CN117957237A

CN117957237A - 经修饰的b型利钠肽

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Publication number: CN117957237A
Application number: CN202280047467.4A
Authority: CN
Inventors: N·P·尚克利; B·约翰逊; S·B·卡林吉安; L·弗里德里希
Original assignee: Antelia Biosciences
Current assignee: Antelia Biosciences
Priority date: 2021-05-14
Filing date: 2022-05-16
Publication date: 2024-04-30
Also published as: EP4337668A1; US20240199716A1; JP2024517967A; WO2022241310A1; BR112023023793A2; AU2022272733A1; CA3218973A1

Abstract

提供了一种经修饰的B型利钠肽(BNP)，其包括包含氨基酸的共价连接的聚合物，其中所述聚合物抑制受试者中的所述BNP的降解和/或消除，并且其中所述经修饰的BNP保留了血管舒张活性。编码上述经修饰的BNP的核酸分子，以及包括所述核酸分子的载体和包括所述载体的细胞。还提供了治疗患有或被诊断患有可以用利钠剂、利尿剂或血管舒张剂治疗的疾病、病症或医学病状的受试者的方法。所述方法包括向所述受试者施用上文经修饰的BNP。进一步提供了制备上述经修饰的BNP的方法。另外提供了上述经修饰的BNP、上述核酸、上述载体和/或上述细胞的用途，其用于制备用于治疗可以用利钠剂、利尿剂或血管舒张剂治疗的疾病、病症或医学病状的药物。

Description

经修饰的B型利钠肽

相关申请的交叉应用

本申请要求于2021年5月14日提交的美国临时申请第63/188,743号的权益，并且以全文引用的方式并入本文。

技术领域

本申请一般涉及治疗性肽。更具体地，本发明涉及在哺乳动物中具有减少的降解和/或消除的经修饰的B型利钠肽(BNP)。

背景技术

B型利钠肽(也称为脑利钠肽(或“BNP”)，并且作为名为奈西立肽(nesiritide)和的商业产品出售)是一种属于利钠肽组的内源性肽。BNP是32个氨基酸肽，并且最初是在猪脑的提取物中发现的，从而被命名为脑利钠肽。蛋白的描述作为NCBI参考序列NP_002512.1(“利钠肽B前原蛋白[智人[Homo sapiens)]”)中列出的成熟蛋白提供：

SPKMVQGSGC FGRKMDRISS SSGLGCKVLR RH(SEQ ID NO:1)。

其存在于人脑中，但在心室组织中的量明显更高。BNP作为对增加的心肌壁延伸的应答而释放，这在心力衰竭中被夸大，并且因此被用作与高细胞外液体积相关的病理学的标志物。

与钠和水肿相关联疾病的治疗性措施多种多样，并且包含施用各种利尿剂物质。BNP具有利钠剂、利尿剂、血管舒张剂、支气管扩张作用，并且可能对肾素-血管紧张素-醛固酮系统具有拮抗作用。应当理解，这些肽和其类似物(如心房利钠肽(ANP)、BNP、C型利钠肽(CNP)和尿扩张素(Uro))通过控制流体体积和血管直径来有效调节血压。另外，这些肽产生抗纤维化和抗炎性作用。

若干种疾病状态的特征在于异常流体潴留，包含充血性心力衰竭、肝硬化和肾病综合征。这些疾病与循环静脉侧过多的液体累积和肾脏灌注不足相关联，从而导致肾小球滤过率(GFR)下降。自1980年以来，取得了以下进展：BNP被克隆和表达；并且FDA已批准名为奈西立肽(或)的商品用于急性代偿失调性充血性心力衰竭(ADHF)管理的临床适应症。奈西立肽和相关的医学用途在美国专利第5,114,923号、第5,674,710号、第6,586,396号、第6,974,861号和第7,179,790号中有所描述。存在与奈西立肽的施用相关联的包含在人类受试者中的半衰期短的问题(参见，例如，O'Connor,2011)，并且所述产品尚未被监管用于治疗慢性心力衰竭或除ADHF之外的其它心血管病、代谢疾病、肾病或肺病。

最近，PEG化的BNP产品在公开第WO2009156481A1号中所描述的在预期治疗慢性心力衰竭中制备的，所述慢性心力衰竭在连续输血的2-4小时之间达到血浆浓度的峰值水平。所述申请中描述的PEG化的BNP也是免疫原性的，这导致施用问题。

因此，需要具有更长的持续血液水平，并且比PEG化的BNP具有更低的免疫原性的经修饰的BNP。本发明解决了所述需要。

发明内容

提供了一种经修饰的B型利钠肽(BNP)，其包括与SEQ ID NO:1具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％氨基酸序列同一性的序列。在这些实施例中，所述经修饰的BNP进一步包括包含氨基酸的共价连接的聚合物，其中所述聚合物抑制受试者中的所述BNP的降解和/或消除，并且其中所述经修饰的BNP保留了血管舒张剂活性。

还提供了一种编码上述经修饰的BNP的核酸分子。

另外提供了一种包括上述核酸分子的载体。

进一步提供了一种包括上述载体的细胞。

还提供了一种治疗患有或被诊断患有可以用利钠剂、利尿剂或血管舒张剂治疗的疾病、病症或医学病状的受试者的方法。所述方法包括向需要此类治疗的受试者施用治疗有效量的上文所描述的经修饰的BNP。

进一步提供了一种制备上述经修饰的BNP的方法。所述方法包括将来自上述细胞的经修饰的BNP表达为包含聚合物的融合蛋白，或者可替代地，通过溶液或固相技术产生所述BNP，并且然后使用化学方法共价连接聚合物。

另外提供了上述经修饰的BNP、上述核酸、上述载体和/或上述细胞的用途，其用于制备用于治疗可以用利钠剂、利尿剂或血管舒张剂治疗的疾病、病症或医学病状的药物。

附图说明

本领域技术人员将理解，下文描述的附图仅用于说明目的。附图不旨在以任何方式限制本发明的教导的范围。

图1是天然BNP(SEQ ID NO:1)的结构的图示。

图2是天然BNP与其受体结合的概括描述的图示。

图3是与其酶促降解相关的天然BNP的所关注的位点的图示。

图4是用于BNP衍生化，包含PAS化的所关注的位点的图示。从左至右并且从上至下—SEQ ID NO:15、16、17、18、19、20。

图5是PAS化的BNP和制备方法的图示。

图6是示出BNP和BNP衍生物对人利钠剂多肽受体(hNPR1)的激活的测定结果的图。

图7是示出BNP和BNP衍生化合物1对预收缩豚鼠气管环区段的舒张作用的图。

图8是示出静脉内团注给药(0.2mg/kg)后化合物1的犬血浆浓度随时间变化的两相模型拟合的图。

图9是示出皮下团注给药(0.9mg/kg)后化合物1的犬血浆浓度随时间变化的模型拟合的图。

图10是示出狗的收缩压(SBP)、舒张压(DBP)和计算平均动脉压(MAP＝DBP+[0.33+(HR x 0.0012)]x[SBP])的24小时给药后遥测记录的图。

图11是示出0.9mg/kg化合物1或媒剂的皮下团注给药后平均动脉压(MAP)和心率(HR)的24小时给药后遥测记录的图。平均数据(N＝3)。

图12是示出在0.9mg/kg化合物1的皮下团注给药、0.2mg/kg化合物1的静脉内团注给药和媒剂的皮下给药(磷酸盐缓冲盐水)后的平均动脉压(MAP)的6天记录的图。平均数据(N＝3)。

图13是示出0.9mg/kg化合物1的皮下团注给药后的平均动脉压(MAP)的5天记录的曲线图，所述图绘制在反向轴(右手侧)上，以允许可视化与化合物1的血浆浓度的一致性。

图14是示出0.9mg/kg化合物1的皮下团注给药后的血浆cGMP浓度(覆盖有化合物1的对应血浆浓度)的5天记录的图。

图15是用尺寸排阻色谱法(A)和ESI质谱法(B)展示化合物1的生物分析表征的图。

具体实施方式

缩写和定义

BNP：如本文所使用的，术语“BNP”是指B型利钠肽，如NCBI参考序列NP_002512.1“利钠肽B前原蛋白[智人]”中列出的成熟蛋白所描述的。

BNP蛋白：术语“BNP蛋白”或“BNP肽”或“BNP多肽”意指BNP基因的表达产物，如天然BNP蛋白，或与前述中的一者共享至少65％(但优选地75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)氨基酸序列同一性并显示天然BNP蛋白的功能活性的蛋白质。所述术语可以包含BNP的衍生物，其包括与BNP蛋白的氨基或羧基末端中的一者或两者共价连接的重组多肽。此类重组蛋白可以是BNP蛋白，包含PAS化的BNP蛋白。所述术语还可以包含具有支化或非支化多肽结构的BNP的合成衍生物，例如，其中多肽与包括BNP蛋白的氨基酸中的一个或多个氨基酸共价连接。在本发明的重组方面和合成方面两者中，所得多肽显示天然BNP蛋白的生物活性。

如本文所使用的术语“功能BNP蛋白”或“功能BNP”旨在包含具有至少一种BNP的功能活性的人BNP多肽。

保守变化：如本文所使用的，当提及核酸分子中的突变时，“保守变化”是指其中核酸的蛋白编码区中的至少一个密码子发生变化，使得由核酸序列编码的多肽的至少一个氨基酸被具有相似特征的另一个氨基酸取代。保守氨基酸取代的实例是ser取代ala、thr或cys；lys取代arg；gln取代asn、his或lys；his取代asn；glu取代asp或lys；asn取代his或gln；asp取代glu；pro取代gly；leu取代ile、phe、met或val；val取代ile或leu；ile取代leu、met或val；arg取代lys；met取代phe；tyr取代phe或trp；thr取代ser；trp取代tyr；并且phe取代tyr。

功能活性：如本文所使用的，术语“功能活性”是指物质对活细胞或生物体的生物效应。因此，如本文所使用的术语“功能蛋白”或“功能肽”或“功能多肽”涉及能够诱导例如BNP的生物活性的蛋白质或肽或多肽，例如其通过控制流体体积和血管直径来有效调节血压。在另一个实例中，BNP蛋白的功能活性可以被鉴定为影响某些组织中的异常流体潴留。本文提供了测定BNP以及BNP的片段、变体和同源物的生物活性的方法。本领域技术人员将认识到测量BNP活性的其它方法，例如心力衰竭和流体潴留活性。又值得注意的是，在本发明的上下文中，术语“功能蛋白”涉及本发明的全蛋白，其既包括具有和/或介导所述生物活性的氨基酸序列，也包括形成无规卷曲构象的氨基酸序列，或BNP蛋白的其它支化或非支化衍生物。

因此，如本文所使用的术语“功能氨基酸序列”可以涉及本发明的功能蛋白的“第一结构域”，介导或具有或能够介导或具有上文所定义的生物活性。术语“具有和/或介导生物活性的氨基酸序列”或“具有生物活性的氨基酸序列”也涉及本发明的“功能多肽”和所述生物活性蛋白的“第一结构域”。术语“具有功能活性的氨基酸序列”还包括BNP的功能片段，其体内或体外半衰期延长，同时免疫原性活性降低。因此，根据本发明，具有功能活性的蛋白质可以包括源自天然产生的多肽或通过重组DNA技术产生的多肽的功能活性氨基酸序列。

分离的多肽：如本文所使用的术语“分离的多肽”意指多肽分子相对于其与其它分子的缔合，以不同于在其原始环境中发现的形式存在。术语“分离的多肽”涵盖“经纯化的多肽”，其在本文中用于意指特定多肽处于基本上同质的制剂中，基本上不含其它细胞组分、其它多肽、病毒材料或培养基，或者当多肽是化学合成的时，基本上不含与化学合成相关联的化学前体或副产物。“经纯化的多肽”可以通过标准纯化技术或通过化学合成从天然或重组宿主细胞中获得。

术语“分离的多肽”还涵盖“重组多肽”，其在本文中用于意指通过重组DNA技术或化学合成产生的杂交多肽，所述杂交多肽具有与一个或多个多肽分子共价连接的特定多肽分子，所述多肽分子不与特定多肽天然地连接。

PAS化或PAS化的：如本文所使用的，术语“PAS化”或“PAS化的”广义地定义为包含与包括氨基酸Pro、Ala和任选地Ser(各自为“PAS”基团)的在构象上无序的聚合物序列缀合的BNP；本领域技术人员将认识到PAS基团可以含有保守取代，并且包括Pro、Ala和任选地Ser氨基酸的整个无规卷曲也可以包含保守取代基。因此，术语“PAS化”是指具有大流体动力学体积的溶剂化无规链与BNP肽的连接。这种氨基酸链(聚合物)采用庞大的无规卷曲结构，这显著增加了所得经修饰的肽的大小。由于经修饰的肽的大小显著增加，通常通过肾脏过滤的生物活性组分的快速清除被延迟了1-2个数量级。类似地，大量的无规卷曲结构可以防止生物活性组分的酶促降解。

药学上可接受的：如本文所使用的，术语“药学上可接受的”意指由联邦政府或州政府的监管机构批准的或在美国药典或其它公认的药典中列出的用于动物，并且更具体地用于人的。

药学上可接受的载剂：如本文所使用的，术语“药学上可接受的载剂”是指与化合物一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒剂。此类载剂可以是无菌液体，如水和油，包含石油、动物、植物或合成来源的那些油，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等，聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂。当静脉内施用化合物时，水是优选的载剂。还可以采用盐水溶液以及右旋糖和甘油水溶液作为液体载剂，尤其是用于可注射溶液的液体载剂。合适的赋形剂包含淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。如果期望，化合物还可以组合有少量的润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂，如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐。抗细菌剂，如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；以及用于调节紧张性的药剂，如氯化钠或右旋糖也可以是载剂。用于产生与载剂组合的化合物的方法是本领域技术人员已知的。

药学上可接受的盐：如本文所使用的，术语“药学上可接受的盐”包含由如衍生自盐酸、磷酸、乙酸、草酸和酒石酸的那些的游离氨基形成的那些药学上可接受的化合物的盐，以及由如衍生自钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸和普鲁卡因(procaine)的那些的游离羧基形成的那些药学上可接受的化合物的盐。如果化合物是碱性的，则可以从包含无机酸和有机酸的药学上可接受的无毒酸制备盐。此类酸包含乙酸、苯磺酸(benzene-sulfonic)(苯磺酸(besylate))、苯甲酸、樟脑磺酸、柠檬酸、乙烯磺酸、富马酸、葡萄糖酸、谷氨酸、氢溴酸、盐酸、羟乙磺酸、乳酸、马来酸、苹果酸、扁桃酸、甲磺酸、粘酸、硝酸、扑酸、泛酸、磷酸、琥珀酸、硫酸、酒石酸、对甲苯磺酸等。特别优选的是苯磺酸、氢溴酸、盐酸、磷酸和硫酸。如果化合物是酸性的，可以用药学上可接受的有机和无机碱制备盐。合适的有机碱包含但不限于赖氨酸、N,N'-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、葡甲胺(N-甲基-葡糖胺)和普鲁卡因。合适的无机碱包含但不限于碱金属和碱土金属，如铝、钙、锂、镁、钾、钠和锌。合成此类盐的方法是本领域技术人员已知的。

术语“多肽”、“蛋白质”和“肽”在本文中可互换地使用，以指其中氨基酸残基通过肽键或经修饰的肽键连接的氨基酸链。氨基酸链可以是大于两个氨基酸的任何长度。除非另有说明，否则术语“多肽”、“蛋白质”和“肽”还涵盖其各种经修饰的形式。此类经修饰的形式可以是天然存在的经修饰的形式或经化学修饰的形式。经修饰的形式的实例包含但不限于糖基化形式、磷酸化形式、肉豆蔻酰化形式、棕榈酰化形式、核糖基化形式、乙酰化形式、模拟物(Mason,2010)等。修饰还包含分子内交联和如脂质、黄素、生物素、聚乙二醇或其衍生物等各种部分的共价连接。另外，修饰还可以包含环化、支化和交联。进一步地，除了由基因编码的常规二十个氨基酸之外的氨基酸也可以包含在多肽中。

