CN117956989A - 处理细菌细胞群体的方法 - Google Patents

Abstract

本文提供了可用于处理包括细菌存留细胞和/或抗生素抗性细菌细胞的细菌细胞群体的方法和组合物。

Description

处理细菌细胞群体的方法

技术领域

本公开总体上涉及可用于处理细菌细胞群体的方法和组合物。更具体地，本公开提供了可用于处理包含细菌存留细胞和/或抗生素抗性细菌细胞的细菌细胞群体的方法和组合物。

背景技术

细菌抗生素耐受性被宽泛地定义为一种现象，其中细菌总是含有亚群，该亚群表现出能够承受在其他情况下可致死的抗生素浓度的有害作用，但这种亚群可以在有利的条件下重新生长并产生对抗生素敏感的后代。最近的研究表明，长期驻留在人体内的抗生素耐受细胞的重新生长是导致广泛的慢性和复发性感染的原因，特别是在免疫功能低下的患者中。据了解，超过80％的囊性纤维化患者会被铜绿假单胞菌或金黄色葡萄球菌慢性感染；此类感染通常与肺功能迅速下降和高死亡风险有关。与金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌和其他细菌形成的耐受生物膜相关的留置装置和导管感染约占医院感染的一半，导致这些设备实际上无法使用。据报道，几乎所有临床上重要的细菌病原体均具有细菌耐受性，例如铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌。需要彻底根除细菌耐受亚群，以防止重症患者发生慢性和复发性感染。这也是临床治疗中的重要一步，因为残留的单个细菌可以重新生长并导致反复感染。设计一种通用方法来彻底根除临床上重要的细菌病原体的抗生素耐受亚群，每年将挽救数百万人的生命。

仅通过抑制一种特定的细胞功能来完全根除耐受细胞几乎是不可能的。之前的两篇出版物报道了通过使用类视黄醇和酰基缩肽抗生素分别造成膜损伤和激活酪蛋白溶解蛋白酶，完全根除革兰氏阳性菌中的抗生素耐受亚群。然而，这些试剂对革兰氏阴性生物体无效。

细菌存留细胞也可能表现出抗生素抗性，至少部分归因于它们的休眠状态。苏醒的细菌存留细胞可导致反复感染。

因此，需要用于处理包含抗生素抗性细菌细胞和/或细菌存留细胞的细菌细胞群体的改进方法和组合物。

发明内容

研究发现，细菌跨膜质子动力(PMF)的主动维持对于细菌饥饿诱导的耐受性至关重要，并且PMF的破坏导致整个抗生素抗性和/或存留性亚群的根除。

本公开提供了通过施用能够破坏细菌PMF的试剂和任选的抗细菌剂来治疗包含抗生素抗性细菌细胞和/或细菌存留细胞的细菌细胞群体的策略。

在本发明的第一方面中，提供了一种用于治疗有需要的受试者中的细菌感染的方法，该方法包括：向受试者施用治疗有效量的细菌跨膜质子动力(PMF)抑制剂，其中细菌感染是由包含存留细菌细胞、抗生素抗性细菌细胞或其混合物的细菌细胞群体的结果，其中PMF抑制剂是一种基于咪唑的抗真菌剂，其条件是PMF抑制剂不是4-(2-氨基-1H-咪唑-4-基)-N-(十三烷-7-基)丁酰胺或4-(2-氨基-1H-咪唑-4-基)-N-十三烷基丁酰胺。

在某些实施方案中，细菌细胞群体是革兰氏阴性细菌细胞群体。

在某些实施方案中，基于咪唑的抗真菌剂选自由以下组成的组：克霉唑、益康唑、舍他康唑、硫康唑、噻康唑、卢立康唑、异康唑、咪康唑、恩康唑、芬替康唑、酮康唑、氯咪巴唑、布康唑、奥昔康唑、氟康唑、伏立康唑、来曲唑、三氯苯达唑、噻苯达唑、芬苯达唑和奥美拉唑或其药学上可接受的盐。

在某些实施方案中，PMF抑制剂以有效至少部分抑制细菌细胞群体中的PMF的量施用。

在某些实施方案中，细菌感染是由50％或更多的存留细菌细胞、抗生素抗性细菌细胞或其混合物组成的细菌细胞群体的结果。

在某些实施方案中，细菌感染是由90％或更多的存留细菌细胞、抗生素抗性细菌细胞或其混合物组成的细菌细胞群体的结果。

在某些实施方案中，细菌感染是基本上由选自由大肠杆菌(E.coli)、肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)、鲍曼不动杆菌(A.baumannii)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)和鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)组成的组的抗生素抗性细菌组成的细菌细胞群体的结果。

在某些实施方案中，该方法还包括向受试者共同施用治疗有效量的抗细菌剂的步骤。

在某些实施方案中，细菌感染是由50％或更多的存留细菌细胞、抗生素抗性细菌细胞或其混合物组成的细菌细胞群体的结果。

在某些实施方案中，基于咪唑的抗真菌剂选自由益康唑、舍他康唑、硫康唑、噻康唑、卢立康唑和异康唑或其药学上可接受的盐组成的组。

在某些实施方案中，抗细菌剂选自由以下组成的组：β-内酰胺、氨基糖苷、喹诺酮、糖肽、甘氨酰环素、脂肽、大环内酯、氯霉素、二氢叶酸还原酶抑制剂、磺酰胺、利福平、甲硝唑、克林霉素、林可霉素、夫西地酸、呋喃唑酮、异烟肼和吡嗪酰胺。

在某些实施方案中，抗细菌剂选自由氨苄青霉素、头孢他啶、环丙沙星、庆大霉素、美罗培南和粘菌素或其药学上可接受的盐组成的组。

在某些实施方案中，基于咪唑的抗真菌剂选自由益康唑、舍他康唑、硫康唑、噻康唑、卢立康唑、异康唑和咪康唑或其药学上可接受的盐组成的组；并且所述抗细菌剂为粘菌素或其药学上可接受的盐。

在某些实施方案中，基于咪唑的抗真菌剂是益康唑或其药学上可接受的盐；并且抗细菌剂选自由氨苄青霉素、头孢他啶、环丙沙星、庆大霉素、美罗培南和粘菌素或其药学上可接受的盐组成的组。

在某些实施方案中，细菌感染是由90％或更多的存留细菌细胞、抗生素抗性细菌细胞或其混合物组成的细菌细胞群体的结果。

在第二方面，本文提供了使存留细菌细胞或抗生素抗性细菌细胞对抗细菌剂重新敏感的方法，该方法包括：使存留细菌细胞或抗生素抗性细菌细胞与PMF抑制剂接触，其中PMF抑制剂是一种基于咪唑的抗真菌剂，其条件是PMF抑制剂不是4-(2-氨基-1H-咪唑-4-基)-N-(十三烷-7-基)丁酰胺或4-(2-氨基-1H-咪唑-4-基)-N-十三烷基丁酰胺。

在某些实施方案中，存留细菌细胞或抗生素抗性细菌细胞是革兰氏阴性存留细菌细胞或革兰氏阴性抗生素抗性细菌细胞。

在某些实施方案中，基于咪唑的抗真菌剂选自由以下组成的组：克霉唑、益康唑、舍他康唑、硫康唑、噻康唑、卢立康唑、异康唑、咪康唑、恩康唑、芬替康唑、酮康唑、氯咪巴唑、布康唑、奥昔康唑、氟康唑、伏立康唑、来曲唑、三氯苯达唑、噻苯达唑、芬苯达唑和奥美拉唑或其药学上可接受的盐。

在某些实施方案中，基于咪唑的抗真菌剂是益康唑或其药学上可接受的盐。

在某些实施方案中，存留细菌细胞或抗生素抗性细菌细胞选自由以下组成的组：大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门氏菌。

附图说明

本公开的上述和其他目的和特征将在结合附图时从本公开的以下描述中变得显而易见。

图1.营养饥饿期间激活的Psp应答会影响细菌的存活和抗生素耐受性。(A)将野生型大肠杆菌BW25113菌株和ΔpspA基因敲除菌株饥饿24小时，然后用100μg/mL氨苄青霉素处理144小时，记录的CFU的变化显示了不同时间点的情况。在144小时时测试ΔpspA和ΔpspA+AMP之间的P值。(B)对细胞密度为OD₆₀₀ 0.2的饥饿24小时的细菌群体中PspA蛋白进行蛋白质印迹分析，以内源蛋白GAPDH为对照。显示了在对数期群体以及在用GAPDH对照归一化后经历了24小时营养饥饿的细菌中记录的PspA蛋白的相对表达水平。数据是使用三个生物重复进行的至少两次独立实验的平均值(n≥6)。通过双尾学生检验，**表示P值<0.01，***表示P值<0.001。误差条代表标准偏差。

图2.Psp应答有助于在大肠杆菌饥饿期间维持PMF，而不改变膜通透性。(A)用于检测野生型和ΔpspA菌株细胞膜通透性的SYTOX Green的荧光强度显示，ΔpspA菌株中的细胞膜保持完整；用粘菌素处理的菌株作为阳性对照。(B)野生型和ΔpspA菌株的指数生长期的DiSC₃(5)染色细胞的荧光强度之间的比较揭示了加入缬氨霉素(标记为V)后相同的初始强度和相似程度的膜电位变化。在开始时间测试WT和ΔpspA、WT+V和ΔpspA+V之间的P值。(C)DiSC₃(5)染色的野生型和已经经受饥饿24小时的ΔpspA菌株的荧光强度之间的比较描述了ΔpspA突变体中高得多的荧光强度和因此低得多的PMF。在开始时间测试WT和ΔpspA、WT+V和ΔpspA+V之间的P值。(D)DiSC₃(5)染色的指数生长的野生型群体的荧光强度与已经经受24小时饥饿的群体的荧光强度之间的比较揭示了加入缬氨霉素后相似的初始荧光强度以及相似程度的荧光强度变化，因此相似的膜电位。数据是使用三个生物重复进行的至少两次独立实验的平均值(n≥6)。误差条代表标准偏差。在开始时间测试log和饥饿、log+V和饥饿+V之间的P值。(E)DiSC₃(5)染色的细胞的共聚焦显微镜图像，所述细胞已经在缺乏和存在缬氨霉素的情况下经受24小时饥饿。左分图和右分图分别是荧光图像和明场图像(比例尺：4μm)。(F)共焦显微镜图像的平均DiSC₃(5)荧光强度，由LAS X软件计算。数据是三个观察场图像的平均值。通过双尾学生检验，ns表示无显著性，**表示P值<0.01，***表示P值<0.001。误差条代表标准偏差。

图3.PMF对于维持细菌在饥饿下的耐受表型至关重要。(A)在饥饿24小时后，接着用氨苄青霉素、叠氮化钠、CCCP或这些化合物的各种组合处理，在不同时间点记录的大肠杆菌菌株BW25113的群体大小。在144小时测试WT+NaN3和WT+NaN3+AMP、WT+CCCP和WT+CCCP+AMP之间的P值。(B)在饥饿24小时后，接着用氨苄青霉素、叠氮化钠、CCCP或此类化合物的各种组合处理后，在不同处理时间点记录的ΔpspA基因敲除突变体的群体大小。在指定时间点测试ΔpspA+NaN3和ΔpspA+NaN3+AMP、ΔpspA+CCCP和ΔpspA+CCCP+AMP之间的P值。(C)大肠杆菌菌株BW25113和相应的Δndh和ΔnuoI基因敲除突变体和双基因敲除突变体ΔndhΔnuoI(D)饥饿24小时，然后用氨苄青霉素处理144小时。显示了144小时内群体大小的变化，以及在无氨苄青霉素处理对照中记录的数据。数据是使用三个生物重复进行的至少两次独立实验的平均值(n≥6)。通过双尾学生检验，ns表示无显著性，**表示P值<0.01，***表示P值<0.001。误差条代表标准偏差。

