CN117957255A

CN117957255A - 新型Fab二聚体

Info

Publication number: CN117957255A
Application number: CN202280061317.9A
Authority: CN
Inventors: R·蔡德勒
Original assignee: Helmholtz Munich Center German Center For Health And Environmental Research Ltd
Current assignee: Helmholtz Munich Center German Center For Health And Environmental Research Ltd
Priority date: 2021-07-14
Filing date: 2022-07-13
Publication date: 2024-04-30
Also published as: EP4370556A1; CA3225681A1; EP4119581A1; WO2023285525A1; AU2022311505A1

Abstract

本发明涉及一种由第一Fab单体和第二Fab单体组成的新型二聚体，每个Fab单体包含VH和VL区，其中两个这样的VH或VL区通过其各自N‑末端的另外的非天然存在的半胱氨酸残基之间的二硫键共价连接。

Description

新型Fab二聚体

技术领域

本发明涉及一种由第一Fab单体和第二Fab单体组成的新型二聚体，每个Fab单体包含VH和VL区，其中两个这样的VH或VL区通过其各自N-末端的另外的非天然存在的半胱氨酸残基之间的二硫键共价连接。

背景技术

碳酸酐酶是催化碳酸向碳酸氢盐和质子的可逆水合，并因此参与维持体内pH稳态的酶家族(Badger等，Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Bio(1994),45:369-392)。在没有催化剂的情况下，该反应发生得相当缓慢。由于大多数碳酸酐酶在其活性位点含有锌离子，因此将它们分类为金属酶。碳酸酐酶家族有几个成员。至少有五个不同的碳酸酐酶亚家族(α、β、γ、δ和ε)。这些亚家族没有显著的氨基酸序列相似性，并且在大多数情况下将它们看作是趋同进化的实例。α-碳酸酐酶(CA)发现于哺乳动物中。可根据其动力学、组织表达和亚细胞定位来区分该亚家族的成员(Kivela等，World J Gastroenterol(2005),11(2):155-163)。

将α-CA酶分为四个大亚类，即分为胞质CA(CA-I、CA-II、CA-III、CA-VII和CA-XIII)、线粒体CA(CA-VA和CA-VB)、分泌型CA(CAVI)和膜相关CA(CA-IV、CA-IX、CA-XII、CA-XIV和CA-XV)(Breton等，(2001),JOP 2(4Suppl):159-64)。此外，存在三种“催化”CA同种型(CA-VIII、CA-X和CA-XI)，它们的功能尚不清楚。在所有这些CA中，另外还存在几种同种型。

CA-II、CA-IX和CA-XII与肿瘤形成过程有关，并且它们是各种肿瘤的潜在组织学和预后生物标志物(Nordfors等，(2010),BMC cancer；10:148)。CA-II是α-CA基因家族中表达最广泛的成员，实际上存在于每个人的组织和器官中。CA-II是已知的催化效率最高的酶之一。CA-II在一定程度上存在于恶性细胞中，并且有趣的是，最近已经显示它在肿瘤新血管的内皮细胞中异位表达。跨膜酶CA-IX首先被认为是一种新型的肿瘤相关抗原，其在几种类型的人类癌症以及正常的胃肠组织中表达。CA-IX在功能上与细胞粘附、分化、增殖和致癌过程相关，其酶活性与CA II相当。另一种跨膜CA同工酶CA-XII首先发现于正常肾组织和肾细胞癌中。进一步的研究表明，它在几种其它肿瘤中(Ulmasov等，PNAS(2000),97(26):1412-1417)以及在一些诸如结肠和子宫的正常器官中表达。人CA-XII的X射线晶体学结构表明，它是一种双位点二聚体蛋白质，其短的胞内C-末端位于活性位点结构域的相对侧，使得后者面朝胞外空间。

CA-II、CA-IX和CA-XII在肿瘤中，特别是在缺氧条件下的高表达进一步表明这些酶可以功能性地参与侵袭过程，这通过细胞外空间的酸化来促进。有利于这一假说，已经表明CA抑制剂可以降低癌细胞的侵袭能力和增殖(Manokaran等，(2008),J BiomedNanotechnol.,4(4):491-498)。特别地，CA IX和XII似乎受相似机制的调节，因为这些同工酶的转录是在取样条件下通过缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)-介导的通路在肿瘤中诱导的(Chiche等，(2009))。此外，已经表明在乳腺肿瘤中CA-XII的表达与雌激素受体α(ERα)高度相关(Barnett等，(2008),Cancer Res 68:3505-3515)。为了更详细地解释CA在癌症进展中的重要性，使快速增殖的肿瘤细胞迅速过度生长，使得来自最近的血管(100-150μm)的氧扩散受到损害。因此，肿瘤细胞接受低水平的氧，引起局部缺氧中心和组织坏死。缺氧在细胞中产生选择压力以适应应激条件，导致包括参与pH稳态的酶在内的大约50种另外的蛋白质的表达(Potter等，(2004),Gell Cycle,3:164-167)。如上所解释的，后者至少部分是通过选择的碳酸酐酶(CA)同工酶，特别是CA-II、CA-IX和CA-XII之间的复杂配合来实现的。Proescholdt等(2005),Neuro Onco 7:465-4 75已经证明了CA XII和癌症之间的直接联系。在此证明了，与正常脑组织相比，在内源性(intrinsic)和转移性脑肿瘤中CA XII表达上调。此外，llie等(2011),In J Cancer,128(7):1614-23和Hynninen等(2006),Histopathology,49:594-602证明了CA XII分别在可切除的非小细胞肺癌和卵巢癌组织中过表达。Hsieh等(2010),Eur J Gell Biol,89:598-606揭示了在体内和体外CA XII与肿瘤细胞系的侵袭和转移有关。

此外，CA-抑制剂，特别是CA-II和CA-XII抑制剂被用于降低眼内压并因此治疗高眼压(AI-Barrag等，(2009),Clinical Ophthalomology 3:357-362)。此外，CA抑制剂显示可用于治疗青光眼(Haapasalo等(2008),Neuro Oncology3:357-362,and Vullo etal.2005)。

因此，已知CA，特别是CA-XII在缺氧、癌症和眼病中起作用，因此是它们是治疗性治疗或诊断的重要靶标(Thiry等2008,Vulo等2005,和Haapasalo等(2008),NeuroOncology 3:357-362)。尽管系统性碳酸酐酶抑制剂是本领域已知的，但它们与不良的副作用有关，比如酸碱紊乱、超敏反应和致命性再生障碍性贫血(Gross等(1988),Am JOpthamol.,Naeser等(1986),Acta Opthalmol.,64:330-337,Mastropasqua等(1998),212:318-321；和Passp等Br J Opthalmol.1985；69:572-575)。因此，需要其它手段和方法，这些手段和方法可用在用于上述疾病的其它治疗和诊断手段的开发中。

发明内容

需要克服这些和其它缺点。因此，本发明解决了这些需要和技术目标，并提供了如本文所述和如权利要求书中所限定的方案。

本发明涉及一种由第一Fab单体和第二Fab单体组成的二聚体，每个Fab单体包含VH和VL区，其中

(i)所述第一Fab单体的VL区和所述第二Fab单体的VL区通过所述第一Fab单体的VL区的N-末端处的和所述第二Fab单体的VL区的N-末端处的另外的非天然存在的半胱氨酸残基之间的二硫键共价连接；

(ii)所述第一Fab单体的VH区和所述第二Fab单体的VH区通过所述第一Fab单体的VH区的N-末端处的和所述第二Fab单体的VH区的N-末端处的另外的非天然存在的半胱氨酸残基之间的二硫键共价连接；

(iii)所述第一Fab单体的VL区和所述第二Fab单体的VH区通过所述第一Fab单体的VL区的N-末端处的和所述第二Fab单体的VH区的N-末端处的另外的非天然存在的半胱氨酸残基之间的二硫键共价连接；或

(iv)所述第一Fab单体的VH区和所述第二Fab单体的VL区通过所述第一Fab单体的VH区的N-末端处的和所述第二Fab单体的VL区的N-末端处的另外的非天然存在的半胱氨酸残基之间的二硫键共价连接。

如本发明上下文中已经发现的，Fab单体通过Fab单体的VL和/或VH区的N-末端处的另外的非天然存在的半胱氨酸残基之间的半胱氨酸-键(二硫键)二聚化。因此，根据本发明，在Fab单体的VL区和/或VH区的N-末端处存在的另外的非天然存在的半胱氨酸残基允许在Fab单体之间建立半胱氨酸-键(二硫键)，以构建如本文所述和提供的Fab二聚体。如在本发明的上下文中意外地发现的，并且如本文所示，与在VL和/或VH区的N-末端处不包含此类半胱氨酸-键(二硫键)或不包含另外的非天然存在的半胱氨酸残基的相应(针对相同靶结构(例如抗原)的)Fab单体相比，这些包含半胱氨酸-键(二硫键)的Fab二聚体在酸性环境中对靶结构(例如抗原)表现出增加的结合亲和力和/或亲合力。根据本发明，在其中由Fab二聚体结合的靶结构(本文也称为靶标；例如抗原)由于肿瘤中的酸性微环境而存在于癌症治疗或诊断中或与癌症治疗或诊断相关的情况下，该种在酸性环境中的对靶结构(例如抗原)的增加的结合亲和力和/或亲合力可能是特别重要的(参见，如Estrella等，MicroenvironImmunol(2013),73(5):1524-1535；Boedtkjer等，Annual Rev Physiol(2020),82:103-126；Pillai等，Cancer Metastasis Rev(2019),38:205-222；Ji等，Cancer MetastasisRev(2019):38:103-112；Gatenby等，Nature Rev Cancer(2004):891-899)。

