CN117957192A - 石墨烯栅格、石墨烯栅格的制造方法、结构分析对象物质的结构分析方法 - Google Patents

石墨烯栅格、石墨烯栅格的制造方法、结构分析对象物质的结构分析方法 Download PDF

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CN117957192A
CN117957192A CN202280061504.7A CN202280061504A CN117957192A CN 117957192 A CN117957192 A CN 117957192A CN 202280061504 A CN202280061504 A CN 202280061504A CN 117957192 A CN117957192 A CN 117957192A
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浅原时泰
森口舞子
井上豪
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Abstract

本发明提供一种石墨烯栅格，例如在基于冷冻电子显微镜的结构分析等中，能够抑制或防止结构分析对象物质的不均匀分布、取向性的偏差等，并且能够高效率地捕捉结构分析对象物质，能够以高分辨率进行结构分析对象物质的结构分析。为了实现上述目的，本发明的石墨烯栅格的特征在于，具有在石墨烯表面导入有包含硅原子和磷原子中的至少一者的官能团的结构。

Description

石墨烯栅格、石墨烯栅格的制造方法、结构分析对象物质的结 构分析方法
技术领域
本发明涉及石墨烯栅格、石墨烯栅格的制造方法、结构分析对象物质的结构分析方法。
背景技术
冷冻电子显微镜用于蛋白质等物质的结构分析(专利文献1等)。
在基于冷冻电子显微镜的结构分析对象物质(例如蛋白质)的结构分析中，为了捕捉结构分析对象物质，使用由石墨烯或无定形碳构成且贴附有支撑膜的碳栅格。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2005-250721号公报
发明内容
发明要解决的技术问题
但是，在用碳栅格捕捉蛋白质等结构分析对象物质的情况下，有可能在碳栅格上发生结构分析对象物质的不均匀分布(局部化)、取向性的偏差等，或者无法捕捉足够数量的结构分析对象物质，从而对结构分析造成障碍。另外，有时难以以高分辨率进行结构分析对象物质的结构分析。
因此，本发明的目的在于提供石墨烯栅格、石墨烯栅格的制造方法、结构分析对象物质的结构分析方法，例如，在基于冷冻电子显微镜的结构分析等中，能够抑制或防止结构分析对象物质的不均匀分布、取向性的偏差等，并且，能够高效率地捕捉结构分析对象物质，能够以高分辨率进行结构分析对象物质的结构分析。
用于解决技术问题的技术方案
为了实现上述目的，本发明的石墨烯栅格的特征在于，具有在石墨烯表面导入有包含硅原子和磷原子中的至少一者的官能团的结构。
本发明的石墨烯栅格的制造方法的特征在于，
为石墨烯栅格的制造方法，
所述石墨烯栅格是具有在石墨烯表面导入有包含硅原子和磷原子中的至少一者的官能团的结构的石墨烯栅格，
所述制造方法包括官能团导入工序，其中，使表面具有取代基的石墨烯的所述取代基与硅烷偶联剂和膦酸衍生物中的至少一者反应而导入所述包含硅原子的官能团。
本发明的结构分析对象物质的结构分析方法的特征在于，
是使用冷冻电子显微镜进行结构分析对象物质的结构分析的方法，
所述制造方法包括结构分析用栅格准备工序和结构分析工序，
在所述结构分析用栅格准备工序中，使所述结构分析对象物质结合于所述本发明的石墨烯栅格或通过所述本发明的石墨烯栅格的制造方法制造的石墨烯栅格，或者准备所述本发明的冷冻电子显微镜用栅格或通过基于所述本发明的冷冻电子显微镜用栅格的制造方法制造的冷冻电子显微镜用栅格，
在所述结构分析工序中，使用冷冻电子显微镜对与所述石墨烯栅格结合的所述结构分析对象物质进行结构分析。
发明效果
根据本发明，能够提供石墨烯栅格、石墨烯栅格的制造方法、结构分析对象物质的结构分析方法，例如，在基于冷冻电子显微镜的结构分析等中，能够抑制或防止结构分析对象物质的不均匀分布、取向性的偏差等，并且，能够高效率地捕捉结构分析对象物质，能够以高分辨率进行结构分析对象物质的结构分析。
附图说明
图1是示意性示出使用气相中的反应进行所述表面处理工序的装置的一个例子的图。
图2是示意性示出使用液体反应体系的表面处理工序的一个例子的图。
图3是示出参考例中的石墨烯的表面处理工序(氧化反应)前后的XPS测定结果的曲线图。
图4是示出石墨烯的表面处理工序(氧化)前后的基于AFM的测定结果的例子的图。
图5是示出参考例中结合了罗丹明B的石墨烯的荧光强度测定结果的曲线图。
图6是示出参考例中使用气相中的反应进行了所述表面处理工序的装置的示意图、以及所述表面处理工序前后的石墨烯表面的水的接触角的图。
图7上部是示意性示出GroEL与实施例中制造的石墨烯栅格结合的反应的方案。图7下部是通过使用2％乙酸铀水溶液的负染色法，以倍率15000倍观察结合有所述GroEL的石墨烯栅格表面的照片。
图8是实施例中制造的铜基板上石墨烯的FT-IR光谱图。
图9上部是示出实施例中的官能团导入工序(氧化后的表面修饰)前和后的石墨烯栅格表面的水的接触角的照片。图9中部是GroEL与实施例中制造的石墨烯栅格结合的反应的方案。图9下部是通过使用2％乙酸铀水溶液的负染色法，以倍率15000倍观察结合有所述GroEL的石墨烯栅格(冷冻电子显微镜用栅格)表面的照片。
图10上部是示出实施例中的官能团导入工序(氧化后的表面修饰)前和后的石墨烯栅格表面的水的接触角的照片。图10中部是示意性示出GroEL与实施例中制造的石墨烯栅格结合的反应的方案。图10下部是通过使用2％乙酸铀水溶液的负染色法，以倍率15000倍观察结合有所述GroEL的石墨烯栅格(冷冻电子显微镜用栅格)表面的照片。
图11上部是示意性示出β-半乳糖苷酶与实施例中制造的石墨烯栅格结合的反应的方案。图11下部是通过使用2％乙酸铀水溶液的负染色法，以倍率15000倍观察结合有所述β-半乳糖苷酶的石墨烯栅格(冷冻电子显微镜用栅格)表面的照片。
图12上部是实施例中导入有官能团的铜基板上石墨烯的FT-IR光谱。图12下部是示出所述实施例中所述官能团导入工序(氧化后的表面修饰)前和后的铜基板上石墨烯表面的水的接触角的照片。
图13是实施例中制造的铜基板上石墨烯的FT-IR光谱图。
图14是实施例中制造的铜基板上石墨烯的FT-IR光谱图。
图15是实施例中制造的铜基板上石墨烯的FT-IR光谱图。
图16是实施例中制造的铜基板上石墨烯的FT-IR光谱图。
图17是实施例中制造的铜基板上氧化石墨烯的FT-IR光谱图。
图18上部是示意性示出GroEL与导入有两性离子的石墨烯栅格结合的反应的方案。图18下部是通过使用2％乙酸铀水溶液的负染色法，以倍率15000倍观察结合有GroEL的石墨烯栅格(冷冻电子显微镜用栅格)表面的照片。
具体实施方式
以下，举例对本发明进一步进行具体说明。但是，本发明不受以下说明限定。
本发明的石墨烯栅格例如可以具有在石墨烯表面导入取代基，再通过所述取代基的反应而导入所述官能团的结构。
本发明的石墨烯栅格，例如，所述取代基可以为选自包含羟基、羧基、醛基、酮基或羰基的取代基，包含醚键的取代基，以及包含酯键的取代基中的至少一种取代基。所述包含酮基或羰基的取代基、以及所述包含酯键的取代基的结构没有特别限定，例如可举出如下述化学式A1所示石墨烯骨架的一部分发生了变化的结构。作为所述包含醚键的取代基，例如可举出环氧基等。作为所述环氧基的结构，没有特别限定，例如可举出后述的实施例的化学式E1所示的结构。
[化A1]
本发明的石墨烯栅格例如可以具有通过所述取代基与硅烷偶联剂和膦酸衍生物中的至少一者的反应而导入所述官能团的结构。
本发明的石墨烯栅格，例如，所述包含硅原子和磷原子中的至少一者的官能团可以是在其结构中包含选自羟基、羧基、醛基、羰基、醚键、环氧基、酯键、氨基、亚氨基、马来酰亚胺基、磺酰基、磺酰氧基、氟烷基、氰基、异氰酸基(异氰酸酯基)、乙烯基、苯乙烯基、甲基丙烯酰基、丙烯酰基、脲基、巯基、异硫氰酸酯基、叠氮基、乙炔基、酰亚胺酯基、卤化物、活化的羧基、NHS酯基、酰氯、酸酐和氟酯中的至少一者的官能团。作为所述“活化的羧基”，例如可举出所述NHS酯基、酰氯、酸酐和氟酯等原子团，但并不限定于这些。
本发明的石墨烯栅格例如可以是使基于冷冻电子显微镜的结构分析对象物质结合于所述本发明的石墨烯栅格的冷冻电子显微镜用栅格。
本发明的冷冻电子显微镜用栅格例如可以是使基于冷冻电子显微镜的结构分析对象物质结合于所述本发明的石墨烯栅格的冷冻电子显微镜用栅格。
本发明的冷冻电子显微镜用栅格例如可以是使基于冷冻电子显微镜的结构分析对象物质不结合所述本发明的石墨烯栅格的冷冻电子显微镜用栅格。
本发明的石墨烯栅格的制造方法(以下，有时简称为“本发明的制造方法”)，例如可以进一步包括：取代基导入工序，其中，使石墨烯表面与卤素氧化物自由基反应而对所述石墨烯表面进行改性从而导入所述取代基。
本发明的制造方法，例如所述卤素氧化物自由基可以为二氧化氯自由基。
本发明的制造方法，例如，所述取代基可以为选自包含羟基、羧基、醛基、酮基或羰基的取代基，包含醚键的取代基，以及包含酯键的取代基中的至少一种取代基。所述包含酮基或羰基的取代基、所述包含酰基的取代基、以及所述包含酯键的取代基没有特别限定，例如如上所述。
本发明的制造方法，例如，所述包含硅原子和磷原子中的至少一者的官能团可以是在其结构中包含选自羟基、羧基、醛基、羰基、醚键、环氧基、酯键、氨基、亚氨基、马来酰亚胺基、磺酰基、磺酰氧基、氟烷基、氰基、异氰酸基(异氰酸酯基)、乙烯基、苯乙烯基、甲基丙烯酰基、丙烯酰基、脲基、巯基、异硫氰酸酯基、叠氮基、乙炔基、酰亚胺酯基、卤化物、活化的羧基、NHS酯基、酰氯、酸酐和氟酯中的至少一者的官能团。作为所述“活化的羧基”，例如可举出所述NHS酯基、酰氯、酸酐和氟酯等原子团，但并不限定于这些。
本发明的制造方法例如通过所述取代基导入工序将所述石墨烯表面氧化，所述石墨烯表面被改性的物质可以是石墨烯表面被氧化的物质。
本发明的制造方法例如在所述取代基导入工序中，可以对反应体系进行光照射，也可以不对反应体系进行光照射。
本发明的制造方法例如所述取代基导入工序的反应体系可以为气体反应体系或液体反应体系。
本发明的制造方法例如也可以是一种冷冻电子显微镜用栅格的制造方法，其特征在于，包括结构分析对象物质结合工序，其中，进一步使基于冷冻电子显微镜的结构分析对象物质结合于通过所述本发明的制造方法制造的石墨烯栅格。
通过本发明的制造方法制造的冷冻电子显微镜用栅格可以是结合有基于冷冻电子显微镜的结构分析对象物质的石墨烯栅格，也可以是未结合基于冷冻电子显微镜的结构分析对象物质的石墨烯栅格。
本发明的结构分析对象物质的结构分析方法，例如，所述结构分析对象物质可以是有机物质。
本发明的结构分析对象物质的结构分析方法，例如，所述有机物质可以是蛋白质。
本发明的石墨烯栅格例如可以是仪器分析用栅格。
本发明的石墨烯栅格例如可以是电子显微镜用栅格。
本发明的石墨烯栅格例如可以是冷冻电子显微镜用栅格。
此外，本发明的石墨烯栅格的用途并不限于仪器分析用栅格、电子显微镜用栅格和冷冻电子显微镜用栅格，例如，除了生物反应器、传感器(例如酶传感器等生物传感器)、微反应器等用途以外，也可以为能够用于将抗体、各种蛋白质与珠等连结时的检测试剂或亲和柱色谱等的栅格。
本发明的冷冻电子显微镜用栅格能够用于使用了冷冻电子显微镜的结构分析对象物质的结构分析方法。具体的使用方法没有特别限定，例如可以是与通常的冷冻电子显微镜用栅格相同的使用方法。所述结构分析对象物质也没有特别限定，例如可以为选自蛋白质、抗体、核酸、病毒、核糖体、线粒体、离子通道、酶和酶复合物中的至少一者。作为所述结构分析对象物质的所述蛋白质，没有特别限定，例如可举出酶、伴侣蛋白、铁储藏蛋白质、抗体-抗原复合物、来自病毒的表面蛋白质等。作为所述酶，没有特别限定，例如可举出β-半乳糖苷酶、V1-ATPase等。作为所述伴侣蛋白，没有特别限定，例如可举出GroEL等。作为所述铁储藏蛋白质，没有特别限定，例如可举出铁蛋白等。另外，所述结构分析对象物质例如可以为生物体物质(生物体来源的物质或与其相同的物质)，但并不限定于此，可以是任意的。
根据本发明，例如，为了基于冷冻电子显微镜的结构分析对象物质(例如蛋白质等)的固定化、稳定化，能够简便且高效率地将适当的官能团导入至石墨烯栅格上。
根据本发明的制造方法，例如，通过硅烷偶联剂(有机硅烷)或膦酸衍生物与经表面处理的石墨烯栅格表面的取代基形成稳定的键，官能团导入后的稳定性高，且能够导入的官能团的变化广泛。
