CN117940576A - 从患者样品中分离或分析细菌性病原体的技术 - Google Patents
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Abstract
本公开的主题整体涉及用于从包含红细胞的生物样品中分离细菌细胞的技术。在沉降期间使用聚集剂和抗凝剂允许该样品中的细菌性病原体与红细胞分离。能够将富集任何细菌性病原体的所分离的沉降层离心并再悬浮以浓缩该细菌用于另外的分析，诸如细菌鉴定和/或抗生素敏感性测试。
Description
政府支持声明
本发明是根据由美国陆军/ACC-NJ授予的协议W15QKN-14-9-1001在美国政府支持下完成的。政府拥有发明的某些权利。
背景技术
本文公开的主题涉及从全血中分离和富集病原体的技术。具体地，所公开的技术涉及改进从沉降工作流程中回收病原体并且可以与随后的鉴定和/或敏感性分析结合使用的方法、系统和组合物。
可能导致败血症、休克和其他危及生命的并发症的血流感染是主要的全球医疗保健挑战。血源性病原体的及时鉴定是这些感染管理中公认的临床瓶颈。例如，从患者抽取小瓶血液并培养长达五天，以检测病原体的存在。如果培养物是阳性的，则将来自培养物的样品用于病原体的革兰氏染色和分子分析(例如，聚合酶链反应)以鉴定物种。因此，培养和鉴定患者样品中存在的病原体可能需要几天时间。细菌感染的确认和细菌种类的鉴定可以促进基于抗微生物敏感性测试的病原体特异性治疗的选择。由于从血液中获得微生物鉴定和抗微生物敏感性测试的这些耗时过程，在获得精确诊断之前通常给患者开具广谱抗生素处方。然而，与广谱抗生素相比，精确的抗生素治疗更有效并且可以最小化对共生微生物群的破坏，从而改善了临床结果。不幸的是，微生物诊断的长期延迟促进了抗生素的非靶向使用，这可能导致患者治疗效果不佳，并且还可能促进抗生素抗性病原体的出现。
发明内容
下文概述了与最初要求保护的主题范围相称的某些实施方案。这些实施方案并非旨在限制要求保护的主题的范围，而是这些实施方案仅旨在提供可能的实施方案的简要概述。实际上，本发明可包括多种形式，这些形式可类似于或不同于下文所述的实施方案。
在一个实施方案中，提供了一种从包含红细胞的生物样品中分离细菌细胞的方法。所述方法包括以下步骤：使所述生物样品与聚集剂和抗凝剂接触，以在样品处理容器中形成具有第一体积的沉降溶液；允许发生重力沉降，使得在所述样品处理容器中形成顶层和底层，其中所述底层相对于所述顶层富集红细胞；将所述顶层与所述底层分离；离心所分离的顶层以形成沉淀；从上清液中分离沉淀；以及将所分离的沉淀重悬浮于第二体积的悬浮溶液中以形成样品溶液，所述第二体积小于所述第一体积。
在一个实施方案中，提供了一种用于沉降生物样品中的细胞的试剂盒。所述试剂盒包括聚集剂，所述聚集剂具有至少100kDa的分子量；以及抗凝剂。
在一个实施方案中，提供了一种用于分析全血的方法。所述方法包括以下步骤：在包括生物样品、聚集剂和抗凝剂的样品处理容器中经由重力沉降来形成顶层和底层，其中所述底层相对于所述顶层富集红细胞；离心所述顶层以形成沉淀；将所分离的沉淀重悬浮于第二体积的悬浮溶液中以形成样品溶液；以及分析所述样品溶液中细菌的存在。
附图说明
当参考附图阅读以下详细描述时，将更好地理解本发明的这些和其他特征、方面和优点，附图中相同的符号在整个附图中表示相同的部分，其中：
图1A是根据本公开的实施方案的用于血流感染的单细胞抗微生物敏感性测试的使用葡聚糖沉降和离心的样品制备工作流程的示意图；
图1B是根据本公开的实施方案的用于单细胞抗微生物敏感性测试的微流体装置的示意图和在微通道中捕获的细菌的(底部)放大视图；