如上所述，因为预期通过两个VH区、两个VL区、VH区和VL区或VL区和VH区的N-末端的二聚化由于如含有CDR的可变区的空间位阻而不允许结合靶标，因此，这种二聚体能够结合靶标，例如靶蛋白是令人惊奇的。

实际上，预期非常接近，优选直接在提供抗原结合的可变区的N-末端的二聚化对结合抗原具有不利影响，因为结合抗原的位点(抗体结合部位(paratope))可能在空间上被阻碍与靶蛋白的表位结合。然而，如实施例所证明的，本发明的其中两个VH区如本文所述二聚化的二聚体结合靶。因此，不仅在两个VH区的N-末端处的二聚化而且如本文所述在两个VL区或VH区和VL区或VL区和VH区的N-末端处的二聚化均允许与靶标结合是非常合理的。

事实上，在其它抗体形式中，VH区可以通过经典的N-至C-末端融合的方式与VL区融合，例如VL区的N-末端可以与VH区的C-末端融合，反之亦然。然而，未进行N-末端/N-末端融合。

类似地，引入二硫键是如稳定或迫使抗体或其片段二聚化的合适手段，但据发明人所知，二硫键的位置不会如此接近，优选不会位于可变区的N-末端。相反，在远离可变区的地方引入半胱氨酸残基。

通常，在本发明的上下文中，如本文所述的Fab单体的VL和/或VH区的N-末端处的另外的非天然存在的半胱氨酸残基可以位于相应的VL或VH区内的N-末端多于C-末端的任何位置，在本发明的一个实施方案中，其可以位于相应的VL或VH区的前10个N-末端氨基酸内(相应的VL或VH区的第一个氨基酸被计数为N-末端处的位置1)，更优选地位于前3个N-末端氨基酸内，最优选地位于前2个N-末端氨基酸内。即，在本发明的该实施方案中，在VL区或VH区N-末端的非天然存在的半胱氨酸残基在氨基酸位置1或氨基酸位置2处，其中氨基酸分别从VL区或VH区的N-末端开始计数，位置1是N-末端处的第一个氨基酸。

如本文所用，并且如本领域技术人员容易理解的，“Fab”(或“Fab分子”)是例如如本文所述的抗体的片段，并且是本领域公知的。Fab可以包含含有可变轻(VL)链或区和可变重(VH)链或区的结合剂，所述可变轻(VL)链或区和可变重(VH)链或区一起形成允许Fab与靶结构(如抗原或表位)结合的结合区或基序。“Fab”的VH链或区和VL链或区可以进一步包含恒定区或恒定区的部分。如本文所用，在对本领域技术人员合理适用的情况下，术语“Fab”也可以包含F(ab')₂、Fab’、Fv、scFv、Fd、dAb以及保留了结合抗原功能的其它抗体片段。通常，这样的片段将包含抗原结合结构域，并与本文所述Fab具有相同的性质。

在本发明的上下文中，如本文所用，在如本文所述的Fab单体的VL和/或VH区的N-末端处的“另外的非天然存在的半胱氨酸残基”的上下文中，“另外的”意指(i)除了相应的VL和/或VH区的相应的参照(即天然)序列所包含的其它氨基酸之外，半胱氨酸残基还存在于Fab单体的VL和/或VH区的相应的N-末端(由此使参照VL或VH区的总氨基酸序列长度延长了1个氨基酸)，或(ii)其取代了相应的VL和/或VH区的相应的参照(即天然)序列所包含的氨基酸之一(因此不改变参照VL或VH区的总氨基酸序列，但与所述参照序列相比添加1个半胱氨酸残基)。在本发明的优选实施方案中，“另外的”指根据上述语句(i)，将半胱氨酸残基添加到相应VL和/或VH区的相应参照(即天然)序列所包含的其它氨基酸中。

同样，在本发明的上下文中，如本文所用，在如本文所述Fab单体的VL和/或VH区的N-末端处的“另外的非天然存在的半胱氨酸残基”的上下文中，“非天然存在的”意指在相应的参照VL或VH区的氨基酸序列中，无论是在相应位置还是全部位置，还是不在该相应位置或者不在全部位置均不存在该另外的半胱氨酸残基。

根据本发明，其VL和/或VH区通过其各自VL和/或VH区的N-末端处的另外的非天然存在的半胱氨酸残基之间的二硫键共价连接的所述第一Fab单体和所述第二Fab单体可以相同或不同。在两种情况下，其VL和/或VH区通过其各自VL和/或VH区的N-末端处的另外的非天然存在的半胱氨酸残基之间的二硫键共价连接的所述第一Fab单体和所述第二Fab单体可针对相同靶标或针对不同靶标(如抗原)。在一个实施方案中，根据本发明，其VL和/或VH区通过其各自VL和/或VH区的N-末端处的另外的非天然存在的半胱氨酸残基之间的二硫键共价连接的所述第一Fab单体和所述第二Fab单体可以是相同的，并且两个Fab单体针对相同的靶标。在本发明的另一个实施方案中，其VL和/或VH区通过其各自VL和/或VH区的N-末端处的另外的非天然存在的半胱氨酸残基之间的二硫键共价连接的所述第一Fab单体和所述第二Fab单体可以是不同的，并且它们针对相同的靶标。在本发明的又一个实施方案中，其VL和/或VH区通过其各自VL和/或VH区的N-末端处的另外的非天然存在的半胱氨酸残基之间的二硫键共价连接的所述第一Fab单体和所述第二Fab单体可以是不同的，并且它们针对不同的靶标。在本发明的后一实施方案中，所述第一Fab单体针对第一靶标，并且所述第二Fab单体针对第二靶标，所述第一和第二靶标是不同的。在这种情况下，由于针对两种不同的靶标，因此如本文所述和提供的二聚体将是双特异性Fab-二聚体。

根据本发明，本发明的Fab二聚体所针对的靶标可以是需要标签化、标记、中和或以其它方式结合的任何靶标。在本发明的一些实施方案中，此类的靶标可以是存在于患有缺氧或眼病的受试者中，或存在于癌细胞或肿瘤细胞中或癌细胞或肿瘤细胞上，或以其他方式存在于患有癌症，特别是实体瘤的受试者中的抗原。此类靶标可以是抗原或抗体或其片段(例如Fab或F(ab’)₂片段)能够结合的具有肽、糖苷和/或其它部分的任何其它结构。在本发明的具体实施方案中，本发明的二聚体所针对的靶标是α-碳酸酐酶XII(CA-XII)。

因此，在本发明的具体实施方案中，本文所述和提供的二聚体结合(优选地特异性结合)CA-XII。在本上下文中，根据本发明，如本文所述和提供的二聚体可以以如本文所述的第一和第二Fab单体中的一者或两者，优选两者结合(优选特异性结合)CA-XII。

根据本发明，术语“特异性识别”(本文中同样以“特异性结合”、“针对”或“与…反应”使用)意指识别分子能够特异性地与本文定义的表位的至少两个、优选至少三个、更优选至少四个氨基酸相互作用和/或结合。这种结合可以用“锁和钥匙原理”的特异性来举例说明。因此，在本上下文中，术语“特异性地”意指识别分子结合给定的靶标表位，但基本上不结合另一种蛋白质。术语“另一种蛋白质”包括任何蛋白质，包括与识别分子针对的表位密切相关或同源的蛋白质。然而，术语“另一种蛋白”不包括识别分子与来自与产生识别分子所针对的物种不同的物种的表位交叉反应。

本文所用的术语“基本上不结合”是指本发明的表位识别分子不结合另一种蛋白质，即本发明的表位识别分子与另一种蛋白质显示小于30％，优选20％，更优选10％，特别优选小于9、8、7、6或5％的交叉反应性。

认为特异性结合受结合结构域的氨基酸序列中的特异性基序的影响，并且抗原由于它们的一级、二级或三级结构以及所述结构的二级修饰而彼此结合。抗原相互作用位点与其特异性抗原的特异性相互作用也可导致所述位点与抗原的简单结合。此外，抗原相互作用位点与其特异性抗原的特异性相互作用可选择性地导致信号的启动，例如由于抗原构象改变、抗原寡聚化等的诱导。符合本发明的结合结构域的优选实例是抗体。通常，当结合亲和力高于10^-6M时，结合被认为是“特异性的”。优选地，当结合亲和力为约10^-11至10^-8M(K_D)，优选为约10^-11至10^-9M时，认为结合是“特异性”的。如果需要，可以通过改变结合条件来减少非特异性结合，而基本上不影响特异性结合。尤其是通过将所述识别分子与表位的反应与所述识别分子与其它蛋白质的反应进行比较，可以容易地测定识别分子是否如上文定义的特异性反应。