在本发明的制造方法中，如上所述，在所述石墨烯表面导入取代基的所述取代基导入工序也为对所述石墨烯表面进行改性的工序。以下，本说明书中，有时将所述取代基导入工序称为“表面处理工序”、“改性处理”或“改性方法”。在通过所述表面处理工序将所述石墨烯氧化的情况下，所述表面处理工序可以说是所述石墨烯的氧化方法。
本发明中，“取代基”和“官能团”没有特别限定，例如可以如上所述。另外，所述“取代基”和“官能团”分别可以为例如烃基或其衍生物基团。所述烃基或其衍生物基团没有特别限定，例如为下述烃或其衍生物的1价基团。所述烃例如可以为非芳香族或芳香族，可以为饱和或不饱和。具体而言，所述烃例如可以为直链状或支链状的饱和或不饱和的烃(例如，直链状或支链状的烷烃、直链状或支链状的烯烃、直链状或支链状的炔烃等)。另外，所述烃例如可以为包含非芳香族的环状结构的饱和或不饱和的烃(例如，环烷烃、环烯烃等)。此外，所述烃可以为芳香族烃。另外，所述烃在其结构中例如可以分别具有或不具有1个或多个芳香族或非芳香族的环。所述烃在其结构中例如可以分别具有或不具有1个或多个直链状或支链状的饱和或不饱和烃的烃基。所述不饱和烃例如可以是具有羰基(-C(＝O)-)的酮、酯、酰胺等。所述烃的碳原子数没有特别限制，例如可以为1～40、1～32、1～24、1～18、1～12、1～6、1～2，在所述烃为不饱和烃的情况下，碳原子数例如可以为2～40、2～32、2～24、2～18、2～12、2～6。作为所述烃的具体例，例如可举出甲烷、乙烷、丙烷、正丁烷、2-甲基丙烷、正戊烷、正己烷、乙烯、丙烯、1,3-丁二烯、乙炔、环戊烷、环己烷、环庚烷、环辛烷、甲基环己烷、环己烯、苯、甲苯、邻二甲苯、间二甲苯、对二甲苯、均三甲苯、杜烯、联苯、萘、1-甲基萘、2-甲基萘、蒽、菲、芘、苯乙烯等。
所述烃的“衍生物”例如为包含杂元素(碳和氢以外的元素)的有机化合物。所述杂元素没有特别限定，例如可举出氧(O)、氮(N)、硫(S)、卤素等。所述卤素例如可举出氟(F)、氯(Cl)、溴(Br)、碘(I)等。所述衍生物例如可以为烃基与任选的取代基或原子团键合而得到的结构的有机化合物。所述衍生物例如可以是多个烃基通过任意的原子团键合而成的结构的化合物，此外，所述烃基可以被任意的1个或多个取代基取代，也可以不被取代。所述烃基没有特别限定，例如可举出由所述烃衍生的1价或2价以上的基团。所述烃基例如其碳原子的1个或2个以上可以被杂原子取代。具体而言，例如，可以通过苯基的1个碳原子(及与其键合的氢原子)被氮原子取代而形成吡啶基。另外，所述取代基或原子团没有特别限定，例如可举出羟基、卤素基(氟基、氯基、溴基、碘基等)、烷氧基、芳氧基(例如苯氧基等)、羧基、烷氧基羰基、芳氧基羰基(例如苯氧基羰基等)、巯基、烷硫基、芳硫基(例如苯硫基等)、具有取代基的氨基或不具有取代基的氨基(例如氨基、烷基氨基、二烷基氨基等)、醚键(-O-)、酯键(-CO-O-)、硫醚键(-S-)等。
本发明中，链状取代基(例如烷基、不饱和脂肪族烃基等烃基)，只要没有特别说明，就可以为直链状或支链状，其碳原子数没有特别限定，例如可以为1～40、1～32、1～24、1～18、1～12、1～6、或1～2(不饱和烃基的情况下为2以上)。另外，本发明中，环状基团(例如芳基、杂芳基等)的环元数(构成环的原子数)没有特别限定，例如可以为5～32、5～24、6～18、6～12或6～10。另外，在取代基等存在异构体的情况下，只要没有特别说明，可以为任意的异构体，例如在简称为“萘基”的情况下，可以为1-萘基也可以为2-萘基。
本发明中，盐没有特别限制，例如可以为酸加成盐，也可以为碱加成盐。形成所述酸加成盐的酸例如可以为无机酸也可以为有机酸，形成所述碱加成盐的碱例如可以为无机碱也可以为有机碱。所述无机酸没有特别限定，例如可举出硫酸、磷酸、氢氟酸、盐酸、氢溴酸、氢碘酸、次氟酸、次氯酸、次溴酸、次碘酸、亚氟酸、亚氯酸、亚溴酸、亚碘酸、氟酸、氯酸、溴酸、碘酸、高氟酸、高氯酸、高溴酸和高碘酸等。所述有机酸没有特别限定，例如可举出对甲苯磺酸、甲磺酸、草酸、对溴苯磺酸、碳酸、琥珀酸、柠檬酸、苯甲酸和乙酸等。所述无机碱没有特别限定，例如可举出氢氧化铵、碱金属氢氧化物、碱土金属氢氧化物、碳酸盐和碳酸氢盐等，更具体而言，例如可举出氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸氢钾、氢氧化钙和碳酸钙等。所述有机碱没有特别限定，例如可举出乙醇胺、三乙胺和三(羟甲基)氨基甲烷等。
以下，举例对本发明的实施方式进一步进行具体说明。但是，本发明并不限于以下实施方式。
[1.表面处理工序(石墨烯表面被改性的物质的制造方法)]
基于本发明的石墨烯栅格的制造方法(本发明的制造方法)的特征在于，如上所述，包括官能团导入工序，使表面具有取代基的石墨烯的所述取代基与硅烷偶联剂和膦酸衍生物中的至少一者反应而导入包含硅原子的官能团。本发明的制造方法在所述官能团导入工序之前，例如，如上所述，可以包括取代基导入工序(表面处理工序)，使石墨烯表面与卤素氧化物自由基反应而对所述石墨烯表面进行改性从而导入所述取代基。所述表面处理工序也可以说是石墨烯表面被改性的物质的制造方法。以下，举例对所述表面处理工序进行具体说明。
(1)石墨烯
所述石墨烯为碳同素异形体的一种。作为碳同素异形体，除了石墨烯以外，例如可举出类金刚石碳(以下有时简称为“DLC”)、碳纳米管、富勒烯、纳米金刚石、石墨、金刚石或碳纤维等。如上所述，本发明的制造方法的特征在于，包括：使石墨烯表面与卤素氧化物自由基反应的表面处理工序；以及向所述被改性的表面导入官能团的官能团导入工序。另外，如上所述，本发明的石墨烯栅格是具有在石墨烯表面导入官能团的结构的石墨烯栅格。
与其它碳同素异形体相比，石墨烯非常薄，因此例如在用于冷冻电子显微镜用栅格等仪器分析用途的情况下，具有容易实现高分辨率的优势。具体而言，石墨烯理论上只有1原子份的厚度，因此例如在用于冷冻电子显微镜用栅格的情况下，信号/噪声比容易变高。因此，根据本发明，如上所述，能够以高分辨率进行结构分析对象物质的结构分析。
在本发明中，所述石墨烯可以包含或不包含碳以外的其它元素。作为所述其它元素，例如可举出氢、氧、氮、硫、硼、硅、磷、各种金属元素等。所述石墨烯例如可以仅通过碳原子彼此键合而形成骨架，并在表面键合有所述其它原子。例如，所述石墨烯可以在表面存在羟基、甲基、羧基、醛基、羰基、醚键、酯键等基团。在所述石墨烯包含所述其它元素的情况下，其含有率没有特别限定，例如以原子数计可以为整体的40％以下、20％以下或5％以下，例如以原子数计可以为整体的0.01％以上、0.1％以上或1％以上。
根据本发明的所述表面处理工序，例如，如后述所示，能够将石墨烯的表面氧化而导入羟基、羧基等官能团。该机理尚不明确，但推测是由于例如所述石墨烯表面的甲基等被氧化而转化为羟甲基、羧基等。但是，该说明是例示性的推测，本发明不受该说明限定。
(2)卤素氧化物自由基
在本发明中，所述卤素氧化物自由基包含在所述表面处理工序的反应体系中。关于所述卤素氧化物自由基，例如可以通过在所述反应体系中生成而包含在所述反应体系中，也可以使所述反应体系包含另行生成的所述卤素氧化物自由基。所述卤素氧化物自由基的产生方法没有特别限定。关于所述卤素氧化物自由基的产生，在下文叙述具体例。
所述卤素氧化物自由基例如可以为任一种，也可以并用两种以上。所述卤素氧化物自由基例如可以根据改性的对象的石墨烯的种类、反应条件等适当选择。
所述卤素氧化物自由基例如可举出：F2O·(二氟化氧自由基)、F2O2·(二氟化二氧自由基)、ClO2·(二氧化氯自由基)、BrO2·(二氧化溴自由基)、I2O5·(氧化碘(V))等卤素的氧化物自由基等。
(3)反应体系
所述表面处理工序中的所述反应体系为包含所述石墨烯和所述卤素氧化物自由基的反应体系。如上所述，所述反应体系例如可以为气体反应体系，也可以为液体反应体系。在所述表面处理工序中，对于所述反应体系，例如可以进行光照射，也可以不进行光照射。即，即使不对所述石墨烯进行光照射，也能够使所述石墨烯与所述卤素氧化物自由基反应。由于可以不对所述石墨烯进行光照射，因此例如可得到安全性的提高、成本节约等效果。例如，也可以在不同于所述表面处理工序的反应体系的自由基生成用反应体系中通过光照射而产生卤素氧化物自由基，而在所述表面处理工序的反应体系中不进行光照射。需要说明的是，如上所述，所述卤素氧化物自由基的产生方法本身没有特别限定，可以进行光照射，也可以不进行光照射。
(3A)气体反应体系
在所述反应体系为气体反应体系的情况下，例如，在包含所述卤素氧化物自由基的所述气体反应体系中配置所述石墨烯，进行光照射。但是，在本发明中，所述表面处理工序并不限于此。例如，只要能够使所述石墨烯表面与所述卤素氧化物自由基反应，则也可以不进行光照射来进行所述表面处理工序。所述气体反应体系包含例如所述自由基即可，所述气体反应体系中的气相的种类没有特别限制，为空气、氮、稀有气体、氧等。
本发明中，例如可以在所述表面处理工序前或所述表面处理工序的同时对所述气体反应体系导入所述卤素氧化物自由基，也可以使所述气体反应体系中产生所述卤素氧化物自由基。在前者的情况下，例如将包含所述卤素氧化物自由基的气体导入气相即可。在后者的情况下，例如，如后所述，可以通过使在液相的自由基生成用反应体系中产生的所述卤素氧化物自由基转移至气相中而进行导入。
作为具体例，在所述卤素氧化物自由基为所述二氧化氯自由基的情况下，例如能够通过向所述气相中导入二氧化氯气体而使所述气相中存在所述二氧化氯自由基。所述二氧化氯自由基例如可以通过电化学方法而在所述气相中产生。
(3B)液体反应体系
所述反应体系为液体反应体系的情况下，例如包含有机相。所述液体反应体系例如可以为仅包含所述有机相的单相反应体系，也可以为包含所述有机相和水相的两相反应体系。在仅包含所述有机相的单相反应体系的情况下，例如，如后所述，可以另行准备包含所述卤素氧化物自由基的产生源的水相，在所述水相中生成所述卤素氧化物自由基后，在所述水相中混合所述有机相，使所述水相的所述卤素氧化物自由基溶解(萃取)于所述有机相中。
(3B-1)有机相
如上所述，在所述有机相中配置有所述石墨烯，例如为包含所述卤素氧化物自由基且配置有所述石墨烯的有机溶剂的相。
所述有机溶剂没有特别限定。所述有机溶剂例如可以仅使用1种，也可以并用多种。在本发明中，所述有机溶剂例如如上所述，可举出卤代溶剂、含氟溶剂等。所述液体反应体系为所述两相反应体系的情况下，所述有机溶剂优选为例如能够形成所述两相体系的溶剂，即，与构成所述水相的后述水性溶剂分离的溶剂、相对于所述水性溶剂为难溶性或不溶性的溶剂。
“卤代溶剂”是例如烃的氢原子中的全部或大部分被卤素替代得到的溶剂。所述卤代溶剂例如可以为烃的氢原子数的50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、或90％以上被卤素替代的溶剂。所述卤代溶剂没有特别限定，例如可举出二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、四溴化碳和后述的氟溶剂等。
“氟溶剂”是上述卤代溶剂的1种，例如是指烃的氢原子的全部或大部分被氟原子取代的溶剂。所述氟溶剂例如可以为烃的氢原子数的50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、或90％以上被氟原子取代的溶剂。本发明中，如果使用所述氟溶剂，则例如所述溶剂本身的反应性低，因此具有能够进一步抑制或防止副反应的优点。所述副反应例如可举出所述溶剂的氧化反应、基于所述自由基的所述溶剂的夺氢反应或卤化反应(例如氯化反应)、以及来自于原料化合物的自由基与所述溶剂的反应(例如所述石墨烯的侧链或末端的烃基为乙基时，乙基自由基与所述溶剂的反应)等。所述氟溶剂难以与水混溶，因此例如适合于形成所述两相反应体系。
所述氟溶剂的例子例如可举出下述化学式(F1)～(F6)所表示的溶剂等，其中，例如优选下述化学式(F1)中的n＝4的CF3(CF2)4CF3等。
[化F1-F6]
所述有机溶剂的沸点没有特别限定。所述有机溶剂例如能够根据所述表面处理工序的温度条件来适宜选择。在所述表面处理工序中将反应温度设为高温的情况下，作为所述有机溶剂，可选择高沸点溶剂。需要说明的是，本发明例如如后所述，加热不是必须的，例如可以在常温常压下进行。在这样的情况下，所述有机溶剂例如无须为高沸点溶剂，从处理容易性的观点出发，可以使用沸点不太高的溶剂。
所述有机相例如可以仅包含所述石墨烯、所述卤素氧化物自由基和所述有机溶剂，也可以进一步包含其它成分。所述其它成分没有特别限定，例如可举处布朗斯特酸(Bronsted acid)、路易斯酸和氧(O2)等。在所述有机相中，所述其它成分例如可以为溶解于所述有机溶剂的状态，也可以为未溶解的状态。在后者的情况下，所述其它成分例如可以是分散于所述有机溶剂的状态，也可以是沉淀的状态。
