前述值中的任何两个界定的范围内，例如，0.5-100nm、1-100nm、2-100nm、0.5-50nm、1-50nm、2-50nm、0.5-10nm、1-10nm或2-10nm。
在第一组实施例中，连接子(L)是或者包括肽。如本文所使用的，术语“肽”意指包括单个氨基酸(单肽)、二肽、三肽、寡肽和多肽。肽可以由单一类型或不同类型的氨基酸构成。氨基酸可以选自任何众所周知的必需氨基酸。在特定实施例中，肽连接子是或者包括一个或多个赖氨酸单位。在一些实施例中，肽连接子是或者包括聚赖氨酸嵌段，所述聚赖氨酸嵌段可以含有至少2、5或10个赖氨酸以及至多15、20、25、30、40或50个赖氨酸。在一些实施例中，肽连接子含有不超过20或25个氨基酸(或者更具体地，赖氨酸)单位(例如，2-20或2-25个单位)。
在第二组实施例中，连接子(L)是或者包括糖。如本文所使用的术语“糖”意指包括糖(单糖)、二糖、三糖、低聚糖和多糖。糖可以由单一类型或不同类型的糖单元构成。糖可以选自任何已知类型的糖，如葡萄糖、果糖和半乳糖，以及其氨基官能化形式(例如，葡糖胺和半乳糖胺)和其N-乙酰基官能化形式(例如，N-乙酰基葡糖胺)。在一些实施例中，糖含有不多于或少于5、10、20、25、30、40或50个糖单位。
在第三组实施例中，连接子(L)是或者包括脂质。脂质可以是本领域已知的任何脂质。众所周知，脂质部分由多元醇部分(例如，二醇、甘油、磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺或磷脂酰丝氨酸)构造而成，所述多元醇部分已经用一种或多种脂肪酸分子酯化以产生单酰基或二酰基脂质，其中术语“酰基”是指RC(＝O)基团，其中R是含有至少八个并且典型地至多30个碳原子的直链或支链烃(脂肪)链，其中烃链可以是饱和的或含有一个或多个碳-碳双键。脂质部分可以是例如二酰基二醇(例如，二酰基乙二醇)、二酰基甘油(二酰基甘油酯)、二酰基磷脂酰甘油、二酰基磷脂酰乙醇胺或二酰基磷脂酰丝氨酸部分。酰基(即，“脂肪酰基”)部分可以源自已知脂肪酸中的任何一种。脂肪酰基部分的一些实例包括油酰、棕榈酰、月桂酰、肉豆蔻酰、硬脂酰、亚油酰和花生酰。
在第四组实施例中，连接子(L)是或者包括非生物分子或聚合物。非生物分子可以是或者包括例如直链或支链亚烷基连接子、双官能交联剂、芳香族基团(例如，亚苯基)或其组合。非生物聚合物可以是本领域已知的与活生物体相容的任何聚合物，如聚环氧乙烷、聚胺、聚酰胺、聚脲和聚酯。
在一些实施例中，上文所描述的任何一种或多种类或特定类型的连接子被排除在连接子(L)之外。
由于连接子(L)可以不存在或存在(即，任选的)，经修饰的病毒载体可以由以下结构表达：
在上述式(1)中，VV是病毒载体，如上文所描述的任何病毒载体；L是连接子，其中y是0或1，其分别对应于连接子的不存在或存在；ISM是免疫抑制部分，如上文所描述的任何免疫抑制部分；并且z至少为1。连接VV、Ly和ISM的线表示共价键。在一些实施例中，所述连接子或所述ISM通过病毒载体的氨基基团与病毒载体连接，其中氨基基团可以在病毒载体的表面处的蛋白质或脂质分子(例如，病毒的衣壳或包膜的蛋白质或脂质)上。虽然式(1)描述了单个Ly-(ISM)z部分的实施例，但是该实施例是为了说明，而不是为了限制。在一些实施例中，多个Ly-(ISM)z部分(即，多个L-(ISM)z或ISM，取决于y)与VV连接。如任选地大于1的变量z所示，单个L可以与多于一个ISM连接。通过在L中具有一个或多个分支点，单个L可以与多于一个ISM连接，所述分支点中的每个分支点可以与ISM连接。以这种方式，对于单个L，变量z的值可以精确地为或至少为例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15、18、20、22、25或30或在由前述值中的任何两个界定的范围内的值。
在一些实施例中，所述连接子(L)存在，在这种情况下，所述经修饰的病毒载体是或者包括以下结构：
在式(1a)的一些实施例中，所述连接子(L)通过所述VV的氨基基团与所述病毒载体(VV)连接。氨基基团可以位于VV的表面处的分子(例如，衣壳或包膜的蛋白质或脂质)上。虽然式(1a)描述了单个L-(ISM)z部分的实施例，但是该实施例是为了说明，而不是为了限制。通常，多个L-(ISM)z部分与VV连接。VV上的L-(ISM)z部分的多重性(密度)可以对应于例如VV的至少或至多10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的天然基团(例如，氨基基团)与L-(ISM)z部分连接。此外，如任选地大于1的变量z所示，单个L可以与多于一个ISM连接。通过在L中具有一个或多个分支点，单个L可以与多于一个ISM连接，所述分支点中的每个分支点可以与ISM连接。以这种方式，对于单个L，变量z的值可以精确地为或至少为例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15、18、20、22、25或30或在由前述值中的任何两个界定的范围内的值。值得注意的是，单个L可以通过多于一个的键与所述VV连接，并且所述单个L可以与一个或多个ISM连接。如下文进一步讨论的，式(1)和(1a)中的L包括在VV与L之间和/或L与ISM之间连接的反应性官能团的可能性。
在一些实施例中，多于一个ISM与所述VV共价结合。在一些实施例中，多个L-ISM部分与所述VV连接，其中每个L-ISM部分含有单个ISM。在其它实施例中，多个L-(ISM)z部分与所述VV连接，其中每个L-(ISM)z部分含有与多于一个ISM连接的支链L(即，其中z至少为2)。在一些实施例中，1-10,000个ISM以L-ISM或L-(ISM)z部分的形式与所述VV共价结合。在其它实施例中，1-5,000个ISM与所述VV共价结合。在其它实施例中，1-2,000个ISM与所述VV共价结合。在其它实施例中，100-2,000个ISM与所述VV共价结合。在一些实施例中，ISM在与所述VV连接之前首先与连接子连接。在一些实施例中，连接子首先与所述VV连接，然后ISM与所述连接子连接。在每种情况下，单个连接子可以具有一个或多个(例如，2、5、10、20、30、40或50个或其中的范围)ISM。通过具有支链部分，单个连接子可以包括多个ISM，每个支链部分使主连接子部分与所述ISM连接。在连接子与单个ISM连接的情况下，连接子可以是线性的(即，不含任何分支部分)，其中ISM可以与线性连接子的任何部分结合，通常是连接子的末端(即，离VV最远)。
在一些实施例中，所述经修饰的病毒载体是或者包含以下结构：
在式(1b)中，L1和L2是连接子的部分。L1表示双官能交联剂(含有两个反应性官能团)，如具有氨基反应性基团和巯基反应性基团的交联剂，其中氨基反应性基团与病毒载体(VV)的氨基基团结合(即，已与所述氨基基团反应)。L2表示含有巯基基团的连接部分，所述巯基基团与L1的巯基反应性基团结合(即，反应)，其中L2也与ISM结合。因此，L1包括由其氨基反应性基团和巯基反应性基团分别与VV的氨基基团和L2的巯基基团反应得到的反应产物。L2可以是上文先前所描述的任何肽、糖、脂质或非生物分子或聚合物，只要其含有与L1的巯基反应性基团结合的巯基基团。虽然式(1b)描述了单个L1-L2-(ISM)z部分的实施例，但是该实施例是为了说明，而不是为了限制。通常，多个L1-L2-(ISM)部分与VV连接。VV上的L1-L2-(ISM)z部分的多重性(密度)可以对应于例如VV的至少或至多10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的天然基团(例如，氨基基团)与L1-L2-(ISM)z部分连接。
在式(1b)的替代性实施例中，病毒载体(VV)被修饰以包含巯基基团，并且L1表示与VV的巯基基团结合(即，已与所述巯基基团反应)的巯基反应性基团，其中L2与L1和ISM结合。L2可以是上文先前所描述的任何肽、糖、脂质或非生物分子或聚合物。
在式(1b)的另一个替代性实施例中，VV和L2被修饰以包含叠氮基团或炔烃基团，以便VV和L2通过叠氮-炔环加成点击化学连接。L1表示或者包括连接VV和L2的1,2,3-三唑基团，其中所述1,2,3-三唑基团是所述VV上的所述叠氮基团或炔烃基团分别与L2上的炔烃基团或叠氮基团之间的叠氮-炔环加成点击化学反应的结果。L2可以是上文先前所描述的任何肽、糖、脂质或非生物分子或聚合物。
