CN117940155A - 免疫原性组合物及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

提供一种包含病原体或病原体感染的宿主细胞或它们的裂解物的免疫原性组合物，其中该病原体或宿主细胞已经使用类异戊二烯代谢途径的抑制剂处理；还提供了开了使用所述的免疫原性组合物来治疗或预防由病原体感染引起的疾病或症状的方法，以及本文的免疫原性组合物在制备用于预防和/或治疗受试者中由病原体感染引起的疾病或症状的药物中的用途。

Description

免疫原性组合物及其制备方法和用途
本申请要求于2021年9月9日提交的中国专利申请202111055072.2的优先权，其全部内容通过引用并入本文以用于所有目的。
技术领域
本发明涉及免疫原性组合物及其制备方法，以及使用该免疫原性组合物来治疗或预防由病原体感染引起的疾病或症状的方法。
背景技术
宿主先天免疫细胞是对抗病原体的第一道防线，使用主要组织相容性复合物(MHC)在其表面呈递抗原。这种抗原呈递启动了清除受感染宿主细胞的适应性T和B细胞免疫应答。然而，微生物病原体通过进化复杂而有效的方法来应对宿主先天性和适应性免疫机制。包括疟原虫在内的感染性病原体用来逃避宿主免疫的机制长期以来一直尚未阐明，这使得开发疫苗和根除这些病原体十分困难。
在由感染性病原体引起的多种疾病中，疟疾仍然是严重的全球健康问题，每年有数十万人死于疟原虫感染。这些寄生虫最初在肝细胞中生长和繁殖，然后再感染红细胞(RBC)。在血液中，连续的寄生虫群在红细胞内生长并摧毁红细胞，正是这些红细胞期寄生虫引起了疟疾症状。红细胞期疟疾寄生虫是疟疾所有临床症状的起因，临床疾病的发展取决于寄生虫与宿主免疫系统之间的相互作用。反复接触疟原虫后会产生自然获得性免疫，这为开发红细胞期疟疾疫苗提供了理论依据，但迄今为止仅实现了较差的临床结果，目前仍然没有针对红细胞期疟疾的疫苗获得批准。此外，新出现的对一线抗疟疾药物的耐药性构成了巨大的公共卫生威胁。这些困境至少部分是因为对寄生虫如何逃避宿主免疫监视的机制缺乏了解。
最新的研究表明，脂质代谢，尤其是类异戊二烯生物合成在免疫调节中发挥重要功能。类异戊二烯是由异戊烯二磷酸(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)产生有机小分子，其在生命结构中发挥重要作用。先前已报道，这些不可或缺的生物分子在调节树突细胞功能、γδT细胞活化和作为诱导急性细胞死亡的危险信号方面的具有相关功能。以哺乳动物树突状细胞为例，甲 羟戊酸(MVA)途径产生香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)分子，该分子已知可调节小GTP酶的脂化，最终导致抗原加工动力学的改变。然而，关于类异戊二烯生物合成途径与病原体-宿主相互作用，特别是宿主对病原体的免疫应答之间的关联性尚不明了。
发明概述
本发明人发现，通过阻断病原体的类异戊二烯代谢途径，抑制了下游途径包括蛋白质的香叶酰香叶酰化，使得原本利用香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)隐藏的抗原蛋白得以暴露，从而诱导宿主的免疫应答。因此，通过抑制参与类异戊二烯代谢途径的各种酶可用于预防或治疗包括疟疾在内的多种病原体感染疾病。
相应地，在第一个方面，本公开涉及一种免疫原性组合物，其包含病原体或该病原体感染的宿主细胞或它们的裂解物，其中所述病原体或所述宿主细胞已经使用类异戊二烯代谢途径的抑制剂处理。
在一些实施方案中，所述病原体选自寄生虫、病毒、细菌和真菌。
在一些实施方案中，所述寄生虫可以是顶复门原虫，例如选自疟原虫(Plasmodium spp.)、弓形虫(Toxoplasma gondii)、隐孢子虫(Cryptosporidium spp.)、巴贝斯虫(Babesia spp.)和艾美耳球虫(Eimeria spp.)。
在一些实施方案中，所述寄生虫是疟原虫，例如选自夏氏疟原虫(Plasmodium chabaudi)、约氏疟原虫(Plasmodium yoelii)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、伯氏疟原虫(Plasmodium berghei)、三日疟原虫(Plasmodium malariae)和卵形疟原虫(Plasmodium ovale)。
在一些优选的实施方案中，所述病原体为疟原虫，且所述宿主细胞为红细胞或其前体细胞。
在另一些实施方案中，所述病原体是病毒，例如选自非洲猪瘟病毒、腺病毒、登革热1至4血清型、埃博拉病毒、肠道病毒、肝炎A至E血清型、单纯疱疹病毒1或2、人免疫缺陷病毒、流感病毒、中东呼吸综合征(Mers)病毒、日本马脑炎病毒、麻疹病毒、诺沃克病毒、乳头瘤病毒、细小病毒B19、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、轮状病毒、风疹病毒、麻疹病毒、痘苗病毒、水痘病毒、和黄热病病毒。
在一些实施方案中，所述病原体是细菌，例如选自结核分枝杆菌、炭疽、弯曲杆菌、霍乱、白喉、产肠毒素性大肠杆菌、贾第虫、淋球菌、幽门螺杆菌、乙型流感嗜血菌、不可定型的流感嗜血菌、脑膜炎球菌、百日咳、肺炎球菌、沙门氏菌、志贺氏菌、链球菌B、A组链球菌、破伤风、霍乱弧菌、耶尔森氏菌、葡萄球菌、假单胞菌属物种和梭菌属物种。
在另一些实施方案中，所述病原体是真菌，例如选自孢子、霉菌和酵母(例如，念珠菌物种)。
在本公开的免疫原性组合物的一些实施方案中，所述类异戊二烯代谢途径的抑制剂是针对参与类异戊二烯代谢途径的酶的抑制剂。例如，所述酶可以选自参与甲羟戊酸(MVA)途径的酶和参与2C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸(MEP)途径的酶。
在一些实施方案中，所述参与MVA途径的酶可以选自乙酰CoA乙酰基转移酶(ATOB)、HMG-CoA合酶(HMG)、HMG-CoA还原酶(HMGR)、甲羟戊酸激酶(MVK)、磷酸甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶(MPD)、异戊烯焦磷酸异构酶(IPI)、法尼基焦磷酸合酶(FPPS)、香叶基香叶基焦磷酸合酶(GGPPS)和香叶基香叶基转移酶(GGTase)。
在一些实施方案中，参与MEP途径的酶可以选自1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXS)、1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(DXR)、2C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸胞苷基转移酶(IspD)、4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓糖醇激酶(IspE)、2C-甲基-D-赤藓糖醇-2,4-环二磷酸合酶(IspF)、1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸合酶(IspG)、4-羟基-3-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸还原酶(IspH)、香叶基香叶基焦磷酸合酶(GGPPS)和香叶基香叶基转移酶(GGTase)。
在本公开的免疫原性组合物的一些实施方案中，所述类异戊二烯代谢途径的抑制剂抑制蛋白质的香叶酰香叶酰化。
在本公开的免疫原性组合物的一些实施方案中，所述抑制剂可以选自小分子抑制剂、抑制性RNA分子(例如siRNA、miRNA)、蛋白质或肽类抑制剂。
在一些实施方案中，所述抑制剂可以选自膦胺霉素、FR-900098、TH-Z626、双膦酸类(例如利塞膦酸盐、唑来膦酸盐、TH-Z321、TH-Z613、BPH-703)、GGTI-298、GGTI-287、GGTI297、FTI-276和FTI277中的一种或 多种。
在一些实施方案中，所述抑制剂可以选自TH-Z321、TH-Z613和BPH-703。
在一些实施方案中，所述抑制剂可以选自以下化合物或其药学上可接受的盐：
在一些实施方案中，所述抑制剂可以为他汀类，例如普伐他汀、阿托伐他汀、罗苏伐他汀、氟伐他汀、匹伐他汀、美伐他汀、洛伐他汀、辛伐他汀、西立伐他汀，或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述抑制剂可以为双膦酸类，例如唑来膦酸、帕米 膦酸、阿仑膦酸、伊班膦酸、奈立膦酸、利塞膦酸、奥帕膦酸、米诺磷酸、西马膦酸、EB-1053、依替膦酸、英卡膦酸、匹瑞膦酸、唑仑膦酸、伊本膦酸，或其药学上可接受的盐。
在一些实施方案中，所述抑制剂可以为式I所示化合物或其药学上可接受的盐或水合物：
上述式I中，其分子量小于1000，Ar为苯并咪唑类基或氮杂苯并咪唑基；X为下述任意一种：氢、羟基、脂肪基、巯基、卤素、烷氧基或烷基；每一个M可独立地为下述任意一种：负电荷、氢、烷基、脂肪基、-(CH 2)p-O-CO-R、-(CH 2)p-CO-R或阳离子；其中，p＝1-6，R为氢、烷基或芳香基；所述阳离子为Li +、Na +、K +、Ca 2+、Mg 2+、NH 4 +或N(R’) 4 +，其中R’为烷基；R 6、R 7分别独立地选自下述任意一种：氢、羟基、巯基、卤素、氨基、脂肪基或烷基；和m＝1-6的整数。
在一些实施方案中，所述抑制剂可以为下式的化合物或其可药用盐、酯、前药、溶剂化物：
其中，R 1、R 2各自选自氢、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷基氨基、烷基硫基、卤素、羟基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基，所述烷氧基中的烷基任选被芳基、杂芳基或杂环基取代，所述芳基、杂芳基或杂环基任选取代有烷基、氨基甲酰基；和X选自氢、羟基、巯基、卤素。
在一些实施方案中，所述抑制剂可以为下式的化合物或其可药用盐、酯、前药、溶剂化物：
其中，R 3、R 4各自选自氢、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷基氨基、烷基硫基、卤素、羟基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基，所述烷氧基中的烷基任选被芳基、杂芳基或杂环基取代，所述芳基、杂芳基或杂环基任选取代有烷基、氨基甲酰基；和X选自氢、羟基、巯基、卤素。
在一些实施方案中，所述抑制剂可以为下式的化合物或其可药用盐、酯、前药、溶剂化物：
其中，R 1选自氢、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷基氨基、烷基硫基、卤素、羟基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基，所述烷氧基中的烷基任选被芳基、杂芳基或杂环基取代，所述芳基、杂芳基或杂环基任选取代有烷基、氨基甲酰基；R 2选自氢、烷基、烷氧基、烷基氨基、烷基硫基、卤素、羟基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基；R 3选自氢、烷基、烷氧基、烷基氨基、烷基硫基、卤素、羟基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基；或者R 2与R 3与它们所连接的碳原子一起形成芳环或杂芳环；以及R 4选自氢、烷基、烷氧基、烷基氨基、烷基硫基、卤素、羟基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基。
在一些实施方案中，所述抑制剂可以为下式的化合物或其可药用盐、酯、前药、溶剂化物：
其中，R 5选自氢、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷基氨基、烷基硫基、卤素、羟基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基；R 6选自氢、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷基氨基、烷基硫基、卤素、羟基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基；R 7选自氢、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷基氨基、烷基硫基、卤素、羟基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基；以及R 8选自氢、烷基、烯基、 炔基、烷氧基、烷基氨基、烷基硫基、卤素、羟基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基。
在一些实施方案中，所述抑制剂可以为下式的化合物或其可药用盐、酯、前药、溶剂化物：
其中，R 9选自氢、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷基氨基、烷基硫基、卤素、羟基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基；R 10选自氢、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷基氨基、烷基硫基、卤素、羟基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基；R 11选自氢、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷基氨基、烷基硫基、卤素、羟基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基；以及R 12选自氢、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷基氨基、烷基硫基、卤素、羟基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基。在一些实施方案中，所述组合物是疫苗组合物。
在一些实施方案中，所述疫苗组合物还包含一种或多种佐剂。例如，所述佐剂可以选自铝佐剂(例如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝、明矾)、MF59、AS03、病毒体(例如肝炎病毒病毒体和流感病毒病毒体)、AS04、热可逆水包油乳液、ISA51、弗氏佐剂、IL-12、CpG基序、甘露糖或其任意组合。
在第二方面，本公开涉及免疫原性组合物，其包含病原体或病原体感染的宿主细胞或它们的裂解物，其中所述病原体或所述宿主细胞中的编码参与类异戊二烯代谢途径的酶的基因被敲除，或经突变使得所述酶的功能降低或丧失。
在一些实施方案中，所述基因的突变选自核苷酸的插入、缺失、取代或其任意组合。
在一些实施方案中，所述基因的敲除或突变通过基因编辑来实现。
在一些实施方案中，所述基因编辑通过使用选自以下的系统来实现：CRISPR/Cas、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活样效应因子核酸酶(TALEN)和巨型核酸酶(Meganuclease)。
在一些实施方案中，所述基因编辑通过使用CRISPR/Cas系统来实现，所述CRISPR/Cas系统选自CRISPR/Cas9、CRISPR/nCas9、CRISPR/Cas10、CRISPR/Cas9a、CRISPR/Cas12、CRISPR/Cas12a、CRISPR/Cas12b、 CRISPR/Cas13和CRISPR/Cas14。
在一些实施方案中，所述CRISPR/Cas系统为CRISPR/Cas9；优选地，所述CRISPR/Cas9包含D10A突变。
在一些实施方案中，所述CRISPR/Cas系统还包含gRNA，所述gRNA包含能够与所述编码参与类异戊二烯代谢途径的酶的基因互补的序列。
在一些实施方案中，所述病原体选自寄生虫、病毒、细菌和真菌。
在一些实施方案中，所述寄生虫为顶复门原虫。
在一些实施方案中，所述顶复门原虫选自疟原虫(Plasmodium spp.)、弓形虫(Toxoplasma gondii)、隐孢子虫(Cryptosporidium spp.)、巴贝斯虫(Babesia spp.)和艾美耳球虫(Eimeria spp.)。
在一些实施方案中，所述疟原虫选自夏氏疟原虫(Plasmodium chabaudi)、约氏疟原虫(Plasmodium yoelii)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、伯氏疟原虫(Plasmodium berghei)、三日疟原虫(Plasmodium malariae)和卵形疟原虫(Plasmodium ovale)。
在一些实施方案中，所述病原体为疟原虫，且所述宿主细胞为红细胞或红细胞前体细胞。
在一些实施方案中，所述病毒选自非洲猪瘟病毒、腺病毒、登革热1至4血清型、埃博拉病毒、肠道病毒、肝炎A至E血清型、单纯疱疹病毒1或2、人免疫缺陷病毒、流感病毒、中东呼吸综合征(Mers)病毒、日本马脑炎病毒、麻疹病毒、诺沃克病毒、乳头瘤病毒、细小病毒B19、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、轮状病毒、风疹病毒、麻疹病毒、痘苗病毒、水痘病毒、和黄热病病毒。
在一些实施方案中，所述细菌选自结核分枝杆菌、炭疽、弯曲杆菌、霍乱、白喉、产肠毒素性大肠杆菌、贾第虫、淋球菌、幽门螺杆菌、乙型流感嗜血菌、不可定型的流感嗜血菌、脑膜炎球菌、百日咳、肺炎球菌、沙门氏菌、志贺氏菌、链球菌B、A组链球菌、破伤风、霍乱弧菌、耶尔森氏菌、葡萄球菌、假单胞菌属物种和梭菌属物种。
在一些实施方案中，所述真菌选自孢子、霉菌和酵母(例如，念珠菌物种)。
在一些实施方案中，所述参与类异戊二烯代谢途径的酶选自参与甲羟戊酸(MVA)途径的酶和参与2C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸(MEP)途径的酶。