在本发明的一个实施方案中，CA-XII是人CA-XII。根据本发明，还可以是所描述和提供的二聚体结合WO2011/138279中所描述的细胞外结构域CA-XII的至少一个表位，或优选地结合CA-XII的不连续的催化结构域的区域中。本发明的术语“胞外结构域”是本领域熟知的术语，并且与本发明一起还涉及CA-XII延伸到胞外环境中的部分。本发明的术语“催化结构域”也是本领域熟知的术语，并且与本发明一起还涉及CA-XII的部分，在该部分发生碳酸向碳酸氢盐和质子的催化。

术语“抗原”和“免疫原”在本文中可互换使用，指在动物中，优选地在用其免疫的非人动物中诱导免疫应答(优选抗体应答)的分子或物质(即在动物中抗原是“免疫原性的”)，并且通常该种“抗原”和“免疫原”可以由抗体或其部分(例如，如本文所述和提供的Fab单体或二聚体，或如本文所述和本领域已知的F(ab')₂片段或其它Fab分子)结合。

术语“表位”还指识别分子结合的抗原上的位点。优选地，表位是分子上的位点，针对该位点将产生识别分子，优选产生抗体，和/或抗体将与之结合。例如，表位可被识别分子识别，特别优选地被定义该表位的抗体识别。“线性表位”是其中氨基酸一级序列包含该识别的表位的表位。线性表位通常在独特(unique)序列中包括至少3个，更通常至少5个，例如约8至约10个氨基酸。

与线性表位不同，“构象表位”是这样一种表位，其中包含该表位的氨基酸一级序列不是所识别表位的唯一限定组分(例如，其中氨基酸一级序列不一定被定义该表位的抗体识别的表位)。通常，相对于线性表位，构象表位包含增加的氨基酸数目。关于构象表位的识别，识别分子识别抗原的3维结构，优选识别肽或蛋白质或其片段。例如，当蛋白质分子折叠形成3维结构时，形成构象表位的一些氨基酸和/或多肽骨架变得并列(juxtaposed)，使得抗体能够识别表位。测定表位构象的方法包括但不限于，例如，X-射线晶体学、2维核磁共振光谱法和位置定向自旋标记和电子顺磁共振光谱法。

当在本文中使用时，“抗体”是包含一种或多种基本上或部分地由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因的片段编码的多肽(其包含一个或多个结合结构域，优选抗原结合结构域)的蛋白质。术语“免疫球蛋白”(Ig)在本文中与“抗体”互换使用。公认的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及无数的免疫球蛋白可变区基因。

特别地，如本文所用的“抗体”是典型地由两个轻(L)链(每个约25kDa)和两个重(H)链(每个约50kDa)组成的四聚体糖基化蛋白。在抗体中可以发现两种类型的轻链，称作λ和κ。根据重链恒定结构域的氨基酸序列，可以将免疫球蛋白划分为五个主要类别：A、D、E、G和M，这些中若干类别可进一步划分成亚类(同种型)，例如(对于人而言的)IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。IgM抗体由5个基本异四聚体单元连同一个另外的称为J链的多肽组成，并含有10个抗原结合位点，而IgA抗体包含与J链组合的2-5个可聚合形成多价聚集体(assemblage)的基本4-链单元。在IgG的情况下，4-链单元通常为约150,000道尔顿。

每个轻链包括N端可变(V)结构域(VL)和恒定(C)结构域(CL)。每个重链包括N端V结构域(VH)、三或四个C结构域(CH)和铰链区。所述恒定结构域并不直接参与抗体与抗原的结合

VH与VL的配对一起形成单一抗原结合位点。将最靠近VH的CH结构域指定为CH1。各L链通过一个共价二硫键连接至H链，而取决于H链同种型，两个H链通过一或多个二硫键彼此连接。VH和VL结构域由称为框架区的四个相对保存的序列区域(FR1、FR2、FR3和FR4)组成，该框架区形成三个高变序列区域(互补决定区，CDR)的骨架。CDR含有负责抗体与抗原的特定相互作用的残基中的大部分。CDR称为CDR1、CDR2和CDR3。因此，将重链上的CDR成分称为H1、H2和H3，而将轻链上的CDR成分称为L1、L2和L3。术语“可变”是指免疫球蛋白结构域中显示序列可变性且与确定特定抗体的特异性和结合亲和力有关的部分(即“可变结构域”)。可变性在抗体的整个可变结构域中并非均匀分布；其集中于各重链和轻链可变区的子结构域中。这些子结构域称为“高变”区或“互补决定区“”(CDR)。可变结构域的保存性更高(即非高变)的部分称为“框架”区(FRM)。天然存在的重链和轻链的可变结构域各自包含四个FRM区，其主要采取由三个高变区连接的β片构型，该三个高变区形成连接β片结构的环且在一些情况下形成β片结构的一部分。各链中的高变区通过FRM紧密结合在一起且与来自其它链的高变区一起促进抗原结合位点的形成(参见Kabat等)。恒定结构域不与抗原结合直接相关，但表现各种效应子功能，诸如抗体依赖性、细胞介导的细胞毒性和补体活化。

术语“CDR”和其复数“CDRs”是指互补决定区(CDR)，三个互补决定区组成轻链可变区的结合特性(CDRL1、CDRL2和CDRL3；在本文中也称为VL-CDR、VL-CDR2和VL-CDR3)且三个互补决定区组成重链可变区的结合特性(CDRH1、CDRH2和CDRH3；在本文中也称为VH-CDR、VH-CDR2和VH-CDR3)。CDR促进抗体分子的功能活性且由包含骨架区或框架区的氨基酸序列分开。精确定义的CDR边界和长度视不同分类和编号系统而定。因此可通过Kabat、Chothia、接触型或任何其他边界定义(包括本文中所描述的编号系统)对CDR进行指代。尽管边界不同，但这些系统中的每一者在组成可变序列内的所谓的“高变区”的部分中均具有一定程度的重叠。因此，相对于相邻框架区，根据这些系统的CDR定义可在长度和边界区域方面不同。参见例如Kabat、Chothia和/或MacCallum(Kabat等，在上述引文中；Chothia等,J.Mol.Biol,1987,196:901；和MacCallum等,J.MoI.Biol,1996,262:732)。然而，优选根据所谓的Kabat系统的编号。

在本发明的具体实施方案中，所述第一和第二Fab单体可以包含特定的VL和VH区，每个VL和VH区包含一个或多个特定的CDR区。例如，在本发明的一个具体实施方案中，所述第一Fab单体包含(A)SEQ ID NO:1所示的VH-CDR1、SEQ ID NO:2所示的VH-CDR2、SEQ IDNO:3所示的VH-CDR3、SEQ ID NO:4所示的VL-CDR1、SEQ ID NO:5所示的VL-CDR2和/或(优选和)SEQ ID NO:6所示的VL-CDR3，或(B)(A)中所述的任何一个或所有序列，其中与相应的氨基酸序列SEQ ID NO：1至6相比，至少1个、至多5个、优选至多4个、更优选至多3个、更优选至多2个、更优选恰好1个氨基酸被取代、缺失或添加(优选取代)。在本发明的一个具体实施方案中，所述第一Fab单体包含SEQ ID NO：1所示的VH-CDR1、SEQ ID NO：2所示的VH-CDR2、SEQID NO：3所示的VH-CDR3、SEQ ID NO：4所示的VL-CDR1、SEQ ID NO：5所示的VL-CDR2和SEQID NO：6所示的VL-CDR3。在本发明的另一具体实施方案中，所述第一Fab单体包含SEQ IDNO：1所示的VH-CDR1、SEQ ID NO：2所示的VH-CDR2、SEQ ID NO：3所示的VH-CDR3、SEQ IDNO：4所示的VL-CDR1、SEQ ID NO：5所示的VL-CDR2和/或(优选和)SEQ ID NO：6所示的VL-CDR3，其中在分别根据SEQ ID NO：1至6中任一个或全部序列中，至少1个、至多5个、优选至多4个、更优选至多3个、更优选至多2个、更优选恰好1个氨基酸被取代，并且其中所述取代中的至少一个，(优选)全部是保守取代或高度保守取代。

如本文所用，“保守性”取代是指如本文的表I中作为“示例性取代”列出的取代。本文所用的“高度保守的”取代是指本文表I中“优选取代”标题下所示的取代。

表I氨基酸取代

原始	示例性取代	优选取代
			Ala(A)	val；leu；ile	Val
Arg(R)	lys；g1n；asn	lys
			Asn(N)	g1n；his；asp，lys；arg	gln
Asp(D)	glu；asn	glu
			Cys(C)	ser；ala	ser
Gln(Q)	asn；glu	asn
			Glu(E)	asp；gln	asp
Gly(G)	ala	ala
			His(H)	asn；g1n；1ys；arg	arg
Ile(I)	leu；val；met；ala；phe；	leu
			Leu(L)	norleucine；ile；val；met；ala；	ile
Lys(K)	arg；gin；asn	arg
			Met(M)	leu；phe；ile	leu
Phe(F)	leu；val；ile；ala；tyr	tyr
			Pro(P)	ala	ala
Ser(S)	thr	thr
			Thr(T)	ser	ser
Trp(W)	tyr；phe	tyr
			Tyr(Y)	trp；phe；thr；ser	Phe
Val(V)	ile；1eu；met；phe；ala；	leu