在式(1b)的另一个替代性实施例中，L1和ISM被修饰以包含叠氮基团或炔烃基团，以便L1和ISM通过叠氮-炔环加成点击化学连接。L2表示或者包括连接L1和ISM的1,2,3-三唑基团，其中所述1,2,3-三唑基团是L1上的所述叠氮基团或炔烃基团分别与ISM上的炔烃基团或叠氮基团之间的叠氮-炔环加成点击化学反应的结果。L1可以是上文先前所描述的任何肽、糖、脂质或非生物分子或聚合物。
在式(1b)的任何上文所描述的实施例中，多个L-(ISM)z部分通常与VV连接。L-(ISM)z部分的多重性可以对应于例如VV的至少或至多10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的天然基团(例如，氨基基团)与L-(ISM)z部分连接。此外，如任选地大于1的变量z所示，单个L可以与多于一个ISM连接。通过在L中具有一个或多个分支点，单个L可以与多于一个ISM连接，所述分支点中的每个分支点可以与ISM连接。以这种方式，对于单个L，变量z的值可以精确地为或至少为例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15、18、20、22、25或30或在由前述值中的任何两个界定的范围内的值。值得注意的是，单个L可以通过多于一个的键与所述VV连接，并且所述单个L可以与一个或多个ISM连接。
在一些实施例中，所述经修饰的病毒载体是或者包含以下结构：
在式(1c)中，L1、L2和L3是连接子的部分。L1表示双官能交联剂，如具有氨基反应性基团和巯基反应性基团的交联剂，其中氨基反应性基团与病毒载体的氨基基团结合(即，已与所述氨基基团反应)。L2表示含有与L1的所述巯基反应性基团结合的巯基基团的连接部分，其中L2可以是上文先前所描述的任何肽、糖、脂质或非生物分子或聚合物。L3表示具有氨基反应性基团和巯基反应性基团的双官能交联剂，其中所述氨基反应性基团与L2的氨基基团结合(即，与所述氨基基团反应)并且所述巯基反应性基团与所述ISM的巯基基团结合(即，与所述巯基基团反应)，或者可替代地，所述氨基反应性基团与所述ISM的氨基基团结合(即，与所述氨基基团反应)并且所述巯基反应性基团与L2的巯基基团结合(即，与所述巯基基团反应)。虽然式(1c)描述了单个L1-L2-L3-(ISM)z部分的实施例，但是该实施例是为了说明，而不是为了限制。通常，多个L1-L2-L3-(ISM)z部分与VV连接。VV上的L1-L2-L3-(ISM)z部分的多重性(密度)可以对应于例如VV的至少或至多10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的天然基团(例如，氨基基团)与L1-L2-L3-(ISM)z部分连接。
在式(1c)的替代性实施例中，病毒载体(VV)被修饰以包含巯基基团，并且L1表示与VV的巯基基团结合的巯基反应性基团。L3表示具有氨基反应性基团和巯基反应性基团的双官能交联剂，其中所述氨基反应性基团与L2的氨基基团结合(即，与所述氨基基团反应)并且所述巯基反应性基团与所述ISM的巯基基团结合(即，与所述巯基基团反应)，或者可替代地，所述氨基反应性基团与所述ISM的氨基基团结合(即，与所述氨基基团反应)并且所述巯基反应性基团与L2的巯基基团结合(即，与所述巯基基团反应)。L2可以是上文先前所描述的任何肽、糖、脂质或非生物分子或聚合物。
在式(1c)的另一个替代性实施例中，VV和L2被修饰以包含叠氮基团或炔烃基团，以便VV和L2通过叠氮-炔环加成点击化学连接。L1表示或者包括连接VV和L2的1,2,3-三唑基团，其中所述1,2,3-三唑基团是所述VV上的所述叠氮基团或炔烃基团分别与L2上的炔烃基团或叠氮基团之间的叠氮-炔环加成点击化学反应的结果。L2可以是上文先前所描述的任何肽、糖、脂质或非生物分子或聚合物。L3是与L2和ISM连接的连接部分。L3可以是例如L2上的氨基基团与ISM上的氨基反应性基团反应的结果，或者是L2上的氨基反应性基团与ISM上的氨基基团反应的结果，或者是L2上的巯基基团基团与ISM上的巯基反应性基团反应的结果，或者是L2上的巯基反应性基团与ISM上的巯基基团反应的结果，或者L3可以是由L2上的炔基基团与ISM上的叠氮基团之间的环加成反应产生的1,2,3-三唑基团，或者L3可以是由ISM上的炔基基团与L2上的叠氮基团之间的环加成反应产生的1,2,3-三唑基团。
在式(1c)的另一个替代性实施例中，L2和ISM被修饰以包含叠氮基团或炔烃基团，以便L2和ISM通过叠氮-炔环加成点击化学连接。L3表示或者包括连接L2和ISM的1,2,3-三唑基团，其中所述1,2,3-三唑基团是L2上的所述叠氮基团或炔烃基团分别与ISM上的炔烃基团或叠氮基团之间的叠氮-炔环加成点击化学反应的结果。L2可以是上文先前所描述的任何肽、糖、脂质或非生物分子或聚合物，只要其被修饰以包含叠氮基团或炔烃基团。L1是与L2和VV连接的连接部分。L1可以是例如L2上的氨基基团与VV上的氨基反应性基团反应的结果，或者是L2上的氨基反应性基团与VV上的氨基基团反应的结果，或者是L2上的巯基基团基团与VV上的巯基反应性基团反应的结果，或者是L2上的巯基反应性基团与VV上的巯基基团反应的结果，或者L1可以是由L2上的炔基基团与VV上的叠氮基团之间的环加成反应产生的1,2,3-三唑基团，或者L1可以是由VV上的炔基基团与L2上的叠氮基团之间的环加成反应产生的1,2,3-三唑基团。
在式(1c)的任何上文所描述的实施例中，多个L-(ISM)z部分通常与VV连接。L-(ISM)z部分的多重性可以对应于例如VV的至少或至多10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的天然基团(例如，氨基基团)与L-(ISM)z部分连接。此外，如任选地大于1的变量z所示，单个L可以与多于一个ISM连接。通过在L中具有一个或多个分支点，单个L可以与多于一个ISM连接，所述分支点中的每个分支点可以与ISM连接。以这种方式，对于单个L，变量z的值可以精确地为或至少为例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15、18、20、22、25或30或在由前述值中的任何两个界定的范围内的值。值得注意的是，单个L可以通过多于一个的键与所述VV连接，并且所述单个L可以与一个或多个ISM连接。
在一些实施例中，所述ISM具体地是磷酸丝氨酸(PS)。在此类实施例中，所述经修饰的病毒载体可以具有以下结构中的任何一个：
在上式(1-1)、(1a-1)、(1b-1)和(1c-1)中，VV、L、y、L1、L2和L3如以上式(1)、(1a)、(1b)和(1c)中所描述，包括其中提供的所有示例性实施例，包括L或其子连接子组分(例如，L1、L2或L3)具有一个或多个分支点的可能性，由此允许单个连接子与多于一个或多个ISM连接。
在一些实施例中，所述ISM具体地是聚唾液酸(PSA)。在此类实施例中，所述经修饰的病毒载体可以具有以下结构中的任何一个：
在上式(1-2)、(1a-2)、(1b-2)和(1c-2)中，VV、L、y、L1、L2和L3如以上式(1)、(1a)、(1b)和(1c)中所描述，包括其中提供的所有示例性实施例，包括L或其子连接子组分(例如，L1、L2或L3)以具有一个或多个分支点的可能性，由此允许单个连接子与多于一个或多个ISM连接。
在存在L1和/或L3的实施例中，L1和/或L3可以表示任何两个反应性官能团之间，如胺与胺反应性基团之间，或者巯基与巯基反应性基团之间，或者炔烃与叠氮反应性基团之间的反应的产物。值得注意的是，在上文所公开的L1和/或L3表示双官能交联剂的任何式中，L1和/或L3可以具有胺-胺、胺-巯基和炔烃-叠氮偶联之外的反应性官能团的组合。L1和/或L3可以起到例如胺-羧基、巯基-羧基和巯基-巯基偶联剂的作用。胺-胺双官能交联剂的一些实例包括双(NHS)-酯化合物(其中NHS＝N-羟基琥珀酰亚胺)和其磺化形式，以及二-亚氨基酯化合物，其中许多是可商购获得的。胺-巯基双官能交联剂的一些实例包括NHS-马来酰亚胺化合物和其磺化形式，其中许多是可商购获得的。巯基-巯基双官能交联剂的一些实例包括双(马来酰亚胺)化合物和其磺化形式，如本领域公知的。胺-羧基双官能交联剂的一些实例包括碳二亚胺，如N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)，如本领域公知的。L1和/或L3可以独立地选自本公开提供的任何式中的任何前述双官能交联剂。可以理解，尽管L1和/或L3可以被鉴定为双官能交联剂，但是L1和/或L3以双官能交联剂的反应性基团与VV、L2或ISM上存在的基团之间反应产生的反应产物的形式存在于上述任何式中。