术语“蛋白质”或“多肽”还可以涵盖“经纯化的”多肽，所述经纯化的多肽基本上与其中天然存在多肽的细胞或生物体中的其它多肽分离(例如，30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％不含污染物)。

术语“引物”、“探针”和“寡核苷酸”在本文中可以互换地使用，以指相对短的核酸片段或序列。其可以是DNA、RNA或其杂交体，或其经化学修饰的类似物或衍生物。通常，其是单链的。然而，其也可以是具有可以分开变性的两条互补链的双链。在某些方面，其长度为约8个核苷酸至约200个核苷酸，优选地约12个核苷酸至约100个核苷酸，更优选地约18个至约50个核苷酸。其可以标记有可检测的标志物或以任何常规方式修饰，用于各种分子生物学应用。

无规卷曲：如本文所使用的，术语“无规卷曲”涉及聚合物分子的任何构象，包含氨基酸聚合物，其中形成所述聚合物结构的单独的单体要素大体上无规地朝向相邻单体要素，同时仍与所述相邻单体要素化学键合。具体地，采用/具有/形成“无规卷曲构象”的多肽或氨基酸聚合物基本上缺乏定义的次级结构和三级结构。多肽无规卷曲的性质和其实验鉴定的方法是本领域技术人员已知的，并在科学文献(Cantor(1980)《生物物理化学(Biophysical Chemistry)》,第2版,纽约的W.H.弗里曼公司(W.H.Freeman and Company,New York)；Creighton(1993)《蛋白质结构和分子特性(Proteins-Structures andMolecular Properties)》,第2版,纽约的W.H.弗里曼公司；Smith(1996)《折叠与设计1(Fold Des 1)》:R95-R106)中有所描述。

治疗有效量：如本文所使用的，术语“治疗有效量”是指考虑到受试者的疾病或病状的性质和严重程度，当向所述受试者施用时，将具有所期望的治疗效果的那些量，例如将治愈、预防、抑制或至少部分地阻止或部分地预防目标疾病或病状的量。

经转化的、经转染的或转基因的：引入了外来核酸，如重组载体的细胞、组织或生物体被认为是“经转化的”、“经转染的”或“转基因的”。“转基因的”或“经转化的”细胞或生物体还包含所述细胞或生物体的后代，包含由此类“转基因的”细胞或生物体作为杂交亲本的育种程序产生的后代。

处理：如本文在经修饰的BNP的上下文中所使用的，术语“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”等是指缓解或减轻由经修饰的BNP施用所介导的病理过程。在本发明的上下文中，就其与下文所述的任何其它病状相关而言，术语“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”等意指缓解或减轻与所述此类病状相关联的至少一种症状，或减缓或逆转此类病状的进展。

载体：如本文所使用的，术语“载体”是指能够转运其已经连接的另一个核酸的核酸分子。一种类型的优选的载体是附加体，即能够进行染色体外复制的核酸。优选的载体是能够自主复制和/表达与其连接的核酸的那些。能够指导与其可操作地连接的基因的表达的载体在本文中被称为“表达载体”。

接头：术语“接头”指分离多肽的多个结构域的短氨基酸序列。

涉及常规分子生物学技术的方法是本领域公知的，并且在方法学论文，如Green和Sambrook(2012)中有详细描述。

经修饰的B型利钠肽(BNP)

提供了进一步包括氨基酸聚合物的BNP，例如由脯氨酸和丙氨酸残基以及任选地丝氨酸残基(PAS)组成的聚合物。此类化合物可以用于治疗纤维变性疾病、炎性疾病、慢性心力衰竭和其它异常流体潴留适应状，包含肺病，如肺气肿、哮喘和COPD。在一些实施例中，PAS化向天然BNP蛋白中添加了具有大流体动力学体积的溶剂化无规链。添加PAS聚合物(PAS化)已成功用于94-氨基酸肽adnectin，以增加血浆半衰期(Aghaabdollahian,S.等人,2019)。

BNP 1-32在形成二硫桥的残基10和26处具有半胱氨酸，因此在激素的中间区段形成环结构。从这些残基延伸出来的是线性头(N末端)和尾(C末端)部分(图1)。

存在可用的晶体学数据，由此从位置9处的甘氨酸通过环区到位置29处的亮氨酸的分子的片段与非常类似于靶受体的受体蛋白共结晶。此数据表明，分子的这一部分很可能埋藏在受体结构内，因为那里几乎没有多余的空间。这一点的另外的证据来自于源自全1-32BNP分子的信息，由此在位置14和27处与赖氨酸的两亲性PEG寡聚体连接失去了其激动剂活性(Cataliotti等人,2007)。

激素通过酶DPPIV在残基2与3之间、通过脑啡肽酶(neprilysin)在残基4与5之间以及通过金属蛋白酶，穿膜肽酶(meprin)在残基7与8之间的切割进行处理。(图3)。

当两亲性PEG寡聚体与位置3处的赖氨酸连接时，所述活性相当保守，并且半衰期延长。这表明，至少BNP分子的一些头部不参与结合受体。相反，BNP分子的头部占据了存在空间以用于容纳大分子的区，推测指向远离受体的结合位点。因此，N末端区是BNP分子进行修饰的有利部分，其含有处理点(例如，图3中的切割点)和可能不参与与受体结合的残基。然而，本发明涵盖BNP分子中任何点的PAS化。

因此，在一些实施例中，提供了经修饰的B型利钠肽(BNP)。经修饰的BNP包括与SEQID NO:1或其部分具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％氨基酸序列同一性的序列。在这些实施例中，所述经修饰的BNP进一步包括包含氨基酸的共价连接的聚合物，其中所述聚合物抑制受试者中的所述BNP的降解和/或消除，并且其中所述经修饰的BNP保留了血管舒张剂活性。

在一些实施例中，经修饰的BNP具有改变的序列。这些BNP蛋白变体，如天然BNP蛋白的片段、类似物和衍生物也在本发明内。此类变体包含，例如，由天然BNP基因的天然存在的等位基因变体编码的多肽，由天然BNP基因的替代性剪接形式编码的多肽，由天然BNP基因的同源物编码的多肽，和由天然BNP基因的非天然存在的变体编码的多肽。

BNP蛋白变体具有在一个或多个氨基酸中不同于天然BNP蛋白的肽序列。此类变体的肽序列可以以天然BNP多肽的一个或多个氨基酸的缺失、添加或取代为特征。氨基酸插入可以是约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个和9至10个连续氨基酸，并且缺失可以是约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个和9至10个连续氨基酸。在一些应用中，变体BNP蛋白基本上保持了BNP蛋白功能活性。对于其它应用，变体BNP蛋白缺乏BNP蛋白功能活性或以所述BNP蛋白功能活性的显著降低为特征。当期望保留天然BNP蛋白的功能活性时，优选的BNP蛋白变体可以通过表达本发明内以沉默或保守变化为特征的核酸分子来制备。功能活性发生实质性变化的变体BNP蛋白可以通过表达本发明内以变化少于保守变化为特征的核酸分子来制备。

对应于一个或多个特定基序和/或结构域或对应于任意大小，例如，长度为至少5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个和32个氨基酸的BNP蛋白片段和变体旨在于本发明的范围内。BNP蛋白的分离的肽基部分可以通过筛选从编码此类肽的核酸的对应片段重组产生的肽来获得。另外，可以使用本领域已知的技术，如常规的Merrifield固相f-Moc或t-Boc化学来化学合成片段。例如，本发明的BNP蛋白可以任意地分成所期望长度的片段，其中片段之间没有重叠，或者优选地分成所期望长度的重叠片段。可以产生(重组或通过化学合成)所述片段，并进行测试以鉴定那些可以充当天然BNP蛋白的激动剂或拮抗剂的肽基片段。

本发明的另一方面涉及BNP蛋白的重组形式。除了天然BNP蛋白之外，本发明优选的重组多肽由与NCBI基因ID：4879的核酸序列具有至少85％序列同一性(例如，85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％和99％)的核酸编码。在一优选的实施例中，变体BNP蛋白具有天然BNP蛋白的一种或多种功能活性。

在各个实施例中，经修饰的BNP是全长BNP。在其它实施例中，经修饰的BNP在SEQID NO:1的C末端和/或N末端处被截短。如在图1中所示出的，BNP包括Cys 10与Cys 26之间的二硫桥。BNP可以从C末端或N末端或两个末端向二硫桥方向截短，而没有显著的活性损失。参见例如实例4，其中在hNPR1激动测定中，PAS化的BNP1-30、PAS化的BNP3-32和PAS化的BNP6-32表现与PAS化的BNP1-32相当。

经修饰的BNP还可以包含一种或多种以重组方式或以化学方式共价连接或非共价连接的另外的蛋白质，例如一种或多种另外的经修饰的或未经修饰的BNP、包括抗体结合位点的蛋白质、尿皮质素，如stresscopin或任何其它生物活性蛋白。

因此，经截短的BNP可以是BNP2-32、BNP3-32、BNP4-32、BNP5-32、BNP6-32、BNP7-32、BNP8-32、BNP9-32、BNP10-32、BNP1-31、BNP2-31、BNP3-31、BNP4-31、BNP5-31、BNP6-31、BNP7-31、BNP8-31、BNP9-31、BNP10-31、BNP1-30、BNP2-30、BNP3-30、BNP4-30、BNP5-30、BNP6-30、BNP7-30、BNP8-30、BNP9-30、BNP10-30、BNP1-29、BNP2-29、BNP3-29、BNP4-29、BNP5-29、BNP6-29、BNP7-29、BNP8-29、BNP9-29、BNP10-29、BNP1-28、BNP2-28、BNP3-28、BNP4-28、BNP5-28、BNP6-28、BNP7-28、BNP8-28、BNP9-28、BNP10-28、BNP1-27、BNP2-27、BNP3-27、BNP4-27、BNP5-27、BNP6-27、BNP7-27、BNP8-27、BNP9-27、BNP10-27、BNP1-26、BNP2-26、BNP3-26、BNP4-26、BNP5-26、BNP6-26、BNP7-26、BNP8-26或BNP9-26。

这些实施例的聚合物可以是各种长度和分子量。在一些实施例中，多肽形成无规卷曲结构。聚合物可以具有任何长度。在一些实施例中，聚合物长度小于200个氨基酸。在其它实施例中，聚合物长度为200至1000个氨基酸，包含200的倍数。每个200个氨基酸的生物聚合物单元赋予其所连接的分子约17kDa的计算分子量。也设想了在这些聚合物中使用经修饰的氨基酸或氨基酸模拟物。

这些经修饰的BNP实施例中的一些的聚合物包括由脯氨酸和丙氨酸残基以及任选地丝氨酸残基(PAS)组成的氨基酸。

在一些实施例中，聚合物包括以下氨基酸序列中的任一者或任何组合：

ASPAAPAPASPAAPAPSAPA(SEQ ID NO:2)，

AAPASPAPAAPSAPAPAAPS(SEQ ID NO:3)，

APSSPSPSAPSSPSPASPSS(SEQ ID NO:4)，

SAPSSPSPSAPSSPSPASPS(SEQ ID NO:5)，

SSPSAPSPSSPASPSPSSPA(SEQ ID NO:6)，

AASPAAPSAPPAAASPAAPSAPPA(SEQ ID NO:7)，

ASAAAPAAASAAASAPSAAA(SEQ ID NO:8)，

APAAPAPAPAAPAPAPA(SEQ ID NO:9)，

AAPAPAPAAPAPAPAAP(SEQ ID NO:10)，

APPPAPPPAP(SEQ ID NO:11)，

PAPPPAPPPA(SEQ ID NO:12)，

AAPAAPAPPAAAPAAPAPPA(SEQ ID NO:13)，

以及AAAAPAAAAAAAPAAA(SEQ ID NO:14)

或这些序列的作为这些序列的整体或部分排列或环状排列的版本或多聚体。

已经发现，在一些情况下，用脯氨酸终止聚合物有助于经修饰的BNP的后续纯化。因此，在各个实施例中，聚合物被脯氨酸终止。

特别有用的聚合物包括重复至少十次、至少二十次、至少三十次、至少四十次或更多次的SEQ ID NO:2，任选地被脯氨酸终止。在这些实施例的一些实施例中，聚合物在聚合物的额外丙氨酸处与BNP结合。在其它实施例中，额外丙氨酸用于终止聚合物序列。

一种或多种经修饰的BNP的PAS聚合物可以与BNP的N末端或C末端中的任一者或两者共价结合。另外地，或可替代地，一种或多种聚合物可以与二硫桥之外的BNP的任何氨基酸侧链残基，即SEQ ID NO:1的残基1、2、3、4、5、6、7、8、9、27、28、29、30、31或32中的任何残基结合。

在一些实施例中，经修饰的BNP包括插入在SEQ ID NO:1的残基1-9或27-32中的任何残基之间或取代其的半胱氨酸。在这些实施例中，半胱氨酸进一步包括聚合物。参见实例1。图4示出了经修饰的BNP的非限制性实例，其中半胱氨酸取代了BNP中的天然氨基酸，并且PAS聚合物与非天然半胱氨酸结合。可以使用本领域已知的各种接头中的任何接头将氨基酸聚合物与BNP衍生物中的游离半胱氨酸连接，所述接头包含衍生自经激活的碘乙酸(图4中的IA)的甲基羰基(IA)。

为了促进氨基酸聚合物与BNP的缀合，可以利用位于BNP与聚合物之间的接头。可以利用本领域已知的任何能够有助于此缀合的接头。在美国专利申请公开2011/0105397，例如在第135段以及其中引用的参考文献中提供了实例。在一些实施例中，接头部分是N-(乙基羰基)琥珀酰亚胺或甲基羰基。那些接头具有以下结构

本文所描述的经修饰的BNP可以包括任何数量的聚合物，包含1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种或13种聚合物。当经修饰的BNP上有多于一种的聚合物时，所述聚合物在组成和/或长度上可以相同或不同。

在一些实施例中，聚合物在BNP的N末端或C末端处。此类末端聚合物可以通过基因产生，例如，通过在DNA序列中用BNP编码聚合物并表达所述序列产生。因此，本文还提供了编码在N末端和/或C末端中的任一者或两者处都具有氨基酸聚合物的经修饰的BNP的核酸分子，以及包括所述核酸分子的载体。本文还提供了包括所述载体的细胞，包含能够表达所述经修饰的BNP的细胞。

本文所提供的特异性经修饰的BNP的非限制性实例包含P-(SEQ ID NO:2)₁₀-A-hBNP(1-32)(与N末端氨基连接的PAS)(以下实例中的化合物1)、P-(SEQ ID NO:2)₁₀-A-hBNP(3-32)(与N末端赖氨酸3的α氨基连接的PAS)(以下实例中的化合物2)、P-(SEQ ID NO:2)₁₀-A-hBNP(6-32)(与谷氨酰胺6的N末端连接的PAS)(以下实例中的化合物3)、hBNP(1-32)-(SEQ ID NO:2)₁₀-A(与C末端羧基连接的PAS)(以下实例中的化合物4)、hBNP(1-30)-(SEQID NO:2)₁₀-A(与C末端精氨酸30的羧基连接的PAS)(以下实例中的化合物5)、P-(SEQ IDNO:2)₂₀-A-hBNP(1-32)(与N末端氨基连接的PAS)、P-(SEQ ID NO:2)₂₀-A-hBNP(3-32)(与N末端赖氨酸3的α氨基连接的PAS)、P-(SEQ ID NO:2)₂₀-A-hBNP(6-32)(与谷氨酰胺6的N末端连接的PAS)、hBNP(1-32)-(SEQ ID NO:2)₂₀-A(与C末端羧基连接的PAS)、hBNP(1-30)-(SEQID NO:2)₂₀-A(与C末端精氨酸30的羧基连接的PAS)、P-(SEQ ID NO:2)₃₀-A-hBNP(1-32)(与N末端氨基连接的PAS)、P-(SEQ ID NO:2)₃₀-A-hBNP(3-32)(与N末端赖氨酸3的α氨基连接的PAS)、P-(SEQ ID NO:2)₃₀-A-hBNP(6-32)(与谷氨酰胺6的N末端连接的PAS)、hBNP(1-32)-(SEQ ID NO:2)₃₀-A(与C末端羧基连接的PAS)、hBNP(1-30)-(SEQ ID NO:2)₃₀-A(与C末端精氨酸30的羧基连接的PAS)、P-(SEQ ID NO:2)₄₀-A-hBNP(1-32)(与N末端氨基连接的PAS)、P-(SEQ ID NO:2)₄₀-A-hBNP(3-32)(与N末端赖氨酸3的α氨基连接的PAS)、P-(SEQ ID NO:2)₄₀-A-hBNP(6-32)(与谷氨酰胺6的N末端连接的PAS)、hBNP(1-32)-(SEQ ID NO:2)₄₀-A(与C末端羧基连接的PAS)或hBNP(1-30)-(SEQ ID NO:2)₄₀-A(与C末端精氨酸30的羧基连接的PAS)。