如上所述，所述有机相包含所述卤素氧化物自由基。所述卤素氧化物自由基例如能够通过在所述有机相以外生成，并利用所述有机相进行萃取而包含在所述有机相中。即，在所述反应体系为仅包含有机相的单相反应体系的情况下，例如能够在作为所述反应体系的所述有机相以外另行生成所述卤素氧化物自由基，利用所述有机相对所生成的所述卤素氧化物自由基进行萃取，将包含萃取出的所述卤素氧化物自由基的所述有机相作为所述反应体系供于所述表面处理工序。所述卤素氧化物自由基的生成例如能够如后所述地在另行准备的水相中进行。另一方面，在所述液体反应体系为包含所述有机相和所述水相的两相体系反应体系的情况下，例如能够在所述水相中生成所述卤素氧化物自由基，将生成的卤素氧化物自由基从所述水相中萃取到所述有机相中，将所述水相和包含所述卤素氧化物自由基的有机相作为所述两相反应体系而供于所述表面处理工序。
所述石墨烯配置于所述有机相中。在所述石墨烯为成型体的情况下，例如，从后述的反应处理的效率的观点出发，所述成型体例如优选以将要进行表面处理的部分浸渍于所述有机相中，不从所述有机相中露出的方式固定于所述有机相中。
(3B-2)水相
所述水相例如为水性溶剂的相。所述水性溶剂例如为与在所述有机相中使用的溶剂分离的溶剂。所述水性溶剂例如可举出H2O、D2O等水。
所述水相例如如后述那样，可以包含路易斯酸、布朗斯特酸、自由基产生源等任意的成分。所述水相中，这些任意的成分例如可以为溶解于所述水性溶剂中的状态，也可以为未溶解的状态。在后者的情况下，所述任意成分例如可以为分散于所述水性溶剂的状态，也可以为沉淀的状态。
(4)表面处理工序
如上所述，所述表面处理工序是使所述石墨烯表面与所述卤素氧化物自由基反应的工序。所述表面处理工序，例如，对于所述反应的反应体系，可以进行光照射，也可以不进行光照射。以下主要说明对所述反应体系进行光照射的方法，但本发明并不限于此。如上所述，只要能够使所述石墨烯表面与所述卤素氧化物自由基反应即可，也可以不进行光照射来进行所述表面处理工序。在该情况下，例如在以下的说明中省略光照射来进行所述表面处理工序即可。如上所述，由于对所述石墨烯不进行光照射，因此可得到例如安全性的提高、成本节约等效果。
在所述反应体系中配置有所述石墨烯，能够对所述石墨烯进行改性。具体而言，根据本发明，在所述卤素氧化物自由基的存在下，能够容易地对所述石墨烯进行改性。根据本发明，例如通过调整所述卤素氧化物自由基的量、光照射的时间的长度等，也能够容易地调整所述石墨烯的改性的程度(例如氧化等改变的程度)。因此，例如，也能够防止因过度氧化等原因而导致的所述石墨烯的分解，例如也能够避免损害所述石墨烯本来所具有的特性。
在所述表面处理工序中，在所述石墨烯表面存在甲基的情况下，甲基(-CH3)例如被氧化为羟甲基(-CH2OH)、甲酰基(-CHO)和羧基(-COOH)中的至少任一种。推测其机理如下。即，通过光照射，由所述卤素氧化物自由基(例如二氧化氯自由基)产生所述卤素的自由基(例如氯自由基(Cl·))和所述氧的分子。然后，所述石墨烯表面的甲基(-CH3)因所述卤素的自由基(例如氯自由基(Cl·))作为夺氢剂发挥作用而成为碳自由基(-CH2·)，接着，所述氧的分子(例如O2)作为氧化剂发挥作用而成为羟甲基(-CH2OH)。另外，羟甲基(-CH2OH)通过进一步氧化而成为甲酰基(-CHO)或羧基(-COOH)。
在所述表面处理工序中，在所述石墨烯表面存在乙基的情况下，乙基(-CH2CH3)例如被氧化为羟乙基(-CH2CH2OH)、乙醛基(-CH2CHO)、羧甲基(-CH2COOH)。
另外，例如，在所述石墨烯表面包含亚甲基(-CH2-)的情况下，例如，所述亚甲基被氧化为羟基亚甲基(-CHOH-)、羰基(-CO-)等。
在所述表面处理工序中，光照射的条件没有特别限制。照射光的波长没有特别限定，下限例如为200nm以上，上限例如为800nm以下，光照射时间没有特别限定，下限例如为1秒以上，上限例如为1000小时，反应温度没有特别限定，下限例如为-20℃以上，上限例如为100℃以下、40℃以下，范围例如为0～100℃、0～40℃。反应时的气氛压力没有特别限定，下限例如为0.1MPa以上，上限例如为100MPa以下、10MPa以下、0.5MPa以下，范围例如为0.1～100MPa、0.1～10MPa、0.1～0.5MPa。作为所述表面处理工序的反应条件，例如可以例示出温度0～100℃或0～40℃、压力0.1～0.5MPa。另外，如上所述，例如即使省略光照射也能够进行所述表面处理工序。根据本发明，例如也能够不进行加热、加压、减压等，而在常温(室温)和常压(大气压)下进行所述表面处理工序或包含其在内的全部工序。“室温”没有特别限定，例如为5～35℃。因此，例如，即使包含耐热性低的石墨烯，所述石墨烯也能够适用。另外，根据本发明，例如也能够在不进行非活性气体置换等的情况下在大气中进行所述表面处理工序或包括其在内的全部工序。
所述光照射的光源没有特别限定，能够利用例如太阳光等自然光中包含的可见光。如果利用自然光，则例如能够简便地进行激发。另外，作为所述光源，例如能够代替所述自然光或在所述自然光的基础上还使用氙灯、卤素灯、荧光灯、汞灯、LED灯等光源。所述光照射中，例如进一步还能够适当使用将所需波长之外的波长截止的滤波器。
本发明也可以通过对所述石墨烯仅对任意区域进行光照，从而仅对所述区域进行改性处理。这样的选择性光照射的控制方法没有特别限制，例如可以仅对任意区域进行光照射，也可以仅掩盖不进行光照射的区域并对整体进行光照射。
在所述反应体系为所述液体反应体系的情况下，在所述表面处理工序中，例如可以至少对所述有机相进行光照射。在仅由所述有机相构成的单相反应体系的情况下，例如，能够通过对所述单相反应体系进行光照射而实施所述表面处理工序。在包含所述有机相和所述水相的两相反应体系的情况下，例如可以仅对有机相进行光照射，也可以对所述两相反应体系进行光照射。在所述液体反应体系的情况下，例如可以一边使所述液体反应体系与空气接触一边对所述液体反应体系进行光照射，在所述两相反应体系的情况下，可以在所述水相中溶解有氧的状态下进行光照射。
根据本发明，在所述表面处理工序中，例如通过在所述卤素氧化物自由基的存在下仅进行光照射的非常简便的方法，产生所述卤素的自由基(例如氯原子自由基Cl·)和氧分子O2，对所述石墨烯进行反应(例如氧化反应)，能够将所述石墨烯进行改性。然后，例如，即使在常温和常压等非常温和的条件下，也能够简便地使所述石墨烯高效地变化而进行改性。
根据本发明，例如不使用有毒的重金属催化剂等而得到所述石墨烯表面被改性的物质。因此，如上所述，例如能够在非常温和的条件下进行反应，并且能够通过对环境的负荷非常小的方法而高效进行所述石墨烯表面的改性。
作为石墨烯的表面的氧化方法，例如包括使用高锰酸钾(KMnO4)等强氧化剂的方法、利用气相中的等离子体处理的方法、利用臭氧气氛下的紫外线(UV)照射的方法等。但是，这样的方法不限于石墨烯的表面的氧化，有可能切断骨架的碳-碳键而分解所述石墨烯。与此相对，根据本发明的所述表面处理工序，如上所述，能够在温和的反应条件下进行反应，因此能够抑制或防止石墨烯骨架的碳-碳键的切断。另外，根据本发明的所述表面处理工序，容易控制反应条件。具体而言，例如，通过光照射的停止、所述卤素氧化物自由基的供给停止等，能够任意地停止所述表面处理工序中的反应。由此，例如能够进一步抑制所述石墨烯骨架的碳-碳键的切断，另外，例如容易控制所述石墨烯表面的反应的进行。因此，根据本发明，例如能够在不分解石墨烯的情况下高效地对所述石墨烯表面进行改性。需要说明的是，所述表面处理工序后的石墨烯的劣化(分解等)少的情况例如能够通过利用AFM(原子力显微镜)观察所述表面处理工序后的所述石墨烯表面来确认。另外，例如在基于使用了高锰酸钾的液相处理的氧化、臭氧气氛下的紫外线(UV)照射等中处理时间花费数十分钟的情况下，根据本发明的所述表面处理工序，例如也可以通过气相处理(干法工艺)简便且短时间(数分钟以内)地在维持石墨烯的结构的状态下进行石墨烯表面的改性(氧化处理)。由此，例如能够在之后的官能团导入工序中有效地导入官能团。但是，该说明为例示，本发明并不限定于此。例如，如上所述，本发明的所述表面处理工序中的反应体系不限于气体反应体系(气相处理)，也可以为液体反应体系。
(5)卤素氧化物自由基生成工序
本发明例如还可以包括生成所述卤素氧化物自由基的卤素氧化物自由基生成工序。所述卤素氧化物自由基生成工序例如可以在所述表面处理工序之前进行，或者与所述表面处理工序同时进行。所述卤素氧化物自由基的生成方法没有特别限制。
所述卤素氧化物自由基生成工序例如可以使用自由基生成用反应体系产生所述卤素氧化物自由基。所述表面处理工序中的反应体系例如可以为所述气体反应体系(气相)，也可以为所述液体反应体系(液相)。所述自由基生成用反应体系例如可以在生成所述卤素氧化物自由基后直接作为所述表面处理工序中的所述液体反应体系使用。
在所述表面处理工序的反应体系为所述气体反应体系的情况下，例如可以在所述表面处理工序的反应体系之外另行准备所述自由基生成用反应体系。所述自由基生成用反应体系例如可以为包含所述卤素氧化物自由基的产生源的水相。所述水相例如包含所述卤素氧化物自由基的产生源，在所述卤素氧化物自由基生成工序中由所述卤素氧化物自由基的产生源生成所述卤素氧化物自由基。所述水相例如为水性溶剂的相，所述水性溶剂与上述相同。在所述水相中产生的所述卤素氧化物自由基为疏水性的情况下，例如，通过制成包含所述有机相和所述水相的两相反应体系，可以使所述卤素氧化物自由基转移到所述有机相。如上所述，当在所述气体反应体系中进行所述表面处理工序的情况下，所述卤素氧化物自由基的生成用反应体系例如可以仅为水相，也可以为水相与有机相的两相反应体系。在所述卤素氧化物自由基为疏水性的情况下，例如，由于能够在所述水相中产生自由基而直接转移至所述气相，所以所述自由基生成用反应体系可以仅为所述水相。
所述表面处理工序的反应体系和所述自由基生成用反应体系例如可以为图1所示的反应体系。具体而言，首先，如图1所示，在培养皿3内配置自由基生成用反应体系5。自由基生成用反应体系5例如可以为包含所述卤素氧化物自由基的产生源的水相。所述卤素氧化物自由基的产生源没有特别限定，例如如后所述。另一方面，在另一培养皿4内配置石墨烯6。将这些培养皿3和4收纳在另一个大的培养皿1中，并且将盖2盖在培养皿1上，以防止内部气体泄漏。然后，对培养皿3内的自由基生成用反应系统5进行光照射。通过该光照射，在培养皿3内产生卤素氧化物自由基的气体，该卤素氧化物自由基的气体流入到培养皿4内而与石墨烯6反应。如此可以进行所述表面处理工序。另外，在图1中，例示了下述情况：自由基生成用反应体系5中的卤素氧化物自由基的产生源为亚氯酸钠水溶液(NaClO2aq)和盐酸(HCl)，通过它们的反应而产生的卤素氧化物自由基为二氧化氯自由基(ClO2·)。但是，如上所述，在本发明中，卤素氧化物自由基的产生源和卤素氧化物自由基并不限定于这些。
在所述表面处理工序的反应体系为所述液体反应体系、且包含所述水相的情况下，例如所述水相可以为所述自由基生成用反应体系。所述水相例如可以与所述表面处理工序的反应体系为所述气体反应体系时的所述自由基生成用反应体系相同。在所述水相中产生的所述卤素氧化物自由基为疏水性的情况下，例如，通过制成包含所述有机相和所述水相的两相反应体系，可以使所述卤素氧化物自由基转移到所述有机相。
所述卤素氧化物自由基的产生源(自由基生成源)没有特别限制，例如能够根据所述卤素氧化物自由基的种类适当选择。所述卤素氧化物自由基的产生源例如可以使用1种，也可以并用多种。
所述卤素氧化物自由基的产生源例如为包含氧和卤素的化合物，作为具体例，例如可举出亚卤酸(HXO2)或其盐。所述亚卤酸的盐没有特别限定，例如可举出金属盐，所述金属盐例如可举出碱金属盐、碱土金属盐、稀土类盐等。所述卤素氧化物自由基的产生源例如可以为包含氧、卤素和第IA族元素(例如选自H、Li、Na、K、Rb和Cs中的至少一种)的化合物，例如为所述亚卤酸或其碱金属盐。在所述卤素氧化物自由基为所述二氧化氯自由基的情况下，其产生源没有特别限定，例如为亚氯酸(HClO2)或其盐，具体而言，例如为亚氯酸钠(NaClO2)、亚氯酸锂(LiClO2)、亚氯酸钾(KClO2)、亚氯酸镁(Mg(ClO2)2)、亚氯酸钙(Ca(ClO2)2)等。其中，从成本、处理容易性等观点出发，优选亚氯酸钠(NaClO2)。例如，关于其它卤素氧化物自由基的产生源，也可以采用同样的盐等。作为其它产生源，例如可举出亚溴酸钠等溴酸盐类、亚碘酸钠等亚碘酸盐类等。
在所述水相中，所述产生源的浓度没有特别限定。在所述产生源为所述化合物的情况下，在其浓度换算为所述卤素氧化物离子浓度的情况下，例如下限为0.0001mol/L以上，上限为1mol/L以下，另外，在其浓度换算为所述卤素氧化物离子的摩尔数的情况下，例如下限为所述原料的摩尔数的1/100000倍以上，上限为1000倍以下。在所述产生源为亚卤酸或亚卤酸盐(例如亚氯酸或亚氯酸盐)的情况下，其浓度换算为亚卤酸根离子(例如亚氯酸根离子(ClO2 -))浓度的情况下，例如下限为0.0001mol/L以上，上限为1mol/L以下。另外，在所述产生源的浓度换算成亚卤酸根离子(例如亚氯酸根离子(ClO2 -))的摩尔数的情况下，例如下限为所述原料的摩尔数的1/100000倍以上，上限为1000倍以下。关于其它产生源，例如也能够引用所述浓度。