图1C显示了在单细胞微流体装置的微型通道中捕获的细菌，用于显现细菌的存在及其对抗菌素的反应，并显示了20μm的比例尺；
图1D显示了在微流体通道中捕获的各个细菌的(顶部和底部)图像，并且显示了5μm的比例尺；
图2A是根据本公开的实施方案的用于去除血细胞的葡聚糖沉降方案的示意图；
图2B显示了血细胞去除效率的结果，显示了细胞计数随血浆中的沉降时间呈指数下降，并且插图显示了以半对数标度绘制的数据以说明若干数量级的细胞去除；
图2C显示了葡聚糖沉降15分钟的细菌回收率(总细菌的一部分)；
图2D显示了葡聚糖沉降30分钟的细菌回收率(总细菌的一部分)；
图2E显示了通过以200g轻柔旋转20分钟的细菌回收率和样品体积减少；
图3A显示了葡聚糖沉降后大肠杆菌(E.coli)、粪肠球菌(E.faecalis)、肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)的回收率；
图3B显示用于表征金黄色葡萄球菌的回收率的血浆和葡聚糖溶液的对照实验；
图3C显示了在葡聚糖温育30分钟后，使用凝血酶抑制剂阿加曲班(argatroban)的金黄色葡萄球菌的回收率；
图3D显示了在葡聚糖温育30分钟后，使用凝血酶抑制剂阿加曲班的大肠杆菌的回收率；
图4A显示了肺炎克雷伯氏菌在缓冲液、10％血液和葡聚糖分离的血浆中的表型生长；
图4B显示了屎肠球菌在缓冲液、10％血液和葡聚糖分离的血浆中的表型生长；
图5显示了分离的大肠杆菌在具有不同浓度的氨苄青霉素的单细胞微通道中的生长；
图6是根据本公开的实施方案的从具有红细胞的生物样品中分离细菌的方法的流程图；并且
图7是根据本公开的实施方案的用于沉降生物样品中的细胞的试剂盒的示意图。
具体实施方式
血流感染是世界范围内发病率和死亡率的重要原因。快速开始有效抗生素治疗对于血流感染患者是至关重要的。然而，血源性病原体的诊断在很大程度上因血液的基质效应和冗长的血管培养程序而复杂化。由于低细菌负荷，单细胞分析对于无需血管培养步骤的血流感染的诊断特别有吸引力。然而，由于血液的低细菌浓度和复杂的基质效应，血流感染诊断仍然具有挑战性。已经开发了基于离心和过滤的样品制备程序以从全血中分离细菌。然而，与这些技术相关的困难的手动步骤和病原体物种特异性挑战(诸如过滤器相互作用或病原体-宿主细胞相互作用)通常使得这些技术的临床转化不切实际。
具体地，单细胞分析平台非常有希望提供具有快速周转时间的高分辨率诊断。例如，具有机器学习算法的自动化单细胞形态分析平台在非传统医疗环境中提供具有成本效益且准确的抗微生物敏感性数据。具有高分辨率熔解曲线分析的纳米阵列数字聚合酶链反应能够进行快速广泛的细菌鉴定和表型抗微生物敏感性测试。此外，单细胞微流体装置与分子生物传感器一起允许病原体的快速分类、多微生物样品的检测、细菌种类的鉴定以及单细胞抗微生物敏感性测试。这些平台已被证明可用于快速诊断各种常见感染，诸如尿道感染和创伤感染。因此，绕过冗长的血液培养步骤的有效样品制备程序对于血流感染的单细胞微生物分析是非常受欢迎的。
本文提供了用于从全血中快速分离和富集病原体如细菌或其他微生物病原体(例如，真菌、寄生虫)的技术。该技术可与单细胞微生物分析结合使用。在一个实施方案中，葡聚糖沉降步骤用于降低全血样品中的血细胞的浓度。在一个实施方案中，掺入基质破坏剂如抗凝剂可进一步改善沉降。沉降后回收的细菌中的红细胞去除促进了下游基于离心的富集步骤，达到脓毒症相关细菌的浓度。所公开的技术与常见的抗生素抗性细菌相容，并且不影响在敏感性测试(例如，使用微流体装置的快速单细胞测试)中使用的最小抑制浓度。