在一些实施例中，经修饰的BNP在上述细胞中产生。例如，用指导编码主题多肽的核苷酸序列的表达的核酸载体转染的宿主细胞可以在适当的条件下培养，以允许肽的表达发生。可以采集、裂解细胞并分离蛋白质。可以使用本领域已知的用于纯化蛋白质的技术从宿主细胞中分离重组BNP蛋白质，所述技术包含离子交换色谱法、凝胶过滤色谱法、超滤、电泳和用对此类蛋白质具有特异性的抗体进行的免疫亲和纯化。

药物制备和施用的方法

在一些实施例中，上文所描述的经修饰的BNP在药学上可接受的载剂中调配。这些组合物可以以治疗有效剂量向受试者施用，以治疗由NPR1活性介导的任何疾病、病症或医学病状。受试者可以是任何哺乳动物、爬行动物或鸟类，包含马、牛、狗、猫、羊、猪和鸡，以及人。

治疗有效剂量

此类组合物的毒性和治疗功效可以通过在细胞培养物或实验动物中测定LD₅₀(对50％群体致死的剂量)和ED₅₀(对50％群体治疗有效的剂量)的标准制药程序来测定。毒性作用与治疗作用之间的剂量比是可以表示为比率LD₅₀/ED₅₀的治疗指数。优选展现出大的治疗指数的组合物。虽然可以使用展现毒性副作用的组合物，但是应该注意设计将此类组合物靶向到受疾病或病症影响的部位的递送系统，以使对未受影响的细胞的潜在损伤最小化并减少副作用。

从细胞培养物测定和动物研究获得的数据可以用于调配用于人和其它哺乳动物的剂量范围。此类组合物的剂量优选地处于包含几乎没有或没有毒性的ED₅₀的循环血浆或其它体液浓度的范围内。剂量可以根据所采用的剂型和所利用的施用途径在此范围内变化。对于本发明的任何组合物，治疗有效剂量可以最初根据细胞培养物测定估计。可以在动物模型中调配剂量，以达到包含如在细胞培养物中测定的EC₅₀(达到半数最大效应的测试组合物的浓度)的循环血浆浓度范围。此类信息可以用于更准确地测定人和其它哺乳动物的有效剂量。可以例如通过高效液相色谱法来测量血浆中的组合物水平。

可以与药学上可接受的载剂组合以产生单一剂型的组合物的量将根据所治疗的宿主和特定施用模式而变化。本领域技术人员将理解，每个剂型的单独剂量中所含的组合物的单位含量本身不需要构成治疗有效量，因为必要的治疗有效量可以通过施用多个单独剂量来达到。剂量的选择取决于所利用的剂型、所治疗的疾病以及根据本领域技术人员的判断所要达到的特定目的。

用于根据多种因素选择用本发明的组合物和/或组合物组合治疗疾病或病状的剂量方案，所述因素包含患者的类型、年龄、体重、性别、饮食和医学病状、施用途径、药理学考虑，如所采用的特定组合物的活性、功效、药代动力学和毒理学概况、是否利用组合物递送系统以及组合物是否作为前药或药物组合的一部分施用。因此，实际采用的剂量方案可能因受试者而异。

调配物和用途

本发明的组合物可以通过已知的方法调配，用于使用若干种途径向受试者施用，所述途径包含但不限于胃肠外、口服、局部、皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外、吸入和眼部途径。单独的组合物还可以与本发明的一种或多种另外的组合物和/或与其它生物活性或生物惰性剂一起组合施用(“组合物组合”)。此类生物活性或惰性剂可以与组合物流体或机械连通，或者通过离子、共价、范德华力(Van der Waals)、疏水、亲水或其它物理力与组合物连接。优选在受试者体内局部施用，但也可以全身施用。

组合物或组合物组合可以通过任何常规方式使用一种或多种药学上可接受的载剂和/或赋形剂来调配。因此，组合物和其药学上可接受的盐和溶剂化物可以被特别调配以用于施用，例如通过肠胃外、吸入或吹入(通过口或鼻)或口服、口腔、肠胃外或直肠施用。组合物或组合物组合可以采取带电、中性和/或其它药学上可接受的盐形式。药学上可接受的载剂的实例包含但不限于在《雷明顿药物科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)》(A.R.Gennaro编辑),第20版,美国宾夕法尼亚州威廉姆斯和威尔金斯出版社(Williams&Wilkins PA,USA)(2000)中所描述的那些。

组合物还可以采取溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、粉末、控释或缓释调配物等形式。此类组合物将含有治疗有效量的组合物，优选地呈纯化形式，连同合适的量的载剂，以便提供适当的向患者施用的形式。调配物应适合施用模式。

肠胃外施用

组合物或组合物组合可以被调配用于通过注射，例如通过团注注射或连续输注进行肠胃外施用。用于注射的调配物可以以安瓿或多剂量容器中的单位剂量存在，并添加任选的防腐剂。可以将肠胃外制剂封装在由玻璃、塑料等制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。组合物可以采用如以下形式：在油性或水性媒剂中的悬浮液、溶液或乳液，并且可以含有调配剂，如助悬剂、稳定剂和/或分散剂。

例如，肠胃外制剂可以是在无毒肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液(例如，在1,3-丁二醇中的溶液)。可以采用的可接受的媒剂和溶剂是水、林格氏溶液(Ringer's solution)和等渗氯化钠溶液。另外，无菌的不挥发性油常规被用作溶剂或悬浮介质。出于此目的，可以采用包含合成的甘油单酯或甘油二酯的任何温和的不挥发性油。另外，如油酸等脂肪酸可以用于肠胃外制剂。

可替代地，组合物可以呈粉末形式，以便在使用前用合适的媒剂，如无菌无热原水一起构成。例如，适合于肠胃外施用的组合物可以包括含有每体积组合物或组合物组合介于0.1重量％至90重量％之间的无菌等渗盐水溶液。举例来说，溶液可以含有组合物的约5％至约20％，更优选的约5％至约17％，更优选地约8％至约14％，以及仍更优选地约10％。溶液或粉末制剂还可以包含增溶剂和如利多卡因(lignocaine)等局部麻醉剂，以减轻注射部位的疼痛。本领域技术人员将知道组合物的其它胃肠外递送方法，并且这些方法也在本发明的范围内。

其它施用系统

各种其它递送系统是本领域已知的，并且可以用于施用本发明的组合物。此外，这些和其它递送系统可以组合和/或修改以优化本发明的组合物的施用。在一些实施例中，调配物可以被气溶胶化。

活性成分试剂盒

在各个实施例中，本发明还可以涉及试剂盒。此类试剂盒可以包含本发明的组合物，并且在某些实施例中，还包含施用说明。当作为试剂盒供应时，组合物的不同组分可以包装在单独的容器中并且在使用之前立即混合。如果期望，此类组分的单独包装可以存在于包装或分配器装置中，所述包装或分配器装置可以含有一个或多个含有组合物的单位剂型。包装可以例如包括金属或塑料箔，如泡罩包装。在某些情况下，此类组分的单独包装还可以允许长期储存而不损失组分的活性。另外，如果打算采用多于一种的施用途径或打算采用多于一种的施用方案，不同的组分可以单独包装，并且在使用前不要混合。在各个实施例中，不同的组分可以包装在一种组合物中，用于一起施用。

试剂盒还可以包含单独容器中的试剂，例如待添加到单独包装的冻干活性组分中的无菌水或盐水。例如，密封的玻璃安瓿可以含有冻干磷酸酶，并且在单独的安瓿中含有无菌水、无菌盐水或无菌溶液，所述无菌水、无菌盐水或无菌溶液中的每一种都已经在中性非反应气体如氮气下包装。安瓿可以由任何合适的材料，如玻璃、有机聚合物，如聚碳酸酯、聚苯乙烯、陶瓷、金属或通常用于容纳试剂的任何其它材料组成。合适的容器的其它实例包含可以由与安瓿类似的物质制造的瓶子，以及可以由如铝或合金等箔衬里的内部组成的封套。其它容器包含试管、小瓶、烧瓶、瓶子、注射器等。容器可以具有无菌进入口，如具有可以通过皮下注射针刺穿的塞子的瓶子。其它容器可以具有两个隔室，所述两个隔室由可容易去除的膜分开，所述膜在去除时允许组分混合。可去除的膜可以是玻璃、塑料、橡胶等。

在某些实施例中，试剂盒可以供应有说明材料。说明可以印刷在纸或其他基材上，和/或可以作为电子可读介质，如拇指驱动器、CD-ROM、DVD-ROM、视频、音频等供应。详细的说明可能与试剂盒没有物理关联；相反，用户可以被引导到由试剂盒的制造商或经销商指定的互联网网站。

治疗方法

还提供了一种治疗患有或被诊断患有可以用利钠剂、利尿剂或血管舒张剂治疗的疾病、病症或医学病状，包含纤维化或炎性疾病的受试者的方法。所述方法包括向需要此类治疗的受试者施用治疗有效量的任何上文所描述的经修饰的BNP。

在一些实施例中，所述疾病、病症或医学病状是血液病、神经系统疾病、发育性疾病、泌尿系统疾病、生殖障碍、精神障碍、癌症、自身免疫性疾病、纤维变性疾病、炎性疾病、神经退行性疾病、感染性疾病、肺病、心脏病、血管疾病或代谢性疾病。

在这些实施例中的一些实施例中，所述疾病、病症或医学病状是焦虑、抑郁、创伤后应激障碍、肥胖、外周作用炎性肠病、肠易激综合征、应激应答、睡眠障碍、成瘾行为、急性和慢性神经退行性病变、早产或疼痛、自身免疫性病症中的血管炎和/或过度血管生成、系统性硬化症、多发性硬化症、斯耶格伦氏病(Sjogren's disease)、血管和/或淋巴管中的血管畸形、左心室肥大、门静脉高压症、肝腹水、肺动脉高压症、特发性肺动脉高压症、心房高压症、慢性阻塞性肺病、特发性肺纤维化、肺纤维化、迪乔治综合征(DiGeorge syndrome)、遗传性出血性毛细血管扩张症、海绵状血管瘤、皮肤血管瘤、淋巴畸形、移植腺病、动脉粥样硬化、血管吻合、肥胖症中的脂肪组织、同种异体移植排斥、皮肤病、银屑病、疣、过敏性皮炎、瘢痕疙瘩、化脓性肉芽肿、水泡病(blistering disease)、AIDS患者中的卡波西肉瘤、系统性硬化症、眼病、持续性增生性玻璃体综合征、糖尿病性视网膜病、早产儿视网膜病变、脉络膜血管新生、肺动脉高压症、哮喘、鼻息肉、鼻炎、慢性气道炎症和梗阻、囊性纤维化、急性肺损伤、闭塞性细支气管炎机化性肺炎、胃肠道疾病、炎性肠病、牙周病、腹水、腹膜粘连、肝硬化、生殖系统疾病、子宫内膜异位症、子宫出血、卵巢囊肿、卵巢过度刺激、骨或关节疾病、关节炎、滑膜炎、骨髓炎、骨赘形成、HIV诱导的骨髓血管生成、肾病或早期糖尿病性肾病。

如上文所讨论的，组合物可以通过本领域已知的任何适当的方法施用。在一些实施例中，通过注射施用。在其它实施例中，经修饰的BNP被气溶胶化并通过吸入施用。

制备方法

上述组合物可以通过本领域已知的任何适当的方法制备。当聚合物位于BNP的N末端或C末端处时，包括编码经修饰的BNP的载体的上述细胞可以表达经修饰的BNP。当聚合物与BNP的一个或多个氨基酸残基缀合时，可以通过溶液或固相技术产生经修饰的BNP，然后使用化学方法共价连接聚合物。此类技术和方法在本领域中是熟知的。

在以下实施例中描述了优选的实施例。考虑到如本文所公开的本发明的说明书或实践，本文权利要求范围内的其它实施例对本领域技术人员来说将是显而易见的。说明书连同实例仅旨在被认为是示例性的，而本发明的范围和精神由实例后的权利要求书来表示。

PAS化的ANP和尿扩张素的功用

本文所提供的组合物和方法可以应用于ANP和尿扩张素，以制备保留天然ANP和尿扩张素的生物活性的PAS化的ANP和尿扩张素。

实例

实例1-BNP衍生物合成

BNP 1-32衍生物通过固相或液相化学或两者的混合物获得。由于分子中具有两个形成二硫桥所需的半胱氨酸，以及连接PAS部分的其它半胱氨酸，所以使用了正交保护基团策略。可以使用其它化学合成技术来实现正交保护基团策略。

PAS基团本身是通过重组方法制备的。分离重组产物，然后在其N末端，通常在丙氨酸残基处用能够与BNP衍生物中的游离半胱氨酸硫醇反应的连接试剂进行衍生。所使用的接头是甲基羰基(图4中的IA)或N-(乙基羰基)琥珀酰亚胺。当将IA用作由脯氨酸和丙氨酸或脯氨酸、丙氨酸和丝氨酸的适当序列组成的接头试剂时，H₂OC-(Pro/Ala)-Ala-NHCOCH₂I或H₂OC-(Pro/Ala/Ser)-Ala-NHCOCH₂I通过与羧基激活的碘乙酸反应由PAS制备。然后，这些PAS化试剂依次与BNP衍生物中的游离半胱氨酸硫醇反应，以获得PAS化的肽。例如，残基1可以从S突变为C；残基3可以从K突变为C；残基4可以从M突变为C；残基5可以从V突变为C；残基6可以从Q突变为C；并且残基8可以从S突变为C。

PAS化导致(A)BNP的肾脏过滤延迟，而：(B)确定N末端是否有任何侧链在赋予受体对激素的亲和力方面不是必需的，以及(C)抑制蛋白水解酶促切割(这很容易延长半衰期)。

本领域技术人员将认识到，可以利用PAS化BNP蛋白的其它方法，所述方法包含通过修饰BNP蛋白的C末端的化学，或通过与PAS序列或聚合物在N末端或C末端遗传融合的BNP的异源基因表达。

实例2-BNP的PAS化

编码人BNP的氨基酸1-32(化合物1和4)、3-32(化合物2)、6-32(化合物3)或1-30(化合物5)的合成DNA片段从赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)(德国雷根斯堡(Regensburg，Germany))获得。化合物1至3(SEQ ID NO:21、22、23)的基因片段包括NdeI限制位点，随后是CCT脯氨酸密码子、GCC丙氨酸密码子、非编码链上的第一SapI识别序列GCTCTTC、8-核苷酸间隔子和具有在编码链上的识别序列GCTCTTC的反向的第二SapI限制序列，随后是GCC丙氨酸密码子和人BNP(或其片段)的编码序列，最后是HindIII限制位点。化合物4和5(SEQ ID NO:24、25)的基因片段上的编码要素的顺序如下：NdeI限制位点、人BNP(或其片段)的编码序列、GCC丙氨酸密码子、非编码链上的第一SapI识别序列GCTCTTC、8-核苷酸间隔子和具有在编码链上的识别序列GCTCTTC的反向的第二SapI限制序列，随后是GCC丙氨酸密码子和TAA终止密码子。