在一些实施方案中，所述参与MVA途径的酶选自乙酰CoA乙酰基转移酶(ATOB)、HMG-CoA合酶(HMG)、HMG-CoA还原酶(HMGR)、甲羟戊酸激酶(MVK)、磷酸甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶(MPD)、异戊烯焦磷酸异构酶(IPI)、法尼基焦磷酸合酶(FPPS)、香叶基香叶基焦磷酸合酶(GGPPS)和香叶基香叶基转移酶(GGTase)；和所述参与MEP途径的酶选自1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXS)、1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(DXR)、2C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸胞苷基转移酶(IspD)、4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓糖醇激酶(IspE)、2C-甲基-D-赤藓糖醇-2,4-环二磷酸合酶(IspF)、1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸合酶(IspG)、4-羟基-3-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸还原酶(IspH)、香叶基香叶基焦磷酸合酶(GGPPS)和香叶基香叶基转移酶(GGTase)。
在一些实施方案中，所述病原体为非洲猪瘟病毒，并且所述编码参与类异戊二烯代谢途径的酶的基因为非洲猪瘟病毒编码GGPPS的基因B318L。
在一些实施方案中，所述组合物是疫苗组合物。
在一些实施方案中，所述疫苗组合物还包含一种或多种佐剂。
在一些实施方案中，所述佐剂选自铝佐剂(例如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝、明矾)、MF59、AS03、病毒体(例如肝炎病毒病毒体和流感病毒病毒体)、AS04、热可逆水包油乳液、ISA51、弗氏佐剂、IL-12、CpG基序、甘露糖或其任意组合。
在第三方面，本公开涉及制备本公开的第一方面的免疫原性组合物的方法，所述方法包括使所述病原体或宿主细胞与类异戊二烯代谢途径的抑制剂接触的步骤。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括在接触步骤后裂解所述病原体或宿主细胞以获得裂解物的步骤。
在第四方面，本公开涉及制备本公开第二方面的免疫原性组合物的方法，所述方法包括敲除或突变所述病原体或所述宿主细胞中的编码参与类异戊二烯代谢途径的酶的基因使得所述酶的功能降低或丧失的步骤。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括在敲除或突变步骤后裂解所述病原体或宿主细胞以获得裂解物的步骤。
在第五方面，本公开涉及预防和/或治疗受试者中由病原体感染引起的疾病或症状的方法，其包括向所述受试者施用有效量的本公开的第一方面或第 二方面的免疫原性组合物的步骤。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括施用一种或多种另外的预防剂或治疗剂。
在一些实施方案中，所述另外的预防剂或治疗剂可以是先天性免疫激动剂，例如选自STING激动剂如DMAXX和TLR激动剂如咪喹莫特。
在第六方面，本公开涉及本公开的第一方面或第二方面的免疫原性组合物，其用于预防和/或治疗受试者中由病原体感染引起的疾病或症状。
在第七方面，本公开涉及本公开的第一方面或第二方面的免疫原性组合物在制备用于预防和/或治疗受试者中由病原体感染引起的疾病或症状的药物中的用途。
在本公开第六方面和第七方面的用途的一些实施方案中，所述免疫原性组合物用于与一种或多种另外的预防剂或治疗剂的一起使用。
在一些实施方案中，所述另外的预防剂或治疗剂可以是先天性免疫激动剂，例如选自STING激动剂如DMAXX和TLR激动剂如咪喹莫特。
在第八方面，本公开涉及治疗受试者中由病原体感染引起的疾病或症状的方法，其包括向所述受试者施用有效量的至少一种参与MEP途径的酶的抑制剂以及至少一种选自以下的治疗剂：参与MVA途径的酶的抑制剂和先天性免疫激动剂。
在本公开第八方面的一些实施方案中，所述参与MEP途径的酶选自1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXS)、1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(DXR)、2C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸胞苷基转移酶(IspD)、4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓糖醇激酶(IspE)、2C-甲基-D-赤藓糖醇-2,4-环二磷酸合酶(IspF)、1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸合酶(IspG)、4-羟基-3-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸还原酶(IspH)、香叶基香叶基焦磷酸合酶(GGPPS)和香叶基香叶基转移酶(GGTase)。
在一些实施方案中，所述参与MVA途径的酶选自乙酰CoA乙酰基转移酶(ATOB)、HMG-CoA合酶(HMG)、HMG-CoA还原酶(HMGR)、甲羟戊酸激酶(MVK)、磷酸甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶(MPD)、异戊烯焦磷酸异构酶(IPI)、法尼基焦磷酸合酶(FPPS)、香叶基香叶基焦磷酸合酶(GGPPS)和香叶基香叶基转移酶(GGTase)。优选地，其中所述参与MVA途径的酶的抑制剂为辛伐他丁。
在一些实施方案中，所述先天性免疫激动剂选自STING激动剂如DMAXX和TLR激动剂如咪喹莫特。
在一些实施方案中，所述病原体选自寄生虫、病毒、细菌和真菌。
附图说明
在本公开中，如果没有另外说明，使用的小鼠为BALB/c品系，每组小鼠n＝5。如果没有另外说明，使用图1A和相关附图说明中所述的免疫接种流程并在最后一次免疫后1个月进行攻毒。如果没有另外说明，使用的疟原虫和疟原虫寄生的红细胞分别为夏氏疟原虫(Pc)和夏氏疟原虫寄生的红细胞(Pc pRBC)。
图1.使用疟原虫类异戊二烯生物合成抑制剂膦胺霉素(FOS)处理的全寄生虫疫苗(WPV)能够用于预防红细胞期疟疾。(A)使用不同药物处理的WPV用于免疫接种的流程的示意图。小鼠(n＝5)接受10 7个药物处理的夏氏疟原虫(Pc)寄生的红细胞(Pc pRBC)的3次免疫，其中使用10 7个正常红细胞(nRBC)作为对照(Ctrl)。在最后一次免疫后1个月或3个月用10 5个Pc pRBC对动物进行攻毒。(B)使用FOS/青蒿素(ART)/氯喹(CQ)处理的WPV进行疫苗接种后1个月时进行攻毒的防护功效。监测小鼠的寄生虫血症和存活率。(C)使用FOS处理的WPV进行疫苗接种后3个月时进行攻毒的防护功效。(D)使用FOS处理的约氏疟原虫(Py)pRBC WPV进行疫苗接种后1个月时对同源病毒Py pRBC进行攻毒时的防护功效。(E)小鼠用10 7个FOS处理的Pc pRBC免疫3次；1个月后，用10 5个Py pRBC对小鼠进行异源病毒攻毒时的防护效果。使用对数秩(Mantel-Cox)检验分析生存图数据(D和E)。NS，不显著，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001和****P<0.0001。误差线表示SEM。
图2.DXR抑制剂诱导的免疫防护作用的免疫细胞依赖性评估。(A)如图1A中所述对C57BL/6小鼠或B细胞缺陷型小鼠(n＝5)进行免疫，在最后一次免疫1个月后用10 5个Pc pRBC进行攻毒；监测寄生虫血症和存活率。(B)在用Pc pRBC进行攻毒的第-1、0、1、2、3、4、6和10天，向免疫的小鼠注射大鼠IgG(对照IgG)、抗CD4或抗CD8抗体以耗竭对应的T细胞类型；监测寄生虫血症和存活率。(C)免疫小鼠的细胞因子和脾细胞分析。C57BL/6小鼠(n＝3)用10 7个FOS处理的Pc pRBC或10 7个FOS处理的nRBC免疫3次。最后一次免疫后30天，处死小鼠并在布雷菲尔德菌素A存在下用PMA和离子霉素在体外刺激脾细胞 6小时。通过染色分析IFNγ +CD4 +T细胞的百分比(左图)；将脾细胞与培养基(对照)、nRBC或Pc pRBC以1:1的比例培养72小时，然后收集上清液用于测量细胞因子水平(右图)。使用对数秩(Mantel-Cox)检验分析生存图数据(A和B)。NS，不显著，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001和****P<0.0001。使用双尾未配对学生t检验分析细胞因子和脾细胞数据(C)。误差线表示SEM。
图3.经免疫的供体小鼠的血清过继转移到受体小鼠后提供免疫保护。(A)从用FOS处理的Pc pRBC免疫小鼠或未免疫小鼠收集血清；在进行攻毒的第-1、0、1、2、3、4和6天，每只受体小鼠接受500μl血清。对于攻毒实验，受体小鼠在第0天腹膜内接种10 5个Pc pRBC。(B)监测小鼠的寄生虫血症和存活率。使用对数秩(Mantel-Cox)检验分析生存图数据。NS，不显著，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001和****P<0.0001。误差线表示SEM。
图4.FR900098(另一种DXR抑制剂)的化学结构，以及使用FR900098处理的Pc pRBC在小鼠中的防护功效。使用对数秩(Mantel-Cox)检验分析生存图数据。NS，不显著，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001和****P<0.0001。误差线表示SEM。
图5.选择性疟原虫GGPPS抑制剂开发。(A)与双膦酸盐BPH-1222(PDB代码4N1Z)复合的人FPPS的结构表明，在杂环(蓝色)中引入额外的基团可能导致位阻，从而阻止与人FPPS的结合。(B)GGPP分子的香叶基香叶基尾部位于疏水裂缝中，如PDB(2Q80)所示；引入极性配体基团(红色圆圈)可能不利于结合。(C)通过在吡啶鎓-1-基环中引入甲基并在癸基链尾部引入四唑基团开发了选择性疟原虫GGPPS抑制剂TH-Z626。解析的与TH-Z626(PDB代码7ES7)复合的间日疟原虫GGPPS的结构表明，两个水分子位于TH-Z626的四唑环附近，并且引入的甲基不会破坏TH-Z626与疟原虫GGPPS的结合。(D)与TH-Z626复合的间日疟原虫GGPPS的结构示意图，以及TH-Z626(PDB代码7ES7)的密度图。Mg 2+离子显示为粉红色球体，水分子显示为红色球体。(E)TH-Z626以0.12μM的IC 50抑制间日疟原虫GGPPS，该IC 50值与唑来膦酸(ZOL)相当；TH-Z626以2.49μM的EC 50抑制恶性疟原虫。TH-Z626的作用可以通过添加外源GGPP(10μM)来阻断。(F)体外活性测定表明，TH-Z626不抑制纯化的重组人FPPS(HsFPPS)或人GGPPS(HsGGPPS)；非选择性唑来膦酸盐(ZOL)和TH-Z145用作阳性对照。(G)细胞测定表明，TH-Z626不抑制小鼠FPPS或GGPPS，如通过测量其增强脂多糖(LPS)引发的小鼠BMDM(骨髓衍生的巨噬 细胞)中炎性细胞因子的产生来证实；非选择性ZOL用作阳性对照。(H)通过测试TH-Z626在C57BL/6小鼠中产生OVA特异性抗体的佐剂性来评估TH-Z626的选择性；非选择性TH-Z93作为对照(n＝5)。(I)TH-Z626处理的Pc WPV赋予完全防护作用。(J)TH-Z626处理的Py WPV提供了防止约氏疟原虫感染的保护。在最后一次免疫后1个月的寄生虫进行攻毒后，监测寄生虫血症和存活率。(K)THZ-626处理的WPV的防护功效依赖于B细胞和CD4T细胞(实验程序如图2A和2B中所述)。使用双尾未配对学生t检验分析炎性细胞因子和抗体滴度数据(G和H)。使用对数秩(Mantel-Cox)检验分析生存图数据(I、J和K)。NS，不显著，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001和****P<0.0001。误差线表示SEM。
图6.用于疟疾治疗的双重GGPPS抑制剂的表征及其抗疟剂功效和免疫细胞依赖性评估。(A)BPH-703、TH-Z321和TH-Z613的化学结构以及酶促和寄生虫抑制活性。(B)与疟原虫GGPPS(PDB代码7ES3)复合的代表性双重GGPPS抑制剂TH-Z321的X射线晶体结构。(C)与人GGPPS(PDB代码7ERW)复合的代表性双重GGPPS抑制剂TH-Z321的X射线晶体结构。在B和C的两种结构中，烷基链位于疏水裂缝中，双膦酸头部与Mg 2+离子螯合。(D)所有三种抑制剂都表现出有效的佐剂性，如通过C57BL/6小鼠中的OVA特异性抗体测量(每组n＝5)。TH-Z93用作阳性对照。所有实验重复至少3次。(E)双重GGPPS抑制剂如BPH-703、TH-Z321、TH-Z613用于降低宿主GGPPS活性和寄生虫GGPPS活性的图示；这些双重抑制剂可以替代辛伐他汀和FOS组合的治疗需求。BALB/c小鼠用10 7个Pc pRBC感染，并用BPH-703(10mg/kg)、TH-Z321(8mg/kg)或TH-Z613(8mg/kg)处理(腹膜内注射，每天一次，持续5天)；1个月后，最初治愈的小鼠用10 5个Pc pRBC再次攻毒(每组n＝5)。记录存活率和寄生虫血症。(F)Pc(10 7)感染的C57BL/6小鼠和B细胞缺陷型(μMT)小鼠在感染后每天用BPH-703(2mg/kg)或CQ(3mg/kg)处理，并记录寄生虫血症。(G)Pc感染的C57BL/6小鼠用BPH-703(2mg/kg)处理，感染后每天给予对照IgG或α-NK抗体；记录寄生虫血症。与BPH-703不同，CQ的体内抗疟活性不依赖于B细胞或NK细胞。通过使用双尾未配对学生t检验分析抗体滴度数据(D)。使用对数秩(Mantel-Cox)检验分析生存图数据(E)。治疗数据用双向ANOVA进行分析(F和G)。NS，不显著，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001和****P<0.0001。误差线表示SEM。
图7.抑制疟原虫香叶酰香叶酰化促进了针对红细胞期疟疾寄生虫的适应性免疫应答。(A)显示疟原虫类异戊二烯生物合成途径和五种小分子抑制剂靶向的代谢节点的示意图。(B)香叶基香叶基转移酶抑制剂GGTI-298，而不是下游泛醌或Q10抑制剂，促进了WPV的功效。如图1A中所述进行免疫；最后一次免疫后1个月开始寄生虫攻击。(C)GGTI-298处理使WPV能够抵抗疟原虫感染(n＝5)。使用对数秩(Mantel-Cox)检验分析生存图数据(B和C)。NS，不显著，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001和****P<0.0001。误差线表示SEM。
图8.FOS处理的pRBC在用LPS引发时没有改变小鼠骨髓衍生的树突细胞(BMDC)的成熟状态，如通过CD80和CD86表达进行评估。
图9.香叶酰香叶酰化抑制导致抗原蛋白的暴露增加。(A)在用FOS/TH-Z626/GGTI-298处理24小时的细胞中进行针对蛋白质长链异戊二烯修饰的免疫印迹。(B)FOS、TH-Z626和GGTI-298影响恶性疟原虫Rab5a(PfRab5a)的细胞定位。(C)FOS、TH-Z626和GGTI-298导致恶性疟原虫REX1(PfREX1)错误定位。FOS和TH-Z626的活性通过添加内源GGPP被阻断(B和C)。为了确定PfRab5a/PfREX1错误定位的严重程度，在每种条件下对50个细胞进行盲法评分(图B和C的右侧小图)。使用异硫氰酸荧光素(FITC)来探测B和C中的PfRab5a和PfREX1。(D)FOS、TH-Z626和GGTI-298导致SBP1的错误定位。使用抗恶性疟原虫SBP1(PfSBP1)抗体通过共聚焦免疫荧光来检测。通过使用双尾未配对学生t检验分析错误定位数据(B、C和D)。NS，不显著，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001和****P<0.0001。误差线表示SEM。
图10.疟原虫中香叶酰香叶酰化抑制对食物液泡形态的影响。FOS/TH-Z626/GGTI-298处理的寄生虫中的食物液泡缺陷。异常食物液泡被定义为缺乏食物液泡膜的食物液泡(在每种条件下n>30)。FOS和TH-Z626的作用通过添加外源GGPP被阻断。通过使用双尾未配对学生t检验分析数据。NS，不显著，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001和****P<0.0001。误差线表示SEM。
图11.疟原虫中香叶酰香叶酰化抑制对寄生虫生长的影响。直接抑制疟原虫中蛋白质香叶酰香叶酰化导致“快速细胞死亡”。(A)FOS/BPH703/TH-Z626/GGTI-298处理的寄生虫在第一个生长周期的滋养体阶段停滞，而用强力霉素(DOX)、克林霉素(CLIN)或阿奇霉素(AZI)处理的寄生虫在第二个生长周期的裂殖体阶段停滞。(B)在处理后48和96小时评估的7种抗疟药的IC 50 值汇总表。
图12.药物处理的pRBC裂解物提供了抗疟疾免疫防护作用。(A)FOS/TH-Z626/GGTI-298处理增加了来自pRBC裂解物上清液(代表细胞质含量)中的REX1和SBP1水平。(B)用经FOS处理后裂解的的pRBC的上清液对小鼠进行免疫接种提供强的抗感染防护。小鼠接种3剂来自10 7个FOS处理的Pc pRBC的裂解物上清液或裂解物沉淀，在接种1个月后用10 5个Pc pRBC进行攻毒；裂解物上清液缩写为Lys-S，裂解物沉淀缩写为Lys-P。(C)来自FOS-Pc pRBC(10 4)的裂解物上清液在与佐剂(利塞膦酸盐-MnCl 2)一起施用时提供针对夏氏疟原虫感染的全面防护。使用对数秩(Mantel-Cox)检验分析生存图数据(B和C)。NS，不显著，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001和****P<0.0001。误差线表示SEM。
图13.MEP途径抑制剂与其他治疗剂的联合疗法实现协同的抗疟疾功效。(A)使用FOS和佐剂组合用于疟疾治疗的基本原理的示意图。(B和C)FOS(40mg/kg)与DMXAA(5mg/kg)、咪喹莫特(5mg/kg)(B)或辛伐他汀(SIM，5mg/kg)(C)组合的治疗功效。攻毒后每天治疗Pc感染的小鼠，并监测寄生虫血症。治疗数据用双向ANOVA进行分析(B和C)。NS，不显著，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001和****P<0.0001。误差线表示SEM。
发明详述
术语