所公开的技术可以与用于血流感染诊断的无培养工作流程(诸如用于从全血中分离普通抗生素抗性细菌的工作流程)结合使用。工作流程涉及相对简单的设备和程序，这些设备和程序可能在非传统环境中实施，例如在现场。如果资源(例如，电力)有限，则可考虑便携式和手动离心机以进一步简化系统要求，因为沉降步骤仅需要单个减容离心步骤。此外，该技术允许使用1)单个减容沉降步骤2)以相对较低的速度进行有效沉降，使得相对于使用较高旋转速度和/或多个离心步骤的工作流程，回收的细菌细胞的裂解减少。分离和富集步骤可以在大约30分钟内完成，这与其他诊断工作流程类似或比其他诊断工作流程更快。使用能够进行单细胞分析的微流体装置，诸如在WO 2020/014537中公开的微流体装置(该专利以引用的方式并入本文用于所有目的)，通过显微镜检查可以在快至5分钟内进行病原体分类，并且可以在与病原体的倍增时间相似的时间尺度内获得抗生素敏感性结果。微流体装置的使用还使液体培养基体积标准化，这使种菌效应的影响最小化，并且通过促进气体交换来促进细菌快速生长。重要的是，该工作流程保持了细菌的生存能力并与其他单细胞微生物分析平台兼容，包括基于机器学习的形态分析仪和微流体分子测定。
图1A是用于血流感染的单细胞抗微生物敏感性测试的使用葡聚糖沉降和离心的样品制备工作流程的示意图。图1A的工作流程用于获得本文所公开的实施例的结果。工作流程开始于用于红细胞(红血球)去除的葡聚糖沉降，其已经应用于免疫分析，诸如嗜中性粒细胞纯化，以及其他生物医学应用。然后通过离心来富集葡聚糖分离的细菌，与目前采用的复杂选择性裂解或梯度离心技术相比，提供了用于红细胞去除的有效方法。将富集的样品加载到微流体装置中，用于确定样品中细菌的存在和表型单细胞抗微生物敏感性测试。
更具体地，在图1A所示的工作流程中，在容器10中提供包括红细胞的生物样品12。将葡聚糖溶液和聚茴香脑磺酸钠与全血混合以形成沉降溶液14。然后，在一个实施方案中，使混合物或溶液14沉降并沉降少于30分钟以去除红细胞。形成两层，顶层16(例如，上清液相)和底层18(例如，沉降相)。顶层16去除了红细胞，而底层18包括更多的血细胞。然后小心地吸出血浆(顶层16或溶液的澄清部分)以回收具有细菌性病原体的部分。其次，通过离心进一步富集血浆。富集步骤产生具有减少的样品体积的样品24，并增加用于微流体单细胞分析的细菌的浓度。
在通过沉降到底层18中的简单步骤将大部分红细胞去除的情况下，离心成为实现体积减小的一步过程，而不是如果使用常见的选择性裂解或梯度离心法进行细菌选择所需要的多步过程。去除上清液后，将沉淀重悬浮于例如50微升MH液体培养基中。在所公开的结果中，除非另有说明，否则所有试剂可购自Sigma(St.Louis,MO)。在斯坦福大学机构审查委员会批准的方案下，从患者尿液样品中分离出病原性细菌分离物(大肠杆菌(Escherichiacoli)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、粪肠球菌(Enterococcus faecails)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus))。Veterans Affairs Palo Alto Health CareSystem的临床微生物学验室先前确定了病原性大肠杆菌的抗微生物耐药性特征。屎肠球菌获自ATCC(ATCC 35667)。