除非本文另有说明，否则当根据本发明使用时术语“位置”意指氨基酸在本文所描绘的氨基酸序列内的位置。除非本文另有说明，否则在本上下文中的术语“相应的”还包括不仅仅由在前的核苷酸/氨基酸的数目确定的位置。

术语“氨基酸”或“氨基酸残基”典型地是指具有本领域所公认的定义的氨基酸，比如选自下述的氨基酸：丙氨酸(Ala或A)；精氨酸(Arg或R)；天冬酰胺(Asn或N)；天冬氨酸(Asp或D)；半胱氨酸(Cys或C)；谷氨酰胺(Gln或Q)；谷氨酸(Glu或E)；甘氨酸(Gly或G)；组氨酸(His或H)；异亮氨酸(He或I)：亮氨酸(Leu或L)；赖氨酸(Lys或K)；甲硫氨酸(Met或M)；苯丙氨酸(Phe或F)；脯氨酸(Pro或P)；丝氨酸(Ser或S)；苏氨酸(Thr或T)；色氨酸(Trp或W)；酪氨酸(Tyr或Y)；和缬氨酸(VaI或V)，但也可根据需要使用经修饰的、合成的或稀有的氨基酸。通常，氨基酸可分组为具有非极性侧链(例如Ala、Cys、He、Leu、Met、Phe、Pro、Val)；带负电荷侧链(例如Asp、Glu)；带正电荷侧链(例如Arg、His、Lys)；或不带电荷极性侧链(例如Asn、Cys、Gln、Gly、His、Met、Phe、Ser、Thr、Trp和Tyr)。

根据本发明，第一和第二Fab单体各自的VL和/或VH区还可以在其N-末端包含分泌序列。如本领域通常已知的，这种分泌序列可与允许合成的Fab单体分泌到Fab生产细胞外相关。例如，在本发明的上下文中，第一和/或第二Fab单体的VL和/或VH区的N-末端的这种分泌序列可以包含如SEQ ID NO:15或16中所示的氨基酸序列或由其组成，或者，包含如SEQID NO:15或16中所示的氨基酸序列或由其组成，其中与相应的氨基酸序列SEQ ID NO:15或16相比，至少1个、且至多5个、优选至多4个、更优选至多3个、更优选至多2个、更优选恰好1个氨基酸被取代、缺失或添加(优选取代)。在本发明的一个具体实施方案中，第一和/或第二Fab单体的VL和/或VH区的N-末端处的这种分泌序列可以包含如SEQ ID NO:15或16中所示的氨基酸序列或由其组成。在本发明的另一具体实施方案中，第一和/或第二Fab单体的VL和/或VH区的N-末端的这种分泌序列可以包含如SEQ ID NO:15或16中所示的氨基酸序列或由其组成，其中，与SEQ ID NO:15或16所示的氨基酸序列相比，至少1个、且至多5个、优选至多4个、更优选至多3个、更优选至多2个、更优选恰好1个氨基酸被取代，并且其中所述取代中的至少一个或(优选)全部是如本文定义的保守取代或高度保守取代。

在本上下文中，在本发明的一个具体实施方案中，所述第一Fab单体的VL区和所述第二Fab单体的VL区在其N-末端包含如SEQ ID NO:16所示的分泌序列。在本发明的另一具体实施方案中，所述第一Fab单体的VH区和所述第二Fab单体的VH区在其N-末端包含如SEQID NO:16所示的分泌序列。在本发明的又一具体实施方案中，所述第一Fab单体的VL区和所述第二Fab单体的VH区在其N-末端包含如SEQ ID NO:16所示的分泌序列。在本发明的再一具体实施方案中，所述第一Fab单体的VH区和所述第二Fab单体的VL区在其N-末端包含如SEQ ID NO:16所示的分泌序列。

在本上下文中，在本发明的另一具体实施方案中，所述第一Fab单体的VH区和所述第二Fab单体的VH区在其N-末端包含SEQ ID NO:15所示的分泌序列。在本发明的又一具体实施方案中，所述第一Fab单体的VL区和所述第二Fab单体的VL区在其N-末端包含SEQ IDNO:15所示的分泌序列。在本发明的再一具体实施方案中，所述第一Fab单体的VH区和所述第二Fab单体的VL区在其N-末端包含SEQ ID NO:15所示的分泌序列。在本发明的另又一具体实施方案中，所述第一Fab单体的VL区和所述第二Fab单体的VH区在其N-末端包含SEQ IDNO:15所示的分泌序列。

在本发明的一个更具体的实施方案中，所述第一Fab单体的VL区和所述第二Fab单体的VL区在其N-末端包含SEQ ID NO:16所示的分泌序列，并且所述第一Fab单体的VH区和所述第二Fab单体的VH区在其N-末端包含SEQ ID NO:15所示的分泌序列。在本发明的另一更具体的实施方案中，所述第一Fab单体的VH区和所述第二Fab单体的VH区在其N-末端包含SEQ ID NO:16所示的分泌序列，并且所述第一Fab单体的VL区和所述第二Fab单体的VL区在其N-末端包含SEQ ID NO:15所示的分泌序列。在本发明的再一更具体的实施方案中，所述第一Fab单体的VL区和所述第二Fab单体的VH区在其N-末端包含SEQ ID NO:16所示的分泌序列，并且所述第一Fab单体的VH区和所述第二Fab单体的VL区在其N-末端包含SEQ ID NO:15所示的分泌序列。在本发明的另又一更具体的实施方案中，所述第一Fab单体的VH区和所述第二Fab单体的VL区在其N-末端包含SEQ ID NO:16所示的分泌序列，并且所述第一Fab单体的VL区和所述第二Fab单体的VH区在其N-末端包含SEQ ID NO:15所示的分泌序列。

在本发明的非常具体的实施方案中，所述第一和/或第二Fab单体包含SEQ ID NO:7所示的VH区和/或(优选和)SEQ ID NO:8所示的VL区。在本发明的另一具体的实施方案中，所述第一和/或第二Fab单体包含SEQ ID NO:7所示的VH区和/或(优选和)SEQ ID NO:8所示的VL区，其中与相应的氨基酸序列SEQ ID NO:7或8相比，至少1个、且至多5个、优选至多4个、更优选至多3个、更优选至多2个、更优选恰好1个氨基酸被取代、缺失或添加(优选取代)。在后一种情况下，在本发明的一个实施方案中，所述第一和/或第二Fab单体包含SEQID NO:7所示的VH区和/或(优选和)SEQ ID NO:8所示的VL区，其中与相应的氨基酸序列SEQID NO:7或8相比，至少1个、且至多5个、优选至多4个、更优选至多3个、更优选至多2个、更优选地恰好1个氨基酸被取代，并且其中所述取代中的至少一个或(优选)全部是如本文定义的保守取代或高度保守取代。

在本发明的另一个非常具体的实施方案中，所述第一和/或第二Fab单体包含由SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列编码的VH区和/或(优选和)由SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列编码的VL区，或者，所述第一和/或第二Fab单体包含由SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列编码的VH区和/或(优选和)由SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列编码的VL区，其中分别与SEQID NO:9或10各自的核酸序列相比，有1-30个、优选1-21个、更优选1-12个、更优选1-6个核苷酸被取代、添加或缺失(优选取代)。在后一种情况下，分别与SEQ ID NO:9或10的各自核酸序列相比，有1-30个，优选1-21个，更优选1-12个，更优选1-6个核苷酸被取代，此类取代优选是保守的、高度保守的，或者-更优选为沉默取代。

如本文所用，“沉默”取代或突变意指核酸序列内的碱基取代，其不改变由该核酸序列编码的相应氨基酸序列。“保守”取代意指表I中作为“示例性取代”列出的取代。本文所用的“高度保守”取代意指表I中“优选取代”标题下所示的取代。

除非另有明确定义，否则如本文所用的术语“核酸”或“核酸分子”与“寡核苷酸”、“核酸链”等同义使用，并且是指包含一个、两个或更多个核苷酸的聚合物，例如单链或双链的。

同样，如本文所使用的，术语“多核苷酸”、“核酸分子”应该被同义地解释。通常，核酸分子尤其可以包括DNA分子、RNA分子、寡核苷酸硫代磷酸酯、取代的核糖-寡核苷酸或PNA分子。此外，术语“核酸分子”可以指DNA或RNA或其杂交体或其本领域已知的任何修饰物(修饰物的实例参见例如US 5525711、US 471 1955、US 5792608或EP 302175)。多核苷酸序列可以是单链或双链的、线性的或环状的、天然的或合成的，并且没有任何大小限制。例如，多核苷酸序列可以是基因组DNA、cDNA、线粒体DNA、mRNA、反义RNA、核酶RNA或编码此类RNA的DNA或chimeroplasts(Gamper,Nucleic Acids Research,2000,28,4332-4339)。所述多核苷酸序列可以是载体、质粒或病毒DNA或RNA的形式。本文还描述了与上述核酸分子互补的核酸分子和能够与本文所述的核酸分子杂交的核酸分子。本文所述的核酸分子也可以是本发明上下文中的核酸分子的片段。特别地，这样的片段是功能性片段。这样的功能性片段的实例是可以用作引物的核酸分子。