为了在表达质粒pD451-SR(加利福尼亚州纽瓦克的ATUM公司(ATUM,Newark,CA))上克隆BNP DNA构建体，载体上的原始SapI克隆位点被包括NdeI和HindIII识别位点的序列取代。为此，将载体用XbaI和StyI消化，并且其主链与一对双链合成的寡核苷酸重新连接，所述寡核苷酸包括核糖体结合位点(RBS)、NdeI位点、HindIII位点和与XbaI和StyI位点相容的侧接粘性端。

然后根据标准程序(Sambrook(2012)《分子克隆：实验室手册(MolecularCloning:A Laboratory Manual)》,冷泉港实验室出版社(Cold Spring HarborLaboratory Press)，通过限制位点NdeI和HindIII将BNP基因片段插入到经修饰的pD451-SR载体中。随后，将每个所得质粒用SapI消化，这导致释放出小的(27bp)DNA插入，所述DNA插入含有作为上文所描述的合成DNA片段一部分的一对SapI识别位点和载体主链，所述载体主链直接在BNP的编码的N末端(化合物1-3)的上游或C末端(化合物4和5)的下游的位置处具有相容的5'-GCC/5'-GGC粘性端。这种策略非常适合于插入编码富含脯氨酸/丙氨酸的氨基酸重复序列的低重复核酸分子。在使用Wizard凝胶提取试剂盒(德国曼海姆市的普洛麦格公司(Promega,Mannheim,Germany))分离所述载体片段并用热敏碱性磷酸酶FastAP(马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA))去磷酸化后，将其与先前克隆的携带相容突出端的PAS#1.2(200)基因盒(SEQ ID NO:26)连接，如(WO 2017/109087 A1)所描述。所得质粒允许细菌使用相同读框表达融合蛋白，所述融合蛋白包括在N末端或C末端与生物活性BNP肽(或其片段)融合的PAS序列。

用下列表达质粒中的一个转化感受态大肠杆菌(E.coli)T7表达细胞(马萨诸塞州伊普斯维奇的新英格兰生物实验室(New England Biolabs,Ipswich,MA))：化合物1的pD451-SR-PAS200-BNP32(SEQ ID NO:27)、化合物2的pD451-SR-PAS200-BNP(3-32)(SEQ IDNO:28)，化合物3的pD451-SR-PAS200-BNP(6-32)(SEQ ID NO:29)、化合物4的pD451-SR-BNP32-PAS200(SEQ ID NO:30)、化合物5的pD451-SR-BNP(1-30)-PAS200(SEQ ID NO:31)。含有补充有卡那霉素(kanamycin)(30mg/l)的50mL TB培养基(德国卡尔斯鲁厄的卡尔罗斯公司(Carl Roth,Karlruhe,Germany))的锥形瓶为每次转化接种一个单菌落，并在37℃下温育过夜。10ml的此预培养物用于接种含有2LTB培养基(具有30mg/l卡那霉素)的摇瓶。在30℃下温育16小时并达到约3的光密度(OD₆₀₀)后，通过向培养物中添加1mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)来诱导重组基因表达。通过离心(6,000rpm，25分钟，4℃)在诱导后4小时采集大肠杆菌细胞，并将细胞沉淀物(每个摇瓶约10g)在-20℃下冷冻。

通过添加0.15％(v/v)15-S-9型tergitol(密苏里州圣路易斯的西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO))、鸡蛋清溶菌酶(4mg/10g沉淀物；西格玛奥德里奇公司)、Cyanase核酸酶(250U/10g沉淀物；德国海德尔堡的SERVA电泳公司(SERVAElectrophoresis,Heidelberg,Germany))和40μM MgCl₂将沉淀物重新悬浮在100mM Tris/HCl pH 8.5(4.4vol.)中后，进行细胞裂解。将裂解混合物在冰上温育2小时后，通过离心(39,000x g，1.5小时，4℃)从细胞碎片中分离可溶性级分。将清除的上清液经受硫酸铵沉淀(在室温下30％饱和)，并将沉淀物在补充有1mM EDTA的25mM硼酸钠缓冲液(pH 9.5)中重新溶解。将残余的硫酸铵通过对硼酸盐缓冲液进行透析来去除。

将所得蛋白提取物在Fractogel EMD TMAE(S)柱(德国达姆施塔特的默克公司(Merck，Darmstadt，Germany))上经受减材阴离子交换色谱法，随后在Fractogel EMD SO₃ ^-(S)柱(默克公司)上经受阳离子交换色谱(结合模式)。通过在硼酸盐缓冲液中施加0-500mM的NaCl梯度将PAS200-BNP融合蛋白从此柱中洗脱(参见上文)。通过SDS-PAGE分析洗脱液级分，视情况池化并用超纯水进行透析。将无盐PAS200-BNP32冻干，从而得到如通过重量分析所测定的每2l摇瓶培养物5-10mg的产率。

经纯化的化合物1的ESI-MS分析(图15B)揭示了对应于具有正确形成的分子内二硫桥(20150.7Da)的PAS200-BNP32的预期质量的单个质量峰，也指示了经切割的start-Met。质谱未揭示潜在二硫化物连接的PAS200-BNP二聚体的暗示或蛋白水解降解的迹象。在用磷酸盐缓冲盐水(PBS)作为运行缓冲液的Superose 6增加10/300柱(瑞典乌普萨拉的思拓凡公司(Cytiva,Uppsala,Sweden))上的分析尺寸排阻色谱法(SEC)中，PAS化的BNP在16.5ml体积的单峰中作为单分散大分子洗脱(图15A)，从而表明是均匀的多肽制剂。用已知分子量的球状蛋白校准柱，能够测定出PAS化的BNP的表观分子量为93kDa。这种升高的表观分子量是由于PAS部分的无规卷曲性质引起的，这导致流体力学体积的显著增加。

实例3-BNP的施用

研究目的

研究确定，在患有局部缺血诱导的、进行性的、不可逆的心力衰竭的狗中，用诱导的无规卷曲的BNP蛋白进行长期(3个月)治疗与以下因素相关联：(1)保持和/或改善LV结构和功能；(2)心肌损伤的生物标志物没有变化或长期减少；以及(3)与安慰剂(媒剂)相比，不存在显著的新发室性心律失常或恶性心律失常的易感性增加。还请参见实例6。

研究方案

研究分析了24只狗因多次连续冠状动脉内微栓塞(LV射血分数≤25％)而导致的晚期心力衰竭(HF)(1)。狗被随机分成3个研究组。第I组(n＝8只)接受皮下媒剂注射，持续3个月，同时充当安慰剂对照。第II组(n＝8只)接受具有BNP衍生物(0.1mg/kg，Q5d)的慢性疗法，持续3个月。第III组(n＝8只)接受具有BNP衍生物(0.3mg/kg，Q5d)的慢性疗法，持续3个月。所有给药均在一天的同一时间在20cm x 24cm的区域上进行：在动物颈部的前肩胛背区域(颈背)上剃掉的20cm x 24cm区域内，六(6)个区被勾勒出轮廓，每个区的中心相距12cm。将区按照概述进行编号，并且其中注射顺序是区1、5、3、6、2、4。血液动力学、血管造影和超声心动图测量在全身麻醉下的左心和右心导管插入术中进行。在基线、安慰剂媒剂或BNP衍生物注射前7天、第一次(第1次)BNP衍生物注射后24小时、第三次(第3次)BNP衍生物注射后24小时(第10天)、第五次(第5次)BNP衍生物注射后24小时(第20天)、第七次(第7次)BNP衍生物注射后24小时(第30天)、第十二次(第12次)BNP衍生物注射后24小时(第60天)和第十八次(第18次)BNP衍生物注射后24小时(第90天)进行左心和右心导管插入术。在第90天进行血液动力学和心室造影测量后，迅速打开胸腔，并迅速取出0.5-1.0g左心室切片，并用液氮冷却的Wollenberger钳夹快速冷冻，用于心肌环磷酸鸟苷(cGMP)分析。还分析了血浆中cGMP的水平。然后取出用于组织形态测量、心肌受体和离子通道测量以及RNA基因芯片分析的样品。在每一次心脏导管插入术和超声心动图测量之前，在一天的同一时间在清醒的狗中获得静脉血液样品，包含第7天、第0-16天、第22天、第30天、第38天、第45天、第53天、第60天、第68天、第75天、第83天和第90天获得静脉血液样品。将血液样品(至少9mL-3x3ml)收集在含有EDTA和全蛋白酶抑制剂(罗氏生物科学公司(Roche Biosciences))的塑料管中。根据溶解在2ml生理盐水中的1片全蛋白酶抑制剂片剂的以下组合物的储备溶液，每个EDTA血液收集管，每ml全血含有40μL的全蛋白酶抑制剂。用EDTA和蛋白酶抑制剂收集全血液样品。将用EDTA和蛋白酶抑制剂收集的全血液样品立即置于冰上，并在收集的30分钟内以3000rpm离心，持续10分钟。将血浆(i)置于冷冻保存管中；以及(ii)在-70℃下直立储存直至分析，以确定LANA血浆浓度。将给药溶液样品(2mL)置于冷冻保存管中，并在-70℃下直立储存。在基线和每次心脏导管插入术结束时抽取单独的静脉血液样品(血清)，用于测定血清电解质，包含肌酐，以估计肾小球滤过率(eGFR)。在基线和每次心脏导管插入术结束时收集静脉血液，以用于血浆生物标志物。在每次心脏导管插入术之前，每月测量一次狗的体重。

血液动力学和血管造影测量

所有血液动力学测量都是在经麻醉的狗的左心和右心导管插入术期间，在每个指定的研究时间点进行的。在所有狗中评估以下参数：(1)使用导管尖端微压计(Millar仪器)的主动脉和LV压力；(2)在等容收缩(峰值+dP/dt)和舒张(峰值-dP/dt)期间LV压力的峰值变化率；(3)LV末期舒张压；(4)心脏输出量；(5)每搏输出量；(6)心脏指数；以及(7)全身血管阻力。

完成血液动力学测量后，在心脏导管插入术期间对狗进行左心室造影(LV)。将狗置于其右侧，使得在20mL的造影剂的动力注射期间，左心室造影以30帧/秒的速度记录在数字介质上(RENO M 60，Squibb诊断)。使用位于LV水平下的不透射线的网格进行图像放大的校正。LV收缩末期和舒张末期体积通过血管造影轮廓使用面积长度法计算。从分析中排除了过早搏动和期外收缩后搏动。将LV射血分数计算为舒张末期(EDI)和收缩末期(ESY)体积之差与舒张末期体积之比乘以100。

LV射血分数＝[(体积EDI-体积ESY)/体积ED]x 100

超声心动图和多普勒测量

使用具有3.5兆赫(MHz)转导器的VIVID 7超声系统(通用电气公司(GeneralElectric))在所有指定的研究时间点对所有狗进行超声心动图和多普勒研究。所有超声心动图测量都是在狗处于右侧卧位的情况下进行的，并记录在松下公司(Panasonic)6300VHS记录仪上，以供后续离线分析。

LV缩短面积分数(FAS)和LV收缩功能从乳头肌水平的短轴线视图中进行测量。测量LV长半轴线和短半轴线，并用于计算LV舒张末期周壁应力。

壁应力的计算如下文所指示的：

壁应力＝Pb/h(1-h/2b)(1-hb/2a2)

其中：p是LV舒张末期压力，a是LV长半轴线，b是LV短半轴线，h是LV壁厚度。

整体纵向应变(GLS)通过斑点追踪测量。

通过脉冲波多普勒超声心动图测量二尖瓣流入速度，以评估LV舒张功能。速度波形用于计算：(i)早期舒张的峰值二尖瓣流速(PE)；(ii)在LA收缩期间的峰值二尖瓣流入速度(PA)；(iii)PE与PA的比率(PE/PA)；(iv)代表早期充盈的二尖瓣流入速度波形的时间-速度积分(Ei)，(v)代表LA收缩的时间-速度积分(Ai)；(vi)Ei/Ai的比率(Ei/Ai)；以及(vii)早期二尖瓣流入速度的减速时间(DT)。彩色血流多普勒评估功能二尖瓣回流(即回流喷射)的存在和严重程度。当存在回流时，所述回流的严重程度被定量为回流喷射面积与左心房面积的比率。

如在所有预先指定的时间点(基线、第1天、第2天、第14天、第30天、第60天和第90天)进行的24小时动态ECG动态心电图监测(Holter monitoring)可评估：(1)峰值；(2)平均和最低心率；以及(3a)每小时单个过早搏动(PVC)的平均数量，(3b)成对过早搏动，(3c)三联过早搏动以及(3c)室性心动过速(VT)发作(>3次搏动)。非持续性VT的发作被定义为持续时间少于30秒的发作。持续超过30秒的发作被定义为“持续性VT”。

循环血浆生物标志物

在基线处和每个随访时间点(在基线处和每次心脏导管插入术后)获得的静脉血液样品，对以下血浆生物标志物进行定量：(1)肌钙蛋白-I；(2)肌红蛋白；(3)大内皮素(大ET)；(4)血管紧张素-II(ANG II)；(5)去甲肾上腺素(NE)；(6)N-末端pro-BNP(NT-pro-BNP)；(7)心房利钠肽(proANP)；(8)肿瘤坏死因子-α(TNF-α)；(9)白介素-6(IL-6)；(10)C-反应蛋白(CRP)；(11)1型前胶原C末端前肽(PICP)；(12)CK-MB以及(13)环磷酸鸟苷(cGMP)。比较6只正常狗的血液样品。

组织形态测量

从每个心获得3个横向切片(大约3mm厚)，此类横向切片在LV的基部、中间和顶端三分之一处各有一个。从每个切片中获取透壁组织块，并将其包埋在石蜡块中。从切片的游离壁区段获得的透壁组织块为：(i)使用组织-Tek包埋介质固定在软木塞上；(ii)在液氮中在预冷却的异戊烷中快速冷冻；以及(iii)储存在-70℃在直至用完。如前所述测量置换纤维化的体积分数(VFRF)、间质纤维化的体积分数(VFIF)、肌细胞横截面积(MCSA)、心肌细胞肥大的量度、毛细血管密度(CD)和氧扩散距离(ODD)。以与上述相同的方式处理来自6只正常狗的LV组织，并将结果用于比较。

心肌受体和离子通道测量

从每个心脏中，快速取出约1-5g的LV前游离壁，解剖，并在-80℃快速冷冻，用于放射性配体结合。β肾上腺素受体和肌浆网钙释放通道的密度和亲和力通过分析[³H]-二氢阿普洛尔(dihydroalprenolol)和[³H]-理阿诺碱(ryanodine)与富集的肌纤维膜和肌浆网膜的特异性结合的饱和等温线来定量。

RNA基因芯片分析

用于本文的组合物和方法的RNA基因芯片分析涉及：表达谱、采集的样品、处理组和组织。由此每只猎犬有两个样品(1个用于RNA，1个用于蛋白质)，并且将组织随后保存在RNA中，其中一半保存在-70℃下用于蛋白质。

用于收集的方法

对5mm³的切片进行解剖，随后进行RNALater冲洗，并储存在经标记的1.5mL聚丙烯艾本德管(Eppendorf tube)中的1-mL RNALater中。血管组织(动脉或静脉)以1cm长度收集。