为了从全血中分离并富集细菌，首先使用0.2pm孔径的PES膜过滤葡聚糖和聚茴香脑磺酸钠(SPS)溶液。将细菌样品稀释至2×l05cfu/mL，并将适当体积掺入血液溶中液以控制浓度(10cfu/ml-100cfu/ml)。混合物包含10mL全血、12mL 2.25％500kDa葡聚糖溶液(Spectrum DI004)和1.98mL1％SPS溶液。使混合物在室温处沉降，直到形成澄清的血浆样层(以下称为血浆层)(约15min-30min)。去除该顶部血浆层并用移液管混合以确保细菌的均匀分布。将血浆层分离到4个试管中，每个试管含有约1mL的体积。将每个试管以2000g离心5min(Denville 260D无刷离心机)。去除上层或上清液，并将沉降步骤中未去除的含有细菌和任何人细胞的沉淀重悬浮于0.1mL Mueller-Hinton(MH)液体培养基中。通过平板计数法确定细菌计数，并通过回收的细菌的部分相对于掺入样品中的细菌的量来估算回收率。
在所公开的实施方案中，样品24被加载到具有与细菌的特征长度(例如，宽度)相容的横截面尺寸的微通道中，如图1B所示。通道用作过滤器以分离样品基质(细胞碎片或其他细胞组分)并使得能够显现和计数样品中的细菌，如图1C和图1D所示。微流体通道还捕获细菌以便于监测细菌对抗生素的反应(即，表型抗微生物敏感性测试)。与在临床实验室中使用基于常规血管培养的技术的5-7天相比，血液对抗微生物敏感性测试工作流程可以在少于2小时内完成。因此，所公开的技术允许更快且有效地分析全血样品中的细菌性病原体。
如本文所公开的，结合微流体装置来分析分离的血浆中的细菌。微通道有助于单个细菌的显现，确定细菌的存在，并进行表型抗微生物敏感性测试。然而，直接血液分析的挑战是低细菌浓度(100cfu/mL-101cfu/mL)。由于微流体抗微生物敏感性测试装置仅处理5μL-50μL的流体，因此有效细菌计数可能小于1cfu。因此，结合离心步骤以通过体积减少来富集样品。基于平板计数法来确定离心步骤的回收率超过80％。然后将富集的样品直接加载到用于细菌捕获的微流体装置的入口中。由于微通道高度(1.3μm)与细菌的尺寸兼容，较大的物体(例如血细胞)被通道有效地滤出。然而，在没有葡聚糖沉降步骤的情况下，由于血细胞堵塞通道，因此通过微通道进行过滤是不可能的。通过显微镜观察细菌的运动性和生长来确定样品中活菌的存在。如图1C和图1D所示，在低至10cfu/ml的血液样品中证明了细菌的捕获。由于血液通常是无菌的，因此细菌的存在可以提供细菌感染的直接指示。在微通道装置内使用多个通道高度可结合所公开的技术用于细菌的基于尺寸的分类。
通过软光刻技术制造了用于单细胞抗微生物敏感性测试的微流体装置。微通道母模是通过硅晶片的光刻图案化和反应离子蚀刻来制造的。然后通过PDMS模塑在母模上制造微通道层。将PDMS预聚物和交联剂以10:1比率混合。将混合物倒在母模上并在65℃处温育至少3小时。通过将PDMS层与载玻片粘结来制造单细胞抗微生物敏感性测试装置。通过用活检打孔器对PDMS层进行打孔来形成入口和出口储器。
为了进行微流体单细胞抗微生物敏感性测试实验，将浓度为0μg/mL、2μg/mL、4μg/mL和8μg/mL的氨苄青霉素添加到富集的样品中。通过毛细管力将每种相应的溶液加载到微流体装置中。然后将装置安装在具有显微镜加热台的落射荧光显微镜(Leica DMI 4000B，物镜20X或40X)上。检查细菌的存在，并连续监测细菌生长。
用Excel进行数据分析。使用单因素方差分析和Tukey事后检验对数据进行分析。数据表示平均值±s.e.m。双侧p值<0.05被认为是统计学上显著的。