在一些实施例中，交联剂化合物包括用于氨基基团与巯基基团交联的N-羟基琥珀酰亚胺酯-马来酰亚胺异双官能脂肪族试剂。交联剂化合物的一些实例包括AMAS、BMPS、GMBS、Sulfo-GMBS、MBS、Sulfo-MBS、SMCC、Sulfo-SMCC、EMCS、Sulfo-EMCS、SMPB、Sulfo-SMPB、SMPH、LC-SMCC和Sulfo-KMUS。
在支链连接子的情况下，所述支链连接子可以具有以下示例性结构：
在上述支链连接子结构中，C是连接子的分支点，并且B、D、F和H是分支部分，每个分支部分的末端是反应性官能团(分别为A、R、G和I)，所述反应性官能团进而与病毒载体(VV)和ISM连接，如下文进一步讨论的。至少一个反应性官能团(A、R、G和I)与VV连接，并且至少一个反应性官能团(A、R、G和I)与ISM连接。在一些实施例中，VV通过VV上的反应性基团(例如，“R1”)与每个连接子上的反应性官能团R的反应而与多个L连接，以形成以下连接：(VV)-R1-R-L-(ISM)z，其中R1-R表示R1与R之间的反应的产物，并且L可以通过其剩余的A、G和/或I反应性官能团与多于一个ISM连接。在其它实施例中，VV通过多于一个连接点(例如，A、R、G和I反应性官能团中的两个或三个)与L连接，并且每个L可以与一个或多个ISM连接。
在一些实施例中，存在于支链连接子或本公开中提供的任何式中的反应性官能团(例如，A、G、R、R1和I)独立地选自H、F、Cl、Br、I、SH、受保护的巯基、NH2、-NH-(仲胺)、N＝C＝O，受保护的NCO、N＝C＝S、COOH、活性酯、醛、COSH、C(＝S)SH、OCOOH、OCOSH、OC(＝S)OH、SC(＝O)SH、SC(＝S)SH、N(C＝O)NH2、N(C＝NH)NH2、N(C＝S)NH2、δ-戊内酯、ε-己内酯、CH2＝CH-C(＝O)-O-、CH2＝CH-C(＝O)-NH-、CH2＝CH-C(＝O)-S-、CN、CH2＝C(CH3)-C(＝O)-O-、CH2＝C(CH3)-C(＝O)-NH-、OH、叠氮、炔烃、C6-C10芳基基团、环状基团(异冰片基、环己基、环戊基)和氟(全氟丁基、全氟乙基)衍生物。
在一些实施例中，支链连接子中的B、F和H独立地选自-(CH2)x-，其中x是0至20的整数。
在一些实施例中，支链连接子中的C可以是碳、氮或硅。
在一些实施例中，支链连接子中的D是C(＝O)(CH2)x或-(CH2)x-，其中x是1至20的整数。
在一些实施例中，本文所公开的经修饰的病毒载体实现的转染效率是未经修饰的病毒载体实现的转染效率的至少30％。在其它实施例中，本文所公开的经修饰的病毒载体实现的转染效率是未经修饰的病毒载体实现的转染效率的至少40％。在其它实施例中，本文所公开的经修饰的病毒载体实现的转染效率是未经修饰的病毒载体实现的转染效率的至少50％。在其它实施例中，本文所公开的经修饰的病毒载体实现的转染效率是未经修饰的病毒载体实现的转染效率的至少60％。在其它实施例中，本文所公开的经修饰的病毒载体实现的转染效率是未经修饰的病毒载体实现的转染效率的至少70％。
用于将经修饰的病毒载体引入到细胞或受试者中的组合物和方法
通过施用病毒载体的基因疗法提供了治疗各种遗传性和获得性疾病的有希望的方法。然而，首次施用病毒载体引起的载体免疫原性可能会限制病毒载体的后续施用。在一些情况下，持续的高滴度抗体可以由多次载体施用触发，降低了重复的基于病毒载体的治疗的任何益处。在一些实施例中，所公开的组合物和方法可以降低病毒载体的免疫原性，由此使得能够多次施用基于病毒的基因递送。
在一些实施例中，本公开提供了一种通过引入本文所公开的经修饰的病毒载体将病毒载体引入受试者的方法，例如，以治疗和/或预防疾病。
在一些实施例中，经修饰的病毒载体离体转染到受试者的细胞中，并且然后在体内输注所产生的细胞。在一些实施例中，所述方法包括使所述细胞与经修饰的病毒载体接触多次。在一些实施例中，所述方法包括多次接触所述细胞，每次使所述细胞与多种经修饰的病毒载体接触。
在一些实施例中，将经修饰的病毒载体直接体内施用并体内递送到受试者的细胞中。
在一些实施例中，所述经修饰的病毒载体通过肠内施用途径施用。在一些实施例中，所述经修饰的病毒载体通过肠胃外施用途径施用。在一些实施例中，所述经修饰的病毒载体口服施用。在一些实施例中，所述经修饰的病毒载体舌下施用。在一些实施例中，所述经修饰的病毒载体直肠施用。在一些实施例中，所述经修饰的病毒载体通过粉末气雾剂吸入施用。在一些实施例中，所述经修饰的病毒载体通过加压计量气雾剂吸入施用，所述加压计量气雾剂包括在液化惰性推进剂中的经修饰的病毒载体。在一些实施例中，所述经修饰的病毒载体皮下施用。在一些实施例中，所述经修饰的病毒载体肌内施用。在一些实施例中，所述经修饰的病毒载体皮内施用。在一些实施例中，所述经修饰的病毒载体静脉内施用。在一些实施例中，所述经修饰的病毒载体动脉内施用。在一些实施例中，所述经修饰的病毒载体鞘内施用。在一些实施例中，所述经修饰的病毒载体腹膜内施用。在一些实施例中，所述经修饰的病毒载体玻璃体内施用。
在一些实施例中，与施用未经修饰的病毒载体的对照受试者相比，施用如本公开中所描述的经修饰的病毒载体的受试者表现出降低的免疫应答。
在一些实施例中，所述方法包括向受试者多次施用单一的本公开的经修饰的病毒载体。在一些实施例中，所述方法包括向受试者多次施用多于一种本公开的经修饰的病毒载体。在一些实施例中，所述方法包括向受试者多次施用多于一种本公开的经修饰的病毒载体，其中与多次施用未经修饰的病毒载体的对照受试者相比，所述受试者表现出降低的免疫应答。
在一些实施例中，所述方法包括在第一时间点向受试者施用(i)本公开中描述的经修饰的病毒载体，并且随后在第二时间点向受试者施用(ii)所述经修饰的病毒载体，并且与在所述第一时间点和所述第二时间点施用未经修饰的病毒载体的对照受试者相比，所述受试者表现出降低的免疫应答。在一些实施例中，所述方法包括在第一时间点向受试者施用(i)本公开中描述的经修饰的病毒载体，并且随后在第二时间点向受试者施用(ii)不同的本公开中描述的经修饰的病毒载体；并且与在两个所述第一时间点和所述第二时间点施用未经修饰的病毒载体的对照受试者相比，所述受试者表现出降低的免疫应答。
在一些实施例中，所述第二时间点在所述第一时间点之后1天与49天之间。在一些实施例中，所述第二时间点在所述第一时间点之后1天与49天之间。在一些实施例中，所述第二时间点在所述第一时间点之后3天与35天之间。在一些实施例中，所述第二时间点在所述第一时间点之后7天与28天之间。在一些实施例中，所述第二时间点在所述第一时间点之后14天与21天之间。在一些实施例中，所述第二时间点是在所述第一时间点之后至少24小时。在一些实施例中，所述第二时间点是在所述第一时间点之后至少72小时。在一些实施例中，所述第二时间点是在所述第一时间点之后至少7天。在一些实施例中，所述第二时间点是在所述第一时间点之后至少14天。在一些实施例中，所述第二时间点是在所述第一时间点之后至少21天。