所述水相例如可以进一步包含路易斯酸和布朗斯特酸中的至少一者，从而使其作用于所述卤素氧化物离子而生成所述卤素氧化物自由基。所述路易斯酸和布朗斯特酸中的至少一者例如为包含所述第IA族元素的路易斯酸和布朗斯特酸中的至少一者。所述卤素氧化物离子例如为亚氯酸根离子(ClO2 -)。所述水相例如可以仅包含所述路易斯酸和所述布朗斯特酸中的一者，也可以包含两者，1种物质可以兼为所述路易斯酸和所述布朗斯特酸两者。所述路易斯酸或所述布朗斯特酸可以各自仅使用1种，也可以并用多种。在本发明中，“路易斯酸”是指例如相对于所述卤素氧化物自由基的产生源作为路易斯酸发挥作用的物质。
在所述水相中，所述路易斯酸和所述布朗斯特酸中的至少一者的浓度没有特别限定，例如可以根据所述改性对象的石墨烯的种类等适当设定。所述浓度的下限例如为0.0001mol/L以上，上限为1mol/L以下。
所述布朗斯特酸没有特别限定，例如可以为无机酸，也可以为有机酸，作为具体例，例如可举出三氟甲磺酸、三氟乙酸、乙酸、氢氟酸、氢氯酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、亚硫酸、硝酸、亚硝酸、磷酸、亚磷酸等。所述布朗斯特酸的酸解离常数pKa例如为10以下。所述pKa的下限值没有特别限定，例如为-10以上。
所述水相例如包含所述卤素氧化物离子和所述布朗斯特酸，例如优选为所述化合物和布朗斯特酸(例如盐酸)溶解于水性溶剂而成的水相。作为具体例，在所述卤素氧化物自由基为二氧化氯自由基的情况下，所述水相例如包含亚氯酸根离子(ClO2 -)和布朗斯特酸，例如优选所述亚氯酸钠(NaClO2)和所述布朗斯特酸(例如盐酸)溶解于水性溶剂而成的水相。
在所述水相中，例如所述路易斯酸、所述布朗斯特酸、所述自由基产生源等可以为溶解于所述水性溶剂中的状态，也可以为非溶解的状态。在后者的情况下，它们例如可以为分散于水性溶剂中的状态，也可以为沉淀的状态。
所述卤素氧化物自由基生成工序没有特别限定，例如通过在所述水性溶剂中含有所述卤素氧化物自由基的产生源，能够由所述卤素氧化物离子(例如，亚氯酸根离子)自然地产生所述卤素氧化物自由基(例如，二氧化氯自由基)。所述水相例如优选所述产生源溶解于所述水性溶剂中，此外，优选使其静置。在所述卤素氧化物自由基生成工序中，所述水相例如可以通过进一步共存有所述路易斯酸和所述布朗斯特酸中的至少一者而进一步促进所述卤素氧化物自由基的产生。所述卤素氧化物自由基生成工序例如也可以通过对所述水相实施光照射而产生所述卤素氧化物自由基，但是即使不进行光照射，例如仅进行静置也可以产生所述卤素氧化物自由基。
在所述水相中，推测由所述卤素氧化物离子产生所述卤素氧化物自由基的机理例如与后述的图2(液相反应体系中，有机相与水相的两相体系的情况)相同。但是，该说明仅为例示，对本发明没有任何限定。
在所述反应体系为所述液体反应体系、且为包含所述有机相和所述水相的两相反应体系的情况下，如上所述，在产生所述卤素氧化物自由基之后将所述液体反应体系直接供于所述的表面处理工序即可。所述反应体系中的所述水相中的所述产生源所产生的所述卤素氧化物自由基难溶于水，因此溶解于所述反应体系中的所述有机相中。例如，对于产生了所述卤素氧化物自由基的所述液体反应体系，也可以通过进一步进行光照射而进行将所述石墨烯的表面改性的所述表面处理工序。在该情况下，例如可通过对所述液体反应体系进行光照射而连续地进行所述卤素氧化物自由基生成工序和所述表面处理工序。在本发明中，通过在所述两相反应体系中进行所述卤素氧化物自由基生成工序和所述表面处理工序，例如可以得到更好的反应效率。
另一方面，在所述表面处理工序中的所述反应体系为所述液体反应体系，且为仅包含所述有机相的单相反应体系的情况下，例如，通过所述方法在所述水相中产生所述卤素氧化物自由基，使产生的所述卤素氧化物自由基溶解(萃取)于所述有机相后，除去所述水相，将包含所述卤素氧化物自由基的所述有机相作为所述单相反应体系而供于所述表面处理工序即可。
图2示意性地表示使用所述两相反应体系的所述卤素氧化物自由基生成工序和所述表面处理工序的一个例子。图2中，作为所述卤素氧化物自由基，示出所述二氧化氯自由基作为具体例，但本发明不受这些例子任何限制。如图2所示，所述反应体系，在反应容器中，水层(所述水相)和有机层(所述有机相)这两层分离，彼此仅在界面接触。上层为水层(所述水相)12，下层为有机层(所述有机相)11。图2是截面图，但为了容易观察，省略了水层12和有机层11的阴影线。如图2所示，水层(水相)12中的亚氯酸根离子(ClO2 -)与酸反应，产生二氧化氯自由基(ClO2·)。二氧化氯自由基(ClO2·)难溶于水，因此溶解于有机层11。接着，对包含二氧化氯自由基(ClO2·)的有机层11进行光照射，赋予光能，由此有机层11中的二氧化氯自由基(ClO2·)分解，产生氯自由基(Cl·)和氧分子(O2)。由此，有机层(有机相)11中的石墨烯被氧化，表面被改性。但是，图2是例示，对本发明没有进行任何限定。
在图2中，水层12为上层，有机层11为下层，但例如在有机层11的密度(比重)低的情况下，有机层11成为上层。例如，也可以以在上层的有机层中配置所述石墨烯的方式在所述反应容器中固定化。在该情况下，固定所述石墨烯的固定部例如可以设置在所述反应容器中，也可以设置在所述反应容器的外部。在后者的情况下，可举出例如从外部吊起所述石墨烯并浸渍于所述有机层中的方式等。
在图2中，例示了所述两相反应体系，但在本发明的制造方法中，所述表面处理工序也可以仅在有机相的单相反应体系中进行。在该情况下，例如另行准备包含所述卤素氧化物自由基的产生源的水相，在所述水相中生成所述卤素氧化物自由基后将所述有机相混合到所述水相中，使所述水相的所述卤素氧化物自由基溶解于(萃取到)所述有机相中。然后，将所述水相和所述有机相分离，回收所述有机相，配置所述石墨烯，将其作为单相反应体系，单独地在所述卤素氧化物自由基的存在下，进行基于所述光照射的所述表面处理工序。另外，在所述表面处理工序中的反应体系为气体反应体系的情况下，如上所述，可以在所述水相中生成所述卤素氧化物自由基后，在所述气体反应体系中进行所述表面处理工序。
作为石墨烯的表面的氧化方法，例如包括使用高锰酸钾(KMnO4)等强氧化剂的方法、利用气相中的等离子体处理的方法、利用臭氧气氛下的紫外线(UV)照射的方法等。但是，这样的方法不仅石墨烯的表面的氧化，而且有可能切断骨架的碳-碳键而分解所述石墨烯。与此相对，根据本发明的所述表面处理工序，如上所述，能够在温和的反应条件下进行反应，因此能够抑制或防止石墨烯骨架的碳-碳键的切断。另外，根据本发明的所述表面处理工序，容易控制反应条件。具体而言，例如，能够通过光照射的停止、所述卤素氧化物自由基的供给停止等，任意地停止所述表面处理工序中的反应。由此，例如能够进一步抑制所述石墨烯骨架的碳-碳键的切断，另外，例如容易控制所述石墨烯表面的反应的进行。因此，根据本发明，例如能够在不分解石墨烯的情况下高效地对所述石墨烯表面进行改性。需要说明的是，所述表面处理工序后的石墨烯的劣化(分解等)少的情况，例如能够通过利用AFM(原子力显微镜)观察所述表面处理工序后的所述石墨烯表面来确认。另外，例如在基于使用了高锰酸钾的液相处理的氧化、臭氧气氛下的紫外线(UV)照射等中处理时间花费数十分钟的情况下，根据本发明的所述表面处理工序，例如也能够利用气相处理(干法工艺)简便且短时间(数分钟以内)地在维持石墨烯的结构的状态下进行石墨烯表面的改性(氧化处理)。由此，例如能够在之后的官能团导入工序中有效地导入官能团。但是，该说明为例示，本发明不限定于此。例如，如上所述，本发明的所述表面处理工序中的反应体系不限于气体反应体系(气相处理)，也可以为液体反应体系。
在本发明的石墨烯栅格的制造方法中，如上所述，通过所述表面处理工序，例如能够在不分解石墨烯的情况下高效地对所述石墨烯表面进行改性。由此，例如如后所述，能够以高浓度将所述结构分析对象物质牢固地固定于所述冷冻电子显微镜表面，能够抑制或防止所述结构分析对象物质的不均匀分布(局部化，例如凝聚等)、取向性的偏差等。由此，例如与以往方法相比，能够显著地减少对冷冻电子显微镜用的测定条件的最佳化筛选所花费的时间。另外，还能够缩短用于结构分析的数据收集所花费的时间。
[2.石墨烯栅格的制造方法]
如上所述，本发明的石墨烯栅格的制造方法(本发明的制造方法)是石墨烯栅格的制造方法，所述石墨烯栅格是具有在石墨烯表面导入有包含硅原子的官能团的结构的石墨烯栅格，所述石墨烯栅格的制造方法的特征在于，包括：官能团导入工序，使在表面具有取代基的石墨烯的所述取代基与硅烷偶联剂反应而导入所述包含硅原子的官能团。所述取代基例如可以是通过使用了所述卤素氧化物自由基的取代基导入工序(表面处理工序)而导入的取代基。以下，主要对导入所述包含硅原子的官能团的官能团导入工序进行说明。
通过导入所述包含硅原子的官能团，能够对所述石墨烯赋予各种功能。具体而言，例如如后述的实施例所示，通过所述官能团，容易利用冷冻电子显微镜捕捉结构分析对象物质(例如蛋白质)。此外，例如通过适当选择所述官能团的种类，能够赋予与该官能团的种类相应的任意功能。
所述官能团导入工序例如可以对被氧化(改性)而导入有羟基、羧基、醛基(甲酰基)等取代基的石墨烯表面，通过所述羟基、羧基、醛基等取代基与其它物质的反应(例如缩合反应)而导入官能团。由此，例如能够导入通过与导入至所述石墨烯表面的所述取代基(例如羟基、羧基、醛基等)的反应而能够导入的任意官能团。所述其它物质例如如上所述，可以为硅烷偶联剂等。
本发明中，硅烷偶联剂的分子结构没有特别限定，例如可以适当使用通常的硅烷偶联剂。本发明中，硅烷偶联剂的分子结构例如可以为如下述化学式(I)所示。
[化I]
所述化学式(I)中，X例如可举出卤素基团(卤素)、烷氧基、羟基、烷基、氨基、芳基等，各X彼此可以相同也可以不同。作为所述卤素基团(卤素)，例如可举出氟基(氟原子)、氯基(氯原子)、溴基(溴原子)、碘基(碘原子)等。所述烷氧基，例如可举出甲氧基、乙氧基、丙氧基等。
所述化学式(I)中，FG为官能基，没有特别限定，例如可举出：羟基、羧基、醛基、羰基、醚键、环氧基、酯键、氨基、亚氨基、马来酰亚胺基、磺酰基、磺酰氧基、氟烷基、氰基、异氰酸基(异氰酸酯基)、和乙烯基、苯乙烯基、甲基丙烯酰基、丙烯酰基、脲基、巯基、异硫氰酸酯基、叠氮基、乙基、酰亚胺酯基、卤化物、活化的羧基(没有特别限定，例如NHS酯基、酰氯、酸酐、氟酯等)等。
所述化学式(I)中，L为连接硅原子Si和FG的原子团(连接基团)，或者不存在。L可以包含或不包含杂原子，可以为直链状也可以为支链状，可以包含或不包含环状结构。构成L的原子数没有特别限定，例如可以为0～3、0～5、0～12或0～30等。L例如可以为碳原子数1～3、1～4、1～7、或1～10的直链或支链亚烷基，例如可以为亚甲基、亚乙基(二亚甲基)、三亚甲基、四亚甲基、五亚甲基、六亚甲基、七亚甲基、八亚甲基等，所述直链或支链亚烷基的例如1个以上的亚甲基可以被醚基(-O-)、硫醚基(-S-)、亚氨基(-NH-)、羰基(-CO-)、或酯基(-COO-)取代。需要说明的是，本发明中，“杂原子”是指碳和氢以外的原子，例如可举出氧、硫、硒、氮、硅等。
本发明的石墨烯栅格的结构没有特别限定，例如可以为下述化学式(II)所示。
[化II]
所述化学式(II)中，Gr为石墨烯。X、FG和L与所述化学式(I)相同。各X彼此可以相同也可以不同，各FG彼此可以相同也可以不同，各L彼此可以相同也可以不同。L1为连接石墨烯和氧原子O的原子团(连接基团)，或者不存在，各L1彼此可以相同也可以不同。在L1存在的情况下，L1可以包含或不包含杂原子，可以为直链状也可以为支链状，可以包含或不包含环状结构。构成L1的原子数没有特别限定，例如可以为0～2、0～5、0～10或0～50等。L1例如可以为羰基、酮基、醚键、酯键等，例如可以为碳原子数1～24、1～18、1～12、或1～6的直链或支链亚烷基，例如可以为亚甲基、亚乙基(二亚甲基)、三亚甲基、四亚甲基、五亚甲基、六亚甲基、七亚甲基、八亚甲基等，所述直链或支链亚烷基的例如1个以上的亚甲基可以被醚基(-O-)、硫醚基(-S-)、亚氨基(-NH-)、或羰基(-CO-)、或取代。
需要说明的是，在所述化学式(II)中，X、FG、L和L1的数量为3，但这是示意性示出的，实际上存在多个。在本发明中，在石墨烯上存在取代基或官能团的情况下，全部相同。
本发明的石墨烯栅格的结构例如可以是在所述化学式(II)中具有羟基来代替取代基X的结构。例如，在硅烷偶联剂的取代基X为卤素基团或烷氧基的情况下，能够通过水解而转化为羟基。另外，本发明的石墨烯栅格的结构例如可以是如下述化学式(III)所示的相邻的硅彼此通过醚键键合的结构。下述化学式(III)中，Gr、X、FG、L和L1与所述化学式(II)相同。