除非另有限定，否则本文所使用的全部技术和科学术语的含义与本领域普通技术人员通常所理解的含义相同。例如，本文所使用的术语如“A multilingual glossary of biotechnological terms:(IUPAC Recommendations)”,Leuenberger,H.G.W,Nagel,B.和 H.编辑(1995),Helvetica Chimica Acta,CH-4010Basel,Switzerland中所述的定义。
应当注意，如本文中及所附权利要求书中使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数提及物，除非上下文另有明确规定。因此，术语“一个”、“一种”、“一个/种或多个/种”和“至少一个/种”可以互换使用。类似地，术语“包含”、“包括”和“具有”可以互换使用。
如本文中使用的，术语“蛋白质”、“多肽”和“肽”在本文中可互换使用，并且指氨基酸的任何肽连接链，无论长度、共翻译或翻译后修饰如何。
如本文中使用的，术语“抗原蛋白”是如上文定义的多肽，其含有至少一个表位。在本发明的一个实施方案中，抗原蛋白是病原体表达的多肽或多肽片段。抗原蛋白的“抗原性片段”是所述抗原蛋白的部分序列，其包含至少一个表位。对于免疫目的，仅蛋白的那些引发免疫应答的部分是有关的。抗原蛋白或其抗原性片段诱导B细胞应答或T细胞应答，或者B细胞应答和T细胞应答。因此，抗原蛋白或抗原性片段包含至少一个T细胞表位和/或至少一个B细胞表位。
如本文中使用的，术语“免疫原性”指特定蛋白质或其特定区域引发对特定蛋白质，或包含与特定蛋白质具有高度同一性的氨基酸序列的蛋白质的免疫应答的能力。依照本发明，两种具有高度同一性的蛋白质具有至少80％相同，至少85％相同，至少87％相同，至少90％相同，至少92％相同，至少94％相同，至少96％相同，至少98％相同或至少99％相同的氨基酸序列。
如本文中使用的，对本发明的免疫原性组合物或疫苗组合物的免疫应答是受试者中形成对组合物中存在的抗原蛋白的体液和/或细胞免疫应答。出于本发明的目的，“体液免疫应答”指由抗体分子，包括分泌性(IgA)或IgG分子介导的免疫应答，而“细胞免疫应答”指由T-淋巴细胞和/或其它白细胞介导的免疫应答。细胞免疫的一个重要方面牵涉细胞裂解T细胞(“CTL”)的抗原特异性应答。CTL对由主要组织相容性复合物(MHC)编码并且在细胞表面上表达的蛋白质结合呈递的肽抗原具有特异性。CTL帮助诱导并促进对胞内微生物的破坏，或者此类微生物感染的细胞的裂解。细胞免疫的另一个方面牵涉辅助T细胞的抗原特异性应答。辅助T细胞作用为帮助刺激功能，并且聚焦非特异性效应细胞针对在其表面上展示与MHC分子结合的肽抗原的细胞的活性。细胞免疫应答还涉及生成由活化的T细胞和/或其它白细胞，包括那些自CD4+和CD8+T细胞衍生的细胞生成的细胞因子、趋化因子和其它此类分子。
因此，免疫应答可以是刺激CTL，和/或辅助T细胞生成或活化的应答。也可以刺激趋化因子和/或细胞因子的生成。免疫原性组合物或疫苗组合物也可以引发抗体介导的免疫应答。因此，免疫应答可以包括下列一种或多种效应：B细胞的抗体(例如IgA或IgG)生成；和/或抑制物、细胞毒性或辅助T细胞和/或特异性针对疫苗中存在的蛋白的T细胞的活化。这些应答可以用来中和感染性，和/或介导抗体-补体，或抗体依赖性细胞细胞毒性(ADCC)以对经免疫个体提供保护。可以使用本领域中公知的标准免疫测定法和中和测定法测 定此类应答。
如本文中使用的，术语“佐剂”指在细胞水平或体液水平增加、刺激、活化、加强或调节针对组合物之活性成分的免疫应答的试剂，例如，免疫佐剂刺激免疫系统针对实际抗原的应答但其本身没有免疫效应。这样的佐剂的实例包括但不限于无机佐剂(例如，无机金属盐例如磷酸铝或氢氧化铝)、有机佐剂(例如，皂角苷或鲨烯)、油基佐剂(如弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂)、细胞因子(如IL-1β、IL-2、IL-7、IL-12、IL-18、GM-CFS和INF-γ)、颗粒状佐剂(例如，免疫刺激性复合物(ISCOMS)、脂质体或可生物降解的微球)、病毒颗粒、细菌佐剂(例如单磷酰脂质A或胞壁肽)、合成佐剂(例如，非离子型嵌段共聚物、胞壁肽类似物或合成脂质A)或合成多核苷酸佐剂(例如，多聚精氨酸或多聚赖氨酸)。优选地，佐剂选自铝佐剂(例如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝、明矾)、MF59、AS03、病毒体(例如肝炎病毒病毒体和流感病毒病毒体)、AS04、热可逆水包油乳液、ISA51、弗氏佐剂、IL-12、CpG基序、甘露糖或其任意组合。
如本文中使用的，术语“疫苗组合物”指诱导或改进对特定疾病的免疫的生物制剂。所述制剂可以包含杀死的或减毒的病原体或该病原体感染的宿主细胞或它们的裂解物。它还可以包含如上所定义的一种或多种佐剂。用疫苗激发个体的免疫系统诱导免疫细胞的形成和/或增殖，该免疫细胞特异性识别由疫苗包含的化合物。所述免疫细胞的至少一部分保持存活一段时间，其可以延长至疫苗接种后10,20或30年。如果个体的免疫系统在前述时间段内遇到衍生能引发免疫应答的化合物的病原体，那么通过疫苗接种生成的免疫细胞被再活化，且相比于尚未用疫苗激发和首次遇到病原体的免疫原性化合物的个体的免疫应答，增强针对该病原体的免疫应答。
如本文中使用的，术语“疫苗接种”、“免疫接种”、“免疫”或“接种”是指向受试者施用疫苗，其目的是防止受试者发展出疾病的一种或多种症状。原则上，疫苗接种包括初次疫苗接种和任选地一次或多次加强疫苗接种。初次疫苗接种定义为施用本文公开的组合物或单位剂量以建立保护性免疫应答的初次施用计划，并且例如由两次施用(例如在三个月内)组成。每当在本公开中提及施用时，除非指定为加强疫苗接种，否则这种施用是指初次疫苗接种。加强疫苗接种是指在初次疫苗接种之后，例如在初次疫苗接种计划的最后一次施用(例如第二次施用)后至少1年或甚至5或10年之后进行的施用或施用计划。 加强施用试图增强或重建初次疫苗接种的免疫应答。
如本文中使用的，术语“受试者”、“个体”、和“患者”是本领域中公知的，并且在本文中可互换使用，指对病原体感染易感的任何哺乳动物。例子包括但不限于人和其它灵长类，包括非人灵长类，诸如黑猩猩及其它猿和猴物种。术语个体、受试者和患者本身不表示特定年龄、性别、人种，等等。感染的受试者是已知在其体内具有病原体的受试者。
“有效量”意指当施用到受试者用于治疗或预防疾病时足以实现这样的治疗或预防的化合物的量。“有效量”可取决于化合物、疾病及其严重度、以及待治疗的受试者的年龄、体重等改变。“治疗有效量”是指用于治疗性治疗的有效量。“预防有效量”是指用于预防性治疗的有效量。
“预防”或“预防性治疗”是指疾病或病症的获得或发展的风险的降低，即，使疾病的临床症状的至少一种在疾病发作之前易受疾病感染、或未暴露于致病原的受试者中不发展。
术语“治疗”是指：(i)在可能易患疾病、障碍和/或病症但尚未诊断患有所述疾病、障碍和/或病症的患者中预防所述疾病、障碍和/或病症；(ii)抑制所述疾病、障碍和/或病症，即阻止其发展；或(iii)减轻所述疾病、障碍和/或病症，即引起所述疾病、障碍和/或病症的消退。
CRISPR/Cas系统
CRISPR(成簇规律间隔短回文重复)/Cas(CRISPR相关)系统是原核生物特有的一种获得性免疫系统，用于抵抗病毒或外源性遗传元件的侵害。
CRISPR/Cas系统由四部分组成：分别为CRISPR簇、前导序列、重复序列、以及一系列保守的CRISPR相关(Cas)基因。CRISPR簇由短的高度保守的正向重复序列(repeat)与长度相似的间隔序列(spacer)间隔排列而成。这个间隔序列就是由Cas系统识别外来基因后存储下来的序列，当具有与系统里储存的序列相同的序列的病毒入侵时，免疫系统就会被启动。前导序列作为启动子启动CRISPR簇转录为非编码RNA，称为pre-crRNA；重复序列转录为反式激活RNA；Cas基因是一类较大的多态性家族，编码的蛋白具有核酸酶相关的功能域。非编码RNA和反式激活RNA通过碱基配对作用结合，经酶加工后形成复合物。
2012年研究人员对该系统进行简化，将非编码RNA和反式激活RNA的序列进行合并，可转录为sgRNA，sgRNA通过碱基互补配对决定靶序列的特异 性。Cas蛋白和sgRNA结合形成复合体，识别并切割靶序列。
CRISPR/Cas系统分为多种类型，其中研究最多的是II型CRISPR/Cas系统。Ⅱ型CRISPR/Cas系统作为RNA直接介导的基因组编辑工具已经在许多真核生物和原核生物体内成功应用。CRISPR/Cas9系统的发展彻底改变了编辑DNA序列和调控目标基因表达水平的能力，从而为生物体的精确基因组编辑提供了有力的工具。
锌指核酸酶(ZFN)
锌指核酸酶(ZFN)由一个DNA识别结构域和一个DNA剪切结构域组成。DNA识别结构域为3-4个Cys2-His2锌指蛋白(ZF)串联结构，每个ZF识别并结合1个特异的三联体碱基。ZF的二级结构为alpha-beta-beta二级结构，骨架结构保守，其中a螺旋的-1、2、3、6位置的氨基酸残基决定锌指的DNA结合特异性。DNA剪切结构域由非特异性核酸内切酶FokI羧基端的96个氨基酸残基组成。每个FokI单体与1个ZF相连构成1个ZFN，并识别特定的位点，当2个识别位点相距恰当的距离时(6-8bp)，2个单体ZFN相互作用产生酶切功能，形成双链断裂，从而介导DNA定点剪切。
转录激活样效应因子核酸酶(TALEN)
转录激活样效应因子核酸酶(TALEN)是可靶向修饰特异性DNA序列的二聚化转录因子/核酸酶。其基于植物病原体黄单胞菌(Xanthomonas)分泌的一种转录激活样效应因子(TALE)可以识别特异性DNA序列的原理而设计和构建靶向特定基因的TALE蛋白。TALE蛋白由N端分泌信号、中央DNA结合结构域、核定位信号和C端激活结构域构成。TALE蛋白的DNA结合结构域由可以识别单个核苷酸碱基的氨基酸序列模块串联而成，该氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有恒定的对应关系。利用TALE的序列模块，可组装成特异性结合任意DNA序列的模块化组合蛋白，从而达到识别内源性基因的目的。
TALEN技术是将TALE蛋白中的DNA结合结构域与FokI核酸内切酶的切割结构域融合，设计和构建能在特定基因位点产生双链断裂的的技术。双链断裂可以极大的提高断裂位点周围的基因修复活性，利用易错修复(非同源末端连接)或者同源重组修复的方式实现特异位点DNA的改造，例如定点基因敲除、基因敲入或点突变修饰等。
巨型核酸酶(Meganuclease)
巨型核酸酶是一种脱氧核糖核酸内切酶，其特征在于它的识别位点较大 (12至40个碱基对的双链DNA序列)。巨型核酸酶在其识别位点处产生DNA双链缺口后，诱导细胞内的修复系统进行同源重组而实现基因整合。由于这种较大的识别位点通常在任何给定的基因组中仅出现一次，因此巨型核酸酶被认为是最特异的天然存在的核酸酶。
类异戊二烯代谢途径
异戊二烯类化合物是从异戊二烯的支链C(5)-骨架中得到的天然产物。它们包括基本代谢物和生理意义还不是很明确的次级代谢物。异戊烯二磷酸(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)是所有生物中普遍存在的异戊烯类化合物的前体。早期，在肝组织和酵母中阐明的异戊二烯类的生物合成使得甲羟戊酸(MVA)途径被人们发现和熟知。随后，在其他物种中的研究也证实了这种代谢途径的广泛分布。
甲羟戊酸途径是真核生物合成胆固醇及类异戊二烯中间体的基础代谢途径。该代谢途径以乙酰辅酶A为原料合成异戊烯二磷酸(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)。该途径的产物可以看作是活化的异戊二烯单位，是类固醇、类萜等生物分子的合成前体。
在该途径中，首先由两分子的乙酰辅酶A(acetyl-CoA)在乙酰辅酶A乙酰基转移酶(ATOB)的催化下生成乙酰乙酰基辅酶A(acetoacetyl-CoA)，生成的乙酰乙酰基辅酶A再与乙酰辅酶A在3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶(HMG)的催化下生成3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)。HMG-CoA在HMG-CoA还原酶(HMGR)的作用下，还原成甲羟戊酸。甲羟戊酸在甲羟戊酸激酶(MVK)和磷酸甲羟戊酸激酶的催化下形成甲羟戊酸焦磷酸，甲羟戊酸焦磷酸在甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶(MPD)的作用下形成IPP。IPP在异戊烯焦磷酸异构酶(IPI)作用下转化成DMAPP。随后，IPP和DMAPP在法尼基焦磷酸合酶(FPPS)的催化下形成法尼基焦磷酸(FPP)。FPP在GGPP合酶(GGPPS)的催化下，合成香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)。FPP和GGPP在下游通路开始分支，例如形成胆固醇、泛醌(ubiquinone)、血红素(Heme A)、甾醇(Sterol)、多萜醇(dolichol)和异戊烯化的(prenylated)蛋白等。例如，FPP和GGPP分别在法尼基转移酶和香叶基香叶基转移酶(GGTase)作用下，可以为G蛋白进行法尼基化(Ras蛋白等)和香叶酰香叶酰化(Rho、Rac、Rap等蛋白)修饰，促使G蛋白锚定于细胞膜从而发挥其生物学功能。FPP可以在角鲨烯合酶(SQS)的作用下合成角鲨烯，角鲨烯在一系列酶的催化下合成胆固醇。胆固醇是生命体不可缺少的生命物 质，是合成胆汁酸、维生素D及甾体激素的原料，更是细胞膜的构成成分并对维持生物体的代谢平衡十分重要。FPP可以经过进一步的聚合反应参与多萜醇化合物如维生素K、泛醌、视黄醇等的生成，同时生成的多萜醇继续参与蛋白的N端糖基化修饰。GGPP能够在香叶基香叶基转移酶作用下，对一些蛋白进行香叶酰香叶酰化修饰从而形成异戊烯化的蛋白。甲羟戊酸通路的代谢产物参与生命体重要的生命活动，对维持生物体稳态极其重要。
除了已知的甲羟戊酸途径外，还发现了一种有利于IPP和DMAPP形成的第二种生物合成途径，即2C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸(MEP)途径，也称为非甲羟戊酸途径。目前已知，这一途径广泛分布在大部分的细菌中，包括主要的人类病原体，如结核分枝杆菌、幽门螺杆菌和引发疟疾的恶性疟原虫中。
目前已确定非甲羟戊酸途径是大量细菌中萜类化合物合成的单一来源。此外，非甲羟戊酸途径也已被证明是顶复门原生动物，包括引起疟疾的疟原虫中独特的萜烯合成途径。MEP途径需要进行多个酶反应：
(1)丙酮酸与3-磷酸甘油醛(GA3P)在1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXS)催化下缩合生成1-脱氧-D-木糖-5-磷酸(DOXP)；
(2)DOXP通过DOXP还原异构酶(DXR/IspC)的作用转化为2C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸(MEP)；
(3)在2C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸胞苷基转移酶(YghP/IspD)催化下，MEP与CTP反应生成4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓糖醇(CDP-ME)；
(4)4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓糖醇激酶(YchB/IspE)催化CDP-ME生成4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓糖醇-2-磷酸(CDP-MEP)；
(5)CDP-MEP经由2C-甲基-D-赤藓糖醇-2,4-环二磷酸合酶(YghB/IspF)催化生成4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓糖醇-2,4-环二磷酸(MEcPP)；
(6)MEcPP经由1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸合酶(GcpE/IspG)转化成2-甲基-2-(E)-丁烯基二磷酸(HMB-PP)；
(7)HMB-PP经由4-羟基-3-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸还原酶(LytB/IspH)转化成IPP和DMAPP。
值得注意的是，IspH能够催化生成IPP和DMAPP的混合物。NAD(P)H还可以通过亚麻还原酶和亚麻黄碱提供还原等价物，通过IPP异构酶的作用，产物混合物可以达到热力学平衡。除了一小群半萜是仅由DMAPP或IPP合成外，DMAPP和IPP均是萜类生物合成所必须的。由于甲羟戊酸途径的主要产物是 IPP，因此形成DMAPP需要IPP异构酶，作为下游萜烯合成途径的先决条件。然而与甲羟戊酸通路不同，由于IspH可以产生DMAPP和IPP，因此，在没有异构酶的情况下，MEP途径也能发挥作用。通过MEP途径产生的IPP和DMAPP在GGPP合酶(GGPPS)的催化下，产生FPP和GGPP；再由FPP和GGPP开启不同的下游代谢分支，例如，GGPP能够在香叶基香叶基转移酶(GGTase)作用下，对一些蛋白进行香叶酰香叶酰化修饰从而形成异戊烯化的蛋白。两种途径显示于下表1中。
表1 MVA途径与MEP途径
如本文使用的，术语“香叶酰香叶酰化”是指由MVA途径或MEP途径产 生的GGPP在香叶基香叶基转移酶(GGTase)的作用下，将其香叶基香叶基转移给一些蛋白质，从而形成香叶酰香叶酰化修饰的蛋白质，以发挥特定的生物学功能。
包括疟原虫在内的感染性病原体主要通过MEP途径产生DMAPP和IPP，第一个关键反应由调节酶1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(DXR)催化。DMAPP和IPP的缩合由双功能FPP/GGPP合酶(称为GGPPS)催化，从而产生FPP，然后产生GGPP。GGPP通过不同的代谢分支产生类异戊二烯，例如，GGPP能够在香叶基香叶基转移酶(GGTase)作用下，对一些蛋白进行香叶酰香叶酰化修饰。
通过使用不同的小分子抑制剂，本发明人发现，疟原虫寄生虫等感染性病原体利用类异戊二烯代谢途径中产生的GGPP来隐藏抗原蛋白，从而逃避宿主的免疫监管。不同类异戊二烯代谢节点的抑制剂使红细胞期疟疾疫苗变得可行，特别是通过剥夺小GTP酶香叶酰香叶酰化所需的GGPP。这种蛋白质香叶酰香叶酰化过程的抑制导致病原体抗原蛋白扩散到包围红细胞的细胞质中，使抗原蛋白得以暴露，从而强烈促进宿主适应性免疫应答。因此，可以将香叶酰香叶酰化阻断应用到抗病原体药物的开发中，使感染性病原体对适应性免疫辅助杀伤更加敏感。重要的是，这种香叶酰香叶酰化阻断在抵抗寄生虫再攻击方面优于传统抗疟疾药物氯喹和青蒿素。