在本发明的进一步具体实施方案中，所述第一和/或第二Fab单体包含SEQ ID NO:11所示的VH区和/或(优选和)SEQ ID NO:12所示的VL区。在本发明的另一具体实施方案中，所述第一和/或第二Fab单体包含SEQ ID NO:11所示的VH区和/或(优选和)SEQ ID NO:12所示的VL区，其中与相应氨基酸序列SEQ ID NO:11或12相比，至少1个、至多5个、优选至多4个、更优选至多3个、更优选至多2个、更优选恰好1个氨基酸被取代、缺失或添加(优选取代)。在后一种情况下，在本发明的一个实施方案中，所述第一和/或第二Fab单体包含SEQID NO:11所示的VH区和/或(优选和)SEQ ID NO:12所示的VL区，其中与相应氨基酸序列SEQID NO:11或12相比，至少1个、至多5个、优选至多4个、更优选至多3个、更优选至多2个、更优选恰好1个氨基酸被取代，并且其中所述取代中的至少一个或(优选)全部是如本文定义的保守取代或高度保守取代。

在本发明的进一步具体实施方案中，所述第一和/或第二Fab单体包含由SEQ IDNO:13所示的核苷酸序列编码的VH区和由SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列编码的VL区。在本发明的另一具体实施方案中，所述第一和/或第二Fab单体包含由SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列编码的VH区和由SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列编码的VL区，其中所述第一和/或第二Fab单体包含由SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列编码的VH区和/或(优选和)由SEQID NO:14所示的核苷酸序列编码的VL区，其中分别与SEQ ID NO:13或14的各自核酸序列相比，有1-30个、优选1-21个、更优选1-12个、更优选1-6个核苷酸被取代、添加或缺失(优选被取代)。在后一种情况下，分别与SEQ ID NO:13或14的各自核酸序列相比，有1-30个，优选1-21个，更优选1-12个，更优选1-6个核苷酸被取代，这样的取代优选是保守的、高度保守的，或者-进一步优选的是沉默取代。

本发明进一步涉及一种如本文所述和提供的二聚体，其可通过以下获得：

(a)培养表达如本文定义的第一和第二Fab单体的合适细胞(例如CHO或HEK293细胞)，直至达到稳定期；

(b)任选地向细胞培养物中加入氧化剂(例如O₂、1mM H₂O₂和/或1mM MnO₄ ^-)；以及

(c)收获所述二聚体。

如本文所用，“稳定期”意指(如，由于正在分裂的和死亡的细胞之间的平衡)细胞数没有进一步的实质性(例如，在2小时内不超过约2％，优选不超过约1％)净增加，优选细胞数没有进一步的净增加。

此外，根据本发明，所述第一和/或第二Fab单体可以偶联到例如用于诊断或治疗目的其它化合物上。这些化合物可以包括例如标记基团、毒素或抗肿瘤药物(例如荧光染料、酶(如过氧化物酶)、放射性核素、rizin、奥唑米星、emtansine、monimethylauristin E、α-鹅膏覃碱(amanitin))。可以在抗体或抗原表达后对附着位点化学地进行这种偶联，或者在DNA水平上将偶联产物工程化到本发明的抗体或抗原中。然后如下所述在合适的宿主系统中表达DNA，收集表达的蛋白质并复性(如果需要的话)。偶联可以通过本领域已知的连接子实现。特别地，在酸性或还原条件下或暴露于特定蛋白酶时释放毒素或抗肿瘤药物的不同连接子可以与该技术一起使用。

在一些方面，可能需要将标记基团、毒素或抗肿瘤药物通过各种长度的间隔臂连接以降低潜在的空间位阻。

本发明还涉及包含如本文所述和提供的二聚体的化合物。根据本发明，此类包含如本文所述和提供的二聚体的化合物还可以另外包含如本文所述和提供的一个或多个Fab单体(非二聚化的)。在本发明的一个实施方案中，此类化合物可以用作药物。例如，包含如本文所述和提供的二聚体的化合物可以是药物组合物。

除非另有说明，否则当在本文中提及“二聚体”时，是指如本文所述的Fab二聚体。同样，当提及“单体”时，是指如本文所述的Fab单体。

通常，在本发明的上下文中，本文所述和提供的化合物可以包含一个或多个如本文所述的二聚体，和一个或多个如本文所述的单体。例如，在本文所述和提供的组合物中，二聚体与单体之间的比率可在约100:0、约99:1、约90:10、约80:20、约70:30、约60:40、约50:50、约40:60、约30:70、约20:80、约10:90或约1:99的范围内。作为具体的实例，二聚体与单体的比率可以是约40:60。

优选地，(药物)组合物施用于诸如家畜和宠物动物的哺乳动物。最优选的是施用于人。可以以合适的剂量将本文所述的药物组合物施用于受试者。用于根据本发明所述用途的药物组合物可使用一种或多种生理性载体或赋形剂根据本领域发现的常规方法来配制，参见，例如Ansel等，"Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems",第7版,Lippincott Williams&Wilkins Publishers,1999。因此，(药物)组合物可以以任选地包含常规药学上可接受赋形剂的剂量单元制剂经口服、胃肠外施用，所述胃肠外施用比如，皮下、静脉内、肌内、腹膜内、鞘内、经皮、经粘膜、硬膜下、通过离子导入而局部或体表(topically)、舌下、经吸入喷雾、气溶胶或直肠等施用。对于口服施用，本发明的(药物)组合物可以采用例如通过常规方法与可药学上可接受的赋形剂制备的片剂或胶囊剂的形式，所述药学上可接受的赋形剂例如为粘合剂(如，预胶凝玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素)、填充剂(如，乳糖、微晶纤维素、磷酸氢钙)、润滑剂(如，硬脂酸镁、滑石、二氧化硅)、崩解剂(如，马铃薯淀粉、羟基乙酸淀粉钠)或润湿剂(如，十二烷基硫酸钠)。如本文所述，(药物)组合物可以与生理上可接受的载体一起施用给患者。术语“载体”是指与治疗剂一起施用的稀释剂、助剂、赋形剂或媒介物。这种药用载体可为无菌液体，例如水或油，包括石油、动物、植物或合成来源的油，比如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当由静脉内施用(药物)组合物时，水是优选的载体。盐溶液以及葡萄糖和甘油水溶液也可被用作液体载体，尤其是用作可注射溶液的液体载体。适合的药用赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩(chalk)、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、钠离子、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如果需要，组合物还可以含有少量的乳化剂或pH缓冲剂。这些组合物可以是溶液、混悬液、乳液、片剂、丸剂、胶囊剂、粉末、缓释制剂等的形式。组合物可与传统的粘合剂和诸如甘油三酯的载体一起配制成栓剂。口服制剂可包括标准的载体，例如药用级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。适合的药用载体的实例由E.W.Martin描述于"Remington's Pharmaceutical Sciences"中。这种组合物会含有治疗有效量的(优选纯化形式的)上述化合物以及适量的载体，从而向患者提供适合的施用方式。所述制剂应当适合施用方式。

本发明的药物组合物可以作为单独的活性剂施用，或者可以与其它药剂组合施用，所述其它药剂优选本领域已知的适合于治疗所讨论的疾病的那些。

根据本发明，如本文所述和提供的二聚体、包含如本文所述和提供的此类二聚体(和一个或多个Fab单体(非二聚化的))的化合物也可用于治疗或抑制缺氧、实体瘤或眼病的方法中。

在本发明的上下文中，例如，缺氧可以选自肿瘤缺氧、神经元缺氧、脑缺氧、狭窄和缺血。在这方面，术语“缺氧”是指其中身体作为整体(全身缺氧)或身体的区域(组织缺氧)缺乏足够的氧供应的一种病理状况。例如，细胞水平的氧供应和其需求之间的不匹配可能导致缺氧状况。完全缺乏氧供应的缺氧被称为缺氧症(anoxia)，其因此也被统称缺氧(hypoxia)所涵盖。

根据本发明的术语“实体瘤”定义了通常不包含囊肿或液体区域的异常组织块。实体瘤可以是良性的(非癌症)或恶性的(在本领域中通常称为癌症)。不同类型的实体瘤以形成它们的细胞类型命名。在本发明的上下文中，例如，实体瘤可以选自肉瘤、神经胶质瘤、癌、间皮瘤、淋巴瘤、肾肿瘤、肺肿瘤、乳腺肿瘤、宫颈肿瘤、卵巢肿瘤、结肠直肠肿瘤、肝肿瘤、前列腺肿瘤、胰腺肿瘤和头颈肿瘤。在本发明的一个实施方案中，实体瘤是神经胶质瘤或肺肿瘤。在本发明的一个具体实施方案中，实体瘤是神经胶质瘤。

如本文所用的术语“眼病”是指包括眼部附件的眼的病理状况或损伤。眼疾病可以例如涉及眼睛的天然晶状体的模糊化(clouding)或混浊化(pacification)，例如由液体或中央视网膜的渗漏和积聚、视网膜下的透明小体少量积聚、视神经损伤、黄斑细胞变性、视力丧失或眼睛的结膜和角膜的炎症、以及瘢痕组织的形成导致的黄斑水肿。在本发明的上下文中，例如，所述眼病选自高眼压、青光眼、黄斑变性、年龄相关性黄斑变性、葡萄膜炎、视网膜炎、X连锁视网膜劈裂症和高血压性视网膜病变。