一旦分析了上述数据，就将其与从天然BNP施用和PEG化的BNP施用获得的数据进行比较。预期BNP蛋白的半衰期延长，而没有PEG化产生的不希望的免疫原性特性。

实例4和5的概述

实例4和5描述了评估以下五种PAS化的BNP的生物活性的研究：通过本领域技术人员熟知的重组方法制备了PAS化的化合物1至5，并在图5中进行了说明。化合物1是P-(SEQID NO:2)₁₀-A-hBNP(1-32)(与N末端氨基连接的PAS)。化合物2是P-(SEQ ID NO:2)₁₀-A-hBNP(3-32)(与N末端赖氨酸3的α氨基连接的PAS)。化合物3是P-(SEQ ID NO:2)₁₀-A-hBNP(6-32)(与谷氨酰胺6的N末端连接的PAS)。化合物4是hBNP(1-32)-(SEQ ID NO:2)₁₀-A(与C末端羧基连接的PAS)。化合物5是hBNP(1-30)-(SEQ ID NO:2)₁₀-A(与C末端精氨酸30的羧基连接的PAS)。

实例4.PAS化的BNP的NPR1激动剂活性

此研究的目的是通过用TR-FRET检测cGMP水平来评估测试化合物在激动剂模式下对hNPR1(BNP的膜结合鸟苷酸环化酶受体)的潜在功能作用。

材料

仪器和耗材

细胞系信息

实验程序

瞬时转染

转染前一天，采集细胞，使用Countess细胞计数器计数密度和活力。仅有活力>85％的细胞用于以下分析。将细胞以9.75x 10⁵个细胞/皿的密度接种在6-cm皿中，并在37℃、5％(v/v)CO₂下培养过夜。第二天，丢弃生长培养基，并向每个孔中添加3ml的Opti-MEMI减少血清培养基。

制备以下DNA/FuGENE 6试剂混合物：

在室温下温育15分钟后，将混合物添加到细胞中，并在37℃下在含有5％(v/v)CO₂的湿润气氛中培养6小时。然后用完全培养基(补充有10％FBS和100U/ml Pen-Strep的F12培养基)替换该培养基，并在使用前在37℃下在具有5％(v/v)CO₂的湿润气氛中培养。

平板接种细胞

转染后24小时丢弃生长培养基，将细胞用PBS洗涤一次。然后添加适量的TrypLE，并与细胞在37℃下温育5分钟。当细胞的形态转变时，添加完全生长培养基以停止反应。然后将细胞转移到无菌的15ml离心管中，并以1200rpm离心5分钟。丢弃上清液，并将细胞沉淀重新悬浮在完全生长培养基中。使用Countess细胞计数器对细胞进行计数。仅有活力>85％的细胞用于以下分析。使用完全生长培养基稀释细胞，将所述细胞以12000个细胞/孔的密度转移到聚-L-赖氨酸包被的384孔板中。然后将细胞在37℃下在具有5％(v/v)CO₂的湿润气氛中培养过夜。

激动剂分析

将参考化合物人BNP和测试化合物溶解在ddH₂O中以制备100μM储备溶液。丢弃生长培养基，并将细胞用40μl的HBSS缓冲液(具有Ca²⁺和Mg²⁺)洗涤一次。向每个孔中加添加补充有0.5mM IBMX的10μl HBSS缓冲液(具有Ca²⁺和Mg²⁺)，然后在37℃下温育15分钟。使用Echo 550将10nL的3倍系列稀释化合物从源板转移到384孔板。对于参考化合物，通过转移300nL、100nL和30nL的100μM储备溶液来制备前三个浓度。对于测试化合物，通过转移1000nL、300nL、100nL和30nL的100μM储备溶液来制备前四个浓度。将板以1000rpm离心1分钟，并以600rpm搅拌。将板在37℃下温育20分钟。将五个5μl/孔的cGMP-d2工作溶液和5μl/孔的抗cGMP-Eu³⁺穴状工作溶液添加到板的每个孔中。然后将板以1000rpm离心1分钟，并以600rpm搅拌，然后在25℃下温育1小时。

用EnVison微板酶标仪(λex＝320nm，λem＝615nm和665nm)读取平板，并针对化合物的浓度绘制激活％以构建剂量应答曲线。曲线用于计算EC₅₀值。使用标准化等式将结果表示为激活％：N＝100-100×(U-C2)/(C1-C2)，其中U是未知值，C1是高对照平均值，并且C2是低对照平均值。通过使用GraphPad PrismTM软件将随化合物浓度变化的激活百分比拟合到四参数通用逻辑函数，来确定下限和上限渐近线、中点斜率和效力(EC₅₀)。

结果

结果的图在图9中提供。

每个PAS化的BNP的结果在下表中示出：

讨论

此实施例确定了PAS化的BNP对人NPR1具有激动剂活性。

实例5.hBNP(1-32)和化合物1在卡巴胆碱(carbachol)预收缩的分离的豚鼠气管环中的效力评估

方法

所有动物均接受标准的住房和饲养，并随意提供水和食物。将雄性白化豚鼠(顿金哈德莱(Dunkin-Hartley)；400-700g；荷兰霍斯特的Envigo公司(Envigo,Horst,NL))通过吸入CO₂，随后通过放血而被处死。将气管从周围的结缔组织中轻轻切开，切成八个等长的完整环，每个环含有两至三个软骨环，并将所述软骨环置于5mL含有Krebs-Ringer PSS(2.5mM CaCl₂)的组织器官浴中，并在37℃下保持，不断用充氧剂(含5％CO₂的O₂)鼓泡以将pH保持在7.4。

在将静止力缓慢调节至30mN后，通过等距转导器连续测量张力(mN)。作为豚鼠气管反应性的对照，累积添加组胺(0.1nM至0.3mM)。在药理学研究之前，添加吲哚美辛(indomethacin)(3μM)以放置前列腺素的释放和可能的干扰。在30分钟的静止期后，用3nM的毒蕈碱激动剂卡巴胆碱收缩区段，以产生最大收缩的约50-75％的稳定的预收缩。当收缩应答达到稳定期时，通过在每种激动剂的0.5log单位剂量间隔(0.1nM-1μM)处累积添加hBNP(1-32)或化合物1，在每个环中获得舒张浓度应答曲线，通过跨器官浴和实验运行的分配进行随机化。相对于对卡巴胆碱的初始收缩应答，将应答表示为张力降低的百分比。这些实验以罂粟碱(papaverine)(0.1mM)和硝普钠(sodium nitroprusside)(0.1mM)的浓度组合结束，以确定最大舒张。

计算和统计

所有数据均以平均值±S.E.M.表示。通过非线性回归将数据拟合到3参数一般逻辑，以计算效力(pEC₅₀)、中点斜率和上限渐近线值。使用GraphPad Prism 8.2.1软件(美国加利福尼亚州圣地亚哥的GraphPad软件公司(GraphPad Software Inc.,San Diego,CA,U.S.A.))使用不成对t-检验进行统计分析，以用于两组之间的比较。p值<0.05被认为是显著的。

药品和供应商

根据制造商和供货商的说明制备储备溶液和稀释液。NaHC0₃、CaCl₂和KCl或自VWR(美国宾夕法尼亚州西切斯特(West Chester,PA,U.S.A.))。二盐酸组胺、卡巴胆碱、罂粟碱、硝普钠、Krebs-Henseleit PSS缓冲液、吲哚美辛和人脑利钠肽hBNP(1-32)购自西格玛奥德里奇公司(美国密苏里州圣路易斯)。将所有储备溶液均储存在-20℃下。每次实验前，在降低其溶剂浓度(Krebs-Ringer PSS)时，从储备液新鲜制备药物的稀释液。

结果

在豚鼠气管区段中，3nM卡巴胆碱诱导了稳定的预收缩，其中在实验时间过程期间最大收缩损失为4±6％(图10)。hBNP(1-32)和化合物1在预收缩的顶部的累积施用诱导平行浓度依赖性舒张(斜率值：分别为1.3±0.1和1.3±0.3)，具有相似的最大效果(Emax：分别为91±4％和90±3％)。hBNP(1-32)的效力(pEC₅₀：8.00±0.10)是化合物1(pEC₅₀：6.79±0.05；p<0.0001)的效力的16倍(16.3±1.3)。

讨论

此实施例进一步证实了PAS化的BNP在生理组织中保留了BNP生物活性。

实例6.比格犬皮下和静脉内施用后化合物1的单剂量药代动力学/药效学研究

此研究的目的是在比格犬中皮下和静脉内施用单剂量化合物1后，确定化合物1在6天内的药代动力学/药效学(PKPD)概况。

研究设计

将化合物1溶解在磷酸盐缓冲盐水中，静脉给药的浓度为0.4mg/ml，并且皮下给药的浓度为1.8mg/kg。第1组接受0.5mL/kg剂量的磷酸盐缓冲盐水的皮下团注。第2组接受体积为0.5mL/kg的0.9mg/kg化合物1的皮下团注剂量。第3组接受体积为0.5mL/kg的0.2mg/kg化合物1的静脉内团注剂量。每组有三只雄性动物。

在体重分层基础上对动物进行随机化，以便在随机化后实现各组间体重的比较分布(在平均体重值的±20％内；整体单独体重范围8-13kg)。单只动物的绝对剂量体积是基于动物最近记录的体重计算的。

所有动物均通过手术植入有遥测发射器，用于在给药后的第一个24小时内使用EMKA遥测系统、IOX2软件和BP-2010E无创血压(NIBP)监测仪连续记录动脉血压和心率。给药24小时后，每隔24小时通过袖带测压法测量血压和心率(第3-6天)。

在所有三个处理组的以下时间点抽取血液样品：给药前(-10分钟)、10分钟、30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、6小时、8小时、12小时、16小时、24小时、48小时、72小时、96小时、120小时和144小时(给药后)。在每个时间点通过静脉穿刺从每只动物收集0.5mL样品，并置于经钾(K₂)EDTA处理的试管中，将管塞住并轻轻倒置若干次以确保抗凝。在4℃下以大约2,000g离心10分钟以允许提取血浆之前，将其在冰上储存最多60分钟。将血浆被分成两份(等体积)并转移到低温小瓶中。然后储存在-75℃下。一组血浆用于使用具有高亲和力单克隆αPAS抗体Avi-PA(S)1.1和αhBNP抗体克隆50E1(对hBNP32的C末端具有特异性)的夹心ELISA设置测定化合物1的浓度，从而确保高灵敏度和选择性。第二组血浆用于使用艾博抗公司(Abcam)ELISA试剂盒(环状GMP完全ELISA试剂盒(ab133052)|艾博抗公司)测定血浆cGMP水平。

结果

药代动力学

来自第3组，0.2mg/kg静脉内团注化合物1、血浆样品的ELISA测定的数据可以拟合到典型的贝特曼函数(Bateman function)。分析的结果在图8和表1中示出。

表1.静脉内团注给药(0.2mg/kg)后，来自化合物1的犬血浆浓度随时间变化的两个隔室模型拟合的药代动力学参数值。

来自第2组(0.9mg/kg皮下团注化合物1血浆样品)的ELISA测定的数据示出了典型的贝特曼函数双相药代动力学概况，并拟合到两个隔室模型。分析的结果在图9和表2中示出。

表2.皮下团注给药(0.9mg/kg)后，来自化合物1的犬血浆浓度随时间变化的两个隔室模型拟合的药代动力学参数值。

皮下给药后的终末半衰期为14.8小时，其是亲本肽hBNP(1-32)的报告的终末半衰期的27倍(33分钟，参考文献：FDA NDA#20-920Pharmr P1第28页,药品批准包：奈西利肽(Natrecor)(奈西立肽)NDA#20-920(fda.gov))

药效学

0.9mg/kg皮下团注化合物1产生的收缩压(SBP)、舒张压(DBP)和经计算的平均动脉压(MAP＝DBP+[0.33+(HR x 0.0012)]x[SBP])的持续性显著(P<0.05)降低，而对心率没有显著影响(图10和11)。在给药后6小时至12小时之间，MAP平均下降了32.4±6.1mm Hg。相同地，在6至12小时时间段，心率每分钟下降7±13次(不显著)。72小时后，MAP恢复到基线和媒剂对照水平(图12)。

0.2mg/kg化合物1的静脉内团注剂量也产生了血压的显著短暂下降，其在给药后24小时恢复到基线(图12)。

药代动力学/药效学

两者对MAP(图13)和生物标志物的浓度、血浆cGMP(图14)的影响反映了施用0.9mg/kg皮下团注的化合物1后的化合物1的血浆浓度。图13中的数据还示出了0.9mg/kg皮下团注剂量在研究持续期间产生的血浆浓度，所述研究定义了化合物从阈下药理作用水平到超最大作用水平的治疗窗。

序列

SEQ ID NO:1

SPKMVQGSGCFGRKMDRISSSSGLGCKVLRRH

SEQ ID NO.2

ASPAAPAPASPAAPAPSAPA

SEQ ID NO:3

AAPASPAPAAPSAPAPAAPS

SEQ ID NO:4

APSSPSPSAPSSPSPASPSS

SEQ ID NO:5

SAPSSPSPSAPSSPSPASPS

SEQ ID NO:6

SSPSAPSPSSPASPSPSSPA

SEQ ID NO:7

AASPAAPSAPPAAASPAAPSAPPA

SEQ ID NO:8

ASAAAPAAASAAASAPSAAA

SEQ ID NO:9

APAAPAPAPAAPAPAPA

SEQ ID NO:10

AAPAPAPAAPAPAPAAP

SEQ ID NO:11

APPPAPPPAP

SEQ ID NO:12

PAPPPAPPPA

SEQ ID NO:13

AAPAAPAPPAAAPAAPAPPA

SEQ ID NO:14

AAAAPAAAAAAAPAAA

SEQ ID NO:15

CPKMVQGSGCFGRKMDRISSSSGLGCKVLRRH

SEQ ID NO:16

SPCMVQGSGCFGRKMDRISSSSGLGCKVLRRH

SEQ ID NO:17

SPKCVQGSGCFGRKMDRISSSSGLGCKVLRRH

SEQ ID NO:18

SPKMCQGSGCFGRKMDRISSSSGLGCKVLRRH

SEQ ID NO:19

SPKMVCGSGCFGRKMDRISSSSGLGCKVLRRH

SEQ ID NO:20

SPKMVQGCGCFGRKMDRISSSSGLGCKVLRRH

SEQ ID NO:21(合成基因片段SapI-BNP32)

AGGTAACATATGCCTGCCAGAAGAGCTCCTCAGCGCTCTTCTGCCAGTCCGAAAAT

GGTTCAAGGTAGCGGTTGTTTTGGTCGTAAAATGGATCGTATTAGCAGCAGCAGCGG

TCTGGGTTGTAAAGTTCTGCGTCGTCATTAATAAGCTTGGGTTG

SEQ ID NO:22(合成基因片段SapI-BNP3-32)

AGGTAAcAtATGCCAGCCAGAAGAGCTCCTCAGCGCTCTTCTGCCAAAATGGTTCAA

GGTAGCGGTTGTTTTGGTCGTAAAATGGATCGTATTAGCAGCAGCAGCGGTCTGGGT

TGTAAAGTTCTGCGTCGTCATTAATAAGCTTGGGTTG

SEQ ID NO:23(合成基因片段SapI-BNP6-32)

ATTCGTTCAGGTAAcAtATGCCAGCCAGAAGAGCTCCTCAGCGCTCTTCTGCCCAAG

GTAGCGGTTGTTTTGGTCGTAAAATGGATCGTATTAGCAGCAGCAGCGGTCTGGGTT

GTAAAGTTCTGCGTCGTCATTAATAAGCTTGGGTTG

SEQ ID NO:24(合成基因片段BNP32)

AGGTAAcAtATGAGTCCGAAAATGGTTCAAGGTAGCGGTTGTTTTGGTCGTAAAATG

GATCGTATTAGCAGCAGCAGCGGTCTGGGTTGTAAAGTTCTGCGTCGTCATGCCAGA

AGAGCTCCTCAGCGCTCTTCTGCCTAATAAGCTTGGGTTG

SEQ ID NO:25(合成基因片段BNP1-30)