值得注意的是，可以通过靶向香叶基香叶基转移酶上游的所有酶来获得对寄生虫的适应性免疫杀伤。两种酶具有特别的转化意义：GGPPS和LytB(IspH)。简而言之，除了通过阻断GGPP产生和促进寄生虫杀灭来增加寄生虫抗原性之外，抑制GGPPS和LytB还会导致其底物(DMAPP/IPP或HBMBPP)的积累，这些化合物已知可刺激人类γδT细胞。这种γδT细胞刺激几乎肯定会进一步促进基于宿主免疫的寄生虫杀灭。
因此，通过阻断病原体的类异戊二烯代谢途径，抑制蛋白的香叶酰香叶酰化，例如通过直接阻断香叶基香叶基转移酶活性或减少香叶酰香叶酰化反应所需的GGPP底物，来破坏病原体中蛋白质(例如疟原虫中的小GTP酶)的香叶酰香叶酰化，使得原本通过GGPP所隐藏的抗原蛋白得以暴露，从而诱导宿主的免疫应答。这种阻断策略可用于包括疟疾在内的多种病原体感染疾病中。
相应地，在第一方面，本发明涉及免疫原性组合物，其包含病原体或该 病原体感染的宿主细胞，或它们的裂解物，其中所述病原体或所述宿主细胞已经使用类异戊二烯代谢途径的抑制剂处理。
在一些实施方案中，所述病原体为寄生虫、病毒、细菌或真菌。
在一些实施方案中，所述寄生虫为顶复门原虫。
在一些实施方案中，所述顶复门原虫选自疟原虫(Plasmodium spp.)、弓形虫(Toxoplasma gondii)、隐孢子虫(Cryptosporidium spp.)、巴贝斯虫(Babesia spp.)和艾美耳球虫(Eimeria spp.)。
在一些实施方案中，所述疟原虫选自夏氏疟原虫(Plasmodium chabaudi)、约氏疟原虫(Plasmodium yoelii)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、伯氏疟原虫(Plasmodium berghei)、三日疟原虫(Plasmodium malariae)和卵形疟原虫(Plasmodium ovale)。
在一些实施方案中，所述病原体为疟原虫，且所述宿主细胞为红细胞或红细胞前体细胞。
在一些实施方案中，所述病毒选自非洲猪瘟病毒、腺病毒、登革热1至4血清型、埃博拉病毒、肠道病毒、肝炎A至E血清型、单纯疱疹病毒1或2、人免疫缺陷病毒、流感病毒、中东呼吸综合征(Mers)病毒、日本马脑炎病毒、麻疹病毒、诺沃克病毒、乳头瘤病毒、细小病毒B19、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、轮状病毒、风疹病毒、麻疹病毒、痘苗病毒、水痘病毒、和黄热病病毒。
在一些实施方案中，所述细菌选自结核分枝杆菌、炭疽、弯曲杆菌、霍乱、白喉、产肠毒素性大肠杆菌、贾第虫、淋球菌、幽门螺杆菌、乙型流感嗜血菌、不可定型的流感嗜血菌、脑膜炎球菌、百日咳、肺炎球菌、沙门氏菌、志贺氏菌、链球菌B、A组链球菌、破伤风、霍乱弧菌、耶尔森氏菌、葡萄球菌、假单胞菌属物种和梭菌属物种。
在一些实施方案中，所述真菌选自孢子、霉菌和酵母(例如，念珠菌物种)。
在一些实施方案中，所述类异戊二烯代谢途径的抑制剂是针对参与类异戊二烯代谢途径的酶的抑制剂。在一些实施方案中，所述酶可以选自参与甲羟戊酸(MVA)途径的酶和参与2C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸(MEP)途径的酶。在一些实施方案中，所述酶包括至少一种参与MVA途径的酶和至少一种参与MEP途径的酶。
在一些实施方案中，参与MVA途径的酶可以选自乙酰CoA乙酰基转移酶 (ATOB)、HMG-CoA合酶(HMG)、HMG-CoA还原酶(HMGR)、甲羟戊酸激酶(MVK)、磷酸甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶(MPD)、异戊烯焦磷酸异构酶(IPI)、法尼基焦磷酸合酶(FPPS)、香叶基香叶基焦磷酸合酶(GGPPS)和香叶基香叶基转移酶(GGTase)。
在一些实施方案中，HMG-CoA还原酶抑制剂可以为他汀类化合物，例如普伐他汀、阿托伐他汀、罗苏伐他汀、氟伐他汀、匹伐他汀、美伐他汀、洛伐他汀、辛伐他汀、西立伐他汀，或它们的可药用盐、酯、前药、溶剂化物。
在一些实施方案中，FPPS抑制剂可以为双膦酸类或其可药用盐、酯、前药、溶剂化物。双膦酸类包括但不限于唑来膦酸、帕米膦酸、阿仑膦酸、伊班膦酸、奈立膦酸、利塞膦酸、奥帕膦酸、米诺磷酸、西马膦酸、EB-1053、依替膦酸、英卡膦酸、匹瑞膦酸、唑仑膦酸、伊本膦酸。
在一些实施方案中，FPPS抑制剂可以为下式的化合物或其可药用盐、酯、前药、溶剂化物：
上述式I中，其分子量小于1000，Ar为苯并咪唑类基或氮杂苯并咪唑基；X为下述任意一种：氢、羟基、脂肪基、巯基、卤素、烷氧基或烷基；每一个M可独立地为下述任意一种：负电荷、氢、烷基、脂肪基、-(CH 2) p-O-CO-R、-(CH 2) p-CO-R或阳离子；其中，p＝1-6，R为氢、烷基或芳香基；所述阳离子为Li +、Na +、K +、Ca 2+、Mg 2+、NH 4 +或N(R’) 4 +，其中R’为烷基；R 6、R 7分别独立地选自下述任意一种：氢、羟基、巯基、卤素、氨基、脂肪基或烷基；m＝1-6的整数。
例如，式I所示化合物可以为下述式II-X所示化合物：
上述式II-X中，X为下述任意一种：氢、羟基、巯基、卤素、烷氧基或烷基；每一个M独立地为下述任意一种：负电荷、氢、烷基、-(CH 2) p-O-CO-R、-(CH 2) p-CO-R或阳离子；其中，p＝1-6，R为氢、烷基或芳香基；所述阳离子为Li +、Na +、K +、Ca 2+、Mg 2+、NH 4 +或N(R’) 4 +，其中R’为烷基；R 1、R 2、R 3、R 4、、R 5、R 8分别独立地选自下述任意一种：氢、羟基、脂肪基、巯基、卤素、氨基、烷基、-O-(CH 2) qCH 3、-NH-(CH 2) qCH 3、-N[(CH 2) qCH 3] 2、-(CH 2) P-S-(CH 2) qCH 3、-O-(CH 2) P-S-(CH 2) qCH 3、-O-(CH 2) P-O-(CH 2) qCH 3，其中，p＝1-6，q＝0-6；m＝1-6的整数。
式I所示化合物还可以为式XI-XVIII所示化合物：
式XI-XVIII中，Z为氢、羟基、脂肪基、烷氧基、氨基或烷胺基。式I所示化合物还可以为式IXX或XX所示化合物：
式IXX、式XX中，n为0或1-12的整数。
式I所示化合物可以为下述任意一种：
在一些实施方案中，FPPS抑制剂可以为下式的化合物或其可药用盐、酯、前药、溶剂化物：
其中R 1、R 2各自选自氢、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷基氨基、烷基硫基、卤素、羟基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基，所述烷氧基中的烷基任选被芳基、杂芳基或杂环基取代，所述芳基、杂芳基或杂环基任选取代有烷基、氨基甲酰基；X选自氢、羟基、巯基、卤素等。
例如，FPPS抑制剂可以为下式的化合物或其可药用盐、酯、前药、溶剂化物：
其中R 1、R 2各自选自氢、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷基氨基、烷基硫基、卤素、羟基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基，所述烷氧基中的烷基任选被芳基、杂芳基或杂环基取代，所述芳基、杂芳基或杂环基任选取代有烷基、氨基甲酰基。
FPPS抑制剂可以为下式的化合物或其可药用盐、酯、前药、溶剂化物：
其中n为1-24的整数，优选n为1-12的整数。
在一些实施方案中，FPPS抑制剂可以为下式的化合物或其可药用盐、酯、前药、溶剂化物：
其中R 3、R 4各自选自氢、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷基氨基、烷基硫基、卤素、羟基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基，所述烷氧基中的烷基任选被芳基、杂芳基或杂环基取代，所述芳基、杂芳基或杂环基任选取代有烷基、氨基甲酰基；X选自氢、羟基、巯基、卤素。
例如，FPPS抑制剂可以为下式的化合物或其可药用盐、酯、前药、溶剂化物：
其中R 3、R 4各自选自氢、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷基氨基、烷基硫基、卤素、羟基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基，所述烷氧基中的烷基任选被芳基、杂芳基或杂环基取代，所述芳基、杂芳基或杂环基任选取代有烷基、氨基甲酰基。
FPPS抑制剂可以为下式的化合物或其可药用盐、酯、前药、溶剂化物：
其中n为1-24的整数，优选n为1-12的整数。
在一些实施方案中，FPPS抑制剂可以为下式的化合物或其可药用盐、酯、前药、溶剂化物：
其中，R 1选自氢、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷基氨基、烷基硫基、卤素、羟基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基，所述烷氧基中的烷基任选被芳基、杂芳基或杂环基取代，所述芳基、杂芳基或杂环基任选取代有烷基、氨基甲酰基；R 2选自氢、烷基、烷氧基、烷基氨基、烷基硫基、卤素、羟基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基；R 3选自氢、烷基、烷氧基、烷基氨基、烷基硫基、卤素、羟基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基；或者R 2与R 3与它们所连接的碳原子一起形成芳环或杂芳环；以及R 4选自氢、烷基、烷氧基、烷基氨基、烷基硫基、卤素、羟基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基。
优选地，R 1选自氢、C 1-10烷基、C 1-10炔基、C 1-10烷基氨基、C 1-10烷基硫基、卤素、羟基、吲唑基、C 1-10烷氧基、被苯基或吡啶基取代的C 1-10烷氧基，所述吡啶基任选取代有氨基甲酰基。更优选地，R 1选自氢、4-甲基苯乙氧基、4,5,6,7-四氢-2H-吲唑-2-基、(2-氨基甲酰基吡啶-4-基)甲氧基、苄基氧基、己基氧基、甲硫基、辛基氨基、己基、辛基、癸基、辛-1-炔-1-基、羟基、溴。
优选地，R 2选自氢、C 1-10烷氧基、卤素。更优选地，R 2选自氢、辛基氧基、溴。
优选地，R 3选自氢、C 1-10烷基、C 1-10烷氧基。更优选地，R 3选自氢、甲基、己基氧基。
优选地，R 2与R 3与它们所连接的碳原子一起形成苯环。
优选地，R 4选自氢、C 1-10烷氧基。更优选地，R 4选自氢、辛基氧基。
优选地，所述化合物可以选自：
在一些实施方案中，FPPS抑制剂可以为下式的化合物或其可药用盐、酯、前药、溶剂化物：
其中，R 5选自氢、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷基氨基、烷基硫基、卤素、羟基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基，优选选自C 1-10烷氧基；R 6选自氢、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷基氨基、烷基硫基、卤素、羟基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基；R 7选自氢、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷基氨基、烷基硫基、卤素、羟基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基；以及R 8选自氢、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷基氨基、烷基硫基、卤素、羟基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基。
优选地，所述化合物为
在一些实施方案中，GGPPS抑制剂为下式的化合物或其可药用盐、酯、前药、溶剂化物：
其中，R 9选自氢、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷基氨基、烷基硫基、卤素、羟基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基，优选选自C 1-10烷氧基；R 10选自氢、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷基氨基、烷基硫基、卤素、羟基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基；R 11选自氢、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷基氨基、烷基硫基、卤素、羟基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基；以及R 12选自氢、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷基氨基、烷基硫基、卤素、羟基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基。
优选地，所述化合物为
在一些实施方案中，参与MEP途径的酶可以选自1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXS)、1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(DXR)、2C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸胞苷基转移酶(IspD)、4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓糖醇激酶(IspE)、2C-甲基-D-赤藓糖醇-2,4-环二磷酸合酶(IspF)、1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸合酶(IspG)、4-羟基-3-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸还原酶(IspH)、香叶基香叶基焦磷酸合酶(GGPPS)和香叶基香叶基转移酶(GGTase)。
在本公开的免疫原性组合物的一些实施方案中，所述类异戊二烯代谢途径的抑制剂抑制蛋白质的香叶酰香叶酰化。
在一些实施方案中，所述抑制剂选自小分子抑制剂、抑制性RNA分子(例如siRNA、miRNA)、蛋白质或肽。
在一些实施方案中，所述抑制剂选自膦胺霉素、FR-900098、TH-Z626、双膦酸类(例如利塞膦酸盐、唑来膦酸盐、TH-Z321、TH-Z613、BPH-703)、GGTI-298、GGTI-287、GGTI-297、FTI-276和FTI277中的一种或多种。GGTI-298、GGTI-287、GGTI-297、FTI-276和FTI277的结构如下表2所示。
表2.相关化合物的结构
在一些实施方案中，所述抑制剂选自以下化合物或其药学上可接受的盐：
在一些实施方案中，所述组合物是疫苗组合物。
在一些实施方案中，所述疫苗组合物还包含佐剂。
在一些实施方案中，所述佐剂选自铝佐剂(例如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝、明矾)、MF59、AS03、病毒体(例如肝炎病毒病毒体和流感病毒病毒体)、AS04、热可逆水包油乳液、ISA51、弗氏佐剂、IL-12、CpG基序、甘露糖或其任意组合。
在第二方面，本公开涉及免疫原性组合物，其包含病原体或病原体感染的宿主细胞或它们的裂解物，其中所述病原体或所述宿主细胞中的编码参与类异戊二烯代谢途径的酶的基因被敲除，或经突变使得所述酶的功能降低或丧失。
在本发明第二方面的免疫原性组合物的一些实施方案中，所述基因的突变选自核苷酸的插入、缺失、取代或其任意组合。
在一些实施方案中，所述基因的敲除或突变通过基因编辑来实现。
在一些实施方案中，所述基因编辑通过使用选自以下的系统来实现：CRISPR/Cas、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活样效应因子核酸酶(TALEN)、巨型核酸酶(Meganuclease)或其任意组合。
在一些实施方案中，所述基因编辑通过使用CRISPR/Cas系统来实现。在一些实施方案中，CRISPR/Cas系统选自CRISPR/Cas9、CRISPR/nCas9、CRISPR/Cas10、CRISPR/Cas9a、CRISPR/Cas12、CRISPR/Cas12a、CRISPR/Cas12b、CRISPR/Cas13、CRISPR/Cas14或其任意组合。
在一些实施方案中，CRISPR/Cas系统为CRISPR/Cas9。Cas9可以来自酿脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、氨基酸球菌属(Acidaminococcus sp)、毛螺科菌(Lachnospiraceae bacterium)或其它物种。在某些实施方式中，Cas9可包括：spCas9、Cpf1、CasY、CasX、或saCas9，优选spCas9。
在一些实施方案中，CRISPR/Cas9包含在催化结构域中的一个或多个突变，其中该一个或多个突变选自下组：D10A、E762A、H840A、N854A、N863A和D986A。在优选的实施方案中，CRISPR/Cas9包含D10A突变。在优选的实施方案中，第一Cas酶具有一个或多个突变，使得该酶是一种互补链切口酶，并且第二Cas酶具有一个或多个突变，使得该酶是一种非互补链切口酶。可替代地，该第一酶可以是一种非互补链切口酶，而该第二酶可以是一种互补链切口酶。
关于CRISPR/Cas的突变，当Cas酶不是SpCas9时，可以在相应于SpCas9的位置10、762、840、854、863和/或986的任何或所有残基处进行突变(其可以例如通过标准序列比较工具进行确定)。具体地说，在SpCas9中的任何或所有下列突变是优选的：D10A、E762A、H840A、N854A、N863A和/或D986A；并且还设想了这些置换氨基酸中的任何的保守性取代。