图4.PMF驱动的主动外排部分有助于饥饿期间抗生素耐受亚群的形成。(A-D)通过流式细胞仪记录的荧光强度描述了在存在和不存在CCCP的情况下，野生型或ΔpspA经受24小时饥饿时抗生素积累的程度(BOCILLIN^TM FL青霉素，10g/mL)。P2门表示BOCILLIN荧光强度大于10³RFU的群体。(E)在存在和不存在CCCP的情况下使用荧光外排底物尼罗红对已经经受了24小时饥饿的野生型细菌群体进行染色。数据是使用三个生物重复进行的至少两次独立实验的平均值(n≥6)。误差条代表标准偏差。(F)经饥饿24小时然后用氨苄青霉素处理144小时的大肠杆菌菌株BW25113和ΔtolC基因敲除菌株的群体大小变化。包括BW25113和ΔtolC基因敲除菌株各自的无氨苄青霉素处理对照。还描述了外排泵抑制剂PAβN对BW25113菌株饥饿诱导的氨苄青霉素耐受性的影响。数据是每次使用三个生物重复进行的至少两次独立实验的平均值(n≥6)。在144小时测试WT和PAβN+AMP、ΔtolC和ΔtolC+AMP之间的P值。通过双尾学生检验，**表示P值<0.01，***表示P值<0.001。误差条代表标准偏差。

图5.PMF的维持对于主要革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌中饥饿诱导的耐受性形成是必需的。铜绿假单胞菌(A)、肺炎克雷伯菌(B)、金黄色葡萄球菌(C)、鲍曼不动杆菌(D)和鼠伤寒沙门氏菌(E)在饥饿24小时接着用单独10×MIC氨苄青霉素(AMP)(图13)、单独CCCP和在10×MIC氨苄青霉素存在下的CCCP处理后，抗生素耐受亚群的大小变化。CCCP(100)，100μM CCCP；CCCP(50)，50μM CCCP；CCCP(10)，10μM CCCP；CCCP(5)，5μM CCCP；CCCP(1)，1μMCCCP。数据是使用三个生物重复进行的至少两次独立实验的平均值(n≥6)。在指定时间点在相同浓度下测试CCCP+AMP和CCCP之间的P值。通过双尾学生检验，**表示P值<0.01，****表示P值<0.0001。误差条代表标准偏差。

图6.提出的PMF介导的饥饿诱导耐受发展模型。(A)维持PMF对于延长饥饿诱导的耐受细胞的存活是必需的。PMF驱动的外排活性挤出β-内酰胺以促进耐受性形成；其他可能涉及特定代谢物/营养物质的输入/输出的膜蛋白活性由PMF支持，并且对于维持耐受表型也很重要。(B)PMF消散剂(例如CCCP)对耐受细胞杀灭的影响。PMF消散剂导致细菌膜PMF消散，从而抑制ATP产生，进而影响一系列涉及维持耐受表型的细胞功能，导致耐受细胞被杀灭。(C)PMF消散剂和氨苄青霉素对耐受细胞杀灭的影响。如果PMF在饥饿应激下无法维持，那么在β-内酰胺存在下，耐受细胞会被更有效地消灭。细菌膜PMF的消散使抗生素外排活性失活，导致抗生素在耐受细胞的周质中积累。抗生素的积累和其他细胞功能的抑制导致更有效地杀灭耐受细胞。(D)无论有或没有抗生素存在，PMF的消散都可能导致耐受细胞被杀灭。PMF消散后耐受细胞对β-内酰胺重新敏感的细胞基础仍有待阐明。

图7.pspA缺失对细菌抗生素耐受性产生负影响。(A)野生型菌株和psp突变体的相对耐受比率通过比较在饥饿24小时后用100g/mL氨苄青霉素处理144小时后存活的细菌群体的大小与未用氨苄青霉素处理的细菌群体的大小来计算。(B)ΔpspA与质粒携带的pspA拷贝互补，恢复了对氨苄青霉素的耐受性。野生型和ΔpspA作为对照。在144小时时测试ΔpspA和ΔpspA+AMP之间的P值。(C)饥饿24小时后用10μg/mL庆大霉素(Gen)或0.5μg/mL环丙沙星(Cip)处理144小时时野生型和ΔpspA的群体的大小。数据是使用三个生物重复进行的至少两次独立实验的平均值(n≥6)。在144小时时测试WT+Gen和ΔpspA+Gen之间的P值。通过双尾学生检验，*表示P值<0.05，***表示P值<0.001。误差条代表标准偏差。

图8.评估表现出饥饿诱导的抗生素耐受性的细菌亚群的抗生素敏感性。为了证实在耐受性试验中观察到的抗生素耐受性表型不是由于抗性亚群的存在，将经受营养饥饿24小时的细菌分成两部分，一部分用100μg/mL氨苄青霉素处理4小时以获得抗生素耐受亚群，而不用抗生素的一部分作为对照。然后通过离心收集耐受亚群，然后在新鲜LB中重新悬浮和稀释，并在37℃下孵育以诱导再生长。对源自该耐受亚群的新鲜细菌培养物进行抗生素敏感性测试，结果证实该亚群的后代仍然对测试剂敏感。测试了两个生物学重复。

图9.PMF消散对细菌对氨苄青霉素和庆大霉素的耐受性产生负影响，但对环丙沙星没有影响。(A)在饥饿24小时，然后用氨苄青霉素、CCCP或这两种化合物的组合处理后，在不同时间点存活的野生型大肠杆菌菌株BW25113的细菌群体的大小。CCCP(100)，100μMCCCP；CCCP(10)，10μM CCCP；CCCP(1)，1μM CCCP；CCCP(0.1)，0.1μM CCCP。在相同浓度下测试CCCP和CCCP+AMP之间P值。(B-E)在饥饿24小时，接着用庆大霉素(10g/mL)、环丙沙星(0.5g/mL)、CCCP(1μM)或这些化合物的组合处理后，在不同时间点存活的野生型或ΔpspA菌株的细菌群体的大小。在指定时间点测试Gen/Cip和CCCP+Gen/Cip之间的P值。(F)质粒携带的ndh和nuoI补充ΔndhΔnuoI，恢复了对氨苄青霉素的耐受性。包括野生型和ΔndhΔnuoI作为对照。在指定时间点测试ΔndhΔnuoI和ΔndhnuoI+AMP、空载体和空载体+AMP之间的P值。通过双尾学生检验，ns表示无显著性，*表示P值<0.05，**表示P值<0.01，***表示P值<0.001，****表示P值<0.0001。误差条代表标准偏差。

图10.评估细胞内荧光β-内酰胺量和外排泵对细菌耐受性的影响。(A)CCCP不会影响BOCILLIN所表现出的荧光水平。测量仅用CCCP(无BOCILLIN)处理的细菌群体的荧光信号，并与同时用CCCP和BOCILLIN处理(含BOCILLIN)的细菌群体进行比较。(B-F)有或没有CCCP(1μM)情况下，BOCILLIN染色的野生型和ΔpspA细胞的FSC-SSC谱。P1门被确定为细菌部分，因为样品中P1的百分比(约30％)远高于水中的百分比(约2％)。(G)质粒携带的tolC拷贝补充ΔtolC，恢复了对氨苄青霉素的耐受性。包括野生型和ΔtolC作为对照。在144小时时测试ΔtolC和ΔtolC+AMP之间的P值。(H)存在和不存在PAβN(100μM)时野生型菌株的生长速率。结果表明PAβN不会抑制细菌生长。通过双尾学生检验，ns表示无显著性，****表示P值<0.0001。误差条代表标准偏差。

图11：共有58个入围基因在RNA-Seq中发现在饥饿24小时后表达水平上调三倍或以上。*饥饿24小时的大肠杆菌群体中测试基因的表达水平的倍数差异，具有相同细胞密度的指数增长群体作为对照。¹外排和膜蛋白基因。²转录调节基因。3包膜应激和伴侣基因。⁴氧化酶基因。⁵DNA修复基因。⁶饥饿应激感应基因。

图12.基因敲除菌株的MIC

图13.氨苄青霉素对不同种细菌菌株的MIC。

图14.实施例中使用的大肠杆菌菌株。*Baba,T.,等人,Construction ofEscherichia coli K-12in-frame,single-gene knockout mutants:the Keiocollection.Mol Syst Biol,2006.2:p.2006 0008。

图15.测试了氨苄青霉素和益康唑对不同物种细菌菌株的最低抑菌浓度(MIC)。

图16.益康唑通过质子动力(PMF)的消散杀灭主要革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌病原体的存留细菌。饥饿24小时然后用单独氨苄青霉素(AMP，10×MIC)、单独益康唑(Econ)、单独头孢他啶(CAZ，100μg/ml)(在鼠伤寒沙门氏菌中)和益康唑与氨苄青霉素和头孢他啶的组合处理后，大肠杆菌(A)、肺炎克雷伯菌(B)、鲍曼不动杆菌(C)、铜绿假单胞菌(D)、金黄色葡萄球菌(E)和鼠伤寒沙门氏菌(F)中抗生素耐受亚群的大小变化。(G)饥饿24小时，然后用单独氨苄青霉素、单独CCCP、单独益康唑以及氨苄青霉素和益康唑或CCCP的组合处理后，大肠杆菌抗生素耐受亚群大小的变化。(H)饥饿24小时，然后用环丙沙星(CIP，1μg/ml)或庆大霉素(GEN，20μg/ml)单独处理或与益康唑(Econ)组合处理后，大肠杆菌抗生素耐受亚群大小的变化。(I)饥饿24小时，然后用单独美罗培南(Mer，40μg/ml)、单独益康唑或两者的组合处理后，碳青霉烯类耐药大肠杆菌(携带bla_NDM-1的大肠杆菌J53)抗生素耐受亚群大小的变化。数据是使用三个生物重复进行的至少两次独立实验的平均值(n>6)。

图17.益康唑(Econ)导致细菌PMF消散。在大肠杆菌(A)、金黄色葡萄球菌(B)和铜绿假单胞菌(C)中用Econ处理后10分钟内，与未处理的对照相比，发现测量细菌膜电位的DiSC3(5)的荧光强度显著增加，表明Econ能会导致这些生物体中膜PMF的消散。

图18.用益康唑、氨苄青霉素或两者的组合处理的大肠杆菌细胞的SEM图像。(A)未经任何处理的细胞中可见完整的膜和细胞内内容物；(B,C)暴露于氨苄青霉素(100μg/ml和1000μg/ml)后，仍可见光滑表面和细胞内内容物，但细胞的一极有轻微收缩(箭头1)。(D)单独用40μM益康唑(Econ)处理会导致细胞膜的严重结构损伤和细胞质渗漏(箭头2)。(E)用益康唑(40μM)和氨苄青霉素(100μg/ml)处理导致细胞裂解，胞质溶胶含量几乎全部损失(箭头3)。箭头表示细胞膜受损的区域。

图19.头孢他啶和益康唑组合处理可有效根除体内小鼠模型中的细菌耐受细胞。(A)大肠杆菌BW25113小鼠大腿深层感染模型。将1×10⁶CFU大肠杆菌BW25113注射到测试动物的右大腿中。感染后24小时，小鼠每12小时接受指定的抗细菌处理(腹腔注射)，持续72小时。对小鼠实施安乐死，并无菌切除受感染的大腿，在PBS中匀浆，然后测定细菌负荷。(B)鼠伤寒沙门氏菌PY1耐受脓毒症模型。给小鼠腹腔注射7.6×10⁵CFU鼠伤寒沙门氏菌PY01。24小时后，每12小时对小鼠进行指定治疗(腹膜内注射)。记录72小时内试验小鼠的死亡率。(C)将(B)中存活的小鼠安乐死，通过向腹膜内注射2mL盐水进行腹膜清洗，随后按摩腹部。然后切开腹部并收集200μL腹腔液用于测定细菌细胞计数。(D)鼠伤寒沙门氏菌PY1耐受脓毒症模型；与(B)相同，唯一的区别是接种了更高量的鼠伤寒沙门氏菌(1.5×10⁶CFU)。(E)由于大多数测试动物已死亡，因此未进行细菌存活测定。在相同耐受脓毒症模型中，使用较低剂量的2.8×10⁵CFU鼠伤寒沙门氏菌PY01。24小时后，每12小时对小鼠进行指定治疗(腹膜内注射)。记录72小时内小鼠的死亡率。(F)将(E)中存活的小鼠安乐死，通过向腹膜内注射2mL盐水进行腹膜清洗，随后按摩腹部。然后切开腹部并收集200μL腹腔液用于测定细菌计数。与用益康唑(Econ)和头孢他啶组合(20mg/kg)处理相比，用头孢他啶(CAZ)(20mg/kg)处理的小鼠仅表现出显著较慢(P＝0.0004)的鼠伤寒沙门氏菌PY1耐受亚群的根除率。Econ20，益康唑(20mg/kg)；CAZ20，头孢他啶(20mg/kg)。使用单向ANOVA和事后Tukey检验。*P<0.05；****P<0.0001。