图1A的葡聚糖沉降步骤和使用葡聚糖沉降方案去除图2A的血细胞的红细胞去除效率使用大肠杆菌(E.coh.)进行评估并且结果如图2B-E所示。通过用血细胞计数器进行细胞计数来测量红细胞的浓度作为沉降时间的函数。如图2B所示，红细胞的初始浓度为大约109个细胞/毫升。在第一个30分钟内，红细胞计数下降至105个细胞/毫升-106个细胞/毫升。之后，血细胞计数以更慢的速率进一步降低(图2B插图)。相比之下，沉降15分钟至30分钟后，溶液的澄清部分保留了大部分(>50％)的掺入细菌量(图2C-D)。结果，少于30分钟的沉降时间与生物样品中的大部分细菌在血浆或顶层16中的保留相关。血浆中细菌的回收率以体积计为约50％，血液中细菌的有效起始浓度(每ml)与初始浓度相似，同时去除了大部分红细胞。与细菌的直接离心相比，这是显著的增强。人红细胞和大肠杆菌的比重都为约1.1g/ml。由于它们在比重上的相似性，直接离心导致细菌大量损失到沉降物部分中(图2E)。相比之下，葡聚糖沉降步骤允许红细胞的去除，同时保持样品中细菌的有效浓度。数据表示平均值±s.e.m(n＝3)。
为了评估葡聚糖沉降步骤用于血流感染诊断的适用性，在掺杂有几种临床细菌分离物的人全血样品中进行将该程序。具体地，用大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、粪肠球菌和金黄色葡萄球菌测试该程序(图3A)。这些细菌涵盖革兰氏阴性菌种和革兰氏阳性菌种，并且代表了临床上重要的引起血流感染和其他细菌感染的多重耐药性病原体。在该实验中，大肠杆菌、粪肠球菌和肺炎克雷伯氏菌根据预期以50％-60％的效率回收。然而，金黄色葡萄球菌的回收导致较低的回收效率和大的批次间差异。回收率在10％和30％之间，而其他细菌的回收率超过50％。
为了探索造成金黄色葡萄球菌的较低回收率的机制，在分离的血浆(即，去除大部分血细胞)和缓冲液(即，没有血细胞和血蛋白)中重复沉降步骤。在两种条件下，血浆和沉降物部分具有大致相等的细菌浓度(图3B)。因此，回收率的降低可能涉及血细胞和血浆蛋白(例如，凝血因子)两者。唯一已知的是，金黄色葡萄球菌通过与血液中的宿主蛋白相互作用的细菌聚集因子的作用而在血液和血浆中聚集。20-21凝聚的金黄色葡萄球菌可能与葡聚糖中的红细胞钱串被动地缠结，而这在去除RBC的血浆中不会成为问题(如图3B中所测试)。
为了检验分离效率降低是金黄色葡萄球菌介导的凝结作用的结果的假设，在葡聚糖沉降过程期间向混合物中提供抗凝剂阿加曲班。结果表明，使用0.1μM阿加曲班使回收率恢复至超过50％(图3C)。较高的阿加曲班浓度不能进一步改善回收率，这表明少量的抗凝剂足以消除金黄色葡萄球菌介导的凝结作用。该实验也在大肠杆菌中进行，以验证抗凝剂处理不影响其他细菌中的葡聚糖沉降效率。这些结果表明葡聚糖沉降步骤适用于分离常见的细菌性病原体，并且将阿加曲班添加到沉降管中使得能够处理已知与血细胞和凝血级联相互作用的病原体。图3A-D中的数据表示平均值±s.e.m(n＝3)。使用Tukey HSD检验的单因素ANOVA。*P<0.05，NS＝不显著。
在实施方案中，所公开的技术允许直接的抗微生物敏感性测试，而无需时间限制的血液培养步骤。为了评估葡聚糖和剩余的血液组分是否会影响抗微生物敏感性测试结果，仅使用液体培养基、含10％血液的液体培养基和葡聚糖分离的血浆与MH液体培养基以1:1比率进行抗微生物敏感性测试。仅有液体培养基的情况代表了标准的抗微生物敏感性测试条件。包括含有10％血液的液体培养基，以评估血液组分(细胞和蛋白质)对最小抑制浓度(MIC)的影响。以1:1比率与MH液体培养基混合的分离的血浆测试了葡聚糖的作用，并且代表所提出的工作流程中的抗微生物敏感性测试条件。实验在肺炎克雷伯氏菌(图4A)和屎肠球菌(图4B)中进行。结果表明，MIC不受包含10％血液或葡聚糖分离方案的影响。例如，屎肠球菌在所有三种条件下都具有在4μg/mL和8μg/mL之间的MIC。这些结果进一步支持使用所公开的工作流程对全血样品进行直接抗微生物敏感性测试。