病毒载体的免疫原性可以基于本领域描述的多种方法来确定。这些方法包括各种功能测定，如抗体酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶联免疫斑点(ELISPOT)、迟发型超敏反应、四聚体分析、基于流式细胞术的细胞因子表达分析、中和抗体测定、飞行时间细胞术(CyTOF)和基于PCR的T细胞受体基因使用或细胞因子产生的检测。(Hui D.J.等人,AAV衣壳CD8+T细胞表位在AAV血清型中高度保守(AAV capsid CD8+T-cell epitopes are highlyconserved across AAV serotypes.)《分子疗法方法临床发展(Mol.Ther.MethodsClin.Dev.)》2015；2:15029.；Martino A.T.等人,测量对重组AAV基因转移的免疫应答(Measuring immune responses to recombinant AAV gene transfer.)《分子生物学方法(Methods Mol.Biol.)》2011；807:259-272；Veron P.等人,随机健康供体对腺相关病毒类型1的体液和细胞衣壳特异性免疫应答(Humoral and cellular capsid-specific immuneresponses to adeno-associated virus type1in randomized healthy donors.)《免疫学杂志(J.Immunol.)》2012；188:6418-6424；以及Kuranda K.等人,暴露于野生型AAV导致人类不同的衣壳免疫特性(Exposure to wild-type AAV drives distinct capsidimmunity profiles in humans.)《临床研究杂志(J.Clin.Invest.)》2018；128:5267-5279，所有这些文献通过引用整体并入本文，因为其涉及免疫原性测定；也参见下面本公开的实例7)。
在一些实施例中，降低的免疫原性可以基于T细胞功能的分析来确定，如Treg活化的分析和/或与对照相比抗载体抗体的量的测量。用于分析T细胞功能的测定是本领域已知的并且包括但不限于基于细胞因子的功能测定、HLAI类/表位四聚体复合物和基于PCR的方法。T细胞功能也可以通过AAV8特异性小鼠干扰素γELISPOT和分泌抗AAV8 IgG的B细胞ELISPOT用可商购获得的试剂盒测量，如下文实例7中所描述的。调节性T细胞(Treg)活化可以通过本领域已知的方法来测量，包括但不限于抑制测定，所述抑制测定测量Treg抑制T细胞增殖的能力，测量CCR5的表达，测量FOXP3去甲基化，包括qPCR和桑格测序(Sangersequencing)迹线的表观遗传测序甲基化分析。另外，如以下实例所示，Treg可以用抗体染色并通过流式细胞术进行分析。可以通过本领域已知的方法检测病毒载体的抗体。此类方法包括通过使用抗病毒载体抗体通过可商购获得的试剂盒并且如下文实例7所示进行的ELISA和流式细胞术。
在一些实施例中，经修饰的病毒载体用于多种体外和体内应用。
在一些实施例中，经修饰的病毒载体用于体外和体内聚集的规则间隔的短回文重复序列-Cas核酸内切酶(CRISPR-Cas)基因编辑。
在一些实施例中，将经修饰的病毒载体施用于受试者以治疗或预防受试者的病状或疾病，包括但不限于感染性疾病(例如，由包括例如SARS-CoV-2的冠状病毒引起的感染)、自身免疫性疾病或癌症。在一些实施例中，经修饰的病毒载体与检查点抑制剂(例如，抗程序性死亡配体1(抗PD-L1)抗体、抗细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(抗CTLA4))一起递送以治疗癌症。
术语“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”是指预防或延迟病症发作、减缓病症进展和/或改善病症的症状。
术语“受试者”是指包括人的任何哺乳动物受试者。
经修饰的病毒载体可以通过直接注射到受试者的血流或期望的组织或器官中而“裸”递送。可替代地，可以将经修饰的病毒载体与促进细胞摄取分子的脂质化合物组合。脂质化合物包括脂质体、脂质转染素、细胞转染素、基于脂质的阳离子，并且然后被引入到体液、血流或选定的组织位点中。
可以通过各种合适的施用途径，包括口服、眼用、鼻用、局部、透皮、肠胃外(例如，静脉内、腹膜内、皮内、皮下或肌内)途径，将经修饰的病毒载体施用于受试者。
在一些实施例中，本公开提供了包括经修饰的病毒载体的组合物，所述经修饰的病毒载体适于向受试者施用。组合物还可以包括药学上可接受的载剂。
如本文所使用的，药学上可接受的载剂包括任何和所有溶剂、分散介质、等渗剂等。除非任何常规介质、试剂、稀释剂或载剂对接受者或经修饰的病毒载体的治疗效果有害，否则其使用是合适的。载剂可以是液体、半固体，例如，糊剂或固体载剂。载剂的实例包括油、水、盐溶液、醇、糖、凝胶、脂质、脂质体、树脂、多孔基质、粘合剂、填充剂、涂层、防腐剂等，或其组合。经修饰的病毒载体可以以任何方便和实用的方式与载剂组合，例如通过混合物、溶液、悬浮液、乳化、包封、吸收等，并且可以制成适合于注射、植入、吸入、摄取等的调配物，如片剂、胶囊、粉末、糖浆、悬浮液。
在一些实施例中，包括任何一种上文所描述的经修饰的病毒载体的组合物是疫苗组合物。在一些实施例中，疫苗组合物包括佐剂。在一些实施例中，包括经修饰的病毒载体的疫苗组合物是针对包括例如SARS-CoV-2的冠状病毒的疫苗。在一些实施例中，本申请公开了用于对受试者进行疫苗接种的方法，所述方法包括向受试者施用上文所描述的经修饰的病毒载体。
实例
在本文所公开的各个实例中所描述的方法的步骤足以实行本公开的方法。因此，在实例中，方法基本上由本文所公开的方法的步骤的组合组成。在另一个实例中，方法由此类步骤组成。
呈现以下实例以说明本公开。这些实例并不旨在在以任何方式进行限制。
实例1.免疫抑制PS部分的合成
方案1.PS部分的合成。
化合物4的合成：将N-Boc-Ser-OtBu(1.0gm，3.82mmol)溶解于30ml干苯中并将溶液冷却至0℃。接下来，添加三乙胺(0.62mL，4.6mmol)，然后在30分钟的时间段内向10mL干苯中滴加2-氯-2-氧代-1,3,2-二氧杂磷杂环戊烷1(0.42mL，4.6mmol)，并且然后将反应内容物在室温下再搅拌3小时。在反应完成之后，将二乙醚倒入反应混合物中并将沉淀的三甲胺盐酸盐过滤出。然后将滤液在减压下浓缩，得到呈油的化合物2，其无需进一步纯化即可用于下一步骤。将化合物2重新溶解于30mL无水乙腈中并向其中添加化合物3(2.2gm，5.7mmol)以及18-冠-6醚(0.14gm，0.53mmol)。然后将反应混合物在55℃下搅拌72小时。在反应之后，将反应内容物过滤，在真空下浓缩并通过快速柱色谱法纯化，得到产率为56％的化合物4。结果通过化合物4的1H NMR谱得到证实。1H NMR(300MHz,D2O)δ4.29-4.19(m,6H),4.02-3.94(m,2H),2.79(t,J＝6.9Hz,2H),2.69-2.61(m,2H)。
PS-SH(化合物5)的合成：将化合物4(1.5gm，2.14mmol)溶解于5mL二氯甲烷中并向其中添加30mL三氟乙酸。将反应内容物搅拌5小时。在反应完成之后，将反应混合物在真空下浓缩，得到粘稠液体。然后将粗产物用MeOH:二乙醚(1:20)结晶，得到呈白色粉末的期望的化合物5。结果通过化合物5的1H NMR谱得到证实。1H NMR(300MHz,D2O)δ4.29-4.19(m,6H),4.02-3.94(m,2H),2.79(t,J＝6.9Hz,2H),2.69-2.61(m,2H)。
m/z:[M]-316.0
实例2.聚合连接子(KK)8肽的合成
Fmoc-Lys(Z)-Lys(Boc)-OH(KK二聚体)的合成：在氮气下，将Fmoc-Lys(Z)-OH(42.5g，0.1mol)和NHS(13.8g,0.12mol)溶解于无水乙腈(400mL)中。然后添加DCC(22.7g，0.11mol)并将混合物在室温下搅拌过夜。在单独的圆底烧瓶中，将H-Lys(Boc)-OH(25.0g，0.102mol)在NaHCO3 6.8％/乙腈1:2(900mL)的混合物中搅拌，并且然后将混合物逐滴倒入前述溶液中。将反应在室温下保持搅拌24小时，然后将pH调节至6(1N HCl)。将所有沉淀物过滤，并且将乙腈蒸发。将水层通过12M HCl酸化至pH为1并用DCM(400mL，3次)萃取。将所有有机层组合，用水(1×300mL)洗涤，并用无水Na2SO4干燥。将粗产物在过量的己烷中粉碎并在乙酸乙酯/己烷溶液中重结晶两次。获得呈白色粉末的KK二聚体。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ7.776-7.685(d,2H),7.605 -7.522(t,2H),7.412-7.269(m,6H),7.177-7.039(m,1H),6.116-5.925(d,1H),5.163-4.981(m,3H),4.881-4.462(dm,2H),4.417-4.236(m,3H),4.214-4.131(m,1H),3.212-2.969(m,4H),1.955-1.582(m,4H),1.533-1.227(m,17H)。m/z:[M-Boc+2H]+＝631.3
