CN117940504A - 含有三唑的聚合物及其使用方法 - Google Patents

含有三唑的聚合物及其使用方法 Download PDF

Info

Publication number
CN117940504A
CN117940504A CN202280054901.1A CN202280054901A CN117940504A CN 117940504 A CN117940504 A CN 117940504A CN 202280054901 A CN202280054901 A CN 202280054901A CN 117940504 A CN117940504 A CN 117940504A
Authority
CN
China
Prior art keywords
compound
substituted
cell
medical device
capsules
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202280054901.1A
Other languages
English (en)
Inventor
大卫·张
宋萍
奥米德·维塞
西亚瓦什·帕克希登
苏迪普·慕克吉
玛丽亚·伊莎贝尔·罗科
B·金
迈克尔·大卫·德费特
成昱璇
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
William Marsh Rice University
Original Assignee
William Marsh Rice University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by William Marsh Rice University filed Critical William Marsh Rice University
Publication of CN117940504A publication Critical patent/CN117940504A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L5/00—Compositions of polysaccharides or of their derivatives not provided for in groups C08L1/00 or C08L3/00
    • C08L5/04—Alginic acid; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • C08B37/0084—Guluromannuronans, e.g. alginic acid, i.e. D-mannuronic acid and D-guluronic acid units linked with alternating alpha- and beta-1,4-glycosidic bonds; Derivatives thereof, e.g. alginates

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)

Abstract

本文公开了A‑L‑R1(I)的化合物，其中这些变量在本文中定义，以及包含所述化合物的医疗装置。本公开内容还提供了包含本文公开的化合物或医疗装置的药物组合物。此外，本公开内容提供了使用本文公开的化合物、医疗装置或药物组合物的治疗方法。