[化III]
需要说明的是，在本发明的石墨烯栅格中，“包含硅原子的官能团”例如是指在所述化学式(II)或(III)中除石墨烯以外的部分、或者，除石墨烯和L1以外的部分。
在本发明中，膦酸衍生物的分子结构没有特别限定。作为所述膦酸衍生物，例如可以适当使用通常的膦酸衍生物作为与硅烷偶联剂相同的用途中使用的膦酸衍生物。在本发明中，膦酸衍生物的分子结构例如可以为如下述化学式(IV)所示。
[化IV]
在所述化学式(IV)中，R例如为氢原子、烷基或芳基，各R可相同也可以不同，L和FG例如与所述化学式(I)相同。
本发明的石墨烯栅格的结构如上所述没有特别限定，例如可以为如下述化学式(V)所示。
[化V]
在所述化学式(V)中，R、L和FG与所述化学式(IV)相同，Gr和L1与所述化学式(II)或(III)相同。
需要说明的是，在本发明中，硅烷偶联剂和膦酸衍生物分别可以自身合成，也可以直接使用市售品。另外，例如，在硅烷偶联剂和膦酸衍生物分别以溶液或分散液的状态市售的情况下，例如，可以直接用于所述官能团导入工序中的反应。
在本发明的石墨烯栅格的制造方法中，如上所述，所述官能团导入工序是使表面具有取代基的石墨烯的所述取代基与硅烷偶联剂和膦酸衍生物中的至少一者反应而导入所述包含硅原子的官能团的工序。下述方案A中示意性地表示所述官能团导入工序的一个例子。下述方案A是所述取代基为羟基的例子。在下述方案A中，R例如为烷基(例如甲基、乙基等)，FG为与所述化学式(I)、(II)和(III)相同的官能团。在下述方案A中，硅原子与官能基FG直接键合，但如上所述，也可以介由连结基团L键合。
[化A]
另外，下述化学式分别表示作为官能团FG具有氨基的硅烷偶联剂、具有环氧基的硅烷偶联剂、具有异氰酸酯基的硅烷偶联剂、具有羧基的硅烷偶联剂的一个例子。但是，这些例示对本发明没有任何限定。
[化SiC]
所述官能团导入工序中的反应条件没有特别限定，可以任意设定。以下，主要对在所述官能团导入工序中使用硅烷偶联剂时的反应条件进行说明，但在硅烷偶联剂的基础上或代替硅烷偶联剂而使用膦酸衍生物的情况下，也能够在与其同样或基于此的反应条件下进行。所述官能团导入工序中的反应条件例如能够在与通常的硅烷偶联剂的反应相同的或基于此的反应条件下进行。所述反应条件例如可以与现有的相同的或类似的反应的反应条件相同或以其为基准。例如，在通过羟基或羧基与硅烷偶联剂的反应而导入官能团的情况下，可以使用羟基或羧基与硅烷偶联剂的现有反应的反应条件相同或基于此的反应条件。
所述官能团导入工序具体而言例如能够按照如下方式进行。首先，准备在表面具有取代基的石墨烯。所述表面具有取代基的石墨烯例如可以是通过前述的所述表面处理工序(取代基导入工序)导入取代基的石墨烯。所述取代基没有特别限定，例如，如上所述，可以为羟基、羧基、醛基等。
接着，使硅烷偶联剂与所述表面具有取代基的石墨烯的所述具有取代基的表面接触。此时，可以将所述硅烷偶联剂制成溶解于溶剂的溶液，或者制成分散于分散介质的分散液来使用。作为所述溶剂或分散介质，没有特别限定，例如可以是水，可以是有机溶剂，也可以是水与有机溶剂的混合物。所述有机溶剂没有特别限定，例如可举出甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇、乙二醇、二乙二醇、三乙二醇、丙二醇、苄醇等醇，丙酮、甲基乙基酮、甲基异丁基酮、二异丁基酮、环己酮、二丙酮醇等酮，二乙基醚、四氢呋喃、1,4-二恶烷、甲基叔丁基醚、乙基乙氧基丙酸酯等醚，以及乙酸乙酯、乙酸丁酯、乙酸丙酯、乙酸异丙酯、乳酸甲酯、乳酸乙酯、乳酸丁酯、3-甲氧基-3-甲基丁基乙酸酯等酯，苯、甲苯、二甲苯、松节油系、异链烷烃系、正链烷烃系、环烷烃系金属清洗剂、芳烃溶剂、正己烷等烃、N-甲基-2-吡咯烷酮、二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺等胺类，可举出二氯甲烷、氯仿、三氯乙烯、全氯乙烯、溴丙烷等卤素系溶剂等，可以仅使用1种，也可以使用多种。在混合多种所述溶剂或所述分散介质的情况下，其混合比没有特别限定，例如，考虑硅烷偶联剂的溶解度或溶剂的沸点等适当设定即可。例如，可以将水与醇(例如甲醇、乙醇等)以适当的比例混合使用。所述溶液或分散液中的所述硅烷偶联剂的浓度没有特别限定，例如可以为25mmol/L以上、15mmol/L以上、10mmol/L以上、5mmol/L以上、或1mmol/L以上，例如可以为25mmol/L以下、15mmol/L以下、10mmol/L以下、5mmol/L以下、或1mmol/L以下。所述溶液或分散液的使用量也没有特别限定，相对于所述石墨烯的表面积1mm2，所述硅烷偶联剂的摩尔数例如可以成为25mmol以上、15mmol以上、10mmol以上、5mmol以上或1mmol以上，例如可以成为25mmol以下、15mmol以下、10mmol以下、5mmol以下或1mmol以下。
此外，在使硅烷偶联剂与所述表面具有取代基的石墨烯的所述具有取代基的表面接触的状态下静置片刻，使所述石墨烯与所述硅烷偶联剂反应。由此，例如能够使所述石墨烯表面的所述取代基与所述硅烷偶联剂键合。所述反应的反应温度没有特别限定，例如可以为130℃以上、120℃以上、100℃以上、80℃以上或70℃以上，例如可以为130℃以下、120℃以下、100℃以下、80℃以下或70℃以下。所述反应的反应时间没有特别限定，例如可以为30分钟以上、20分钟以上、15分钟以上、10分钟以上或5分钟以上，例如可以为30分钟以下、20分钟以下、15分钟以下、10分钟以下或5分钟以下。如上所述，能够通过进行所述官能团导入工序并使所述取代基与硅烷偶联剂反应以导入包含硅原子的官能团来制造本发明的石墨烯栅格。需要说明的是，上述反应后，例如可以通过溶剂或分散介质等将残留于所述石墨烯栅格表面的多余的硅烷偶联剂等清洗除去。该清洗用的溶剂或分散介质没有特别限定，可以使用与所述反应用溶剂或分散介质相同的溶剂或分散介质。
作为所述官能团导入工序，例如可举出后述的实施例中记载的例子。此外，例如能够使用包含2,3-环氧丙基的硅烷偶联剂导入环氧基，进而在所述环氧基与蛋白质或1H,1H-十一氟己胺等之间进行加成反应。需要说明的是，1H,1H-十一氟己胺并不限定于此，也可以为其它任意的胺。所述胺没有特别限定，例如可以为伯胺，也可以为仲胺。进而，本发明并不限定于这些，只要不脱离本发明的范围，则是任意的。
另外，通过所述官能团导入工序能够导入的官能团没有特别限定，例如，如上所述，可以导入通过与导入到所述石墨烯表面的所述取代基(例如羟基、羧基、醛基等)的反应而能够导入的任意官能团。在所述官能团导入工序中导入的官能团例如如上所述，可以为选自羟基、羧基、醛基、羰基、醚键、环氧基、酯键、氨基、亚氨基、马来酰亚胺基、磺酰基、磺酰氧基、氟烷基、氰基、异氰酸基(异氰酸酯基)、以及乙烯基、苯乙烯基、甲基丙烯酰基、丙烯酰基、脲基、巯基、异硫氰酸酯基、叠氮基、乙炔基、酰亚胺酯基、卤化物、活化的羧基(没有特别限定，例如NHS酯基、酰氯、酸酐、氟酯等)中的至少一种。所述氟烷基可以是烷基的氢原子的一部分或全部被氟原子取代的基团，例如可以是烷基的全部氢原子被氟原子取代的全氟烷基，例如可以是三氟甲基。另外，所述官能团例如可以为2个以上的官能团的组合，例如可以为三氟甲基与酯键的组合即三氟乙酰基，例如可以为三氟甲基与磺酰基的组合即三氟甲基磺酰基。需要说明的是，本发明中，“烷基”的碳原子数没有特别限定，例如可以为1～24、1～18、1～12、1～6等，另外，“烷基”可以为直链状也可以为支链状。对于烷基的至少一个氢原子被取代的基团(例如氟烷基)、在结构的一部分中包含烷基的基团(例如烷氧基、烷酰基)、由烷基衍生的基团(例如亚烷基)等也是同样的。可以使作为在所述官能团导入工序中导入的具体的官能团，例如，琥珀酰亚胺基、异硫氰基、磺酰氯基、羧酰氯基、环氧乙烷基、烷基氯基、羧酸酐基、马来酰亚胺基、酰肼等官能团与所述石墨烯表面的羟基、羧基、醛基等取代基反应而导入至所述石墨烯表面。如此导入的官能团例如可以与氨基、巯基(也称为-SH、巯基、硫醇基)、醛基等基团反应，因此能够结合具有这些基团的化合物(例如蛋白质等)而进行捕捉。
硅烷偶联剂通常容易与无机材料反应，能够形成牢固的键。因此，硅烷偶联剂与导入至石墨烯表面的羟基、羧基等反应基团同样容易反应，能够形成牢固的键。另外，例如，如上所述，能够在温和的反应条件下简便地进行使石墨烯表面的取代基与硅烷偶联剂反应而导入所述包含硅原子的官能团的所述“官能团导入工序”。进而，硅烷偶联剂能够采用各种各样的结构，具体而言，例如能够为具有如上所述的多种多样的官能团的结构。因此，根据本发明的制造方法，例如，能够将各种各样官能团导入石墨烯栅格中。因此，如果通过本发明的制造方法制造石墨烯栅格，例如，在将该石墨烯栅格被用作冷冻电子显微镜用栅格的情况下，能够对应各种各样的结构分析对象物质。
另外，在所述官能团导入工序中，在使用膦酸衍生物的情况下，也能够得到与使用硅烷偶联剂时的所述优点相同的优点。另外，如果使用膦酸衍生物，则有可能得到例如与硅烷偶联剂相比不易水解且稳定、容易与石墨烯表面的取代基更牢固地结合等优点。但是，该说明仅为例示，对本发明没有任何限定。
通过本发明的制造方法制造的石墨烯栅格例如能够用作冷冻电子显微镜用栅格。例如，在基于冷冻电子显微镜进行结构分析时，可以使基于冷冻电子显微镜的结构分析对象物质结合于通过本发明的制造方法制造的冷冻电子显微镜用栅格(石墨烯栅格)来进行使用。通过本发明的制造方法制造的冷冻电子显微镜用栅格可以是结合了基于冷冻电子显微镜的结构分析对象物质的石墨烯栅格，也可以是未结合基于冷冻电子显微镜的结构分析对象物质的石墨烯栅格。
[3.石墨烯栅格(冷冻电子显微镜用栅格等)]
本发明的石墨烯栅格的特征在于，如上所述，具有在石墨烯表面导入有包含硅原子的官能团的结构。本发明的石墨烯栅格例如能够用作冷冻电子显微镜用栅格。例如，在基于冷冻电子显微镜进行结构分析时，能够使基于冷冻电子显微镜的结构分析对象物质结合于本发明的冷冻电子显微镜用栅格(石墨烯栅格)来使用。另外，如上所述，本发明的石墨烯栅格例如可以为使基于冷冻电子显微镜的结构分析对象结合于所述本发明的石墨烯栅格的冷冻电子显微镜用栅格。本发明的冷冻电子显微镜用栅格可以是结合了基于冷冻电子显微镜的结构分析对象物质的石墨烯栅格，也可以是未结合基于冷冻电子显微镜的结构分析对象物质的石墨烯栅格。
本发明的石墨烯栅格的制备方法没有特别限定，例如可以通过所述的本发明的石墨烯栅格的制造方法进行制造。如上所述，该制造方法包括所述官能团导入工序。另外，如上所述，本发明的制造方法可以进一步包括所述表面处理工序(取代基导入工序)。
另外，例如，也能够通过对所述石墨烯省略所述表面处理工序而进行所述官能团导入工序，从而制造本发明的石墨烯栅格。更具体而言，例如只要未进行所述表面处理工序的所述石墨烯表面具有羟基、羧基等取代基，则通过对这些取代基进行所述官能团导入工序也能够制造本发明的石墨烯栅格。
本发明的石墨烯栅格例如通过使基于冷冻电子显微镜等的结构分析对象物质结合于所述官能团，从而能够抑制或防止所述结构分析对象物质的不均匀分布、取向性的偏差等。另外，如上所述，本发明的石墨烯栅格例如能够通过使基于冷冻电子显微镜等的结构分析对象物质结合于所述官能团而用作冷冻电子显微镜用栅格。需要说明的是，在本发明中，“结合”没有特别限定，例如可以是化学键合，也可以是基于物理力的结合。本发明中，“键合”例如可以是共价键、离子键等，也可以是氢键或其它各种相互作用，但不限于这些。本发明中，“键合”例如可举出共价键、离子键、金属配位键、主体-客体相互作用、氢键、基于范德华力的键、偶极-偶极相互作用、阳离子-Π相互作用、阴离子-Π相互作用、以及卤素键等。在本发明的石墨烯栅格中，所述官能团与所述结构分析对象物质的结合没有特别限定，例如可以是所述各种键合中的任一种，可举出共价键、离子键、金属配位键、主体-客体相互作用、氢键、基于范德华力的键、偶极子-偶极子相互作用、阳离子-Π相互作用、阴离子-Π相互作用、以及卤素键等，从键合的强度的观点出发，特别优选共价键。