(KK)8-C-NH2多肽的合成：(KK)10-C-NH2通过Fmoc固相肽合成(SPPS)在LibertyBlue自动化微波辅助肽合成仪(CEM)上合成。在Rink酰胺MBHA树脂上，序列合成规模设定为2.5mmol(0.6meq/g取代)。用机器默认的微波条件在20％哌啶/DMF溶液中进行脱保护。在存在5倍摩尔过量的试剂(DMF中的氨基酸/二异丙基碳二亚胺/Oxyma＝0.2M/0.5M/1.0M)的情况下，通过使用CEM提供的2.5mmol偶联循环方法进行偶联反应。使用20ml的混合物(cocktail)(TFA/苯酚/水/茴香硫醚/EDT；82.5/5/5/5/2.5)在室温下进行切割180分钟。在切割之后，将(EK)10-C-NH2沉淀出来并用冰冷的无水乙醚洗涤。m/z:1116.72+,1674.43+,[H-(K(Cbz)K)8C(mob)-NH2,3347.89]通过使用HCOOH/HCOH回流制备胺基团的二甲基化。然后将Z基团在含33％ HBr的AcOH溶液中脱保护。将肽溶解于10％乙酸中并冷冻干燥。Econo-Pac 10DG脱盐柱用于进一步增强产物的纯度。
实例3.经KKPS修饰的AAV8和AAV PHP.eb的制备
在室温下，将2μl的AMAS(10nM于DMSO中)与250μl AAV(2E11 vg/ml于pH为7.4的PBS中)混合2小时。用超离心过滤器去除未反应的AMAS。将AMAS/AAV混合物洗涤并离心5次。将沉淀物用pH为7.4的PBS复溶回90μl。在4℃下将10μl KK肽(20nM)添加到复溶的AMAS/AAV中过夜。用/>超离心过滤器去除未反应的KK肽。将AMAS/AAV/KK混合物洗涤并离心5次。将沉淀物用pH为7.4的PBS复溶为250μl。在室温下添加2μl AMAS肽(100nM)2小时。用/>超离心过滤器去除未反应的AMAS。将混合物洗涤并离心5次。将沉淀物用pH为7.4的PBS复溶为50μl。添加50μl PS-SH小分子(1μM)并将混合物在4℃下反应过夜。用超离心过滤器去除未反应的PS-SH小分子。
实例4.KKPS-AAV8-CMV-GFP的体外和体内转染
将293T细胞在补充有10％牛生长血清、100IU/mL青霉素和100mg/ml链霉素的DMEM(Media Tech公司(Media Tech))中培养。将培养物在37℃和5％ CO2的含湿气温育箱中生长。将每孔约10,000个细胞铺板在96孔板中的100μL的培养基中。在铺板之后，立即用AAV8-GFP或经PS修饰的AAV8-GFP感染细胞，感染复数(MOI)为每个细胞50,000个病毒基因组。在24小时时，向细胞中添加另外的100μL的培养基。在感染后48小时时，收获细胞并在FACSCaliber上分析GFP表达。图2A示出了KKPS-AAV8-GFP的感染性百分比的图，与AAV8-GFP对照相比示出了约75％感染性。
为了显示产生的KKPS-AAV8-CMV-GFP的体内转染，从杰克逊实验室(Jacksonlaboratory)购买雄性C57B/6小鼠。在5-6周龄时，向动物IV注射4×1012vg/kg的AAV-CMV-GFP或KKPS-AAV-CMV-GFP。在表达3周之后，将小鼠处死，并将肝脏切片进行切片并通过共聚焦显微镜观察。图2B表示来自AAV-CMV-GFP对照组的肝脏切片，而图2C表示KKPS-AAV-CMV-GFP小鼠。如可以在图2中看到的，KKPS-AAV8保持了天然AAV8的大部分效率。
实例5.KKPS-AAV PHP.eb-CAG-eGFP在C57B/6小鼠中的脑靶向基因递送
为了验证产生的KKPS-AAV载体能够靶向脑，并确定KKPS缀合策略是否可以进一步地应用于其它AAV载体，用KKPS肽修饰了脑靶向AAV载体php.eb。KKPS-AAV PHP.eb-CAG-eGFP载体和AAV PHP.eb-CAG-eGFP对照载体通过眶后注射以1×1011vg的剂量静脉内施用于成年雄性小鼠(6-8周龄)，体内表达6周。在表达6周之后，用Euthasol(戊巴比妥钠和苯妥英钠溶液)对小鼠进行麻醉，并经心脏灌注有30-50mL的0.1M磷酸盐缓冲盐水(PBS)(pH为7.4)，然后灌注30-50ml的含4％多聚甲醛(PFA)的0.1M PBS。然后收获脑并在4℃下在4％PFA中后固定过夜。使用所有新鲜制备的溶液将组织洗涤并在4℃下储存在0.1M PBS和0.05％叠氮化钠中。在徕卡(Leica)VT1200振动仪上切割100μm厚的脑切片。在KKPS-AAV.eb-CAG-eGFP组织样品的整个脑和神经中都可以看到GFP，如图3A所示。GFP在皮质、海马体和丘脑中的整个细胞和神经元中的表现可以分别在图3B、图3C和图3D中看到。另外，在比较由AAV php.eb-CAG-eGFP载体(图3E)和由KKPS-AAV php.eb-CAG-eGFP载体(图3F)递送的全脑eGFP表达时，似乎经KKPS修饰的病毒载体至少比在AAV-php.eb-CAG-eGFP样品中看到的病毒载体更明显。在脑组织中看到的GFP表示KKP-AAV.eb-CAG-eGFP载体跨血脑屏障同时维持功能能力的能力。
实例6.KKPS-AAV8-CMV-Fluc在C57B/6小鼠体内的肝脏靶向基因递送
为了显示产生的KKPS-AAV载体靶向肝脏的能力，从杰克逊实验室购买雄性C57B/6小鼠。在5-6周龄时，向动物IV注射1×1011颗粒的AAV-CMV-荧光素酶或KKPS-AAV-CMV-荧光素酶。在3周之后，用含2-5％异氟醚的氧气对小鼠进行麻醉。d-荧光素底物以150μg/g的体重的剂量进行腹膜内注射。然后将小鼠置于不透光室中，并使用IVIS系统(珀金埃尔默(Perkin Elmer))记录生物发光。KKPS-AAV8-CMV-Fluc载体受试者显示出与注射有AAV-CMV-Fluc对照的对照受试者的肝脏基因靶向性类似的肝脏基因靶向性。KKPS-AAV8-CMV-Fluc的这种类似肝脏靶向基因递送可以在图4A中看到，其中上图示出了对照，并且下图示出了实验载体，两者在病毒载体注射后3和4周成像。另外，图4B示出了总结在图4.A中看到的数据的图，图4A和4B两者示出了KKPS-AAV8-CMV-Fluc具有与AAV-CMV-Fluc对照类似的肝脏靶向性。
实例7.KKPS-AAV8在C57B/6小鼠中的免疫抑制能力
在每项研究开始时，动物被随机分配到处理组。使用每组五只动物的样品大小。C57/BL6小鼠(雄性；体重20至30g)从杰克逊实验室获得。对于体内免疫原性研究，通过眶后注射将编码mCherry(4×1012vg/kg)的天然AAV8和KKPS-AAV8静脉内施用于小鼠体内。表达3周之后，IV注射另一剂量的编码GFP(4×1012vg/kg)的天然AAV8和KKPS-AAV8。从首次静脉内施用载体后的第21天开始，每7天抽血一次，直至处死为止。在第49天，对所有小鼠实施安乐死，并通过心脏穿刺采集其血液。所有血液样品进行间接ELISA测试(图5A)。作为直接ELISA测试的第一步，用100μl包被缓冲液[0.1M碳酸钠缓冲液(pH为10.5)]中的1×1010个AAV8包被96孔板的每个孔。在4℃下过夜包被过夜之后，将板用PBS-T缓冲液(pH为7.4)洗涤五次以除去抗原溶液，并且然后用封闭缓冲液[在0.1M tris缓冲液(pH为7.4)中的1％ BSA溶液]填充，在室温下温育1小时，随后去除封闭缓冲液。然后将所有孔通过PBS-T缓冲液洗涤五次。随后，将小鼠血清在含1％BSA的PBS缓冲液中的连续稀释液添加到板(每个孔100μl)中，在37℃下温育1小时，随后去除小鼠血清，并且将所有孔用PBS缓冲液洗涤五次。接下来，将山羊抗小鼠IgM或IgG(HRP缀合的)次级抗体添加到每个孔中，在37℃下再温育1小时。在与次级抗体温育之后，在添加每个孔100μl HRP底物3,3′,5,5′-四甲基联苯胺之前，将所有孔使用PBS缓冲液洗涤五次。将板摇动15分钟，并将100μl的终止溶液(0.2M H2SO4)添加到每个孔中。用酶标仪记录在450nm(信号)和570nm(背景)处的吸光度。图5B示出了KKPS成功抑制了抗AAV8抗体的产生，而天然AAV8示出了高抗体滴度(>6400)。未施用AAV样品的小鼠血清用作所有ELISA检测的阴性对照。收获小鼠脾脏，通过100μm细胞滤网(费雪牌(Fisherbrand))将脾细胞分离。通过使用可商购获得的试剂盒(艾博抗公司(abcam))进行AAV8特异性小鼠干扰素γELISPOT和分泌抗AAV8 IgG的B细胞ELISPOT。KKPS成功抑制了AAV8特异性T细胞和B细胞的产生和活化，如图5E所示。另外，每组中部分小鼠脾细胞也在12孔板中培养(每孔106个)并用AAV8肽池再次刺激。在72小时之后，将细胞用抗体染色，用于通过流式细胞术分析。KKPS成功诱导了Treg细胞的产生和活化(参见图5C)，表明用大量经AAV8载体修饰的PS部分处理的小鼠产生了对AAV8基因载体的免疫耐受。