在一些实施方案中，所述CRISPR/Cas系统还包含gRNA，所述gRNA包含能够与所述编码参与类异戊二烯代谢途径的酶的基因互补的序列。gRNA靶向编码参与类异戊二烯代谢途径的酶的基因。在一些实施方案中，gRNA的至少部分序列能够与靶基因互补，且gRNA能够与CRISPR/Cas蛋白形成功能性复合体。在一些实施方案中，gRNA包括sgRNA。
在本发明第二方面的免疫原性组合物的一些实施方案中，所述病原体、 宿主细胞、参与类异戊二烯代谢途径的酶、组合物如本发明第一方面所定义。
在一些实施方案中，所述病原体为非洲猪瘟病毒。在一些实施方案中，所述编码参与类异戊二烯代谢途径的酶的基因为非洲猪瘟病毒编码GGPPS的基因B318L。在优选的实施方案中，所述病原体为非洲猪瘟病毒，并且所述编码参与类异戊二烯代谢途径的酶的基因为非洲猪瘟病毒编码GGPPS的基因B318L。
在第三方面，本发明涉及制备免疫原性组合物的方法，所述组合物包含病原体或该病原体感染的宿主细胞或它们的裂解物，其中所述方法包括使所述病原体或宿主细胞与类异戊二烯代谢途径的抑制剂接触的步骤。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括裂解所述病原体或宿主细胞以获得裂解物的步骤。
在第四方面，本公开涉及制备免疫原性组合物的方法，所述组合物包含病原体或该病原体感染的宿主细胞或它们的裂解物，其中所述方法包括敲除所述病原体或所述宿主细胞中的编码参与类异戊二烯代谢途径的酶的基因或突变所述病原体或所述宿主细胞中的编码参与类异戊二烯代谢途径的酶的基因使得所述酶的功能降低或丧失的步骤。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括在敲除或突变步骤后裂解所述病原体或宿主细胞以获得裂解物的步骤。
在本发明制备方法一些实施方案中，所述病原体、宿主细胞、类异戊二烯代谢途径的抑制剂、所述基因的突变或敲除、组合物如本发明第一方面和第二方面所定义。
在本发明第一方面至第四方面的一些实施方案中，免疫原性组合物可以制成注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。在上述制剂中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。
例如，本发明的免疫原性组合物可以制成可注射组合物的形式。可注射组合物可以含有多种载体如植物油、二甲基酰胺、二甲基甲酰胺、乳酸乙酯、碳酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯、乙醇和多元醇(甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)。对于可注射组合物，生理上可接受的赋形剂可以包括例如5％葡萄糖、0.9％盐 水、林格溶液或其它合适的赋形剂。
在第五方面，本发明涉及预防和/或治疗受试者中由病原体感染引起的疾病或症状的方法，其包括向所述受试者施用有效量的本发明第一方面或第二方面的免疫原性组合物或根据本发明第三方面或第四方面的方法制备的免疫原性组合物。
在一些实施方案中，由病原体感染引起的疾病或症状包括由寄生虫、病毒、细菌或真菌感染引起的疾病。
在一些实施方案中，寄生虫可以为顶复门原虫。顶复门原虫可以选自疟原虫(Plasmodium spp.)、弓形虫(Toxoplasma gondii)、隐孢子虫(Cryptosporidium spp.)、巴贝斯虫(Babesia spp.)和艾美耳球虫(Eimeria spp.)。在一些实施方案中，疟原虫可以选自夏氏疟原虫(Plasmodium chabaudi)、约氏疟原虫(Plasmodium yoelii)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、伯氏疟原虫(Plasmodium berghei)、三日疟原虫(Plasmodium malariae)和卵形疟原虫(Plasmodium ovale)。
在一些实施方案中，病原体为疟原虫，且宿主细胞为红细胞或红细胞前体细胞。
在一些实施方案中，病毒选自非洲猪瘟病毒、腺病毒、登革热1至4血清型、埃博拉病毒、肠道病毒、肝炎A至E血清型、单纯疱疹病毒1或2、人免疫缺陷病毒、流感病毒、中东呼吸综合征(Mers)病毒、日本马脑炎病毒、麻疹病毒、诺沃克病毒、乳头瘤病毒、细小病毒B19、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、轮状病毒、风疹病毒、麻疹病毒、痘苗病毒、水痘病毒、和黄热病病毒。
在一些实施方案中，细菌可以选自结核分枝杆菌、炭疽、弯曲杆菌、霍乱、白喉、产肠毒素性大肠杆菌、贾第虫、淋球菌、幽门螺杆菌、乙型流感嗜血菌、不可定型的流感嗜血菌、脑膜炎球菌、百日咳、肺炎球菌、沙门氏菌、志贺氏菌、链球菌B、A组链球菌、破伤风、霍乱弧菌、耶尔森氏菌、葡萄球菌、假单胞菌属物种和梭菌属物种。
在一些实施方案中，真菌包括但不限于孢子、霉菌和酵母(例如，念珠菌物种)。
在一些实施方案中，所述方法还包括施用另外的预防剂或治疗剂。在一些实施方案中，所述另外的预防剂或治疗剂为先天性免疫激动剂。先天性免疫激动剂包括但不限于STING激动剂如DMAXX，TLR激动剂如咪喹莫特。
在一些实施方案中，所述施用可以通过本领域技术人员已知的任何方式来实现。优选的施用途径包括但不限于胃肠外(例如，肌内、皮下、皮内、静脉内注射)、对皮肤的局部(例如，透皮)或粘膜(例如，口服、鼻内、阴道内、直肠内、透颊、眼内或舌下)。
在一些实施方案中，免疫原性组合物可以以单个剂量方案施用，或者以多个剂量方案施用，例如，免疫原性组合物接种的主要过程是1-10个独立的剂量，之后根据维持和/或加强免疫反应的需要在随后的时间间隔给予其他剂量，例如1-4个月给予第二个剂量，并且如果需要，在几个月或几年后给予随后的剂量。给药方案还至少部分由个体的需要决定并取决于医务人员的判断。可以补充以特定间隔(例如每两年)给予的加强剂量来维持满意的保护性免疫力。
在第六方面，本发明涉及本发明第一方面或第二方面的免疫原性组合物或根据本发明第三方面或第四方面的方法制备的免疫原性组合物，其用于预防和/或治疗受试者中由病原体感染引起的疾病或症状。所述病原体和由病原体感染引起的疾病或症状如本文其他方面所述。
在第七方面，本发明涉及本发明第一方面或第二方面的免疫原性组合物或根据本发明第三方面或第四方面的方法制备的免疫原性组合物在制备用于预防和/或治疗受试者中由病原体感染引起的疾病或症状的药物中的用途。所述病原体和由病原体感染引起的疾病或症状如本文其他方面所述。
在第八方面，本发明涉及本发明第一方面或第二方面的免疫原性组合物或根据本发明第三方面或第四方面的方法制备的免疫原性组合物在制备与另外的预防剂或治疗剂一起施用的药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗受试者中由病原体感染引起的疾病或症状。在一些实施方案中，另外的预防剂或治疗剂为先天性免疫激动剂。先天性免疫激动剂包括但不限于STING激动剂如DMAXX，TLR激动剂如咪喹莫特。所述病原体和由病原体感染引起的疾病或症状如本文其他方面所述。
在第九方面，本发明涉及治疗受试者中由病原体感染引起的疾病或症状的方法，其包括向受试者施用有效量的至少一种参与MEP途径的酶的抑制剂以及至少一种选自以下的治疗剂：参与MVA途径的酶的抑制剂和先天性免疫激动剂。
在一些实施方案中，参与MEP途径的酶可以选自1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸 合酶(DXS)、1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(DXR)、2C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸胞苷基转移酶(IspD)、4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓糖醇激酶(IspE)、2C-甲基-D-赤藓糖醇-2,4-环二磷酸合酶(IspF)、1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸合酶(IspG)、4-羟基-3-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸还原酶(IspH)、香叶基香叶基焦磷酸合酶(GGPPS)和香叶基香叶基转移酶(GGTase)。
在一些实施方案中，参与MVA途径的酶可以选自乙酰CoA乙酰基转移酶(ATOB)、HMG-CoA合酶(HMG)、HMG-CoA还原酶(HMGR)、甲羟戊酸激酶(MVK)、磷酸甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶(MPD)、异戊烯焦磷酸异构酶(IPI)、法尼基焦磷酸合酶(FPPS)、香叶基香叶基焦磷酸合酶(GGPPS)和香叶基香叶基转移酶(GGTase)。例如，参与MVA途径的酶的抑制剂如上文所限定。优选地，参与MVA途径的酶的抑制剂为辛伐他丁。
在一些实施方案中，先天性免疫激动剂选自STING激动剂如DMAXX和TLR激动剂如咪喹莫特。
在一些实施方案中，所述抑制剂或治疗剂可以选自小分子抑制剂、抑制性RNA分子(例如siRNA、miRNA)、蛋白质或肽类抑制剂。
在一些实施方案中，所述参与MEP途径的酶的抑制剂可以选自膦胺霉素、FR-900098、TH-Z626、双膦酸类(例如利塞膦酸盐、唑来膦酸盐、TH-Z321、TH-Z613、BPH-703)、GGTI-298、GGTI-287、GGTI297、FTI-276和FTI277中的一种或多种。在一些实施方案中，所述参与MEP途径的酶的抑制剂可以选自以下化合物或其药学上可接受的盐：
在一些实施方案中，所述参与MVA途径的酶的抑制剂包括但不限于他汀类，例如普伐他汀、阿托伐他汀、罗苏伐他汀、氟伐他汀、匹伐他汀、美伐他汀、洛伐他汀、辛伐他汀、西立伐他汀；双膦酸类，例如唑来膦酸、帕米膦酸、阿仑膦酸、伊班膦酸、奈立膦酸、利塞膦酸、奥帕膦酸、米诺磷酸、TH-Z321、TH-Z613、BPH-703。优选地，所述参与MVA途径的酶的抑制剂为辛伐他丁。
在一些实施方案中，所述先天性免疫激动剂选自STING激动剂如DMAXX和TLR激动剂如咪喹莫特。
在一些实施方案中，所述病原体可以选自寄生虫、病毒、细菌和真菌。
在一些实施方案中，所述寄生虫可以为顶复门原虫。顶复门原虫选自疟原虫(Plasmodium spp.)、弓形虫(Toxoplasma gondii)、隐孢子虫(Cryptosporidium spp.)、巴贝斯虫(Babesia spp.)和艾美耳球虫(Eimeria spp.)。在一些实施方案中，疟原虫可以选自夏氏疟原虫(Plasmodium chabaudi)、约氏疟原虫(Plasmodium yoelii)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、伯氏疟原虫(Plasmodium berghei)、三日疟原虫(Plasmodium malariae)和卵形疟原虫(Plasmodium ovale)。
在一些实施方案中，所述病毒可以选自非洲猪瘟病毒、腺病毒、登革热1至4血清型、埃博拉病毒、肠道病毒、肝炎A至E血清型、单纯疱疹病毒1或2、人免疫缺陷病毒、流感病毒、中东呼吸综合征(Mers)病毒、日本马脑炎病毒、麻疹病毒、诺沃克病毒、乳头瘤病毒、细小病毒B19、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、轮状病毒、风疹病毒、麻疹病毒、痘苗病毒、水痘病毒、和黄热病病毒。
在一些实施方案中，所述细菌可以选自结核分枝杆菌、炭疽、弯曲杆菌、霍乱、白喉、产肠毒素性大肠杆菌、贾第虫、淋球菌、幽门螺杆菌、乙型流感嗜血菌、不可定型的流感嗜血菌、脑膜炎球菌、百日咳、肺炎球菌、沙门氏菌、志贺氏菌、链球菌B、A组链球菌、破伤风、霍乱弧菌、耶尔森氏菌、葡萄球菌、假单胞菌属物种和梭菌属物种。
在一些实施方案中，所述真菌可以选自孢子、霉菌和酵母(例如，念珠菌物种)。
在一些实施方案中，所述方法包括以顺序方式给予这些药剂(例如，参与MEP途径的酶的抑制剂以及参与MVA途径的酶的抑制剂和先天性免疫激动剂中的任一种)，即，其中每种药剂在不同的时间施用，或者以基本上同时的方式施用这些药剂。每种药剂的顺序或基本上同时施用可通过任何适当途径实现，包括但不限于口服途径、静脉内途径、肌肉内、皮下途径和通过粘膜组织的直接吸收。可以通过相同途径或通过不同途径施用药剂。例如，可以口服施用第一药剂(例如，参与MEP途径的酶的抑制剂)，并且可以静脉内施用另外的药剂(例如，参与MVA途径的酶的抑制剂或先天性免疫激动剂)。
如本发明所用，同时施用和基本上同时施用可互换使用。顺序施用是指在时间上分开给予本发明所述的药剂(例如，参与MEP途径的酶的抑制剂以及参与MVA途径的酶的抑制剂和先天性免疫激动剂中的任一种)。
本发明的药剂的合适剂量将取决于特定的参与MEP途径的酶的抑制剂、参与MVA途径的酶的抑制剂、先天性免疫激动剂、和/或疾病或病症的类型和严重程度、既往治疗、患者的临床病史以及主治医师的自由裁量权。通常，临床医生将施用这些药剂，直至达到实现所需结果的剂量。
一般性描述的本发明将通过参考以下实施例更容易理解，包括以下实施 例仅为了说明本发明实施方案的某些方面的目的。实施例不意图限制本发明，因为本领域的技术人员将从以上教导和以下实施例认识到其它技术和方法可以满足权利要求，并可以被采用而不背离要求保护的发明的范围。
实施例
材料和方法
实验动物
本申请中使用的小鼠年龄为6-8周。为了使啮齿动物感染疟疾，将小鼠腹膜内(i.p.)或静脉内(i.v.)接种寄生的红细胞(pRBC)。
恶性疟原虫培养与同步
恶性疟原虫无性繁殖阶段(3D7)在包含RPMI1640(Gibco，目录号2244271)、0.5％(w/v)ALbuMax II(Gibco，目录号11021-045)、25mM N-(2-羟乙基)哌嗪-N’-(2-乙磺酸)(HEPES)(Sigma，目录号H3375)、24mM NaHCO 3(Sigma，目录号S5761)、25μg/ml庆大霉素(Solarbio，目录号L1312)和150μM次黄嘌呤(Sigma，目录号SLCD9483)加人O+红细胞的完全培养基中根据标准程序培养。对于同步环状体阶段恶性疟原虫，用5％(w/v)D-山梨糖醇(Solarbio，目录号S8090)溶液处理培养物。
全寄生虫疫苗(WPV)和小鼠免疫
当寄生虫血症在50％-60％之间并且90％的寄生虫处于早期“环状体”阶段时，从感染了夏氏疟原虫或约氏疟原虫的小鼠收集寄生的红细胞(pRBC)。将pRBC以1％的血细胞比容重悬于25cm 2组织培养瓶中的完全培养基中，并用不同的化合物(800μM膦胺霉素/800μM TH-Z626/100μM青蒿素(MedChemexpress,目录号HY-B0094)/100μM氯喹(HEOWNS,目录号50-63-5)/400μM FR-900098(Sigma,目录号F8037)/50μM GGTI-298(Sigma,目录号F8037)/100μM Ro 48-8071(TargetMol,目录号T1771)/400μM氟草敏(Norflurazon，Sigma,目录号34364))在5％CO 2、37℃下处理3天。
对于免疫接种，将pRBC洗涤3次以去除过量药物，然后将1x10 7个pRBC静脉注射到小鼠体内。在接下来的10-14天，通过吉姆萨染色的血涂片检查小鼠以检测是否出现明显的寄生虫血症。将小鼠免疫3次，每次间隔2周。对照小鼠注射等量的正常红细胞(nRBC)。最后一次接种后30天或90天，通过腹膜内接种同源或异源寄生虫寄生的1x10 5个pRBC对免疫小鼠进行攻毒。
PRBC裂解和免疫
将膦胺霉素(FOS)处理的pRBC团块悬浮在无菌蒸馏水(4倍体积的pRBC团块)中。将细胞重悬2分钟，然后加入双倍强度的PBS以恢复张力。通过离心移出并收集寄生虫。然后将裂解物浓缩并重构为1x10 8个等效pRBC裂解物/ml。为了进行免疫，将100μl的pRBC裂解物静脉注射到小鼠体内，共3次，每次间隔2周。对照小鼠通过相同的方法用等量的正常RBC裂解物进行免疫。对于用稀释的pRBC裂解物进行免疫，将等量的1x10 4个细胞裂解物与佐剂利塞膦酸盐-MnCl 2进行肌内免疫接种。对照小鼠通过相同的方法用等量的正常红细胞裂解物进行免疫。最后一次免疫后30天，通过腹膜内接种1x10 5个pRBC对小鼠进行攻毒。
过继血清转移
在最后一次FOS处理的WPV免疫后一周从供体小鼠抽取血液并离心分离血清。在相对于攻毒时间的第-1、0、1、2、3、4、6天，将血清(500μl)静脉注射到受体BALB/c小鼠中。对于攻毒实验，受体小鼠在第0天腹膜内接种1x10 5个pRBC。
CD4+T细胞、CD8+T细胞和NK细胞耗竭实验
最后一次免疫后30天，在相对于攻毒时间的第-1、0、1、2、3、4、6和10天，将小鼠静脉注射抗小鼠CD4抗体(200μg，Biolegend，目录号100461)、抗小鼠CD8a抗体(200μg，Biolegend，目录号100763)或相应的同种型IgG(200μg，ImmunoReagents，目录号Mu-003-C.01)作为对照。对于攻毒实验，在第0天将小鼠腹膜内接种10 5个pRBC。
对于NK细胞耗竭，从攻毒前一天到实验结束，小鼠每天接受一次静脉注射抗小鼠NK1.1mAb(200μg，Biolegend，目录号108760)。
酶促抑制和结晶
表达并纯化人FPPS(HsFPPS)、人GGPPS(HsGGPPS)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)GGPPS(PvGGPPS)，并如现有技术中所述进行酶促抑制测定(Y.Zhang et al.,Lipophilic bisphosphonates as dual farnesyl/geranylgeranyl diphosphate synthase inhibitors:an X-ray and NMR investigation.J Am Chem Soc 131,5153-5162(2009).doi:10.1021/ja808285e；J.H.No et al.,Lipophilic analogs of zoledronate and risedronate inhibit Plasmodium geranylgeranyl diphosphate synthase(GGPPS)and exhibit potent antimalarial activity.Proc Natl Acad Sci U S A 109,4058-4063(2012).doi:10.1073/pnas.1118215109；K.L.Kavanagh,J.E.Dunford,G.Bunkoczi,R.G.G.Russell,U.Oppermann,The crystal structure of human geranylgeranyl pyrophosphate synthase reveals a novel hexameric arrangement and inhibitory product binding.J Biol Chem 281,22004-22012(2006).doi:10.1074/jbc.M602603200)。