在本发明的石墨烯栅格中，通过使基于冷冻电子显微镜等的结构分析对象物质与所述官能团形成共价键，例如具有如下优点。第一，如果通过共价键将所述结构分析对象物质结合于所述官能团，则即使对冷冻电子显微镜表面进行清洗，所述结构分析对象物质也不容易脱落。因此，通过所述清洗，能够洗掉在所述冷冻电子显微镜表面未形成共价键的不需要的杂质(例如在气-液界面变性的蛋白质等)，能够进行高精度的结构分析。第二，即使所述结构分析对象物质为难以浓缩的物质(例如难以浓缩的蛋白质等)，通过多次反复进行与所述官能团的共价键的形成，能够以高浓度将所述结构分析对象物质导入所述冷冻电子显微镜表面。由此，例如能够显著缩短用于冷冻电子显微镜用的测定条件的最佳化筛选、结构分析的数据收集所花费的时间。第三，根据共价键能够将所述结构分析对象物质牢固地固定于所述冷冻电子显微镜表面，因此能够抑制或防止所述结构分析对象物质的不均匀分布(局部化，例如凝聚等)、取向性的偏差等。因此，能够高精度且高分辨率地对所述结构分析对象物质进行结构分析。第四，例如通过具有所述第一至第三特征，例如如在后述的实施例中所证实的那样，即使不在所述结构分析对象物质(例如蛋白质)中导入标签等，也能够高精度且高分辨率地进行结构分析。因此，不需要在所述结构分析对象物质中导入标签等的工序，因此能够在短时间内简便地制造测定样品(结合了所述结构分析对象物质的本发明的冷冻电子显微镜用栅格)。如此，根据本发明，例如与以往相比，能够显著缩短冷冻电子显微镜用的测定样品制备时间，并且能够通过比以往更容易的操作来制备所述测定样品。但是，本发明并不限于在所述结构分析对象物质中不导入标签等的方式，也可以在所述结构分析对象物质(例如蛋白质)中导入标签等来进行结构分析。
以往的冷冻电子显微镜用碳栅格的所述栅格与结构分析对象物质的结合力弱，因此如上所述，在所述碳栅格上发生所述结构分析对象物质的不均匀分布(局部化)、取向性的偏差等，有可能对结构分析带来障碍。与此相对，如上所述，本发明的石墨烯栅格能够使结构分析对象物质强力地结合。由此，能够抑制或防止所述结构分析对象物质的不均匀分布、取向性的偏差等。
使所述结构分析对象物质与所述官能团结合的方法没有特别限定。例如，可以根据所述官能团与所述结构分析对象物质的组合，适当设定与公知的类似反应的反应条件相同或基于此的反应条件。例如，可以在所述结构分析对象物质的溶液(例如水溶液)中以适宜的时间浸渍具有所述官能团的本发明的石墨烯栅格，但并不限于该方法。
所述结构分析对象物质也没有特别限定，例如，可以与通常的冷冻电子显微镜的结构分析对象物质相同，也可以不同。作为所述结构分析对象物质，例如可举出蛋白质、抗体、核酸、病毒、核糖体、线粒体、离子通道、酶和酶复合物等。作为所述蛋白质，例如可举出以物性分类时的膜蛋白质、水溶性蛋白质、糖蛋白质、以功能分类时的酶蛋白质、结构蛋白质、转录因子、转运蛋白质、储存蛋白质、收缩蛋白质、防御蛋白质等，例如除了作为分析的标准蛋白质使用的脱铁铁蛋白以外，还可举出核糖体、蛋白酶体、RNA聚合酶、衣壳、GPCR、光化学系复合物、ATP合成酶、与抗体的复合物等。另外，由它们构成的微管蛋白等也可以成为本发明中的所述结构分析对象物质。此外，作为本发明中的所述结构分析对象物质，还可举出肌肉、胶原蛋白、鞭毛这样的组织本身。另外，例如，也可以使用抗体等作为标记蛋白质，将生命体本身、组织表面等作为本发明中的所述结构分析对象物质。
根据本发明的石墨烯栅格，如上所述，能够抑制或防止所述结构分析对象物质的不均匀分布、取向性的偏差等。另外，根据本发明的冷冻电子显微镜用栅格，对于在以往的冷冻电子显微镜用栅格中难以进行结构分析的物质也能够进行结构分析。例如，由于膜蛋白质等难以结晶化，所以利用以往的冷冻电子显微镜用栅格难以进行三维结构分析。与此相对，本发明的石墨烯栅格由于能够将所述膜蛋白质等结构分析对象物质强力地结合而使结构稳定化，因此能够进行结构分析，例如也能够进行三维结构分析。另外，根据本发明的石墨烯栅格，例如也能够进行蛋白质的单粒子分析等。
本发明的石墨烯栅格的使用方法没有特别限定，例如可以与通常的冷冻电子显微镜用栅格的使用方法相同。例如，与通常的冷冻电子显微镜用栅格同样地，通过使用冰包埋法对所捕捉的结构分析对象物质进行显微镜观察，能够进行结构分析。
在本发明中，例如，如上所述，即使不对蛋白质附加标签等，也能够以高精度且高分辨率进行结构分析。但是，如上所述，本发明并不限定于在所述结构分析对象物质中不导入标签等的方式，也可以向所述结构分析对象物质(例如蛋白质)导入标签等来进行结构分析。
另外，本发明的石墨烯栅格的用途并不限于冷冻电子显微镜用栅格，能够用于任意的广泛的用途，例如，除了生物反应器、传感器(例如酶传感器等生物传感器)、微反应器等用途以外，还能够用于将抗体、各种蛋白质与珠等连结时的检测试剂或亲和柱色谱等。
[实施例]
以下，针对本发明的实施例进行说明。但是，本发明并不限于以下的实施例。
[参考例1]
如下所述，通过本发明的所述表面处理工序对石墨烯表面进行改性而导入取代基，制造石墨烯表面被改性的物质。
在本参考例中，使用气相中的反应进行了所述表面处理工序。
首先，如图1所示，在直径5cm的培养皿3中加入去离子水20mL，进一步溶解亚氯酸钠NaClO2(300mg)和36质量％HCl水溶液(100μL)，制成盐酸酸性NaClO2水溶液(自由基生成用反应体系)5。另一方面，在直径3cm的培养皿4中加入10mg石墨烯6。将这些培养皿3和4收纳在直径11cm的培养皿1中。进而，在培养皿1上盖上盖2以使内部的气体不泄漏。然后，在室温下，从培养皿1的上方以光量10mW/cm2对培养皿3内的盐酸酸性NaClO2水溶液5照射波长365nm的LED光3分钟、10分钟、30分钟或60分钟。通过该光照射，在培养皿3内通过盐酸与NaClO2的反应而产生并流入到培养皿4内的ClO2自由基的气体被活化，与石墨烯6反应。通过该表面处理工序，对石墨烯6的表面进行了氧化。将氧化后的石墨烯6在减压下干燥24h，得到目标物(石墨烯6的表面被改性的物质)。
在本实施例中，作为石墨烯6，使用粉末状的石墨烯(富士胶片和光纯药株式会社：商品名“06-0313”)，制造石墨烯6的表面被改性的物质。
对于所述石墨烯6，在表面处理工序(氧化反应)前和后，分别进行X射线光电子能谱法(XPS)测定，检测C1s(碳原子的1s轨道)的能量峰位置，由此确认氧化反应的进行。图3的曲线图表示其XPS测定结果。在各图中，横轴为结合能(eV)，纵轴为峰强度的相对值(cps)。
如上所述，图3表示石墨烯的表面处理工序(氧化反应)前后的XPS测定结果。如图所示，在反应30分钟后没有大的变化，但在反应60分钟后，观察到C＝C键峰的衰减、C-OH键峰和C-O-C键峰的增大，因此确认到石墨烯表面的氧化。另外，将所述基于XPS的元素分析结果示于下述表1。如表1所示，氧化反应后O原子数的比率增加，由此也确认到石墨烯表面的氧化。
[表1]
石墨烯的元素比率
0 C
反应前 5.4 94.6
氧化反应30分钟后 8.3 91.6
氧化反应60分钟后 11.4 87.8
另外，利用AFM(原子力显微镜)分别观察表面处理工序(氧化反应)前后的所述石墨烯的表面状态。具体而言，使用扫描型探针显微镜(岛津制作所，商品名SPM-9500J3，悬臂：OLYMPUS公司制造，商品名OMCL-AC200TS-C3)进行了表面形态的评价。将其结果示于图4。如图所示，根据该AFM的评价，通过所述表面处理工序(氧化反应)未观察到所述石墨烯的损伤等，未确认到所述石墨烯的劣化。
另外，推测本参考例中的氧化后的石墨烯表面的结构例如如下述化学式E1所示。但是，该结构是推测的结构的一个例子。
[化E1]
[参考例2]
对于参考例1的石墨烯，通过以下的方法使罗丹明B结合，进而测定荧光强度。
首先，在试管内添加6mg罗丹明B。接下来，向其中加入2ml去离子水，进一步加入0.1M乙酸水溶液，使pH为6.5。将这些溶液准备2个，分别加入氧化反应前的石墨烯和氧化反应60分钟后的石墨烯，在室温下搅拌15分钟。分别反应后使用3mL去离子水清洗2次，减压干燥24h。然后，分别使用UV-vis光谱仪以555nm为激发光在560～660nm的范围内测定荧光强度。
图5示出石墨烯的荧光强度测定结果。在该图中，横轴为波长(nm)，纵轴为峰强度(相对值)。如图所示，氧化反应后的石墨烯的575nm附近的峰强度增大，因此确认到结合有罗丹明B。需要说明的是，由此可以推测，在氧化反应后，在石墨烯的表面导入了羟基或羧基或这两者。
[参考例3]
制造石墨烯栅格，进行使该石墨烯栅格与二氧化氯自由基反应的表面处理工序，进行将表面改性(氧化)的表面改性工序(取代基导入工序)，导入取代基，制造表面被改性(氧化)的石墨烯栅格。
[石墨烯栅格的制造]
将由聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)-石墨烯-Cu这三层构成的片材以Cu面与0.5mol/L的过硫酸铵水溶液的水面接触的方式漂浮，静置30分钟，由此使Cu层溶解。将如此除去Cu层而得到的PMMA-石墨烯片在超纯水中每次漂浮10分钟，共计2次进行清洗。然后，在充满超纯水的膜张紧器(应研商事公司制造，商品名collodion膜张紧器)的底部排列TEM用的Mo栅格(Quantifoil Micro Tools GmbH公司制造，商品名QUANTIFOIL)或Au栅格(QuantifoilMicro Tools GmbH公司制造，商品名QUANTIFOIL)。此外，使所述PMMA-石墨烯片漂浮于该膜张紧器的水面，轻轻地将水排出，由此在所述栅格上贴附所述PMMA-石墨烯片。将该栅格在室温下干燥1小时后，在130℃进行20分钟加热处理。然后，分别将所述栅格依次浸渍于60℃的丙酮中60分钟、室温(约25℃)的氯仿中30分钟、乙酸中3小时、异丙醇中10分钟，进行共计2次，除去PMMA。最后，在100℃进行10分钟加热处理，制造Mo栅格或Au栅格表面被石墨烯被覆的石墨烯栅格。
[石墨烯栅格与二氧化氯自由基的反应(表面处理工序)]
将由所述Mo栅格或Au栅格制造的所述石墨烯栅格分别在130℃进行15分钟热处理。通过与参考例1和图1中说明的方法相同的方法，利用二氧化氯自由基(ClO2自由基)对该加热处理后的石墨烯栅格进行表面处理工序(表面的氧化)。但是，在本实施例中，利用铝箔覆盖所述石墨烯栅格，以使LED光(UV光)不直接照射到所述石墨烯栅格，从而进行了所述表面处理工序(表面的氧化)。反应时间(光照射时间)设为10分钟，反应温度与参考例1相同设为室温。对于表面处理工序前后的所述石墨烯栅格，分别与参考例1相同，进行XPS测定。由此，在所述表面处理工序后，观察到C＝C键峰的衰减、C-OH键峰和C-O-C键峰的增大，进而，O原子数的比率增加，因此确认到石墨烯表面的氧化。
[参考例4]
如下所述，通过本发明的所述表面处理工序对石墨烯栅格表面进行改性，制造石墨烯栅格表面被改性的物质。
首先，使亚氯酸钠NaClO2(200mg)溶解于超纯水20mL后，添加37质量％HCl水溶液(100μL)，制备1质量％的盐酸酸性NaClO2水溶液(自由基生成用反应体系)。接着，如图6所示，将盐酸酸性NaClO2水溶液添加至10cm×10cm的玻璃制双层容器(培养皿)的外侧的容器中。另一方面，在所述玻璃制双层容器的内侧的容器内放入盖玻片，在其上载置通过参考例3的方法制造的石墨烯栅格。进而，在所述玻璃制双层容器上盖上盖以使内部的气体不泄漏。然后，在室温下，从所述玻璃制双层容器的上方以光量20mW/cm2对所述玻璃制双层容器内的盐酸酸性NaClO2水溶液照射10分钟波长365nm的LED光。此时，如图6所示，在所述内侧的容器的上方，从所述盖的上方盖上铝箔，以使光不直接照射到所述石墨烯栅格。通过该光照射，在培养皿3内通过盐酸与NaClO2的反应而产生并流入到培养皿4内的ClO2自由基的气体被活化，与石墨烯6反应。通过该表面处理工序，将所述石墨烯栅格的表面氧化。将氧化后的所述石墨烯栅格在减压下干燥24h，得到目标物(所述石墨烯栅格的表面被改性的物质)。
如图6的下部所示，在所述表面处理工序(表面的氧化)前和后的石墨烯栅格的表面滴加水滴，拍摄该水滴的照片，通过目视照片分别测定水的接触角。其结果，水的接触角在所述表面处理工序前为83°，与此相对，在所述表面处理工序之后不久为51°。即，通过所述表面处理工序，水的接触角减少，因此确认到所述石墨烯栅格表面的亲水性增加。另外，在所述表面处理工序后经过1小时后再次用相同的方法测定水的接触角，结果如图所示为59°。即，确认到即使在所述表面处理工序后经过1小时也保持了所述石墨烯栅格表面的亲水性。
[实施例1]
在本实施例中，使用由所述Mo栅格(Quantifoil Micro Tools GmbH公司制造，商品名QUANTIFOIL)或Au栅格(Quantifoil Micro Tools GmbH公司制造，商品名QUANTIFOIL)制造的所述石墨烯栅格，进行与二氧化氯自由基反应的表面处理工序(取代基导入工序)，将表面改性(氧化)，制造表面被改性(氧化)且导入有取代基(羟基)的氧化石墨烯(GO)。进而，按照下述方案1，进行在所述氧化石墨烯表面的羟基中导入新的官能团的官能团导入工序，制造导入有官能团的石墨烯栅格(官能团导入工序)。
[化S1]
[表面处理工序(取代基导入工序)]
首先，使用由所述Mo栅格或Au栅格制造的所述石墨烯栅格，与参考例3相同，进行与二氧化氯自由基的反应(表面处理工序)。对表面处理工序前后的所述石墨烯栅格分别进行基于FT-IR测定的评价。其结果，在表面处理工序(所述石墨烯表面的氧化处理)前因IR惰性而未观测到峰，与此相对，在表面处理工序后观测到3000cm-1附近的来自-OH(羟基)的峰等。即，通过FT-IR测定，确认到石墨烯表面的氧化。