本文描述了、在附图中示出了、在实施例中阐释了并在权利要求中反映了表征本发明的实施方案。

本发明的特征还在于以下项目：

1.一种由第一Fab单体和第二Fab单体组成的二聚体，每个Fab单体包含VH和VL区，其中

2.根据项目1所述的二聚体，其中所述VL区或VH区的N-末端处的非天然存在的半胱氨酸残基处于氨基酸位置1或氨基酸位置2处，其中分别从所述VL区或VH区的N-末端开始计数氨基酸，其中位置1是N-末端处的第一个氨基酸。

3.根据项目1或2所述的二聚体，其中所述第一Fab单体和所述第二Fab单体相同或不同。

4.根据前述项目中任一项所述的二聚体，其中所述第一Fab单体和所述第二Fab单体针对相同的靶标。

5.根据项目1至3中任一项所述的二聚体，其中所述第一Fab单体针对第一靶标，并且所述第二Fab单体针对第二靶标，所述第一靶标和所述第二靶标是不同的。

6.根据前述项目中任一项所述的二聚体，其中所述第一Fab单体包含SEQ ID NO:1所示的VH-CDR1、SEQ ID NO:2所示的VH-CDR2、SEQ ID NO:3所示的VH-CDR3、SEQ ID NO:4所示的VL-CDR1、SEQ ID NO:5所示的VL-CDR2和SEQ ID NO:6所示的VL-CDR3。

7.根据前述项目中任一项所述的二聚体，其中所述第一Fab单体的VL区和所述第二Fab单体的VL区在其N-末端包含SEQ ID NO:16所示的分泌序列。

8.根据前述项目中任一项所述的二聚体，其中所述第一Fab单体的VH区和所述第二Fab单体的VH区在其N-末端包含SEQ ID NO:16所示的分泌序列。

9.根据前述项目中任一项所述的二聚体，其中所述第一Fab单体的VL区和所述第二Fab单体的VH区在其N-末端包含SEQ ID NO:16所示的分泌序列。

10.根据前述项目中任一项所述的二聚体，其中所述第一Fab单体的VH区和所述第二Fab单体的VL区在其N-末端包含SEQ ID NO:16所示的分泌序列。

11.根据前述项目中任一项所述的二聚体，其中所述第一Fab单体包含SEQ ID NO:7所示的VH区和SEQ ID NO:8所示的VL区。

12.根据前述项目中任一项所述的二聚体，其中所述第一Fab单体包含SEQ ID NO:11所示的VH区和SEQ ID NO:12所示的VL区。

13.根据前述项目中任一项所述的二聚体，其可通过以下获得：

(a)培养表达如权利要求1至12中任一项所定义的第一和第二Fab单体的CHO细胞，直至达到稳定期；

(b)任选地向CHO细胞培养物中加入氧化剂；以及

(c)收获所述二聚体。

14.一种组合物，其包含项目1至13中任一项所述的二聚体。

15.根据项目14所述的组合物，其还包含如项目1至13中任一项所定义的Fab单体。

必须注意的是，如本文中所用，除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“该/所述(the)”包括复数所指物。因此，例如，提及“一种试剂”包括此类不同试剂的一种或多种，提及“该方法”包括提到本领域普通技术人员已知的能够修改或取代本文所述的方法的等效步骤和方法。

除非另有说明，否则一系列要素前的术语“至少”应理解为是指这一系列的每个要素。本领域技术人员仅采用常规实验即能认识到或确定许多与本文描述的本发明具体实施方案等效的情况。本发明旨在涵盖此类等效情况。

本文中任何地方使用的术语“和/或”包括“和”、“或”和“由所述术语连接的元素的全部或任何其它组合”的含义。

在整个本说明书和随后的权利要求中，除非上下文另有要求，否则词语“包含”以及诸如“包括”和“含有”的变型将被理解为意指包含所述的整体或步骤或者整体或步骤的组或，但不排除任何其它整体或步骤或者整体或步骤的组。当在本文中使用时，术语“含有”可用术语“包含”或“包括”代替，或者当在本文中使用时有时用术语“具有”代替。

当在本文中使用时，“由......组成”排除权利要求元素中未指定的任何元素、步骤或成分。当在本文中使用时，“基本上由......组成”不排除不实质上影响权利要求的基本和新颖特征的材料或步骤。

在本文的每种情况下，术语“含有”、“基本上由...组成”和“由......组成”中的任何一个可以用另外两个术语中的任一个来代替。

应当理解，本发明不限于本文所述的特定方法、方案和试剂等，因为它们是可以改变的。本文所用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而不旨在限制本发明的范围，本发明的范围仅由权利要求书限定。

本说明书全文中引用的所有出版物和专利(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、指导书等)，无论在上文还是下文，均以其全文通过引用并入本文。本文中没有任何内容被解释为承认本发明无权凭借在先发明而早于这种公开。在通过引用并入的材料与本说明书矛盾或不一致的程度上，本说明书将取代任何这样的材料。

附图

附图示出了：

图1：载体结构。

HitbasisHygro_ch6A10_LC和HitbasisNeo_ch6A10_HC载体

HitbasisHygro_ch6A10_LC的翻译：

(粗体＝预测的信号(分泌)序列)。

图2：SDS-PAGE。

6A10 Fab二聚体的还原SDS-PAGE分析显示了约25–30kDa的特征条带，对应于6A10Fab片段的轻链和重链。在非还原条件下，检测到约50kDa和100kDa的条带，对应于前体单体和同二聚体形式。

图3：通过LC-ESI-TOF的“完整测试”。

通过LC-ESI-TOF进行前体的单体和二聚体形式的进一步分析。通过在轻链N-末端处的另外的半胱氨酸的二硫桥形成了同二聚体。此外，以变化的比率检测到不同形式的具有和不具有另外的半胱氨酸或谷胱甘肽的单体。

图4：单体和二聚体与CA12阳性人A549肺癌细胞的结合。

流式细胞术显示在pH 7.4下单体和二聚体没有显著不同的结合行为。将50.000个A549细胞与连续稀释的单体或二聚体(6A10)一起温育。洗涤后，将细胞与Cy5标记的第二抗体(驴抗-人IgG轻链和重链)温育。用BD FACSCanto和DIVA软件分析第二抗体的结合。RU＝相对光单位。

图5：流式细胞术。

流式细胞术显示，在酸性环境(pH 5.5)(因为对实体瘤而言酸性环境是典型的)中，单体的结合行为显著降低，而二聚体(610A)则不会。

图6：示出了具有IgG分泌序列的Fab6A10的VH的氨基酸序列和具有IgL分泌序列的Fab6A10的VL的氨基酸序列。

图7：示出了N-和C-末端测序后Fab6A10 VH的氨基酸序列和N-和C-末端测序后Fab6A10 VL的氨基酸序列

本申请还提供了在本申请中提及的以下序列，还产生了用于所述序列的序列方案，并且该序列方案是本申请的一部分。然而，在下列序列与序列表中所示的序列之间冲突的情况下，下列序列将取代序列表中所示的序列：

SEQ ID NO:1-Fab6A10的VH-CDR1:

GFSLTTYSVS

SEQ ID NO:2–Fab6A10的VH-CDR2:

RMWYDGDTV

SEQ ID NO:3-Fab6A10的VH-CDR3:

DFGYFDGSSPFDY

SEQ ID NO:4-Fab6A10的VL-CDR1:

RASQGISTSIH

SEQ ID NO:5-Fab6A10的VL-CDR2:

FASQSIS

SEQ ID NO:6-Fab6A10的VL-CDR3:

QQTYSLPYTF

SEQ ID NO:7-Fab6A10的VH:

(粗体和方框内为CDR，恒定部分加下划线)。

SEQ ID NO:8-Fab6A10的VL:

(粗体和方框内为CDR，恒定部分加下划线)。

SEQ ID NO:9-Fab6A10的VH的核苷酸:

CAGGTCCAGCTGAAGGAGTCCGGTCCAGGTCTGGTCCAGCCTAGTGA

GACCCTGTCACTGACTTGCACCGTGTCAGGATTCTCCCTGACCACATAC

AGTGTCTCATGGGTGAGACAGCCTTCCGGGAAGGGTCCAGAATGGATG

GGGAGGATGTGGTACGACGGCGACACAGTGTATAACAGCGCCCTGAAA

TCTAGGCTGTCCATCAGCCGGGACACTTCTAAGAACCAGGTGTTTCTG

AAAATGAATTCCCTGGAGACTGATGAAACAGGCACTTACTATTGCACC

AGGGACTTCGGGTACTTTGATGGTTCCAGCCCATTCGACTATTGGGGCC

AGGGAGTGATGGTCACCGTGTCTAGTGCTAGTACAAAGGGGCCCAGCG

TGTTTCCACTGGCACCCTCATCCAAATCTACTAGTGGAGGAACCGCCG

CTCTGGGCTGTCTGGTGAAGGATTATTTCCCCGAGCCTGTCACCGTGA

GCTGGAATTCTGGCGCACTGACAAGCGGAGTCCACACTTTTCCAGCCG

TGCTGCAGAGCTCTGGCCTGTACTCCCTGAGTTCAGTGGTCACAGTCC

CCTCCAGCTCTCTGGGAACCCAGACATACATCTGTAACGTGAACCATA

AGCCTAGCAACACTAAGGTGGACAAAAAGGTGGAGCCAAAATCCTGC

GACAAAACCCATACATAA

SEQ ID NO:10-Fab6A10的VL的核苷酸:

AGATGTCCCGTCGATATTGTGCTGACCCAGAGCCCAGCCACACTGAGT

GTGACTCCCGGAGAGTCTGTCAGTCTGTCATGCAGGGCTAGCCAGGGG

ATCTCCACCAGCATTCACTGGTACCAGCAGAAGAGTAACGAATCACCC

AGGCTGCTGATCAAATTCGCCTCTCAGAGTATCTCAGGAATTCCATCTC

GGTTCTCCGGCAGCGGATCTGGGACTGACTTTACCCTGTCCATTAATAG

AGTGGAGAGCGAAGATTTCTCTGTCTATTTTTGCCAGCAGACATACAGC

CTGCCCTATACCTTCGGTGCAGGCACAAAGCTGGAGCTGAAACGCACT

GTGGCCGCTCCTAGCGTCTTCATCTTTCCCCCTTCTGACGAACAGCTGA

AGAGTGGTACAGCTTCAGTGGTCTGTCTGCTGAACAATTTTTACCCAC

GAGAGGCAAAGGTGCAGTGGAAAGTCGATAACGCCCTGCAGTCCGGC

AATAGCCAGGAGTCTGTGACTGAACAGGACAGTAAGGATTCAACCTAT

TCCCTGTCCAGCACCCTGACACTGTCCAAAGCTGACTACGAGAAGCAT

AAAGTGTATGCATGTGAAGTCACCCACCAGGGGCTGTCATCACCCGTC

ACAAAATCATTCAATAGGGGGGAGTGCTAA

SEQ ID NO:11–具有IgG分泌序列的Fab6A10的VH:

(斜体且加粗的为分泌序列，粗体和方框内为CDR，恒定部分加下划线)。SEQ IDNO:12–具有IgL分泌序列的Fab6A10的VL:

(斜体且加粗和方框内的为分泌序列，粗体和方框内为CDR，恒定部分加下划线)。

SEQ ID NO:13-具有IgG分泌序列的Fab6A10的VH的核苷酸:

ATGTATCTGGGTCTGAACTATGTCTTTATCGTCTTTCTGCTGAACGGGGTCCAGTCACAGGTCCAGCTGAAGGAGTCCGGTCCAGGTCTGGTCCAGCCTAGTGAGACCCTGTCACTGACTTGCACCGTGTCAGGATTCTCCCTGACCACATACAGTGTCTCATGGGTGAGACAGCCTTCCGGGAAGGGTCCAGAATGGATGGGGAGGATGTGGTACGACGGCGACACAGTGTATAACAGCGCCCTGAAATCTAGGCTGTCCATCAGCCGGGACACTTCTAAGAACCAGGTGTTTCTGAAAATGAATTCCCTGGAGACTGATGAAACAGGCACTTACTATTGCACCAGGGACTTCGGGTACTTTGATGGTTCCAGCCCATTCGACTATTGGGGCCAGGGAGTGATGGTCACCGTGTCTAGTGCTAGTACAAAGGGGCCCAGCGTGTTTCCACTGGCACCCTCATCCAAATCTACTAGTGGAGGAACCGCCGCTCTGGGCTGTCTGGTGAAGGATTATTTCCCCGAGCCTGTCACCGTGAGCTGGAATTCTGGCGCACTGACAAGCGGAGTCCACACTTTTCCAGCCGTGCTGCAGAGCTCTGGCCTGTACTCCCTGAGTTCAGTGGTCACAGTCCCCTCCAGCTCTCTGGGAACCCAGACATACATCTGTAACGTGAACCATAAGCCTAGCAACACTAAGGTGGACAAAAAGGTGGAGCCAAAATCCTGCGACAAAACCCATACATAA

SEQ ID NO:14-具有IgL分泌序列的Fab6A10的VL的核苷酸：

ATGTCCGTGCCTACCCAGGTGCTGGGGCTGCTGCTGCTGTGGCTGACTGATGCAAGATGTCCCGTCGATATTGTGCTGACCCAGAGCCCAGCCACACTGAGTGTGACTCCCGGAGAGTCTGTCAGTCTGTCATGCAGGGCTAGCCAGGGGATCTCCACCAGCATTCACTGGTACCAGCAGAAGAGTAACGAATCACCCAGGCTGCTGATCAAATTCGCCTCTCAGAGTATCTCAGGAATTCCATCTCGGTTCTCCGGCAGCGGATCTGGGACTGACTTTACCCTGTCCATTAATAGAGTGGAGAGCGAAGATTTCTCTGTCTATTTTTGCCAGCAGACATACAGCCTGCCCTATACCTTCGGTGCAGGCACAAAGCTGGAGCTGAAACGCACTGTGGCCGCTCCTAGCGTCTTCATCTTTCCCCCTTCTGACGAACAGCTGAAGAGTGGTACAGCTTCAGTGGTCTGTCTGCTGAACAATTTTTACCCACGAGAGGCAAAGGTGCAGTGGAAAGTCGATAACGCCCTGCAGTCCGGCAATAGCCAGGAGTCTGTGACTGAACAGGACAGTAAGGATTCAACCTATTCCCTGTCCAGCACCCTGACACTGTCCAAAGCTGACTACGAGAAGCATAAAGTGTATGCATGTGAAGTCACCCACCAGGGGCTGTCATCACCCGTCACAAAATCATTCAATAGGGGGGAGTGCTAA

SEQ ID NO:15–IgG分泌序列:

MYLGLNYVFIVFLLNGVQS

SEQ ID NO:16–IgL分泌序列:

MSVPTQVLGLLLLWLTDARC

SEQ ID NO:17–Fab6A10的VL的N-末端片段

PVDIVLTQSPATLSV

SEQ ID NO:18–Fab6A10的VL的N-末端片段

RCPVDIVLTQSPATLSV

SEQ ID NO:19–Fab6A10的VH的N-末端片段

QVQLKESGPGLVQPS

SEQ ID NO:20–Fab6A10的VL的C-末端片段

GLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO:21–Fab6A10的VH的C-末端片段

VDKKVEPKSCDKTHT

通过以下实施例进一步说明本发明。然而，本文所述的实施例和具体实施方案不应被解释为将本发明限制于这些具体实施方案。

实施例

生产6A10 Fab片段的CHO细胞系的产生

使用重组DNA技术建立表达6A10Fab的中国仓鼠卵巢(CHO)衍生细胞系克隆。生产细胞系的构建是由Helmholtz Zentrum München负责的Fraunhofer ITEM,PhB,Braunschweig完成的。从CHO K1(ECACC，编号85051005)开发宿主悬浮细胞系CHO HIT。所用的6A10Fab具有分别示于

图6和7的序列。图6示出了在被宿主细胞加工之前6A10Fab单体的序列。

图7示出了6A10Fab二聚体测序后获得的序列。

制备HitbasisHygro_ch6A10_LC和HitbasisNeo_ch6A10_HC载体(参见图1)用于转染CHO HIT细胞。为此目的，使用PCR技术从质粒pUC57-ch6A10 LC和pUC57-ch6A10 HC扩增6A10Fab轻链和重链的编码序列。将6A10Fab轻链cDNA插入HITbasisHygro。将6A10Fab重链cDNA插入HITbasisNeo。

图1提供了相应的载体结构。限制性分析和部分测序的组合结果证明了质粒的正确性和完整性。

在将表达载体转化到感受态大肠杆菌TopTen细胞后，将细胞涂布到含氨苄青霉素的LB琼脂培养基上。选择抗性集落以分离质粒DNA。

为了制备宿主细胞系，将一小瓶CHO HIT宿主细胞系解冻，接种到“宿主细胞生长培养基”(含有4mM GlutaMAX的ProCHO5培养基)中，并扩增用于转染。

使用AMAXA核转染系统(LONZA)，根据制造商的手册通过电穿孔将两种表达载体(一起或相继)转染到宿主细胞中。将转染的细胞在37℃下温育。

转染两天后，将细胞池转移到“选择培养基1”或“选择培养基2”(含有4mMGlutaMAX和抗生素的proCHO培养基)中，并传代培养直至存活力恢复且细胞开始生长。对于具有可接受生长的池，通过SDS-PAGE的光密度评估测定滴度，并估算细胞单位生产率(cellspecific productivities)。选择细胞池“MP P6-A4”用于单细胞克隆。

在影像支持的克隆程序中使用有限稀释法结合基于影像的文件来分离克隆。此后，扩增所有生长的克隆，随后各冷冻5小瓶。将通过PAIA分析测定显示最佳产物浓度的克隆扩大至摇瓶水平(9个克隆)。选择克隆“P1D20”、“P1E20”、“P1H06”和“P5E17”作为优选生产细胞系并用于表达稳定性研究。基于在表达稳定性研究期间获得的数据，认为克隆“P1E20”和“P5E17”是足够表型稳定的。最后，根据数量和质量选择细胞克隆“P1E20”用于USP过程的开发。