图20.显示了实验结果，其中在大肠杆菌J53(mcr-1)中单独和组合测试了化合物编号1-23和粘菌素。根据2016年的CLSI标准，使用液体培养基稀释法确定存在和不存在化合物编号1-23时粘菌素对粘菌素抗性大肠杆菌的MIC。

图21.显示化合物编号1-23的化学结构。

具体实施方式

定义

在整个申请中，在组合物被描述为具有、包括或包含特定组分的情况下，或在方法被描述为具有、包括或包括特定方法步骤的情况下，预期本教导的组合物还可以基本上由所列举的组分组成，或由所列举的组分组成，并且本教导的方法还可以基本上由所列举的方法步骤组成，或由所列举的方法步骤组成。

在本申请中，在要素或组分被称为包括在所列举的要素或组分的列表中和/或选自所列举的要素或组分的列表的情况下，应理解所述要素或组分可以是所列举的要素或组分中的任何一个，或所述要素或组分可以从由两个或更多个列举要素或组分组成的组中选择。此外，应当理解，本文描述的组合物或方法的要素和/或特征可以以多种方式组合而不脱离本教导的精神和范围，无论是本文明确的还是隐含的。

应当理解，只要本教导保持可操作，步骤的顺序或执行某些动作的顺序是无关紧要的。此外，可以同时进行两个或更多个步骤或动作。

除非另有明确说明，否则此处使用的单数包括复数(反之亦然)。另外，如果术语“约”的使用在数量值之前，则本教导还包括特定数量值本身，除非另有特别说明。如本文所用，除非另有说明或推断，术语“约”是指标称值的±10％、±7％、±5％、±3％、±1％或±0％的变化。

本文所用术语“革兰氏阳性菌”是指其特征在于具有作为其细胞壁结构一部分的肽聚糖以及多糖和/或磷壁酸的细菌，并且其特征在于在革兰氏染色过程中的蓝紫色反应。

本文所用术语“革兰氏阴性菌”是指特征在于每个细菌细胞周围存在双膜的细菌，其特征在于在革兰氏染色过程中用脱色剂洗去后颜色消失，并用藏红反染粉红色。

术语“组合物”旨在涵盖包含指定量的指定成分的产品，以及任何直接或间接由指定量的指定成分的组合产生的产品。

如本文所用，除非另有说明，术语“治疗”是指逆转、减轻、抑制该术语适用的障碍或病症的发展或预防该障碍或病症的一种或多种症状。如本文所用，术语“治疗”是指治疗的行为，如上面刚刚定义的“治疗”。

本文使用的术语“受试者”是指将是或已经是治疗、观察和/或实验的对象的动物，通常是哺乳动物或人。当该术语与本文描述的化合物的施用结合使用时，则受试者是本文描述的化合物的治疗、观察和/或施用的对象。

术语“共同施用”和“共施用”指同时施用(同时施用两种或更多种治疗剂)和不同时施用(在不同于施用一种或多种治疗剂的时间施用一种或多种另外的治疗剂)，只要治疗剂在一定程度上同时存在于患者体内。

本文所用的术语“治疗有效量”是指在细胞培养物、组织系统、受试者、动物或人类中引起研究者、兽医、临床医生或内科医生所寻求的生物学、医学或成像反应的活性化合物或药剂的量，包括减轻所治疗的疾病、病症或障碍的症状和/或实现所期望程度的磁共振成像对比度增强。

如本文所用，除非另有说明，短语“药学上可接受的盐”包括可存在于本文所述的化合物中的酸性或碱性基团的盐。本文所述的包含碱性基团例如胺的化合物能够与各种无机酸和有机酸形成多种盐。可用于制备本文所述碱性化合物的药学上可接受的酸加成盐的酸是形成相对无毒的酸加成盐的那些，即含有药理学上可接受的阴离子的盐，例如乙酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、碳酸氢盐、硫酸氢盐、酒石酸氢盐、硼酸盐、溴化物、依地酸钙、樟脑磺酸盐、碳酸盐、氯化物、棒酸盐、柠檬酸盐、二盐酸盐、乙二胺四乙酸盐、乙二磺酸盐、酯酸盐、乙磺酸盐、琥珀酸乙酯、富马酸盐、葡庚糖酸盐、葡萄糖酸盐、谷氨酸盐、甘醇胂酸盐、己基间苯二酚盐、氢溴酸盐、盐酸盐、碘化物、异硫氰酸盐、乳酸盐、乳糖酸盐、月桂酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲基硫酸盐、粘酸盐、萘磺酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、双羟萘酸盐(双羟萘酸盐)、棕榈酸盐、泛酸盐、磷酸盐/二磷酸盐、聚半乳糖醛酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、次乙酸盐、琥珀酸盐、单宁酸盐、酒石酸盐、特辛酸盐、甲苯磺酸盐、三硫碘酸盐和戊酸盐。

在其他情况下，本文所述的化合物可以含有一个或多个酸性官能团，并且因此能够与药学上可接受的碱形成药学上可接受的盐。术语“药学上可接受的盐”在这些情况下是指本发明的化合物的相对无毒的无机和有机碱加成盐。这些盐同样可以在给药载剂或剂型生产过程中就地制备，或者通过将游离酸形式的纯化化合物与合适的碱，例如药学上可接受的金属阳离子的氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐，与氨，或者与药学上可接受的有机伯胺、仲胺或叔胺单独反应来制备。代表性的碱金属盐或碱土金属盐包括锂盐、钠盐、钾盐、钙盐、镁盐和铝盐等。用于形成碱加成盐的代表性有机胺包括乙胺、二乙胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪等。

本公开提供了一种用于治疗有需要的受试者中的细菌感染的方法，该方法包括：向受试者施用治疗有效量的细菌跨膜质子动力(PMF)抑制剂，其中细菌感染是由包含存留细菌细胞、抗生素抗性细菌细胞或其混合物的细菌细胞群体的结果，其中PMF抑制剂是一种基于咪唑的抗真菌剂，其条件是PMF抑制剂不是4-(2-氨基-1H-咪唑-4-基)-N-(十三烷-7-基)丁酰胺或4-(2-氨基-1H-咪唑-4-基)-N-十三烷基丁酰胺，如下所示：

在某些实施方案中，受试者是犬科动物、猫科动物、牛科动物、马科动物、非人灵长类动物或人类。在某些实施方案中，受试者是人类。

基于咪唑的抗真菌剂可以选自由以下组成的组：阿拉塞他康唑、联苯苄唑、克霉唑、克康唑、埃伯康唑、益康唑、奈替康唑、舍他康唑、硫康唑、噻康唑、卢立康唑、异康唑、咪康唑、恩康唑、芬替康唑、酮康唑、氯咪巴唑、布康唑、奥昔康唑、氟康唑、伏立康唑、来曲唑、三氯苯达唑、噻苯达唑、芬苯达唑和奥美拉唑或其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，基于咪唑的抗真菌剂可以选自由益康唑、舍他康唑、磺隆唑、噻康唑、卢立唑、异康唑、咪唑啉和尼隆唑组成的组。在某些实施方案中，基于咪唑的抗真菌剂是益康唑。

本文描述的方法可用于治疗由细菌细胞群体引起的任何细菌感染，所述细菌细胞群体包括存留细菌细胞、抗生素抗性细菌细胞或其混合物。本文描述的方法可以是杀细菌的或抑细菌的。在某些实施方案中，该方法是杀细菌的。

细菌可以是革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、革兰氏变异细菌或革兰氏不确定细菌。

示例性的革兰氏阴性细菌包括，但不限于，醋酸钙不动杆菌(Acinetobactercalcoaceticus)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、伴放线放线杆菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、木糖氧化产碱菌(Alcaligenes xylosoxidans)、拟杆菌属(Bacteroides)、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、杆菌状巴尔通体(Bartonella bacilliformis)、博德特氏菌属物种(Bordetella spp.)、伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、卡他布兰哈氏菌(Branhamella catarrhalis)、布鲁氏菌属物种(Brucella spp.)、弯曲杆菌属物种(Campylobacter spp.)、肺炎衣原体(Chalmydia pneumoniae)、鹦鹉热衣原体(Chlamydiapsittaci)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、紫色色杆菌(Chromobacteriumviolaceum)、柠檬酸杆菌属物种(Citrobacter spp.)、腐蚀艾肯氏菌(Eikenellacorrodens)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、大肠杆菌(E.coli)、脑膜败血黄杆菌(Flavobacterium meningosepticum)、梭杆菌属物种(Fusobacterium spp.)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、嗜血杆菌属物种(Haemophilus spp.)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、克雷伯菌属物种(Klebsiella spp.)、军团菌属物种(Legionella spp.)、钩端螺旋体属物种(Leptospiraspp.)、卡他莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)、摩根摩根氏菌(Morganella morganii)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)、禽多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)、志贺邻单胞菌(Plesiomonas shigelloides)、普雷沃菌属物种(Prevotella spp.)、变形杆菌属物种(Proteus spp.)、雷氏普罗维登斯(Providencia rettgeri)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、假单胞菌属物种(Pseudomonas spp.)、普瓦泽基立克次体(Rickettsia prowazekii)、立克次体(Rickettsia rickettsii)、罗沙利马体属物种(Rochalimaea spp.)、沙门氏菌属物种(Salmonella spp.)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、志贺氏菌属物种(Shigella spp.)、宋内志贺氏菌(Shigella sonnei)、密螺旋体(Treponema carateum)、梅毒螺旋体(Treponema pallidum)、地方性梅毒螺旋体(Treponema pallidum endemicum)、密螺旋体(Treponema pertenue)、韦荣球菌属物种(Veillonella spp.)、霍乱弧菌(Vibriocholerae)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、和小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersiniaenterocolitica)、鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)。

示例性的革兰氏阳性细菌包括，但不限于，放线菌属物种(Actinomyces spp.)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、双歧杆菌属物种(Bifidobacterium spp.)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、梭菌属物种(Clostridium spp.)、破伤风杆菌(Clostridium tetani)、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、杰氏棒状杆菌(Corynebacterium jeikeium)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、真杆菌属物种(Eubacterium spp.)、道加德纳菌(Gardnerella vaginalis)、麻斑双子藻(Gemella morbillorum)、明串珠菌属物种(Leuconostoc spp.)、脓肿分枝杆菌(Mycobacterium abscessus)、鸟分枝杆菌复合体(Mycobacterium avium complex)、龟分枝杆菌(Mycobacterium chelonae)、偶然分枝杆菌(Mycobacterium fortuitum)、嗜血分枝杆菌(Mycobacterium haemophilium)、堪萨斯分枝杆菌(Mycobacterium kansasii)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、海分枝杆菌(Mycobacterium marinum)、瘰疬分枝杆菌(Mycobacterium scrofulaceum)、耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)、土分枝杆菌(Mycobacterium terrae)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、溃疡分枝杆菌(Mycobacterium ulcerans)、诺卡氏菌属物种(Nocardia spp.)、黑消化球菌(Peptococcus niger)、消化链球菌属物种(Peptostreptococcus spp.)、丙酸杆菌属物种(Proprionibacterium spp.)、黄八叠球菌(Sarcina lutea)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、耳葡萄球菌(Staphylococcus auricularis)、头葡萄球菌(Staphylococcus capitis)、科尼葡萄球菌(Staphylococcus cohnii)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、溶血性葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus)、人葡萄球菌(Staphylococcus hominis)、路丹葡萄球菌(Staphylococcus lugdanensis)、解糖葡萄球菌(Staphylococcus saccharolyticus)、腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)、施氏葡萄球菌(Staphylococcusschleiferi)、模仿葡萄球菌(Staphylococcus similans)、华氏葡萄球菌(Staphylococcuswarneri)、木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)(B组链球菌)、咽峡炎链球菌(Streptococcus anginosus)、牛链球菌(Streptococcus bovis)、狗链球菌(Streptococcus canis)、马链球菌(Streptococcusequi)、米勒链球菌(Streptococcus milleri)、轻度链球菌(Streptococcus mitior)、变形链球菌(Streptococcus mutans)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)(A组链球菌)、和唾液链球菌(Streptococcus salivarius)、血链球菌(Streptococcus sanguis)。

在某些实施方案中，细菌感染由大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门氏菌引起。

细菌感染可以是由5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、99％或更多的存留细菌细胞、抗生素抗性细菌细胞或其混合物组成的细菌细胞群体。