[官能团导入工序]
使硅烷偶联剂与所述表面处理工序后的石墨烯栅格表面反应，导入官能团(官能团导入工序)。具体而言，首先，将所述表面处理工序后的所述石墨烯栅格配置于盖玻片上，将25mM 3-缩水甘油氧基丙基三甲氧基硅烷(1)(120μL、EtOH/H2O＝1/9)载置于石墨烯侧的面，使用热板在100℃静置5分钟。然后，使用乙醇-水混合溶剂(EtOH/H2O＝1/9)100μL清洗3次，洗去剩余的硅烷偶联剂。由此，制造在所述石墨烯栅格中导入有环氧基的石墨烯栅格(下述方案2)。
[化S2]
使基于冷冻电子显微镜的结构分析对象物质即蛋白质接合(结合)于上述制造的导入有所述官能团(环氧基)的石墨烯栅格。其概要如图7上部的方案所示。具体而言，将包含0.3mg/mL的GroEL的HEPES缓冲液(25mM HEPES pH8.0,50mM NaCl)载置于所述导入有环氧基的石墨烯栅格上，在室温静置5分钟，由此使导入至所述石墨烯栅格表面的环氧基与存在于GroEL中的氨基反应而结合。然后，使用所述HEPES缓冲液(5μL)清洗3次，洗去剩余的GroEL。
通过使用2％乙酸铀水溶液的负染色法，以倍率15000倍观察所述结合有GroEL的石墨烯栅格表面，结果如图7下部的照片所示，能够确认到石墨烯栅格表面结合有GroEL。
[实施例2]
在本实施例中，使用铜基板上的单层石墨烯(ACS Materials公司：商品名“CVCU1S22”)，进行与二氧化氯自由基反应的表面处理工序(取代基导入工序)而将表面改性(氧化)，制造表面被改性(氧化)且导入有取代基(羟基)的氧化石墨烯(GO)。进而，按照下述方案3，进行在所述氧化石墨烯表面的羟基中导入新的官能团的官能团导入工序，制造导入有官能团的石墨烯(官能团导入工序)。利用水的接触角测定、傅里叶变换型红外线分光(FT-IR)测定(Perkin Elmer：商品名“Spectrum Two”)对该导入有官能团的石墨烯进行评价。
此外，使硅烷偶联剂与所述表面处理工序后的铜基板上石墨烯表面反应，导入官能团(官能团导入工序)。具体而言，首先，将所述表面处理工序后的所述石墨烯配置在盖玻片上，将25mM 3-氨基丙基三甲氧基硅烷(2)(120μL、EtOH/H2O＝1/9)载置于石墨烯侧的面，使用热板在100℃加热5分钟。然后，使用乙醇-水混合溶剂(EtOH/H2O＝1/9)100μL清洗3次，洗去剩余的硅烷偶联剂。由此，制造在所述铜基板上石墨烯中导入有包含氨基的官能团的铜基板上石墨烯(下述方案3)。
[化S3]
利用傅里叶变换型红外线分光(FT-IR)测定(Perkin Elmer：商品名“SpectrumTwo”)对该导入有官能团的铜基板上石墨烯进行评价。图8表示其FT-IR光谱。如该图所示，在官能团导入后的光谱中，来自伯胺基的N-H伸缩振动出现在3325cm-1和3438cm-1。进而，在1655cm-1观测到来自伯胺基的N-H变角振动。另外，在1102cm-1和1019cm-1处分别能够观测到Si-O-C伸缩振动和Si-O-Si伸缩振动。
[实施例3]
与实施例1同样进行，使用由所述Mo栅格(Quantifoil Micro Tools GmbH公司制造，商品名QUANTIFOIL)或Au栅格(Quantifoil Micro Tools GmbH公司制造，商品名QUANTIFOIL)制造的所述石墨烯栅格，进行与二氧化氯自由基反应的表面处理工序(取代基导入工序)，将表面改性(氧化)，制造表面被改性(氧化)且导入有取代基(羟基)的氧化石墨烯(GO)。
此外，使硅烷偶联剂与所述表面处理工序后的石墨烯栅格表面反应，导入官能团(官能团导入工序)。具体而言，首先，将所述表面处理工序后的所述石墨烯栅格配置于盖玻片上，将下述方案4所示的25mM具有氨基甲酸酯键的含PEG基的硅烷化合物(3)(120μL、EtOH/H2O＝1/9)载置于石墨烯侧的面，使用热板在100℃静置5分钟。然后，使用乙醇-水混合溶剂(EtOH/H2O＝1/9)100μL清洗3次，洗去剩余的硅烷偶联剂。由此，制造在所述铜基板上石墨烯中导入有PEG基(官能团)的石墨烯栅格(下述方案5)。
[化S4]
[化S5]
分别测定所述官能团导入工序(氧化后的表面修饰)前和后的石墨烯栅格表面的水的接触角。将其测定结果示于图9上部的照片。如该图所示，水的接触角在导入官能团前为75°；与此相对，在刚导入官能团后不久为45°。即，通过官能团导入工序，水的接触角减少，因此确认到所述石墨烯(石墨烯栅格)表面的亲水性增加。
另外，如图9中部的方案所示，在通过所述官能团导入工序导入有PEG基(官能团)的石墨烯栅格(该方案左侧)上，结合基于冷冻电子显微镜的结构分析对象物质即蛋白质(GroEL)，制造冷冻电子显微镜用栅格(该方案右侧)。具体而言，将包含0.3mg/mL的GroEL的HEPES缓冲液(25mM HEPES pH8.0,50mM NaCl)载置于所述导入有PEG基的石墨烯栅格上，在室温静置5分钟，由此使导入至所述石墨烯栅格表面的PEG基与存在于GroEL中的氨基、羟基反应，从而进行氢键合。需要说明的是，图3中部的方案中，PEG基与GroEL的氢键用虚线表示。但是，该方案所示的冷冻电子显微镜用栅格的结构是推定的结构的一个例子，并不限定本实施例的冷冻电子显微镜用栅格的结构。
通过使用2％乙酸铀水溶液的负染色法，以倍率15000倍观察所述结合有GroEL的石墨烯栅格(冷冻电子显微镜用栅格)表面。将其结果示于图9下部的照片。如该图所示，能够确认到石墨烯栅格表面结合有GroEL。
[实施例4]
与实施例1相同，使用由所述Mo栅格(Quantifoil Micro Tools GmbH公司制造，商品名QUANTIFOIL)或Au栅格(Quantifoil Micro Tools GmbH公司制造，商品名QUANTIFOIL)制造的所述石墨烯栅格，进行与二氧化氯自由基反应的表面处理工序(取代基导入工序)，将表面改性(氧化)，制造表面被改性(氧化)且导入有取代基(羟基)的氧化石墨烯(GO)。
此外，使硅烷偶联剂与所述表面处理工序后的石墨烯栅格表面反应，导入官能团(官能团导入工序)。具体而言，首先，将所述表面处理工序后的所述石墨烯栅格配置在盖玻片上，将下述方案6所示的25mM具有脲键的含PEG基的硅烷(4)(120μL、EtOH/H2O＝1/9)载置于石墨烯侧的面，使用热板在100℃静置5分钟。然后，使用乙醇-水混合溶剂(EtOH/H2O＝1/9)100μL清洗3次，洗去剩余的硅烷偶联剂。由此，制造在所述铜基板上石墨烯中导入有PEG基(官能团)的石墨烯栅格(下述方案7)。
[化S6]
[化S7]
分别测定所述官能团导入工序(氧化后的表面修饰)前和后的石墨烯栅格表面的水的接触角。将其测定结果示于图10上部的照片。如该图所示，水的接触角在导入官能团前为75°；与此相对，在刚导入官能团后不久为51°。即，通过官能团导入工序，水的接触角减少，因此确认到所述石墨烯表面的亲水性增加。
另外，如图10中部的方案所示，在通过所述官能团导入工序导入有PEG基(官能团)的石墨烯栅格(该方案左侧)上，接合(结合)基于冷冻电子显微镜的结构分析对象物质即蛋白质(GroEL)，制造冷冻电子显微镜用栅格(该方案右侧)。具体而言，具体而言，将包含0.3mg/mL的GroEL的HEPES缓冲液(25mM HEPES pH8.0，50mM NaCl)载置于所述导入有PEG基的石墨烯栅格上，在室温静置5分钟，由此使导入至所述石墨烯栅格表面的环氧基与存在于GroEL中的氨基、羟基反应，从而进行氢键合。需要说明的是，图10中部的方案中，PEG基与GroEL的氢键用虚线表示。但是，该方案所示的冷冻电子显微镜用栅格的结构是推定的结构的一个例子，并不限定本实施例的冷冻电子显微镜用栅格的结构。
通过使用2％乙酸铀水溶液的负染色法，以倍率15000倍观察所述结合有GroEL的石墨烯栅格(冷冻电子显微镜用栅格)表面。将其结果示于图10下部的照片。如该图所示，能够确认到石墨烯栅格表面结合有GroEL。
[实施例5]
与实施例1相同，使用由所述Mo栅格(Quantifoil Micro Tools GmbH公司制造，商品名QUANTIFOIL)或Au栅格(Quantifoil Micro Tools GmbH公司制造，商品名QUANTIFOIL)制造的所述石墨烯栅格，进行与二氧化氯自由基反应的表面处理工序(取代基导入工序)，将表面改性(氧化)，制造表面被改性(氧化)且导入有取代基(羟基)的氧化石墨烯(GO)。
此外，使硅烷偶联剂与所述表面处理工序后的石墨烯栅格表面反应，导入官能团(官能团导入工序)。具体而言，首先，将所述表面处理工序后的所述石墨烯栅格配置于盖玻片上，将下述方案8所示的25mM含马来酰亚胺基的硅烷(5)(120μL、EtOH/H2O＝1/9)载置于石墨烯侧的面，使用热板在100℃静置5分钟。然后，使用乙醇-水混合溶剂(EtOH/H2O＝1/9)100μL清洗3次，洗去剩余的硅烷偶联剂。由此，制造在所述铜基板上石墨烯中导入有马来酰亚胺基(官能团)的石墨烯栅格(下述方案9)。
[化S8]
[化S9]
另外，如图11上部的方案所示，在通过所述官能团导入工序导入有马来酰亚胺基(官能团)的石墨烯栅格(该方案左侧)上，接合(结合)基于冷冻电子显微镜的结构分析对象物质即蛋白质(β-半乳糖苷酶)，制造冷冻电子显微镜用栅格(该方案右侧)。具体而言，将包含0.5mg/mL的β-半乳糖苷酶(B-gal)的Tris缓冲液(25mM Tris pH7.0、50mM NaCl、2mMMgCl2、1mM DTT)载置于所述导入有马来酰亚胺基的石墨烯栅格上，在室温静置5分钟，由此使导入至所述石墨烯栅格表面的马来酰亚胺基与存在于β-半乳糖苷酶(B-gal)中的巯基反应而结合。然后，使用所述Tris缓冲液(5μL)清洗3次，洗去剩余的β-半乳糖苷酶(B-gal)。
通过使用2％乙酸铀水溶液的负染色法，以倍率15000倍观察所述结合有β-半乳糖苷酶的石墨烯栅格(冷冻电子显微镜用栅格)表面。将其结果示于图11下部的照片。如该图所示，能够确认到在石墨烯栅格表面结合有β-半乳糖苷酶。
[实施例6]
与实施例2相同，使用铜基板上的单层石墨烯(ACS Materials公司：商品名“CVCU1S22”)，进行与二氧化氯自由基反应的表面处理工序(取代基导入工序)而将表面改性(氧化)，制造表面被改性(氧化)且导入有取代基(羟基)的氧化石墨烯(GO)。
此外，使硅烷偶联剂与所述表面处理工序后的铜基板上石墨烯表面反应，导入官能团(官能团导入工序)。具体而言，首先，将所述表面处理工序后的所述石墨烯配置在盖玻片上，将下述方案10所示的25mM具有脲键的含羧酸基硅烷(6)(120μL、EtOH/H2O＝1/9)载置于石墨烯侧的面，使用热板在100℃静置5分钟。然后，使用乙醇-水混合溶剂(EtOH/H2O＝1/9)100μL清洗3次，洗去剩余的硅烷偶联剂。由此，制造在所述铜基板上石墨烯中导入有羧酸基的石墨烯(下述方案11)。
[化S10]
[化S11]
利用傅里叶变换型红外线分光(FT-IR)测定对该导入有官能团的铜基板上石墨烯进行评价。图12上部表示其FT-IR光谱。如该图所示，在官能团导入后的光谱中，来自脲键和末端的羧酸的羰基的C＝O伸缩振动出现在1701cm-1处。进而，分别在3327cm-1处观测到来自脲键的酰胺基的N-H伸缩振动，在1559cm-1处观测到N-H变角振动。另外，在1100cm-1和1007cm-1处分别能够观测到Si-O-C伸缩振动和Si-O-Si伸缩振动。
另外，分别测定所述官能团导入工序(氧化后的表面修饰)前和后的铜基板上石墨烯表面的水的接触角。将其测定结果示于图12下部的照片。如该图所示，水的接触角在导入官能团前为75°；与此相对，在刚导入官能团后不久为43°。即，通过官能团导入工序，水的接触角减少，因此确认到所述石墨烯表面的亲水性增加。
[实施例7]
与实施例2相同，使用铜基板上的单层石墨烯(ACS Materials公司：商品名“CVCU1S22”)，进行与二氧化氯自由基反应的表面处理工序(取代基导入工序)而将表面改性(氧化)，制造表面被改性(氧化)且导入有取代基(羟基)的氧化石墨烯(GO)。
此外，使硅烷偶联剂与所述表面处理工序后的铜基板上石墨烯表面反应，导入官能团(官能团导入工序)。
具体而言，首先，将所述表面处理工序后的所述石墨烯配置在盖玻片上，将下述方案12所示的25mM含NHS酯基的硅烷(7)(120μL、EtOH/H2O＝1/9)载置于石墨烯侧的面，使用热板在100℃静置5分钟。然后，使用乙醇-水混合溶剂(EtOH/H2O＝1/9)100μL清洗3次，洗去剩余的硅烷偶联剂。由此，制造在所述铜基板上石墨烯中导入有NHS酯基(官能团)的铜基板上石墨烯(方案13)。
[化S12]
[化S13]