实例8.KKPS-AAV8-FVIII在FVIII缺陷型小鼠(血友病A，HA)中的体内基因递送
为了验证KKPS肽能够使得在真实动物模型中再次施用AAV8载体，制备rAAV8-HLP-hFVIII并装载在AAV8载体中，并在FVIII基因敲除小鼠中测试效力。在每项研究开始时，动物被随机分配到处理组。使用每组五只动物的样品大小。FVIII缺陷型小鼠(雄性；体重20至30g)从杰克逊实验室获得。对于体内免疫原性研究，通过眶后注射将编码荧光素酶(4×1012vg/kg)的天然AAV8和KKPS-AAV8静脉内施用于小鼠体内。表达3周之后，IV注射编码hFVIII(4×1012vg/kg)的天然AAV8和AAV8和KKPS-AAV8。在第49和56天，在柠檬酸钠处理的试管中采集血浆样品。因为FVIII在其酶原FX的活化中充当酶因子IXa的辅因子，所以使用商业的基于FXa显色的试剂盒(Chromogenix)来测量柠檬酸钠抗凝鼠血浆样品中的hFVIII活性。显色FXa测定间接测量由AAV8-FVIII载体产生的所得hFVIII的总FVIII活性。
图6A示出了在HA小鼠中的两剂量队列的施用途径。图6B示出了用AAV8-FVIII或KKPS-AAV8-FVIII处理的HA小鼠血浆中的FVIII活性。数据用从C57B/6小鼠采集的新鲜血浆中的FVIII活性归一化。由于AAV8的免疫原性，第二剂量的AAV8不能在HA小鼠中表达FVIII。KKPS-AAV8在HA小鼠中实现了FVIII的第二剂量表达。
实例9.含PS的两性离子肽(PSZP-SH)的制备
S-炔烃将如方案2所示制备。将N-Boc-Ser-OtBu溶解于干苯中并将溶液冷却至0℃。然后将添加三乙胺，随后滴加2-氯-2-氧代-1,3,2-二氧杂磷杂环戊烷并将反应在室温下保持搅拌3小时。在反应完成之后，将二乙醚倒入反应混合物中并将形成的盐滤出。然后将滤液(含有中间体1)浓缩并直接用于在存在18-冠-6醚的情况下与丙炔酸钠(1.5摩尔当量的起始材料)反应。产物(化合物2)将通过快速柱色谱法纯化。同时，完全保护的肽H-[Phe(叠氮基)-Lys(Boc)]n-Cys(trt)-OH将通过Fmoc固相肽合成(SPPS)在Liberty Blue自动化微波辅助肽合成仪(CEM)上合成。在三苯甲基氯树脂上，序列合成规模将设定为2.5mmol。脱保护和偶联反应将根据CEM提供的默认设置进行。将使用20ml的混合物(乙酸/TFE/DCM的体积混合物：1/1/8)在室温下进行切割30分钟。然后将粗的完全保护的肽(3)在过量的冷乙醚中沉淀出来并通过制备型HPLC(安捷伦(Agilent))进一步纯化。PSZP-SH将通过两步反应获得：1，铜(I)催化的炔烃-叠氮环加成(CuAAc)点击化学；2，TFA脱保护。乙醚和HPLC纯化过程中的相同沉淀将用于纯化最终产物。H NMR和LC-MS将用于确认所有化合物和肽的结构和纯度。
实例10.用PSZP-SH对AAV进行修饰
AAV将通过巯基-烯‘点击’化学用PSZP-SH进行修饰。首先，AAV的表面胺基团(含0.001％ F-68的pH为7.4的PBS中的2E11 vg/ml)将通过商业交联剂‘AMAS’[2ulAMAS溶液(10nM于DMSO中)]转化为马来酰亚胺基团。其次，PSZP-SH(10ul的20nM PBS溶液)将通过末端巯基基团与马来酰亚胺部分之间的‘点击’化学反应与活化的AAV缀合。在每个反应步骤之间，AAV将通过脱盐柱，然后超滤以去除未反应的试剂并浓缩产物。将通过qPCR监测缀合前后AAV的感染滴度的可能损失。最终产物的组成将通过SDS-PAGE和MALDI-TOF进行表征。
实例11.通过马来酰亚胺-巯基反应制备聚唾液酸缀合的AAV。
PSA-NH2和经修饰的AAV将如图7所示制备。
第一反应将利用α2,3-/α2,8-唾液酸转移酶(CstII)将1-2Neu5Ac添加到受体1 2-氨乙基2-乙酰胺基-2-脱氧-3-O-β-D-吡喃半乳糖基-β-D-吡喃葡萄糖苷的糖端，其中CMP-Neu5Ac作为供体底物(3)。第二反应将通过使用α2,8-唾液酸转移酶(PSTnm)使更多的Neu5Ac在化合物1的糖端生长(4)。两步酶促反应的原因是PSTnm在末端处需要至少2个Neu5Ac以允许成功的多唾液酸化。对应的产物3将通过高效液相色谱法纯化并通过质谱仪定量结合的Neu5Ac残基的量。三种化学反应可以帮助将这种PSA与AAV衣壳表面结合。Sulfo-SMCC将与化合物3反应以将胺基端修饰成马来酰亚胺。如化合物5上所展示的，在与特劳特氏试剂(Traut's reagent)反应之后，衣壳表面上的胺基团将转变成巯基基团。经修饰的4和6将通过马来酰亚胺-巯基反应彼此缀合。可以使用针对衣壳蛋白的多克隆抗体通过蛋白质印迹分析缀合。经修饰的衣壳蛋白与天然的衣壳蛋白之间的不同的衣壳蛋白分子量可以指示成功的缀合。AAV将通过超速离心机纯化并通过脱盐重力柱以清除反应物和盐。
实例12.通过点击反应制备聚唾液酸缀合的AAV
由于酶的特异性，起始受体化合物将是类似的具有叠氮基团的二糖。PSA将由相同的酶促反应产生。AAV将被2,5-二氧代吡咯烷-1-基戊-4-炔酸酯修饰以获得炔烃基团。在CuSO4、THPTA和I-抗坏血酸钠的催化下，AAV和PSA将通过点击化学相互缀合。然而，起始化合物也可以是商业购买的在糖末端处具有Neu5Ac的炔烃连接的聚糖。在这种情况下，将PSA生长到聚糖上只需要PSTnm酶促反应。将应用类似的缀合方法和表征方法。HPLC将用于纯化最终PSA化合物，并且H NMR和LC-MS将用于评估所述化合物的结构和分子量。离心和尺寸排阻柱将用于纯化AAV。在点击化学之后的缀合将通过SDS-PAGE来表征。

Claims (73)

1.一种经修饰的病毒载体，其包括：
病毒载体(VV)；以及
免疫抑制部分(ISM)，所述ISM直接或通过连接子与所述病毒载体共价连接。
2.根据权利要求1所述的经修饰的病毒载体，其中所述病毒载体是选自由以下组成的组的病毒：逆转录病毒、慢病毒、腺病毒和腺相关病毒(AAV)。
3.根据前述权利要求中任一项所述的经修饰的病毒载体，其中所述病毒载体是选自由以下组成的组的腺相关病毒(AAV)：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV6.2、AAVrh10、AAV-DJ、AAV-DJ/8、AAV-PHP.B、AAV-PHP.eB、AAV-PHP.S、AAV2-retro、AAV2-QuadYF、AAV2.7m8和其经基因工程化的衍生物。
4.根据前述权利要求中任一项所述的经修饰的病毒载体，其中所述免疫抑制部分(ISM)包括一种或多种选自由以下组成的组的化合物：小分子、聚合物分子和肽，其中所述小分子、所述聚合物分子和所述肽的分子量为100-10,000g/mol。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的经修饰的病毒载体，其中所述免疫抑制部分(ISM)包括磷酸丝氨酸(PS)，所述PS具有以下结构：
其中波浪线表示与连接子键合的键或与所述病毒载体直接键合的键。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的经修饰的病毒载体，其中所述免疫抑制部分(ISM)包括聚唾液酸(PSA)。