抗生素抗性细菌细胞可以包含一种或多种赋予抗生素抗性的基因。可以赋予至少某种程度的抗生素抗性的示例性基因包括但不限于β-内酰胺酶基因，例如bla_CMY、bla_CTX-M、bla_OXA、bla_IMP、bla_VIM、bla_DHA、bla_KPC、bla_MOX、bla_ACC、bla_FOX、bla_EBC、bla_NDM、bla_TEM和bla_SHV；质粒介导的mcr基因导致粘菌素抗性，例如mcr-1、mcr-1.2、mcr-1.3、mcr-1.4、mcr-1.5、mcr-1.6、mcr-1.7、mcr-1.8、mcr-1.9、mcr-2、mcr-3、mcr-4、mcr-5、mcr-6、mcr-7、mcr-8、mcr-9、mcr-10；染色体突变导致粘菌素抗性，例如pmrA/pmrB、phoP/phoQ、arnBCADTEF、mgrB、ramA、crrB；四环素抗性基因，例如tetA和tetR；和氨基糖苷类抗性基因，例如aac、ant或aph。

在某些实施方案中，用于治疗有需要的受试者中的细菌感染的方法还包括向受试者共同施用治疗有效量的抗细菌剂或其药学上可接受的盐的步骤。

抗细菌剂可以是β-内酰胺、氨基糖苷、喹诺酮、糖肽、甘氨酰环素、脂肽、大环内酯、氯霉素、二氢叶酸还原酶抑制剂、磺酰胺、利福平、甲硝唑、克林霉素、林可霉素、夫西地酸、呋喃唑酮、异烟肼、吡嗪酰胺、抗微生物肽或其组合。

可用于本文所述方法的多粘菌素包括但不限于多粘菌素A、多粘菌素B、多粘菌素C、多粘菌素D、多粘菌素E和多粘菌素A。多粘菌素还可以是多粘菌素类似物。在这种情况下，多粘菌素类似物可以是例如出版物WO 2015/149131、WO 2015/135976、US2015/0031602、WO2014/188178、WO 2014/108469、US 2014/0162937、WO 2013/072695、WO 2012/168820、WO2012051663、US 2012/0283176、US2010/0160215、US2009/0215677、WO 2008/017734、国专利号6,380,356和美国专利号3,450,687中描述的多粘菌素类似物，其内容通过引用并入本文。

在某些实施方案中，多粘菌素是粘菌素A(多粘菌素E1)或多粘菌素B(多粘菌素E2)。在某些实施方案中，粘菌素A是粘菌素A硫酸盐或粘菌素A钠。

可以与本公开的方法组合使用的β-内酰胺抗生素的一些实例一般包括β-内酰胺，其包含青霉烷、碳青霉烷、氧青霉烷、青霉烯、碳青霉烯、单环内酰胺类、头孢烯、碳头孢烯或氧头孢烯核，如下所示。

这些类中特别有用的成员包括：例如青霉烷(penams)，例如苄青霉素(Benzylpenicillin)(G)、苄星青霉素(Benzathine Benzylpenicillin)、普鲁卡因青霉素(Procaine Benzylpenicillin)、苯氧基甲基青霉素(Phenoxymethylpenicillin)(V)、丙匹西林(Propicillin)、非奈西林(Pheneticillin)、吡多西林(Pzidocillin)、普洛美西林(Plometocillin)、醋甲西林(Penamecilli)、氯唑西林(Cloxacillin)、双氯西林(Dicloxacillin)、氟氯西林(Flucloxacillin)、苯唑西林(Oxacillin)、萘夫西林(Nafcillin)、甲氧西林(Methicillin)、阿莫西林(Amoxicillin)、安比西利(Ampicilli)、哌氨西林(Pivampicillin)、海他西林(Hetacillin)、巴卡西林(Bacampicillin)、美氨西林(Metampicillin)、他氨西林(Talampicillin)、埃皮西林(Epicillin)、替卡西林(Ticarcillin)羧苄青霉素(Carbenicillin)、卡林达西林(Carindacillin)、替莫西林(Temocillin)、哌拉西林(Piperacillin)、阿洛西林(Azlocillin)、美洛西林(Mezlocillin)、美西林(Mecillinam)、吡美西林(Pivmecillinam)、和磺卞西林(Sulbenicillin)、青霉烯(penem)，例如法罗培南(Faropenem)和利替培南(Ritipenem)、碳青霉烯(carbapenem)，例如厄他培南(Ertapenem)、多利培南(Doripenem)、亚胺培南(Imipenem)、美洛培南(meropenem)、比阿培南(Biapenem)、和帕尼培南(Panipenem)、头孢烯(Cephem)、例如头孢唑利(Cefazoli)、头孢氨苄(Cefalexin)、头孢羟氨苄(Cefadroxil)、头孢匹林(Cefapirin)、头孢西酮(Cefazedone)、头孢扎氟(Cefazaflur)、头孢拉定(Cefradine)、头孢罗沙定(Cefroxadine)、头孢替唑(Ceftezole)、头孢氨苄(Cefaloglycin)、头孢菌素(Cefacetrile)、头孢氯铵(Cefalonium)、头孢洛定(Cefaloridine)、头孢噻吩(Cefalotin)、头孢曲嗪(Cefatrizine)、头孢克洛(Cefaclor)、头孢替坦(Cefotetan)、头霉素(Cephamycin)、头孢西丁(Cefoxitin)、头孢丙烯(Cefprozil)、头孢呋辛(Cefuroxime)、头孢呋辛酯(Cefuroxime axetil)、头孢孟多(Cefamandole)、头孢米诺(Cefminox)、头孢尼西(Cefonicid)、头孢呋尼(Ceforanide)、头孢替安(Cefotiam)、头孢布拉宗(Cefbuperazone)、头孢唑南(Cefuzonam)、头孢美唑(Cefmetazole)、卡巴西芬(Carbacephem)、氯碳头孢(Loracarbef)、头孢克肟(Cefixime)、头孢曲松(Ceftriaxon)、头孢他啶(Ceftazidime)、头孢哌酮(Cefoperazone)、头孢地尼(Cefdinir)、头孢卡平(Cefcapene)、头孢达肟(Cefdaloxime)、头孢唑肟(Ceftizoxime)、头孢甲肟(Cefmenoxime)、头孢噻肟(Cefotaxime)、头孢匹胺(Cefpiramide)、头孢泊肟(Cefpodoxime)、头孢布汀(Ceftibuten)、头孢托伦(Cefditoren)、头孢他美(Cefetamet)、头孢地嗪(Cefodizime)、头孢咪唑(Cefpimizole)、头孢磺洛定(Cefsulodin)、头孢特仑(Cefteram)、头孢噻啉(Ceftiolene)、奥沙西芬(Oxacephem)、氟氧头孢(Flomoxef)、拉氧头孢(Latamoxef)、头孢吡肟(Cefepime)、头孢唑仑(Cefozopran)、头孢匹罗(Cefpirome)、头孢喹诺(Cefquinome)、头孢洛林酯(Ceftaroline fosamil)、噻呋特啰嗪(Ceftolozane)、头孢托罗(Ceftobiprole)、头孢噻呋(Ceftiofur)、头孢喹诺(Cefquinome)、和头孢维星(Cefovecin)、和单环内酰胺类(monobactam)，例如氨曲南替吉莫南(AztreonamTigemonam)、卡鲁莫南(Carumonam)、和诺卡霉素A(Nocardicin A)。

出人意料地发现，当基于咪唑的抗真菌剂与抗细菌剂共同施用至包含存留细菌细胞、抗生素抗性细菌细胞或其混合物的细菌细胞群体时，观察到杀细菌协同效应。图16表明当益康唑与β-内酰胺、氨苄青霉素共同施用时，在治疗大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和鼠伤寒沙门氏菌中观察到显著的杀细菌协同作用。图20显示，当益康唑、舍他康唑、硫康唑、噻康唑、卢立安唑、异康唑、咪康唑和恩康唑与粘菌素共同施用时，在治疗抗生素抗性大肠杆菌中观察到杀细菌协同作用。

基于咪唑的抗真菌剂可以根据本领域熟知的治疗方案施用。对于本领域技术人员来说显而易见的是，基于咪唑的抗真菌剂和抗细菌剂的施用可以根据所治疗的疾病和抗细菌剂对该疾病的已知作用而变化。另外，根据有经验的临床医生的知识，考虑到所施用的治疗剂(即，基于咪唑的抗真菌剂和抗细菌剂)对患者的观察效果，以及考虑到疾病对所施用的治疗剂的观察反应，可以改变治疗方案(例如，剂量和施用次数)。

另外，通常，基于咪唑的抗真菌剂和抗细菌剂不必在同一药物组合物中施用，并且可能由于不同的物理和化学特性而必须通过不同途径施用。例如，基于咪唑的抗真菌剂可以静脉内施用以产生并维持良好的血液水平，而抗细菌剂可以口服施用。施用方式的确定和在可能的情况下在相同药物组合物中施用的建议是熟练的临床医生熟知的。初始施用可以根据本领域已知的既定方案进行，然后，基于观察到的效果，熟练的临床医生可以修改剂量、施用方式和施用时间。

抗细菌药物的具体选择将取决于主治医生的诊断及其对患者状况的判断以及适当的治疗方案。

基于咪唑的抗真菌剂和抗细菌剂可以并行(例如，同时、基本上同时或在同一治疗方案内)或顺序施用，这取决于细菌感染的性质、患者的状况和与基于咪唑的抗真菌剂联合施用(即，在单一治疗方案中)的抗细菌剂的实际选择。

如果基于咪唑的抗真菌剂和抗细菌剂不同时或基本上不同时施用，则基于咪唑的抗真菌剂和抗细菌剂的最佳施用顺序对于不同的细菌感染可能不同。因此，在某些情况下，可以首先施用基于咪唑的抗真菌剂，然后施用抗细菌剂；在其他情况下，可以首先施用抗细菌剂，然后施用基于咪唑的抗真菌剂。这种交替施用可以在单个治疗方案期间重复。在评估所治疗的疾病和患者的状况后，在治疗方案期间每种治疗剂的施用顺序和重复施用次数的确定在熟练医师的知识范围内。例如，可以首先施用抗细菌剂，然后继续治疗，施用基于咪唑的抗真菌剂，如果确定有利，则随后施用抗细菌剂，等等，直到治疗方案完成。

因此，随着治疗的进行，执业医师可以根据经验和知识，根据个体患者的需要修改用于施用治疗的组分(基于咪唑的抗真菌剂和抗细菌剂)的每个方案。

在某些实施方案中，基于咪唑的抗真菌剂和抗细菌剂顺序施用，其中首先施用抗细菌剂，然后单独施用基于咪唑的抗真菌剂或与抗细菌剂组合施用。

本公开还提供了使存留细菌细胞或抗生素抗性细菌细胞对抗细菌剂重新敏感的方法，该方法包括：使存留细菌细胞或抗生素抗性细菌细胞与PMF抑制剂接触，其中PMF抑制剂是一种基于咪唑的抗真菌剂，其条件是PMF抑制剂不是4-(2-氨基-1H-咪唑-4-基)-N-(十三烷-7-基)丁酰胺或4-(2-氨基-1H-咪唑-4-基)-N-十三烷基丁酰胺。

存留细菌细胞或抗生素抗性细菌细胞可以是本文描述的任何细菌。在某些实施方案中，存留细菌细胞或抗生素抗性细菌细胞是革兰氏阴性存留细菌细胞或革兰氏阴性抗生素抗性细菌细胞。示例性存留细菌细胞或抗生素抗性细菌细胞包括但不限于大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门氏菌。

基于咪唑的抗真菌剂可以如本文所述。在某些实施方案中，基于咪唑的抗真菌剂是益康唑或其药学上可接受的盐。

用于使存留细菌细胞或抗生素抗性细菌细胞对抗细菌剂重新敏感的方法还可包括使细胞与抗细菌剂接触的步骤。

用于使存留细菌细胞或抗生素抗性细菌细胞对抗细菌剂重新敏感的方法可以在体外或体内进行。

psp家族中的基因在饥饿期间过度表达

为了探索在饥饿期间在抗生素抗性的发展和维持中起积极作用的生理应答的范围，首先在大肠杆菌BW25113上进行RNA-Seq，以鉴定即使在测试生物经历了长时间的饥饿事件后其表达水平也显著上调的基因。由于当营养物耗尽时代谢活动降至最低，因此除了可能调节适应性生理应答的必需蛋白之外，大多数功能基因的表达水平预计将保持在最低水平。因此，预期此类蛋白质直接或间接有助于饥饿诱导的耐受性的形成。基于RNA-Seq数据，总共鉴定了58个基因，与指数生长的细胞相比，当测试生物体在生理盐水中经历24小时饥饿应激时，这些基因的表达水平为三倍或更多(图11)。这些基因包括编码转录调节因子、膜转运蛋白、氧化酶、DNA修复蛋白和饥饿应激传感器的基因，其中鉴定出一个功能重要的基因簇，其中所有成员的表达水平均显著升高。该基因簇为psp家族，包含pspA、B、C、D、E和F基因，其表达水平在饥饿24小时后分别上调124、101、123、28、8和11倍(图11)。已知psp操纵子的产物能够感知PMF、膜存储曲率弹性应力、错误定位的分泌素(secretin)的存在和其他因素的变化；psp操纵子的激活使细菌细胞能够维持PMF或避免错误定位的分泌素诱导的毒性。然后研究了该基因簇在介导营养饥饿期间细菌耐受应答表达中的作用。

Psp应答在介导饥饿诱导耐受中的作用

为了测试上调的psp基因的产物是否在抗生素耐受性的形成中发挥作用，对野生型菌株的特定基因敲除突变体在六天内饥饿诱导的耐受性水平的变化进行了监测和比较。值得注意的是，虽然野生型和ΔpspA菌株的耐受水平在处理初始阶段相似，但ΔpspA中氨苄青霉素耐受细胞的比例与野生型相比，突变体在六天内的下降速度明显更快。然而，在整个实验中，psp家族中其他基因的敲除突变体中耐受亚群的大小与野生型相似(图1A；图7A)。氨苄青霉素治疗6天后，ΔpspA菌株中抗生素耐受亚群的大小降至约3×10⁵个细胞/mL，仅为野生型(约4×10⁶个细胞/mL)的10％。这些发现意味着pspA基因产物对于耐受性形成不是必需的，而是长期维持耐受性表型所必需的。当在基因互补实验中将质粒携带的pspA基因导入pspA基因缺失菌株时，氨苄青霉素处理后的存活群体的大小保持与野生型菌株相同(图7B)。还证实，耐受亚群的表型并非由于抗生素应激消除后赋予耐药性的基因突变所致，因为耐受亚群体能够再生为抗生素敏感生物，psp基因家族敲除突变体的最小抑制浓度(MIC)保持与野生型相同(8μg/ml)(图8；图12)。PspA是Psp家族成员中的关键功能蛋白，已知在Psp应答中发挥重要作用。接下来研究并测试了其在维持耐受表型中的作用，并测试pspA基因表达的增加是否实际上导致蛋白质水平的相应增加。进行蛋白质印迹，结果显示在指数期几乎检测不到PspA，然而在饥饿24小时后合成了大量的该蛋白质，其水平是指数期对照的约9.4倍(图1B)。除了维持抗生素耐受性之外，pspA基因产物还被发现对缺乏抗生素的饥饿期间细菌的存活有影响。在没有氨苄青霉素处理的六天饥饿期间，pspA敲除菌株的其他规模逐渐缩小至约7×10⁶个细胞/mL的水平，而野生型保持相对稳定在约2.5×10⁷个细胞/mL(图1A)。除氨苄青霉素外，还比较了ΔpspA和野生型之间对庆大霉素和环丙沙星的耐受亚群的大小。庆大霉素处理后存活的ΔpspA群体的大小被发现减小，但在用环丙沙星处理后仍保持在较高水平(图7C)。

PspA蛋白在饥饿期间维持PMF中发挥作用

据报道，Psp蛋白参与多种膜功能，PspBC复合物位于内膜，与PspA相互作用，防止内膜通透性改变和细胞质收缩。因此，假设缺失pspA基因可能会破坏膜完整性，导致膜渗漏。然而，通过使用染料SYTOX Green测试饥饿期间的膜渗透性，结果表明野生型和ΔpspA菌株在饥饿期间吸收的染料量相似(图2A)，表明ΔpspA突变体的膜通透性没有显著改变。同样，虽然发现粘菌素处理会导致膜损伤并最终增加膜通透性，但粘菌素处理后野生型大肠杆菌和ΔpspA突变体在处理后膜通透性的变化程度相似(图2A)，表明Psp应答对这种膜去稳定剂几乎没有保护作用。

PspA蛋白的主要作用之一是维持细菌PMF。研究发现PspA寡聚物而非PspBCA复合物外可与膜磷脂结合并防止质子泄漏。随后推测，PspA表达增加有助于维持表型耐受性的原因是它有助于在饥饿期间保护PMF。使用染料DiSC₃(5)测试进入饥饿模式后细菌细胞膜电位的变化程度。细菌细胞中染料的高水平积累将导致细胞培养物的整体荧光猝灭，而染料快速释放到培养基中将导致染料去极化后去猝灭。在指数期，野生型和ΔpspA菌株记录的荧光强度与作为阳性对照的缬氨霉素相似，因为它导致膜电位耗散，然后荧光急剧增加(图2B)。然而，在饥饿24小时后，ΔpspA菌株的荧光强度显著高于野生型，表明在饥饿期间pspA突变体中细胞内积累的染料量低得多(图2C)。另一方面，野生型菌株的荧光强度在指数期和饥饿24小时之间也保持在相似的水平，从而证实野生型的PMF在饥饿期间可以保持在相当于指数期的水平(图2D)。这些发现与共聚焦显微镜实验的结果一致，其中只有野生型菌株在饥饿24小时后可以被DiSC₃(5)染色。染料显然无法进入ΔpspA菌株的细胞，因为膜电位太低(图2E)。根据共聚焦图像计算各组的荧光强度，发现野生型菌株的荧光强度(100RFU/细胞)约为ΔpspA突变株的七倍(15RFU/细胞)；这一发现进一步证实，敲除pspA基因会导致营养饥饿期间PMF的快速消散(图2F)。我们的数据表明，PMF在饥饿条件下得以维持，因为PspA高度表达并保留了PMF。这一观察结果与之前的发现一致，即PMF有利于缺氧、不生长的细菌或营养匮乏条件下的细菌的存活。

PMF的维持对于饥饿诱导的耐受细胞的长期存活是必需的

在鉴定了pspA基因产物的PMF维持作用并证实了PMF在积极维持表型耐受性中的功能重要性后，假设仅仅防止预先存在的PMF的消散不足以完全消除维持耐受性表型的能力，因为经受饥饿应激的细菌仍然经历低水平的氧化磷酸化以产生基础水平的PMF。为了测试这种可能性，我们确定了叠氮化钠是否会导致长期饥饿的细菌群体的耐受水平显著降低，叠氮化钠会抑制细胞色素C氧化酶，从而抑制产生PMF的能力。结果表明，无论是否存在氨苄青霉素，用叠氮化钠处理后，野生型菌株的群体大小仅略有减小(图3A)。单独使用叠氮化钠对ΔpspA突变体的作用与野生型菌株相似，表现出轻微的杀细菌作用。然而，在氨苄青霉素存在的情况下，叠氮化钠能够在144小时时根除整个耐受亚群(图3B)。因此，这些发现证实，在营养缺乏的条件下，PMF对于耐受表型的长期维持是必需的，因为分别通过叠氮化钠处理和pspA基因缺失同时抑制PMF的产生和维持，导致在长期饥饿条件下形成的氨苄青霉素耐受细胞的完全消除。为了进一步证实PMF在饥饿诱导的耐受应答中的作用，解偶联剂羰基氰化物-间氯苯腙(CCCP)，一种已知的质子载体，被用于测试其对大肠杆菌耐受应答的作用。当CCCP(1μM)添加到已饥饿24小时的大肠杆菌细胞中时，在整个144小时的实验中，存活群体的大小保持不变，但当氨苄青霉素存在时，群体大小下降至存在约80个细胞/mL(图3A)。当CCCP浓度为10μM时，无论是否存在氨苄青霉素，CCCP处理144小时后记录的大肠杆菌群体大小均降至约50个细胞/mL和约300个细胞/mL范围(图9A)。如果CCCP的浓度增加到100μM，饥饿24小时的大肠杆菌群体的大小在24小时内从约2.5×10⁷个细胞/mL下降到约5×10⁵个细胞/mL，如果氨苄青霉素也存在，则下降到约2×10⁴个细胞/mL。然后，无论有或没有氨苄青霉素治疗，整个抗生素耐受群体在48小时内被根除，表明饥饿诱导的耐受细胞在PMF崩溃后无法再长时间存活(图9A)。同样，PMF消散后也无法维持对庆大霉素的表型耐受性(图9B，C)。然而，对环丙沙星的耐受性不受CCCP处理的影响(图9D，E)。综上所述，数据表明，PMF的主动维持是营养饥饿期间表型抗生素耐受性延长表达的关键机制。

为了证实PMF的主动维持是否确实在细菌表型耐受性的表达中起关键作用，进一步测试了控制PMF形成的细胞机制的破坏是否会影响耐受性的形成。ETC在生成PMF中发挥着重要作用。两种酶，即NADH脱氢酶I和NADH脱氢酶II，分别由基因nuoI和ndh编码，是ETC的关键组成部分。饥饿24小时，然后用氨苄青霉素处理6天后，发现大肠杆菌菌株BW25113::ΔnuoI和Δndh的群体大小分别下降至约3.5×10⁵个细胞/mL和约8×10⁶个细胞/mL(图3C)。重要的是，在用氨苄青霉素处理6天后，大肠杆菌BW25113::ΔndhΔnuoI菌株(其中两个基因同时缺失)的耐受群体的大小急剧下降至约200个细胞/mL，减少了约10⁴倍，表明抑制ETC组分的活性确实严重影响细菌PMF的产生和维持，并因此影响暴露于氨苄青霉素的耐受细胞的长期存活(图3D；图9F)。

PMF驱动的主动外排部分有助于维持大肠杆菌中饥饿诱导的耐受细胞

PMF参与多种细胞功能；特别是，它在维持外排活性方面发挥着重要作用。细菌外排可能导致抗生素积累减少，从而促进细胞形成耐受细胞并从抗生素处理中存活下来。测试了PMF在维持抗生素耐受表型中的作用是由于其促进外排活性的作用。一种被称为BOCILLIN^TM FL青霉素(BOCILLIN)的荧光β-内酰胺抗生素被用于描述存在和不存在CCCP时β-内酰胺抗生素的累积程度。首次证实CCCP对整体荧光信号影响很小，因为CCCP本身表现出的荧光水平仅为约250RFU，比BOCILLIN(约45000RFU)低约180倍(图10A)。在该实验中，进行流式细胞术来评估有或没有CCCP处理时BOCILLIN的积累程度。已经经受饥饿24小时，然后CCCP处理的野生型细菌细胞通常被BOCILLIN染色良好，97.86％的细胞显示高BOCILLIN强度(>10³RFU)，而在不存在CCCP的情况下记录的荧光水平明显较低，只有10.45％的细胞表现出高BOCILLIN强度(>10³RFU)，表明细胞内积累的β-内酰胺抗生素的量随着PMF消散而增加(图4A，B；图10B、C、D)。表现出高BOCILLIN水平的ΔpspA细胞的百分比为18.52％，高于野生型(10.45％)(图4C，D；图10E，F)。这一发现表明，如果不能适当维持PMF，细胞内β-内酰胺抗生素的积累水平就会增加。然后确定与饥饿期间PMF的人工消散相关的BOCILLIN的积累是否是由于未能进行外排所致。染料尼罗红是外排泵的常见底物，用于研究细菌外排活性。在本实验中，尼罗红与24小时饥饿群体一起孵育30分钟，然后添加CCCP并进行荧光测量。结果表明，添加CCCP后PMF的崩溃与荧光信号的增加密切相关。具体来说，野生型菌株中的荧光强度在30分钟内从约6500RFU增加到约10000RFU，表明在没有PMF的情况下外排效率降低(图4E)。