利用傅里叶变换型红外线分光(FT-IR)测定对该导入有官能团的铜基板上石墨烯进行评价。图13表示其FT-IR光谱。如该图所示，在官能团导入后的光谱中，来自脲键的羰基的C＝O伸缩振动出现在1692cm-1处。进而，分别在3317cm-1处观测到来自脲键的酰胺基的N-H伸缩振动，在1530cm-1处观测到N-H变角振动。另外，在1194cm-1和1037cm-1处观测到来自磺基的C-SO3 -伸缩振动。在1098cm-1和1007cm-1处分别能够观测到Si-O-C伸缩振动和Si-O-Si伸缩振动。
[实施例8]
与实施例2相同，使用铜基板上的单层石墨烯(ACS Materials公司：商品名“CVCU1S22”)，进行与二氧化氯自由基反应的表面处理工序(取代基导入工序)而将表面改性(氧化)，制造表面被改性(氧化)且导入有取代基(羟基)的氧化石墨烯(GO)。
此外，使硅烷偶联剂与所述表面处理工序后的铜基板上石墨烯表面反应，导入官能团(官能团导入工序)。具体而言，首先，将所述表面处理工序后的所述石墨烯配置在盖玻片上，将25mM 5-三乙氧基硅基戊酸(8)(120μL、EtOH/H2O＝1/9)载置于石墨烯侧的面，使用热板在100℃静置5分钟。然后，使用乙醇-水混合溶剂(EtOH/H2O＝1/9)100μL清洗3次，洗去剩余的硅烷偶联剂。由此，制造在所述铜基板上石墨烯中导入有羧酸基的铜基板上石墨烯(方案14)。
[化S14]
利用傅里叶变换型红外线分光(FT-IR)测定对该导入有官能团的铜基板上石墨烯进行评价。图14表示其FT-IR光谱。如该图所示，在官能团导入后的光谱中，在1702cm-1处观测到来自羰基的C＝O伸缩振动。另外，在1100cm-1和1004cm-1处分别能够观测到Si-O-C伸缩振动和Si-O-Si伸缩振动。
[实施例9]
与实施例2相同，使用铜基板上的单层石墨烯(ACS Materials公司：商品名“CVCU1S22”)，进行与二氧化氯自由基反应的表面处理工序(取代基导入工序)而将表面改性(氧化)，制造表面被改性(氧化)且导入有取代基(羟基)的氧化石墨烯(GO)。
此外，使硅烷偶联剂与所述表面处理工序后的铜基板上石墨烯表面反应，导入官能团(官能团导入工序)。具体而言，首先，将所述表面处理工序后的所述石墨烯配置在盖玻片上，将25mM含磺酸基的硅烷水溶液(9)(120μL)载置于石墨烯侧的面，使用热板在100℃静置5分钟。然后，使用蒸馏水(100μL)清洗3次，洗去剩余的硅烷偶联剂。由此，制造在所述铜基板上石墨烯中导入有磺酸基的铜基板上石墨烯(下述方案15)。
[化S15]
利用傅里叶变换型红外线分光(FT-IR)测定对该导入有官能团的铜基板上石墨烯进行评价。图15表示其FT-IR光谱。如该图所示，在官能团导入后的光谱中，分别在1474cm-1处观测到来自铵阳离子的NH2 +变角振动，在3323cm-1处观测到NH2 +伸缩振动。另外，在1204cm-1和1040cm-1处观测到来自磺基的C-SO3 -伸缩振动。在1158cm-1和1005cm-1处分别能够观测到Si-O-C伸缩振动和Si-O-Si伸缩振动。
[实施例11]
与实施例2相同，使用铜基板上的单层石墨烯(ACS Materials公司：商品名“CVCU1S22”)，进行与二氧化氯自由基反应的表面处理工序(取代基导入工序)而将表面改性(氧化)，制造表面被改性(氧化)且导入有取代基(羟基)的氧化石墨烯(GO)。
此外，使膦酸衍生物与所述表面处理工序后的铜基板上石墨烯表面反应，导入官能团(官能团导入工序)。具体而言，首先，将所述表面处理工序后的所述石墨烯配置在盖玻片上，将25mM含羧酸基的膦酸溶液(株式会社同仁化学研究所，商品名“10-CDPA”)(10)(120μL)载置于石墨烯侧的面，使用热板在80℃静置5分钟。然后，使用乙醇(100μL)清洗3次，洗去剩余的膦酸衍生物。由此，制造在所述铜基板上石墨烯中导入有羧酸基的铜基板上石墨烯(下述方案16)。
[化S16]
利用傅里叶变换型红外线分光(FT-IR)测定对该导入有官能团的铜基板上石墨烯进行评价。图16表示其FT-IR光谱。如该图所示，在官能团导入后的光谱中，在官能团导入后的光谱中，在1700cm-1处观测到来自羰基的C＝O伸缩振动。在1093cm-1和1007cm-1处分别能够观测到P-O伸缩振动和P＝O伸缩振动。
[实施例12]
此外，实际利用冷冻电子显微镜对在上述的各实施例中结合有冷冻电子显微镜用的结构分析对象物质的石墨烯栅格(冷冻电子显微镜用栅格)进行结构分析，结果能够以非常高精度且高分辨率进行结构分析。
[实施例13]
与实施例2相同，使用铜基板上的单层石墨烯(ACS Materials公司：商品名“CVCU1S22”)，进行与二氧化氯自由基反应的表面处理工序(取代基导入工序)而将表面改性(氧化)，制造表面被改性(氧化)且导入有取代基(羟基)的氧化石墨烯(GO)。
此外，使膦酸衍生物与所述表面处理工序后的铜基板上石墨烯表面反应，导入官能团(官能团导入工序)。具体而言，首先，将所述表面处理工序后的所述石墨烯配置于盖玻片上，将25mM含羧酸基的膦酸溶液(株式会社同仁化学研究所，商品名“FHPA”)(11)(120μL)载置于石墨烯侧的面，使用热板在80℃静置5分钟。然后，使用乙醇(100μL)清洗3次，洗去剩余的膦酸衍生物。由此，在所述铜基板上石墨烯中导入氟(下述方案17)。
[化S17]
利用傅里叶变换型红外线分光(FT-IR)测定对该导入有官能团的铜基板上氧化石墨烯进行评价。图17表示其FT-IR光谱。如该图所示，在官能团导入后的光谱中，在官能团导入后的光谱中在1235cm-1处观测到来自氟的C-F伸缩振动。在1112cm-1和984cm-1处分别能够观测到P-O伸缩振动和P＝O伸缩振动。
[实施例13]
与实施例1相同，使用由所述Mo栅格(Quantifoil Micro Tools GmbH公司制造，商品名QUANTIFOIL)或Au栅格(Quantifoil Micro Tools GmbH公司制造，商品名QUANTIFOIL)制造的所述石墨烯栅格，进行与二氧化氯自由基反应的表面处理工序(取代基导入工序)，将表面改性(氧化)，制造表面被改性(氧化)且导入有取代基(羟基)的氧化石墨烯(GO)。
使硅烷偶联剂与所述表面处理工序后的石墨烯栅格表面反应，导入官能团(官能团导入工序)。具体而言，首先，将所述表面处理工序后的所述石墨烯栅格配置在盖玻片上，将下述方案18所示的10mg/mL两性离子型硅烷偶联剂(12)(5μL、EtOH/H2O＝1/9)载置于石墨烯侧的面，使用热板在100℃静置30分钟。然后，使用乙醇-水混合溶剂(EtOH/H2O＝1/9)10μL清洗3次，洗去剩余的硅烷偶联剂。由此，制造在所述栅格上石墨烯中导入有两性离子(官能团)的石墨烯栅格(下述方案19)。
[化S18]
[化S19]
另外，如图18上部的方案所示，在通过所述官能团导入工序导入有两性离子(官能团)的石墨烯栅格(该方案左侧)上，接合(结合)基于冷冻电子显微镜的结构分析对象物质即蛋白质(GroEL)，制造冷冻电子显微镜用栅格(该方案右侧)。具体而言，将包含0.3mg/mL的GroEL的水溶液载置于所述导入有两性离子的石墨烯栅格上，在室温静置5分钟，由此使导入至所述石墨烯栅格表面的两性离子与GroEL相互作用而结合。然后，使用水(5μL)清洗3次，洗去剩余的GroEL。
通过使用2％乙酸铀水溶液的负染色法，以倍率15000倍观察所述结合有GroEL的石墨烯栅格(冷冻电子显微镜用栅格)表面。将其结果示于图18下部的照片。作为比较，将未导入两性离子的情况下的栅格上GroEL示于图18下部左侧。如该图所示，能够确认到在石墨烯栅格表面结合有GroEL，并且其取向性根据两性离子的导入而变化。
如通过以上的实施例所证实的那样，根据本发明，能够在非常短时间内且简便制备冷冻电子显微镜用的测定样品。进而，如通过以上的实施例所证实的那样，根据本发明，能够在不附加标签的情况下以非常高精度且高分辨率地对β-半乳糖苷酶、GroEL、V1-ATPase这样的多种多样的蛋白质进行结构分析。
以上，参照实施方式说明了本发明，但本发明不限于上述实施方式。对于本发明的构成或详情，能够在本发明的范围内进行本领域技术人员可理解的各种变更。
工业上的可利用性
如上所述，根据本发明，可以提供在基于冷冻电子显微镜的结构分析中能够抑制或防止结构分析对象物质的不均匀分布、取向性的偏差等的冷冻电子显微镜用栅格、冷冻电子显微镜用栅格的制造方法、结构分析对象物质的结构分析方法。根据本发明，例如在非常短时间内制造结合有蛋白质等结构分析对象物质的冷冻电子显微镜用栅格，能够以非常高的分辨率进行所述结构分析对象物质的结构分析，因此其工业上利用价值巨大。
该申请主张以在2021年10月7日申请的日本申请日本特愿2021-165333为基础的优先权，将其公开的全部引入本说明书。
附图标记说明
1培养皿
2盖
3培养皿
4培养皿
5自由基生成用反应体系
6 石墨烯
11有机层(有机相)
12水层(水相)

Claims (15)

1.一种石墨烯栅格，其特征在于，具有在石墨烯表面导入有包含硅原子和磷原子中的至少一者的官能团的结构。
2.根据权利要求1所述的石墨烯栅格，其中，所述石墨烯栅格具有在石墨烯表面导入取代基、再通过所述取代基的反应导入所述官能团的结构。
3.根据权利要求2所述的石墨烯栅格，其中，所述取代基为选自由包含羟基、羧基、醛基、酮基或羰基的取代基；包含醚键的取代基；以及包含酯键的取代基组成的组中的至少一种取代基。
4.根据权利要求2或3所述的石墨烯栅格，其中，所述石墨烯栅格具有通过所述取代基与选自硅烷偶联剂和膦酸衍生物中的至少一者的反应而导入所述官能团的结构。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的石墨烯栅格，其中，所述包含硅原子和磷原子中的至少一者的官能团是在其结构中包含选自羟基、羧基、醛基、羰基、醚键、环氧基、酯键、氨基、亚氨基、马来酰亚胺基、磺酰基、磺酰氧基、氟烷基、氰基、异氰酸基(异氰酸酯基)、乙烯基、苯乙烯基、甲基丙烯酰基、丙烯酰基、脲基、巯基、异硫氰酸酯基、叠氮基、乙炔基、酰亚胺酯基、卤化物、活化的羧基、NHS酯基、酰氯、酸酐和氟酯中的至少一者的官能团。
6.一种冷冻电子显微镜用栅格，其特征在于，所述冷冻电子显微镜用栅格是使冷冻电子显微镜的结构分析对象物质结合于权利要求1至5中任一项所述的石墨烯栅格而成的。
7.一种石墨烯栅格的制造方法，其特征在于，
所述石墨烯栅格是具有在石墨烯表面导入有包含硅原子和磷原子中的至少一者的官能团的结构的石墨烯栅格，
所述制造方法包括：官能团导入工序，其中，使表面具有取代基的石墨烯的所述取代基与选自硅烷偶联剂和膦酸衍生物中的至少一者反应，导入所述包含硅原子的官能团。
8.根据权利要求7所述的制造方法，其中，所述制造方法进一步包括：取代基导入工序，其中，使石墨烯表面与卤素氧化物自由基反应而对所述石墨烯表面进行改性，从而导入所述取代基。
9.根据权利要求8所述的制造方法，其中，所述卤素氧化物自由基为二氧化氯自由基。
10.根据权利要求7至9中任一项所述的制造方法，其中，所述取代基为选自由包含羟基、羧基、醛基、酮基或羰基的取代基；包含醚键的取代基；以及包含酯键的取代基组成的组中的至少一种取代基。
11.根据权利要求7至10中任一项所述的制造方法，其中，所述包含硅原子和磷原子中的至少一者的官能团是在其结构中包含选自羟基、羧基、醛基、羰基、醚键、环氧基、酯键、氨基、亚氨基、马来酰亚胺基、磺酰基、磺酰氧基、氟烷基、氰基、异氰酸基(异氰酸酯基)、乙烯基、苯乙烯基、甲基丙烯酰基、丙烯酰基、脲基、巯基、异硫氰酸酯基、叠氮基、乙炔基、酰亚胺酯基、卤化物、活化的羧基、NHS酯基、酰氯、酸酐和氟酯中的至少一者的官能团。
12.一种冷冻电子显微镜用栅格的制造方法，其特征在于，包括结构分析对象物质结合工序，其中，进一步使冷冻电子显微镜的结构分析对象物质结合于通过权利要求7至11中任一项所述的制造方法制造的石墨烯栅格。
13.一种结构分析方法，其特征在于，是使用冷冻电子显微镜进行结构分析对象物质的结构分析的方法，
所述结构分析方法包括结构分析用栅格准备工序和结构分析工序，
在所述结构分析用栅格准备工序中，使所述结构分析对象物质结合于权利要求1至5中任一项所述的石墨烯栅格或通过权利要求7至11中任一项所述的制造方法制造的石墨烯栅格，或者准备权利要求6所述的冷冻电子显微镜用栅格或通过权利要求12所述的制造方法制造的冷冻电子显微镜用栅格，
在所述结构分析工序中，使用冷冻电子显微镜对与所述石墨烯栅格结合的所述结构分析对象物质进行结构分析。
14.根据权利要求13所述的结构分析方法，其中，所述结构分析对象物质为有机物质。
15.根据权利要求14所述的结构分析方法，其中，所述有机物质为蛋白质。
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