所公开的工作流程可用于使用微流体装置的抗微生物敏感性测试。微流体装置将细菌捕获在一维通道中，并允许细菌沿通道生长以用于表型抗微生物敏感性测试。作为示范，测试大肠杆菌临床分离株对氨苄青霉素的抗微生物敏感性(图5)。将样品分离到四个试管中并与不同浓度的抗生素混合。细菌菌株的MIC在2μg/ml和4μg/ml之间。仅当氨苄青霉素的浓度低于2μg/mL时，才能观察到细菌的生长。在较高浓度(例如，8μg/mL)的溶菌氨苄青霉素下，一些细菌在实验期间被溶解。根据临床和实验室标准协会(CLSI)指南，MIC值低于肠杆菌的敏感折点。结果与临床微生物学实验室报告完全一致。数据展示了从全血到AST快速诊断血流感染的工作流程。
从全血中分离红细胞(RBC)可以在分析或治疗性使用丰度较低的细胞(诸如白细胞或干细胞)之前进行。虽然某些技术使用葡聚糖沉降来分离血液中存在的细胞，诸如红细胞，但是如本文所公开的，在细菌沉降步骤中使用葡聚糖来分离全血中的细菌是新颖的。此外，使用抗凝剂(例如阿加曲班)改善了与血细胞相互作用的细菌的细菌分离，否则这些细菌可能保留在底层18中(参见图1A)。因此，所公开的技术更广泛地适用于分离全血样品中未知类型的病原体。
在所公开的技术中，通常在沉降(例如，重力沉降)期间形成两层，并且顶层的去除和简单的一步离心形成保留原始全血样品中的任何细菌的离心沉淀。在实施方案中，沉降步骤中的葡聚糖可以与全血样品以1:1体积比提供，或者在约0.8:1(全血:葡聚糖溶液)至约1:1.5(全血:葡聚糖溶液)的范围内提供。在一个实施方案中，与全血样品接触的葡聚糖溶液相对于全血样品的体积具有更大的体积。在一个实施方案中，葡聚糖可具有至少75kDa的尺寸。在一个具体实施方案中，葡聚糖具有100kDa至600kDa或200kDa至500kDa的分子量。葡聚糖溶液可以是在1％至10％(重量比体积)范围内的葡聚糖。
虽然在葡聚糖沉降的背景下讨论某些公开的实施方案，但是除了葡聚糖之外或代替葡聚糖，在沉降步骤中可以使用其他聚集剂。其他聚集剂可以使用浓度配制，并且可以具有与关于葡聚糖所公开的那些相似的分子量特征。聚集剂的示例包括但不限于高分子量聚合分子，诸如某些蛋白质，如纤维蛋白原或γ球蛋白；明胶和某些多糖，如葡聚糖、羟乙基淀粉、五聚淀粉和聚乙二醇(PEG)。聚集剂与生物样品混合并反应以促进重力沉降，这在功能上不同于本领域已知的其他聚合物添加剂，诸如触变凝胶和其他固体，这些聚合物添加剂在离心过程中促进差异沉降。
此外，某些公开的实施方案结合抗凝剂如阿加曲班进行讨论。附加地或另选地，其他凝血酶抑制剂如抗凝血酶、水蛭素、达比加群(dabigatran)、来匹卢定(lepirudin)、地西卢定(desirudin)和比伐卢定(bivalirudin)可用作沉降溶液、试剂盒或技术的一部分。此外，可以使用其他抗凝剂，诸如华法林(warfarin)、肝素、醋硝香豆素、苯丙香豆素、黑毛桩菇霉素(atromentin)和苯茚酮。在一个实施方案中，抗凝剂是聚茴香脑磺酸钠(SPS)。因此，抗凝剂可以是在本文提供的聚集剂(例如，葡聚糖)的存在下使用的单一抗凝剂或抗凝剂混合物(例如，SPS和阿加曲班)。