先前显示耐受性形成与细胞内β-内酰胺积累呈负相关。为了进一步确定外排活性是否确实与饥饿诱导的抗生素耐受性有关，缺失tolC基因导致饥饿期间记录的抗生素耐受性群体大小的减小，该基因的产物构成了几个主要外排系统(如AcrAB-TolC和EmrAB-TolC)的关键组分。在测定条件下，在用氨苄青霉素处理6天后，大肠杆菌ΔtolC突变体中的耐受群体的大小(约5×10⁴个细胞/mL)比野生型中的耐受群体的大小(约2.5×10⁷个细胞/mL)小得多，这表明外排泵在抗生素耐受表型的表达中起作用(图4F；图10G)。通过测试外排泵抑制剂PAβN的效果进一步证实了这一想法，PAβN也被发现会导致耐受细胞群大小显著下降(约1.5×10⁵个细胞/mL)(图4F)。结果表明，PAβN对细菌生长没有产生任何负面影响，表明该化合物所赋予的耐受性抑制作用不是由于其杀细菌作用(图10H)。这些数据表明，可能通过PMF维持的外排泵活性有助于营养饥饿期间表型抗生素耐受性的表达。

通过比较PMF消散和外排抑制对饥饿诱导的耐受细胞存活的影响，发现破坏PMF对耐受抑制的作用比抑制外排活性的作用强得多。用CCCP和氨苄青霉素处理六天后，野生型菌株中的整个耐受细胞群体记录为约50个细胞/mL；在pspA敲除的情况下，用叠氮化钠/CCCP和氨苄青霉素处理可以在144小时内完全根除。另一方面，在缺失tolC或用外排泵抑制剂PAβN处理后，野生型菌株中耐受群体的大小保持在约5×10⁴个细胞/ml(图4F)。这些数据强烈表明，PMF的维持是维持饥饿诱导的细菌抗生素耐受性的关键机制，PMF的功能作用可能在于调节外排和其他重要的膜转运活动，这值得进一步研究。

PMF的维持是革兰氏阴性和阳性细菌的关键耐受机制

为了确定PMF的维持是否是各种细菌物种普遍采用的促进耐受性形成的活性细胞机制，测试了CCCP是否能够根除主要细菌病原体的饥饿诱导的耐受性细胞。数据证实，低浓度的CCCP足以抑制甚至完全消除肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌和鼠伤寒沙门氏菌的表型氨苄青霉素耐受性，即使在没有氨苄青霉素的情况下，较高浓度的CCCP(100μM)也可以根除耐受细菌细胞(图5B-E)。铜绿假单胞菌中的耐受亚群在100μM CCCP存在下被氨苄青霉素根除(图5A)。这一发现证实，PMF维持是大多数细菌物种中表型抗生素耐受性延长表达的普遍机制。

益康唑作为抗生素佐剂杀灭饥饿诱导的细菌耐受细胞

通过进行耐受性试验筛选FDA批准的药物库，以选择化合物，这些化合物与氨苄青霉素协同作用从而杀灭通过将对数期大肠杆菌细胞在盐水中孵育24小时而产生的大肠杆菌耐受性细胞。经鉴定，一种抗真菌药物益康唑可以在氨苄青霉素存在的情况下有效杀灭饥饿诱导的大肠杆菌耐受细胞。与用盐水悬浮和孵育96小时后记录的约4×10⁷CFU/mL的初始群体大小相比，用致死剂量的氨苄青霉素(10×MIC)处理96小时后，群体大小保持在约1×10⁶CFU/mL的高水平，这表明绝大多数细菌群体对氨苄青霉素具有耐受性。然而，在用益康唑和氨苄青霉素的组合处理24小时后，整个耐受群体被根除(图15、图16A)。这种杀灭作用可归因于益康唑和氨苄青霉素的协同作用，因为单独使用益康唑对耐受细胞几乎没有影响，尽管益康唑处理早期群体大小略有下降(约1×10⁴CFU/mL(24小时)。对益康唑和氨苄青霉素组合对不同细菌物种的作用的进一步表征显示，在40μM时，单独的益康唑对革兰氏阴性菌如肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和鼠伤寒沙门氏菌的耐受细胞仅表现出轻微的杀灭作用，但在96小时内根除了革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)的耐受细胞(图16B-16F)。这种差异可能是由于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的细胞壁结构不同，这与金黄色葡萄球菌(40μM)中益康唑的MIC远低于革兰氏阴性菌(>160μM)的发现一致(图15)。然而，当与氨苄青霉素联合使用时，益康唑对肺炎克雷伯菌和鲍曼不动杆菌的耐受细胞表现出显著的杀灭作用，在24小时内根除整个耐受亚群(图16B、16C)。对于铜绿假单胞菌和鼠伤寒沙门氏菌，联合使用益康唑和氨苄青霉素可以在96小时内根除耐受亚群(图16D，16F)。益康唑与其他β-内酰胺类药物联合使用时也表现出协同抗细菌作用；例如，在益康唑和头孢他啶存在的情况下，耐受群体的大小在96小时内减少至约500CFU/mL，而单独使用头孢他啶处理后96小时记录的耐受群体大小仍保持在约1.4×10⁷CFU/mL(图16F)。

通过使用荧光探针DiSC₃(5)测量跨膜电位来研究益康唑对细菌细胞质膜的影响。这种染料在细菌细胞中积累，导致细胞悬浮液整体荧光的自猝灭。去极化后，染料迅速释放到介质中，导致可通过荧光测定检测到的去猝灭。测试了益康唑在大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌中的作用。在向细菌细胞中添加益康唑后发现荧光信号增加，表明益康唑引起革兰氏阴性和革兰氏阳性菌株中的PMF消散(图17)。据推测，细菌耐受细胞膜电位的耗散会导致细胞死亡。CCCP(羰基氰化物间氯苯腙)是一种已知的PMF消散剂，用于研究它是否能够以类似于益康唑的方式杀灭细菌耐受细胞。数据显示，单独的CCCP以及CCCP和氨苄青霉素的组合都可以杀灭大肠杆菌的细菌耐受细胞，但是CCCP和氨苄青霉素的组合的杀灭效果明显强于单独的CCCP(图16G)。这一发现证实细菌PMF的消散可以使细菌耐受细胞对抗生素敏感。值得注意的是，CCCP和益康唑本身对主要革兰氏阴性菌物种不表现出抗细菌活性，所有测试菌株中的MIC均>160μM。对于革兰氏阳性病原体金黄色葡萄球菌，记录的MIC为40μM(图15)。CCCP对人类是有毒的，然而益康唑是FDA批准的，并且已经被证明作为治疗剂使用是安全的，包括对人类全身性施用，这表明该化合物具有很高的潜力被开发成杀灭细菌耐受细胞的临床疗法。

然后测试是否可以通过单独使用益康唑或与各种类型的常用抗生素联合处理来根除耐受细胞。在大肠杆菌中，用益康唑和环丙沙星/庆大霉素组合处理4小时后，存活的细菌群体大小约为200CFU/mL，而单独用益康唑处理后存活的群体大小约为1.7×10⁵CFU/mL，与未经处理时记录的值相似(群体重悬于盐水中，约6.3×10⁷CFU/mL)。当处理时间达到24小时时，所有耐受细胞被益康唑和环丙沙星/庆大霉素的组合杀灭(图16H)。这些发现表明，除了氨苄青霉素外，益康唑还增强了喹诺酮类和氨基糖苷类药物对细菌抗生素耐受细胞的杀灭作用。还发现益康唑可与亚致死剂量的美罗培南联合作用，以消除表达碳青霉烯酶NDM-1的耐碳青霉烯大肠杆菌J53菌株的耐受亚群(当这些细胞遭受营养饥饿时)(图16I)。这一发现表明，益康唑不仅可以增强常规抗生素对抗生素敏感菌株的耐受亚群的杀灭作用，而且还可以增强对耐药生物体的耐受亚群的杀灭作用。

益康唑处理的耐受细胞的形态学

通过扫描电子显微镜(SEM)进一步研究了益康唑和氨苄青霉素组合对大肠杆菌耐受细胞的细胞结构的影响。用高剂量氨苄青霉素(100μg/ml和1000μg/ml)处理后，耐受细胞在极区表现出轻微收缩，但膜的显微镜图像仍然与用盐水处理的细胞一样清晰和光滑(图18A、18B、18C)。然而，用40μM益康唑处理的耐受细胞表现出粗糙的细胞表面，以及以越来越透明的胞质溶胶为特征的细胞内物质渗漏(图18D)。当用益康唑和氨苄青霉素联合处理时，细胞膜结构被严重破坏，导致细胞内内容物完全渗漏和细胞裂解，具有在SEM下可见细胞完全透明的特征(图18E)。还应该指出的是，益康唑并未发现对指数生长的细胞造成任何可检测到的膜损伤或形态变化，这些细胞积极进行有氧呼吸以产生强PMF(数据未显示)，这表明益康唑对饥饿诱导的抗生素耐受细胞的有害作用是由于PMF消散。这些发现与长期杀灭数据一致，饥饿下的细菌最初对氨苄青霉素具有耐受性，但可以被益康唑和氨苄青霉素组合完全根除(图16)。

益康唑和头孢他啶组合根除体内耐受细菌群体

在小鼠感染模型中进一步测试了β-内酰胺和益康唑组合根除细菌耐受细胞的功效，并以临床治疗细菌感染常用的抗生素头孢他啶为试验药剂。首先，以大肠杆菌BW25113为测试菌建立大腿深层耐受模型；数据显示，单独使用益康唑(20mg/kg)或联合使用益康唑(20mg/kg)和头孢他啶(20mg/Kg)与单独用头孢他啶(20mg/Kg)处理相比可显著提高(P＝0.026和P＝0.031)大肠杆菌耐受细胞的有效根除(图19A)。其次，对涉及鼠伤寒沙门氏菌PY1的腹膜炎感染模型进行了测试，并发现头孢他啶和头孢他啶与益康唑的组合都可以保护测试动物免于因接种7.6×10⁵CFU的鼠伤寒沙门氏菌PY1而诱发的耐受感染死亡，组合疗法稍微更有效(图19B)。处理72小时后，测定存活动物中鼠伤寒沙门氏菌PY1的CFU，结果显示组合疗法导致小鼠中PY1耐受细胞的清除率显著更高(P<0.0001)(图19C)。在感染较低剂量(2.8×10⁵CFU)鼠伤寒沙门氏菌PY1的小鼠中也观察到类似的效果(图19E，F)。然而，当用相对高剂量的鼠伤寒沙门氏菌PY1(1.5×10⁶CFU)感染时，在用益康唑(20mg/kg)和头孢他啶(20mg/kg)组合治疗的小鼠中记录到80％的存活率，而用头孢他啶单独治疗(20mg/Kg)只能拯救10％的感染小鼠(图4D)。这些发现证实，益康唑可以显著增强头孢他啶在体内根除沙门氏菌耐受细胞的功效。

抗生素耐受是指细菌亚群在致命剂量的抗生素治疗下存活并在停药后重新生长的现象。在这项工作中，一个目标是描绘细菌的主动耐受机制。通过对经受长期饥饿的细菌的基因表达谱的系统分析，表明psp基因家族的产物在防止PMF消散中起作用，从而促进特定外排和运输系统的正常功能，即使在营养物饥饿期间。事实证明，这种细胞活动对于维持抗生素耐受亚群的存活适应性是必需的。PspA蛋白由Peter Model于1990年发现，首次显示在大肠杆菌中被丝状噬菌体f1感染后被诱导。此后，Psp蛋白被认为在调节细菌毒力、维持PMF和介导包膜应激应答中发挥作用。在这项工作中rcsA和cpxP基因(其介导细菌包膜应激应答，也被报道在维持PMF中起作用)被发现分别上调约100和268倍。

发现Psp应答参与吲哚诱导的耐受的调节，因为pspBC突变体中吲哚诱导的耐受亚群大小显著减小。还表明PspA在稳定期细菌群体中过表达，并且在碱性条件下(pH 9)，缺乏pspABC基因的生物表现出比野生型明显更低的存活率，这表明Psp应答可以增强细菌在不利条件下的存活。然而，尽管有这些发现，Psp应答在介导细菌表型抗生素耐受性表达中的功能重要性似乎被忽视了。这项工作描述了PspA通过维持细菌中的PMF在介导饥饿诱导的抗生素耐受应答表达中的重要作用。