7.根据权利要求6所述的经修饰的病毒载体，其中所述PSA包括以下结构：
其中Ac表示乙酰基；并且
n至少为2。
8.根据前述权利要求中任一项所述的经修饰的病毒载体，其中所述免疫抑制部分(ISM)包括一种或多种mTOR抑制剂。
9.根据权利要求8所述的经修饰的病毒载体，其中所述一种或多种mTOR抑制剂选自由以下组成的组：雷帕霉素(Rapamycin)、替西罗莫司(Temsirolimus)、依维莫司(Everolimus)、乌米莫司(Umirolimus)以及其组合。
10.根据前述权利要求中任一项所述的经修饰的病毒载体，其中所述免疫抑制部分包括选自由以下组成的组的一个或多个：芳香烃受体(AHR)配体、维生素D3、视黄酸、具有CxxC/CxxS侧接表位的肽(其中x是任何氨基酸)，以及其组合。
11.根据前述权利要求中任一项所述的经修饰的病毒载体，其中所述免疫抑制部分包括一种或多种来自凋亡细胞的分子。
12.根据权利要求11所述的经修饰的病毒载体，其中所述一种或多种来自凋亡细胞的分子选自由以下组成的组：磷脂酰丝氨酸、染色质寡核苷酸以及其组合。
13.根据前述权利要求中任一项所述的经修饰的病毒载体，其中所述免疫抑制部分包括一个或多个次级淋巴器官(脾脏或淋巴结)靶向部分或肝脏靶向部分。
14.根据权利要求13所述的经修饰的病毒载体，其中所述一个或多个次级淋巴器官靶向部分或肝脏靶向部分选自由以下组成的组：N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、N-乙酰神经氨酸(NeuAc或唾液酸)、半乳糖和岩藻糖以及其组合。
15.根据前述权利要求中任一项所述的经修饰的病毒载体，其中所述免疫抑制部分包括一个或多个炎症减少部分。
16.根据权利要求15所述的经修饰的病毒载体，其中所述炎症减少部分选自Z2-Y12、Z1-Y15、Z1-Y19、地塞米松(dexamethasone)、淋巴细胞功能相关抗原拮抗剂、d-甘露糖以及其组合。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的经修饰的病毒载体，其中所述病毒载体和所述免疫抑制部分彼此直接共价连接。
18.根据权利要求1至16中任一项所述的经修饰的病毒载体，其中所述病毒载体和所述免疫抑制部分通过连接子共价连接。
19.根据权利要求18所述的经修饰的病毒载体，其中所述连接子包括连接子肽和/或交联剂化合物。
20.根据权利要求19所述的经修饰的病毒载体，其中所述连接子肽是25个氨基酸的肽或25个氨基酸以下的的肽。
21.根据权利要求19或20所述的经修饰的病毒载体，其中所述连接子肽包括交替的Glu-Lys(EK)肽或Lys-Lys(KK)肽。
22.根据权利要求19或20所述的经修饰的病毒载体，其中所述连接子肽包括(KK)8-C-NH2或其衍生物。
23.根据权利要求19至22中任一项所述的经修饰的病毒载体，其中所述交联剂化合物包括N-羟基琥珀酰亚胺酯-马来酰亚胺异双官能脂肪族试剂。
24.根据权利要求19至23中任一项所述的经修饰的病毒载体，其中所述交联剂化合物选自由以下组成的组：AMAS、BMPS、GMBS、Sulfo-GMBS、MBS、Sulfo-MBS、SMCC、Sulfo-SMCC、EMCS、Sulfo-EMCS、SMPB、Sulfo-SMPB、SMPH、LC-SMCC和Sulfo-KMUS。
25.根据权利要求19至24中任一项所述的经修饰的病毒载体，其中所述经修饰的病毒载体包括多个所述连接子。
26.根据权利要求19至25中任一项所述的经修饰的病毒载体，其中每个连接子包括多个肽连接子和/或多个交联剂化合物。
27.根据权利要求19至26中任一项所述的经修饰的病毒载体，其中所述病毒载体包括表面位点，所述免疫抑制部分或所述连接子与所述表面位点共价结合。
28.根据权利要求27所述的经修饰的病毒载体，其中所述病毒载体的所述表面位点包括衣壳蛋白、gag蛋白、包膜蛋白和/或脂质层。
29.根据权利要求1至16中任一项所述的经修饰的病毒载体，其中所述经修饰的病毒载体包括以下结构：
其中：
VV是所述病毒载体；
L是直链或支链连接子，所述直链或支链连接子选自由以下组成的组：肽、糖、脂质和非生物分子和聚合物，其中y是0或1，分别对应于所述连接子的不存在或存在；
ISM是所述免疫抑制部分；并且
z至少为1，其中z对应于与L连接的ISM的数量；
其中连接VV、Ly和ISM的线表示共价键。
30.根据权利要求1至16和29中任一项所述的经修饰的病毒载体，其中所述连接子或所述ISM通过所述病毒载体的氨基基团与所述病毒载体连接。
31.根据权利要求30所述的经修饰的病毒载体，其中所述氨基基团位于所述病毒载体的衣壳或包膜上。
32.根据权利要求1至16和29至31中任一项所述的经修饰的病毒载体，其中所述连接子存在，并且所述经修饰的病毒载体包括以下结构：
33.根据权利要求32所述的经修饰的病毒载体，其中所述连接子通过所述病毒载体的氨基基团与所述病毒载体连接。
34.根据权利要求33所述的经修饰的病毒载体，其中所述氨基基团位于所述病毒载体的衣壳或包膜上。
35.根据权利要求1至16和29至34中任一项所述的经修饰的病毒载体，其中所述经修饰的病毒载体包括以下结构：
其中：
VV是所述病毒载体；
L1和L2是所述直链或支链连接子L的部分，其中L1表示具有氨基反应性基团和巯基反应性基团的双官能交联剂，其中所述氨基反应性基团与所述病毒载体的氨基基团结合；并且L2表示含有与L1的所述巯基反应性基团结合的巯基基团的连接部分，其中L2也与所述ISM结合，并且L2选自由以下组成的组：肽、糖、脂质和非生物分子和聚合物；
ISM是所述免疫抑制部分；并且
z至少为1，其中z对应于与L连接的ISM的数量。
36.根据权利要求1至16和29至35所述的经修饰的病毒载体，其中所述经修饰的病毒载体包括以下结构：
其中：
VV是所述病毒载体；
L1、L2和L3是所述直链或支链连接子L的部分，其中L1表示具有氨基反应性基团和巯基反应性基团的双官能交联剂，其中所述氨基反应性基团与所述病毒载体的氨基基团结合；L2表示含有与L1的所述巯基反应性基团结合的巯基基团的连接部分，并且L2选自由以下组成的组：肽、糖、脂质和非生物分子和聚合物；并且L3表示具有氨基反应性基团和巯基反应性基团的双官能交联剂，其中所述氨基反应性基团与L2的氨基基团结合，并且所述巯基反应性基团与所述ISM的巯基基团结合，或者其中所述氨基反应性基团与所述ISM的氨基基团结合并且所述巯基反应性基团与L2的巯基基团结合；
ISM是所述免疫抑制部分；并且
z至少为1，其中z对应于与L连接的ISM的数量。
37.根据权利要求1至16和29中任一项所述的经修饰的病毒载体，其中所述经修饰的病毒载体包括以下结构：
其中：
VV是所述病毒载体；
L1和L2是所述直链或支链连接子L的部分，其中VV被修饰以包含巯基基团，并且L1表示与VV的所述巯基基团结合的巯基反应性基团，其中L2与L1和所述ISM结合，并且L2选自由以下组成的组：肽、糖、脂质和非生物分子和聚合物；
ISM是所述免疫抑制部分；并且
z至少为1，其中z对应于与L连接的ISM的数量。
38.根据权利要求1至16和29中任一项所述的经修饰的病毒载体，其中所述经修饰的病毒载体包括以下结构：
其中：
VV是所述病毒载体；
L1、L2和L3是所述直链或支链连接子L的部分，其中VV被修饰以包含巯基基团，并且L1表示与VV的所述巯基基团结合的巯基反应性基团；L3表示具有氨基反应性基团和巯基反应性基团的双官能交联剂，其中所述氨基反应性基团与L2的氨基基团结合，并且所述巯基反应性基团与所述ISM的巯基基团结合，或者所述氨基反应性基团与所述ISM的氨基基团结合，并且所述巯基反应性基团与L2的巯基基团结合；其中L2选自由以下组成的组：肽、糖、脂质和非生物分子和聚合物；
ISM是所述免疫抑制部分；并且
z至少为1，其中z对应于与L连接的ISM的数量。
39.根据权利要求1至16和29中任一项所述的经修饰的病毒载体，其中所述经修饰的病毒载体包括以下结构：
其中：
VV是所述病毒载体；
L1和L2是所述直链或支链连接子L的部分，其中VV和L2被修饰以包含叠氮基团或炔烃基团，以便VV和L2通过叠氮-炔环加成点击化学连接；