N-和C-末端测序

通过MALDI-TOF-MS的N-和C-末端测序是一种用于验证蛋白质N-和C-末端氨基酸序列的方法。将还原的样品用1,5-二氨基萘点样在ground steel靶板上，并用MALDI-TOF-MS以正离子模式测量。沿着肽氨基酸骨架的片段化产生对蛋白质的N-和C-末端氨基酸序列特异的片段。通过将实验测定的片段分子量与理论预期的片段进行比较来验证理论氨基酸序列。

通过使用MALDI-ISD-MS的N-和C-末端测序来验证6A10Fab-CHX-A”-DTPA的身份(identity)。测序在轻链N-末端检测到另外的精氨酸(R)和半胱氨酸(C)氨基酸；参见表2。在重链中没有观察到这样的添加或修饰。

表2：6A10Fab链的N-和C-末端(参照和批次(batch))

/>

不受理论束缚，为轻链的最佳翻译和分泌而选择的预测的信号序列未被酶信号序列肽酶(SSP)正确切割。结果，第一Fab6A10单体的VL区和第二Fab6A10单体的VL区通过第一Fab6A10单体的VL区的N-末端处的和第二Fab6A10单体的VL区的N-末端处的另外的非天然存在的半胱氨酸残基之间的二硫键共价连接。

如上表2中可见，第一Fab6A10单体在VL区的N-末端含有另外的半胱氨酸残基(Cys)(在如上所示的SEQ ID NO:18中加下划线)，其能够与第二Fab6A10单体的VL区的N-末端存在的另外的半胱氨酸残基(Cys)建立二硫桥，从而在第一Fab6A10单体的VL区和第二Fab6A10单体的VL区之间产生Cys-Cys桥，从而产生Fab6A10二聚体。

当然，即使二硫键是由于很可能未被酶信号序列肽酶(SSP)正确切割而行成的，但是形成这种二硫键的半胱氨酸残基也可以，但并非必须通过可变区N-末端的信号/分泌序列引入。事实上，也可通过本领域公知的编码这些可变区的核苷酸序列的相应工程化来引入此类半胱氨酸残基。

从Fab二聚体能够通过异常的、之前未曾见过的二硫键构建二聚体的观察结果，可以合理地推测

单体和二聚体与CA12阳性人A549肺癌细胞的结合

将50.000个A549细胞与连续稀释的Fab6A10-单体或-二聚体一起温育。Fab6A10具有以下CDR：SEQ ID NO:1所示的VH-CDR1、SEQ ID NO:2所示的VH-CDR2、SEQ ID NO:3所示的VH-CDR3、SEQ ID NO:4所示的VL-CDR1、SEQ ID NO:5所示的VL-CDR2和SEQ ID NO:6所示的VL-CDR3。

在本实施例中使用的Fab6A10二聚体中，第一Fab6A10单体的VL区和第二Fab6A10单体的VL区通过第一Fab6A10单体的VL区的N-末端处的和第二Fab6A10单体的VL区的N-末端处的另外的非天然存在的半胱氨酸残基之间的二硫键共价连接。

所用的6A10Fab具有分别示于图6和7的序列。图6示出了在被宿主细胞加工之前6A10Fab单体的序列。图7示出了6A10Fab二聚体测序后获得的序列。

洗涤后，将细胞与Cy5标记的第二抗体(驴抗-人IgG轻链和重链)温育。用BDFACSCanto和DIVA软件分析第二抗体的结合。RU＝相对光单位。

图4示出了在pH 7.4时，Fab6A10二聚体和CA12阳性A549细胞的结合与单体和CA12阳性A549细胞的结合相当。

流式细胞术

在指定pH下，用不同量的Fab6A10二聚体或Fab6A10单体温育CA12阳性A549细胞，随后是中性pH(约7.2)下的合适的Cy5标记的第二抗体的温育。

Fab6A10具有下列CDR：SEQ ID NO:1所示的VH-CDR1、SEQ ID NO:2所示的VH-CDR2、SEQ ID NO:3所示的VH-CDR3、SEQ ID NO:4所示的VL-CDR1、SEQ ID NO:5所示的VL-CDR2和SEQ ID NO:6所示的VL-CDR3。

通过流式细胞术测量二聚体或单体的结合。

图5示出了在低pH下(由于低pH存在于例如肿瘤环境中)，Fab6A10二聚体的结合特别优于单体的结合。

Claims

2.根据权利要求1所述的二聚体，其中所述VL区或VH区的N-末端处的非天然存在的半胱氨酸残基处于氨基酸位置1或氨基酸位置2处，其中分别从所述VL区或VH区的N-末端开始计数氨基酸，其中位置1是N-末端处的第一个氨基酸。

3.根据权利要求1或2所述的二聚体，其中所述第一Fab单体和所述第二Fab单体相同或不同。

4.根据前述权利要求中任一项所述的二聚体，其中所述第一Fab单体和所述第二Fab单体针对相同的靶标。

5.根据权利要求1至3中任一项所述的二聚体，其中所述第一Fab单体针对第一靶标，并且所述第二Fab单体针对第二靶标，所述第一靶标和所述第二靶标是不同的。

6.根据前述权利要求中任一项所述的二聚体，其中所述第一Fab单体包含SEQ ID NO:1所示的VH-CDR1、SEQ ID NO:2所示的VH-CDR2、SEQ IDNO:3所示的VH-CDR3、SEQ ID NO:4所示的VL-CDR1、SEQ ID NO:5所示的VL-CDR2和SEQ ID NO:6所示的VL-CDR3。

7.根据前述权利要求中任一项所述的二聚体，其中所述第一Fab单体的VL区和所述第二Fab单体的VL区在其N-末端包含SEQ ID NO:16所示的分泌序列。

8.根据前述权利要求中任一项所述的二聚体，其中所述第一Fab单体的VH区和所述第二Fab单体的VH区在其N-末端包含SEQ ID NO:16所示的分泌序列。

9.根据前述权利要求中任一项所述的二聚体，其中所述第一Fab单体的VL区和所述第二Fab单体的VH区在其N-末端包含SEQ ID NO:16所示的分泌序列。

10.根据前述权利要求中任一项所述的二聚体，其中所述第一Fab单体的VH区和所述第二Fab单体的VL区在其N-末端包含SEQ ID NO:16所示的分泌序列。

11.根据权利要求7所述的二聚体，其中所述第一Fab单体的VH区和所述第二Fab单体的VH区在其N-末端包含SEQ ID NO:15所示的分泌序列。

12.根据权利要求8所述的二聚体，其中所述第一Fab单体的VL区和所述第二Fab单体的VL区在其N-末端包含SEQ ID NO:15所示的分泌序列。

13.根据权利要求9所述的二聚体，其中所述第一Fab单体的VH区和所述第二Fab单体的VL区在其N-末端包含SEQ ID NO:15所示的分泌序列。

14.根据权利要求10所述的二聚体，其中所述第一Fab单体的VL区和所述第二Fab单体的VH区在其N-末端包含SEQ ID NO:15所示的分泌序列。

15.根据前述权利要求中任一项所述的二聚体，其中所述第一Fab单体包含SEQ ID NO:7所示的VH区和SEQ ID NO:8所示的VL区。

16.根据前述权利要求中任一项所述的二聚体，其中所述第一Fab单体包含由SEQ IDNO:9所示的核苷酸序列编码的VH区和由SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列编码的VL区。

17.根据前述权利要求中任一项所述的二聚体，其中所述第一Fab单体包含SEQ ID NO:11所示的VH区和SEQ ID NO:12所示的VL区。

18.根据前述权利要求中任一项所述的二聚体，其中所述第一Fab单体包含由SEQ IDNO:13所示的核苷酸序列编码的VH区和由SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列编码的VL区。

19.根据前述权利要求中任一项所述的二聚体，其可通过以下获得：

(a)培养表达如权利要求1至18中任一项所定义的第一和第二Fab单体的CHO细胞，直至达到稳定期；

(b)任选地向CHO细胞培养物中加入氧化剂；以及

(c)收获所述二聚体。

20.根据前述权利要求中任一项所述的二聚体，其中将所述第一Fab单体和/或第二Fab单体偶联至

(a)标记基团，

(b)毒素，或

(c)抗肿瘤药物。

21.一种组合物，其包含权利要求1至20中任一项所述的二聚体。

22.根据权利要求21所述的组合物，其还包含如权利要求1至20中任一项所定义的Fab单体。

23.根据权利要求1至20中任一项所述的二聚体或权利要求21或22所述的组合物，其用作药物。

24.根据权利要求1至20中任一项所述的二聚体或根据权利要求21或22所述的组合物，其用在用于治疗或抑制缺氧、实体瘤或眼病的方法中。

25.根据权利要求24所述的二聚体或组合物，其中所述缺氧选自肿瘤缺氧、神经元缺氧、脑缺氧、狭窄和缺血。

26.根据权利要求24所述的二聚体或组合物，其中所述实体瘤选自肉瘤、神经胶质瘤、癌、间皮瘤、淋巴瘤、肾肿瘤、肺肿瘤、乳腺肿瘤、宫颈肿瘤、卵巢肿瘤、结肠直肠肿瘤、肝肿瘤、前列腺肿瘤、胰腺肿瘤和头颈肿瘤。

27.根据权利要求24所述的二聚体或组合物，其中所述眼病选自高眼压、青光眼、黄斑变性、年龄相关性黄斑变性、葡萄膜炎、视网膜炎、X连锁视网膜劈裂症和高血压性视网膜病变。