在这项工作中，之所以要经六天监测耐受水平的变化，是因为人们认为缺乏PMF维持功能的影响无法立即观察到。事实上，之前的多项研究表明，破坏PMF和降低ATP水平实际上可能会导致耐受性的形成，大概是通过触发休眠来实现的。目前没有证据表明PMF在耐受细胞中完全消散；相反，已知PMF是非复制型结核分枝杆菌活力所需要的，因为在抑制ETC的活性时观察到细胞死亡，ETC的活性对于PMF的产生是必需的。据报道，在存在导致PMF消散的化合物的情况下，耐受细胞会被根除。因此，尽管据报道PMF消散会降低ATP水平并引发细菌生理休眠的开始，但PMF对于延长休眠细胞的存活仍然是不可或缺的。介导耐受性的机制是复杂的，因为一些证据表明休眠对于耐受性细胞的形成是不充分的，甚至不是必需的，因为在具有高呼吸活性或活跃分裂的细胞的细菌群体中形成的耐受性细胞已被鉴定。Orman,M.等人报道，具有高呼吸活性的细菌中的耐受亚群的大小实际上高于具有低呼吸活性的细胞，并且抑制ETC或TCA循环阻止了耐受性的形成。本公开提供了关于PMF在细菌抗生素耐受性表型表达中的作用的综合观点，通过显示，尽管PMF的消散甚至在没有饥饿应激的情况下也能触发耐受性形成，但基础水平的PMF实际上是细菌耐受性细胞延长存活所需要的。因此，与野生型菌株相比，缺乏维持PMF的能力，如pspA敲除的情况，导致抗生素耐受亚群的大小逐渐减少。通过叠氮化钠处理抑制产生PMF的能力也轻微影响耐受性。重要的是，当产生和维持PMF的能力同时受到抑制时，通过用叠氮化钠处理pspA敲除突变体，发现耐受水平急剧下降(图6)。因此，这些观察结果证实，在营养饥饿期间，表型耐受性的表达需要主动维持PMF的基础水平。一致地，我们发现，敲除呼吸ETC的关键组分(ΔnuoIΔndh)(它在生成PMF中发挥作用)会导致耐受水平急剧下降。关于PMF在维持耐受性中的功能重要性的发现也与Ma等人的发现一致，他们表明通过在sucB和ubiF基因中引入突变来抑制能量产生会影响耐受性水平。总而言之，耐受细胞很可能维持基础代谢水平，以产生ATP并保持PMF，这可能是通过主动清除死细胞释放的细胞物质作为碳源。基因表达数据显示，多种膜结合转运蛋白的表达在长期饥饿后上调(图11)。

本公开还证明PMF维持与外排活性相关，外排活性也可诱导增强饥饿期间细菌的存活适应性(图11)。这些外排活性可能与细胞内抗生素或毒性代谢物在饥饿或其他应激期间的输出有关，减少了细胞内积累的抗生素的量，并使饥饿下的生物体变得对抗生素耐受。结果表明，如果PMF崩溃，外排系统将失去驱动能量并表现出外排效率下降。一致地，Wu等人表明AcrAB-TolC泵的结构缺陷与抗生素耐受性降低相关。Pu等人报道外排活性参与稳定期诱导的耐受性，但潜在的调节机制尚未阐明。另一方面，先前的研究还表明，特定的外排泵赋予抗生素耐受性，但没有表明这种外排活性是否是饥饿诱导的。证实外排系统在长期饥饿条件下维持表型药物耐受性方面发挥作用。因此，这些发现有助于弥合这一知识差距，并对未来探索饥饿引起的耐受机制和制定反耐受策略具有重要意义。

数据证实，PMF的作用不限于支持外排活性，因为单独用CCCP处理导致PMF消散，导致耐受细胞的快速根除，而缺失外排基因或用外排泵抑制剂处理仅导致耐受群体大小的适度减少(图6)。PMF对于多种膜蛋白的正常功能是必需的，包括前面提到的营养物清除转运蛋白；维持耐受表型的PMF依赖性机制仍有待确定。然而，由于其在维持耐受细胞活力方面的功能重要性，PMF被认为是根除耐受细胞的极好靶标。通过抑制一种特定的细胞功能很少能实现耐受细胞的完全根除。以前有两篇关于完全根除革兰氏阳性菌中抗生素耐受细胞的报道，其中涉及使用类视黄醇和酰基缩肽抗生素分别造成膜损伤和激活酪蛋白水解蛋白酶。然而，这些抗生素对革兰氏阴性生物体无效。破坏细菌PMF以彻底根除革兰氏阳性菌和阴性菌的耐受细胞具有临床意义。

总之，本公开显示PMF对于革兰氏阳性和阴性细菌中饥饿诱导的抗生素耐受表型的延长表达是必需的。这项工作的发现代表了在理解细菌抗生素耐受现象的细胞基础方面的重大进展：抗生素耐受性群体的出现是由于响应于环境条件变化的代谢关闭和一系列PMF依赖性防御机制的激活的综合效应，一系列PMF依赖性防御机制的激活对耐受性表型的长期维持特别重要。诱导细菌PMF消散可能是根除细菌持续存在的有效方法。

经鉴定，FDA批准的抗真菌药物益康唑在单独使用时可导致细菌PMF消散，并有效根除金黄色葡萄球菌耐药细胞，在与各种常规抗生素联合使用时可根除革兰氏阴性细菌病原体耐药细胞。在动物感染模型中，进一步证明益康唑和头孢他啶的联合使用可以有效根除细菌耐受细胞。这些发现具有高度的临床相关性，因为它们意味着在4天的治疗过程中，大多数处于耐受状态的细菌物种可以通过单独使用PMF抑制剂或通过联合使用这些药物和常规抗生素来根除。

由于其在维持耐受细胞活力方面的功能重要性，PMF被认为是筛选可根除细菌耐受亚群的化合物的极好靶标。仅抑制一种特定的细胞功能很少能完全根除耐受细胞。然而，靶向PMF越来越被视为一种新型抗细菌策略。然而，迄今为止发现的大多数PMF消散剂，例如CCCP，对人体表现出高毒性。在这项工作中发现，FDA批准的咪唑类抗真菌药物具有很强的PMF消散活性。可能还有其他低毒性化合物可能导致细菌PMF消散。应尝试进一步筛选FDA批准的药物和新药先导化合物，以鉴定可导致细菌PMF消散而不对人体产生毒性的化合物。低毒性PMF消散剂应该是开发能够杀灭存留细菌的药物的潜在良好候选者。

总而言之，我们的研究确定了FDA批准的抗真菌药物益康唑，它可以导致细菌PMF消散。我们的研究结果表明，用无毒的PMF破坏剂根除革兰氏阳性菌和阴性菌的细菌耐受细胞是高度可行的。

菌株和培养。所有敲除菌株均源自大肠杆菌BW25113，并且单个敲除菌株获自ColiGenetics Stock Center(美国)(图14)。采用lambda red重组方法构建双敲除菌株，其中质粒pKD46用于表达Red重组酶，其包含frp exo下游的终止子；pKD4用于表达卡那霉素抗性，pCP20用于表达Flp重组酶。质粒pBAD18用于基因互补。除非另有说明，所有培养物均使用Luria-Bertani(LB)液体培养基。所有菌株均在37℃、250rpm振荡下生长。

本研究工作还研究了以下菌株：大肠杆菌BW25113，耐碳青霉烯类大肠杆菌(携带bla_NDM-1的大肠杆菌J53)、金黄色葡萄球菌ATCC29213、肺炎克雷伯菌ATCC13833、鲍曼不动杆菌ATCC19606、铜绿假单胞菌PA01和鼠伤寒沙门氏菌PY01。除非另有说明，所有培养物均使用Luria-Bertani(LB)液体培养基。所有测试菌株均在37℃、250rmp/min振荡下生长。DiSC₃(5)购自Thermo Fisher。

耐受性测定。到达指数生长期后，将细菌洗涤并重悬于盐水(0.9％ NaCl)中，在37℃下恒定振荡(250rpm)下孵育24小时，然后用约10X MIC浓度的氨苄青霉素处理(图12,3)144小时(6天)，每48小时补充新鲜氨苄青霉素。在氨苄青霉素处理之前和处理4小时、2天、4天和6天之后进行标准连续稀释并在LB琼脂上铺板，以确定处理过程中不同时间点的测试群体的存活分数。

RNA测序和分析。将新鲜的大肠杆菌K-12BW25113菌落接种到LB培养基中并在37℃恒定振荡(250rpm)下生长过夜。将过夜培养物在LB液体培养基中稀释100倍并培养约1小时直至OD₆₀₀值达到0.2(指数期)。将该指数期培养物的等分试样洗涤并重悬于盐水中，在37℃下恒定振荡(250rpm)下培养，然后与100μg/mL氨苄青霉素在37℃下孵育24小时。采用RNeasy Mini Kit(Qiagen，德国)提取指数期和饥饿期细菌的总RNA；使用Illumina Ribo-Zero Plus rRNA Depletion Kit去除rRNA；样品被送往北京华大基因研究所(香港)进行转录组测序。首先使用Hisat2将原始读段映射到参考基因组。这些映射的读段作为Cufflinks的输入提供，Cufflinks为每个样品生成一个组装转录本的文件。将组装文件与参考转录组注释通过Cuffmerge合并为统一注释，并通过Cuffdiff进行定量，生成一组表达数据。Cuffdiff发现了唯一映射到一种异构体的读段，并计算了异构体丰度、倍数变化和q值。使用的归一化策略是RPKM(Reads Per Kilobase Million)，并且仅选择RPKM大于5的基因进行分析。

蛋白质印迹分析。饥饿24小时后，通过离心收获细菌并在100℃下在样品缓冲液中溶解10分钟。通过SDS-PAGE分离总细胞蛋白，并使用半干式电印迹装置(BIO-RAD)将其电印迹到PVDF膜(BIO-RAD 0.2μM)上。首先用抗PspA(多克隆兔来源)或抗GAPDH(Abcam)抗体探测含有分级样品的膜，然后用tris缓冲盐水和Tween 20(TBST)清洗。将洗涤后的膜重新封闭并同时用抗兔抗体进行探测。通过测量HRP底物(EMD Millipore)显示的化学发光来检测目标蛋白条带；通过ImageJ v1.29计算蛋白质印迹的相对条带强度。

膜渗透性测定。使用SYTOX Green(ThermoFisher)测量测试生物体的膜通透性或完整性，SYTOX Green可以通过受损的细胞膜进入细胞并与核酸结合，产生荧光信号。OD₆₀₀浓度为0.2的大肠杆菌BW25113及其ΔpspA衍生物，经24小时饥饿处理后，通过离心(6000×g，2分钟)收集，洗涤两次并重悬于盐水中。然后加入SYTOX Green至终浓度为1μM，然后在室温下避光孵育30分钟。使用Cary Eclipse荧光分光光度计(Agilent)测量野生型和ΔpspA菌株的相对荧光信号，激发波长为488±10nm，发射波长为523±10nm。

评估PAβN对细菌生长速率的影响。大肠杆菌BW25113菌株的过夜培养物在LB液体培养基中按1:100稀释，然后添加100μM PAβN；仅添加盐水的样品作为阴性对照。在不同时间点测试OD₆₀₀值。

膜电位测定。使用膜电位敏感探针DiSC₃(5)测量跨膜电位。通过离心(6000×g，2分钟)收集处于指数期(OD₆₀₀为0.2)或24小时饥饿(重悬于盐水中)的细菌群体，洗涤两次并重悬于PBS(pH 7.4)，然后调整至OD₆₀₀为0.2。加入KCl和DiSC₃(5)直至终浓度分别达到100mM和1μM，然后在黑暗中室温孵育25分钟，使染料渗透外膜并产生猝灭效果。然后将缬氨霉素(1μM)添加到阳性对照组中，将K⁺转运到细胞质中，从而导致去极化。使用Clariostar酶标仪(BMG LABTECH)在622±10nm的激发波长和670±10nm的发射波长下监测荧光读数10分钟。去极化后，染料迅速释放到培养基中，导致去猝灭并促进荧光检测。还进行共焦成像以测试野生型菌株和ΔpspA突变体的膜电位之间的差异。除最后一步外，样品制备方法与用酶标仪测试前相同。简而言之，共聚焦观察前用PBS洗涤细胞三次，以去除细胞外DiSC₃(5)染料。通过配备60倍油浸物镜的Leica TCS SP8 MP多光子显微镜对细菌进行成像。DiSC₃(5)由638nm激光激发，并通过HyD检测器在发射波长675±25nm处检测到荧光。图像由Leica Application Suite X(LAS X)软件采集和分析。