Description

含有三唑的聚合物及其使用方法
对相关申请的交叉参考
本申请要求2021年6月14日提交的美国临时申请号63/210,377的优先权权益，其特此通过引用整体并入。
关于联邦资助的研究的声明
本发明在政府支持下完成，国立卫生研究院授予的批准编号R01DK120459。政府对本发明享有一定的权利。
发明背景
I.发明领域
本发明总体上涉及生物学、化学和医学的领域。更具体地，它涉及用于治疗和预防疾病和障碍(诸如与纤维化相关的那些)的化合物、组合物和方法。
II.相关技术的描述
糖尿病、血友病、粘多糖贮积症和许多其它疾病可以通过蛋白药物(诸如胰岛素或单克隆抗体)或最近出现的基于细胞的疗法来控制或抑制。但是，蛋白药物不可口服施用，并且必须静脉内(IV)注射。蛋白药物快速地降解，从而限制治疗效果并需要定期静脉内注射以在体内维持治疗水平。定期静脉内注射的负担是患者生活质量的主要限制，并导致高昂的卫生保健费用。
植入人体的细胞原则上可以充当“活工厂”并不断生产蛋白药物。但是，患者的免疫系统会破坏这些外来的植入细胞，因此需要某种将细胞封装在非免疫原性材料中的机制以实现长期细胞治疗。细胞治疗领域长期以来一直受到限制，因为用于封装细胞的生物材料会诱导异物应答，即纤维化。这种纤维化包裹着植入物，从而限制氧气和营养物质转移到被封装的细胞中，并导致细胞死亡。因此，开发一种可以阻止宿主免疫识别并延迟纤维化的充分生物相容的移植装置或免疫保护涂层是一种迫切的医疗需求。
先前的研究证实了使用高通量水凝胶库来筛选共价修饰的含有三唑的海藻酸盐类似物的库以鉴定可有效预防啮齿动物以及非人灵长类动物模型中的纤维化的先导生物材料(Vegas等人,2016)。筛选了总共774种组合合成的化学物质，导致鉴定出三种具有相似分子结构的含有三唑的先导抗纤维化小分子化合物(Vegas等人,2016)。为了对这样的海藻酸盐封装材料进行体内评价，在每只小鼠中使用了八个不同的皮下植入部位。但是，需要强调的是，新型生物材料的高通量筛选涉及活体(小鼠/非人灵长类动物：NHP)的严格使用，这会显著增加时间、成本并损害大量啮齿类动物/非人灵长类动物。但是，试验的样品的数目非常小，并且没有开发出一致的高通量筛选方法来在单个啮齿动物/NHP中筛选大量免疫保护性生物材料，这将帮助减少实验活体的数目。因此，需要另外的三唑化合物以及高通量筛选方法来鉴定免疫保护性生物材料。
本发明的开发部分地由德克萨斯州癌症预防和研究所(Cancer Prevention andResearch Institute of Texas)资助，批准编号RR160047。
发明内容
本公开内容提供了具有抗纤维化性能的含有三唑的化合物、药物组合物、其制备方法及其使用方法。
在一个方面，提供了下式的化合物或其药学上可接受的盐：
A-L-R1(I)，
其中：
A是聚合物；
L是下式的接头：
NRaX1(CH2CH2O)o
其中：
Ra是氢、烷基(C≤6)或被取代的烷基(C≤6)；
o是2、3、4或5；且
X1是烷二基(C≤8)或被取代的烷二基(C≤8)；
或下式的接头：
NRb(CH2)pX2
其中：
Rb是氢、烷基(C≤6)或被取代的烷基(C≤6)；
p是1、2或3；且
X2是芳烃二基(C≤12)或被取代的芳烃二基(C≤12)；
R1是环烷基(C≤12)；卤代芳基(C≤12)；含有S的杂芳基(C≤12)；被取代的含有S的杂芳基(C≤12)；烷基(C≤6)、卤代烷基(C≤6)、烯基(C≤6)或炔基(C≤6)取代的芳基(C≤12)；芳烷基(C≤12)；被取代的芳烷基(C≤12)；杂环烷基(C≤12)；被取代的杂环烷基(C≤12)；2-吡啶基；3-氨基苯基；4-烷氧基(C≤6)取代的芳基(C≤12)；或下式的基团：
X3OR2
其中：
X3是烷二基(C≤8)或被取代的烷二基(C≤8)；
R2是芳基(C≤12)或被取代的芳基(C≤12)。
在某些实施方案中，所述化合物进一步被定义为：
A-L-R1(I)
其中：
A是聚合物
L是下式的接头：
NRaX1(CH2CH2O)m
其中：
Ra是氢、烷基(C≤6)或被取代的烷基(C≤6)；
m是2、3、4或5；且
X1是烷二基(C≤8)或被取代的烷二基(C≤8)；
R1是环烷基(C≤12)；卤代芳基(C≤12)；含有S的杂芳基(C≤12)；被取代的含有S的杂芳基(C≤12)；烷基(C≤6)、卤代烷基(C≤6)、烯基(C≤6)或炔基(C≤6)取代的芳基(C≤12)；3-氨基苯基；4-烷氧基(C≤6)取代的芳基(C≤12)；或下式的基团：
X3OR2
其中：
X3是烷二基(C≤8)或被取代的烷二基(C≤8)；
R2是芳基(C≤12)或被取代的芳基(C≤12)；
或其药学上可接受的盐。
在某些实施方案中，所述化合物进一步被定义为：
A-L-R1(I)
其中：
A是聚合物
L是下式的接头：
NRaX1(CH2CH2O)m
其中：
Ra是氢、烷基(C≤6)或被取代的烷基(C≤6)；
m是2、3、4或5；且
X1是烷二基(C≤8)或被取代的烷二基(C≤8)；
或下式的接头：
NRb(CH2)nX2
其中：
Rb是氢、烷基(C≤6)或被取代的烷基(C≤6)；
n是1、2或3；且
X2是芳烃二基(C≤12)或被取代的芳烃二基(C≤12)；
R1是卤代芳基(C≤12)；芳烷基(C≤12)；被取代的芳烷基(C≤12)；杂环烷基(C≤12)；被取代的杂环烷基(C≤12)；2-吡啶基；3-氨基苯基；
或其药学上可接受的盐。
在某些实施方案中，所述聚合物包含一个或多个糖重复单元，诸如所述重复单元具有下式：
其中：
R3或R4各自独立地是氢或羟基；
R5是羟基、烷氧基(C≤8)、被取代的烷氧基(C≤8)或与所述接头的共价键；且
m是具有从约50,000道尔顿至约500,000道尔顿的分子量的重复单元的数目。
在某些实施方案中，所述聚合物包含下式的重复单元：
其中：
R3、R3′、R4或R4′各自独立地是氢或羟基；
R5是羟基、烷氧基(C≤8)、被取代的烷氧基(C≤8)或与所述接头的共价键；
R5′是与所述接头的共价键；且
m和n导致具有从约50,000道尔顿至约500,000道尔顿的分子量的重复单元的数目。
在某些实施方案中，所述聚合物是丙烯酸酯聚合物诸如甲基丙烯酸酯聚合物。在某些实施方案中，o是2或3。在某些实施方案中，o是2。在其它实施方案中，o是3。在某些实施方案中，Ra是氢。在某些实施方案中，X1是烷二基(C≤6)诸如-CH2CH2-。在某些实施方案中，Rb是氢。在某些实施方案中，p是1或2。在某些实施方案中，p是1。在某些实施方案中，X2是芳烃二基(C≤12)诸如苯二基。
在某些实施方案中，R1是卤代芳基(C≤12)诸如氯苯基、溴苯基或氟苯基。在某些实施方案中，R1是2-溴苯基、4-氯苯基、2-氟苯基或4-氟苯基。在其它实施方案中，R1是3-氨基苯基。在其它实施方案中，R1是含有S的杂芳基(C≤12)或被取代的含有S的杂芳基(C≤12)。在某些实施方案中，R1是含有S的杂芳基(C≤12)诸如2-噻吩基或3-噻吩基。在其它实施方案中，R1是环烷基(C≤12)诸如环丙基。在其它实施方案中，R1是烷基(C≤6)、卤代烷基(C≤6)、烯基(C≤6)或炔基(C≤6)取代的芳基(C≤12)。在某些实施方案中，R1是烷基(C≤6)取代的芳基(C≤12)诸如3-甲基苯基或4-甲基苯基。在其它实施方案中，R1是卤代烷基(C≤6)取代的芳基(C≤12)诸如4-三氟甲基苯基。在其它实施方案中，R1是炔基(C≤6)取代的芳基(C≤12)诸如3-乙炔-苯基。在某些实施方案中，R1是下式的基团：
X3OR2
其中：
X3是烷二基(C≤8)或被取代的烷二基(C≤8)；
R2是芳基(C≤12)或被取代的芳基(C≤12)。
在某些实施方案中，X3是烷二基(C≤8)诸如-CH2-。在某些实施方案中，R2是取代的芳基(C≤12)诸如4-氨基苯基。在其它实施方案中，R1是4-烷氧基(C≤6)取代的芳基(C≤12)诸如4-乙氧基苯基。在其它实施方案中，R1是杂环烷基(C≤12)或被取代的杂环烷基(C≤12)。在某些实施方案中，R1是杂环烷基(C≤12)诸如硫代吗啉-二氧化物。在其它实施方案中，R1是芳烷基(C≤12)或被取代的芳烷基(C≤12)。在某些实施方案中，R1是芳烷基(C≤12)诸如2-苯基乙基。在某些实施方案中，所述化合物进一步被定义为：
其中：
m和n导致具有从约50,000道尔顿至约500,000道尔顿的分子量的重复单元的数目。
在再另一个方面，本公开内容提供了检测样品中的纤维化的方法，所述方法包含将所述样品暴露于本文描述的一种或多种聚合物并测量反应性。
在另一个方面，本公开内容提供了医疗装置，其中所述医疗装置涂有本文描述的化合物。在某些实施方案中，所述医疗装置是可植入装置、心脏起搏器、导管、针注射导管、血块过滤器、血管移植物、球囊、支架移植物、胆管支架、肠支架、支气管支架、食管支架、输尿管支架、动脉瘤填充线圈或其它线圈装置、外科手术修复网、乳房植入物、有机硅植入物、PDMS、经心肌血运重建装置、经皮心肌血运重建装置、假体、器官、血管、主动脉、心脏瓣膜、管、器官替代部件、植入物、纤维、中空纤维、膜、纺织品、储存的血液、血液容器、滴定板、吸附剂介质、透析器、连接件、传感器、瓣膜、内窥镜、过滤器、泵室或另一种旨在具有血液相容性能或用于癌症、糖尿病、缺血、抗细菌、血友病、中风、血液障碍或涉及人工程细胞的细胞因子疗法的医疗装置。
在某些实施方案中，所述医疗装置是胶囊、可植入的聚合物块、3D打印块、3D打印凝胶或聚合物封装装置。在某些实施方案中，所述聚合物封装装置进一步包含选自球形、正方形、长条形(noodles)、针形、矩形和圆柱形的形状。在某些实施方案中，所述可植入的胶囊是微胶囊。在某些实施方案中，所述医疗装置是导管。在某些实施方案中，所述医疗装置导致与没有涂层的医疗装置相比更少的纤维化。在某些实施方案中，所述医疗装置与没有涂层的医疗装置相比是免疫保护性的。在某些实施方案中，所述免疫保护性导致更低的异物应答。
在再另一个方面，本公开内容提供了药物组合物，其包含：
(A)本文描述的化合物或医疗装置；和
(B)赋形剂。
在某些实施方案中，所述药物组合物进一步包含生物材料。在某些实施方案中，所述生物材料被封装在所述化合物或医疗装置中。在某些实施方案中，所述生物材料是细胞。在某些实施方案中，所述细胞是来自异种组织的细胞、来自尸体的细胞、干细胞、源自干细胞的细胞、来自细胞系的细胞、原代细胞、重编程的细胞、重编程的干细胞、源自重编程的干细胞的细胞、遗传工程改造的细胞或它们的组合。在某些实施方案中，所述细胞是人细胞。在某些实施方案中，所述细胞是产生胰岛素的细胞。在某些实施方案中，所述细胞是胰岛细胞。在某些实施方案中，所述化合物是交联的。在某些实施方案中，所述交联的化合物是共价交联。
在再另一个方面，本公开内容提供了治疗或预防疾病或障碍的方法，所述方法包含给有此需要的患者施用本文描述的化合物、医疗装置或药物组合物。在某些实施方案中，所述方法导致更低的异物应答。在某些实施方案中，所述方法导致更少的纤维化。
从下述详细描述将会明白本公开内容的其它目的、特征和优点。然而，应当理解，详细描述和具体实施例尽管指明了本发明的具体实施方案，但仅通过举例说明来给出，因为本领域技术人员从该详细描述会明白在本发明的精神和范围内的各种变化和修改。应当指出，仅仅因为特定化合物归于一个特定通式不意味着它不可以也属于另一个通式。
附图说明
以下附图形成本说明书的一部分，并且被包括在内以进一步证实本发明的某些方面。通过参考这些附图中的一个或多个，并结合本文中呈现的具体实施方案的详细描述，可以更好地理解本发明。
图1显示了概述新海藻酸盐类似物的合成的总体示意图。所使用的具体接头和炔烃如表2所示。该方案的左侧是先前的含有三唑的先导海藻酸盐中的两种(B1-A21和Z1-A34)，其预防小鼠和NHP模型中的纤维化。通过改变与在中心所示的一组炔烃类组合的先导亲水接头(叠氮基PEG-胺)和疏水接头(碘苄基胺)，合成了总共211种新的海藻酸盐类似物。
图2A-2D显示了用于材料筛选的细胞条形码化策略。(图2A)总体示意图：将20个不同的HUVEC供体用相应材料封装并植入小鼠中用于评价抗纤维化性能和生物相容性4周。(图2B)已经通过NGS对20种独特的HUVEC进行了测序以鉴定其特定SNP，这些SNP可以在体内用作条形码来标记和鉴定不同的封装材料。(20)已经通过下一代测序(NGS)对独特的HUVEC进行了测序来鉴定它们各自的单核苷酸多态性(SNP)，这些SNP可以在体内用作条形码来标记和鉴定不同的封装材料。(图2C、2D)为了证明所有供体(H1-H20)可以通过NGS解卷积，将封装20个不同的HUVEC供体的20个不同胶囊的混合物植入NSG小鼠中4周。(图2C)植入前和植入后的明视野和暗视野图像；在回收胶囊时细胞沉积最少，表明没有纤维化，这与植入前胶囊相似。植入4周后，封装的细胞仍然存活(活细胞：绿色，死细胞：红色)。比例条，2mm。(图2D)用NGS分析了来自一只小鼠的胶囊，并成功鉴定了200个胶囊中的195个。在供体之间，鉴定出的胶囊百分比从供体1到供体20均匀分布。
图3A-3E显示了胶凝测定结果和材料表征。(图3A)使用罗丹明B包埋的海藻酸盐类似物的胶凝测定。(图3B)使用海藻酸盐类似物形成胶囊的代表性图像。比例条，2mm。(图3C)在初步表征研究(包括纯度、溶解度和凝胶形成能力)以后，149种海藻酸盐聚合物被用于筛选试验。(图3D)海藻酸盐接头的元素分析表确认接头与海藻酸盐主链的缀合。(图3E)代表性NMR图像显示了海藻酸盐类似物中的三唑峰，证实了修饰。
图4A-4C显示了使用植入前胶囊的DNA提取方法的优化。使用一种优化的方法进行进一步分析，诸如使用植入后胶囊进行qPCR和NGS鉴定。(图4A)根据胶囊裂解条件的DNA含量的对比；有EDTA裂解步骤对比没有EDTA裂解步骤，以及新鲜相对于冷冻条件。(图4B)根据DNA洗脱条件的DNA含量的对比；洗脱体积和洗脱温度。(图4C)根据每个胶囊的细胞数目的DNA含量/收率的对比。
图5A和5B显示了NGS库制备工作流程的优化。库制备涉及扩增SNP基因座的多路PCR步骤、向每个样品添加位置条形码的条形码化PCR步骤以及基于连接的测序适配器修正程序。(图5A)在优化之前，库命中目标率<10％，其中引物二聚体和非特异性PCR产物贡献了大部分读数。(图5B)在优化之后，无论起始材料中的DNA输入是否低(<1ng)，命中目标率均增加至>80％。
图6显示了用于从NGS测序数据确定材料身份/组成的生物信息学流程。将FastqNGS数据通过行和列条形码进行多路分离，以重新分组从相同DNA输入扩增的序列。然后，对于每个扩增子序列，应用grep函数搜索显性等位基因和变异等位基因，以计算每个SNP基因座的变异等位基因频率(VAF)。如果封装的细胞仅包含一个供体，则将VAF概况与20名预先筛选的HUVEC供体的概况进行对比。具有最高匹配率的供体被鉴定为封装的供体细胞。当使用一个或两个供体作为封装细胞时，计算所有可能的供体组成的对数似然。具有最高总体对数似然的组成被确定为细胞组成(用于对数似然分析的质量控制：1)至少25/30个SNP基因座具有>50的测序覆盖度；和2)高于-200的总体对数似然，以及3)高于10的优良度测量，其中优良度被定义为最可能的和第二最可能的供体对之间的对数似然之差)。对应于所鉴定的供体细胞或细胞组成的材料将是封装细胞的材料。
图7A-7F显示了使用独特的细胞条形码化对组合合成的化学修饰的海藻酸盐的高通量筛选有助于在免疫活性小鼠中鉴定具有减少的纤维化的新水凝胶。(图7A)免疫调节性生物材料的库；合成了总共211种新型海藻酸盐类似物。(图7B)将不同材料的混合物植入同一植入位点以增加筛选通量。使用NGS测定通过去多路化封装的HUVEC的SNP基因型来确定材料身份。200个海藻酸盐胶囊(约1.5mm直径，10个胶囊/材料)的典型植入允许同时评价20种不同的植入材料，每种材料具有足够的独立胶囊以实现统计分析。(图7C)其中一轮的代表性结果。植入4周之后，将胶囊移出。与植入前胶囊类似的具有低纤维化的透明胶囊(底行)被分离以进行进一步分析。比例条，10mm。(图7D)热图总结了整个海藻酸盐类似物的材料筛选。(图7E)筛选了149种新材料，并通过NGS测定鉴定了相应的先导材料。误差棒代表来自二项式分布的95％置信区间。Z1-A34(先前的阳性材料，标记为条)的平均水平被标记为虚线。在Z1-A34中的顶部材料用黑条标记。(图7F)前三种先导海藻酸盐类似物的代表性结构(图7E中的橙色条)。
图8A-8H显示了使用双供体条形码化在NHP模型中的材料筛选的扩大。(图8A)将两个HUVEC供体以1:2的比例混合并封装在各种材料中。(图8B)利用以1:2的比例混合的20个HUVEC供体，创建了20x20＝400个独特SNP谱。(图8C)将100个供体对用相应的材料封装并植入NHP的腹膜内空间中4周。每种材料使用了30个胶囊，植入了总共3000个胶囊。(图8D)植入前胶囊的代表性图像。(图8E)4周之后，收集在腹膜内空间中的所有自由漂浮的胶囊并用于材料鉴定(浅色箭头：具有纤维化组织聚集的胶囊，灰色箭头：自由漂浮的胶囊)。(图8F)供体对鉴定的总结。在总共503个选定的胶囊中，466个(92.6％)被鉴定为具有高置信度，32个(6.36％)具有较低置信度，并且5个(0.99％)胶囊未能鉴定。(图8G)所分析的胶囊的置信水平分布。优良度是最可能的对和第二最可能的供体对的对数似然之间的差异，并且因此高优良度指示错误鉴定的低可能性。在右上角的胶囊具有较高的置信度，并且具有低于-200的对数似然或小于10的优良度的胶囊被视为具有“较低置信度”。(图8H)顶部4种鉴定出的先导物的化学结构。
图9A-9D显示了两个HUVEC供体条形码化的优化，以扩大条形码化容量以用于更大的库筛选。(图9A)在体外试验了含有相应供体对的三种不同材料的混合物。优良度是所选择的最可能对和第二最可能对之间的对数似然差异，这是对所选择的组合的突出程度的衡量。(图9B-9D)代表性热图绘制了不同混合比(b,1:2,c,1:3,d,1:4)的每种20x20供体组合的对数似然。每个小方块的暗度代表可能性。
图10A-10F显示了在C57BL/6J小鼠中的双供体条形码化鉴定。(图10A)试验了三种不同的材料；UP-VLVG(对照)，B1-A51(阴性材料之一)和Z1-A34(阳性材料之一)。(图10B)含有混合的双供体的三种材料筛选的示意性工作流程。(图10C和图10D)在植入2周以后，从每只小鼠(M1-M3)中取出胶囊并根据纤维化水平其分成三组。(图10E)所鉴定的供体对的代表性热图结果。(图10F)39个样品映射至Z1-A34(阳性对照材料)，其由1:2比例的H16:H14编码；4个样品映射到由1:2比例的H6:H8编码的UP-VLVG；0个样品映射到B1-A51。总体43/45个样品从400个供体SNP概况中映射。绘制了对应于供体对的每种材料的比例，并且Z1-A34显示出最高值，表明最佳的免疫保护性能。
图11A-11C显示了先导水凝胶在C57BL/6J小鼠的腹膜内表现出低纤维化。(图11A)在2周后从腹膜内空间取回的植入前和外植微胶囊(300～400μm大小)的代表性暗视野图像。比例条，2mm。(图11B)外植微胶囊的代表性共焦图像；将胶囊用CD68(浅色)、DAPI(灰色)和α-SMA(深色)标志物染色。(图11C)使用RT-qPCR分析对比在不同材料中的RNA表达。将纤维化标志物(α-SMA和Col1a1)的表达归一化至SLG20(对照)。使用具有Bonferroni校正的双因素方差分析进行统计分析(****P<0.0001，SLG20对照相对于其它)。
图12显示了用先导材料(Z4-A10)进行的糖尿病逆转研究的结果。以4,000、8,000和16,000IEQ/海藻酸盐体积(mL)的最终细胞密度制造含有人胰岛的胶囊。在每个胶囊中的最终IEQ值分别为每个胶囊10、20和40IEQ。在每个组中，在腹膜内空间中植入500μL、250μL和125μL胶囊，每只小鼠含有总共2,000IEQ。
图13A-13H显示，封装异种人胰岛的先导水凝胶在免疫活性的C57BL/6J小鼠中表现出糖尿病逆转。(图13A)植入前胶囊的代表性图像。Z4-A10胶囊含有人胰岛，密度分别为10IEQ/胶囊、20IEQ/胶囊和40IEQ/胶囊。SLG20胶囊用作对照材料。双硫腙染色指示在胶囊基质内的活胰岛。封装以后，胰岛表现出良好生存力(活的：亮，死的：暗)。(图13B)监测Z4-A10和SLG20组(4,000IEQ/mL密度)的血糖水平，直至小鼠被安乐死(****P<0.0001(SLG20相对于Z4-A10))。(图13C)在糖尿病小鼠中使用Z4-A10胶囊(4,000IEQ/mL)植入物组以及在糖尿病小鼠和非糖尿病小鼠中使用非植入物组的IVGTT试验(ns；不显著，****P<0.0001(所有对比))。(图13D、图13E)外植的Z4-A10和SLG20胶囊(4,000IEQ/mL)的代表性暗视野(图13D)和双硫腙染色(红色，图13E)图像。(图13F)在移植后80天的人c肽测量(SLG20相对于Z4-A10)。(图13G、图13H)高胰岛密度组的血糖监测：Z4-A10胶囊(图13G)和SLG20胶囊(图13H)。误差棒表示平均值±sem；具有Bonferroni多重比较校正的双因素方差分析。
图14A-14E显示了使用先导免疫保护小分子来涂布导管，以在C57BL/6小鼠的皮下空间中提供免疫保护。(图14A)未修饰组或涂有Met-Z1-A3或Met-B2-A17的组的化学结构。(图14B)未修饰的、Met-Z1A3和Met-B2-A17修饰的导管的XPS数据显示小分子特异性原子的重量％，表明成功涂布。(图14C)未修饰的、Met-Z1A3和Met-B2-A17修饰的导管的ToF-SIMS数据显示了通过主峰(CN-、Br-)的总离子强度归一化强度(a.u.)的面积，表明成功涂布。(图14D)未修饰的和涂布的导管的测量的纤维化囊的代表性组织学图像。在涂布的导管的组织-导管界面处较薄的、密度较小的紫色细胞带表明较温和的免疫应答。(图14E)未修饰的和涂布的导管的纤维化囊厚度的量化。使用具有Bonferroni校正的单因素方差分析进行统计分析(****P<0.0001，***P<0.002)。
图15A-15E显示了涂有先导分子的导管的材料表征和评价。(图15A、图15B)绘制通过Tof-SIMS分析的两个主峰的总强度(图15A，CN-，和图15B，Br-)，以与未修饰的导管进行对比。(图15C)未修饰和涂布的导管的代表性SEM图像。(图15D)测量的沉积的纤维化囊组织的实例。使用Image J通过邻近导管的紫色组织带测量组织沉积。(图15E)每组的外植导管的代表性苏木精和曙红染色切片。比例条，2mm。
示例性实施方案的描述
本文公开了具有抗纤维化性能的新化合物和组合物、其制备方法、及其使用方法，包括用于治疗和/或预防疾病的方法。这些化合物是海藻酸盐衍生物(被描述为修饰的海藻酸盐化合物)，其含有一个或多个将化合物连接至海藻酸盐主链的三唑基团。与本领域已知的其它海藻酸盐相比，这些化合物具有一种或多种改进的性能，例如在体内或体外测定中改进的相容性或活性。
本发明描述了小分子和小分子-聚合物缀合物，其(1)具有抗纤维化性能并且(2)维持封装细胞生存力。这些材料的化学结构是基于通过对大约700种材料的初步筛选鉴定出的抗纤维化小分子(Vegas等人,2016)。迄今为止的研究表明，鉴定出的具有免疫调节性能的三唑化合物似乎占据了特殊的结构空间，如果不进行本文描述的筛选，则无法预期其免疫调节性能。与改善的体内性能相关的含有三唑的修饰总体表明，围绕这些三唑修饰的结构类似物可能是设计可以减轻异物应答和调节免疫应答的生物材料的通用化学空间。
I.本发明的化合物
在上面(例如，在发明概述部分中)和在下面的权利要求书中显示了本发明的化合物(也被称作“修饰的海藻酸盐化合物”、“本公开内容的化合物”或“本文公开的化合物”)。使用在实施例部分中概述的合成方法可以制备它们。使用本领域技术人员所应用的有机化学的原理和技术，可以进一步修改和优化这些方法。这样的原理和技术教导在，例如，Smith,March’s Advanced Organic Chemistry:Reactions,Mechanisms,and Structure,(2013)，其通过引用并入本文。另外，使用本领域技术人员所应用的过程化学的原理和技术，可以为制备、中试规模或大规模生产进一步修改和优化合成方法，无论批式还是连续式。这样的原理和技术教导在，例如，Anderson,Practical Process Research&Development-A Guide for Organic Chemists(2012)，其通过引用并入本文。
表1:本文描述的修饰的海藻酸盐化合物的例子
/>
/>
/>
/>
本发明的所有化合物在某些实施方案中可以用于预防和治疗在本文中或在别处讨论的一种或多种疾病或障碍。在某些实施方案中，在本文中表征或举例说明为中间体、代谢物和/或前药的一种或多种化合物仍然也可以用于预防和治疗一种或多种疾病或障碍。因此，除非明确地做出相反说明，否则本发明的所有化合物都被视为考虑用作活性药物成分(API)的“活性化合物”和“治疗性化合物”。通常使用临床试验方案和规定程序(例如由食品和药品管理局(FDA)颁布的那些)的组合来确定对人或兽医学应用的实际适合性。在美国，FDA负责通过确保人和兽用药物、疫苗和其它生物产品和医疗装置的安全性、有效性、质量和可靠性来保护公共卫生。
在某些实施方案中，本发明的化合物具有的优点是，无论是用于本文所述的适应症还是其它方面，与现有技术中已知的化合物相比，它们可以更有效，毒性更小，作用时间更长，更强效，产生更少的副作用，更容易被吸收，在代谢上更稳定，更亲脂，更亲水，和/或具有更好的药代动力学特性(例如，更高的口服生物利用度和/或更低的清除率)，和/或具有其它有用的药理学、物理或化学性能。
本发明的化合物可以含有一个或多个不对称地取代的碳、硫或磷原子，并且可以以光学活性的或外消旋的形式分离。因而，除非特别指出具体的立体化学或异构形式，否则意指化学式的所有手性、非对映异构、外消旋形式、差向异构形式和所有几何异构形式。化合物可以作为外消旋体和外消旋混合物、单一对映异构体、非对映异构体混合物和各非对映异构体存在。在某些实施方案中，获得单一非对映异构体。本发明的化合物的手性中心可以具有S或R构型。在某些实施方案中，本发明化合物可以含有两个或更多个具有确定的立体化学取向的原子。
用于表示本发明化合物的化学式通常仅显示可能几种不同的互变异构体之一。例如，已知许多类型的酮基与相应的烯醇基平衡存在。类似地，许多类型的亚胺基与烯胺基平衡存在。无论对于给定的化合物描绘了哪种互变异构体，并且无论哪个是最普遍的，意指给定化学式的所有互变异构体。
另外，构成本发明化合物的原子意图包括这样的原子的所有同位素形式。本文中使用的同位素包括具有相同原子序数但是具有不同质量数的那些原子。作为一般示例而非限制性地，氢的同位素包括氚和氘，且碳的同位素包括13C和14C。
在某些实施方案中，本发明的化合物作为前药起作用或可以被衍生化以作为前药起作用。由于已知前药会增强药物的众多合乎需要的特性(例如，溶解度、生物利用度、制造等)，因此如果需要的话，在本发明的某些方法中采用的化合物可以以前药形式递送。因而，本发明考虑本发明的化合物的前药以及递送前药的方法。本发明中所用的化合物的前药可以通过修饰存在于所述化合物中的官能团来制备：使得所述修饰在常规操作中或在体内被裂解而形成母体化合物。因此，前药包括例如这样的本文描述的化合物：其中羟基、氨基或羧基键合到任何基团，当给患者施用所述前药时，所述任何基团裂解而分别形成羟基、氨基或羧酸。
在某些实施方案中，本发明的化合物以盐或非盐形式存在。关于盐形式，在某些实施方案中，形成本文提供的化合物的任何盐形式的一部分的特定阴离子或阳离子不是关键性的，只要该盐作为整体是药理学上可接受的即可。药学上可接受的盐的其它例子和它们的制备方法与使用方法呈现于Handbook of Pharmaceutical Salts:Properties,and Use(2002)，其通过引用并入本文。
应当理解，许多有机化合物可以与它们在其中反应或从中沉淀或结晶的溶剂形成复合物。这些复合物被称为“溶剂化物”。在溶剂是水的情况下，该复合物被称为“水合物”。还应当理解，许多有机化合物可以以超过一种固体形式存在，包括结晶形式和无定形形式。本文提供的化合物的所有固体形式，包括其任何溶剂化物，都在本发明范围内。
II.化合物的使用方法
本文描述的修饰的海藻酸盐可以用于食品、药物、化妆品、农业、印刷和纺织工业中的多种应用。海藻酸盐在食品工业中广泛用作增稠剂、胶凝剂、稳定剂、稠化剂、助悬剂和乳化剂。可替换地，这些修饰的海藻酸盐可以用作基质来控制治疗剂、预防剂和/或诊断剂的递送。此外，这些修饰的海藻酸盐可以作为赋形剂掺入药物组合物中，它们在其中可以充当增粘剂、助悬剂、乳化剂、粘合剂和崩解剂。所述修饰的海藻酸盐还可以用于其它应用，诸如牙印模材料、创伤敷料的组分以及作为印刷剂。本领域普通技术人员会认识到，本文公开的修饰的海藻酸盐可以用于目前可采用任何当前使用的海藻酸盐或修饰的海藻酸盐的任何应用。特别考虑的是，本文描述的修饰的海藻酸盐可以用于这样的应用：其中与商购可得的海藻酸盐相比，改善的生物相容性和物理性能(诸如抗纤维化)是优选的。
i.细胞的封装
在历史上，海藻酸盐和因此本文描述的修饰的海藻酸盐可以在水中、在室温与二价阳离子发生离子交联，以形成水凝胶基质。参见，例如，美国专利号4,352,883。在此过程中，将含有待封装的生物材料的水溶液悬浮在水溶性聚合物的溶液中，所述悬浮液形成微滴，所述微滴通过与多价阳离子接触而制备成离散的胶囊，然后胶囊的表面与聚氨基酸交联以在封装的材料周围形成半透膜。
具有带电侧基的水溶性聚合物通过使聚合物与含有相反电荷的多价离子(如果聚合物具有酸性侧基则为多价阳离子，或者如果聚合物具有碱性侧基则为多价阴离子)的水溶液反应来交联。用于交联具有酸性侧基的聚合物以形成水凝胶的阳离子是二价和三价阳离子诸如铜、钙、铝、镁、锶、钡和锡，尽管还可以使用二、三或四官能有机阳离子诸如烷基铵盐，例如，R3N+--\∧∧/--+NR3。将这些阳离子的盐的水溶液加入聚合物中以形成柔软的、高度溶胀的水凝胶和膜。阳离子的浓度越高或化合价越高，聚合物的交联度越大。低至0.005M的浓度已经被证明可以使聚合物交联。较高的浓度受到盐的溶解度限制。
用于交联含有碱性侧链的聚合物以形成水凝胶的阴离子是二价和三价阴离子诸如低分子量二羧酸，例如，对苯二甲酸、硫酸根离子和碳酸根离子。将这些阴离子的盐的水溶液加入聚合物中以形成柔软的、高度溶胀的水凝胶和膜，如针对阳离子所描述。
多种聚阳离子可以用于络合并从而将聚合物水凝胶稳定成半透性表面膜。可以使用的材料的例子包括具有碱性反应基团诸如胺或亚胺基团、具有在3,000至100,000之间的分子量的聚合物，诸如聚乙烯亚胺和聚赖氨酸。这些是商购可得的。一种聚阳离子是聚(L-赖氨酸)；合成多胺的例子是聚乙烯亚胺、聚(乙烯基胺)和聚(烯丙基胺)。还有天然的聚阳离子，诸如多糖、壳聚糖。
可以用于通过与聚合物水凝胶上的碱性表面基团反应而形成半透性膜的聚阴离子包括丙烯酸、甲基丙烯酸和丙烯酸的其它衍生物的聚合物和共聚物，具有SO3H侧基的聚合物诸如磺酸化的聚苯乙烯，和带有羧酸基团的聚苯乙烯。
在一个实施方案中，细胞被封装在修饰的海藻酸盐聚合物中。在一个实施方案中，使用封装器(诸如封装器)从含有悬浮细胞的修饰的海藻酸盐溶液制造修饰的海藻酸盐胶囊。在某些实施方案中，修饰的海藻酸盐与多价阳离子(诸如Ca2+、Ba2+或Sr2+)离子交联。在某些实施方案中，使用BaCl2交联修饰的海藻酸盐。在某些实施方案中，所述胶囊在形成后被进一步纯化。在某些实施方案中，将所述胶囊洗涤，例如，用HEPES溶液、Krebs溶液和/或RPMI-1640培养基洗涤。
细胞可以直接从供体、从供体细胞的细胞培养物、或从建立的细胞培养系获得。在某些实施方案中，细胞直接从供体获得，洗涤并与聚合物材料组合地直接植入。使用组织培养领域的技术人员已知的技术来培养细胞。在某些实施方案中，细胞是自体的—即源自细胞将被移植到其中的个体，但是可以是同种异体的或异源的。
使用扫描电子显微术、组织学和放射性同位素的定量评估，可以评估细胞附着和生存力。使用上述技术和功能测定的组合，可以确定植入细胞的功能。例如，就肝细胞而言，通过将插管放入接受者的胆总管中，可以进行体内肝功能研究。然后可以增量地收集胆汁。通过高压液相色谱法寻找未衍生化的四吡咯，或者通过与重氮化的偶氮二吡咯乙基邻氨基苯甲酸酯反应(无论是否用P-葡萄糖醛酸苷酶处理)转化为偶氮二吡咯以后的薄层色谱法，可以分析胆汁色素。在偶联的胆汁色素的碱性甲醇分解以后也可以通过薄层色谱法测定双偶联的胆红素和单偶联的胆红素。一般而言，随着功能性移植肝细胞的数目增加，结合的胆红素的水平将增加。还可以对血液样品进行简单的肝功能试验，诸如白蛋白产生。根据确定植入后细胞功能的程度所需要，使用本领域技术人员已知的技术可以进行类似的器官功能研究。例如，可以以与专门用于植入肝细胞的类似方式递送胰腺的胰岛细胞，以通过适当分泌胰岛素来实现葡萄糖调节以治疗糖尿病。也可以植入其它内分泌组织。可以进行使用标记的葡萄糖的研究以及使用蛋白测定的研究来定量在聚合物支架上的细胞质量。然后可以将细胞质量的研究与细胞功能研究相关联，以确定合适的细胞质量是什么。就软骨细胞而言，功能被定义为为周围附着组织提供适当的结构支撑。
该技术可以用于在三维支架内提供多种细胞类型，包括遗传上改变的细胞，以有效转移大量细胞并促进移植植入，以创建新的组织或组织等同物。当新组织或组织等同物通过排除宿主免疫系统而生长时，它还可以用于细胞移植物的免疫保护。
可以如本文所述植入的细胞的例子包括软骨细胞和形成软骨的其它细胞、成骨细胞和形成骨的其它细胞、肌细胞、成纤维细胞和器官细胞。本文中使用的“器官细胞”包括肝细胞、胰岛细胞、肠来源的细胞、源自肾脏的细胞以及主要起合成和分泌或代谢物质作用的其它细胞。一种特定的细胞类型是胰岛细胞。
聚合物基质可以与体液因子组合以促进细胞移植和移植物植入。例如，聚合物基质可以与血管生成因子、抗生素、抗炎药、生长因子、诱导分化的化合物以及细胞培养领域的技术人员已知的其它因子组合。例如，在形成用于移植的植入物之前，可以将体液因子以缓释形式与细胞-海藻酸盐悬浮液混合。可替换地，在与分离的细胞悬浮液组合之前，可以对水凝胶进行修饰以结合体液因子或信号识别序列。
本文描述的技术可以用于递送许多不同的细胞类型以获得不同的组织结构。在一个实施方案中，在水凝胶硬化之前，将细胞与水凝胶溶液混合并直接注射到需要植入细胞的部位。但是，基质也可以模制并植入身体的一个或多个不同区域以适合特定应用。当需要特定的结构设计时或当细胞将被植入的区域缺乏特定的结构或支撑以促进细胞的生长和增殖时，该应用尤其相关。
要植入细胞的一个或多个部位基于个体需要而确定，所需的细胞数目也是如此。对于具有器官功能的细胞，例如，肝细胞或胰岛细胞，可以将混合物注射到肠系膜、皮下组织、腹膜后、腹膜前间隙和肌肉内间隙。为了形成软骨，将细胞注射到需要软骨形成的部位。人们还可以应用外部模具来塑造注射溶液的形状。此外，通过控制聚合速率，可能像模制粘土一样模制注入细胞水凝胶的植入物。可替换地，可以将混合物注入模具中，让水凝胶硬化，然后植入材料。
ii.涂布产物和表面
医学产品可以使用多种技术用所公开的修饰的海藻酸盐聚合物涂布，所述技术的实例包括喷涂、浸涂和刷涂。通常如下将聚合物涂层施加于待涂布的表面：将聚合物溶解在适当的有机溶剂中，并通过喷涂、刷涂、浸涂、涂漆或其它类似的技术来施加。涂层沉积在表面上并通过非共价相互作用与表面结合。特别考虑和公开了所得到的涂布产品和表面。
在某些实施方案中，可以用适当的溶液或悬浮液预处理表面以改变表面的性能，并从而增强修饰的表面与涂层之间的非共价相互作用。
在适当的温度将聚合物溶液施加至表面足够的时间段以在表面上形成涂层，其中所述涂层有效地形成抗纤维化表面。典型的温度包括室温，但也可以使用更高的温度。典型的时间段包括5分钟或更短、30分钟或更短、60分钟或更短和120分钟或更短。在某些实施方案中，可以施加溶液120分钟或更长时间以形成具有所需抗纤维化活性的涂层。但是，可以使用更短的时间段。可以以本文公开的或本领域已知的任何方式测量抗纤维化活性。抗纤维化活性可以是如本文所述测定的异物应答。