编码人FPPS(残基6-353)、人GGPPS和间日疟原虫GGPPS的克隆具有N端His6标签和TEV蛋白酶切割位点，在大肠杆菌BL21-codon Plus(DE3)RIL中表达。在蛋白酶抑制剂混合物(CwBio，目录号CW2200S)存在下通过超声裂解细胞，然后使用Ni-sepharose色谱柱纯化蛋白质。然后将洗脱的蛋白质浓缩并加载到Sephadex S-200凝胶过滤柱上，收集含有人FPPS、人GGPPS或间日疟原虫GGPPS的级分用于进一步实验。
使用每孔含有200μl反应混合物的96孔板进行人FPPS、人GGPPS和间日疟原虫GGPPS抑制测定。通过磷酸盐释放酶的连续分光光度测定法来监测GPP和IPP的缩合。反应缓冲液含有50mM Tris-HCl、1mM MgCl 2，pH 7.4。将研究的化合物与酶在20℃下预孵育30分钟。通过将抑制数据拟合至GraphPad PRISM的剂量反应曲线来获得IC 50值。
参考现有技术(Y.Zhang et al.,Lipophilic bisphosphonates as dual farnesyl/geranylgeranyl diphosphate synthase inhibitors:an X-ray and NMR investigation.J Am Chem Soc 131,5153-5162(2009).doi:10.1021/ja808285e；J.H.No et al.,Lipophilic analogs of zoledronate and risedronate inhibit Plasmodium geranylgeranyl diphosphate synthase(GGPPS)and exhibit potent antimalarial activity.Proc Natl Acad Sci U S A 109,4058-4063(2012).doi:10.1073/pnas.1118215109；K.L.Kavanagh,J.E.Dunford,G.Bunkoczi,R.G.G.Russell,U.Oppermann,The crystal structure of human geranylgeranyl pyrophosphate synthase reveals a novel hexameric arrangement and inhibitory product binding.J Biol Chem 281,22004-22012(2006).doi:10.1074/jbc.M602603200)进行结晶，但存在以下修改。具体而言，将80mg/ml人GGPPS(HsGGPPS)或15mg/ml间日疟原虫GGPPS(PvGGPPS)与1mM不同化合物(TH-Z321/TH-Z626)和1mM MgCl 2混合以进行共结晶。
通过将1μl 80mg/ml蛋白质在10mM pH 7.5HEPES、500mM NaCl、5％甘油中与1μl沉淀剂溶液(由25％PEG 3350、200mM pH 5.5甲酸镁) 混合并针对300μl沉淀剂溶液进行平衡，使具有TH-Z321的HsGGPPS晶体在16℃下静滴生长。
通过首先将PvGGPPS与1mM抑制剂和1mM MgCl 2在冰上孵育30分钟，然后与结晶缓冲液(19％PEG 3350,1mM MgCl 2,0.1M Tris-HCl pH 7.4,和0.1M Li 2SO 4)混合来进行PvGGPPS与TH-Z321/TH-Z626和1mM MgCl 2的共结晶。晶体仍使用悬滴法在16℃下生长。
衍射数据是在台湾同步辐射研究中心(NSRRC)和上海同步辐射设施(SSRF)光束线BL17U收集的。数据通过HKL2000进行处理(Z.Otwinowski,W.Minor,Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode.Methods Enzymol 276,307-326(1997))。通过使用Phaser程序的分子置换方法确定结构。HsGGPPS(PDB ID代码2Q80)和PvGGPPS(PDB代码3RBM)的晶体结构用作检索模板。使用Coot(P.Emsley,K.Cowtan,Coot:model-building tools for molecular graphics.Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 60,2126-2132(2004).doi:10.1107/s0907444904019158)和phenix.refine(D.Liebschner et al.,Macromolecular structure determination using X-rays,neutrons and electrons:recent developments in Phenix.Acta Crystallogr D Struct Biol 75,861-877(2019).doi:10.1107/s2059798319011471)进行进一步的模型构建和改进。使用PyMOL(http://pymol.sourceforge.net)生成图像。
恶性疟原虫生长抑制
将环状体阶段恶性疟原虫菌株3D7(0.3％-0.5％寄生虫血症和2％的血细胞比容)在96孔板中培养，总体积为200μl。使用2倍梯度稀释将测试化合物从最大浓度20μM稀释至总共8个浓度，并在具有或没有10μM GGPP的情况下与寄生虫一起孵育48或96小时。
未经药物处理的nRBC和pRBC分别用作阴性和阳性对照。使用先前描述的SYBR Green1方法确定对疟原虫生长的药物抑制作用(J.H.No et al.,Lipophilic analogs of zoledronate and risedronate inhibit Plasmodium geranylgeranyl diphosphate synthase(GGPPS)and exhibit potent antimalarial activity.Proc Natl Acad Sci U S A 109,4058-4063(2012).doi:10.1073/pnas.1118215109)；从浓度-反应曲线计算半数最大抑制浓度(IC 50)。
为了确定寄生虫对分析化合物敏感的时间，计算了化合物在48和96小时的IC 50值并进行了比较。使用100倍显微镜(Olympus DP80)对吉姆萨染色 的薄涂片进行拍照以确定寄生虫的阶段。简而言之，将环状体阶段寄生虫在6孔板中以1％血细胞比容在有或没有不同化合物(1μM强力霉素(DOX)/50nM克林霉素(CLIN)/100nM阿奇霉素(AZI)/5μM膦胺霉素/5μM TH-Z626/5μM GGTI298)的情况下在培养物(3ml)中培养。在24小时后，去除化合物并将新鲜培养基加入剩余的培养物中。从24小时开始，制备吉姆萨染色薄涂片，每24小时检查一次(共120小时)。
IFNγ的脾细胞胞内染色
将取自免疫小鼠或对照小鼠的脾脏分解，用Geys裂解缓冲液(Beyotime，目录号C3702)裂解，并对脾细胞进行计数。1x10 6个脾细胞用10μg/ml布雷菲尔德菌素A(BFA，BioLegend，目录号420601)、0.1μg/ml PMA(Sigma-Aldrich，目录号401633)和0.1μM离子霉素(Sigma-Aldrich，目录号401633)处理，并在37℃培养6小时。将细胞用PBS洗涤，并用别藻蓝蛋白(APC)标记的抗小鼠CD3(Biolegend，目录号100236)、藻红蛋白(PE)标记的抗小鼠CD4(Biolegend，目录号100408)和FITC标记的抗小鼠CD8a(Biolegend，目录号100705)在冰上染色30分钟。然后根据制造商的方案，使用BD固定和透化缓冲液(Biolegend，目录号421002)固定和透化细胞。随后将细胞用在透化洗涤缓冲液中的抗-IFNγ(Biolegend，目录号505839)在冰上染色20分钟。然后洗涤细胞并通过流式细胞术评估。
树突细胞表面共刺激分子染色
为了制备未成熟的树突细胞(DC)，从C57BL/6小鼠分离骨髓细胞并通过补充20ng/ml IL-4(Peprotech，目录号214-14)和20ng/ml GM-CSF(Peprotech，目录号315-03)来诱导分化。将这些细胞与pRBC和nRBC以1:10的比例一起孵育24小时，然后用100ng/ml LPS(Sigma，目录号437627)诱导成熟24小时(或不处理作为对照)。使用抗小鼠CD80(Biolegend,目录号104705)和抗小鼠CD86(Biolegend,目录号105109)通过流式细胞术评估细胞表面共刺激分子。
细胞因子测定
对于脾脏培养物细胞因子测定，将如上所述分离的5x10 5个脾细胞与新鲜pRBC(寄生虫血症在50％-60％之间)或nRBC以1:1的比例在U型底96孔板中培养72小时。
对于体外BMDM刺激，从C57BL/6小鼠分离骨髓细胞并用20％L929条件培养基诱导4天以分化成BMDM。然后将BMDM用唑来膦酸盐 (Zoledronate，10μM作为阳性对照)或THZ-626(10μM)处理18小时，然后再加入200ng/ml LPS处理24小时。然后使用ELISA试剂盒(Ebioscience)测量上清液IFNγ、IL-6和TNFα水平。
双膦酸盐诱导的OVA特异性抗体的测量
将C57BL/6小鼠用卵清蛋白(OVA，10μg)加TH-Z93(100μg)和TH-Z626(100μg)肌内接种两次，间隔为2周。最后一次免疫接种后7天，通过离心从全血收集血清，并如现有技术中所述测量抗体效价(Y.Xia et al.,The Mevalonate Pathway Is a Druggable Target for Vaccine Adjuvant Discovery.Cell 175,1059-1073.e1021(2018).doi:10.1016/j.cell.2018.08.070)。简而言之，用OVA包被ELISA板。用2％BSA封闭后，将100μl稀释的血清加入孔中，一式三份，然后将板与HRP标记的IgG(Souther Biotech，目录号1036-05)一起孵育。加入邻苯二胺(Sigma,目录号P9029)底物并孵育15分钟，然后加入H 2SO 4终止反应。立即在492nm处读取光密度(OD)，并将产生光密度>2倍背景的最大血清稀释度用作抗体效价值。
PfRab5a、PfREX1和PfSBP1特异性抗体的制备
将PfRab5a(1-235，PlasmoDB基因ID代码PF3D7_0211200)、PfREX1(1-198，PlasmoDB基因ID代码PF3D7_0935900)或PfSBP1(1-210，PlasmoDB基因ID代码PF3D7_0501300)克隆到pET28a载体中，并在BL21(DE3)细胞中表达。使用Ni-sepharose和Superdex 200 Increase 10/300 GL柱(GE Healthcare)纯化蛋白质。将兔或小鼠用纯化的蛋白(100μg)和佐剂明矾肌内接种3次，每次间隔2周。如上所述通过ELISA测量抗体效价。使用PROTEIN A HP树脂(GE Healthcare)收集和纯化血清。
显微分析
通过5％(w/v)D-山梨糖醇使恶性疟原虫寄生虫同步化，然后用膦胺霉素(10μM，有或没有IPP，200μM)、TH-Z626(10μM，有或没有GGPP，15μM)或GGTI-298(10μM)处理24小时。为了进行免疫荧光显微镜检查，将pRBC首先用多聚甲醛(4％)固定，然后透化、封闭，并与如上所述制备的兔抗PfRab5a、小鼠抗PfREX1和小鼠抗PfSBP1一起孵育1小时。在洗涤后加入抗小鼠(ZSGB-BIO,目录号ZF-0512)或抗兔Alexa Fluor 488抗体(ZSGB-BIO,目录号ZF-0511)。然后用DAPI-Fluoromount-G(Southern Biotech，目录号0100-20)固定PRBC。使用100 x Nikon Ti2-E显微镜对样品进行成像，图像 使用ImageJ软件处理。
为了进行食物液泡的超微结构分析，将恶性疟原虫感染的红细胞在4℃下固定在2.5％戊二醛+2％PFA中。样品用PBS洗涤3次，然后用1％四氧化锇的PBS(pH 7.2)溶液在4℃下固定1小时。将细胞在磷酸盐缓冲液中洗涤并在ddH 2O中彻底冲洗，然后在室温下用1％乙酸双氧铀水溶液整体染色1小时。在ddH 2O中冲洗3次后，将样品在系列分级乙醇(50％、70％、80％、90％、95％、100％)中脱水并嵌入Eponate12树脂(FEI)中。切下80nm的切片，用乙酸双氧铀和柠檬酸铅染色，并在60kV加速电压下在透射电子显微镜(Hitachi-7650B)上观察。
免疫印迹分析
恶性疟原虫3D7寄生虫生长到约5％的寄生虫血症，并通过如上所述的山梨糖醇处理进行同步化。然后用膦胺霉素(10μM)或TH-Z626(10μM)在具有或不具有GGPP(15μM)的情况下，或用GGTI-298(10μM)、氯喹(10μM)处理寄生虫24小时。对于寄生虫异戊二烯化抑制，如现有技术中所述进行寄生虫沉淀物的收集(R.Howe,M.Kelly,J.Jimah,D.Hodge,A.R.Odom,Isoprenoid biosynthesis inhibition disrupts Rab5 localization and food vacuolar integrity in Plasmodium falciparum.Eukaryot Cell 12,215-223(2013).doi:10.1128/ec.00073-12)，但存在以下一些修改。宿主红细胞用0.1％皂苷(Sigma，目录号S7900)裂解，收获寄生虫并通过在液氮下冷冻和解冻来裂解寄生虫。对于REX1和SBP1，如上所述，用无菌蒸馏水裂解经药物处理的pRBC。上清液用于鉴定。
小鼠疟疾治疗
将小鼠腹膜内感染pRBC(每只小鼠1x10 7个)。腹膜内注射不同化合物(一天两次磷胺霉素150mg/kg，青蒿素100mg/kg，氯喹10mg/kg，持续7或8天；或每天一次TH-Z613 8mg/kg，TH-Z321 8mg/kg，BPH-703 10mg/kg，持续5天)。基于吉姆萨染色的血涂片，评估药物功效。对于寄生虫再次攻毒，在最后一次药物治疗后30天用1x10 5个pRBC进行对治愈的小鼠进行再次攻毒。从再次攻毒后4天开始，每隔一天基于吉姆萨染色的血涂片监测寄生虫血症。
对于膦胺霉素与其他药剂的联合疗法，将小鼠腹膜内接种1x10 7个pRBC，然后在攻毒后腹膜内注射膦胺霉素(40mg/kg)同时肌内注射DMXAA (5mg/kg)、咪喹莫特(5mg/kg)或辛伐他汀(5mg/kg)，每天3次。为了评估BPH-703功效中B细胞和/或NK细胞的依赖性，将10 7个pRBC感染的小鼠腹膜内注射低剂量的BPH-703(2mg/kg)或CQ(3mg/kg)。
合成实验
所有双膦酸盐化合物均使用先前描述的方法制备(Y.Zhang et al.,Lipophilic bisphosphonates as dual farnesyl/geranylgeranyl diphosphate synthase inhibitors:an X-ray and NMR investigation.J Am Chem Soc 131,5153-5162(2009).doi:10.1021/ja808285e；J.H.No et al.,Lipophilic analogs of zoledronate and risedronate inhibit Plasmodium geranylgeranyl diphosphate synthase(GGPPS)and exhibit potent antimalarial activity.Proc Natl Acad Sci U S A 109,4058-4063(2012).doi:10.1073/pnas.1118215109)。通过在Varian Unity光谱仪上使用 1H NMR and 31P NMR光谱以及通过HRMS来监测纯度。
(5-((10-(1H-四唑-1-基)癸基)氧基)-6-甲基必定-1-基)亚乙基-1,1-双膦酸(THZ-626). 1H NMR(400MHz,D 2O),δ(ppm):8.75(s,1H),8.54(d,J＝2.4Hz,1H),7.89(dd,J＝9.2Hz,J＝2.4Hz,1H),7.71(d,J＝9.2Hz,1H),4.83-4.89(m,2H),4.72(t,J＝6.8Hz,2H),4.19(t,J＝6.8Hz,2H),2.84(s,3H),2.42-2.55(m,1H),1.97-2.02(m,2H),1.77-1.96(m,2H),1.32-1.45(m,2H),1.25-1.27(m,10H). 31P NMR(162MHz,D 2O),δ(ppm):13.42. 13C NMR(100MHz,D 2O),δ(ppm):160.2,155.7,152.7,147.6,132.7,131.8,130.1,70.3,53.4,41.1,28.4,28.3,28.2,28.0,27.8,25.3,24.9,18.9.C 19H 32N 5O 7P 2HRMS(M–H) –计算值504.1777,实测值504.1796。
(N-十二烷基咪唑-1-基)亚乙基-1,1-双膦酸(BPH-703). 1H NMR(400MHz,D 2O)δppm:8.77(s,1H),7.52(d,J＝2.0Hz,1H),7.30(d,J＝2.0Hz,1H),4.51(td,J 1＝13.6Hz,J 2＝5.6Hz,2H),4.11(t,J＝7.2Hz,2H),2.11(tt,J 1＝21.6Hz,J 2＝5.6Hz,1H),1.81-1.87(m,2H),1.23-1.28(m,18H),0.82(t,J＝7.2Hz,3H). 31P NMR(162MHz,D 2O)δppm:15.36.