评估质子离子载体和叠氮化钠对饥饿诱导的耐受性的影响。为了确定保持显著水平的PMF是否对于维持饥饿诱导的耐受细胞的耐受表型是必需的，分别测试了解偶联剂CCCP或叠氮化钠(5mM)的效果。将测试剂添加到已饥饿24小时的细菌中，然后在37℃下孵育并用约10X MIC氨苄青霉素处理144小时。对每24小时收集的样品进行标准连续稀释并在LB琼脂上铺板，以评估处理过程中存活的亚群大小的变化。对于每个样品，实验中均包括未接受氨苄青霉素处理的对照。

抗生素积累测定。将过夜细菌培养物在LB液体培养基中稀释100倍并培养约1小时直至OD₆₀₀值达到0.2(指数期)。洗涤该指数生长期培养物的等分试样并重悬于盐水中，在37℃下恒定振荡(250rpm)培养24小时，然后加入CCCP(1μM)。5分钟后，加入BOCILLIN^TM FL青霉素(10μg/mL)，并在37℃下以250rpm振荡孵育1小时。用PBS洗涤两次后，通过流式细胞术CytoFLEX(Beckman)测量荧光信号。通过FSC(前向散射)和SSC(侧向散射)参数来鉴定微生物。在488nm激发、525nm发射下测量荧光强度。

外排活动评估。将已经历24小时饥饿的细菌群体的10mL部分在室温下以6000×g离心5分钟。将沉淀重悬于含有1mM MgCl₂(PPB)的PBS中，并调整至OD₆₀₀0.2。添加终浓度为5μM的尼罗红(在水溶液中仅发出微弱荧光，但在非极性环境中会发出强荧光)，然后在37℃下孵育30分钟，并以250rpm振荡。然后添加CCCP以产生100μM的终浓度；通过Clariostar酶标仪在544±10nm的激发波长和650±10nm的发射波长下测量荧光30分钟。

最小抑制浓度(MIC)的测定。氨苄青霉素对鲍曼不动杆菌ATCC19606、肺炎克雷伯菌ATCC13883、铜绿假单胞菌PAO1、金黄色葡萄球菌ATCC29213、鼠伤寒沙门氏菌PY01和大肠杆菌K-12BW25113及其基因敲除衍生物(获自Keio保藏中心)的MIC通过以下测定：将新鲜生长的培养物(Mueller Hinton液体培养基(MHB)(BD Difco，America)与各种浓度的氨苄青霉素一起孵育16小时，记录抑制细菌生长并导致浊度减少的最小浓度。结果基于至少三个独立实验的平均值，并根据CLSI指南进行解释。

最小抑制浓度(MIC)的测定。氨苄青霉素或益康唑对鲍曼不动杆菌菌株ATCC19606、肺炎克雷伯菌ATCC13883、铜绿假单胞菌PAO1、金黄色葡萄球菌ATCC29213、鼠伤寒沙门氏菌PY01和大肠杆菌BW25113的MIC通过以下测定：将新鲜生长的培养物(MuellerHinton液体培养基(MHB)(BD Difco，America)与各种浓度的氨苄青霉素或益康唑一起孵育16小时，记录抑制细菌生长并导致浊度减少的浓度。结果基于至少三个独立实验的平均值，并根据CLSI指南进行解释。

耐受性测定

达到指数生长期后，将细菌洗涤并重悬于盐水(0.9％ NaCl)中，然后在37℃下持续振荡(250rpm/min)孵育24小时。然后用益康唑40μM、CCCP 100μM、美罗培南40μg/ml、庆大霉素20μg/ml、环丙沙星1μg/ml、头孢他啶100μg/ml、10XMIC浓度的氨苄青霉素处理或将这些常规抗生素与益康唑/CCCP联合处理96小时(4天)。在氨苄青霉素处理之前和处理4小时、1天、2天和4天之后进行标准连续稀释并在LB琼脂上铺板，以确定治疗过程中不同时间点的测试群体的存活分数。

评估益康唑对膜电位的影响。使用电压敏感染料DiSC3(5)进行细菌细胞膜电位的荧光测量。首先将测试生物体饥饿24小时，然后离心并用PBS洗涤两次。将细胞沉淀重悬于含有100mM KCl的PBS中，直至终浓度OD 0.2。将细胞与1μM DiSC3(5)一起在黑暗中振荡孵育5分钟。用益康唑(40μM)处理细胞；不包括处理对照。使用Clariostar酶标仪(BMGLABTECH)在黑色聚苯乙烯微量滴定板上进行荧光测量，激发波长为610nm，发射波长为660nm。

电子显微镜分析。饥饿24小时的大肠杆菌用单独益康唑、单独氨苄青霉素以及益康唑和氨苄青霉素组合处理24小时，然后在扫描电子显微镜下检查(SEM)。用盐水处理的细胞作为阴性对照。简而言之，将细菌细胞在0.4％聚甲醛中固定过夜，然后在四氧化锇(OsO₄)中固定2小时，随后用PBS洗涤三次。然后用纯乙醇将细胞脱水，并渗透并包埋在Spurr树脂中以供SEM检查。

小鼠大腿深层感染模型

NIH小鼠购自中国广州广东省实验动物中心。实验使用约6周龄、体重约20g的雄性小鼠，每组6只小鼠。让动物适应饲养设施5天。感染前3天和1天施用150mg/kg环磷酰胺使小鼠中性粒细胞减少。将大肠杆菌BW25113的1×10⁶CFU接种物注射到小鼠的右大腿中。感染后24小时，每组小鼠每12小时随机接受头孢他啶(20mg/kg)、益康唑(20mg/kg)或头孢他啶联合益康唑处理(腹腔注射)，持续72小时。然后对小鼠实施安乐死，无菌切除受感染的大腿并在PBS中匀浆；通过系列稀释、铺在LB平板上并在37℃孵育过夜来计数样品中存在的大肠杆菌的数量。记录、比较并且通过单向ANOVA和事后Tukey检验分析不同处理后存活的细菌的群体大小。数据通过Graph Pad Prism软件呈现。所有实验方案均遵循香港城市大学动物伦理委员会批准的生物安全二级动物设施的标准操作程序。

小鼠腹膜炎感染模型

使用约六周龄、体重约20g的NIH雄性小鼠，每组6只小鼠。让动物适应饲养设施5天。感染前3天和1天施用150mg/kg环磷酰胺使小鼠中性粒细胞减少。不同量的鼠伤寒沙门氏菌菌株PY01(2.8×10⁵CFU、7.6×10⁵CFU或1.5×10⁶CFU)通过腹腔注射接种到动物体内。小鼠在接种后24小时随机接受头孢他啶(20mg/kg)、益康唑(20mg/kg)或头孢他啶联合益康唑处理(腹腔注射)，间隔为12小时，共72小时。每12小时记录一次试验小鼠的死亡率。治疗72小时后，对活小鼠实施安乐死并进行腹膜清洗，其中包括向腹膜内注射2mL盐水，然后进行腹部按摩。然后切开腹部并收集200μL腹膜液并用盐水连续稀释。将每种稀释液取100μL涂在LB板上，然后在37℃下孵育过夜。对菌落进行计数以确定测试样品中的细菌负荷，以CFU/ml表示。统计分析和伦理批准与上述相同。

定量和统计分析

本工作中使用的统计方法在图例中进行了描述。使用GraphPad Prism软件7.00版(Prism)进行统计分析。显示平均值，并用误差线表示SD。使用双尾学生t检验。ns，-不显著；*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；****p<0.0001。

Claims (20)

1.一种治疗有需要的受试者的细菌感染的方法，所述方法包括：向所述受试者施用治疗有效量的细菌跨膜质子动力(PMF)抑制剂，其中所述细菌感染是由包含存留细菌细胞、抗生素抗性细菌细胞或其混合物的细菌细胞群体的结果，其中所述PMF抑制剂是基于咪唑的抗真菌剂，其条件是所述PMF抑制剂不是4-(2-氨基-1H-咪唑-4-基)-N-(十三烷-7-基)丁酰胺或4-(2-氨基-1H-咪唑-4-基)-N-十三烷基丁酰胺。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述细菌细胞群体是革兰氏阴性细菌细胞群体。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述基于咪唑的抗真菌剂选自由以下组成的组：克霉唑、益康唑、舍他康唑、硫康唑、噻康唑、卢立康唑、异康唑、咪康唑、恩康唑、芬替康唑、酮康唑、氯咪巴唑、布康唑、奥昔康唑、氟康唑、伏立康唑、来曲唑、三氯苯达唑、噻苯达唑、芬苯达唑和奥美拉唑或其药学上可接受的盐。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述PMF抑制剂以有效地至少部分抑制所述细菌细胞群体中的PMF的量施用。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述细菌感染是由50％或更多的存留细菌细胞、抗生素抗性细菌细胞或其混合物组成的细菌细胞群体的结果。

6.如权利要求1所述的方法，其中所述细菌感染是由90％或更多的存留细菌细胞、抗生素抗性细菌细胞或其混合物组成的细菌细胞群体的结果。

7.如权利要求1所述的方法，其中所述细菌感染是基本上由选自由大肠杆菌(E.coli)、肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)、鲍曼不动杆菌(A.baumannii)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)和鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)组成的组的抗生素抗性细菌组成的细菌细胞群体的结果。

8.如权利要求1所述的方法，其进一步包括：向所述受试者共同施用治疗有效量的抗细菌剂的步骤。

9.如权利要求8所述的方法，其中所述细菌感染是由50％或更多的存留细菌细胞、抗生素抗性细菌细胞或其混合物组成的细菌细胞群体的结果。

10.如权利要求8所述的方法，其中所述基于咪唑的抗真菌剂选自由以下组成的组：益康唑、舍他康唑、硫康唑、噻康唑、卢立康唑和异康唑或其药学上可接受的盐。

11.如权利要求8所述的方法，其中所述抗细菌剂选自由以下组成的组：β-内酰胺、氨基糖苷、喹诺酮、糖肽、甘氨酰环素、脂肽、大环内酯、氯霉素、二氢叶酸还原酶抑制剂、磺酰胺、利福平、甲硝唑、克林霉素、林可霉素、夫西地酸、呋喃唑酮、异烟肼和吡嗪酰胺。

12.如权利要求8所述的方法，其中所述抗细菌剂选自由以下组成的组：氨苄青霉素、头孢他啶、环丙沙星、庆大霉素、美罗培南和粘菌素或其药学上可接受的盐。

13.如权利要求8所述的方法，其中所述基于咪唑的抗真菌剂选自由以下组成的组：益康唑、舍他康唑、硫康唑、噻康唑、卢立康唑、异康唑和咪康唑或其药学上可接受的盐；并且所述抗细菌剂是粘菌素或其药学上可接受的盐。

14.如权利要求8所述的方法，其中所述基于咪唑的抗真菌剂是益康唑或其药学上可接受的盐；并且所述抗细菌剂选自由以下组成的组：氨苄青霉素、头孢他啶、环丙沙星、庆大霉素、美罗培南和粘菌素或其药学上可接受的盐。

15.如权利要求14所述的方法，其中所述细菌感染是由90％或更多的存留细菌细胞、抗生素抗性细菌细胞或其混合物组成的细菌细胞群体的结果。

16.一种使存留细菌细胞或抗生素抗性细菌细胞对抗细菌剂重新敏感的方法，所述方法包括：使所述存留细菌细胞或所述抗生素抗性细菌细胞与PMF抑制剂接触，其中所述PMF抑制剂是基于咪唑的抗真菌剂，其条件是所述PMF抑制剂不是4-(2-氨基-1H-咪唑-4-基)-N-(十三烷-7-基)丁酰胺或4-(2-氨基-1H-咪唑-4-基)-N-十三烷基丁酰胺。

17.如权利要求16所述的方法，其中所述存留细菌细胞或所述抗生素抗性细菌细胞是革兰氏阴性存留细菌细胞或革兰氏阴性抗生素抗性细菌细胞。

18.如权利要求16所述的方法，其中所述基于咪唑的抗真菌剂选自由以下组成的组：克霉唑、益康唑、舍他康唑、硫康唑、噻康唑、卢立康唑、异康唑、咪康唑、恩康唑、芬替康唑、酮康唑、氯咪巴唑、布康唑、奥昔康唑、氟康唑、伏立康唑、来曲唑、三氯苯达唑、噻苯达唑、芬苯达唑和奥美拉唑或其药学上可接受的盐。

19.如权利要求16所述的方法，其中所述基于咪唑的抗真菌剂是益康唑或其药学上可接受的盐。

20.如权利要求16所述的方法，其中所述存留细菌细胞或所述抗生素抗性细菌细胞选自由以下组成的组：大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门氏菌。