L1表示连接VV和L2的1,2,3-三唑基团，其中所述1,2,3-三唑基团是所述VV上的所述叠氮基团或炔烃基团分别与L2上的炔烃基团或叠氮基团之间的叠氮-炔环加成点击化学反应的结果；其中L2与L1和所述ISM结合，并且L2选自由以下组成的组：肽、糖、脂质和非生物分子和聚合物；
ISM是所述免疫抑制部分；并且
z至少为1，其中z对应于与L连接的ISM的数量。
40.根据权利要求1至16和29中任一项所述的经修饰的病毒载体，其中所述经修饰的病毒载体包括以下结构：
其中：
VV是所述病毒载体；
L1和L2是所述直链或支链连接子L的部分，其中L1和ISM被修饰以包含叠氮基团或炔烃基团，以便L1和ISM通过叠氮-炔环加成点击化学连接；
L1选自由以下组成的组：肽、糖、脂质和非生物分子和聚合物；L2表示连接L1和ISM的1,2,3-三唑基团，其中所述1,2,3-三唑基团是L1上的所述叠氮基团或炔烃基团分别与ISM上的炔烃基团或叠氮基团之间的叠氮-炔环加成点击化学反应的结果；
ISM是所述免疫抑制部分；并且
z至少为1，其中z对应于与L连接的ISM的数量。
41.根据权利要求29至40中任一项所述的经修饰的病毒载体，其中所述ISM包括磷酸丝氨酸(PS)，所述PS具有以下结构：
其中波浪线表示与连接子键合的键或与所述病毒载体直接键合的键。
42.根据权利要求1至16和29至35所述的经修饰的病毒载体，其中所述经修饰的病毒载体包括以下结构：
其中：
VV是所述病毒载体；
磷酸丝氨酸(PS)被修饰以包含巯基基团，并且存在多个PS部分；
z大于1并且对应于通过L3与L2连接的PS部分的数量；
L1、L2和L3是所述直链或支链连接子L的部分，其中L1表示具有氨基反应性基团和巯基反应性基团的双官能交联剂，其中所述氨基反应性基团与所述病毒载体的氨基基团结合；L2表示含有与L1的所述巯基反应性基团结合的巯基基团的连接部分，并且L2是含有多个氨基基团的多肽；并且L3表示多个双官能交联剂，每个双官能交联剂具有氨基反应性基团和巯基反应性基团，其中所述氨基反应性基团与L2的所述氨基基团结合，并且所述巯基反应性基团与所述多个PS部分的所述巯基基团结合。
43.根据权利要求1至16和29至35所述的经修饰的病毒载体，其中所述经修饰的病毒载体包括以下结构：
其中：
VV是所述病毒载体；
磷酸丝氨酸(PS)被修饰以包含巯基基团；
L1、L2和L3是所述直链或支链连接子L的部分，其中L1表示具有氨基反应性基团和巯基反应性基团的双官能交联剂，其中所述氨基反应性基团与所述病毒载体的氨基基团结合；L2表示含有与L1的所述巯基反应性基团结合的巯基基团的连接部分，并且L2是多肽；L2和PS被修饰以包含叠氮基团或炔烃基团，以便L2和PS通过叠氮-炔环加成点击化学连接，并且L3表示连接L2和PS的1,2,3-三唑基团，其中所述1,2,3-三唑基团是L2上的所述叠氮基团或炔烃基团分别与PS上的炔烃基团或叠氮基团之间的叠氮-炔环加成点击化学反应的结果；并且
z至少为1，其中z对应于与L2连接的PS的数量。
44.根据权利要求29至40中任一项所述的经修饰的病毒载体，其中所述免疫抑制部分(ISM)包括聚唾液酸(PSA)。
45.根据权利要求所述的经修饰的病毒载体，其中所述PSA包括以下结构：
其中Ac表示乙酰基；并且
n至少为2。
46.根据权利要求1至16和29至35所述的经修饰的病毒载体，其中所述经修饰的病毒载体包括以下结构：
其中：
VV是所述病毒载体，所述病毒载体被修饰以包含巯基基团；
PSA是聚唾液酸；
L是连接VV和PSA的连接子并且包括与VV的所述巯基基团结合的巯基反应性基团。
47.根据权利要求1至16和29至35所述的经修饰的病毒载体，其中所述经修饰的病毒载体包括以下结构：
其中：
VV是所述病毒载体，所述病毒载体被修饰以包含炔烃基团或叠氮基团；
PSA是聚唾液酸，所述聚唾液酸被修饰以包含炔烃基团或叠氮基团；
L是连接VV和PSA的1,2,3-三唑基团，其中所述1,2,3-三唑基团是VV上的所述叠氮基团或炔烃基团分别与PSA上的炔烃基团或叠氮基团之间的叠氮-炔环加成点击化学反应的结果。
48.根据前述权利要求中任一项所述的经修饰的病毒载体，其中所述连接子包括肽。
49.根据权利要求48所述的经修饰的病毒载体，其中所述肽包括聚赖氨酸。
50.根据前述权利要求中任一项所述的经修饰的病毒载体，其中所述肽包含不超过25个氨基酸单位。
51.根据前述权利要求中任一项所述的经修饰的病毒载体，其中所述经修饰的病毒载体包括多于一个与所述病毒载体共价结合的免疫抑制部分。
52.根据前述权利要求中任一项所述的经修饰的病毒载体，其中所述经修饰的病毒载体包括1-10,000个与所述病毒载体共价结合的免疫抑制部分。
53.根据前述权利要求中任一项所述的经修饰的病毒载体，其中所述经修饰的病毒载体包括1-5,000个与所述病毒载体共价结合的免疫抑制部分。
54.根据前述权利要求中任一项所述的经修饰的病毒载体，其中所述经修饰的病毒载体包括1-2,000个与所述病毒载体共价结合的免疫抑制部分。
55.根据前述权利要求中任一项所述的经修饰的病毒载体，其中所述经修饰的病毒载体包括100-2,000个与所述病毒载体共价结合的免疫抑制部分。
56.根据前述权利要求中任一项所述的经修饰的病毒载体，其中所述经修饰的病毒载体实现的转染效率是未经修饰的病毒载体实现的转染效率的至少30％。
57.根据前述权利要求中任一项所述的经修饰的病毒载体，其中所述经修饰的病毒载体实现的转染效率是未经修饰的病毒载体实现的转染效率的至少40％。
58.根据前述权利要求中任一项所述的经修饰的病毒载体，其中所述经修饰的病毒载体实现的转染效率是未经修饰的病毒载体实现的转染效率的至少50％。
59.根据前述权利要求中任一项所述的经修饰的病毒载体，其中所述经修饰的病毒载体实现的转染效率是未经修饰的病毒载体实现的转染效率的至少60％。
60.根据前述权利要求中任一项所述的经修饰的病毒载体，其中所述经修饰的病毒载体实现的转染效率是未经修饰的病毒载体实现的转染效率的至少70％。
61.一种制备经修饰的病毒载体的方法，所述方法包括使免疫抑制部分与病毒载体连接，以获得根据前述权利要求中任一项所述的经修饰的病毒载体。
62.一种将遗传物质引入到细胞中的方法，所述方法包括使细胞与至少一种根据权利要求1至60中任一项所述的经修饰的病毒载体接触。
63.根据权利要求62所述的方法，其中所述细胞与所述至少一种经修饰的病毒载体接触多次。
64.根据权利要求62至63中任一项所述的方法，其中所述至少一种经修饰的病毒载体包括多种经修饰的病毒载体。
65.一种治疗受试者的方法，所述方法包括向受试者施用至少一种根据权利要求1至60中任一项所述的经修饰的病毒载体。
66.根据权利要求65所述的方法，其中与施用未经修饰的病毒载体的对照受试者相比，所述受试者在施用所述至少一种经修饰的病毒载体之后表现出降低的免疫应答。
67.根据权利要求65至66中任一项所述的方法，其中向所述受试者多次施用所述至少一种经修饰的病毒载体。
68.根据权利要求65至67中任一项所述的方法，其中所述至少一种经修饰的病毒载体包括多种经修饰的病毒载体。
69.根据权利要求67或68所述的方法，其中与施用未经修饰的病毒载体的对照受试者相比，所述受试者表现出降低的免疫应答。
70.根据权利要求67或68所述的方法，其中在第一时间点向所述受试者施用(i)根据权利要求1至60中任一项所述的经修饰的病毒载体，并且随后在第二时间点向所述受试者施用(ii)所述经修饰的病毒载体，并且与在所述第一时间点和所述第二时间点施用未经修饰的病毒载体的对照受试者相比，所述受试者表现出降低的免疫应答。
71.根据权利要求66至67中任一项所述的方法，其中在第一时间点向所述受试者施用(i)根据权利要求1至60中任一项所述的经修饰的病毒载体，并且随后在第二时间点向所述受试者施用(ii)根据权利要求1至60中任一项所述的不同的经修饰的病毒载体；并且
与在所述第一时间点和所述第二时间点施用未经修饰的病毒载体的对照受试者相比，所述受试者表现出降低的免疫应答。
72.根据权利要求70或71所述的方法，其中所述第二时间点在所述第一时间点之后1天与49天之间。
73.根据权利要求70至72中任一项所述的方法，其中所述第二时间点是在所述第一时间点之后至少21天。
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