(N-十一烷基-4-甲基咪唑-1-基)亚乙基-1,1-双膦酸(THZ-321). 1H NMR(400MHz,D 2O),δppm:8.68(s,1H),7.29(s,1H),4.46-4.54(m,2H),4.07(t,J＝7.2Hz,2H),2.28(s,3H),2.11(tt,J 1＝21.6Hz,J 2＝6.0Hz,1H),1.81-1.85(m,2H),1.27-1.34(m,16H),0.86(t,J＝7.2Hz,3H). 31P NMR(162MHz,D 2O),δppm:14.55. 13C NMR(100MHz,D 2O),δppm:135.5,131.0,119.6,47.2,46.6, 41.2,31.5,29.1,29.1,28.9,28.9,28.5,25.7,22.3,13.6,8.3.C 17H 35N 2O 6P 2HRMS(M+H) +计算值425.1970,实测值425.1953。
(3-癸氧基-6-甲基吡啶-1-基)亚乙基-1,1-双膦酸(THZ-613). 1H NMR(400MHz,MeOH),δ(ppm):8.70(d,J＝2.0Hz,1H),7.98(dd,J 1＝8.8Hz,J 2＝2.0Hz,1H),7.79(d,J＝8.8Hz,1H),4.94-5.02(m,2H),4.20(t,J＝6.4Hz,2H),2.88(s,3H),2.74-2.82(m,1H),1.81-1.88(m,2H),1.47-1.54(m,2H),1.30-1.38(m,12H),0.90(t,J＝6.8Hz,3H). 31P NMR(162MHz,MeOH),δ(ppm):14.73. 13C NMR(100MHz,MeOH),δ(ppm):157.5,149.3,134.4,133.5,131.3,71.4,56.7,33.1,30.7,30.7,30.5,30.4,30.0,26.9,23.8,19.5,14.5.C 18H 34NO 7P 2HRMS(M+H) +计算值438.1811,实测值438.1808,
实施例1.DXR抑制剂提供了抗疟原虫感染的免疫防护作用
为了探究类异戊二烯生物合成在宿主抗病原体例如疟疾病原体免疫学中的作用，首先选择MEP途径的第一个关键酶DXR进行靶向。没有采用常见的关键目标抗原识别策略，而是采用了药物处理的全寄生虫免疫(WPV)方案，因为这种方案可以暴露整个抗原谱，并且能够反映免疫方案与现实感染之间的抗原变异性。在准备好早期“环状体”阶段夏氏疟原虫(P.chabaudi)寄生的红细胞(pRBC)后，在体外用膦胺霉素(DXR抑制剂)或青蒿素、氯喹(两种传统抗疟剂药物)分别处理以杀死寄生虫，从而得到经药物减毒的pRBC。随后，向小鼠静脉(i.v.)注射10 7个经药物处理的pRBC或正常RBC(nRBC)进行免疫接种3次。在3次接种后的1个月或3个月时用致死剂量的活寄生虫(10 5个夏氏疟原虫pRBC)再次攻毒(图1A)。对小鼠存活率和血液中寄生虫含量(寄生虫血症)进行监测。结果表明，在免疫接种后1个月时再次攻毒(图1B)和3个月时再次攻毒(图1C)，仅膦胺霉素组显示出完全的防护作用，而其他组在10天内达到100％的死亡率。
当使用膦胺霉素处理的约氏疟原虫(P.yoelii)pRBC对小鼠进行免疫接种，并在随后使用同源寄生虫Py pRBC进行攻毒时也观察到膦胺霉素的完全防护作用(图1D)，这表明膦胺霉素处理对不同的疟原虫感染都具有防护作用。此外，将小鼠用10 7个膦胺霉素调节的夏氏疟原虫pRBC免疫3次，一个月后用10 5个约氏疟原虫pRBC静脉注射攻毒小鼠。对小鼠存活率和血液中寄生虫含量进行监测。异源攻毒实验的结果证实，膦胺霉素处理的pRBC提供跨物 种防护作用(图1E)。
为了揭示适应性免疫的哪些组分对免疫防护作用是必要的，进行了免疫细胞耗竭实验。如上所述用膦胺霉素处理的约氏疟原虫pRBC对C57BL/6小鼠或B细胞缺陷型小鼠进行免疫，然后用10 5个夏氏疟原虫pRBC进行攻毒以评估B细胞依赖性，结果如图2A所示。此外，在用膦胺霉素处理的约氏疟原虫pRBC对C57BL/6小鼠进行3次免疫接种后，在攻毒的第-1、0、1、2、3、4、6和10天向小鼠分别注射大鼠IgG(对照IgG)、抗CD4抗体或抗CD8抗体以耗竭对应的T细胞类型并评估CD4+和CD8+T细胞依赖性，结果如图2B所示。免疫细胞耗竭实验表明，CD8+T细胞的缺失不会降低疗效，但CD4+T细胞或B细胞的耗竭导致小鼠死亡，其水平与未处理的对照动物相当。
进一步分析了免疫小鼠的细胞因子和脾细胞。向C57BL/6小鼠3次免疫接种1x10 7个经膦胺霉素调节的夏氏疟原虫pRBC或1x10 7个经膦胺霉素调节的nRBC。最后一次免疫后30天，处死小鼠，在布雷菲尔德菌素A存在下用PMA和离子霉素在体外刺激脾细胞6小时，并通过染色分析IFNγ +CD4 +T细胞，结果如图2C所示(左图)。将脾细胞与培养基(对照)、nRBC或pRBC一起培养72小时，然后收集上清液并检测细胞因子的表达，结果如图2C所示(右图)。结果显示，免疫小鼠的脾细胞在用pRBC刺激后产生大量IFNγ。总的来说，这些结果表明了免疫小鼠中CD4+T细胞依赖性抗体的产生。
进一步进行了血清过继转移以评估经免疫的小鼠血清是否提供免疫防护作用。简而言之，将经过膦胺霉素处理的约氏疟原虫pRBC免疫的供体小鼠的血清转移到未经免疫的受体小鼠，并进行攻毒实验。监测受体小鼠的寄生虫血症和存活率。结果表明，接受来自接种了膦胺霉素组小鼠的血清的受体小鼠产生了对寄生虫攻毒的防护作用(图3A和3B)。这些结果与图2中的结果一致，表明经免疫接种的小鼠中CD4+T细胞依赖性抗体的产生提供了免疫防护作用。
为了排除膦胺霉素以抑制DXR之外的其他方式引起增强免疫应答的可能性，使用另一种DXR抑制剂(FR900098)进行了相同的免疫接种和攻毒实验，并检测到类似的防护作用(图4)。
这些结果表明，宿主免疫系统能够感知疟原虫中类异戊二烯代谢途径的抑制作用，并引发针对病原体的强烈免疫应答。疟原虫中类异戊二烯代谢途径的抑制，例如DXR的抑制能够增强宿主的适应性免疫诱导。
实施例2.GGPPS抑制剂赋予了抗疟疾适应性免疫防护作用
法尼基焦磷酸合酶(FPPS)和香叶基香叶基焦磷酸合酶(GGPPS)是类异戊二烯生物合成中的分支节点酶。哺乳动物细胞含有独立的FPPS和GGPPS。在疟疾寄生虫中，DMAPP和IPP的缩合由双功能FPP/GGPP合酶(称为GGPPS)催化，从而产生C15法尼基焦磷酸(FPP)，然后产生C20香叶基香叶基二磷酸酯(GGPP)。与人FPPS一样，疟原虫GGPPS对例如唑来膦酸盐和利塞膦酸盐的双膦酸类药物敏感。这类药物抑制疟原虫和宿主两者的GGPPS，而不能特异性抑制疟原虫GGPPS，因此会对宿主类异戊二烯生物合成途径产生影响。对疟原虫GGPPS具有选择性的抑制剂可以帮助阐明，破坏这种疟原虫特异性生物合成步骤是否会增强宿主免疫应答。
为此，开发了疟原虫GGPPS的高选择性双膦酸盐抑制剂TH-Z626。简而言之，将甲基引入吡啶鎓-1-基环中以引起与人FPPS的空间位阻(图5A)。TH-Z626的极性四唑部分几乎肯定排除了TH-Z626在人GGPPS疏水裂缝处的任何结合(图5B)，而疟原虫GGPPS中存在的两个水分子很容易稳定这种相互作用。TH-Z626及其与疟原虫GGPPS复合的晶体结构分别如图5C和图5D所示。确定了TH-Z626对间日疟原虫GGPPS(IC 50＝0.12μM)和恶性疟原虫(IC 50＝2.49μM)的抑制活性并确认了TH-Z626对疟原虫GGPPS的选择性。体外和体内试验均表明TH-Z626不抑制重组人FPPS(HsFPPS)或人GGPPS(HsGGPPS)以及鼠FPPS或GGPPS(图5E和图5F-5H)。
此外，与对DXR抑制的观察结果一致，接种了TH-Z626处理的夏氏疟原虫pRBC的小鼠免受活夏氏疟原虫(图5I)和约氏疟原虫的攻毒(图5J)，并且这种防护作用依赖于CD4+T细胞和B细胞(图5K)。这些结果表明，疟原虫特异性GGPPS抑制剂能够增强宿主的适应性免疫诱导，并且产生免受寄生虫攻毒的跨物种防护作用。
还测试了可以结合并抑制宿主GGPPS和寄生虫GGPPS两者的亲脂性双膦酸盐化合物的抗疟疾功效。测试了三种具有以上属性的化合物BPH-703、TH-Z321和TH-Z613。这些化合物的结构、酶促和细胞活性、晶体结构和佐剂性如图6A-6D所示。其中，图6A显示了BPH-703、TH-Z321和TH-Z613的化学结构以及酶促和寄生虫抑制活性；图6B和图6C分别显示了TH-Z321与疟原虫GGPPS(PDB代码7ES3)复合和与人GGPPS(PDB代码7ERW)复合的X射线晶 体结构。在这两种结构中，烷基链位于疏水裂缝中，双膦酸头部与Mg 2+离子螯合。图6D显示了所有三种抑制剂都表现出有效的佐剂性，如通过C57BL/6小鼠中的OVA特异性抗体测量。图6E显示了三种抑制剂的直接注射都能够杀灭动物体内的寄生虫，并抵抗再次攻毒。
为了评估这些化合物的寄生虫杀灭作用对免疫细胞的依赖性，在攻毒后每天用BPH-703或对照CQ处理夏氏疟原虫感染的C57BL/6小鼠和B细胞缺陷型小鼠并记录寄生虫血症，结果如图6F所示。此外，每天用BPH-703处理夏氏疟原虫感染的C57BL/6小鼠，感染后每天给予对照IgG或α-NK抗体并记录寄生虫血症，结果如图6G所示。结果表明，B细胞和NK细胞对于BPH-703的体内功效是必不可少的，而CQ的体内抗疟活性不依赖于B细胞或NK细胞。这些来自免疫细胞耗竭实验的结果证实了，抗体依赖性NK细胞杀伤作用介导了类异戊二烯生物合成抑制剂的寄生虫杀灭活性。
这些结果表明，疟原虫GGPPS特异性抑制或疟原虫GGPPS和宿主GGPPS的双重抑制均赋予了抗疟疾适应性免疫防护作用。
实施例3.香叶基香叶基转移酶抑制剂赋予了抗疟疾免疫防护作用
为了确定观察到的DXR和GGPPS抑制剂效应的潜在机制，接下来探究了下游酶对宿主抗红细胞期疟原虫免疫应答的贡献。筛选了三个分子：GGTI-298(已知的疟原虫香叶基香叶基转移酶抑制剂)；氟草敏(Norflurazon，已知可阻断八氢番茄红素去饱和酶以阻断类胡萝卜素合成)；和Ro 48-8071(其阻断醌和泛醌的产生)，如图7A所示。基于用这些抑制剂对pRBC进行初始处理的WPV接种实验确定了GGPP代谢的特定分支(即，香叶基香叶基转移酶催化的蛋白质香叶酰香叶酰化)对宿主抗疟原虫感染的免疫应答的特定生化贡献。与对DXR和GGPPS抑制的观察结果一致，接种了GGTI-298处理的夏氏疟原虫pRBC的小鼠免受活夏氏疟原虫(图7B)和约氏疟原虫的攻毒(图7C)。结果表明，对香叶基香叶基转移酶(GGTase)，而不是产生较大类异戊二烯(泛醌、类胡萝卜素等)的酶的抑制，促进了疟原虫的适应性免疫识别。这些结果表明，通过抑制香叶基香叶基转移酶和上游途径，阻断了蛋白质的香叶酰香叶酰化，能够产生免受寄生虫攻毒的防护作用
实施例4.香叶酰香叶酰化抑制导致抗原蛋白的暴露增加
在免疫上，观察到的对类异戊二烯生物合成途径的抑制实现寄生虫免疫原性可归因于两个原因。一个可能是增加了抗原蛋白的暴露；另一个可能是通过pRBC/树突细胞相互作用增加先天免疫细胞的激活。为了确定寄生虫免疫原性的机制，将膦胺霉素处理的pRBC和未经处理的pRBC用LPS引发，实验方法如“树突细胞表面共刺激分子染色”小节中所述，并测量CD80和CD86的表达，结果如图8所示。结果显示，膦胺霉素处理的pRBC在LPS诱导成熟的小鼠树突细胞中没有引起CD80和CD86表达的差异，这表明寄生虫免疫原性不是由pRBC/树突细胞相互作用增加先天免疫细胞的激活所导致。
基于以上结果，本发明人合理推断，对类异戊二烯生物合成途径的抑制实现寄生虫免疫原性的机制是抗原蛋白的暴露增加，这是由疟原虫中香叶酰香叶酰化被破坏所导致。这些结果支持在典型的红细胞期感染中，疟原虫细胞利用GGPP来“隐藏”它们的抗原蛋白以逃避宿主免疫监视。
据报道，哺乳动物中GTP酶的香叶酰香叶酰化(或缺乏)是控制GTP酶是否与膜结合的开关，这已被证明可指导细胞器运输、裂变和融合。设想通过直接阻断香叶基香叶基转移酶活性或减少香叶酰香叶酰化反应所需的GGPP底物，来破坏疟原虫中的小GTP酶的香叶酰香叶酰化，将会促进抗原蛋白在pRBC胞质溶胶中积累，增加抗原蛋白的暴露。为了验证上述猜想，用FOS/TH-Z626/GGTI-298处理24小时的细胞进行靶向长链异戊烯修饰的免疫印迹，结果表明FOS、TH-Z626和GGTI-298均抑制了小GTP酶的香叶酰香叶酰化程度(图9A)；并且添加外源GGPP(15μM)逆转了FOS和TH-Z626的抑制作用。如通过免疫荧光染色所测定的，观察到FOS、TH-Z626和GGTI-298导致了抗原蛋白如Rab5a(图9B)、环输出蛋白1(REX1)(图9C)和骨架结合蛋白1(SBP1)(图9D)的错误定位，即从局限于寄生虫的正常向心凝聚模式到存在于全部感染RBC中的抑制剂诱导的斑块状、膜锚定定位模式。在这些类异戊二烯生物合成抑制剂处理之后，包括Rab5a、REX1和SBP1在内的抗原蛋白从毛勒氏裂(Maurer’s cleft)完全扩散到RBC细胞质中，这证实了抗原隐藏得以逆转。
食物液泡是疟原虫寄生虫的消化细胞器，其相当于哺乳动物的溶酶体。用膦胺霉素、TH-Z626和GGTI-298处理寄生虫，观察到寄生虫中食物液泡形态的异常变化，这种异常变化通过缺乏食物液泡膜来表征。FOS和TH-Z626对食物液泡的作用可以通过添加外源GGPP被阻断(图10)。这些结果与上述观 察到的抗原蛋白错误定位的结果相一致，进一步证实了疟原虫香叶酰香叶酰化抑制导致抗原蛋白的暴露增加。
通过使用这些不同的类异戊二烯生物合成抑制剂来减少GGPP或直接阻断香叶基香叶基转移酶获得的结果，推断红细胞期疟原虫寄生虫通过操纵香叶酰香叶酰化来隐藏宿主细胞胞质溶胶中的抗原蛋白，从而逃避宿主的免疫杀伤。另外，还观察到膦胺霉素、TH-Z626和GGTI-298均导致寄生虫快速死亡，即即发生在疟原虫的第一个生长周期内(图11A)，而用强力霉素(DOX)、克林霉素(CLIN)或阿奇霉素(AZI)处理的寄生虫在第二个生长周期的裂殖体阶段停滞。在处理后48和96小时评估的7种抗疟药的IC 50值显示于图11B中。
实施例5.经药物调节的pRBC裂解物提供了抗疟疾免疫防护作用
为了测试了经香叶酰香叶酰化抑制处理的RBC细胞质中抗原蛋白水平的变化及其这些抗原蛋白是否负责诱导适应性免疫，用经FOS/TH-Z626/GGTI-298处理的pRBC裂解物针对REX1和SBP1进行蛋白质免疫印迹；并单独用经FOS处理的pRBC裂解物上清液(FOS-pRBC Lys-S)或裂解物沉淀(FOS-pRBC Lys-P)免疫小鼠，免疫接种后1个月对小鼠进行同源攻毒。结果显示，FOS/TH-Z626/GGTI-298处理增加了pRBC裂解物上清液中抗原蛋白REX1和SBP1的水平(图12A)，并且单独的pRBC裂解物上清液具有免疫原性并提供全面防护(图12B)。这证实了，经香叶酰香叶酰化抑制处理的RBC细胞质中抗原蛋白水平增加并诱导了适应性免疫应答。
用来自FOS-pRBC(10 4)的裂解物上清液与佐剂(利塞膦酸盐-MnCl 2)一起免疫小鼠，结果表明，在疫苗佐剂的存在下，可以在10 4个细胞的最小等效剂量下实现完全防护作用(图12C)。
实施例6.MEP途径抑制剂与其他治疗剂的联合疗法
进一步测试了同时增加疟疾抗原蛋白水平和宿主先天免疫细胞的抗原呈递能力是否可加速体内寄生虫杀灭。具体而言，实验基于用低剂量膦胺霉素(40mg/kg)处理夏氏疟原虫感染的小鼠，该剂量不足以完全治愈小鼠。膦胺霉素与两种先天性免疫激动剂DMXAA(一种STING激动剂)或咪喹莫特(一种TLR激动剂)之一的组合的结果显示，两种联合疗法在降低寄生虫血症的程度方面都明显优于膦胺霉素单一疗法(图13A和13B)。单独的DMXAA和咪喹莫 特疗法未能减少动物体内的寄生虫负担。这表明增强适应性免疫应答可以加速寄生虫清除。
辛伐他汀(simvstatin)是哺乳动物宿主甲羟戊酸(MVA)途径中HMG-CoA还原酶的抑制剂，通过耗尽树突细胞中的GGPP含量起到疫苗佐剂的作用。在本研究中，测试了膦胺霉素-辛伐他汀联合疗法作为疟疾治疗方法的功效。在夏氏疟原虫感染的小鼠模型中，通过使用膦胺霉素和辛伐他汀的组合来处理小鼠，结果如图13C所示。结果显示，与膦胺霉素单一疗法相比，膦胺霉素-辛伐他汀联合疗法实现了增强杀灭寄生虫的协同效应。这种基于一种MEP途径抑制剂和一种MVA途径抑制剂的组合所实现的协同效应表明，同时减少疟疾寄生虫和宿主细胞中的GGPP可增强杀伤效果。
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Claims (62)

  1. 免疫原性组合物，其包含病原体或病原体感染的宿主细胞或它们的裂解物，其中所述病原体或所述宿主细胞已经使用类异戊二烯代谢途径的抑制剂处理。
  2. 权利要求1的组合物，其中所述病原体选自寄生虫、病毒、细菌和真菌。
  3. 权利要求2的组合物，其中所述寄生虫为顶复门原虫。
  4. 权利要求3的组合物，其中所述顶复门原虫选自疟原虫(Plasmodium spp.)、弓形虫(Toxoplasma gondii)、隐孢子虫(Cryptosporidium spp.)、巴贝斯虫(Babesia spp.)和艾美耳球虫(Eimeria spp.)。
  5. 权利要求4的组合物，其中所述疟原虫选自夏氏疟原虫(Plasmodium chabaudi)、约氏疟原虫(Plasmodium yoelii)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、伯氏疟原虫(Plasmodium berghei)、三日疟原虫(Plasmodium malariae)和卵形疟原虫(Plasmodium ovale)。
  6. 权利要求1的组合物，其中所述病原体为疟原虫，且所述宿主细胞为红细胞或红细胞前体细胞。
  7. 权利要求2的组合物，其中所述病毒选自非洲猪瘟病毒、腺病毒、登革热1至4血清型、埃博拉病毒、肠道病毒、肝炎A至E血清型、单纯疱疹病毒1或2、人免疫缺陷病毒、流感病毒、中东呼吸综合征(Mers)病毒、日本马脑炎病毒、麻疹病毒、诺沃克病毒、乳头瘤病毒、细小病毒B19、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、轮状病毒、风疹病毒、麻疹病毒、痘苗病毒、水痘病毒、和黄热病病毒。
  8. 权利要求2的组合物，其中所述细菌选自结核分枝杆菌、炭疽、弯曲杆菌、霍乱、白喉、产肠毒素性大肠杆菌、贾第虫、淋球菌、幽门螺杆菌、乙型流感嗜血菌、不可定型的流感嗜血菌、脑膜炎球菌、百日咳、肺炎球菌、沙门氏菌、志贺氏菌、链球菌B、A组链球菌、破伤风、霍乱弧菌、耶尔森氏菌、葡萄球菌、假单胞菌属物种和梭菌属物种。
  9. 权利要求2的组合物，其中所述真菌选自孢子、霉菌和酵母(例如，念珠菌物种)。
  10. 权利要求1-9中任一项的组合物，其中所述类异戊二烯代谢途径的抑制剂是针对参与类异戊二烯代谢途径的酶的抑制剂。
  11. 权利要求10的组合物，其中所述酶选自参与甲羟戊酸(MVA)途径的酶和参与2C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸(MEP)途径的酶。