本文描述的修饰的海藻酸盐化合物可以与产品、装置和表面共价地或非共价地结合。对于其中本文描述的修饰的海藻酸盐化合物与产品、装置或表面共价结合的那些实施方案，可以如下将聚合物附着于产品、装置或表面：例如，用反应官能团(诸如亲核基团)官能化产品、装置或表面，和使亲核基团与聚合物上的反应官能团(诸如亲电子基团)反应。可替换地，聚合物可以用亲核基团官能化，所述亲核基团与产品、装置或表面上的亲电子基团反应。
在特定实施方案中，本文描述的修饰的海藻酸盐化合物与产品、装置或表面非共价地结合。可以如下将聚合物施加于产品、装置或表面：喷雾、润湿、浸没、浸渍、涂抹、粘合或粘附或以其它方式给产品、装置或表面提供具有本文描述的修饰的海藻酸盐化合物的化合物。在一个实施方案中，通过喷涂、涂漆、或浸涂或浸没来施加聚合物。例如，可以如下制备聚合物涂料：将本文描述的修饰的海藻酸盐化合物溶解在合适的溶剂(通常为水性)中，并且任选地对溶液进行声波处理以确保聚合物完全溶解。可以将待涂布的产品、装置或表面浸入聚合物溶液中合适的时间段，例如5秒，随后干燥，诸如风干。所述程序可以根据需要重复多次，以达到足够的覆盖度。涂层的厚度通常为约1nm至约1cm，优选约10nm至1mm，更优选约100nm至约100微米。
涂层可以在制造产品、装置或表面时施加，或者可以在制造产品、装置或表面之后施加。在某些实施方案中，在即将使用产品、装置或表面之前将涂层施加于产品、装置或表面。
这被称为术中涂布。本文中使用的“即将……之前”意指在植入或使用的1、2、5、10、15、20、30、45、60、75、90、120、150、180分钟或更长时间内。在某些实施方案中，在植入或使用的20、15、10或5分钟内在医院(例如在手术室中)涂布产品、装置或表面。在使用前即刻涂布可以克服在制造时涂布的产品、装置和表面的限制，诸如在产品、装置或表面的储存和/或运输过程中涂层的损坏，和/或随着时间推移涂层功效因涂层暴露于恶劣的环境条件(例如高温、潮湿、暴露于紫外线等)中而降低。
经涂布的医学产品可以用于医学产品的未涂布或不同涂布形式的已知用途和目的。
a.医学产品
可用于涂布的医学产品包括至少部分地用于植入患者体内的任何类型的医疗装置。例子包括、但不限于植入物、可植入的医学产品、可植入装置、导管和其它管(包括泌尿管和胆管、气管内管、伤口引流管、针注射导管、可外周插入的中心静脉导管、透析导管、长期隧道中心静脉导管、外周静脉导管、短期中心静脉导管、动脉导管、肺导管、Swan-Ganz导管、导尿管、腹膜导管)、血管导管端口、血块过滤器、泌尿装置(包括长期泌尿装置、组织粘合泌尿装置、人工尿道括约肌、尿道扩张器)、分流器(包括心室或动静脉分流器、支架移植物、胆管支架、肠支架、支气管支架、食管支架、输尿管支架和脑积水分流器)、球囊、起搏器、可植入的除颤器、矫形产品(包括销、板、螺钉和植入物)、移植物(包括器官、血管移植物、血管、主动脉、心脏瓣膜和器官替代部件)、假体(包括乳房植入物、阴茎假体、血管移植假体、心脏瓣膜、人工关节、人工喉、耳科植入物、人工心脏、人工血管和人工肾)、动脉瘤填充线圈和其它线圈装置、经心肌血运重建装置、经皮心肌血运重建装置、管、纤维、中空纤维、膜、血液容器、滴定板、吸附剂介质、透析器、连接件、传感器、瓣膜、内窥镜、过滤器、泵室、手术刀、针头、剪刀(以及在侵入性外科手术、治疗或诊断程序中使用的其它装置)、以及其它旨在具有抗纤维化性能的医学产品和装置。表述“医学产品”含义广泛，并特指与血液短暂(例如，内窥镜)或永久(例如，支架)接触的产品。
有用的医学产品是球囊导管和血管内假体，特别是支架。常规设计的支架具有由金属支柱组成的细丝支撑结构。支撑结构最初以未扩张状态提供以插入体内，并然后在施用部位处加宽至扩张状态。可以在将支架卷曲到球囊上之前或之后对支架进行涂布。用于高度多样化的应用的多种医用内用假体或医学产品或植入物是已知的。例如，它们用于支撑血管、中空器官和导管系统(血管内植入物)，连接和临时固定组织植入物和组织移植物，以及用于矫形外科目的，诸如销、板或螺钉。
本文描述的修饰的海藻酸盐化合物可以施加至、吸收至或偶联至多种不同的基底和表面。合适材料的例子包括金属、金属材料、陶瓷、聚合物、纤维、惰性材料诸如硅和它们的组合。
合适的聚合物材料包括、但不限于苯乙烯和取代的苯乙烯、乙烯、丙烯、聚(氨基甲酸酯)、丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺和甲基丙烯酰胺、聚酯、聚硅氧烷、聚醚、聚(原酸酯)、聚(碳酸酯)、聚(羟基烷酸酯)、其共聚物、及其组合。
基底可以是薄膜、颗粒(纳米颗粒、微米颗粒或毫米直径珠子)、纤维(创伤敷料、绷带、纱布、胶带、垫、海绵，包括织造和非织造海绵、以及专为牙科或眼科外科手术设计的那些)、传感器、起搏器导线、导管、支架、隐形眼镜、骨植入物(髋关节置换物、销、铆钉、板、骨水泥等)或组织再生或细胞培养装置、或在体内使用或与身体接触的其它医疗装置的形式或形成其一部分。
本文描述了涂有修饰的海藻酸盐化合物涂层的植入物。“植入物”是意图放置在哺乳动物(诸如人)体内的非活体组织的任何物体。植入物是医学产品的一种形式。植入物包括已经处理过、使得其活组织失去活力的天然衍生的物体。作为一个例子，可以对骨移植物进行处理，从而除去其活细胞，但使其形状被保留以充当宿主骨骼向内生长的模板。作为另一个例子，天然存在的珊瑚可以被加工以产生羟磷灰石制品，其可以应用于身体进行某些矫形外科和牙科治疗。植入物还可以是包含人造部件的制品。术语“植入物”可以应用于意图放置在人体或哺乳动物体内的整个医疗装置范围，包括矫形外科应用、牙科应用、耳鼻喉(“ENT”)应用和心血管应用。
在某些实施方案中，本文中使用的“植入物”表示宏观组合物，其包括用于植入的装置或用于植入的装置的表面和修饰的海藻酸盐化合物涂层。在这些实施方案中，术语“植入物”不涵盖纳米颗粒和/或微米颗粒。本文中使用的“宏观”通常表示可以通过肉眼观察到的装置、植入物或组合物。
可植入的医疗装置以及可以使用生物相容性涂层的医疗装置和机械结构的例子包括、但不限于支架、导管、支撑架、心脏瓣膜环、心血管瓣膜、起搏器、髋关节置换装置、植入的传感器装置、食管支架、心脏植入物、心脏瓣膜的生物相容性衬里、透析设备和心肺旁路系统的氧合器管道。
一般而言，支架是一种通常呈管状形状的装置，其插入身体的内腔(诸如血管或导管)中以防止或抵消局部流动收缩。在某些情况下，支架的目的是机械地支撑打开体液导管。支架经常用于缓解流向器官和四肢的血流减少，以便维持充足的含氧血液递送。支架的最常见用途是在冠状动脉中，但它们也广泛用于其它身体管道中，诸如、例如中央和外周动脉和静脉、胆管、食管、结肠、气管、大支气管、输尿管和尿道。经常，插入内腔中的支架能够在插入以后扩张或者是自扩张的。例如，使用球囊导管将金属支架部署到闭塞的动脉中并扩张以恢复血流。例如，不锈钢丝网支架可从Boston Scientific,Natick,Mass商购获得。
在某些实施方案中，所述植入物是矫形外科植入物。“矫形外科植入物”被定义为替代骨或提供向骨的固定、替代关节的接合表面、为假体提供基台或其组合、或者协助替代骨或提供向骨的固定、替代关节的接合表面、为假体提供基台或其组合的植入物。
矫形外科植入物可以用于替代骨或提供向骨的固定、替代关节的接合表面、为假体提供基台或其组合，或者协助替代骨或提供向骨的固定、替代关节的接合表面、为假体提供基台，包括牙科应用，及其组合。
合适的矫形外科植入物包括、但不限于丝、Kirschner丝、骨板、螺钉、销、tacs、杆、钉、螺母、螺栓、垫圈、长钉、纽扣、线材、骨折板、重建和稳定装置、内假体和外假体(关节式和非关节式)、骨内经皮假体、间隔物、网、植入基台、锚、倒钩、夹子、缝合线、椎体间融合装置、任何几何形状的管、支架及其组合。
在其它实施方案中，所述植入物是耳、鼻和/或喉(“ENT”)植入物。示例性的ENT植入物包括、但不限于耳管、气管内管、通气管、耳蜗植入物和骨锚式听力装置。
在其它实施方案中，所述植入物是心血管植入物。示例性的心血管植入物是心脏瓣膜或同种异体血管壁支撑件、全人工心脏植入物、心室辅助装置、血管移植物、支架、电信号承载装置诸如起搏器和神经导线、除颤器导线等。
植入物可以由多种材料制备。在某些实施方案中，所述材料是生物相容的。在某些实施方案中，所述材料是生物相容的和不可生物降解的。示例性的材料包括金属材料、金属氧化物、聚合物材料(包括可降解的和不可降解的聚合物材料)、陶瓷、瓷器、玻璃、同种异体、异种骨或骨基质；遗传工程改造的骨；及其组合。
合适的金属材料包括、但不限于基于钛的金属和合金(诸如镍钛记忆合金、镍钛合金、热记忆合金材料)、不锈钢、钽、钯、锆、铌、钼、镍-铬、或某些钴合金，包括钴-铬和钴-铬-镍合金诸如和/>
有用的例子包括316级不锈钢(SS 316L)(包含Fe、<0.3％ C、16-18.5％Cr、10-14％ Ni、2-3％ Mo、<2％ Mn、<1％ Si、<0.45％ P和<0.03％ S)、钽、铬钼合金、镍-钛合金(诸如镍钛记忆合金)和钴铬合金(诸如MP35N、ASTM材料命名：35Co-35Ni-20Cr-10Mo)。目前用于支架的典型金属包括SS 316L钢和MP35N。另参阅，“Comparing and Optimizing Co—Cr Tubing for Stent Applications,”Poncin,P,Millet,C.,Chevy,J，和Profit,J.L.,Materials&Processes for Medical Devices Conference,2004年8月,ASMInternational。
合适的陶瓷材料包括、但不限于过渡元素的氧化物、碳化物或氮化物，诸如氧化钛、氧化铪、氧化铱、氧化铬、氧化铝和氧化锆。也可以使用基于硅的材料，例如二氧化硅。
合适的聚合物材料包括、但不限于聚苯乙烯和取代的聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚乙炔、聚苯乙烯、聚(乙烯氯)(PVC)、聚烯烃共聚物、聚(氨基甲酸酯)、聚丙烯酸酯和聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺和聚甲基丙烯酰胺、聚酯、聚硅氧烷、聚醚、聚(原酸酯)、聚(碳酸酯)、聚(羟基烷酸酯)、聚氟烃、/>(聚四氟乙烯、PTFE)、有机硅、环氧树脂、/> (从乙二醇和对酞酸得到的缩合聚合物)、尼龙、聚烯烃、酚醛树脂、天然的和合成的弹性体、粘着剂和密封剂、聚烯烃、聚砜、聚丙烯腈、生物聚合物诸如多糖和天然胶乳、胶原、纤维质聚合物(例如，烷基纤维素等)、多糖、聚(羟乙酸)、聚(L-乳酸)(PLLA)、聚二氧杂环己烷酮(PDA)或外消旋的聚(乳酸)、聚碳酸酯(例如，聚酰胺(尼龙)；氟塑料、碳纤维及其掺合物或共聚物。
所述聚合物可以与表面共价地或非共价地结合；但是，在特定实施方案中，所述聚合物与表面非共价地结合。所述聚合物可以通过本领域的多种技术来施加，包括、但不限于喷涂、润湿、浸渍、浸没诸如浸涂(例如，术中浸涂)、涂漆或以其它方式施加疏水性聚阳离子聚合物到植入物的表面。
适合在医疗环境中使用的产品的表面可以能够使用高压灭菌、杀生物剂暴露、辐射或充气技术(如环氧乙烷暴露)来灭菌。在医疗环境中发现的表面包括各种仪器和装置的内部和外部，无论是一次用弃还是意图重复使用。
b.水凝胶
医学产品也可以由水凝胶制成或使用水凝胶。本文描述的修饰的海藻酸盐化合物可以形成用于该目的和其它目的的水凝胶。由其它水凝胶制成的产品也可以用所公开的修饰的海藻酸盐聚合物涂布。因而，本文描述的修饰的海藻酸盐化合物可以用作在产品或表面上的涂层或可以用作产品本身。水凝胶是能够吸收大量的水或生物液体的三维亲水性聚合物网络(Peppas等人.Eur.J.Pharm.Biopharm.2000,50,27-46)。这些网络由同聚物或共聚物组成，并且由于化学交联或物理交联(诸如缠结或微晶)的存在而不溶。根据侧基的性质，水凝胶可以分为中性或离子型。此外，它们可以是无定形的、半结晶的、氢键合的结构、超分子结构和水胶体聚集体(Peppas,N.A.Hydrogels.见:Biomaterials science:anintroduction to materials in medicine；Ratner,B.D.,Hoffman,A.S.,Schoen,F.J.,Lemons,J.E.，编；Academic Press,1996，第60-64页；Peppas等人,Eur.J.Pharm.Biopharm.2000,50,27-46)。水凝胶可以从合成的或天然的单体或聚合物制备。所述水凝胶可以包括本文描述的修饰的海藻酸盐化合物。
水凝胶可以从合成的聚合物诸如聚(丙烯酸)及其衍生物[例如聚(甲基丙烯酸羟乙酯)(pHEMA)]、聚(N-异丙基丙烯酰胺)、聚(乙二醇)(PEG)及其共聚物和聚(乙烯醇)(PVA)等制备(Bell和Peppas,Adv.Polym.Sci.122:125-175(1995)；Peppas等人,Eur.J.Pharm.Biopharm.50:27-46(200)；Lee和Mooney,Chem.Rev.101:1869-1879(2001))。从合成的聚合物制备的水凝胶通常在生理条件下不可降解。水凝胶还可以从天然聚合物制备，包括、但不限于多糖、蛋白和肽。本文描述的修饰的海藻酸盐化合物是一个例子。这些网络通常在生理条件下通过化学或酶促方式降解。
在某些实施方案中，所述水凝胶在相关的体外和体内条件下是不可降解的。稳定的水凝胶涂层对于某些应用而言是必要的，包括中心静脉导管涂层、心脏瓣膜、起搏器和支架涂层。在其它情况下，水凝胶降解可能是一种优先方案诸如在组织工程构建体中。
在某些实施方案中，所述水凝胶可以从葡聚糖形成。葡聚糖是一种细菌多糖，其主要由α-1,6连接的D-吡喃型葡萄糖残基和小百分比的α-1,2、α-1,3或α-1,4-连接的侧链组成。葡聚糖由于其生物相容性、低毒性、相对低的成本和简单的修饰而被广泛用于生物医学应用。这种多糖作为血浆容量扩张剂、外周血流促进剂和抗血栓溶解剂已经在临床上使用了超过五十年(Mehvar,R.J.Control.Release 2000,69,1-25)。此外，它已经被用作递送药物和蛋白的大分子载体，主要用于增加治疗剂在循环中的寿命。通过使用化学或酶促方法可以用乙烯基基团修饰葡聚糖来制备凝胶(Ferreira等人.Biomaterials 2002,23,3957-3967)。
基于葡聚糖的水凝胶会阻止血管内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞的粘附(Massia,S.P.；Stark,J.J.Biomed.Mater.Res.2001,56,390-399.Ferreira等人.2004,J.Biomed.Mater.Res.68A,584-596)，并且葡聚糖表面会阻止蛋白吸附(Osterberg等人.J.Biomed.Mat.Res.1995,29,741-747)。
如本文描述的，本文描述的修饰的海藻酸盐化合物可以用于封装细胞。在某些实施方案中，所述封装的细胞可以制造成宏装置。例如，在某些实施方案中，封装在修饰的海藻酸盐水凝胶中的细胞可以被涂布到表面上，诸如平面表面上。在某些实施方案中，可以使用生物相容性粘合剂将含有细胞的胶囊粘附至受试者的组织。在其它实施方案中，含有细胞的胶囊可以被涂布到适合植入的医疗装置上。
iii.治疗疾病或障碍
可替换地，可以将封装的细胞移植到有此需要的患者中以治疗疾病或障碍。在某些实施方案中，所述封装的细胞得自相同物种的遗传上不相同的成员。在替代实施方案中，所述封装的细胞得自与患者不同的物种。在某些实施方案中，分泌激素或蛋白的细胞被封装并移植到患者中以治疗疾病或障碍。
在某些实施方案中，所述疾病或障碍涉及患者中的分泌激素或蛋白的细胞机能障碍或由其造成。在某些实施方案中，所述疾病或障碍是糖尿病。涂有本文描述的修饰的海藻酸盐化合物的医学产品、装置和表面可以被移植或植入有此需要的患者中以治疗疾病或障碍。所公开的胶囊、产品、装置和表面可以保持基本上没有纤维化效应，或可以继续表现出减少的异物应答，在施用或植入以后持续2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8、个月、9个月、10个月、11个月、1年、2年或更长时间。
所公开的胶囊、产品、装置和表面可以单独施用或植入，或与任何合适的药物或其它疗法组合施用或植入。这样的药物和疗法也可以在所述胶囊、产品、装置和表面存在于患者体内期间单独施用(即并行使用)。尽管所公开的胶囊、产品、装置和表面减少了纤维化和对所述胶囊、产品、装置和表面的免疫反应，但是不排除与所述胶囊、产品、装置和表面一起或并行使用抗炎药物和免疫系统抑制药物。但是，在一个实施方案中，在不使用抗炎药物和免疫系统抑制药物的情况下使用所公开的胶囊、产品、装置和表面。在某些实施方案中，在所使用的任何抗炎药物或免疫系统抑制药物的使用、浓度、效果或其组合降至有效水平以下之后，纤维化仍保持减少。例如，在所使用的任何抗炎药物或免疫系统抑制药物的使用、浓度、效果或其组合降至有效水平以下之后，纤维化可以保持减少2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8、个月、9个月、10个月、11个月、1年、2年或更长时间。
III.联合疗法
除了用作单一疗法之外，本发明的化合物还可以与一种或多种其它疗法联合使用。有效的联合疗法可以用包含两种药剂的单一组合物或药理学制剂实现，或用同时施用的两种不同的组合物或制剂实现，其中一种组合物包括本发明的化合物，且另一种组合物包括第二种药剂。可替换地，所述疗法可以在其它药剂治疗之前或之后，间隔从数分钟到数月。
这样的联合疗法的非限制性例子包括一种或多种本发明的化合物与以下药剂的组合：另一种抗炎剂、化学治疗剂、辐射疗法、抗抑郁药、抗精神病药、抗惊厥药、情绪稳定剂、抗感染剂、抗高血压剂、胆固醇降低剂或血液脂质的其它调节剂、用于促进重量减轻的药剂、抗血栓形成剂、用于治疗或预防心血管事件诸如心肌梗塞或中风的药剂、抗糖尿病剂、用于减轻移植排斥或移植物抗宿主病的药剂、抗关节炎药、镇痛药、抗哮喘药或呼吸系统疾病的其它治疗或用于治疗或预防皮肤障碍的药剂。
IV.定义
以下定义替代在通过引用并入本文的任何参考文献中的任何冲突的定义。但是，对某些术语加以定义的事实不应当被认为表示未被定义的任何术语是不确定的。相反，所使用的所有术语均被认为以使得本领域普通技术人员可以明白本发明的范围并实施本发明的方式描述本发明。
当在化学基团的上下文中使用时：“氢”是指-H；“羟基”是指-OH；“氧代”是指＝O；“羰基”是指-C(＝O)-；“羧基”是指-C(＝O)OH(也写作-COOH或-CO2H)；“卤素”独立地是指-F、-Cl、-Br或-I；“氨基”是指-NH2；“羟氨基”是指-NHOH；“硝基”是指-NO2；亚氨基是指＝NH；“氰基”是指-CN；“异腈基”是指-N＝C＝O；“叠氮基”是指-N3；在单价上下文中，“磷酸酯”是指-OP(O)(OH)2或其去质子化形式；在二价上下文中，“磷酸酯”是指-OP(O)(OH)O-或其去质子化形式；“巯基”是指-SH；且“硫代”是指＝S；“硫代羰基”是指-C(＝S)-；“磺酰基”是指-S(O)2-；且“亚磺酰基”是指-S(O)-。
在化学式的上下文中，符号“-”是指单键，“＝”是指双键，且“≡”是指三键。符号“----”代表任选的键，其如果存在的话是单键或双键。符号代表单键或双键。因而，式/>涵盖，例如，/>和/>且应当理解，没有一个这样的环原子形成超过一个双键的一部分。此外，应当指出，当连接一个或两个立体原子时，共价键符号“-”未指示任何优选的立体化学。相反，它涵盖所有立体异构体及其混合物。当垂直穿过键绘制时(例如，对于甲基，/>)，符号/>指示该基团的连接点。应当指出，通常仅以这种方式为较大的基团标识连接点，以帮助读者明确标识连接点。符号/>是指单键，其中连接至楔的粗端的基团“从纸面出来”。符号/>是指单键，其中连接至楔的粗端的基团“进入纸面”。符号/>是指单键，在双键周围的几何形状(例如，E或Z)未确定。因此，两种选择以及它们的组合都是预期的。在本申请中显示的结构的原子上的任何未定义化合价暗含地表示与该原子键合的氢原子。在碳原子上的粗体点指示，与该碳相连的氢朝向纸面之外。
当一个变量被描述为在环系上的“浮动基团”时，例如，下式中的基团“R”：
则该变量可以替代与环原子中的任一个相连的任何氢原子，包括所描绘的、暗示的或明确定义的氢，只要形成稳定的结构即可。当一个变量被描述为在稠合环系上的“浮动基团”时，例如，下式中的基团“R”：
则该变量可以替代与稠合环中的任一个的任何环原子相连的任何氢，除非另有说明。可替换的氢包括所描绘的氢(例如、在上式中与氮连接的氢)、隐含的氢(例如、未示出但理解为存在的上式中的氢)、明确定义的氢以及其存在取决于环原子的身份的任选氢(例如，当X等于-CH-时，与基团X相连的氢)，只要形成稳定的结构即可。在所示的例子中，R可以位于稠合环系的5元或6元环上。在上式中，在括号中的R后面紧跟着的下标字母“y”表示数字变量。除非另有说明，否则此变量可以是0、1、2或大于2的任何整数，仅受限于环或环系统的可替换氢原子的最大数目。
对于化学基团和化合物类别，该基团或类别中的碳原子的数目如下指示：“Cn”或“C＝n”定义了该基团/类别中的碳原子的确切数目(n)。“C≤n”定义了可以在该基团/类别中的碳原子的最大数目(n)，而最小数目对于所讨论的基团/类别而言尽可能小。例如，应当理解，在基团“烷基(C≤8)”、“烷二基(C≤8)”、“杂芳基(C≤8)”和“酰基(C≤8)”中的碳原子的最小数目为1，在基团“烯基(C≤8)”、“炔基(C≤8)”和“杂环烷基(C≤8)”中的碳原子的最小数目为2，在基团“环烷基(C≤8)”中的碳原子的最小数目为3，且在基团“芳基(C≤8)”和“芳烃二基(C≤8)”中的碳原子的最小数目为6。“Cn-n′”定义了基团中碳原子的最小数目(n)和最大数目(n′)。因而，“烷基(C2-10)”表示具有2-10个碳原子的那些烷基。这些碳数指示符可以在其修饰的化学基团或类别之前或之后，并且它可以包封或不包封在括号中，而不表示含义的任何变化。因而、术语“C1-4-烷基”、“C1-4-烷基”、“烷基(C1-4)”和“烷基(C≤4)”都是同义的。除以下所述外，对每个碳原子计数以确定该基团或化合物是否落入碳原子的指定数目内。例如，基团二己基氨基是二烷基氨基(C＝12)基团的一个例子；但是，它不是二烷基氨基(C＝6)基团的一个例子。同样地，苯乙基是芳烷基(C＝8)基团的一个例子。当本文定义的任何化学基团或化合物类别被术语“取代的”修饰时，替换氢原子的部分中的任何碳原子均不计算在内。因此，总共具有七个碳原子的甲氧基己基是取代的烷基(C1-6)的一个例子。除非另有说明，否则在权利要求书中列出的没有碳原子限制的任何化学基团或化合物类别具有小于或等于12的碳原子限制。
当用于修饰化合物或化学基团时，术语“饱和的”是指该化合物或化学基团不具有碳-碳双键和碳-碳三键，除非下文另有说明。当该术语用于修饰原子时，它是指该原子不是任何双键或三键的部分。在饱和基团的被取代形式的情况下，可以存在一个或多个碳氧双键或碳氮双键。并且当这样的键存在时，则不排除可能作为酮-烯醇互变异构现象或亚胺/烯胺互变异构现象的一部分出现的碳-碳双键。当术语“饱和的”用于修饰物质的溶液时，它是指没有更多的该物质可以溶解在该溶液中。
术语“脂族的”表示如此修饰的化合物或化学基团是无环的或环状的、但非芳族的化合物或基团。在脂族化合物/基团中，碳原子可以以直链、支链或非芳族环(脂环族)连接在一起。脂族化合物/基团可以是饱和的，即通过单个碳-碳键连接(烷烃/烷基)，或不饱和的，具有一个或多个碳-碳双键(烯烃/烯基)或具有一个或多个碳-碳三键(炔烃/炔基)。
术语“芳族”表示在完全共轭的环状π系统中，如此修饰的化合物或化学基团具有含4n+2个电子的原子的平面不饱和环。芳族化合物或化学基团可以描述为单个共振结构；但是，对一个共振结构的描述也用于表示任何其它共振结构。例如：
也用于表示/>
芳香化合物也可以用圆圈描绘以表示电子在完全共轭的环状π系统中的离域性质，其两个非限制性例子如下所示：
术语“烷基”表示单价饱和脂族基团，其具有碳原子作为连接点，具有直链或支链无环结构，且没有除碳和氢以外的原子。基团-CH3(Me)、-CH2CH3(Et)、-CH2CH2CH3(n-Pr或丙基)、-CH(CH3)2(i-Pr、iPr或异丙基)、-CH2CH2CH2CH3(n-Bu)、-CH(CH3)CH2CH3(仲-丁基)、-CH2CH(CH3)2(异丁基)、-C(CH3)3(叔丁基、叔丁基、t-Bu或tBu)和-CH2C(CH3)3(新戊基)是烷基基团的非限制性例子。术语“烷二基”表示二价饱和脂族基团，其具有1个或2个饱和碳原子作为连接点，具有直链或支链无环结构，没有碳-碳双键或三键，且没有除碳和氢以外的原子。基团-CH2-(亚甲基)、-CH2CH2-、-CH2C(CH3)2CH2-和-CH2CH2CH2-是烷二基基团的非限制性例子。术语“亚烷基”表示二价基团＝CRR′，其中R和R′独立地是氢或烷基。亚烷基基团的非限制性例子包括＝CH2、＝CH(CH2CH3)和＝C(CH3)2。“烷烃”表示具有式H-R的化合物类别，其中R是烷基，该术语如上面所定义。
术语“环烷基”表示具有碳原子作为连接点的单价饱和脂族基团，所述碳原子形成一个或多个非芳族环结构的一部分，没有碳-碳双键或三键，且没有除碳和氢以外的原子。非限制性的例子包括-CH(CH2)2(环丙基)、环丁基、环戊基或环己基(Cy)。本文中使用的该术语不排除连接至非芳族环结构的碳原子的一个或多个烷基基团(碳数限制允许)的存在。术语“环烷二基”表示具有2个碳原子作为连接点的二价饱和脂族基团，没有碳-碳双键或三键，且没有除碳和氢以外的原子。基团是环烷二基基团的一个非限制性例子。“环烷烃”表示具有式H-R的化合物类别，其中R是环烷基，该术语如上面所定义。
术语“烯基”表示具有碳原子作为连接点的单价不饱和脂族基团，其具有直链或支链无环结构，至少一个非芳族碳-碳双键，没有碳-碳三键，且没有除碳和氢以外的原子。非限制性的例子包括-CH＝CH2(乙烯基)、-CH＝CHCH3、-CH＝CHCH2CH3、-CH2CH＝CH2(烯丙基)、-CH2CH＝CHCH3和-CH＝CHCH＝CH2。术语“烯烃二基”表示二价不饱和脂族基团，其具有2个碳原子作为连接点，具有直链或支链无环结构，至少一个非芳族碳-碳双键，没有碳-碳三键，且没有除碳和氢以外的原子。基团-CH＝CH-、-CH＝C(CH3)CH2-、-CH＝CHCH2-和-CH2CH＝CHCH2-是烯烃二基基团的非限制性例子。应当指出，尽管烯烃二基基团是脂族的，但一旦在两端连接，就不排除该基团形成芳族结构的一部分。术语“烯烃”和“链烯烃”是同义的，并且表示具有式H-R的化合物类别，其中R是烯基，该术语如上面所定义。类似地，术语“末端烯烃”和“α-烯烃”是同义的并且表示具有刚好一个碳-碳双键的烯烃，其中该键是在分子末端处的乙烯基基团的部分。
术语“炔基”表示具有碳原子作为连接点的单价不饱和脂族基团，其具有直链或支链无环结构，至少一个碳-碳三键，且没有除碳和氢以外的原子。本文中使用的术语炔基不排除一个或多个非芳族碳-碳双键的存在。基团-C≡CH、-C≡CCH3和-CH2C≡CCH3是炔基基团的非限制性例子。“炔烃”表示具有式H-R的化合物类别，其中R是炔基。
术语“芳基”表示具有芳族碳原子作为连接点的单价不饱和芳族基团，所述碳原子形成一个或多个芳族环结构的一部分，每个芳族环结构具有6个都为碳的环原子，且其中所述基团不由除碳和氢以外的原子组成。如果存在超过一个环，所述环可以是稠合的或未稠合的。未稠合的环通过共价键连接。本文中使用的术语芳基不排除连接至第一个芳族环或存在的任何另外芳族环的一个或多个烷基基团(碳数限制允许)的存在。芳基基团的非限制性例子包括苯基(Ph)、甲基苯基、(二甲基)苯基、-C6H4CH2CH3(乙基苯基)、萘基和从联苯衍生出的单价基团(例如，4-苯基苯基)。术语“芳烃二基”表示具有2个芳族碳原子作为连接点的二价芳族基团，所述碳原子形成一个或多个6元芳族环结构的一部分，每个芳族环结构具有6个都为碳的环原子，且其中所述二价基团不由除碳和氢以外的原子组成。本文中使用的术语芳烃二基不排除连接至第一个芳族环或存在的任何另外芳族环的一个或多个烷基基团(碳数限制允许)的存在。如果存在超过一个环，所述环可以是稠合的或未稠合的。未稠合的环通过共价键连接。芳烃二基基团的非限制性例子包括：
“芳烃”表示具有式H-R的化合物类别，其中R是芳基，该术语如上面所定义。苯和甲苯是芳烃的非限制性例子。
术语“芳烷基”表示单价基团-烷二基-芳基，其中术语烷二基和芳基各自以与上面提供的定义一致的方式使用。非限制性例子是苯基甲基(苄基,Bn)和2-苯基-乙基。
术语“杂芳基”表示具有芳族碳原子或氮原子作为连接点的单价芳族基团，所述碳原子或氮原子形成一个或多个芳族环结构的一部分，每个芳族环结构具有3-8个环原子，其中所述芳族环结构的至少一个环原子是氮、氧或硫，且其中所述杂芳基基团不由除碳、氢、芳族氮、芳族氧和芳族硫以外的原子组成。如果存在超过一个环，所述环是稠合的；但是，术语杂芳基不排除连接至一个或多个环原子的一个或多个烷基或芳基基团(碳数限制允许)的存在。杂芳基的非限制性例子包括苯并噁唑基、苯并咪唑基、呋喃基、咪唑基(Im)、吲哚基、吲唑基、异噁唑基、甲基吡啶基、噁唑基、噁二唑基、苯基吡啶基、吡啶基(吡啶基)、吡咯基、嘧啶基、吡嗪基、喹啉基、喹唑啉基、喹喔啉基、三嗪基、四唑基、噻唑基、噻吩基和三唑基。术语“N-杂芳基”表示具有氮原子作为连接点的杂芳基基团。“杂芳烃”表示具有式H-R的化合物类别，其中R是杂芳基。吡啶和喹啉是杂芳烃的非限制性例子。术语“杂芳烃二基”表示二价芳族基团，其具有2个芳族碳原子、2个芳族氮原子、或1个芳族碳原子和1个芳族氮原子作为2个连接点，所述原子形成一个或多个芳族环结构(各具有3-8个环原子)的部分，其中所述芳族环结构的至少一个环原子是氮、氧或硫，且其中所述二价基团不由除碳、氢、芳族氮、芳族氧和芳族硫以外的原子组成。如果存在超过一个环，所述环是稠合的；但是，术语杂芳烃二基不排除与一个或多个环原子连接的一个或多个烷基或芳基基团(碳数限制允许)的存在。杂芳烃二基基团的非限制性例子包括：
术语“杂芳烷基”表示单价基团-烷二基-杂芳基，其中术语烷二基和杂芳基各自以与上面提供的定义一致的方式使用。非限制性例子是吡啶基甲基和2-喹啉基-乙基。
术语“杂环烷基”表示具有碳原子或氮原子作为连接点的单价非芳族基团，所述碳原子或氮原子形成一个或多个非芳族环结构的一部分，每个非芳族环结构具有3-8个环原子，其中所述非芳族环结构的至少一个环原子是氮、氧或硫，且其中所述杂环烷基基团不由除碳、氢、氮、氧和硫以外的原子组成。如果存在超过一个环，所述环是稠合的。本文中使用的该术语不排除连接至一个或多个环原子的一个或多个烷基基团(碳数限制允许)的存在。并且，该术语不排除一个或多个双键在环或环系统中的存在，前提条件是，得到的基团仍然是非芳族的。杂环烷基的非限制性例子包括氮杂环丙基、氮杂环丁基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、硫代吗啉基、四氢呋喃基、四氢噻吩基、四氢吡喃基、吡喃基、氧杂环丙基和氧杂环丁基。术语“N-杂环烷基”表示具有氮原子作为连接点的杂环烷基基团。N-杂环烷基基团的非限制性例子包括N-吡咯烷基和
术语“酰基”表示基团-C(O)R，其中R是氢、烷基、环烷基或芳基，那些术语如上面所定义。基团、-CHO、-C(O)CH3(乙酰基、Ac)、-C(O)CH2CH3、-C(O)CH(CH3)2、-C(O)CH(CH2)2、-C(O)C6H5和-C(O)C6H4CH3是酰基基团的非限制性例子。“硫代酰基”以类似的方式定义，但是基团-C(O)R的氧原子已经用硫原子替换，-C(S)R。术语“醛”对应于连接至-CHO基团的如上定义的烷基基团。
术语“烷氧基”表示基团-OR，其中R是烷基，该术语如上面所定义。非限制性的例子包括-OCH3(甲氧基)、-OCH2CH3(乙氧基)、-OCH2CH2CH3、-OCH(CH3)2(异丙氧基)或-OC(CH3)3(叔丁氧基)。在没有“取代的”修饰词的情况下使用的术语“环烷氧基”、“烯基氧基”、“炔基氧基”、“芳氧基”、“芳烷氧基”、“杂芳基氧基”、“杂环烷氧基”和“酰氧基”表示定义为-OR的基团，其中R分别是环烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、杂芳基、杂环烷基和酰基。术语“烷硫基”和“酰基硫基”表示基团-SR，其中R分别是烷基和酰基。术语“醇”对应于如上定义的烷烃，其中至少一个氢原子已经用羟基基团替换。术语“醚”对应于如上定义的烷烃，其中至少一个氢原子已经用烷氧基替换。
术语“烷基氨基”表示基团-NHR，其中R是烷基，该术语如上面所定义。非限制性的例子包括-NHCH3和-NHCH2CH3。术语“二烷基氨基”表示基团-NRR′，其中R和R′可以是相同的或不同的烷基基团。二烷基氨基基团的非限制性例子包括-N(CH3)2和-N(CH3)(CH2CH3)。在没有“取代的”修饰词的情况下使用的术语“酰氨基”(酰基氨基)表示基团-NHR，其中R是酰基，该术语如上面所定义。酰氨基基团的一个非限制性例子是-NHC(O)CH3。
当化学基团与“取代的”修饰词一起使用时，所述基团的一个或多个氢原子已经独立地在每种情况下被-OH、-F、-Cl、-Br、-I、-NH2、-NO2、-CO2H、-CO2CH3、-CO2CH2CH3、-CN、-SH、-OCH3、-OCH2CH3、-C(O)CH3、-NHCH3、-NHCH2CH3、-N(CH3)2、-C(O)NH2、-C(O)NHCH3、-C(O)N(CH3)2、-OC(O)CH3、-NHC(O)CH3、-S(O)2OH或-S(O)2NH2替换。例如，下述基团是被取代的烷基基团的非限制性例子：-CH2OH、-CH2Cl、-CF3、-CH2CN、-CH2C(O)OH、-CH2C(O)OCH3、-CH2C(O)NH2、-CH2C(O)CH3、-CH2OCH3、-CH2OC(O)CH3、-CH2NH2、-CH2N(CH3)2和-CH2CH2Cl。术语“羟基烷基”是被取代的烷基的一个子集，其中一个或多个氢原子已经被羟基(即-OH)替换，使得没有除碳、氢和氧以外的其它原子存在。基团-CH2OH、-CH2CH2OH、-CH(OH)CHOH、-CH2CH(OH)CH3和-CH(OH)CH2OH是羟基烷基基团的非限制性例子。术语“单羟基烷基”是被取代的烷基的一个子集，其中一个氢原子已经被羟基(即-OH)替换，使得没有除碳、氢和一个氧以外的其它原子存在。基团-CH2OH、-CH2CH2OH和-CH2CH(OH)CH3是单羟基烷基基团的非限制性例子。术语“氟代烷基”是被取代的烷基的一个子集，其中一个或多个氢原子已经被氟替换，使得没有除碳、氢和氟以外的其它原子存在。基团-CH2F、-CHF2和-CF3是氟代烷基基团的非限制性例子。术语“单氟烷基”是被取代的烷基的一个子集，其中一个氢原子已经被氟替换，使得没有除碳、氢和一个氟以外的其它原子存在。基团-CH2F、-CH2CH2F和-CH2CH(F)CH3是单氟烷基基团的非限制性例子。术语“氨基烷基”是被取代的烷基的一个子集，其中一个或多个氢原子已经被氨基(即-NH2)基团替换，使得没有除碳、氢和氮以外的其它原子存在。基团-CH2NH2、-CH(NH2)CH3、-CH2CH2NH2、-CH2CH(NH2)CH3和-CH(NH2)CH2NH2是氨基烷基基团的非限制性例子。术语“单氨基烷基”是被取代的烷基的一个子集，其中一个氢原子已经被氨基(即-NH2)基团替换，使得没有除碳、氢和一个氮以外的其它原子存在。基团-CH2NH2、-CH2CH2NH2和-CH2CH(NH2)CH3是单氨基烷基基团的非限制性例子。被取代的芳烷基的非限制性例子是(3-氯苯基)-甲基和2-氯-2-苯基-乙-1-基。基团-C(O)CH2CF3、-CO2H(羧基)、-CO2CH3(甲基羧基)、-CO2CH2CH3、-C(O)NH2(氨甲酰基)和-CON(CH3)2是被取代的酰基基团的非限制性例子。基团-NHC(O)OCH3和-NHC(O)NHCH3是被取代的酰氨基基团的非限制性例子。
当在权利要求书和/或说明书中结合术语“包含”使用时，词语“一个”或“一种”的使用可以表示“一个/种”，但它也与“一个/种或多个/种”、“至少一个/种”以及“一个/种或一个/种以上”的含义一致。
贯穿本申请，术语“约”用于指示，值包括用于测定所述值的装置、方法的误差的固有变异，或在研究受试者或患者之间存在的变异。