AGGTAAcAtATGAGTCCGAAAATGGTTCAAGGTAGCGGTTGTTTTGGTCGTAAAATG

GATCGTATTAGCAGCAGCAGCGGTCTGGGTTGTAAAGTTCTGCGTGCCAGAAGAGC

TCCTCAGCGCTCTTCTGCCTAATAAGCTTGGGTTG

SEQ ID NO:26(PAS1.2(200))

GCCAGCCCTGCCGCACCTGCGCCCGCATCACCTGCGGCACCTGCACCTTCCGCCCC

GGCTGCATCTCCTGCCGCACCCGCGCCTGCCAGCCCAGCTGCACCTGCCCCAAGTG

CGCCAGCAGCATCCCCTGCCGCGCCTGCCCCCGCTAGTCCAGCGGCCCCAGCTCCA

TCTGCACCAGCTGCTAGCCCTGCTGCACCAGCTCCTGCTTCTCCCGCAGCCCCAGC

GCCTTCTGCTCCCGCAGCCTCACCTGCGGCCCCGGCACCAGCATCTCCAGCGGCAC

CAGCACCTTCGGCCCCTGCTGCTAGCCCAGCAGCACCTGCGCCAGCCTCACCAGCT

GCTCCCGCTCCTAGTGCCCCGGCGGCCTCGCCTGCTGCTCCTGCACCAGCTTCGCCA

GCGGCACCGGCTCCTTCGGCGCCGGCTGCTTCACCAGCAGCACCTGCTCCAGCGTC

CCCAGCGGCCCCTGCTCCAAGTGCTCCGGCTGCATCGCCTGCCGCTCCTGCTCCTGC

ATCCCCAGCTGCTCCAGCACCAAGCGCACCTGCCGCCTCACCAGCGGCGCCAGCAC

CCGCCAGCCCAGCAGCGCCTGCTCCATCCGCACCGGCGGCC

SEQ ID NO:27(pD451-SR-PAS200-BNP32)

CCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGC

TGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGA

GCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATAC

TGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGCCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCC

TACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTC

GTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGG

GCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGA

ACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAA

AGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGA

GCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTG

ACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACG

CCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGT

TCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGC

TGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAA

GCGGAAGGCGAGAGTAGGGAACTGCCAGGCATCAAACTAAGCAGAAGGCCCCTGA

CGGATGGCCTTTTTGCGTTTCTACAAACTCTTTCTGTGTTGTAAAACGACGGCCAGT

CTTAAGCTCGGGCCCCCTGGGCGGTTCTGATAACGAGTAATCGTTAATCCGCAAATA

ACGTAAAAACCCGCTTCGGCGGGTTTTTTTATGGGGGGAGTTTAGGGAAAGAGCAT

TTGTCAGAATATTTAAGGGCGCCTGTCACTTTGCTTGATATATGAGAATTATTTAACCT

TATAAATGAGAAAAAAGCAACGCACTTTAAATAAGATACGTTGCTTTTTCGATTGAT

GAACACCTATAATTAAACTATTCATCTATTATTTATGATTTTTTGTATATACAATATTTCT

AGTTTGTTAAAGAGAATTAAGAAAATAAATCTCGAAAATAATAAAGGGAAAATCAG

TTTTTGATATCAAAATTATACATGTCAACGATAATACAAAATATAATACAAACTATAAG

ATGTTATCAGTATTTATTATGCATTTAGAATAAATTTTGTGTCGCCCTTCCGCGAAATT

AATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTAGAAATAAT

TTTGTTTAACTTTTTGAGACCTTAAGGAGGTAAAACATATGCCTgccagccctgccgcacctgc

gcccgcatcacctgcggcacctgcaccttccgccccggctgcatctcctgccgcacccgcgcctgccagcccagctgcacctgccc

caagtgcgccagcagcatcccctgccgcgcctgcccccgctagtccagcggccccagctccatctgcaccagctgctagccctgct

gcaccagctcctgcttctcccgcagccccagcgccttctgctcccgcagcctcacctgcggccccggcaccagcatctccagcggca

ccagcaccttcggcccctgctgctagcccagcagcacctgcgccagcctcaccagctgctcccgctcctagtgccccggcggcctc

gcctgctgctcctgcaccagcttcgccagcggcaccggctccttcggcgccggctgcttcaccagcagcacctgctccagcgtcccc

agcggcccctgctccaagtgctccggctgcatcgcctgccgctcctgctcctgcatccccagctgctccagcaccaagcgcacctgc

cgcctcaccagcggcgccagcacccgccagcccagcagcgcctgctccatccgcaccggcgGCCAGTCCGAAAATG

GTTCAAGGTAGCGGTTGTTTTGGTCGTAAAATGGATCGTATTAGCAGCAGCAGCGGT

CTGGGTTGTAAAGTTCTGCGTCGTCATTAATAAGCTTGGTTGAGGTCTCACCCCCTA

GCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCCCCTGAGACGC

GTCAATCGAGTTCGTACCTAAGGGCGACACCCCCTAATTAGCCCGGGCGAAAGGCC

CAGTCTTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTTGATGCCTGGCAGTTCCCTACTCTCGCA

TGGGGAGTCCCCACACTACCATCGGCGCTACGGCGTTTCACTTCTGAGTTCGGCATG

GGGTCAGGTGGGACCACCGCGCTACTGCCGCCAGGCAAACAAGGGGTGTTATGAG

CCATATTCAGGTATAAATGGGCTCGCGATAATGTTCAGAATTGGTTAATTGGTTGTAA

CACTGACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGA

CAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAATATGAGCCATATTC

AACGGGAAACGTCGAGGCCGCGATTAAATTCCAACATGGATGCTGATTTATATGGGT

ATAAATGGGCTCGCGATAATGTCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTATCGCTTGTATG

GGAAGCCCGATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAAT

GATGTTACAGATGAGATGGTCAGACTAAACTGGCTGACGGAATTTATGCCACTTCCG

ACCATCAAGCATTTTATCCGTACTCCTGATGATGCATGGTTACTCACCACTGCGATCC

CCGGAAAAACAGCGTTCCAGGTATTAGAAGAATATCCTGATTCAGGTGAAAATATTG

TTGATGCGCTGGCAGTGTTCCTGCGCCGGTTGCACTCGATTCCTGTTTGTAATTGTCC

TTTTAACAGCGATCGCGTATTTCGCCTCGCTCAGGCGCAATCACGAATGAATAACGG

TTTGGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGAGCGTAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGT

CTGGAAAGAAATGCATAAACTTTTGCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTCACTCATGG

TGATTTCTCACTTGATAACCTTATTTTTGACGAGGGGAAATTAATAGGTTGTATTGAT

GTTGGACGAGTCGGAATCGCAGACCGATACCAGGATCTTGCCATCCTATGGAACTGC

CTCGGTGAGTTTTCTCCTTCATTACAGAAACGGCTTTTTCAAAAATATGGTATTGATA

ATCCTGATATGAATAAATTGCAGTTTCATTTGATGCTCGATGAGTTTTTCTAAGCGGC

GCGCCATCGAATGGCGCAAAACCTTTCGCGGTATGGCATGATAGCGCCCGGAAGAG

AGTCAATTCAGGGTGGTGAATATGAAACCAGTAACGTTATACGATGTCGCAGAGTAT

GCCGGTGTCTCTTATCAGACCGTTTCCCGCGTGGTGAACCAGGCCAGCCACGTTTCT

GCGAAAACGCGGGAAAAAGTGGAAGCGGCGATGGCGGAGCTGAATTACATTCCCA

ACCGCGTGGCACAACAACTGGCGGGCAAACAGTCGTTGCTGATTGGCGTTGCCACC

TCCAGTCTGGCCCTGCACGCGCCGTCGCAAATTGTCGCGGCGATTAAATCTCGCGCC

GATCAACTGGGTGCCAGCGTGGTGGTGTCGATGGTAGAACGAAGCGGCGTCGAAG

CCTGTAAAGCGGCGGTGCACAATCTTCTCGCGCAACGCGTCAGTGGGCTGATCATTA

ACTATCCGCTGGATGACCAGGATGCCATTGCTGTGGAAGCTGCCTGCACTAATGTTC

CGGCGTTATTTCTTGATGTCTCTGACCAGACACCCATCAACAGTATTATTTTCTCCCA

TGAGGACGGTACGCGACTGGGCGTGGAGCATCTGGTCGCATTGGGTCACCAGCAAA

TCGCGCTGTTAGCGGGCCCATTAAGTTCTGTCTCGGCGCGTCTGCGTCTGGCTGGCT

GGCATAAATATCTCACTCGCAATCAAATTCAGCCGATAGCGGAACGGGAAGGCGAC

TGGAGTGCCATGTCCGGTTTTCAACAAACCATGCAAATGCTGAATGAGGGCATCGTT

CCCACTGCGATGCTGGTTGCCAACGATCAGATGGCGCTGGGCGCAATGCGCGCCATT

ACCGAGTCCGGGCTGCGCGTTGGTGCGGATATCTCGGTAGTGGGATACGACGATACC

GAAGATAGCTCATGTTATATCCCGCCGTTAACCACCATCAAACAGGATTTTCGCCTGC

TGGGGCAAACCAGCGTGGACCGCTTGCTGCAACTCTCTCAGGGCCAGGCGGTGAA

GGGCAATCAGCTGTTGCCAGTCTCACTGGTGAAAAGAAAAACCACCCTGGCGCCC

AATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGA

CAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGACTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGA

GTTACGCGCGCGTCGTTCCACTGAGCGTCAGAC

SEQ ID NO:28(pD451-SR-PAS200-BNP3-32)

CCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGC

TGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGA

GCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATAC

TGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGCCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCC

TACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTC

GTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGG

GCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGA

ACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAA

AGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGA

GCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTG

ACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACG

CCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGT

TCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGC

TGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAA

GCGGAAGGCGAGAGTAGGGAACTGCCAGGCATCAAACTAAGCAGAAGGCCCCTGA

CGGATGGCCTTTTTGCGTTTCTACAAACTCTTTCTGTGTTGTAAAACGACGGCCAGT

CTTAAGCTCGGGCCCCCTGGGCGGTTCTGATAACGAGTAATCGTTAATCCGCAAATA

ACGTAAAAACCCGCTTCGGCGGGTTTTTTTATGGGGGGAGTTTAGGGAAAGAGCAT

TTGTCAGAATATTTAAGGGCGCCTGTCACTTTGCTTGATATATGAGAATTATTTAACCT

TATAAATGAGAAAAAAGCAACGCACTTTAAATAAGATACGTTGCTTTTTCGATTGAT

GAACACCTATAATTAAACTATTCATCTATTATTTATGATTTTTTGTATATACAATATTTCT

AGTTTGTTAAAGAGAATTAAGAAAATAAATCTCGAAAATAATAAAGGGAAAATCAG

TTTTTGATATCAAAATTATACATGTCAACGATAATACAAAATATAATACAAACTATAAG

ATGTTATCAGTATTTATTATGCATTTAGAATAAATTTTGTGTCGCCCTTCCGCGAAATT

AATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTAGAAATAAT

TTTGTTTAACTTTTTGAGACCTTAAGGAGGTAAAACATATGCCAgccagccctgccgcacctgc

cgcctcaccagcggcgccagcacccgccagcccagcagcgcctgctccatccgcaccggcgGCCAAAATGGTTCAA

GGTAGCGGTTGTTTTGGTCGTAAAATGGATCGTATTAGCAGCAGCAGCGGTCTGGGT

TGTAAAGTTCTGCGTCGTCATTAATAAGCTTGGTTGAGGTCTCACCCCCTAGCATAA

CCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCCCCTGAGACGCGTCAAT

CGAGTTCGTACCTAAGGGCGACACCCCCTAATTAGCCCGGGCGAAAGGCCCAGTCT

TTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTTGATGCCTGGCAGTTCCCTACTCTCGCATGGGGA

GTCCCCACACTACCATCGGCGCTACGGCGTTTCACTTCTGAGTTCGGCATGGGGTCA

GGTGGGACCACCGCGCTACTGCCGCCAGGCAAACAAGGGGTGTTATGAGCCATATT

CAGGTATAAATGGGCTCGCGATAATGTTCAGAATTGGTTAATTGGTTGTAACACTGA

CCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAA

CCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAATATGAGCCATATTCAACGG

GAAACGTCGAGGCCGCGATTAAATTCCAACATGGATGCTGATTTATATGGGTATAAAT

GGGCTCGCGATAATGTCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTATCGCTTGTATGGGAAGC

CCGATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAATGATGTTA

CAGATGAGATGGTCAGACTAAACTGGCTGACGGAATTTATGCCACTTCCGACCATCA

AGCATTTTATCCGTACTCCTGATGATGCATGGTTACTCACCACTGCGATCCCCGGAAA

AACAGCGTTCCAGGTATTAGAAGAATATCCTGATTCAGGTGAAAATATTGTTGATGC

GCTGGCAGTGTTCCTGCGCCGGTTGCACTCGATTCCTGTTTGTAATTGTCCTTTTAAC

AGCGATCGCGTATTTCGCCTCGCTCAGGCGCAATCACGAATGAATAACGGTTTGGTT

GATGCGAGTGATTTTGATGACGAGCGTAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGGAA

AGAAATGCATAAACTTTTGCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTTC

TCACTTGATAACCTTATTTTTGACGAGGGGAAATTAATAGGTTGTATTGATGTTGGAC

GAGTCGGAATCGCAGACCGATACCAGGATCTTGCCATCCTATGGAACTGCCTCGGTG

AGTTTTCTCCTTCATTACAGAAACGGCTTTTTCAAAAATATGGTATTGATAATCCTGA

TATGAATAAATTGCAGTTTCATTTGATGCTCGATGAGTTTTTCTAAGCGGCGCGCCAT

CGAATGGCGCAAAACCTTTCGCGGTATGGCATGATAGCGCCCGGAAGAGAGTCAAT

TCAGGGTGGTGAATATGAAACCAGTAACGTTATACGATGTCGCAGAGTATGCCGGTG

TCTCTTATCAGACCGTTTCCCGCGTGGTGAACCAGGCCAGCCACGTTTCTGCGAAA

ACGCGGGAAAAAGTGGAAGCGGCGATGGCGGAGCTGAATTACATTCCCAACCGCG

TGGCACAACAACTGGCGGGCAAACAGTCGTTGCTGATTGGCGTTGCCACCTCCAGT

CTGGCCCTGCACGCGCCGTCGCAAATTGTCGCGGCGATTAAATCTCGCGCCGATCAA

CTGGGTGCCAGCGTGGTGGTGTCGATGGTAGAACGAAGCGGCGTCGAAGCCTGTAA

AGCGGCGGTGCACAATCTTCTCGCGCAACGCGTCAGTGGGCTGATCATTAACTATCC

GCTGGATGACCAGGATGCCATTGCTGTGGAAGCTGCCTGCACTAATGTTCCGGCGTT

ATTTCTTGATGTCTCTGACCAGACACCCATCAACAGTATTATTTTCTCCCATGAGGAC

GGTACGCGACTGGGCGTGGAGCATCTGGTCGCATTGGGTCACCAGCAAATCGCGCT

GTTAGCGGGCCCATTAAGTTCTGTCTCGGCGCGTCTGCGTCTGGCTGGCTGGCATAA

ATATCTCACTCGCAATCAAATTCAGCCGATAGCGGAACGGGAAGGCGACTGGAGTG

CCATGTCCGGTTTTCAACAAACCATGCAAATGCTGAATGAGGGCATCGTTCCCACTG

CGATGCTGGTTGCCAACGATCAGATGGCGCTGGGCGCAATGCGCGCCATTACCGAG

TCCGGGCTGCGCGTTGGTGCGGATATCTCGGTAGTGGGATACGACGATACCGAAGAT

AGCTCATGTTATATCCCGCCGTTAACCACCATCAAACAGGATTTTCGCCTGCTGGGG

CAAACCAGCGTGGACCGCTTGCTGCAACTCTCTCAGGGCCAGGCGGTGAAGGGCA

ATCAGCTGTTGCCAGTCTCACTGGTGAAAAGAAAAACCACCCTGGCGCCCAATACG

CAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTT

TCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGACTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTACG

CGCGCGTCGTTCCACTGAGCGTCAGAC

SEQ ID NO:29(pD451-SR-PAS200-BNP6-32)

CCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGC

TGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGA

GCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATAC

TGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGCCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCC

TACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTC

GTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGG

GCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGA

ACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAA

AGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGA

GCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTG

ACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACG

CCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGT

TCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGC

TGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAA

GCGGAAGGCGAGAGTAGGGAACTGCCAGGCATCAAACTAAGCAGAAGGCCCCTGA

CGGATGGCCTTTTTGCGTTTCTACAAACTCTTTCTGTGTTGTAAAACGACGGCCAGT

CTTAAGCTCGGGCCCCCTGGGCGGTTCTGATAACGAGTAATCGTTAATCCGCAAATA

ACGTAAAAACCCGCTTCGGCGGGTTTTTTTATGGGGGGAGTTTAGGGAAAGAGCAT

TTGTCAGAATATTTAAGGGCGCCTGTCACTTTGCTTGATATATGAGAATTATTTAACCT

TATAAATGAGAAAAAAGCAACGCACTTTAAATAAGATACGTTGCTTTTTCGATTGAT

GAACACCTATAATTAAACTATTCATCTATTATTTATGATTTTTTGTATATACAATATTTCT

AGTTTGTTAAAGAGAATTAAGAAAATAAATCTCGAAAATAATAAAGGGAAAATCAG

TTTTTGATATCAAAATTATACATGTCAACGATAATACAAAATATAATACAAACTATAAG

ATGTTATCAGTATTTATTATGCATTTAGAATAAATTTTGTGTCGCCCTTCCGCGAAATT

AATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTAGAAATAAT

TTTGTTTAACTTTTTGAGACCTTAAGGAGGTAAAACATATGCCAgccagccctgccgcacctgc

cgcctcaccagcggcgccagcacccgccagcccagcagcgcctgctccatccgcaccggcgGCCCAAGGTAGCGGT

TGTTTTGGTCGTAAAATGGATCGTATTAGCAGCAGCAGCGGTCTGGGTTGTAAAGTT

CTGCGTCGTCATTAATAAGCTTGGTTGAGGTCTCACCCCCTAGCATAACCCCTTGGG

GCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCCCCTGAGACGCGTCAATCGAGTTCGT

ACCTAAGGGCGACACCCCCTAATTAGCCCGGGCGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGA

GCCTTTCGTTTTATTTGATGCCTGGCAGTTCCCTACTCTCGCATGGGGAGTCCCCACA

CTACCATCGGCGCTACGGCGTTTCACTTCTGAGTTCGGCATGGGGTCAGGTGGGACC

ACCGCGCTACTGCCGCCAGGCAAACAAGGGGTGTTATGAGCCATATTCAGGTATAAA

TGGGCTCGCGATAATGTTCAGAATTGGTTAATTGGTTGTAACACTGACCCCTATTTGT

TTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAAT

GCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAATATGAGCCATATTCAACGGGAAACGTCGAG

GCCGCGATTAAATTCCAACATGGATGCTGATTTATATGGGTATAAATGGGCTCGCGAT

AATGTCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTATCGCTTGTATGGGAAGCCCGATGCGCCA

GAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAATGATGTTACAGATGAGATG

GTCAGACTAAACTGGCTGACGGAATTTATGCCACTTCCGACCATCAAGCATTTTATC

CGTACTCCTGATGATGCATGGTTACTCACCACTGCGATCCCCGGAAAAACAGCGTTC

CAGGTATTAGAAGAATATCCTGATTCAGGTGAAAATATTGTTGATGCGCTGGCAGTG

TTCCTGCGCCGGTTGCACTCGATTCCTGTTTGTAATTGTCCTTTTAACAGCGATCGCG

TATTTCGCCTCGCTCAGGCGCAATCACGAATGAATAACGGTTTGGTTGATGCGAGTG

ATTTTGATGACGAGCGTAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGGAAAGAAATGCATA

AACTTTTGCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTGATAA

CCTTATTTTTGACGAGGGGAAATTAATAGGTTGTATTGATGTTGGACGAGTCGGAAT

CGCAGACCGATACCAGGATCTTGCCATCCTATGGAACTGCCTCGGTGAGTTTTCTCC

TTCATTACAGAAACGGCTTTTTCAAAAATATGGTATTGATAATCCTGATATGAATAAAT

TGCAGTTTCATTTGATGCTCGATGAGTTTTTCTAAGCGGCGCGCCATCGAATGGCGC

AAAACCTTTCGCGGTATGGCATGATAGCGCCCGGAAGAGAGTCAATTCAGGGTGGT

GAATATGAAACCAGTAACGTTATACGATGTCGCAGAGTATGCCGGTGTCTCTTATCA

GACCGTTTCCCGCGTGGTGAACCAGGCCAGCCACGTTTCTGCGAAAACGCGGGAA

AAAGTGGAAGCGGCGATGGCGGAGCTGAATTACATTCCCAACCGCGTGGCACAACA

ACTGGCGGGCAAACAGTCGTTGCTGATTGGCGTTGCCACCTCCAGTCTGGCCCTGC

ACGCGCCGTCGCAAATTGTCGCGGCGATTAAATCTCGCGCCGATCAACTGGGTGCC

AGCGTGGTGGTGTCGATGGTAGAACGAAGCGGCGTCGAAGCCTGTAAAGCGGCGG

TGCACAATCTTCTCGCGCAACGCGTCAGTGGGCTGATCATTAACTATCCGCTGGATG

ACCAGGATGCCATTGCTGTGGAAGCTGCCTGCACTAATGTTCCGGCGTTATTTCTTG

ATGTCTCTGACCAGACACCCATCAACAGTATTATTTTCTCCCATGAGGACGGTACGC

GACTGGGCGTGGAGCATCTGGTCGCATTGGGTCACCAGCAAATCGCGCTGTTAGCG

GGCCCATTAAGTTCTGTCTCGGCGCGTCTGCGTCTGGCTGGCTGGCATAAATATCTC

ACTCGCAATCAAATTCAGCCGATAGCGGAACGGGAAGGCGACTGGAGTGCCATGTC

CGGTTTTCAACAAACCATGCAAATGCTGAATGAGGGCATCGTTCCCACTGCGATGCT

GGTTGCCAACGATCAGATGGCGCTGGGCGCAATGCGCGCCATTACCGAGTCCGGGC

TGCGCGTTGGTGCGGATATCTCGGTAGTGGGATACGACGATACCGAAGATAGCTCAT

GTTATATCCCGCCGTTAACCACCATCAAACAGGATTTTCGCCTGCTGGGGCAAACCA

GCGTGGACCGCTTGCTGCAACTCTCTCAGGGCCAGGCGGTGAAGGGCAATCAGCTG

TTGCCAGTCTCACTGGTGAAAAGAAAAACCACCCTGGCGCCCAATACGCAAACCGC

CTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACT

GGAAAGCGGGCAGTGACTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTACGCGCGCGTC

GTTCCACTGAGCGTCAGAC

SEQ ID NO:30(pD451-SR-BNP32-PAS200)

CCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGC

TGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGA

GCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATAC

TGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGCCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCC

TACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTC

GTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGG

GCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGA

ACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAA

AGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGA

GCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTG

ACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACG

CCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGT

TCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGC

TGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAA

GCGGAAGGCGAGAGTAGGGAACTGCCAGGCATCAAACTAAGCAGAAGGCCCCTGA

CGGATGGCCTTTTTGCGTTTCTACAAACTCTTTCTGTGTTGTAAAACGACGGCCAGT

CTTAAGCTCGGGCCCCCTGGGCGGTTCTGATAACGAGTAATCGTTAATCCGCAAATA

ACGTAAAAACCCGCTTCGGCGGGTTTTTTTATGGGGGGAGTTTAGGGAAAGAGCAT

TTGTCAGAATATTTAAGGGCGCCTGTCACTTTGCTTGATATATGAGAATTATTTAACCT

TATAAATGAGAAAAAAGCAACGCACTTTAAATAAGATACGTTGCTTTTTCGATTGAT

GAACACCTATAATTAAACTATTCATCTATTATTTATGATTTTTTGTATATACAATATTTCT

AGTTTGTTAAAGAGAATTAAGAAAATAAATCTCGAAAATAATAAAGGGAAAATCAG

TTTTTGATATCAAAATTATACATGTCAACGATAATACAAAATATAATACAAACTATAAG

ATGTTATCAGTATTTATTATGCATTTAGAATAAATTTTGTGTCGCCCTTCCGCGAAATT

AATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTAGAAATAAT

TTTGTTTAACTTTTTGAGACCTTAAGGAGGTAAAACATATGAGTCCGAAAATGGTTC

AAGGTAGCGGTTGTTTTGGTCGTAAAATGGATCGTATTAGCAGCAGCAGCGGTCTGG

GTTGTAAAGTTCTGCGTCGTCATgccagccctgccgcacctgcgcccgcatcacctgcggcacctgcaccttccg

ccccggctgcatctcctgccgcacccgcgcctgccagcccagctgcacctgccccaagtgcgccagcagcatcccctgccgcgcct

gcccccgctagtccagcggccccagctccatctgcaccagctgctagccctgctgcaccagctcctgcttctcccgcagccccagcg

ccttctgctcccgcagcctcacctgcggccccggcaccagcatctccagcggcaccagcaccttcggcccctgctgctagcccagca

gcacctgcgccagcctcaccagctgctcccgctcctagtgccccggcggcctcgcctgctgctcctgcaccagcttcgccagcggca

ccggctccttcggcgccggctgcttcaccagcagcacctgctccagcgtccccagcggcccctgctccaagtgctccggctgcatcg

cctgccgctcctgctcctgcatccccagctgctccagcaccaagcgcacctgccgcctcaccagcggcgccagcacccgccagccc

agcagcgcctgctccatccgcaccggcgGCCTAATAAGCTTGGTTGAGGTCTCACCCCCTAGCATA

ACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCCCCTGAGACGCGTCA

ATCGAGTTCGTACCTAAGGGCGACACCCCCTAATTAGCCCGGGCGAAAGGCCCAGT

CTTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTTGATGCCTGGCAGTTCCCTACTCTCGCATGGG

GAGTCCCCACACTACCATCGGCGCTACGGCGTTTCACTTCTGAGTTCGGCATGGGGT

CAGGTGGGACCACCGCGCTACTGCCGCCAGGCAAACAAGGGGTGTTATGAGCCATA

TTCAGGTATAAATGGGCTCGCGATAATGTTCAGAATTGGTTAATTGGTTGTAACACTG

ACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATA

ACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAATATGAGCCATATTCAACG

GGAAACGTCGAGGCCGCGATTAAATTCCAACATGGATGCTGATTTATATGGGTATAAA

TGGGCTCGCGATAATGTCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTATCGCTTGTATGGGAAG

CCCGATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAATGATGTT

ACAGATGAGATGGTCAGACTAAACTGGCTGACGGAATTTATGCCACTTCCGACCATC

AAGCATTTTATCCGTACTCCTGATGATGCATGGTTACTCACCACTGCGATCCCCGGAA

AAACAGCGTTCCAGGTATTAGAAGAATATCCTGATTCAGGTGAAAATATTGTTGATG

CGCTGGCAGTGTTCCTGCGCCGGTTGCACTCGATTCCTGTTTGTAATTGTCCTTTTAA

CAGCGATCGCGTATTTCGCCTCGCTCAGGCGCAATCACGAATGAATAACGGTTTGGT

TGATGCGAGTGATTTTGATGACGAGCGTAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGGA

AAGAAATGCATAAACTTTTGCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTT

CTCACTTGATAACCTTATTTTTGACGAGGGGAAATTAATAGGTTGTATTGATGTTGGA

CGAGTCGGAATCGCAGACCGATACCAGGATCTTGCCATCCTATGGAACTGCCTCGGT

GAGTTTTCTCCTTCATTACAGAAACGGCTTTTTCAAAAATATGGTATTGATAATCCTG

ATATGAATAAATTGCAGTTTCATTTGATGCTCGATGAGTTTTTCTAAGCGGCGCGCCA

TCGAATGGCGCAAAACCTTTCGCGGTATGGCATGATAGCGCCCGGAAGAGAGTCAA

TTCAGGGTGGTGAATATGAAACCAGTAACGTTATACGATGTCGCAGAGTATGCCGGT

GTCTCTTATCAGACCGTTTCCCGCGTGGTGAACCAGGCCAGCCACGTTTCTGCGAA

AACGCGGGAAAAAGTGGAAGCGGCGATGGCGGAGCTGAATTACATTCCCAACCGC

GTGGCACAACAACTGGCGGGCAAACAGTCGTTGCTGATTGGCGTTGCCACCTCCAG

TCTGGCCCTGCACGCGCCGTCGCAAATTGTCGCGGCGATTAAATCTCGCGCCGATCA

ACTGGGTGCCAGCGTGGTGGTGTCGATGGTAGAACGAAGCGGCGTCGAAGCCTGTA

AAGCGGCGGTGCACAATCTTCTCGCGCAACGCGTCAGTGGGCTGATCATTAACTATC

CGCTGGATGACCAGGATGCCATTGCTGTGGAAGCTGCCTGCACTAATGTTCCGGCGT

TATTTCTTGATGTCTCTGACCAGACACCCATCAACAGTATTATTTTCTCCCATGAGGA

CGGTACGCGACTGGGCGTGGAGCATCTGGTCGCATTGGGTCACCAGCAAATCGCGC

TGTTAGCGGGCCCATTAAGTTCTGTCTCGGCGCGTCTGCGTCTGGCTGGCTGGCATA

AATATCTCACTCGCAATCAAATTCAGCCGATAGCGGAACGGGAAGGCGACTGGAGT

GCCATGTCCGGTTTTCAACAAACCATGCAAATGCTGAATGAGGGCATCGTTCCCACT

GCGATGCTGGTTGCCAACGATCAGATGGCGCTGGGCGCAATGCGCGCCATTACCGA

GTCCGGGCTGCGCGTTGGTGCGGATATCTCGGTAGTGGGATACGACGATACCGAAGA

TAGCTCATGTTATATCCCGCCGTTAACCACCATCAAACAGGATTTTCGCCTGCTGGGG

CAAACCAGCGTGGACCGCTTGCTGCAACTCTCTCAGGGCCAGGCGGTGAAGGGCA

ATCAGCTGTTGCCAGTCTCACTGGTGAAAAGAAAAACCACCCTGGCGCCCAATACG

CAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTT

TCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGACTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTACG

CGCGCGTCGTTCCACTGAGCGTCAGAC

SEQ ID NO:31(pD451-SR-BNP1-30-PAS200)

CCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGC

TGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGA

GCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATAC

TGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGCCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCC

TACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTC

GTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGG

GCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGA

ACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAA

AGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGA

GCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTG

ACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACG

CCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGT

TCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGC

TGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAA

GCGGAAGGCGAGAGTAGGGAACTGCCAGGCATCAAACTAAGCAGAAGGCCCCTGA

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CCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGACTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTACGC

GCGCGTCGTTCCACTGAGCGTCAGAC

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美国专利第7,179,790号。

PCT专利申请公开号第WO2009156481A1号。

鉴于以上内容，将看到实现了本发明的若干个目标并且获得了其它优势。

由于在不脱离本发明的范围的情况下可以在以上方法和组合物中进行各种改变，因此旨在以上描述中含有的以及在附图中示出的所有主题应被解释为说明性的而非限制性的含义。

本说明书中引用的所有参考文献，包含但不限于专利公开和非专利文献，以及其中引用的参考文献，在此通过引用并入。本文对参考文献的讨论仅旨在概述作者的主张，并不承认任何参考文献构成现有技术。申请人保留对引用参考文献的准确性和针对性提出质疑的权利。