  12. 权利要求11的组合物，其中所述参与MVA途径的酶选自乙酰CoA乙酰基转移酶(ATOB)、HMG-CoA合酶(HMG)、HMG-CoA还原酶(HMGR)、甲羟戊酸激酶(MVK)、磷酸甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶(MPD)、异戊烯焦磷酸异构酶(IPI)、法尼基焦磷酸合酶(FPPS)、香叶基香叶基焦磷酸合酶(GGPPS)和香叶基香叶基转移酶(GGTase)；和所述参与MEP途径的酶选自1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXS)、1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(DXR)、2C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸胞苷基转移酶(IspD)、4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓糖醇激酶(IspE)、2C-甲基-D-赤藓糖醇-2,4-环二磷酸合酶(IspF)、1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸合酶(IspG)、4-羟基-3-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸还原酶(IspH)、香叶基香叶基焦磷酸合酶(GGPPS)和香叶基香叶基转移酶(GGTase)。
  13. 权利要求1-12中任一项的组合物，其中所述类异戊二烯代谢途径的抑制剂抑制蛋白质的香叶酰香叶酰化。
  14. 权利要求1-13中任一项的组合物，其中所述抑制剂选自小分子抑制剂、抑制性RNA分子(例如siRNA、miRNA)、蛋白质或肽类抑制剂。
  15. 权利要求1-14中任一项的组合物，其中所述抑制剂选自膦胺霉素、FR-900098、TH-Z626、双膦酸类(例如利塞膦酸盐、唑来膦酸盐、TH-Z321、TH-Z613、BPH-703)、GGTI-298、GGTI-287、GGTI297、FTI-276和FTI277中的一种或多种。
  16. 权利要求15的组合物，其中所述抑制剂选自TH-Z321、TH-Z613和BPH-703。
  17. 权利要求1-14中任一项的组合物，其中所述抑制剂选自以下化合物或其药学上可接受的盐：
  18. 权利要求1-14中任一项的组合物，其中所述抑制剂为他汀类，例如普伐他汀、阿托伐他汀、罗苏伐他汀、氟伐他汀、匹伐他汀、美伐他汀、洛伐他汀、辛伐他汀、西立伐他汀，或其药学上可接受的盐。
  19. 权利要求1-14中任一项的组合物，其中所述抑制剂为双膦酸类，例如唑来膦酸、帕米膦酸、阿仑膦酸、伊班膦酸、奈立膦酸、利塞膦酸、奥帕膦酸、米诺磷酸、西马膦酸、EB-1053、依替膦酸、英卡膦酸、匹瑞膦酸、唑仑膦酸、伊本膦酸，或其药学上可接受的盐。
  20. 权利要求1-14中任一项的组合物，其中所述抑制剂为式I所示化合物或其药学上可接受的盐或水合物：
    上述式I中，其分子量小于1000，
    Ar为苯并咪唑类基或氮杂苯并咪唑基；
    X为下述任意一种：氢、羟基、脂肪基、巯基、卤素、烷氧基或烷基；
    每一个M可独立地为下述任意一种：负电荷、氢、烷基、脂肪基、-(CH 2)p-O-CO-R、-(CH 2)p-CO-R或阳离子；其中，p＝1-6，R为氢、烷基或芳香基；所述阳离子为Li +、Na +、K +、Ca 2+、Mg 2+、NH 4 +或N(R’) 4 +，其中R’为烷基；
    R 6、R 7分别独立地选自下述任意一种：氢、羟基、巯基、卤素、氨基、脂肪基或烷基；和
    m＝1-6的整数。
  21. 权利要求1-14中任一项的组合物，其中所述抑制剂为下式的化合物或其可药用盐、酯、前药、溶剂化物：
    其中
    R 1、R 2各自选自氢、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷基氨基、烷基硫基、卤素、羟基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基，所述烷氧基中的烷基任选被芳基、杂芳基或杂环基取代，所述芳基、杂芳基或杂环基任选取代有烷基、氨基甲酰基；和
    X选自氢、羟基、巯基、卤素。
  22. 权利要求1-14中任一项的组合物，其中所述抑制剂为下式的化合物或其可药用盐、酯、前药、溶剂化物：
    其中
    R 3、R 4各自选自氢、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷基氨基、烷基硫基、卤素、羟基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基，所述烷氧基中的烷基任选被 芳基、杂芳基或杂环基取代，所述芳基、杂芳基或杂环基任选取代有烷基、氨基甲酰基；和
    X选自氢、羟基、巯基、卤素。
  23. 权利要求1-14中任一项的组合物，其中所述抑制剂为下式的化合物或其可药用盐、酯、前药、溶剂化物：
    其中
    R 1选自氢、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷基氨基、烷基硫基、卤素、羟基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基，所述烷氧基中的烷基任选被芳基、杂芳基或杂环基取代，所述芳基、杂芳基或杂环基任选取代有烷基、氨基甲酰基；
    R 2选自氢、烷基、烷氧基、烷基氨基、烷基硫基、卤素、羟基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基；
    R 3选自氢、烷基、烷氧基、烷基氨基、烷基硫基、卤素、羟基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基；
    或者R 2与R 3与它们所连接的碳原子一起形成芳环或杂芳环；以及
    R 4选自氢、烷基、烷氧基、烷基氨基、烷基硫基、卤素、羟基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基。
  24. 权利要求1-14中任一项的组合物，其中所述抑制剂为下式的化合物或其可药用盐、酯、前药、溶剂化物：
    其中
    R 5选自氢、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷基氨基、烷基硫基、卤素、羟基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基；
    R 6选自氢、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷基氨基、烷基硫基、卤素、羟基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基；
    R 7选自氢、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷基氨基、烷基硫基、卤素、羟基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基；以及
    R 8选自氢、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷基氨基、烷基硫基、卤素、羟基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基。
  25. 权利要求1-14中任一项的组合物，其中所述抑制剂为下式的化合物或其可药用盐、酯、前药、溶剂化物：
    其中
    R 9选自氢、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷基氨基、烷基硫基、卤素、羟基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基；
    R 10选自氢、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷基氨基、烷基硫基、卤素、羟基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基；
    R 11选自氢、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷基氨基、烷基硫基、卤素、羟基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基；以及
    R 12选自氢、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷基氨基、烷基硫基、卤素、羟基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基。
  26. 权利要求1-25中任一项的组合物，其中所述组合物是疫苗组合物。
  27. 权利要求26的组合物，其中所述疫苗组合物还包含一种或多种佐剂。
  28. 权利要求27的组合物，其中所述佐剂选自铝佐剂(例如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝、明矾)、MF59、AS03、病毒体(例如肝炎病毒病毒体和流感病毒病毒体)、AS04、热可逆水包油乳液、ISA51、弗氏佐剂、IL-12、CpG基序、甘露糖或其任意组合。
  29. 免疫原性组合物，其包含病原体或病原体感染的宿主细胞或它们的裂解物，其中所述病原体或所述宿主细胞中的编码参与类异戊二烯代谢途径的酶的基因被敲除，或经突变使得所述酶的功能降低或丧失。
  30. 权利要求29的组合物，其中所述基因的突变选自核苷酸的插入、缺失、取代或其任意组合。
  31. 权利要求29或30的组合物，其中所述基因的敲除或突变通过基因编辑来实现。
  32. 权利要求31的组合物，其中所述基因编辑通过使用选自以下的系统来实现：CRISPR/Cas、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活样效应因子核酸酶(TALEN)和巨型核酸酶(Meganuclease)。
  33. 权利要求32的组合物，其中所述基因编辑通过使用CRISPR/Cas系统来实现，所述CRISPR/Cas系统选自CRISPR/Cas9、CRISPR/nCas9、CRISPR/Cas10、CRISPR/Cas9a、CRISPR/Cas12、CRISPR/Cas12a、CRISPR/Cas12b、CRISPR/Cas13和CRISPR/Cas14。
  34. 权利要求33的组合物，其中所述CRISPR/Cas系统为CRISPR/Cas9；优选地，所述CRISPR/Cas9包含D10A突变。
  35. 权利要求33或34的组合物，其中所述CRISPR/Cas系统还包含gRNA，所述gRNA包含能够与所述编码参与类异戊二烯代谢途径的酶的基因互补的序列。
  36. 权利要求29-35中任一项的组合物，其中所述病原体选自寄生虫、病毒、细菌和真菌。
  37. 权利要求36的组合物，其中所述寄生虫为顶复门原虫。
  38. 权利要求37的组合物，其中所述顶复门原虫选自疟原虫(Plasmodium spp.)、弓形虫(Toxoplasma gondii)、隐孢子虫(Cryptosporidium spp.)、巴贝斯虫(Babesia spp.)和艾美耳球虫(Eimeria spp.)。
  39. 权利要求38的组合物，其中所述疟原虫选自夏氏疟原虫(Plasmodium chabaudi)、约氏疟原虫(Plasmodium yoelii)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、伯氏疟原虫(Plasmodium berghei)、三日疟原虫(Plasmodium malariae)和卵形疟原虫(Plasmodium ovale)。
  40. 权利要求36的组合物，其中所述病原体为疟原虫，且所述宿主细胞为红细胞或红细胞前体细胞。
  41. 权利要求36的组合物，其中所述病毒选自非洲猪瘟病毒、腺病毒、登革热1至4血清型、埃博拉病毒、肠道病毒、肝炎A至E血清型、单纯疱疹病毒1或2、人免疫缺陷病毒、流感病毒、中东呼吸综合征(Mers)病毒、日本马脑炎病毒、麻疹病毒、诺沃克病毒、乳头瘤病毒、细小病毒B19、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、轮状病毒、风疹病毒、麻疹病毒、痘苗病毒、水痘病毒、和黄热病病毒。
  42. 权利要求36的组合物，其中所述细菌选自结核分枝杆菌、炭疽、弯 曲杆菌、霍乱、白喉、产肠毒素性大肠杆菌、贾第虫、淋球菌、幽门螺杆菌、乙型流感嗜血菌、不可定型的流感嗜血菌、脑膜炎球菌、百日咳、肺炎球菌、沙门氏菌、志贺氏菌、链球菌B、A组链球菌、破伤风、霍乱弧菌、耶尔森氏菌、葡萄球菌、假单胞菌属物种和梭菌属物种。
  43. 权利要求36的组合物，其中所述真菌选自孢子、霉菌和酵母(例如，念珠菌物种)。
  44. 权利要求29-43中任一项的组合物，其中所述参与类异戊二烯代谢途径的酶选自参与甲羟戊酸(MVA)途径的酶和参与2C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸(MEP)途径的酶。
  45. 权利要求44的组合物，其中所述参与MVA途径的酶选自乙酰CoA乙酰基转移酶(ATOB)、HMG-CoA合酶(HMG)、HMG-CoA还原酶(HMGR)、甲羟戊酸激酶(MVK)、磷酸甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶(MPD)、异戊烯焦磷酸异构酶(IPI)、法尼基焦磷酸合酶(FPPS)、香叶基香叶基焦磷酸合酶(GGPPS)和香叶基香叶基转移酶(GGTase)；和所述参与MEP途径的酶选自1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXS)、1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(DXR)、2C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸胞苷基转移酶(IspD)、4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓糖醇激酶(IspE)、2C-甲基-D-赤藓糖醇-2,4-环二磷酸合酶(IspF)、1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸合酶(IspG)、4-羟基-3-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸还原酶(IspH)、香叶基香叶基焦磷酸合酶(GGPPS)和香叶基香叶基转移酶(GGTase)。
  46. 权利要求29-45中任一项的组合物，其中所述病原体为非洲猪瘟病毒，并且所述编码参与类异戊二烯代谢途径的酶的基因为非洲猪瘟病毒编码GGPPS的基因B318L。
  47. 权利要求29-46中任一项的组合物，其中所述组合物是疫苗组合物。
  48. 权利要求47的组合物，其中所述疫苗组合物还包含一种或多种佐剂。
  49. 权利要求48的组合物，其中所述佐剂选自铝佐剂(例如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝、明矾)、MF59、AS03、病毒体(例如肝炎病毒病毒体和流感病毒病毒体)、AS04、热可逆水包油乳液、ISA51、弗氏佐剂、IL-12、CpG基序、甘露糖或其任意组合。
  50. 制备根据权利要求1-28中任一项所述的免疫原性组合物的方法，所述方法包括使所述病原体或宿主细胞与类异戊二烯代谢途径的抑制剂接触的步 骤。
  51. 权利要求50的方法，其中所述方法进一步包括在接触步骤后裂解所述病原体或宿主细胞以获得裂解物的步骤。
  52. 制备根据权利要求29-49中任一项所述的免疫原性组合物的方法，所述方法包括敲除或突变所述病原体或所述宿主细胞中的编码参与类异戊二烯代谢途径的酶的基因使得所述酶的功能降低或丧失的步骤。
  53. 权利要求52的方法，其中所述方法进一步包括在敲除或突变步骤后裂解所述病原体或宿主细胞以获得裂解物的步骤。
  54. 预防和/或治疗受试者中由病原体感染引起的疾病或症状的方法，其包括向所述受试者施用有效量的权利要求1-49中任一项的免疫原性组合物的步骤。
  55. 权利要求54的方法，其还包括施用一种或多种另外的预防剂或治疗剂。
  56. 权利要求55的方法，其中所述另外的预防剂或治疗剂为先天性免疫激动剂。
  57. 权利要求56的方法，其中所述先天性免疫激动剂选自STING激动剂如DMAXX和TLR激动剂如咪喹莫特。
  58. 治疗受试者中由病原体感染引起的疾病或症状的方法，其包括向所述受试者施用有效量的至少一种参与MEP途径的酶的抑制剂以及至少一种选自以下的治疗剂：参与MVA途径的酶的抑制剂和先天性免疫激动剂。
  59. 权利要求58的方法，其中所述参与MEP途径的酶选自1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXS)、1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(DXR)、2C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸胞苷基转移酶(IspD)、4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓糖醇激酶(IspE)、2C-甲基-D-赤藓糖醇-2,4-环二磷酸合酶(IspF)、1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸合酶(IspG)、4-羟基-3-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸还原酶(IspH)、香叶基香叶基焦磷酸合酶(GGPPS)和香叶基香叶基转移酶(GGTase)。
  60. 权利要求58的方法，其中所述参与MVA途径的酶选自乙酰CoA乙酰基转移酶(ATOB)、HMG-CoA合酶(HMG)、HMG-CoA还原酶(HMGR)、甲羟戊酸激酶(MVK)、磷酸甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶(MPD)、异戊烯焦磷酸异构酶(IPI)、法尼基焦磷酸合酶(FPPS)、香叶基香叶基焦磷酸合酶 (GGPPS)和香叶基香叶基转移酶(GGTase)；优选地，其中所述参与MVA途径的酶的抑制剂为辛伐他丁。
  61. 权利要求58的方法，其中所述先天性免疫激动剂选自STING激动剂如DMAXX和TLR激动剂如咪喹莫特。
  62. 权利要求58-61中任一项的方法，其中所述病原体选自寄生虫、病毒、细菌和真菌。
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