“活性成分”(AI)或活性药物成分(API)(也被称作活性化合物、活性物质、活性剂、药学试剂、试剂、生物活性分子或治疗性化合物)是药物中在生物学上有活性的成分。
术语“包含”、“具有”和“包括”是开放式系动词。这些动词中的一个或多个的任何形式或时态，例如“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“具有(has)”、“具有(having)”、“包括(includes)”和“包括(including)”，也是开放式的。例如，“包含”、“具有”或“包括”一个或多个步骤的任何方法并不限于仅具有那一个或多个步骤，并且还涵盖其它未列出的步骤。
当在本说明书和/或权利要求书中使用该术语时，术语“有效的”意指足以实现期望的、预期的或想要的结果。当在用化合物治疗患者或受试者的背景下使用时，“有效量”、“治疗有效量”或“药学有效量”意指这样的化合物的量：当施用给所述患者或受试者时，其足以实现所述疾病的这样的治疗或预防，那些术语在下面定义。
“赋形剂”是与药物、药物组合物、制剂或药物递送系统的活性成分一起配制的药学上可接受的物质。赋形剂可以用来例如稳定组合物，使组合物膨胀(因而当为此目的使用时，经常被称作“增量剂”、“填充剂”或“稀释剂”)，或给最终剂型中的活性成分赋予治疗增强作用，例如促进药物吸收、降低粘度或提高溶解度。赋形剂包括药学可接受形式的抗粘剂、粘合剂、包衣剂、颜料、崩解剂、矫味剂、助流剂、润滑剂、防腐剂、吸附剂、甜味剂和媒介物。作为运输活性成分的介质的主要赋形剂通常被称为媒介物。赋形剂也可以用在制造过程中，例如，辅助活性物质的处理，诸如通过促进粉末流动性或不粘性能，以及辅助体外稳定性，诸如在预期的贮存期限内防止变性或聚集。赋形剂的适用性通常会变化，取决于施用途径、剂型、活性成分以及其它因素。
术语“水合物”在被用作化合物的修饰语时，意指所述化合物具有少于一个(例如，半水合物)、一个(例如，一水合物)或多于一个(例如，二水合物)与每个化合物分子(诸如，所述化合物的固体形式)结合的水分子。
本文中使用的术语“IC50”表示获得最大应答的50％的抑制剂量。该定量量度指示将给定的生物过程、生物化学过程或化学过程(或过程的组分，即酶、细胞、细胞受体或微生物)抑制一半所需的特定药物或其它物质(抑制剂)的量。
第一化合物的“异构体”是这样的单独化合物：其中每个分子含有与所述第一化合物相同的组分原子，但其中那些原子的三维构型不同。
本文中使用的术语“患者”或“受试者”表示活的哺乳动物生物体，诸如人、猴、牛、绵羊、山羊、狗、猫、小鼠、大鼠、豚鼠或其转基因物种。在某些实施方案中，所述患者或受试者是灵长类动物。人患者的非限制性例子是成年人、少年、婴儿和胎儿。
本文中普遍使用的“药学上可接受的”表示这样的化合物、材料、组合物和/或剂型：其在合理的医学判断范围内适合用于与人类和动物的组织、器官和/或体液接触，而没有过度的毒性、刺激、变应性应答或其它问题或并发症，与合理的收益/风险比相称。
“药学上可接受的盐”是指这样的本文中公开的化合物的盐：其如上定义是药学上可接受的，并且其具有期望的药理学活性。这样的盐包括与以下酸形成的酸加成盐：无机酸诸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等；或有机酸诸如1,2-乙烷二磺酸、2-羟基乙磺酸、2-萘磺酸、3-苯基丙酸、4,4′-亚甲基双(3-羟基-2-烯-1-甲酸)、4-甲基二环[2.2.2]辛-2-烯-1-甲酸、乙酸、脂族单和二羧酸、脂族硫酸、芳族硫酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑磺酸、碳酸、肉桂酸、柠檬酸、环戊烷丙酸、乙磺酸、富马酸、葡萄庚糖酸、葡糖酸、谷氨酸、羟乙酸、庚酸、己酸、羟基萘甲酸、乳酸、月桂基硫酸、马来酸、苹果酸、丙二酸、扁桃酸、甲磺酸、粘康酸、邻-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、草酸、对氯苯磺酸、苯基-取代的链烷酸、丙酸、对甲苯磺酸、丙酮酸、水杨酸、硬脂酸、琥珀酸、酒石酸、叔丁基乙酸、三甲基乙酸等。药学上可接受的盐还包括在存在的酸性质子能够与无机碱或有机碱反应时可以形成的碱加成盐。可接受的无机碱包括氢氧化钠、碳酸钠、氢氧化钾、氢氧化铝和氢氧化钙。可接受的有机碱包括乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨丁三醇、N-甲基葡糖胺等。应当认识到，形成本发明的任何盐的一部分的特定阴离子或阳离子不是至关重要的，只要所述盐作为整体是药理学上可接受的即可。药学上可接受的盐的其它例子和它们的制备方法与使用方法呈现于Handbook ofPharmaceutical Salts:Properties,and Use(P.H.Stahl和C.G.Wermuth编,VerlagHelvetica Chimica Acta,2002)。
“药学上可接受的载体”、“药物载体”或简称的“载体”是与活性成分药物一起配制的药学上可接受的物质，其参与运载、递送和/或运输化学试剂。药物载体可以用于改善药物的递送和有效性，包括例如控释技术以调节药物生物利用度、降低药物代谢和/或降低药物毒性。一些药物载体可能提高药物向特定靶部位递送的有效性。载体的例子包括：脂质体、微球(例如，由聚(乳酸-乙醇酸)制成)、白蛋白微球、合成的聚合物、纳米纤维、蛋白-DNA复合物、蛋白缀合物、红细胞、病毒体和树枝状聚合物。
“药学药物”(也被称作药物、药物制品、药物组合物、药物制剂、药物产品、医学产品、药品、医药、药剂或简称的药、药剂或制剂)是用于诊断、治愈、治疗或预防疾病的组合物，其包含活性药物成分(API)(如上定义)，且任选地含有一种或多种无活性成分，它们也被称作赋形剂(如上定义)。
“预防”包括：(1)抑制受试者或患者的疾病发作，所述受试者或患者可能有患所述疾病的风险和/或易患所述疾病，但尚未经历或表现出所述疾病的任何或所有病状或症状；和/或(2)减慢受试者或患者的疾病的病状或症状发作，所述受试者或患者可能有患所述疾病的风险和/或易患所述疾病，但尚未经历或表现出所述疾病的任何或所有病状或症状。
“前药”是指可在体内通过代谢转化为本发明的活性药物成分的化合物。所述前药本身在其前药形式中可能具有或不具有活性。例如，包含羟基的化合物可以作为通过在体内水解而转化成羟基化合物的酯施用。可在体内转化成羟基化合物的合适的酯的非限制性例子包括乙酸酯、柠檬酸酯、乳酸酯、磷酸酯、酒石酸酯、丙二酸酯、草酸酯、水杨酸酯、丙酸酯、琥珀酸酯、富马酸酯、马来酸酯、亚甲基-二-β-羟基萘甲酸酯、龙胆酸酯、羟乙基磺酸酯、二-对甲苯酰基酒石酸酯、甲磺酸酯、乙磺酸酯、苯磺酸酯、对甲苯磺酸酯、环己基氨基磺酸酯、奎尼酸酯和氨基酸的酯。类似地，包含胺基的化合物可以作为通过在体内水解而转化成胺化合物的酰胺施用。
“立体异构体”或“光学异构体”是这样的给定化合物的异构体：其中，相同的原子键合到相同的其它原子上，但其中那些原子的三维构型不同。“对映异构体”是给定化合物的立体异构体，其像左手和右手一样互为镜像。“非对映异构体”是给定化合物的并非对映异构体的立体异构体。手性分子含有手性中心(也被称作立构中心或立体中心)，它是携带多个基团的分子中的任意点(尽管不一定是原子)，使得任意2个基团的互换会产生立体异构体。在有机化合物中，手性中心通常是碳、磷或硫原子，尽管其它原子也可能成为有机和无机化合物中的立构中心。分子可以具有多个立构中心，从而产生它的许多立体异构体。在其立体异构现象可归因于四面体立体中心(例如，四面体碳)的化合物中，假定可能的立体异构体的总数不会超过2n，其中n是四面体立构中心的数目。具有对称性的分子经常具有比立体异构体的最大可能数目更小的数目。对映异构体的50:50混合物被称作外消旋混合物。可替换地，可以对映异构地富集对映异构体的混合物，使得一种对映异构体以大于50％的量存在。通常，使用本领域已知的技术，可以拆分或分离对映异构体和/或非对映异构体。预期对于尚未定义其立体化学的任何立构中心或手性轴，该立构中心或手性轴可以以它的R形式、S形式或作为所述R形式和S形式的混合物(包括外消旋混合物和非外消旋混合物)存在。本文中使用的短语“基本上不含有其它立体异构体”是指所述组合物含有≤15％、更优选≤10％、甚至更优选≤5％、或最优选≤1％的另外一种或多种立体异构体。
“治疗”包括(1)抑制正经历或表现出疾病的病状或症状的受试者或患者的所述疾病(例如，阻止所述病状和/或症状的进一步发展)，(2)改善正经历或表现出疾病的病状或症状的受试者或患者的所述疾病(例如，逆转所述病状和/或症状)，和/或(3)实现正经历或表现出疾病的病状或症状的受试者或患者的所述疾病或其症状的任何可测量的减少。
术语“单位剂量”表示化合物或组合物的制剂，使得该制剂以足以在单次施用中向患者提供单次治疗有效剂量的活性成分的方式制备。可以使用的这样的单位剂量制剂包括、但不限于单个片剂、胶囊剂或其它口服制剂、或具有可注射液体或其它可注射制剂的单个管形瓶。
以上定义替代在通过引用并入本文的任何参考文献中的任何冲突的定义。但是，对某些术语加以定义的事实不应当被认为表示未被定义的任何术语是不确定的。相反，所使用的所有术语均被认为以使得本领域普通技术人员可以明白本发明的范围并实施本发明的方式描述本发明。
V.实施例
包括以下实施例来证实本发明的优选实施方案。本领域技术人员应该理解，在以下的实施例中公开的技术代表发明人发现的在本发明的实践中良好地起作用的技术，因而可以视为构成其实践的优选模式。但是，本领域技术人员考虑到本公开内容以后应该理解，可以在所公开的具体实施方案中做出许多改变且仍然获得类似或相似的结果，而不背离本发明的精神和范围。
实施例1:实验程序和表征数据
A.基于海藻酸盐衍生物的新型生物材料生成库
使用遗传条形码化技术，开发了水凝胶的组合库以鉴定在使用C57BL/6小鼠的临床前纤维化模型中识别度降低的材料。尽管目前尚未完全理解控制抗纤维化性能的物理化学参数，但开发了一种组合生物材料筛选方案来生成基于海藻酸盐的水凝胶库，其中利用几种共价地修饰聚合的海藻酸盐主链上的潜在官能团和性能的逆化学反应。这种合成化学方案能够快速产生多种立体特异性化学结构，并且该反应与海藻酸盐化合物修饰相容。使用具有高古洛糖醛酸含量的低分子量超纯VLVG海藻酸盐(Nova Matrix inc.)作为起始材料，并提出用多种胺、醇、叠氮化物和炔烃合成6872个成员的海藻酸盐类似物库。在初始阶段中，通过始终保持三唑环，合成了总共211种海藻酸盐类似物。在211种独特的海藻酸盐类似物聚合物中，从三种亲水性的基于PEG的接头(类似于报道的具有51种新炔烃的亲水性先导物(Z1-A34))与61种含有三唑的类似物((来自两种疏水性接头，类似于疏水先导物(B1-A21))的组合合成产生了约150种类似物(图1，表2)。使用元素分析和核磁共振光谱法(NMR)表征共价连接的含有三唑的海藻酸盐类似物(图3D、3E)。在确认合成、纯度、溶解度和凝胶形成能力(胶凝测定)以后，选择149种海藻酸盐类似物用于体内筛选目的(图3)。元素分析已经表明，使用优化的反应条件可以对至多20-30％的海藻酸盐进行修饰，从而显著调节材料性能。
在啮齿动物模型中开发了一种新型高通量体内筛选方法，该方法利用人细胞向促纤维化C57BL/6模型啮齿类动物中的异种移植，使用高通量生物材料条形码化和分析在单个植入部位试验多种生物材料。这些方法包括用条形码细胞标记每种生物材料。使用20种不同的独特HUVEC开发了条形码化技术，该技术用于使用下一代测序(NGS)在小鼠和NHP模型中在体内筛选免疫保护性的化学修饰的含有三唑的水凝胶生物材料的大型库。见图。参见图2A。
表2.使用符号的接头和炔烃的表。
表3:关于20个不同的HUVEC供体的信息
表4.合成的海藻酸盐类似物和体内筛选表(小鼠和NHP)
/>
/>
B.材料和方法
试剂.所有化学物质来自美国Sigma Aldrich(除非另外提及)，并不经任何进一步纯化地使用。在本研究中使用的海藻酸盐描述于表5中。
表5.海藻酸盐制剂表.
高通量修饰的海藻酸盐类似物合成.为了生成高分辨率结构-功能关系，合成了211种下一代类似物(含有关键的三唑环)的库，其中包括另外的结构变化，诸如链延伸和差异取代。
用于合成和表征海藻酸盐的通用策略.在有0.5当量的4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物的偶联剂存在下，使用1当量的UPVLVG海藻酸盐和1当量的胺接头(表2中5种不同的胺接头)进行酰胺偶联反应，产生5种不同的胺接头缀合的海藻酸盐聚合物。如下纯化这些接头修饰的海藻酸盐衍生物：使用10-12kDa透析膜透析3天(在盐水和水中)，随后冷冻干燥。通过NMR和元素分析表征了这5种分子的纯度和起始海藻酸盐的修饰百分比。在接下来的步骤中，通过铜催化的点击反应，将1当量的炔烃(45：炔烃)与适当地修饰的海藻酸盐缀合。从合成生成了共211种含有三唑的海藻酸盐衍生物。将所有211种不同的海藻酸盐通过透析进行纯化，然后冷冻干燥，并通过NMR进行化学表征。
用于制备小分子的优化合成.
Z2-A19胺:将3-乙炔基噻吩(1当量,4g,36.98mmol)加入含有420mL的5:1甲醇:水(350mL甲醇和70mL水)(5:1甲醇:水)的1L圆底烧瓶中，随后加入三((1-苄基-4-三唑基)甲基)胺(0.25当量,2.932克，5.52mmol))并搅拌15分钟。这之后加入三乙胺(0.25当量,0.77mL,5.52mmol)和碘化亚铜(0.1当量,422mg,2.22mmol)。在用氩气净化的同时将反应瓶历时15分钟冷却至0℃，然后加入11-叠氮基-peg-2-胺(1当量,5.86mL,36.98mmol)。将反应物在室温搅拌5分钟，随后在55℃搅拌过夜。将反应混合物在上过滤并使用旋转蒸发除去溶剂。然后将粗制反应物通过液相色谱法用0％至40％的二氯甲烷:ultra(22％MeOH在含有3％ NH4OH的DCM中)混合物在120克ISCO硅胶柱上纯化。
Z1-A3胺:将1-溴-2-乙炔基苯(1当量,2g,11mmol)加入含有180mL的5:1甲醇:水(150mL甲醇和30mL水)(5:1甲醇:水)的250mL圆底烧瓶中，随后逐滴加入溶解在24mL的5:1甲醇:水(20mL甲醇和4mL水)中的三((1-苄基-4-三唑基)甲基)胺(0.25当量,1.466克，2.76mmol)并搅拌15分钟。这之后加入三乙胺(0.25当量,0.385mL,2.76mmol)和碘化亚铜(0.1当量,211mg,1.11mmol)。在用氩气净化的同时将反应瓶历时15分钟冷却至0℃，然后加入11-叠氮基-peg-3-胺(1当量,2.193mL,11.05mmol)。将反应物在室温搅拌5分钟，随后在55℃搅拌过夜。将反应混合物在上过滤并使用旋转蒸发除去溶剂。然后将粗制反应物通过液相色谱法用0％至40％的二氯甲烷:ultra(22％ MeOH在含有3％ NH4OH的DCM中)混合物在120克ISCO硅胶柱上纯化。
Z4-A10胺的合成：将1,3-二乙炔基苯(1当量,4g,32mmol)加入含有450mL的5:1甲醇:水(375mL甲醇和75mL水)的1000mL圆底烧瓶中，随后逐滴加入溶解在30mL的5:1甲醇:水(25mL甲醇和5mL水)中的三((1-苄基-4-三唑基)甲基)胺(0.25当量,2.932克，5.52mmol)并搅拌15分钟。这之后加入三乙胺(0.25当量,0.77mL,5.52mmol)和碘化亚铜(0.1当量,422mg,2.22mmol)。在用氩气净化的同时将反应瓶冷却至0℃保持15分钟，然后加入11-叠氮基-peg-4-胺(1当量,6.92mL,32mmol)。将反应物在室温搅拌5分钟，随后在55℃搅拌过夜。将反应混合物在上过滤，并使用旋转蒸发除去溶剂。然后将粗制反应物通过液相色谱法用0％至40％的二氯甲烷:ultra(22％ MeOH在含有3％ NH4OH的DCM中)混合物在120克ISCO硅胶柱上纯化。
B2-A17胺的合成:将3-碘苄基酰胺(1当量,4g,14.8mmol)加入含有24mL的甲醇的50mL圆底烧瓶中，随后相继加入三乙胺(2.4当量,3.6克，35.62mmol)、叠氮化钠(2当量,1.93g,29.68mmol)、水(6mL)、碘化亚铜(0.15当量,423.89mg,2.22mmol)、抗坏血酸钠(0.1当量,293.95,0.1当量，2.97mmol)、1.83ml反式-N-N′-二甲基环己烯-1,2-二胺(0.2当量,422.12mg,2.97mmol)。将混合物抽真空并用氩气冲洗(flashed)3次，并加入(4-(4-(吡啶-2-基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苯基)甲胺(1当量,3.72g,14.8mmol)。将反应物在室温搅拌5分钟，随后在55℃搅拌过夜。将反应混合物在上过滤，并使用旋转蒸发除去溶剂。然后将粗制反应物通过液相色谱法用0％至40％的二氯甲烷:ultra(22％ MeOH在含有3％NH4OH的DCM中)混合物在120克ISCO硅胶柱上纯化。
B1-A51胺的合成:将(4-碘苯基)甲胺(1当量,2g,15.13mmol)加入90mL的甲醇中。将三乙胺(2.4当量,3.67g,36.3mmol)和叠氮化钠(2当量,1.97g,30.3mmol)加入反应瓶中。在先前添加的所有物质溶解之后，将40mL的超纯水加入烧瓶中。将抗坏血酸钠(0.1当量,300mg,1.5mmol)和碘化亚铜(0.15当量,432mg,2.27mmol)加入烧瓶中。通过用氩气在混合物中鼓泡15分钟，用氩气净化烧瓶。将反式-N,N’-二甲基环己烷-1,2-二胺(0.2当量,430mg,3.03mmol)和1-乙炔基-2-甲氧基苯(1当量,2g,15.13mmol)加入烧瓶中。将反应物在室温搅拌5分钟，随后在氩气下在55℃搅拌过夜。将反应混合物在上过滤，并使用旋转蒸发除去溶剂。然后将粗制反应物通过液相色谱法用0％至40％的二氯甲烷:ultra(22％ MeOH在含有3％ NH4OH的DCM中)混合物在120克ISCO硅胶柱上纯化。
Z1-A34胺的合成:将4-炔丙基硫代吗啉1,1-二氧化物(1当量)加入250mL圆底烧瓶中并溶解在甲醇:水混合物(5:1)中。结果，加入三[(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]胺(0.25当量)、三乙胺(0.25当量)和碘化亚铜(0.1当量)。将反应混合物用氩气净化15分钟并冷却至0℃，此后加入11-叠氮基-3,6,9-三氧杂十一烷-1-胺(1当量，6.30g,28.86mmol)。将反应混合物在室温搅拌15分钟并在此后加热至55℃保持过夜。将反应物冷却至室温并穿过过滤以除去任何不溶性部分。将滤液使用旋转蒸发在减压下用硅胶干燥。然后将粗制反应物通过液相色谱法用0％至40％的二氯甲烷:ultra(22％MeOH在含有3％ NH4OH的DCM中)混合物在120克ISCO硅胶柱上纯化，并进一步用ESI质量和NMR质谱法表征。
海藻酸盐反应:将1.5g的VLVG(1当量)溶解在45ml水中。然后将7.65mmol的Z2-A19、Z1-A3(1当量)胺溶解在22.5ml乙腈中并加入混合物中。此后，将4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(0.75当量)的水溶液逐滴加入混合物中。将反应物在55℃搅拌过夜。在减压下除去溶剂并将固体溶解在水中。将溶液穿过氰基-官能化的硅胶垫过滤，并在减压下除去水以浓缩溶液。然后将它在去离子水中用10,000MWCO膜透析3天。在减压下除去水并冻干以得到官能化的海藻酸盐。
甲基丙烯酰基Z1A3(Met-Z1A3)的合成:将2-(2-(2-(2-(4-(2-溴苯基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙烷-1-胺(1当量,1.4克，3.51mmol)加入50mL圆底烧瓶中并用氩气净化3次(各10分钟)。加入25mL无水二氯甲烷，随后在氩气环境下以逐滴方式加入三乙胺(1.5当量,734μL,5.265mmol)和甲基丙烯酰氯(1.5当量,509.6μL,5.265mmol)。将反应物搅拌5-6小时，随后使用0％至40％的二氯甲烷:ultra(22％ MeOH在含有3％NH4OH的DCM中)混合物在40克ISCO硅胶柱上纯化以得到约1克无色固体(Met-Z1A3)。通过质谱法和NMR表征化合物以证实质量和纯度。
甲基丙烯酰基B2-A17(Met-B2-A17)的合成:将(3-(4-(吡啶-2-基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)苯基)甲胺)(1.2克，4.78mmol,B2-A17)加入50mL圆底烧瓶中并用氩气净化3次(各10分钟)。加入25mL无水二氯甲烷(30mL)，随后在氩气环境下以逐滴方式加入三乙胺(1.5当量,7.17mmol,999.6μL)和甲基丙烯酰氯(1.5当量,7.17mmol,693.99μL)。将反应物搅拌5-6小时，随后使用己烷/乙酸乙酯(1:0至0:1)在40克ISCO硅胶柱上纯化以得到约1克无色固体(Met-B2-A17)。通过质谱法和NMR表征化合物以证实质量和纯度。
小分子对海藻酸盐的官能化：
用Z4-A10胺对海藻酸盐进行官能化：将1.5g的UP-VLVG(1当量)溶解在45mL水中。然后将7.65mmol的Z4-A10(1当量)胺溶解在22.5mL乙腈中并加入混合物中。此后，将4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(0.75当量)的水溶液逐滴加入混合物中。将反应物在55℃搅拌过夜。在减压下除去溶剂，并将固体溶解在水中。将溶液穿过氰基-官能化的硅胶垫过滤。然后将溶液在去离子水中用10,000MWCO预处理的透析管透析3天。将透析的溶液在-80℃冷冻并冻干直到干燥。
用B1-A51胺对海藻酸盐的官能化:将1.5g的UP-VLVG(1当量)溶解在45mL水中。然后将7.65mmol的B1-A51(1当量)胺溶解在22.5mL乙腈中并加入混合物中。此后，将4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(0.75当量)的水溶液逐滴加入混合物中。将反应物在55℃搅拌过夜。在减压下除去溶剂，并将固体溶解在水中。将溶液穿过氰基-官能化的硅胶垫过滤。然后将溶液在去离子水中用10,000MWCO预处理的透析管透析3天。将透析的溶液在-80℃冷冻并冻干直到干燥。
用Z1-A34胺对海藻酸盐的官能化:将2g(1当量)的UP-VLVG(BP-1903-04；Novamatrix)溶解在水(75mL)中。然后在涡旋下将Z1-A34小分子(3.99g,10.20mmol,1当量)溶解在水中。使用HCl将Z1-A34溶液的pH调至7.4。然后在搅拌的同时将Z1-A34水溶液缓慢地加入UP-VLVG溶液中。然后将(4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基-吗啉鎓氯化物)(DMTMM,0.5当量)的溶液逐滴加入UP-VLVG和Z1-A34的混合物中。将反应物加热至55℃并搅拌过夜。将溶液穿过氰基-官能化的硅胶垫过滤。然后将溶液在烧杯中使用盐水(2天)和mili-Q水(3天)用10,000MWCO预处理的透析管透析。将透析的溶液在-80℃冷冻并冻干直到干燥。
胶凝测定.在荧光团保留测定中，试验了211种海藻酸盐类似物在钡存在下有效交联以形成水凝胶的能力。将100μl的1％(w/v)修饰的海藻酸盐聚合物在0.9％盐水中的溶液分配到96孔平板中。将1μl的1％(w/v)罗丹明B在DMSO中的溶液加入每个孔中；随后加入50μl的1M氯化钡溶液，然后在定轨摇床上温育10分钟。将孔用去离子水洗涤3次，然后进行荧光测量(ex:540nm/em:580nm)。先前合成的UPVLVG海藻酸盐将用作阳性对照；去离子水作为阴性对照。
使用表面等离子体清洁用Met-Z1-A3/Met-B2-A17涂布导管.使用手术刀片将钡浸渍的硅橡胶导管(心房远侧导管,Ref#821670)导管切成相同长度片段。为了进行化学修饰，导管经过3次持续1分钟的等离子体处理，在暴露之间旋转以覆盖所有侧面，其中使用在600-700毫巴压强的高射频频率(扩展等离子体清洁器，HarrickPlasma，P/NPDC-001)，并立即滴入0.02M的Met-Z1-A3/Met-B2-A17在5％ DMSO的甲苯溶液中的溶液中。将反应物在搅拌下保持2小时，并将植入物在甲醇中彻底洗涤1次，在乙醇中彻底洗涤3次，用无菌级水彻底洗涤3次，并最后再次用无菌级乙醇洗涤。最后，将植入物真空干燥过夜。
涂布的和未修饰的导管的扫描电子显微术
将未修饰的导管样品粘贴到SEM针座上，用气枪轻轻处理以除去微粒，并使用Denton Desk V溅射系统(Rice SEA)溅射Au。对每个涂布的导管组重复此操作。使用JEOL6500F扫描电子显微镜对溅射的导管进行成像。
未修饰的和涂布的导管的XPS
X-射线光电子光谱法(XPS)是一种表面敏感的光谱方法，当样品受到单能X射线照射时，造成从材料的表面发射出光电子，所述方法定量地测量在任何材料的表面处(在6nm范围内)的元素组成。通过PHIQuantera XPS分析未涂布的、Met-Z1-A3涂布的、Met-B2-A17涂布的植入物的元素组成。使用1100eV、200μm斑尺寸、50W 15kV离子枪中和的测量技术进行分析。
未修饰的和涂布的导管的ToF-SIMS
使用ToF-SIMS NCS仪器进行正和负高质量拆分波谱，该仪器组合了TOF.SIMS5仪器(ION-TOF GmbH,Münster，德国)和莱斯大学(Rice University)共享设备授权的原位扫描探针显微镜(NanoScan，瑞士)。使用成束的30keV Bi3 +离子(测量电流为0.2pA)作为主探针，用于分析250×250μm2的视场、128x2128像素的光栅，并遵守静态限制1.1012离子/cm2以不损伤表面。在分析过程中已经应用了电子泛滥枪的电荷补偿，并使用表面电势对电荷效应进行了调整。周期时间固定为100μs(对应于m/z＝0-1102a.m.u质量范围)。
用先导分子涂布的导管的材料表征和评价.
XPS结果显示，涂有小分子的导管中的氮含量高于未涂布的导管，这表明含氮小分子向导管的有效附着(图14B)。此外，含溴的Z1-A3涂布的导管中的Br-含量增加支持小分子向导管表面的附着。XPS结果进一步得到Tof-SIMS结果的支持，显示与未涂布的导管相比，小分子涂布的导管中更高的CN-含量和含溴的Z1-A3涂布的导管中更高的Br-含量(图14C、图15A、图15B)。另外，Met-Z1-A3和Met-B2-A17导管看起来比从SEM图像(图15C)观察到未修饰的导管更光滑，可能是由于在涂布过程中除去了微观凸块。
细胞培养和繁殖.将来自20位不同供体的人脐静脉内皮细胞(HUVEC,CC-2517,LONZA,MD，美国)(表3)在VEGF培养基完整试剂盒(LL-0003，Lifeline CellTechnology,CA，美国)中培养。将HUVEC传代培养以进行扩增，并维持在37℃、5％ CO2气氛的保湿培养箱中。每周更换培养基3次。
20位供体的SNP概况
设计了30-重单核苷酸多态性(SNP)小组，通过多路PCR反应和下一代测序(NGS)来唯一鉴定HUVEC供体。从1000个基因组数据库下载SNP基因座，并从国家生物技术信息中心(NCBI)网站获取基因组序列。选择SNP，使得次要等位基因的群体等位基因频率为10％和90％，并且它们的基因座均匀分布在1-22号染色体上。
使用DNeasy试剂盒(Qiagen，目录号69054)从20个不同的HUVEC供体中提取基因组DNA(gDNA)。对于每位供体，将100ng的gDNA加入50μL的PCR反应混合物中，每种引物的浓度为50nM，并添加Phusion Hot Start Flex 2X Master Mix(NEB，目录号M0536L)。PCR反应条件包括在98℃活化30秒，以及20个在98℃变性30秒、在63℃退火2分钟和在72℃延伸1分钟的循环，并用在72℃温育5分钟(缩短为98℃:30s-(98℃:10s-63℃:2min-72℃:1min)x20-72℃:5min-4℃:保持)结束反应。使用Monarch PCR和DNA净化试剂盒(5μg)(NEB，目录号T1030S)纯化PCR产物。然后根据制造商的方案，使用用于Illumina的NEBNext Ultra IIDNALibrary Prep Kit(NEB，目录号E7645S)在Illumina Miseq平台上制备纯化的PCR产物用于NGS。在Agilent 2100生物分析仪上进行库定量和质量控制。然后以大约5000倍深度进行深度测序，以建立20个不同的HUVEC供体的SNP图谱。
在修饰的海藻酸盐内的HUVEC封装.
用于小鼠的胶囊制造.对于每轮筛选，试验了20种不同的材料，在C57BL/6J小鼠中筛选了总共149种材料。因此，每一轮，使用20个不同的HUVEC供体为每种材料创建相应的细胞条形码。将修饰的海藻酸盐最初以3-5％w/v溶解在0.8％盐水中，并然后与3％w/vSLG100(也溶解在0.8％盐水中)以70％修饰的海藻酸盐:30％ SLG100的体积比掺合。将海藻酸盐溶液通过穿过0.2-μm过滤器过滤进行灭菌。在即将封装之前，将培养的HUVEC在250G离心5分钟，并用不含Ca的Krebs缓冲液(4.7mM KCl,25mM HEPES,1.2mM KH2PO4,1.2mMMgSO4·7H2O,135mM NaCl)洗涤。洗涤后，再次离心细胞，并吸出所有上清液。然后将细胞沉淀物以每0.5ml海藻酸盐溶液5×106个细胞的细胞密度(约40,000个细胞/胶囊)重新悬浮在海藻酸盐溶液中。每个HUVEC供体用相应的修饰的海藻酸盐溶液封装。使用电喷雾机(泵11Pico Plus,Harvard Apparatus,MA，美国)制成海藻酸盐胶囊。将18G钝头针连接到含有海藻酸盐溶液的1-ml路厄锁注射器，该注射器夹在注射泵上，所述注射泵垂直放置在150ml交联溶液浴(20mM BaCl2,250mM D-甘露醇,25mM HEPES，含有0.01v/v％吐温20)中。将电压发生器连接到针尖并接地到交联浴。注射泵的设置为在15～20cm高度处5ml/小时流速。通过调整5.5至7kV之间的电压，使每个胶囊的细胞密度保持一致。在交联浴中形成胶囊后，收集它们，并然后用HEPES缓冲液(25mM HEPES(Gibco,Life Technologies,California，美国),1.2mM MgCl2×6H2O,4.7mM KCl,132mM NaCl)洗涤3次，并用培养基洗涤3次，并在37℃培养箱中培养过夜用于移植。将每种材料的10个胶囊等分并混合到一个2ml管中，并将该200个胶囊的混合物用于植入。在即将植入小鼠腹腔中之前，将胶囊用0.9％盐水洗涤另外2次。将所有材料在明视野显微术下观察，以验证均匀的细胞密度和胶囊的尺寸。
对于微胶囊植入，使用了从小鼠筛选中鉴定出的前十种先导材料和两种对照(SLG20和Z1-A34)。将修饰的海藻酸盐以3～5％w/v溶解在0.8％盐水中，并以70:30比例与3％w/v SLG 100掺合。将SLG20以1.4％w/v溶解在0.8盐水中。使用配制的海藻酸盐溶液制备300～500μm大小胶囊。封装程序与1.5mm大小胶囊相同，不同之处是，微胶囊使用30G针头，流速为200μL/min。洗涤后，将400μL微胶囊等分并植入小鼠腹膜内腔空间内2周。
NHP植入物的胶囊制造：通过以特定比例混合两种不同的HUVEC供体，可以创建来自20个不同供体的400种不同的供体组合来标记生物材料。为了确认混合供体鉴定的可行性，试验了不同的比例(1:2、1:3和1:4)，并确定哪些比例可以通过NGS检测到。用三种细胞系做出总共九种组合(图9A)。一旦正确的比例被等分到其各自的试管中，就使用SLG20创建九个不同比例的胶囊，然后进行在上一部分中提到的封装方案。包括20个单独HUVEC供体，可以生成总共400个细胞条形码组合，并将400个中的100个细胞条形码用于NHP研究。创建了总共100个细胞条形码，并将这些HUVEC混合物分别用100种不同的材料封装。每个胶囊的细胞密度固定为60,000个细胞/胶囊，其中包括供体1的20,000个细胞和供体2的40,000个细胞，遵循在上一部分(小鼠研究)中描述的相同封装方法。将每种材料30个胶囊混合到一个T225烧瓶中，并将这些混合的胶囊准备用于腹膜内植入。将所需数目的胶囊等分到烧瓶中以后，将这些样品过夜运输以植入NHP中。
供体条形码化的优化和鉴定
通过组合来自20种供体的两种不同供体，如上所述创建了总共400个供体对。首先，为了试验混合供体的可行性，在体外优化了两种供体的掺合比例。本研究使用具有三种不同掺合比例(1:2、1:3、1:4)的三种供体组合(H15和H16、H16和H17、H15和H17)，并随后试验了总共9种不同的条件(图9A)。混合来自每组的1个胶囊，并对9个胶囊的供体对进行分析(样品编号1-9)。试验了三种不同的混合比例，以找到具有更高鉴定置信度(优良度水平)的最佳条件。应用对数似然分析以对供体身份进行解卷积。所有样品都用其匹配的供体对成功地鉴定。随着两个混合池的细胞密度彼此距离越来越远，优良度水平降低。将供体1:供体2的掺合比例设置为1:2作为进一步实验的最佳条件(图9B-9D)。
接下来，在优化的体外条件下，在小鼠体内试验了三种不同材料的鉴定可行性。制备了以1:2比例封装两个供体对的三种材料(Z1-A34：减轻FBR的阳性对照，PVLVG:未修饰的对照，和B1-A51：不能减轻纤维化的阴性对照)。将三种材料的混合物(每只小鼠20个胶囊/材料)植入小鼠(M1-M3)的腹膜内空间中两周(图10A和图10B)。取出胶囊以后(图10C)，根据纤维化水平将它们分成三组(图10D)。选择了总共45个胶囊进行供体鉴定，并确定了相应的材料(图10E和图10F)。在400个供体组合中，成功鉴定出43/45(95.6％)的供体对，从而提示，这种混合的供体条形码化策略可以应用于在更大的动物模型中筛选数百种材料。该组群的结果表明，先前公开的Z1-A34(免疫保护材料)具有最高数目的低纤维化囊，其次是UP-VLVG(未修饰的海藻酸盐)。使用这种双条形码化策略筛选数百种材料的能力将指数式扩展筛选的高通量潜力，以鉴定减轻FBR的材料。
使用先导材料的人胰岛封装：在PIM(S)培养基(Prodo Labs)中培养人胰岛(来自Prodo Labs)供进一步使用。将培养的胰岛在1200rpm离心3分钟，并用不含Ca的Krebs缓冲液洗涤。然后再次对胰岛进行离心。然后将胰岛沉淀物重新悬浮于5％的Z4-A10溶液(与3％SLG100以70:30的比例掺合)中，胰岛密度为每1mL海藻酸盐溶液5,000个胰岛。使胶囊在BaCl2溶液中交联，并将其尺寸调整为1.5mm。在交联后，将胶囊用HEPES洗涤3次，并用培养基再次洗涤2次。由于胰岛具有可变的尺寸(50～400μm)，因此重新计数封装的胰岛的总数并转换成胰岛当量(IEQ)(图12)。每个胶囊的平均IEQ为约10IEQ/胶囊(1倍)。为了制备高密度胶囊(2倍和4倍密度)，将海藻酸盐体积分别减少至0.5mL和0.25mL，同时保持相同的IEQ。最后，用Z4-A10修饰的海藻酸盐制备了约20个IEQ/胶囊(2倍)和约40个IEQ/胶囊(4倍)。使用SLG20作为对照材料，采用相同的封装方法和胰岛密度。
DNA提取(体外)的优化：为了增加从单个胶囊中提取的gDNA的量，使用DNesay试剂盒(Qiagen，目录号69054)优化了不同的参数。新鲜胶囊和速冻胶囊在有或没有裂解条件下进行对比。将在10mM HEPES溶液中的50mM EDTA用于裂解胶囊，并然后在250G离心5分钟。仅沉淀的细胞用于以下DNA提取过程。在匀浆化以后也使用未裂解的胶囊作为对比。其次，用不同的洗脱温度设置(RT相对于56℃)试验了收率。最后，对比每个胶囊的不同细胞数目(每个胶囊5,000、10,000、20,000、40,000和80,000个细胞)，以确定体内研究的最佳细胞密度。
从单个胶囊提取DNA的优化及NGS鉴定