如本文所使用的，在特定实施例中，术语“约”或“大约”在数字值之前时指示所述值加上或减去10％的范围。在提供了值范围的情况下，应当理解，在所述范围的上限与下限之间的每个中间值(到下限单位的十分之一，除非上下文清楚地另外指明)以及在所述范围内的任何其它所陈述的值或中间值均被涵盖在本公开内。这些较小范围的所述上限和下限能够独立地包含在更小范围内并且也涵盖于本公开内，从属于所述范围内的任何具体排除限制。在所述范围包含限值中的一个或两个限值的情况下，排除被包含在内的限值中的任一个或两个限值的范围也包含在本公开内。

除非清楚地相反地指出，否则如本文中在说明书和实施例中使用的不定冠词“一个/一种(a/an)”应理解为意指“至少一个”。

如本文在说明书中和实施例中所使用的，短语“和/或”应当理解为意指如此联合的要素中的“任一个或两个”，所述要素即在一些情况下共同存在而在其它情况下分开存在的要素。用“和/或”列出的多个要素应以相同的方式理解，即如此联合的要素中的“一个或多个”。除了通过“和/或”从句具体标识的要素之外，还可以任选地存在其它要素，而无论是与具体标识的那些要素相关还是不相关。因此，作为非限制性实例，在一个实施例中，当与如“包括”等开放式语言结合使用时，对“A和/或B”的引用可以仅指A(任选地包含除B以外的要素)；在另一个实施例中，仅指B(任选地包含除A以外的要素)；在又另一个实施例中，指A和B两者(任选地包含其它要素)；等。

如本文中在说明书和实施例中所使用的，“或”应被理解为具有与如上文所定义的“和/或”相同的含义。例如，当将列表中的项分开时，“或”或“和/或”应被解释为包含性的，即，包含多个要素或要素列表中的至少一个要素、但是还包含多于一个要素，以及任选地另外未列出的项。仅明确指出相反的术语如“…中的仅一个”或“…中的恰好一个”或当在实施例中使用时，“由…组成”指包含许多要素或要素列表中的恰好一个要素。一般而言，当前面为排他性术语，如“…中的任一个”、“…中的一个”、“…中的仅一个”或“…中的恰好一个”时，如本文使用的术语“或”应仅解释为指示唯一的备选方案(即，“一个或另一个，但不是两者”)。当在实施例中使用时，“大体上由…组成”应当具有如在专利法领域中使用的普通含义。

如本文在说明书和实施例中所使用的，关于一个或多个要素的列表的短语“至少一个”应被理解为是指选自要素列表中的任一个或多个要素中的至少一个要素、但不一定包含要素列表内具体列出的每一个要素中的至少一个要素，并且不排除要素列表中的要素的任何组合。此定义还允许可以任选地存在除了在短语“至少一个”所指的要素列表内具体标识的要素之外的要素，而无论与具体标识的那些要素相关还是不相关。因此，作为非限制性实例，在一个实施例中，“A和B中的至少一个”(或等效地，“A或B中的至少一个”，或等效地“A和/或B中的至少一个”)可以指任选地包含多于一个A，不存在B(并且任选地包含除B以外的元素)的至少一个；在另一个实施例中，可以指任选地包含多于一个B，不存在A(并且任选地包含除A以外的元素)的至少一个；在又另一个实施例中，可以指任选地包含多于一个A的至少一个，以及任选地包含多于一个B(以及任选地包含其它元素)的至少一个；等。

Claims

1.一种经修饰的B型利钠肽(BNP)，其包括与SEQ ID NO:1具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％氨基酸序列同一性的序列，

所述经修饰的BNP进一步包括包含氨基酸的共价连接的聚合物，其中所述聚合物抑制受试者中的所述BNP的降解和/或消除，

其中所述经修饰的BNP保留了血管舒张活性。

2.根据权利要求1所述的经修饰的BNP，其在SEQ ID NO:1的C末端和/或N末端处截短。

3.根据权利要求2所述的经修饰的BNP，其中经截短的BNP是BNP2-32、BNP3-32、BNP4-32、BNP5-32、BNP6-32、BNP7-32、BNP8-32、BNP9-32、BNP10-32、BNP1-31、BNP1-30、BNP1-29、BNP1-28、BNP1-27或BNP1-26。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的经修饰的BNP，其中所述聚合物包括由脯氨酸、丙氨酸和任选地丝氨酸残基(PAS)组成的氨基酸。

5.根据权利要求4所述的经修饰的BNP，其中所述聚合物包括氨基酸脯氨酸和丙氨酸。

6.根据权利要求4所述的经修饰的BNP，其中所述聚合物包括氨基酸脯氨酸、丙氨酸和丝氨酸。

7.根据权利要求5或6所述的经修饰的BNP，其中所述聚合物包括至少100个氨基酸。

8.根据权利要求5至7中任一项所述的经修饰的BNP，其中所述聚合物包括选自由以下组成的组的氨基酸序列：

ASPAAPAPASPAAPAPSAPA(SEQ ID NO:2)；

AAPASPAPAAPSAPAPAAPS(SEQ ID NO:3)；

APSSPSPSAPSSPSPASPSS(SEQ ID NO:4)；

SAPSSPSPSAPSSPSPASPS(SEQ ID NO:5)；

SSPSAPSPSSPASPSPSSPA(SEQ ID NO:6)；

AASPAAPSAPPAAASPAAPSAPPA(SEQ ID NO:7)；

ASAAAPAAASAAASAPSAAA(SEQ ID NO:8)；

APAAPAPAPAAPAPAPA(SEQ ID NO:9)；

AAPAPAPAAPAPAPAAP(SEQ ID NO:10)；

APPPAPPPAP(SEQ ID NO:11)；

PAPPPAPPPA(SEQ ID NO:12)；

AAPAAPAPPAAAPAAPAPPA(SEQ ID NO:13)；以及

AAAAPAAAAAAAPAAA(SEQ ID NO:14)

9.根据权利要求5至8中任一项所述的经修饰的BNP，其中所述聚合物由脯氨酸终止。

10.根据权利要求5至9中任一项所述的经修饰的BNP，其中所述聚合物包括在所述聚合物的开头或结尾处的额外丙氨酸。

11.根据权利要求8至10中任一项所述的经修饰的BNP，其中所述聚合物包括重复至少十次的SEQ ID NO:2。

12.根据权利要求8至10中任一项所述的经修饰的BNP，其中所述聚合物包括重复至少二十次的SEQ ID NO:2。

13.根据权利要求8至10中任一项所述的经修饰的BNP，其中所述聚合物包括重复至少三十次的SEQ ID NO:2。

14.根据权利要求8至10中任一项所述的经修饰的BNP，其中所述聚合物包括重复至少四十次的SEQ ID NO:2。

15.根据权利要求11至14中任一项所述的经修饰的BNP，其中所述聚合物由脯氨酸终止。

16.根据权利要求11至15中任一项所述的经修饰的BNP，其中所述聚合物包括在所述聚合物的开头或结尾处的额外丙氨酸。

17.根据权利要求1至16中任一项所述的经修饰的BNP，其中所述聚合物与所述BNP的所述N末端和/或所述C末端共价结合。

18.根据权利要求1至16中任一项所述的经修饰的BNP，其中所述聚合物与所述BNP的至少一个氨基酸残基共价结合。

19.根据权利要求18所述的经修饰的BNP，其中与所述聚合物共价结合的所述至少一个氨基酸残基位于SEQ ID NO:1的残基1、2、3、4、5、6、7、8或9处。

20.根据权利要求18所述的经修饰的BNP，其中与所述聚合物共价结合的所述至少一个氨基酸残基位于SEQ ID NO:1的残基27、28、29、30、31或32处。

21.根据权利要求1至16中任一项所述的经修饰的BNP，其包括插入在SEQ ID NO:1的残基1-9或27-32中的任一者之间或取代其的半胱氨酸，其中所述半胱氨酸与所述聚合物共价连接。

22.根据权利要求1至21中任一项所述的经修饰的BNP，其进一步包括位于所述经修饰的BNP与所述聚合物之间的接头。

23.根据权利要求1至22中任一项所述的经修饰的BNP，其中所述经修饰的BNP包括多于一种聚合物。

24.根据权利要求23所述的经修饰的BNP，其中所述多于一种聚合物各自独立地包括氨基酸脯氨酸和任选地丝氨酸。

25.根据权利要求23或24所述的经修饰的BNP，其中所述多于一种聚合物包括位于所述BNP的末端处的聚合物和与所述BNP的至少一个氨基酸残基连接的聚合物。

26.根据权利要求1所述的经修饰的BNP，其中所述经修饰的BNP是P-(SEQ ID NO:2)₁₀-A-hBNP(1-32)(与N末端氨基连接的PAS)、P-(SEQ ID NO:2)₁₀-A-hBNP(3-32)(与N末端赖氨酸3的α氨基连接的PAS)、P-(SEQ ID NO:2)₁₀-A-hBNP(6-32)(与谷氨酰胺6的N末端连接的PAS)、hBNP(1-32)-(SEQ ID NO:2)₁₀-A(与C末端羧基连接的PAS)、hBNP(1-30)-(SEQ ID NO:2)₁₀-A(与C末端精氨酸30的羧基连接的PAS)、P-(SEQ ID NO:2)₂₀-A-hBNP(1-32)(与N末端氨基连接的PAS)、P-(SEQ ID NO:2)₂₀-A-hBNP(3-32)(与N末端赖氨酸3的α氨基连接的PAS)、P-(SEQ ID NO:2)₂₀-A-hBNP(6-32)(与谷氨酰胺6的N末端连接的PAS)、hBNP(1-32)-(SEQ IDNO:2)₂₀-A(与C末端羧基连接的PAS)、hBNP(1-30)-(SEQ ID NO:2)₂₀-A(与C末端精氨酸30的羧基连接的PAS)、P-(SEQ ID NO:2)₃₀-A-hBNP(1-32)(与N末端氨基连接的PAS)、P-(SEQ IDNO:2)₃₀-A-hBNP(3-32)(与N末端赖氨酸3的α氨基连接的PAS)、P-(SEQ ID NO:2)₃₀-A-hBNP(6-32)(与谷氨酰胺6的N末端连接的PAS)、hBNP(1-32)-(SEQ ID NO:2)₃₀-A(与C末端羧基连接的PAS)、hBNP(1-30)-(SEQ ID NO:2)₃₀-A(与C末端精氨酸30的羧基连接的PAS)、P-(SEQID NO:2)₄₀-A-hBNP(1-32)(与N末端氨基连接的PAS)、P-(SEQ ID NO:2)₄₀-A-hBNP(3-32)(与N末端赖氨酸3的α氨基连接的PAS)、P-(SEQ ID NO:2)₄₀-A-hBNP(6-32)(与谷氨酰胺6的N末端连接的PAS)、hBNP(1-32)-(SEQ ID NO:2)₄₀-A(与C末端羧基连接的PAS)或hBNP(1-30)-(SEQ ID NO:2)₄₀-A(与C末端精氨酸30的羧基连接的PAS)。

27.根据权利要求1至26中任一项所述的经修饰的BNP，其在药学上可接受的载剂中。

28.根据权利要求27所述的经修饰的BNP，其在能够气溶胶化的调配物中。

29.一种核酸分子，其编码根据权利要求17所述的经修饰的BNP。

30.一种载体，其包括根据权利要求29所述的核酸分子。

31.一种细胞，其包括根据权利要求30所述的载体。

32.根据权利要求31所述的细胞，其能够表达所述经修饰的BNP。

33.一种治疗患有或被诊断患有可以用利钠剂、利尿剂或血管舒张剂治疗的疾病、病症或医学病状的受试者的方法，所述方法包括向需要此类治疗的受试者施用治疗有效量的根据权利要求27或28所述的经修饰的BNP。

34.根据权利要求33所述的方法，其中所述疾病、病症或医学病状是血液病、神经系统疾病、发育性疾病、泌尿系统疾病、生殖障碍、精神障碍、癌症、自身免疫性疾病、纤维变性疾病、炎性疾病、神经退行性疾病、感染性疾病、肺病、心脏病、血管疾病或代谢性疾病。

35.根据权利要求33所述的方法，其中所述疾病、病症或医学病状是焦虑、抑郁、创伤后应激障碍、肥胖、外周作用炎性肠病、肠易激综合征、应激应答、睡眠障碍、成瘾行为、急性和慢性神经退行性病变、早产或疼痛、自身免疫性病症中的血管炎和/或过度血管生成、系统性硬化症、多发性硬化症、斯耶格伦氏病(Sjogren's disease)、血管和/或淋巴管中的血管畸形、左心室肥大、门静脉高压症、肝腹水、肺动脉高压症、特发性肺动脉高压症、心房高压症、慢性阻塞性肺病、特发性肺纤维化、肺纤维化、迪乔治综合征(DiGeorge syndrome)、遗传性出血性毛细血管扩张症、海绵状血管瘤、皮肤血管瘤、淋巴畸形、移植腺病、动脉粥样硬化、血管吻合、肥胖症中的脂肪组织、同种异体移植排斥、皮肤病、银屑病、疣、过敏性皮炎、瘢痕疙瘩、化脓性肉芽肿、水泡病(blistering disease)、AIDS患者中的卡波西肉瘤、系统性硬化症、眼病、持续性增生性玻璃体综合征、糖尿病性视网膜病、早产儿视网膜病变、脉络膜血管新生、肺动脉高压症、哮喘、鼻息肉、鼻炎、慢性气道炎症和梗阻、囊性纤维化、急性肺损伤、闭塞性细支气管炎机化性肺炎、胃肠道疾病、炎性肠病、牙周病、腹水、腹膜粘连、肝硬化、生殖系统疾病、子宫内膜异位症、子宫出血、卵巢囊肿、卵巢过度刺激、骨或关节疾病、关节炎、滑膜炎、骨髓炎、骨赘形成、HIV诱导的骨髓血管生成、肾病或早期糖尿病性肾病。

36.根据权利要求33所述的方法，其中所述疾病、病症或医学病状是代谢性疾病、肺病或心力衰竭。

37.根据权利要求33所述的方法，其中所述疾病、病症或医学病状是心力衰竭。

38.根据权利要求33至36中任一项所述的方法，其中所述施用是通过注射进行的。

39.根据权利要求33至36中任一项所述的方法，其中所述经修饰的BNP被气溶胶化并且通过吸入施用。

40.一种制备根据权利要求17所述的经修饰的BNP的方法，所述方法包括获得根据权利要求32所述的细胞并表达所述经修饰的BNP。

41.一种制备根据权利要求1至26中任一项所述的经修饰的BNP的方法，所述方法包括由根据权利要求32所述的细胞表达经修饰的BNP或通过溶液或固相技术产生BNP衍生物，然后使用化学方法共价连接聚合物。

42.根据权利要求41所述的方法，其中根据权利要求25所述的经修饰的BNP是通过在所述细胞中表达根据权利要求17所述的经修饰的BNP，然后将聚合物与根据权利要求17所述的经修饰的BNP的至少一个氨基酸残基共价连接来制备的。

43.一种根据权利要求1至26中任一项所述的经修饰的BNP、根据权利要求29所述的核酸、根据权利要求30所述的载体或根据权利要求32所述的细胞的用途，其用于制备用于治疗可以用利钠剂、利尿剂或血管舒张剂治疗的疾病、病症或医学病状的药物。

44.根据权利要求43所述的用途，其中所述疾病、病症或医学病状是代谢性疾病、肺病或心力衰竭。

45.根据权利要求43所述的用途，其中所述疾病、病症或医学病状是心力衰竭。