图6是从包含红细胞的生物样品中分离细菌细胞的方法的流程图100。在步骤102，使生物样品与聚集剂和抗凝剂接触以形成沉降溶液。生物样品可以是来自针对血流感染进行测试的受试者的血液样品，诸如全血样品。生物样品可以是未知感染状态的样品，并且可以如本文所公开来确定感染状态(例如，存在或不存在细菌)。在一个实施方案中，向全血样品提供缓冲液、添加剂或其他添加物以保持样品完整性。可以将聚集剂和抗凝剂添加到生物样品中，例如与生物样品混合。
在步骤104，发生沉降溶液的重力沉降，使得在样品处理容器中形成顶层和底层，其中底层相对于顶层富集红细胞。将红细胞沉降到底层中，而生物样品中存在的任何病原体保留在顶层中。沉降可以在15分钟或更短时间内或30分钟或更短时间内发生。在一个实施方案中，沉降在60分钟或更短时间内发生。
在步骤106，将顶层与底层分离。例如，可以将顶层移入单独的容器中。将分离的顶层在步骤108离心以形成沉淀。离心可以是单步骤离心。在一个实施方案中，离心以10,000g或更低的速度进行15分钟或更短时间。在步骤110，从沉淀中去除上清液，并在步骤112，将沉淀重悬浮于所需体积的可疑溶液中。在一个实施方案中，可以在准备用于下游步骤(例如，重悬浮、加载到分析装置中)之前洗涤沉淀。所需体积可以小于生物样品的起始体积和/或沉降溶液的体积。一旦重悬浮，可以将样品溶液提供至如本文所公开的下游分析。如本文所提供的，离心步骤在生物样品的重力沉降之后进行，这不同于由离心力引起的沉降步骤，例如，其中沉降和离心同时发生。
图7是用于沉降细胞以例如分离样品中存在的细菌的试剂盒200的示例。如本文所提及的试剂盒可包括给定测定或测试所必需的一种或多种反应物、使用试剂盒中存在的反应物的一组说明、保持反应条件所必需的任何缓冲液和其他任选材料，诸如样品处理容器。试剂盒可以包括容器202，该容器包括反应溶液或混合物204。在一个实施方案中，反应溶液204包括用于与包括红细胞的生物样品212混合的适当浓度的聚集剂，诸如葡聚糖。在实施方案中，反应溶液204可包括与聚集剂预混合的抗凝剂。然而，在其他实施方案中，试剂盒200可包括在单独容器中的聚集剂和抗凝剂，所述聚集剂和抗凝剂混合在一起，然后添加到生物样品212中，或者单独添加到样品处理容器中。在例示的实施方案中，将反应溶液204添加到已经容纳生物样品的容器210中。然而，在其他实施方案中，样品处理容器可以是容纳聚集剂和抗凝剂中的一者或两者的容器202，或者可以是试剂盒200的单独的专用容器。
所公开的技术包括以临床相关浓度(10cfu/mL)进行单细胞抗微生物敏感性测试的工作流程。然而，败血症诊断可以低至1cfu/mL。值得注意的是，将分离的样品分离到多个试管中以用于测试各种抗生素条件。可以通过进一步优化工作流程来增强工作流程的检测极限。例如，可以增加初始血液体积以增加样品中的细菌计数。如果必要，可以在工作流程中添加短的预培养步骤(例如，2小时)以增加初始细菌计数。还可以通过结合其他微流体模块(例如，电动捕获和富集)来提高细菌加载的效率。所公开的技术可用于从具有不同临床状况的患者中分离细菌性病原体血液样品，所述患者在其全血样品中具有不同的细胞分布。例如，脓毒症诱导的效应可能导致白细胞计数升高。
本发明的技术效应包括改进从全血样品中分离和/或富集细菌以用于病原体鉴定和抗微生物敏感性测试。特别地，葡聚糖沉降步骤在20分钟-30分钟内将血细胞的浓度降低四个数量级，同时保持样品中细菌的有效浓度。在脓毒症相关细菌浓度下，红细胞去除促进了下游基于离心的富集步骤。为了避免降低总回收效率的金黄色葡萄球菌介导的凝结，可以在葡聚糖沉降过程期间将血液基质效应破坏剂或抗凝剂(例如阿加曲班)掺入混合物中。
该书面描述使用示例来公开本发明，包括最佳模式，并且还使本领域技术人员能够实践本发明，包括制造和使用任何设备或系统以及执行任何包含的方法。本发明的专利范围由权利要求书限定，并且可包括本领域技术人员想到的其他示例。如果此类其他示例具有与权利要求书的字面语言没有区别的结构元素，或者如果它们包括与权利要求书的字面语言具有微小差别的等效结构元素，则此类其他示例旨在落入权利要求书的范围内。
Claims (21)
1.一种从包含红细胞的生物样品中分离细菌细胞的方法，所述方法包括：
使所述生物样品与聚集剂和抗凝剂接触，以在样品处理容器中形成具有第一体积的沉降溶液；
允许发生重力沉降，使得在所述样品处理容器中形成顶层和底层，其中所述底层相对于所述顶层富集红细胞；
将所述顶层与所述底层分离；
离心所分离的顶层以形成沉淀；
从上清液中分离沉淀；以及
将所分离的沉淀重悬浮于第二体积的悬浮溶液中以形成样品溶液，所述第二体积小于所述第一体积。
2.根据权利要求1所述的方法，所述方法包括将所述样品溶液加载在微流体分析装置中。
3.根据权利要求1所述的方法，所述方法包括使用所述微流体分析装置以进行抗微生物敏感性测试。
4.根据权利要求1所述的方法，所述方法包括使用所述微流体分析装置以鉴定所述样品溶液中的一种或多种病原体。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述聚集剂包含高分子量聚合物。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述聚集剂在所述溶液中的重量体积比为1％-10％。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述接触包括使所述生物样品同时与所述抗凝剂和所述聚集剂接触。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗凝剂包括阿加曲班，并且所述聚集剂包括具有至少100kDa的分子量的葡聚糖。
9.根据权利要求1所述的方法，所述方法包括在将所述样品溶液加载到所述微流体分析装置中之前洗涤所分离的沉淀。
10.一种用以沉降生物样品中的细胞的试剂盒，所述试剂盒包括：
聚集剂，所述聚集剂具有至少100kDa的分子量；以及
抗凝剂。
11.根据权利要求10所述的试剂盒，其中所述聚集剂在溶液中。
12.根据权利要求11所述的试剂盒，其中所述聚集剂在所述溶液中的重量体积比为1％至8％。
13.根据权利要求11所述的试剂盒，所述试剂盒包括所述生物样品，其中所述生物样品为全血，并且其中所述全血的体积和所述溶液的体积具有在0.8:1至1:1.5的范围内的比率。
14.根据权利要求11所述的试剂盒，其中所述抗凝剂在所述溶液中。
15.根据权利要求10所述的试剂盒，其中所述抗凝剂是凝血酶抑制剂。
16.根据权利要求10所述的试剂盒，其中所述聚集剂是羟乙基淀粉或明胶。
17.根据权利要求10所述的试剂盒，其中所述抗凝剂是阿加曲班。
18.根据权利要求10所述的试剂盒，其中所述聚集剂是葡聚糖。
19.根据权利要求10所述的试剂盒，所述试剂盒包括样品处理容器，在所述样品处理容器中设置有所述聚集剂和所述抗凝剂。
20.一种用以分析全血的方法，所述方法包括：
在包括生物样品、聚集剂和抗凝剂的样品处理容器中经由重力沉降来形成顶层和底层，其中所述底层相对于所述顶层富集红细胞；
离心所述顶层以形成沉淀；
将所分离的沉淀重悬浮于第二体积的悬浮溶液中以形成样品溶液；以及
针对细菌的存在对所述样品溶液进行分析。
21.根据权利要求20所述的方法，其中在所述分析之前不培养所述样品溶液。
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