由于单个水凝胶胶囊含有来自不同HUVEC的独特基因型，因此从每个胶囊中提取gDNA是鉴定每种材料的条形码的重要第一步。
细胞存在于交联的水凝胶基质内，这使得从水凝胶中分离细胞具有挑战性。通过对比裂解组成、细胞密度和提取温度，优化细胞分离和gDNA提取步骤以增加gDNA含量(图4)。使用植入前HUVEC胶囊来对比不同条件下的DNA提取效率。首先，用EDTA溶液解离每个胶囊。在从单个胶囊中提取DNA之前用EDTA裂解胶囊会将DNA提取效率提高约5倍(图4A)。此外，速冻胶囊显示出与新鲜样品相似的DNA含量水平，从而证实了外植胶囊可以在速冻步骤之后储存以供将来使用。另外，对比不同的洗脱条件以增加提取的DNA量(图4B)。当用56℃预热的洗脱缓冲液洗脱样品时，DNA含量增加。此外，随着洗脱体积增加，总DNA量增加。但是，增加洗脱体积会降低DNA浓度，并选择100μl洗脱缓冲液作为进一步分析的最佳体积。最后，通过对比不同的细胞密度条件来调整每个胶囊的细胞数目(图4C)。随着每个胶囊的细胞密度增加，提取的DNA含量升高。但是，总DNA收率降低，因此将约20,000个细胞/胶囊设置为封装的最小细胞密度。应用优化的条件从外植胶囊中提取gDNA，并将这些提取的gDNA样品用于优化NGS方法。
从体外和体内外植胶囊中成功提取DNA，其具有高质量和足够的人DNA含量，用于聚合酶链式反应(PCR)扩增，随后通过NGS进行SNP基因分型。此外，NGS库制备经过优化，即使在低DNA输入的情况下也能增加命中目标率(图5)。最后，生物信息学流程显示了用于材料/供体鉴定的NGS分析过程的高通量策略(图6)。
NGS库制备工作流程的优化：由于从胶囊中提取的DNA处于低浓度，并且用于构建NGS库的输入通常低于1ng，因此PCR反应更容易出现引物二聚体，特别是在多路PCR中。在此，优化了库制备工作流程以减少引物二聚体。第一个PCR使用含有5'-突出端序列的多路引物扩增SNP。调整第一个PCR的引物浓度、PCR循环和退火时间，以减少从多路PCR可能产生的引物二聚体。在平板上纯化之后，第二个PCR如下修正位置条形码：使用包含hamming条形码序列和与SNP引物的5'-突出端区域退火的序列的行特异性和列特异性引物进行扩增。也调整了第二个PCR的扩增循环。
植入/移植外科手术.
在C57BL/6J小鼠中腹膜内植入混合胶囊：所有小鼠实验得到莱斯大学动物护理和使用机构委员会(lACUC)批准。将免疫活性的雄性C57BL/6J小鼠首先称重，并在加热垫上用在氧气中的1-4％异氟烷麻醉。根据他们的体重皮下施用丁丙诺啡(0.5mg/kg剂量)。将其腹部剃毛并分别用聚维酮碘和异丙醇擦洗消毒3次。使用锋利的刀片在皮肤中切开0.5-10cm中线切口。然后用镊子夹住腹膜壁并沿着白线切开5mm切口。然后将0.5ml体积的胶囊植入腹腔中。使用可吸收的缝线缝合腹部肌肉。然后用缝线闭合皮肤。
导管样品在C57BL/6小鼠中的皮下植入:将未修饰的和涂布的导管植入n＝6只C57BL/6小鼠(Charles River Labs)的皮下空间中。具体来说，在每只小鼠的背部制作一个切口部位，并为每个导管植入物制作一个单独的皮下袋。将切口缝合，并根据莱斯动物资源设备(Rice Animal Resource Facility)标准对小鼠进行监测和护理。
在STZ-诱导的糖尿病C57BL/6J小鼠中的腹膜内植入人胰岛素胶囊和血糖监测:为了创建胰岛素依赖型糖尿病小鼠，用链脲霉素(STZ)处理健康的C57BL/6J小鼠。连续五天，将7.5mg/ml浓度的STZ溶液(50mg/kg的STZ)注入腹膜内空间。在禁食一小时后测量所有小鼠的血糖(BG)水平和重量。只有在连续两天中BG水平高于350mg/dL的小鼠才被认为患有糖尿病并用于胰岛移植。将200个含有人胰岛的胶囊植入糖尿病小鼠(每只小鼠约2,000IEQ)中，作为1倍组。此外，为2倍和4倍组植入100个胶囊(约20个IEQ/胶囊)和50个胶囊(约40个IEQ/胶囊)，保持每只小鼠相同的IEQ数(每只小鼠约2,000IEQ)。在移植含有Z4-A10和SLG20胶囊的胰岛后，每周监测3次BG水平。具有低于250mg/dL的BG水平的小鼠被认为血糖正常。持续监测，直到所有小鼠已经恢复到高血糖状态，在此时它们被安乐死，并取回胶囊。小鼠在体内葡萄糖耐量试验之前禁食4小时。每只小鼠通过尾静脉注射以1.5g/kg施用30％无菌葡萄糖盐水溶液的单次推注剂量。在葡萄糖注射后2小时内每15分钟测量一次血糖水平。
通过腹腔镜将胶囊植入NHP的腹膜内空间：在预定外科手术的当天，对NHP(雄性毛里求斯食蟹猴)进行镇静和麻醉(按照批准的动物方案)。将前腹部从剑突到耻骨剃毛并准备好。进行脐上小切口(2cm)，并插入5-12mm套管针。用CO2在10-14mmHg的压强产生气腹。在用加热的盐水预热后，将照相机通过套管针插入腹腔中。在腹腔镜检查下，另切2个小切口(1-2cm)(在左和右胁腹)，并将5-12mm套管针插入腹腔中。将通过有机硅管连接到注射器的2mL无菌移液器通过套管针插入腹腔中。胶囊均匀分布在以下空间：肝周、胃后、脾周、左侧和结肠flexium、网膜和小肠后。然后使用Vicryl 3-0(对于肌肉)和4-0Vicryl(对于皮肤)(表皮下)，通过分层缝合来缝合三个小切口。手术室(OR)工作人员、兽医人员和技术人员跟踪动物的康复情况。在本研究中涉及非人灵长类动物的护理和使用的动物方案在开始前得到了伊利诺伊大学芝加哥分校(University of Illinois-Chicago，UIC)机构动物护理和使用委员会(IACUC)的审查和批准。根据UIC实验动物护理和使用指南进行所有动物程序。
材料取出.
从腹膜内空间取出胶囊：在植入的特定阶段，将每轮中的5只小鼠在CO2施用下安乐死，随后颈椎脱位。然后使用镊子和剪刀沿着腹部皮肤和腹膜壁切开切口。然后使用Ca+Krebs缓冲液从腹部洗出所有材料胶囊并放入培养皿中进行收集。确保所有胶囊都被洗掉或手动回收后，将它们转移进50ml锥形管中。经过几个Krebs缓冲液洗涤步骤后，对混合的外植胶囊进行处理以进一步成像和选择。
通过腹腔镜检查技术从NHP的腹膜内腔中取出胶囊：对NHP进行镇静和麻醉(按照批准的方案)。将前腹部从剑突到耻骨剃毛并准备好。进行2cm脐上切口，并插入5-12mm套管针。用CO2在10-14mmHg的压强产生气腹。在用加热的生理盐水预热后，将照相机通过套管针插入腹腔中。在腹腔镜检查下，(在左或右胁腹)切开另一个切口(1-2cm)，并将5-12mm套管针插入腹腔中。拍摄腹腔镜检查图像和视频来记录微胶囊分布。将20-30cc生理盐水用于在腹腔镜下冲洗可能存在于盆腔空间中且可能已经从小囊漏出的任何游离胶囊。在本研究中涉及非人灵长类动物的护理和使用的动物方案在开始前得到了伊利诺伊大学芝加哥分校(University of Illinois-Chicago，UIC)机构动物护理和使用委员会(IACUC)的审查和批准。根据UIC实验动物护理和使用指南进行所有动物程序。
导管外植体的加工、固定和组织学：在4周时通过小心地将导管和附着的组织一起取出来外植导管。皮下导管外植体牢固地附着至皮肤，并覆盖有轻微粘附在肌肉上的薄膜(图15)。将导管周围的组织从导管切下约3mm，并将附有皮肤的导管从小鼠移除。将外植体用10％福尔马林(Sigma)固定4天，然后转移至PBS中。进一步的处理、切片和组织学由Baylor病理学和组织学中心完成。具体而言，将样品石蜡包埋，沿导管的横截面轴切片，并用苏木精和曙红染色剂染色。
外植材料胶囊的成像和选择：对于相差成像，使用Krebs缓冲液轻轻洗涤胶囊并转移进35mm培养皿中，使用Leica显微镜进行明视野和暗视野成像。根据在胶囊表面上的纤维化过度生长水平，将胶囊手动分为三个不同的组(L：低纤维组织形成组，M：中纤维组织形成组，和H：高纤维组织形成组)。选择具有低纤维化的透明胶囊(L组)进行速冻并用于DNA提取，另外将剩下的胶囊用液N2速冻并在-80℃储存以供进一步使用。
活/死细胞染色：对活/死测定染色的细胞进行荧光成像，以检查植入前或植入后胶囊中封装的HUVEC生存力。将每种材料的5个胶囊用DPBS洗涤并用在完全培养基中的2μM钙黄绿素AM和4μM EthD-1染色。将胶囊温育30分钟，并使用带有荧光滤光片的EVOS显微镜进行成像。将活细胞使用GFP滤光片成像为绿色，将死细胞使用Texas-Red滤光片成像为红色。(外植胶囊-NSG小鼠)对于来自NSG小鼠的外植胶囊，将胶囊用Ca+Krebs缓冲液洗涤3次，并然后在染色溶液中温育。将每只小鼠的胶囊转移进35mm培养皿中并用DPBS洗涤两次。将它们在2倍放大率下成像，并将获得的图像缝合以观察整个培养皿。
双硫腙染色：将外植的胰岛胶囊用双硫腙(DTZ)染色。将5mg的DTZ溶解于1mL二甲亚砜(DMSO)中，充分混合，并温育5分钟。将4mL的DPBS加入到混合溶液中并通过0.22μm过滤器过滤。将胰岛胶囊置于35mm培养皿中，并用PBS洗涤3次。然后将胶囊在DTZ溶液中温育5分钟，并用DPBS洗涤3次以除去背景染色。用Leica显微镜对染色的胶囊进行成像。
从回收的微胶囊中提取蛋白并定量胶原含量：使用RIPA缓冲液(目录号89901,Thermo Scientific,PA，美国)裂解沉积在微胶囊表面上的细胞/组织，以提取蛋白。简而言之，使用100μl微胶囊与200μl含有HaltTM蛋白酶抑制剂混合液(目录号78430,ThermoScientific,PA，美国)的裂解缓冲液的比例从胶囊裂解细胞。将裂解物在12000rpm在4℃离心20分钟，并将上清液转移至新管中。将沉淀物用相同体积的裂解缓冲液洗涤，并然后在12000rpm在4℃离心20分钟。将上清液与前一上清液合并，并将提取的蛋白于-80℃储存以备将来使用。使用BCA测定(Pierce BCA蛋白测定试剂盒，目录号23225,ThermoScientific,PA，美国)对裂解物中的蛋白浓度进行定量。将来自每个样品的含有20μg蛋白量的裂解物用水稀释至100μL，与37％盐酸以1:1的比例混合，并然后在120℃水解3小时。根据制造商的说明书，使用羟基脯氨酸测定试剂盒(目录号MAK008,Sigma-Aldrich,MO，美国)使用得到的溶液测定回收的微胶囊的胶原含量。测量在560nm处的吸光度，并从所有读数中减去羟基脯氨酸标准品的空白值。从羟基脯氨酸标准曲线确定羟基脯氨酸含量。
共焦成像的免疫荧光染色：对于免疫荧光染色，将回收的微胶囊用Krebs缓冲液洗涤，并在4％低聚甲醛中于4℃固定过夜。将样品用PBS洗涤3次，并将细胞用1％ Triton X-100在室温下透化15分钟。在用PBS洗涤后，将样品在1％牛血清白蛋白(BSA)溶液中在室温温育1小时以进行封闭，并然后与含有抗体混合液(在1％ BSA中稀释的1:200Alexa Fluor488抗-小鼠CD68抗体(目录号137012,BioLegend,CA，美国)、1:200抗-小鼠α-平滑肌-Cy3(目录号C6198,Sigma-Aldrich,MO，美国)，以及2滴/ml的DAPI(NucBlue Fixed CellReadyProbes Reagent，目录号R37606,Invitrogen,CA，美国))的染色溶液一起在室温温育1小时。用0.1％吐温20溶液洗涤后，将样品用PBS洗涤两次，并转移至玻璃底24-孔平板中的50％甘油溶液中进行成像。将Nikon A1-Rsi共焦显微镜用于免疫荧光成像。
对回收的导管进行组织学处理(苏木精和曙红和Masson的三色染色)，并对导管上的组织过度生长进行基于组织学的评估：使用Leica M165C光学显微镜对导管外植体的染色切片进行成像。为了确定在导管上的组织过度生长的程度，使用Image J软件测量在导管和皮肤层之间的紫色组织的暗带。该方法是基于Xie等人的发现，其显示直接邻近皮下植入物的组织带用苏木精和曙红染色为深紫色，并用三色染色为蓝色(Xie等人,2018)。用三色染成蓝色意味着该组织带富含胶原，这又提示该组织指示纤维化过度生长。由于这种相关性，测量了深紫色组织并用于评估对不同涂布导管的相对免疫应答。
具体来说，旋转导管截面图像以使相邻皮肤组织向下成角度。对每张图像的深紫色组织带进行三次沿着皮肤组织等距的测量，，并取平均值以避免任意测量一个点。测量刻入图像中的比例条的长度，用于将Image J像素测量值转换为毫米。应当指出，某些切片具有大的、浅紫色的组织带，其走向更垂直于导管。在测量过程中要特别避免这些，因为它们是切口瘢痕组织的一部分。
从外植胶囊中提取DNA并进行RT-qPCR.对于从单个胶囊中提取DNA，本研究应用了优化的方法。将来自外植前或外植后胶囊的封装细胞在50mM EDTA中裂解15分钟，并以5000rpm离心10分钟。吸出上清液，将细胞沉淀物悬浮于200μl的PBS中。根据制造商的说明书并进行少量修改作为优化过的条件，使用DNeasy试剂盒(Qiagen，目录号69504)从单个胶囊中分离总gDNA。简而言之，将细胞悬浮液在室温用蛋白水解酶K和RNA酶A裂解5分钟，并在56℃用裂解缓冲液温育20分钟。添加乙醇后，将上清液转移进柱中并用洗涤缓冲液洗涤两次。用在56℃加热的洗脱缓冲液收集DNA，并在-20℃储存以供进一步使用。从100μl回收的微胶囊(300-400μm大小)中提取总RNA。将速冻胶囊在冰上解冻，匀浆化，并根据制造商的说明书使用RNeasy Mini Kit(Qiagen，目录号74104)处理。将提取的RNA使用高容量cDNA反转录试剂盒(Applied Biosystems，目录号4368814)转化为cDNA用于RT-qPCR。使用在10μL反应体积中的3μL的gDNA/cDNA和SYBR Green(PowerUp SYBR Green Master Mix；AppliedBiosystems，目录号A25741)进行实时qPCR，以量化PCR产物。在以下条件下进行PCR：在95℃保持10秒，在48℃保持20秒，在72℃保持30秒(40个循环)，在72℃保持5分钟，在65℃保持5秒，最后一个循环在95℃。一式三份进行所有反应。使用2-ΔΔCT方法分析数据，并在归一化至小鼠b-肌动蛋白(ActB)和SLG20(对照)以后对比相对RNA水平。在本研究中使用的引物列于表6中。
表6.RT-qPCR引物的列表
NGS分析以鉴定具有低纤维化的免疫调节性海藻酸盐类似物.
NGS库制备.使用qPCR作为样品质量控制程序半定量地评价单个胶囊中的DNA含量，Ct值与提取的DNA含量呈负相关。具有可扩增的DNA含量的样品将经过两个PCR步骤来扩增目标扩增子并对其进行条形码标记。对于在96孔PCR板的各个孔中的每个胶囊的DNA，使用靶向30个非致病性SNP的30-重引物进行第一个PCR，这些SNP的基因型图谱将唯一地鉴定HUVEC供体(表7)。所述30-重引物都含有5'-突出端序列以将通用结合结构域掺入目标扩增子中。反应混合物包含各在50nM浓度的30-重SNP引物和1X的Phusion Hot Start Flex 2XMaster Mix。反应条件为在98℃活化30秒，和7个在98℃变性30秒、在63℃退火5分钟、在72℃延伸1分钟的循环，并通过在72℃温育5分钟(缩短为98℃:30s-(98℃:10s-63℃:5min-72℃:1min)x7-72℃:5min-4℃：保持)完成反应。将1.2倍体积比的AMPure XP磁珠(BeckmanCoulter，目录号A63881)加入第一个PCR产物中。将悬浮液在室温温育5min，然后置于磁力架上分离并弃去上清液。将剩余的磁珠用80％乙醇洗涤两次，并用水洗脱DNA内容物。第二个PCR使用携带突出端Hamming代码序列的引物对胶囊样品进行独特条形码化。总共12种带条形码的列特异性的正向引物和8种带条形码的行特异性的反向引物被设计为彼此之间具有至少3的距离，这允许12x8＝96个胶囊的条形码化。反应条件为98℃:30s-(98℃:10s-63℃:1min-72℃:1min)x20-72℃:5min-4℃:保持)，引物浓度为400nM，Phusion Hot StartFlex 2X Master Mix为1X。行和列条形码唯一地确定在96-孔平板上的样品位置，并因此可以从所有孔汇集带条形码的扩增子，形成含有来自96个不同胶囊样品的SNP信息的单个库(表8)。如上所述，使用AMPure XP磁珠以1.0倍体积比纯化产物。
通过基于连接的方法修改Illumina测序适配器，并根据生产商的方案使用用于Illumina的NEBNext Ultra IIDNA库制备试剂盒(NEB，目录号E7645S)通过PCR添加库索引。在Agilent 2100生物分析仪上进行库定量和质量控制。
表7.SNP信息和SNP引物序列.
/>
/>
/>
/>
表8.位置条形码化引物序列
/>
单供体样品分析.封装材料由共封装的HUVEC供体细胞打上条形码，并因此通过测序数据分析确定HUVEC供体身份可以揭示材料信息。NGS fastq数据通过行和列条形码进行去多路化，以重新分组从相同DNA输入扩增的序列。在bowtie2中进行与目标扩增子的序列比对。然后，对于每个扩增子序列，应用grep函数搜索显性等位基因和变异等位基因，以计算每个SNP基因座的变异等位基因频率(VAF)。由于植入小鼠体内的胶囊含有仅一个HUVEC供体，与分析物样品具有最高匹配率的HUVEC供体被鉴定为条形码化细胞。
双供体样品分析:采用对数似然分析封装一个或两个HUVEC供体的外植样品。具体来说，计算了供体细胞的所有可能组成的SNP VAF图谱。在方程式(1)中的VAFi,j,k代表当供体i和供体j以1:R的比例混合时第k个SNP的预期VAF。在这里，20个不同HUVEC供体的所有可能组合具有20x20＝400种不同组合物。对于每种可能的组合物，根据观察到的值与组合物中的VAF的近或远，即概率p(i,j,k)，从高斯分布计算每个SNP的观察到的VAF。通过对所有SNP的对数似然求和而获得每种组合物的总体对数似然Log(Li,j)，并且具有最高总体对数似然的组合物被确定为条形码细胞组合物。
统计分析.材料筛选的统计分析使用定制的MATLAB脚本。良好材料的回收百分比是生物重复的平均值(小鼠数目N＝5)，并从二项式分布计算每种材料的95％置信区间的误差棒。任何两种具有不重叠误差棒的材料都被鉴定为统计上显著的(p<0.05)。对于其它图的统计分析，使用具有Bonferroni多重比较校正的单因素或双因素方差分析(****P<0.0001，***P<0.002)。
C.结果和讨论
NGS筛选的材料开发、方法开发以及在免疫受损小鼠中的筛选.为了使用细胞的条形码化在体内筛选免疫保护性水凝胶的大库，在体内筛选细胞封装材料之后开发了一套用于鉴定细胞封装材料的连续方法，该方法包括(a)制备源自一个或多个受试者的多个条形码细胞，其中条形码细胞的每种组合物包含多个SNP的独特图谱，所述多个SNP充当每种细胞封装材料的遗传条形码；(b)使用各种封装材料和条形码细胞制造胶囊；(c)将胶囊植入试验受试者体内；(d)在设定的时间段之后外植胶囊；和(d)确定每个外植胶囊的条形码细胞中的多个SNP的序列，从而鉴定每个胶囊的细胞封装材料(图2A)。早期公开的报告展示了774种组合合成的水凝胶库的开发和具有相似分子结构的三种含有三唑的抗纤维化共价修饰的先导海藻酸盐类似物的鉴定(1)。仔细的结构分析表明，先导类似物之间的共同点在于三唑(具有两个碳原子和三个氮原子的杂环五元环)的存在。这表明含有三唑的分子可以调节在这些生物材料的表面处的免疫细胞群体，包括巨噬细胞，从而抑制其活化并中断纤维化过程。在本手稿中，通过三唑表面修饰合成了总共211种新的海藻酸盐类似物(封装材料)(图1)。开发了一种组合生物材料方案，通过共价连接小分子官能团保持三唑类似物为共有，生成基于海藻酸盐的水凝胶库。使用具有高古洛糖醛酸(G)含量(>60％ G，约25kDa MW,NovaMatrix)的低分子量(MW)超纯海藻酸盐UPVLVG作为起始材料。使用三种亲水的基于PEG的接头(图1、表2)创建150种独特的聚合物。使用两种疏水接头生成另外61种独特的聚合物，全部含有三唑(图1、表2)。进一步，使用元素分析、核磁共振光谱法(NMR)和胶凝测定来表征共价连接(分别为图3D、3E和3A)。初步表征研究(包括纯度、溶解度和凝胶形成能力)之后，选择了约149种海藻酸盐类似物用于体内筛选目的(表3)。使用以下技术对新形成的胶囊(具有或没有细胞)进行进一步的各种体外表征：1)使用基于荧光的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)成像的活-死测定，以及2)用于验证所有胶囊的均匀形状和尺寸的明视野和暗视野显微术。通过下一代测序(NGS)对20个独特的HUVEC供体进行测序，并已经建立了独特的条形码化来鉴定其各自的单核苷酸多态性(SNP)，其被用作条形码来打标签和鉴定不同的封装材料。从体外和体内外植的胶囊成功提取DNA，其具有高质量和足够的人DNA，用于聚合酶链式反应(PCR)扩增，然后进行NGS来进行人SNP鉴定。HUVEC细胞的深度测序揭示了所选30个非致病性SNP的基因谱。每个SNP基因座可拥有三种基因型之一：野生型(WT)等位基因纯合的、杂合的，或变异等位基因纯合的。30个SNP的基因型共同形成了独特的基因谱，其可以模糊地代表HUVEC细胞身份(图2B)。图2C是来自筛选的代表性图像(植入前和外植后)。因此，通过将单供体HUVEC封装在每种不同的水凝胶材料中，通过细胞条形码来独特地标记材料身份，所述细胞条形码可以通过植入后测序来读取。优化了从单个胶囊中提取gDNA的方法(图4)，以增加用于测序的DNA输入。此外，建立了NGS库制备和材料鉴定的工作流程(图5和图6)。
为了证明所有供体(H1-H20，表3)可以通过NGS解卷积，将封装20种独特HUVEC的20种不同水凝胶胶囊(由211种新型水凝胶类似物库制成)的混合物植入NSG(NOD SCIDγ)小鼠的腹膜内(IP)空间保持4周。NSG小鼠缺乏成熟的T细胞、B细胞和天然杀伤细胞来诱导正常的先天免疫功能。在免疫缺陷小鼠中的筛选使我们能够评估这种细胞条形码化策略，同时对植入材料的宿主免疫应答最小。回收后胶囊的成像显示最小的细胞沉积，表明被封装的细胞的纤维化缺乏和高活力(图2C)。使用NGS技术对一只小鼠的胶囊进行了分析，并且200个胶囊中的195个(约96.5％)基于其独特的细胞条形码化被成功鉴定(图2D)。鉴定的百分比在供体之间均匀分布。这些结果表明，使用不同HUVEC供体的细胞条形码化和NGS基因分型可以用作确定生物材料身份而不改变材料性能的合适策略。
在免疫活性小鼠中的材料筛选.为了测量免疫应答水平，使用新型高通量体内筛选方法评价了这些新合成的海藻酸盐类似物(图7A)。使用20个不同HUVEC供体的独特单核苷酸多态性(SNP)基因型对每种材料进行条形码标记。每轮将20种不同材料的混合物(每种材料10个胶囊)植入每只小鼠的腹膜内(IP)空间。使用该方法筛选了总共约150种新材料。在小鼠体内植入28天后，从腹膜内空间取回胶囊，并进行后处理以鉴定材料的供体对(图7B)。表现出低纤维化应答的那些胶囊表明，不受理论的约束，所述材料具有免疫保护性能。由于这些外植的胶囊是20种不同材料的混合物，因此应使用高通量方法鉴定封装的HUVEC供体以找到相应的材料。在显微镜下根据表面纤维化水平将所有外植的胶囊分为三组(L：低纤维组织形成胶囊，M：中纤维组织形成胶囊，H：高纤维组织形成胶囊)。在低纤维组织形成(L)组中的胶囊显示出具有低纤维化沉积的透明表面。相反，高纤维组织形成(H)组显示出在胶囊表面上较高的纤维化组织沉积，从而导致由于胶囊之间的纤维化过度生长而形成聚集体。两组之间的胶囊被指定为中等纤维组织形成组(M)。仅选择L组胶囊进行使用NGS测定的材料鉴定(图7C)。
为了提高材料筛选的通量，将工作流程设计为在一次运行中处理一批96个提取的DNA样品。在96孔PCR板上扩增SNP扩增子之后，在板上的每个样品将通过含有Hamming条形码的正向引物和反向引物的独特组合进行位置条形码化，以代表其在板上的位置。这使得可以在不丢失样品信息的情况下合并带条形码的扩增子，然后可以使用基于连接的方法在Illumina平台上处理合并的库进行测序。对于在小鼠中的体内筛选，这样的库中的两个能够筛选来自一只动物的外植胶囊，并且估计的测序空间为约1150万个读数(基于2000个覆盖率/路x 30路x 96个样品/库)，或NextSeq流动池的容量的2.9％。
对所有鉴定的胶囊进行绘图(图7E)以找到具有抗炎性能的命中材料。低纤维组织形成胶囊的百分比代表了材料的抗纤维化性能(图7E、表3)。对于每轮，每种材料植入10个胶囊，因此将图绘制为低纤维组织形成胶囊的百分比(与植入的胶囊数目相比)。发现总共15种海藻酸盐类似物(图7E中的蓝色和橙色条)(包括一种先前已知的材料Z1-A34，在图7E中标记为绿色条)显示出高于50％的低纤维组织形成胶囊，这意味着10个植入的胶囊中平均有5个胶囊清晰地出来。还将筛选结果绘制为热图(图7D)以可视化炔烃和接头的不同组合的纤维化结果。这些结果表明，某些炔烃(A3、A17、A19、A30、A43)在不同的接头之间表现出低纤维化水平。这些炔烃分别含有苯基溴、吡啶、噻吩、乙氧基和环丙基官能团(表2)。这些炔烃的某些相似之处包括支链结构的缺乏和较长的碳链，这使得这些炔烃相对紧凑。此外，这些炔烃都含有碳环结构，并且大多数在碳环内或碳环周围具有负电原子(O、N、S、Br)。
图7F显示了具有最低FBR或纤维化的前三种鉴定的先导海藻酸盐类似物(图7E中的橙色条)(Z4-A10、Z2-A19和Z1-A3)的化学结构。所有三种新类似物在主链中含有三唑部分，这进一步支持了三唑类抑制纤维化的作用。有趣的是，除了溴苯(Z1-A3)、噻吩(Z2-A19)和乙炔基苯(Z4-A10)对三唑的官能化之外，所有三种先导材料都具有与海藻酸盐连接的亲水性peg接头(图7F)。值得注意的是，在前15种先导物中，仅鉴定出两种疏水性类似物(B2-A17和B1-A34)，其中一种后来被用于导管涂布应用。
双供体细胞条形码化扩展了高通量潜力.为了将这种新颖的条形码化策略转化为筛选更大批量的抗纤维化生物材料，采用了双供体条形码化策略，并在NHP模型中试验了其可行性。在一只小鼠中仅植入20种不同的材料。相比之下，在NHP模型中，由于可植入空间的更大容量，材料批大小可以增加到100，从而导致通量的5倍增加。对于单供体封装，其通量受可用独特供体的数目限制。在这里，设计了一种使用双供体条形码化策略的新方法以提高筛选通量，而无需购买和验证新的细胞供体。通过以1:2的比例混合两种不同的HUVEC(图8A)，仅用20个HUVEC供体就创建了400种独特的条形码化组合物排列(图8B)，这显著扩展了现有供体的条形码化能力。利用该比率，复杂的变异等位基因频率(VAF)现在包括七种可能性(0、1/6、1/3、1/2、2/3、5/6和1)。因此，供体鉴定策略从与个体供体的直接对比修改为对数似然分析(图6)。根据高斯分布评估所有可能组合的可能性以确定混合供体身份。优化两个供体的混合比例(图9)，并进行小组群筛选(三种材料的对比)以确认双供体条形码化策略的可行性(图10)。
在开发了400个新颖的双条形码之后，用两种不同HUVEC的独特组合(1:2比例)封装的一组100种独特的含有三唑的海藻酸盐类似物(从211个新合成的类似物库(如图1所示)中随机选择)被植入(每种材料30个胶囊)NHP的腹膜内空间中4周(图5C)。植入前胶囊的代表性图像显示1.5mm胶囊的均匀分布(图8D)。植入前胶囊的活/死染色证实，细胞在植入NHP之前是活的(图8D)。4周后，取回在腹膜内空间中的所有自由漂浮胶囊并用于使用NGS测定进行的材料鉴定(白色箭头：组织聚集的胶囊，黄色箭头：自由漂浮的胶囊，图8E)。从3000个植入的胶囊中，回收了总共503个自由漂浮的胶囊并用于NGS分析，结果约92.6％的样品胶囊被以高置信度成功鉴定(图8F)。剩余的7.4％胶囊由于测序深度不足(N＝5，失败)或低条形码匹配可能性(N＝32，更低置信度)而无法被可靠地鉴定。胶囊在置信空间中的分布绘制在图8G中。本研究成功证实了双条形码化策略在NHP模型中对100种新材料进行体内筛选的适用性和可行性。从100种中鉴定出四种先导水凝胶，它们在NHP中显示出最小的纤维化(Z1-A2、Z4-A11、Z1-A27和Z2-A27，图8H)。所有这四种先导水凝胶含有亲水接头。令人感兴趣的是，来自NHP筛选的这4种先导物在小鼠研究中未被鉴定为前15种先导物，并因此在本研究中没有被用于进一步应用。
从小鼠研究中筛选出的新先导材料减轻了异物应答，并且可以用于各种涂布应用以保护免于免疫应答.
化学修饰的海藻酸盐降低个体环境中免疫活性小鼠中的FBR.用于筛选的所有材料在混合条件下进行试验以进行高通量测定。因此，需要确认筛选的顶级先导材料在个体环境中是否具有免疫保护性能。用300～400μm大小的微胶囊进行了两周植入试验，因为胶囊的较小尺寸可以在短时间内激发免疫应答。本研究使用了前十种先导材料、一种先前报道的阳性对照水凝胶(Z1-A34)和一种阴性对照水凝胶(SLG20)。在小鼠中植入腹膜内空间2周后，暗视野图像显示先导材料中的纤维化沉积比对照少(图11A)。与选定的先导材料(包括Z4-A10和Z1-A3)相比，SLG20对照具有更高的免疫应答，并且大多数微胶囊聚集在纤维化组织内。通过用巨噬细胞和成纤维细胞标志物对胶囊进行成像以及RT-qPCR分析来确定表面纤维化水平(图11B-11C)6,50。根据免疫荧光成像(图11B)，与SLG20对照相比，Z4-A10和Z1-A3显示巨噬细胞(CD68，绿色)和肌成纤维细胞(α-SMA，红色)标志物的最低强度，表明低纤维化水平。纤维化标志物(α-SMA和Col1a1)的反转录PCR分析揭示，与SLG20相比，先导材料具有显著更低的两种标志物表达，表明在胶囊表面上更低的纤维化和减少的胶原沉积(图11C)。Z4-A10和Z1-A3看起来在所有顶级先导物中最有希望预防FBR，并因此被考虑进一步应用，包括在糖尿病性啮齿类动物中递送异种人胰岛(Z4-A10)和涂布医用级导管(Z1-A3)。这些结果证实了筛选的先导材料在个体环境中的抗纤维化效应，从而提供了各种免疫调节应用机会。
先导水凝胶在免疫活性动物模型中使用异种人胰岛恢复长期血糖
本发明的抗纤维化海藻酸盐(Z4-A10，方案5和6)水凝胶被用于封装异种人胰岛。这些制剂提供了高度多孔的且抗纤维化的水凝胶外膜，以实现长期营养扩散、高胰岛生存力和低体内纤维化。在小鼠中的高通量筛选使用高密度细胞负载(每个胶囊约30,000个HUVEC)来提供增强的选择压力，以鉴定可以保护密集封装的异种细胞免受排斥的材料。对于本文描述的糖尿病校正研究，维持每个胶囊相似的细胞密度(每个胶囊15K-60K个细胞)以评估先导制剂在STZ诱导的C57BL/6J小鼠中实现胰岛的持久活力和保护方面的功效。
使用Z4-A10海藻酸盐制备了具有三种不同密度(4K IEQ/mL的海藻酸盐、8K IEQ/mL的海藻酸盐和16K IEQ/mL的海藻酸盐，图12)的人胰岛的胶囊，Z4-A10海藻酸盐是通过高通量筛选鉴定的含有三唑的先导海藻酸盐(图7E-7F)。以4K IEQ/mL和16K IEQ/mL的胰岛细胞密度制备对照SLG20胶囊。胶囊组(Z4-A10和对照SLG20)的植入前双硫腙染色和活/死成像证明了胰岛的活力(图13A)。4K IEQ/mL密度的Z4-A10胶囊表现出正常血糖的长期恢复并维持血糖校正直至数据记录80天，处于禁食状态下的平均血糖(BG)水平低于250(被视为健康小鼠的BG水平)(图13B)。但是，相同剂量(4K/mL的IEQ密度)的对照SLG20海藻酸盐未能维持血糖校正超过4周。在第75天禁食四小时后进行静脉内葡萄糖耐量试验(IVGTT)，表明封装的胰岛细胞将血糖恢复正常至与健康C57BL/6J小鼠相当的速度(图13C)。此外，与SLG20相比，回收后的胶囊图像(暗视野)显示在Z4-A10胶囊表面上的最小纤维化过度生长(图13D)。双硫腙染色还支持在植入80天后的长期胰岛活力(图13E)。在移植后80天从小鼠血液分离的血清中测量了人c-肽(胰岛素产生的替代生物标志物)的浓度。与SLG20相比，在Z4-A10组中观察到更高水平的c-肽分泌，这表明，不受理论的约束，更好地改善了长期生存力(图13F)。
在高密度封装组中，具有16K IEQ/mL浓度的Z4-A10胶囊可以维持>50天的长期血糖控制功能(图13G)。相反，对照SLG20组在植入后不超过10天未能维持血糖控制(图13H)。这些结果再次表明，不受理论的约束，Z4-A10保护封装的胰岛免于异物应答的能力得到增强，这维持了移植物更长的生存力和功能。
先导抗纤维化材料在涂布导管时表现出低纤维化.为了试验新开发的小分子在其它医疗器械的背景下预防纤维化的有效性，对医用级有机硅导管进行了等离子体处理，并涂布了甲基丙烯酰基修饰Z1-A3(一种新的亲水性先导物)和B2-A17(一种新的疏水性先导物)(图14A，方案7-10)。有机硅导管本质上是疏水性的。因此，选择一种顶级疏水性先导物(B2-A17)和一种亲水性先导物(Z1-A3)来确定亲水性/疏水性是否影响纤维化的减轻。使用XPS和ToF-SIMS分析未修饰的和涂布的导管的表面化学以确认导管的成功涂布(图14B-14C、图14A-14C)。
为了试验未涂布的和小分子涂布的导管在促纤维化C57BL/6J小鼠模型中的纤维化应答，将这些导管植入小鼠皮下空间中保持4周。4周后外植导管的组织学和成像显示，与小分子涂布的导管(Met-Z1-A3和Met-B2-A17)相比，未修饰的导管外植体导致在导管和皮肤组织之间更厚的深紫色组织沉积(富含胶原，表明纤维化过度生长23)(图14D-14E、图15D-15E)。结果表明，不受理论的约束，小分子涂布的导管比未修饰的导管更能预防FBR。还值得注意的是，当用于涂布疏水性有机硅导管23时，疏水性先导物(Met-B2-A17)在预防纤维化沉积方面比亲水性先导物之一(Met-Z1-A3)表现更好。
前20种性能更好的海藻酸盐类似物的NMR数据.
Z1A3:1H(600MHz；D2O):2.99(4H,s,N-CH2-CH2-S),3.20-3.53(m，海藻酸盐质子),3.46(4H,s,N-CH2-CH2-S),3.52-3.76(16H,m，乙氧基),3.7-5.2(m，海藻酸盐质子),8.21(1H,s，三唑)。
Z1A5:1H(600MHz；D2O):3.02(4H,s,N-CH2-CH2-S),3.25-3.57(m，海藻酸盐质子),3.52(4H,s,N-CH2-CH2-S),3.55-3.78(16H,m，乙氧基),3.8-5.3(m，海藻酸盐质子),8.48(1H,s，三唑)。
Z1A7:1H(600MHz；D2O):2.95(4H,s,N-CH2-CH2-S),3.17-3.51(m，海藻酸盐质子),3.43(4H,s,N-CH2-CH2-S),3.52-3.73(16H,m，乙氧基),3.7-5.3(m，海藻酸盐质子),8.25(1H,s，三唑)。
Z1A14:1H(600MHz；D2O):3.05(4H,s,N-CH2-CH2-S),3.20-3.45(m，海藻酸盐质子),3.43(4H,s,N-CH2-CH2-S),3.48-3.69(16H,m，乙氧基),3.73-5.3(m，海藻酸盐质子),8.31(1H,s，三唑)。
Z1A16:1H(600MHz；D2O):2.92(4H,s,N-CH2-CH2-S),3.20-3.55(m，海藻酸盐质子),3.45(4H,s,N-CH2-CH2-S),3.52-3.74(16H,m，乙氧基),3.75-5.2(m，海藻酸盐质子),8.22(1H,s，三唑)。
Z1A19:1H(600MHz；D2O):2.95(4H,s,N-CH2-CH2-S),3.15-3.50(m，海藻酸盐质子),3.48(4H,s,N-CH2-CH2-S),3.50-3.72(16H,m，乙氧基),3.70-5.3(m，海藻酸盐质子),8.20(1H,s，三唑)。
Z1A43:1H(600MHz；D2O):2.95(4H,s,N-CH2-CH2-S),3.12-3.43(m，海藻酸盐质子),3.41(4H,s,N-CH2-CH2-S),3.45-3.68(16H,m，乙氧基),3.70-5.5(m，海藻酸盐质子),8.17(1H,s，三唑)。
Z2A19:1H(600MHz；D2O):2.97(4H,s,N-CH2-CH2-S),3.20-3.56(m，海藻酸盐质子),3.53(4H,s,N-CH2-CH2-S),3.57-3.78(16H,m，乙氧基),3.80-5.6(m，海藻酸盐质子),8.24(1H,s，三唑)。
Z2A20:1H(600MHz；D2O):2.95(4H,s,N-CH2-CH2-S),3.22-3.57(m，海藻酸盐质子),3.55(4H,s,N-CH2-CH2-S),3.58-3.82(16H,m，乙氧基),3.84-5.5(m，海藻酸盐质子),8.25(1H,s，三唑)。
Z2A28:1H(600MHz；D2O):2.98(4H,s,N-CH2-CH2-S),3.24-3.58(m，海藻酸盐质子),3.56(4H,s,N-CH2-CH2-S),3.60-3.84(16H,m，乙氧基),3.82-5.4(m，海藻酸盐质子),8.28(1H,s，三唑)。
Z3A10:1H(600MHz；D2O):3.03(4H,s,N-CH2-CH2-S),3.20-3.54(m，海藻酸盐质子),3.51(4H,s,N-CH2-CH2-S),3.54-3.82(16H,m，乙氧基),3.78-5.3(m，海藻酸盐质子),8.38(1H,s，三唑)。
Z3A22:1H(600MHz；D2O):2.74(4H,s,N-CH2-CH2-S),3.05-3.38(m，海藻酸盐质子),3.34(4H,s,N-CH2-CH2-S),3.43-3.75(16H,m，乙氧基),3.78-5.2(m，海藻酸盐质子),8.08(1H,s，三唑)。
Z3A26:1H(600MHz；D2O):2.98(4H,s,N-CH2-CH2-S),3.15-3.48(m，海藻酸盐质子),3.45(4H,s,N-CH2-CH2-S),3.52-3.76(16H,m，乙氧基),3.78-5.1(m，海藻酸盐质子),8.17(1H,s，三唑)。
Z3A27:1H(600MHz；D2O):2.92(4H,s,N-CH2-CH2-S),3.08-3.46(m，海藻酸盐质子),3.41(4H,s,N-CH2-CH2-S),3.48-3.73(16H,m，乙氧基),3.76-5.7(m，海藻酸盐质子),8.35(1H,s，三唑)。
Z3A30:1H(600MHz；D2O):2.95(4H,s,N-CH2-CH2-S),3.12-3.42(m，海藻酸盐质子),3.48(4H,s,N-CH2-CH2-S),3.46-3.82(16H,m，乙氧基),3.76-5.4(m，海藻酸盐质子),8.28(1H,s，三唑)。
Z3A43:1H(600MHz；D2O):3.02(4H,s,N-CH2-CH2-S),3.08-3.43(m，海藻酸盐质子),3.48(4H,s,N-CH2-CH2-S),3.47-3.84(16H,m，乙氧基),3.73-5.6(m，海藻酸盐质子),8.32(1H,s，三唑)。
B1A34:1H(600MHz；D2O):3.20-5.5(m，海藻酸盐质子),7.15-7.27(1H,s,C-CH＝C),7.47-7.65(1H,d,C-CH＝C-N),8.27(1H,s，三唑)。
B2A3:1H(600MHz；D2O):3.07-5.7(m，海藻酸盐质子),6.82-7.07(1H,s,C-CH＝C),7.17-7.38(1H,d,C-CH＝C-N),7.75(1H,s，三唑)。
B2A17:1H(600MHz；D2O):3.20-5.3(m，海藻酸盐质子),7.08-7.17(1H,s,C-CH＝C),7.26-7.48(1H,d,C-CH＝C-N),7.82(1H,s，三唑)。
B2A31:1H(600MHz；D2O):3.08-5.5(m，海藻酸盐质子),7.03-7.18(1H,s,C-CH＝C),7.25-7.(1H,d,C-CH＝C-N),7.74(1H,s，三唑)。
方案1.B1-A51胺的合成的示意图.
质量和NMR数据：1H(600MHz；CDCl3):3.63(s,3H,CH3-O-C),4.01(s,2H,NH2-CH2-CH2),7.05(s,1H,-O苯),7.17(m,2H，芳族),7.52(m,2H，芳族),7.79(s,1H，三唑)13C(600MHz；CDCl3):46.5(NH2CH2),56.8(CH3-O-CH2),111.4(CH3-O-CH2-C(芳族)),121.6(CH芳族),122.7(CH三唑),128.4(CH芳族),135.8(Cq-N芳族),144.9(Cq-C芳族),146.9(C三唑),157.6(O-C(芳族))ESI:M+1＝281.1
方案2.用B1-A51修饰海藻酸盐的示意图.
NMR数据:1H(600MHz；CDCl3):3.23-3.45(m，海藻酸盐质子),3.72(s,2H,C-H2C-O),3.75(s,3H,CH3-O),3.8-5.2(m，海藻酸盐质子),4.59(s,1H,C-CH-O),4.61(s,2H,C-CH2-O),7.18(s,1H,O-CH芳族),7.32(s,2H，芳族),7.67(s,2H，芳族),8.04(s,1H，三唑)。
元素：C:34.75％,H:8.55％,N:3.56％。
方案3.Z1-A34胺的合成的示意图.
质量和NMR数据：1H(600MHz；CDCl3):2.87(s,2H,NH2-CH2-CH2-O),3.05(m,8H,N-CH2-CH2-S),3.51(t,2H,NH2-CH2),3.61(m,8H,PEG)3.81(s,2H,-CH2-三唑),3.89(t,2H,N-CH2-CH2-O),4.55(t,2H,N-CH2-CH2-O),7.51(s,2H，芳族),7.68(s,1H，三唑)。13C(600MHz；CDCl3):41.74(NH2-CH2),50.42(N-CH2),50.56(N-CH2硫代吗啉)51.52(S-CH2硫代吗啉)52.2(硫代吗啉-CH2-三唑),69.54-73.14(m,PEG),124.10(CH三唑),143.32(C三唑)。
ESIMS:[M+H+]＝392.1939
方案4.用Z1-A34修饰海藻酸盐的示意图.
NMR数据:1H(600MHz；D2O):2.95(s,4H,N-CH2-CH2-S),3.05-3.34(m，海藻酸盐质子),3.56(s,4H,N-CH2-CH2-S),3.48-3.71(16H,m，乙氧基),3.65-5.32(m，海藻酸盐质子),8.08(1H,s，三唑)。
元素：C:35.67％,H:4.34％,N:5.08％,O:33.50％。
方案5.Z4-A10胺的合成的示意图.
质量和NMR数据：1H(600MHz；CDCl3):2.93(s,2H,NH2-CH2-CH2-O),3.15(s,H，炔烃),3.47(t,2H,NH2-CH2),3.65(m,8H,PEG)3.86(s,2H,CH2-三唑),3.89(t,2H,N-CH2-CH2-O),4.55(t,2H,N-CH2-CH2-O),7.69(s,1H，三唑),7.79(s,2H，芳族)。
13C(600MHz；CDCl3):40.7(NH2CH2),51.8(N-CH2-C),69.2(N-C-CH2-O),71.5(C-CH2-O),73.2(N-CH2-CH2-O),82.1(炔烃),119.6(H2C＝C),122.6(CH芳族),127.7(CH芳族),129.5(CH芳族),130.6(CH芳族),132.4(CH芳族),133.4(C三唑),139.7(CH芳族),147.9(1-乙基yne),166.5(C,NH-C＝O)。
ESIMS:[M+H+]＝389.2080
方案6.用Z4-A10修饰海藻酸盐的示意图.
NMR:1H(600MHz；D2O):3.12(s，炔烃),3.17-3.40(m，海藻酸盐质子),3.50-3.70(m,16H，乙氧基),3.7-5.2(m，海藻酸盐质子),8.08(s,1H，三唑)
元素：C:40.45％,H:5.60％,N:6.22％。
方案7.Z1-A3胺的合成的示意图.
质量和NMR数据：1H(600MHz；D2O):3.48(m,1H，亚甲基),3.54(m,1H，亚甲基),3.91(s,1H,NH2-CH2),4.74(d,1H,J＝12Hz,O-CH2-三唑),4.89(d,1H,J＝12Hz,O-CH2-三唑),7.32(m,2H，芳族),7.54(m,2H，芳族),7.75(m,2H，芳族),8.46(s,1H，三唑)。13C(600MHz；D2O):40.1(NH2CH2),49.9(N-CH2-C),67.5(N-C-CH2-O),70.1(C-CH2-O),72(N-CH2-CH2-O),122.2(CH芳族),127.2(CH芳族),130.4(CH芳族),134.1(C三唑)。ESI:M+1＝399.1。
方案8.Met-Z1-A3的合成的示意图.
质量和NMR数据.1H(600MHz；CDCl3):1.95(m,1H，甲基),3.53(m,1H，亚甲基),3.55(m,1H，亚甲基),3.89(s,1H,NH2-CH2),4.76(d,1H,J＝12Hz,O-CH2-三唑),4.85(d,1H,J＝12Hz,O-CH2-三唑),5.28(1H,1亚乙基),5.74(d,1H,1亚乙基),7.18(m,2H，芳族),7.52(m,2H，芳族),7.73(m,2H，芳族),7.75(m,2H，芳族),8.42(s,1H，三唑)。13C(600MHz；CDCl3):18.6(CH3),39.3(NH2CH2),50.4(N-CH2-C),69.6(N-C-CH2-O),70.5(C-CH2-O),72(N-CH2-CH2-O),119.6(H2C＝C),122.2(CH芳族),127.2(CH芳族),129.3(CH芳族),130.58(CH芳族),131.4(CH芳族),133.5(C三唑),139.9(CH芳族),145.2(1-亚乙基),168.38(C,NH-C＝O)。
ESI:M+1＝469.1。
方案9.B2-A17胺的合成的示意图.
质量和NMR数据：1H(600MHz；DMSO-D6):4.17(s,2H,NH2-CH2-Ph),7.25(d,2H，芳族),7.48(s,1H，芳族),7.52(s,2H，芳族-三唑),7.87(s,1H，芳族),7.96(s,1H，三唑),8.25(s,1H，芳族-三唑),8.59(s,2H，胺),8.65(s,1H，芳族-N)。
13C(600MHz；MeOD):44.2(CH2-NH2),119.6(CH芳族),121.3(CH芳族),123.7(CH芳族),127.8(CH芳族),129.4(CH三唑),137.4(Cq-N芳族),142.3(Cq-C芳族),148.9(C-N芳族),151.2(C-芳族)。
ESI:M+1＝252.1545
方案10:Met-B2-A27的合成的示意图.
质量和NMR数据：1H(600MHz；DMSO-D6):1.96(m,1H，甲基),4.65(s,2H,NH-CH2-芳族),5.56(s,1H，亚乙基),5.64(s,1H，亚乙基),7.23(s,2H，芳族),7.48(s,1H，芳族),7.62(m,2H，芳族),7.75(m,1H，芳族),7.83(s,1H，三唑),8.27(s,1H，芳族-三唑),8.73(s,1H，芳族-N),8.89(s,1H，酰胺)。13C(600MHz；DMSO-D6):18.7(CH3,1-α,C-C),43.1(CH2-NH2),119.2(CH2，亚乙基),120.1(CH芳族),124.3(CH芳族),126.9(CH芳族),131.2(CH三唑),137.6(Cq-N芳族),139.7(Cq-C芳族),143.2(C-亚乙基),148.3(C-N芳族),150.5(C芳族),168.2(C-酰胺)。
ESI:M+1＝320.1857。
方案11:Z2-A19的合成的示意图.
****************
根据本公开内容，可以在不进行过多实验的情况下制备和实施本文公开的和要求保护的所有化合物、制剂和方法。尽管已经以优选实施方案的方式描述了本发明的化合物、制剂和方法，但是本领域技术人员显而易见，可以对化合物、制剂和方法以及本文描述的方法的步骤或步骤的顺序应用变化，而不脱离本发明的概念、精神和范围。更具体地，显而易见，可以用在化学上和生理学上均相关的某些药剂替代本文所述的药剂，并实现相同或类似的结果。本领域技术人员显而易见的所有这样的类似的替代和修改均被认为落入由所附权利要求书限定的本发明的精神、范围和概念内。
参考文献
以下参考文献就它们提供补充本文所述细节的示例性程序性细节或其它细节而言明确地通过引用并入本文。
Anderson,Practical Process Research&Development-A Guide for OrganicChemists，第2版,Academic Press,New York,2012.
Handbook of Pharmaceutical Salts:Properties,and Use,Stahl和Wermuth编,Verlag Helvetica Chimica Acta,2002.
Reagan-Shaw等人,FASEB J.,22(3):659-661,2008
Smith,March’s Advanced Organic Chemistry:Reactions,Mechanisms,andStructure，第7版，Wiley,2013.
Vegas等人,Nat.Biotechnol.,34(3):345-352,2016.
Xie等人,Nat.Biomed.Eng.,2(12):894-906,2018.
序列表
<110> 威廉马什莱斯大学
<120> 含有三唑的聚合物及其使用方法
<130> RICE.P0059WO
<140> 尚未指定
<141> 2022-06-14
<150> US 63/210,377
<151> 2021-06-14
<160> 86
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 1
cgcttccgct gcccagagac t 21
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 2
tataggtggt ttcgtggatg cccgct 26
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 3
catgttcagc tttgtggacc t 21
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 4
gcagctgact tcagggatgt 20
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 5
gcttctttgc agctccttcg tt 22
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 6
cggagccgtt gtcgacgacc 20
<210> 7
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 7
ccaaagtcgt taagctgcca aaccaatggg agtcactgct g 41
<210> 8
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 8
tatgtccgtc gttgcgaagt gcctggacat cagtgtcctc atct 44
<210> 9
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 9
ccaaagtcgt taagctgcca acctgaatgt cagttttgtt agagcaac 48
<210> 10
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 10
tatgtccgtc gttgcgaagt gacagggtga tgtaaaagtg tctga 45
<210> 11
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 11
ccaaagtcgt taagctgcca acagacttaa tcaaagccct tgaaaaga 48
<210> 12
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 12
tatgtccgtc gttgcgaagt gactcatggc aacttgcttc tca 43
<210> 13
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 13
ccaaagtcgt taagctgcca acctcccata gtgattctta tgaagtca 48
<210> 14
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 14
tatgtccgtc gttgcgaagt gggataacct tgtgtgcatg tcact 45
<210> 15
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 15
ccaaagtcgt taagctgcca accacactct gcctctcatg gtat 44
<210> 16
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 16
tatgtccgtc gttgcgaagt gaggcaagta agcagacaat agca 44
<210> 17
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 17
ccaaagtcgt taagctgcca atccgcaaaa cctacaatct ctgaa 45
<210> 18
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 18
tatgtccgtc gttgcgaagt gcagtatagc tgaggtaacc acagta 46
<210> 19
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 19
ccaaagtcgt taagctgcca acttgtatat agacggtaaa ataaacacca aga 53
<210> 20
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 20
tatgtccgtc gttgcgaagt gctggacagt taccttattc aaacatca 48
<210> 21
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 21
ccaaagtcgt taagctgcca attcctgctt ccagacatga atca 44
<210> 22
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 22
tatgtccgtc gttgcgaagt gcaccatacc tccatgacac ca 42
<210> 23
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 23
ccaaagtcgt taagctgcca actctctgcc tgcaggatgt g 41
<210> 24
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 24
tatgtccgtc gttgcgaagt ggcgtttctc actggtctca gat 43
<210> 25
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 25
ccaaagtcgt taagctgcca aactaagagt gcagagcctg gaa 43
<210> 26
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 26
tatgtccgtc gttgcgaagt gtggggtttg tgaacaagag taga 44
<210> 27
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 27
ccaaagtcgt taagctgcca acactttatc agacacagtt atgtgct 47
<210> 28
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 28
tatgtccgtc gttgcgaagt ggcccacatt tagaatttag aggtaact 48
<210> 29
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 29
ccaaagtcgt taagctgcca actatctgca ggattgtgtt caatgta 47
<210> 30
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 30
tatgtccgtc gttgcgaagt gagcaaacca ctggggaaaa tact 44
<210> 31
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 31
ccaaagtcgt taagctgcca actctctaga gtgcagattg gtagaa 46
<210> 32
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 32
tatgtccgtc gttgcgaagt gcaagtgaga gaccaaggaa aacaa 45
<210> 33
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 33
ccaaagtcgt taagctgcca acaaagttga taaattaaag gactaaggca c 51
<210> 34
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 34
tatgtccgtc gttgcgaagt gttaaatcct gcctctacta cttgct 46
<210> 35
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 35
ccaaagtcgt taagctgcca acattctgtc tgggatgagg tgat 44
<210> 36
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 36
tatgtccgtc gttgcgaagt gaacagttat atgaaaaaaa tgctcaatat cact 54
<210> 37
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 37
ccaaagtcgt taagctgcca atgaaagacg tcacagcaag gt 42
<210> 38
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 38
tatgtccgtc gttgcgaagt gcggggacca ggagcaaag 39
<210> 39
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 39
ccaaagtcgt taagctgcca atgtaggaga gattgggcta gagag 45
<210> 40
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 40
tatgtccgtc gttgcgaagt gctctacctg ggaaatctca ttcattc 47
<210> 41
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 41
ccaaagtcgt taagctgcca actaacttcc taactaaaac tttacagtgg a 51
<210> 42
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 42
tatgtccgtc gttgcgaagt gtcagtagaa ctttgaaggg tacaca 46
<210> 43
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 43
ccaaagtcgt taagctgcca agcacgtaga tgaaattgcc ccata 45
<210> 44
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 44
tatgtccgtc gttgcgaagt gacttcctac ttagcccttt agaaatgtaa 50
<210> 45
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 45
ccaaagtcgt taagctgcca aggaaaatat gtctaaaaag gctctggag 49
<210> 46
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 46
tatgtccgtc gttgcgaagt gccagtgcag tgtttctcaa actc 44
<210> 47
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 47
ccaaagtcgt taagctgcca agtttgttct aaggttcatc tggtgat 47
<210> 48
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 48
tatgtccgtc gttgcgaagt ggctcatgaa gaaaataatc cttatggtaa tc 52
<210> 49
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 49
ccaaagtcgt taagctgcca atgtcccact ttttacctcc cttc 44
<210> 50
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 50
tatgtccgtc gttgcgaagt gcttcatgga ggagatagta actaaggt 48
<210> 51
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 51
ccaaagtcgt taagctgcca atgtgctacg acagagctaa gtac 44
<210> 52
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 52
tatgtccgtc gttgcgaagt gtggtcagct taaatagcta ctgct 45
<210> 53
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 53
ccaaagtcgt taagctgcca accccggatg tcagggaatg 40
<210> 54
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 54
tatgtccgtc gttgcgaagt ggtgagtatg cacgtctcca tct 43
<210> 55
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 55
ccaaagtcgt taagctgcca accaggcacc actgctttgt 40
<210> 56
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 56
tatgtccgtc gttgcgaagt ggcaagggga cagaaatttg cttatc 46
<210> 57
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 57
ccaaagtcgt taagctgcca aaccttgtca agaacctaaa tagtgagaa 49
<210> 58
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 58
tatgtccgtc gttgcgaagt gtgggagagt tcactgcacc t 41
<210> 59
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 59
ccaaagtcgt taagctgcca acgtgggcta gtcaagaata taaaatgtta g 51
<210> 60
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 60
tatgtccgtc gttgcgaagt gcatgcaggt ggtgtgaatc tc 42
<210> 61
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 61
ccaaagtcgt taagctgcca atgtgtggct cagtatacca cttag 45
<210> 62
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 62
tatgtccgtc gttgcgaagt gctcaagcca tgtcatattt tcaaatagac 50
<210> 63
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 63
ccaaagtcgt taagctgcca agcacatcat acattatttc tgttgctat 49
<210> 64
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 64
tatgtccgtc gttgcgaagt gagagcccac ttagcatctc ca 42
<210> 65
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 65
ccaaagtcgt taagctgcca agaaatattg ctggggtcag cg 42
<210> 66
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 66
tatgtccgtc gttgcgaagt gggagggttt aaggtgtttt atgttttg 48
<210> 67
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 67
atacgtgcca aagtcgttaa gctgccaa 28
<210> 68
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 68
tgaagttcca aagtcgttaa gctgccaa 28
<210> 69
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 69
tgattagcca aagtcgttaa gctgccaa 28
<210> 70
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 70
ctaatcacca aagtcgttaa gctgccaa 28
<210> 71
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 71
atgacgccca aagtcgttaa gctgccaa 28
<210> 72
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 72
gtaatgtcca aagtcgttaa gctgccaa 28
<210> 73
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 73
aaacttccca aagtcgttaa gctgccaa 28
<210> 74
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 74
tccgagacca aagtcgttaa gctgccaa 28
<210> 75
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 75
gtcaatctat gtccgtcgtt gcgaagtg 28
<210> 76
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 76
cgctatgtat gtccgtcgtt gcgaagtg 28
<210> 77
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 77
accgatttat gtccgtcgtt gcgaagtg 28
<210> 78
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 78
aacaccgtat gtccgtcgtt gcgaagtg 28
<210> 79
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 79
ctcggaatat gtccgtcgtt gcgaagtg 28
<210> 80
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 80
gactgattat gtccgtcgtt gcgaagtg 28
<210> 81
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 81
tactgcgtat gtccgtcgtt gcgaagtg 28
<210> 82
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 82
aactggctat gtccgtcgtt gcgaagtg 28
<210> 83
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 83
atcggtctat gtccgtcgtt gcgaagtg 28
<210> 84
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 84
gccagtttat gtccgtcgtt gcgaagtg 28
<210> 85
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 85
cacgtattat gtccgtcgtt gcgaagtg 28
<210> 86
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 86
cgcatgttat gtccgtcgtt gcgaagtg 28

Claims (72)

1.下式的化合物或其药学上可接受的盐：
A-L-R1(I)，
其中：
A是聚合物；
L是下式的接头：
NRaX1(CH2CH2O)o
其中：
Ra是氢、烷基(C≤6)或被取代的烷基(C≤6)；
o是2、3、4或5；且
X1是烷二基(C≤8)或被取代的烷二基(C≤8)；
或下式的接头：
NRb(CH2)pX2
其中：
Rb是氢、烷基(C≤6)或被取代的烷基(C≤6)；
p是1、2或3；且
X2是芳烃二基(C≤12)或被取代的芳烃二基(C≤12)；
R1是环烷基(C≤12)；卤代芳基(C≤12)；含有S的杂芳基(C≤12)；被取代的含有S的杂芳基(C≤12)；烷基(C≤6)、卤代烷基(C≤6)、烯基(C≤6)或炔基(C≤6)取代的芳基(C≤12)；芳烷基(C≤12)；被取代的芳烷基(C≤12)；杂环烷基(C≤12)；被取代的杂环烷基(C≤12)；2-吡啶基；3-氨基苯基；4-烷氧基(C≤6)取代的芳基(C≤12)；或下式的基团：
X3OR2
其中：
X3是烷二基(C≤8)或被取代的烷二基(C≤8)；
R2是芳基(C≤12)或被取代的芳基(C≤12)。
2.权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，所述化合物进一步被定义为：
A-L-R1(I)
其中：
A是聚合物
L是下式的接头：
NRaX1(CH2CH2O)m
其中：
Ra是氢、烷基(C≤6)或被取代的烷基(C≤6)；
m是2、3、4或5；且
X1是烷二基(C≤8)或被取代的烷二基(C≤8)；
R1是环烷基(C≤12)；卤代芳基(C≤12)；含有S的杂芳基(C≤12)；被取代的含有S的杂芳基(C≤12)；烷基(C≤6)、卤代烷基(C≤6)、烯基(C≤6)或炔基(C≤6)取代的芳基(C≤12)；3-氨基苯基；4-烷氧基(C≤6)取代的芳基(C≤12)；或下式的基团：
X3OR2
其中：
X3是烷二基(C≤8)或被取代的烷二基(C≤8)；
R2是芳基(C≤12)或被取代的芳基(C≤12)。
3.权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，所述化合物进一步被定义为：
A-L-R1(I)
其中：
A是聚合物
L是下式的接头：
NRaX1(CH2CH2O)m
其中：
Ra是氢、烷基(C≤6)或被取代的烷基(C≤6)；
m是2、3、4或5；且
X1是烷二基(C≤8)或被取代的烷二基(C≤8)；
或下式的接头：
NRb(CH2)nX2
其中：
Rb是氢、烷基(C≤6)或被取代的烷基(C≤6)；
n是1、2或3；且
X2是芳烃二基(C≤12)或被取代的芳烃二基(C≤12)；
R1是卤代芳基(C≤12)；芳烷基(C≤12)；被取代的芳烷基(C≤12)；杂环烷基(C≤12)；被取代的杂环烷基(C≤12)；2-吡啶基；3-氨基苯基。
4.权利要求1或权利要求2所述的化合物，其中所述聚合物包含一个或多个糖重复单元。
5.权利要求4所述的化合物，其中所述重复单元具有下式：
其中：
R3或R4各自独立地是氢或羟基；
R5是羟基、烷氧基(C≤8)、被取代的烷氧基(C≤8),或与所述接头的共价键；且
m是具有从约50,000道尔顿至约500,000道尔顿的分子量的重复单元的数目。
6.权利要求5所述的化合物，其中所述聚合物包含下式的重复单元：
其中：
R3、R3′、R4或R4′各自独立地是氢或羟基；
R5是羟基、烷氧基(C≤8)、被取代的烷氧基(C≤8)或与所述接头的共价键；
R5′是与所述接头的共价键；且
m和n导致具有从约50,000道尔顿至约500,000道尔顿的分子量的重复单元的数目。
7.根据权利要求1-3中的任一项所述的化合物，其中所述聚合物是丙烯酸酯聚合物。
8.权利要求7所述的化合物，其中所述聚合物是甲基丙烯酸酯聚合物。
9.根据权利要求1、2和4-8中的任一项所述的化合物，其中o是2或3。
10.权利要求9所述的化合物，其中o是2。
11.权利要求9所述的化合物，其中o是3。
12.根据权利要求1-11中的任一项所述的化合物，其中Ra是氢。
13.根据权利要求1-12中的任一项所述的化合物，其中X1是烷二基(C≤6)。
14.权利要求13所述的化合物，其中X1是-CH2CH2-。
15.根据权利要求1和3-6中的任一项所述的化合物，其中Rb是氢。
16.根据权利要求1、3-6和15中的任一项所述的化合物，其中p是1或2。
17.权利要求16所述的化合物，其中p是1。
18.根据权利要求13、3-6和15-17中的任一项所述的化合物，其中X2是芳烃二基(C≤12)。
19.权利要求18所述的化合物，其中X2是苯二基。
20.根据权利要求1-19中的任一项所述的化合物，其中R1是卤代芳基(C≤12)。
21.权利要求20所述的化合物，其中R1是氯苯基、溴苯基或氟苯基。
22.权利要求21所述的化合物，其中R1是2-溴苯基、4-氯苯基、2-氟苯基或4-氟苯基。
23.根据权利要求1-19中的任一项所述的化合物，其中R1是3-氨基苯基。
24.根据权利要求1-19中的任一项所述的化合物，其中R1是含有S的杂芳基(C≤12)或被取代的含有S的杂芳基(C≤12)。
25.权利要求24所述的化合物，其中R1是含有S的杂芳基(C≤12)。
26.权利要求25所述的化合物，其中R1是2-噻吩基或3-噻吩基。
27.根据权利要求1-19中的任一项所述的化合物，其中R1是环烷基(C≤12)。
28.权利要求27所述的化合物，其中R1是环丙基。
29.根据权利要求1-19中的任一项所述的化合物，其中R1是烷基(C≤6)、卤代烷基(C≤6)、烯基(C≤6)或炔基(C≤6)取代的芳基(C≤12)。
30.权利要求29所述的化合物，其中R1是烷基(C≤6)取代的芳基(C≤12)。
31.权利要求30所述的化合物，其中R1是3-甲基苯基或4-甲基苯基。
32.权利要求29所述的化合物，其中R1是卤代烷基(C≤6)取代的芳基(C≤12)。
33.权利要求32所述的化合物，其中R1是4-三氟甲基苯基。
34.权利要求29所述的化合物，其中R1是炔基(C≤6)取代的芳基(C≤12)。
35.权利要求34所述的化合物，其中R1是3-乙炔-苯基。
36.根据权利要求1-19中的任一项所述的化合物，其中R1是下式的基团：
X3OR2
其中：
X3是烷二基(C≤8)或被取代的烷二基(C≤8)；
R2是芳基(C≤12)或被取代的芳基(C≤12)。
37.权利要求36所述的化合物，其中X3是烷二基(C≤8)。
38.权利要求37所述的化合物，其中X3是-CH2-。
39.根据权利要求36-38中的任一项所述的化合物，其中R2是取代的芳基(C≤12)。
40.权利要求39所述的化合物，其中R2是4-氨基苯基。
41.根据权利要求1-19中的任一项所述的化合物，其中R1是4-烷氧基(C≤6)取代的芳基(C≤12)。
42.权利要求41所述的化合物，其中R1是4-乙氧基苯基。
43.根据权利要求1-19中的任一项所述的化合物，其中R1是杂环烷基(C≤12)或被取代的杂环烷基(C≤12)。
44.权利要求43所述的化合物，其中R1是杂环烷基(C≤12)。
45.权利要求44所述的化合物，其中R1是硫代吗啉-二氧化物。
46.根据权利要求1-19中的任一项所述的化合物，其中R1是芳烷基(C≤12)或被取代的芳烷基(C≤12)。
47.权利要求46所述的化合物，其中R1是芳烷基(C≤12)。
48.权利要求47所述的化合物，其中R1是2-苯基乙基。
49.根据权利要求1-48中的任一项所述的化合物，其中所述化合物进一步被定义为：
其中：
m和n导致具有从约50,000道尔顿至约500,000道尔顿的分子量的重复单元的数目。
50.一种检测样品中的纤维化的方法，所述方法包含将所述样品暴露于根据权利要求1-49中的任一项所述的一种或多种聚合物并测量反应性。
51.一种医疗装置，其中所述医疗装置涂有根据权利要求1-49中的任一项所述的化合物。
52.权利要求51所述的医疗装置，其中所述医疗装置是可植入装置、心脏起搏器、导管、针注射导管、血块过滤器、血管移植物、球囊、支架移植物、胆管支架、肠支架、支气管支架、食管支架、输尿管支架、动脉瘤填充线圈或其它线圈装置、外科手术修复网、乳房植入物、有机硅植入物、PDMS、经心肌血运重建装置、经皮心肌血运重建装置、假体、器官、血管、主动脉、心脏瓣膜、管、器官替代部件、植入物、纤维、中空纤维、膜、纺织品、储存的血液、血液容器、滴定板、吸附剂介质、透析器、连接件、传感器、瓣膜、内窥镜、过滤器、泵室、或另一种旨在具有血液相容性能或用于癌症、糖尿病、缺血、抗细菌、血友病、中风、血液障碍或涉及人工程细胞的细胞因子疗法的医疗装置。
53.权利要求52所述的医疗装置，其中所述医疗装置是胶囊、可植入的聚合物块、3D打印块、3D打印凝胶或聚合物封装装置。
54.权利要求53所述的医疗装置，其中所述聚合物封装装置进一步包含选自球形、正方形、长条形、针形、矩形和圆柱形的形状。
55.权利要求53所述的医疗装置，其中所述可植入的胶囊是微胶囊。
56.权利要求52所述的医疗装置，其中所述医疗装置是导管。
57.根据权利要求51-56中的任一项所述的医疗装置，其中所述医疗装置导致与没有所述涂层的医疗装置相比更少的纤维化。
58.权利要求57所述的医疗装置，其中所述医疗装置与没有所述涂层的医疗装置相比是免疫保护性的。
59.权利要求58所述的医疗装置，其中所述免疫保护性导致更低的异物应答。
60.一种药物组合物，其包含：
(A)根据权利要求1-58中的任一项所述的化合物或医疗装置；和
(B)赋形剂。
61.权利要求60所述的药物组合物，其中所述药物组合物进一步包含生物材料。
62.权利要求61所述的药物组合物，其中所述生物材料被封装在所述化合物或医疗装置中。
63.权利要求62所述的药物组合物，其中所述生物材料是细胞。
64.权利要求63所述的药物组合物，其中所述细胞是来自异种组织的细胞、来自尸体的细胞、干细胞、源自干细胞的细胞、来自细胞系的细胞、原代细胞、重编程的细胞、重编程的干细胞、源自重编程的干细胞的细胞、遗传工程改造的细胞或它们的组合。
65.权利要求63所述的药物组合物，其中所述细胞是人细胞。
66.权利要求63所述的药物组合物，其中所述细胞是产生胰岛素的细胞。
67.权利要求66所述的药物组合物，其中所述细胞是胰岛细胞。
68.根据权利要求60-67中的任一项所述的药物组合物，其中所述化合物是交联的。
69.权利要求68所述的药物组合物，其中所述交联的化合物是共价地交联的。
70.一种治疗或预防疾病或障碍的方法，所述方法包括给有此需要的患者施用根据权利要求1-69中的任一项所述的化合物、医疗装置或药物组合物。
71.权利要求70所述的方法，其中所述方法导致更低的异物应答。
72.权利要求70或权利要求71所述的方法，其中所述方法导致更少的纤维化。
CN202280054901.1A 2021-06-14 2022-06-14 含有三唑的聚合物及其使用方法 Pending CN117940504A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202163210377P 2021-06-14 2021-06-14
US63/210,377 2021-06-14
PCT/US2022/033416 WO2022266086A2 (en) 2021-06-14 2022-06-14 Triazole containing polymers and methods of use thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117940504A true CN117940504A (zh) 2024-04-26

Family

ID=84527401

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202280054901.1A Pending CN117940504A (zh) 2021-06-14 2022-06-14 含有三唑的聚合物及其使用方法

Country Status (6)

Country Link
EP (1) EP4355792A2 (zh)
KR (1) KR20240055715A (zh)
CN (1) CN117940504A (zh)
AU (1) AU2022295936A1 (zh)
CA (1) CA3222453A1 (zh)
WO (1) WO2022266086A2 (zh)

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997027226A2 (en) * 1996-01-23 1997-07-31 Argonaut Technologies, Inc. Highly functionalized polyethylene glycol grafted polystyrene supports
KR20170055960A (ko) * 2014-08-01 2017-05-22 메사추세츠 인스티튜트 오브 테크놀로지 항-섬유 물질 및 응용을 위한 변형된 알기네이트
US20180353650A1 (en) * 2017-06-13 2018-12-13 Massachusetts Institute Of Technology Biocompatible microfabricated macrodevices for transplanting cells
CA3092121A1 (en) * 2018-03-02 2019-09-06 Sigilon Therapeutics, Inc. Afibrotic compounds, devices, and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
WO2022266086A2 (en) 2022-12-22
CA3222453A1 (en) 2022-12-22
EP4355792A2 (en) 2024-04-24
WO2022266086A3 (en) 2023-02-02
AU2022295936A1 (en) 2024-01-25
KR20240055715A (ko) 2024-04-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6915224B2 (ja) 抗線維化材料のための修飾されたアルギネートおよび用途
US10730983B2 (en) Biocompatible coatings and hydrogels for reducing foreign body response and fibrosis
US7919112B2 (en) Implantable tissue compositions and method
AU2016344041B2 (en) Materials with improved properties
JP2017524768A5 (zh)
CN117940504A (zh) 含有三唑的聚合物及其使用方法
CN111407922B (zh) 黒磷组合物、含黒磷组合物的生物材料及制备方法和应用
Mukherjee et al. In vivo screening of hydrogel library using cellular barcoding identifies biomaterials that mitigate host immune responses and fibrosis
KR101614802B1 (ko) 심근경색 재생을 위한 세크레토뉴린 펩타이드가 고정된 하이드로젤 및 그 제조방법

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication