CN117940117A - 含有负载有基于反义寡核苷酸的药物的细胞源性天然或人工纳米囊泡的药物组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及药物组合物及其制备方法，该药物组合物通过在细胞源性天然或人工纳米囊泡中负载基于核酸的药物能够将基于核酸的药物引入细胞。根据本发明，负载有反义寡核苷酸的天然或人工纳米囊泡在与常规化疗剂组合施用时抑制癌细胞的增殖和迁移并表现出增加药物敏感性的特性。
Description
技术领域
本发明涉及包含负载有基于核酸的药物的细胞源性天然或人工纳米囊泡的药物组合物。例如，本发明涉及利用负载有针对癌症诱导基因序列的反义寡核苷酸的人细胞源性天然或人工纳米囊泡来开发抗癌药物。
背景技术
根据癌症在体内的位置，癌症可以被称为肝癌、胃癌、子宫癌等。肺部的癌症被称为肺癌，或更准确地说，原发性(肺部开始的)肺癌，即起源于肺组织(例如支气管、细支气管和肺泡)的癌症。相反，起源于其他器官并扩散到肺部的癌症，例如乳腺癌或肝癌，被称为转移性肺癌，其治疗方法与原发性肺癌不同。
肺癌是最可能的癌症死亡原因。肺癌进展缓慢，如果及早发现，可以通过手术治疗。由于临床病程和治疗的不同，肺癌根据癌细胞的大小和形状，在微观上分为非小细胞肺癌(NSCLS)和小细胞肺癌(SCLC)，其中NSCLS占肺癌病例的85％。NSCLC又分为非鳞状NSCLC和鳞状NSCLC。非鳞状NSCLC占病例的大多数(70-75％)，而鳞状NSCLC约占25％。尽管目前一些针对NSCLC的靶向性抗癌药物具有较高的治疗效果，但对于由EGFR T790M突变引起的耐药癌症尚无治疗。
所有细胞都与其他细胞和外部环境交换信息。为此，细胞向环境中分泌多种物质，包括生长因子、细胞因子、趋化因子、激素和神经递质。除了这些单一物质之外，通过细胞外囊泡(EV)进行的信息交换近年来也受到越来越多的关注。就细菌外泌体而言，它们可以含有脂多糖或脂磷壁酸。
细胞外囊泡是所有细胞分泌到外部环境中以在细胞之间交换信息的纳米级囊泡。它们含有多种生物活性物质，包括蛋白质、脂质、核酸和代谢物。它们的组成反映了它们所来源的细胞的类型和状况，并且它们存在于各种体液中，包括细胞培养物、血液、尿液、唾液、眼泪、精液、母乳、腹水和脑脊液。源自多种细胞的细胞外囊泡可以与靶细胞相互作用以执行多种生理和病理功能。例如，干细胞源性细胞外囊泡可以诱导组织再生，而癌细胞源性细胞外囊泡可以影响癌症生长、转移和血管生成。细菌源性细胞外囊泡可以具有抗生素耐药性、消除竞争细菌、递送毒力因子和调节免疫应答等功能。
另一方面，来自多种细胞和液体的细胞外囊泡中常见有许多蛋白质，这表明蛋白质并不是以混乱的方式进入细胞外囊泡，而是通过受调控的机制进入。
根据来源的细胞器分析细胞外囊泡的蛋白质组时，蛋白质主要来源于质膜或细胞溶胶，来自线粒体或细胞核的蛋白质相对较少。细胞外囊泡中常见的蛋白质参与细胞外囊泡的结构、产生和运输，包括四跨膜蛋白(CD9、CD63、CD81等)、整合素、内体分选复合蛋白(TSG101、Alix)、细胞骨架蛋白(肌动蛋白、微管蛋白)和热休克蛋白(HSP70、HSP90)。哺乳动物细胞源性细胞外囊泡共有的蛋白质可用作标记蛋白来分离细胞外囊泡。另一方面，细胞外囊泡上还存在细胞类型特异性蛋白质，它们与执行细胞类型特异性的生理和病理功能有关。
由于细胞外囊泡由多种生物活性物质组成，因此可以执行多种生物学功能。细胞外囊泡与靶细胞相互作用的机制包括配体-受体相互作用、融合和内吞作用。源自各种细胞的细胞外囊泡与靶细胞相互作用，发挥正常情况下的生理功能或引起疾病的病理功能。因此，它们可用于各种疾病的诊断和治疗。
哺乳动物细胞源性细胞外囊泡执行的各种生理功能包括止血、组织再生、干细胞维持、炎症/免疫应答的调节和胚胎发育。血管中存在源自单核细胞、内皮细胞、血小板等多种细胞的细胞外囊泡，含有磷脂酰丝氨酸的细胞外囊泡可促进血液凝固。此外，源自干细胞的细胞外囊泡可以介导肾脏、肝脏和皮肤等损伤模型中的组织再生和炎症反应的调节。另一方面，源自免疫细胞的细胞外囊泡可以通过递送炎性细胞因子如IL-1β或直接或间接呈递抗原来促进免疫应答。它们还可以通过递送抑制性细胞因子(例如TGF-β)或抑制T细胞活化来抑制免疫应答。具有膜结合形态发生素(例如Wnt)的细胞外囊泡可以与相应的受体结合，促进参与胚胎发育的信号传导途径。
另一方面，哺乳动物细胞来源的细胞外囊泡具有导致多种疾病的病理功能。特别是在肿瘤微环境中，癌细胞源性细胞外囊泡具有多种功能。它们通过鞘磷脂作用于内皮细胞，促进分裂、迁移和管形成，从而促进血管生成，并且它们还可以使单核细胞分化为骨髓源性抑制细胞。它还作用于其他免疫细胞，通过促进细胞毒性T细胞的死亡或促进调节性T细胞的分化来抑制抗癌免疫。这表明癌细胞源性细胞外囊泡在肿瘤微环境中发挥作用，促进癌症进展。
核酸药物是使用核酸的药物，所述核酸主要作为负责体内遗传信息的物质起作用，例如抑制基因表达的siRNA和特异性结合靶分子的适体。
核酸药物是基于核酸(DNA或RNA)的药物，所述核酸是基因的组成部分并且包括反义寡核苷酸、siRNA、适体和CpG寡聚物。由于核酸药物通过作用于引起疾病的基因和蛋白质来发挥作用，因此预计它们是有效的且副作用较少，因为它们可以作用于现有药物难以靶向的细胞内分子。
特别是，基于RNA的疗法，例如小干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、反义寡核苷酸(ASO)、适体、合成mRNA和CRISPR Cas9，具有靶向目前不受药物调控的许多基因和基因产物的显著潜力，并为从癌症到大流行性流感、阿尔茨海默氏症和自身免疫性疾病等疾病创造新的治疗范例。但在这些RNA充分发挥其潜力之前，它们必须克服长期建立的、进化完善的阻止细胞外部的RNA渗透到细胞内部的防御机制。突破脂质双层并将RNA递送到细胞中是RNA疗法广泛发展的主要挑战，也是长期存在的药物递送问题。
当原始RNA和聚合物溶液被脂质双层封装时，生命就出现了，从而允许进行独立的化学反应而不受外部RNA和大分子的干扰。脂质双层允许<1,000道尔顿(Da)的中性微疏水性分子的被动扩散，同时限制大分子如RNA的运动。
因此，脂质双层对于创造生命和防御RNA入侵至关重要。在这个古老的屏障之上是一系列进化防御，旨在进一步保护后生动物细胞免受RNA的入侵，包括RNA酶和先天免疫模式识别Toll样受体(TLR)3、7、8和双螺旋RNA受体PKR。此外，RNA可以通过肾细胞和肝细胞上的捕获受体迅速从血液中去除。在这些障碍中，跨脂质双层的递送仍然是一个挑战。小分子抑制剂具有小分子量、低电荷和足够的疏水性，以顺利地滑过细胞膜的脂质双层。相比之下，所有基于RNA的治疗剂都不具有穿过脂质双层的能力，并且是大的、高电荷的大分子(图13)。
然而，2017年《自然》上的一篇论文发现，与传统的药物递送载体脂质体相比，外泌体显著提高了抑制KRAS(一种参与胰腺癌发展的基因)表达的基因疗法的治疗效果，为进一步研究和开发使用外泌体的疗法铺平了道路。
细胞外囊泡被定义为存在于细胞内的生物膜封闭结构，其大小和产量差异很大。术语“外泌体”是指释放到细胞中且尺寸范围为直径30至200nm的细胞内体。
外泌体的产生过程与内体密切相关，所述内体是细胞中负责吸收和分泌物质的部分。晚期内体含有称为多囊泡体的小囊泡，当所述多囊泡体与细胞膜融合时，释放其内部囊泡并成为外泌体。
外泌体具有不同的特性，具体取决于其大小、其表面的生物标志物蛋白、功能和来源组织。换句话说，外泌体是发现于细胞外的生物膜封闭结构的总称，其大小和特性的差异很大。
外泌体的组分可分为生物膜和生物膜内的组分。将外泌体与外界分开的生物膜含有各种膜蛋白、脂质和糖链，就像细胞内部生物膜的成分一样。外泌体的生物膜上存在的蛋白质中有几种是外泌体特异性的，被认为是外泌体的生物标志物，例如CD63、CD9和CD81。外泌体内部的组分包括多种细胞源性蛋白质、RNA(miRNA、mRNA等)以及各种代谢物。
最终，外泌体到达其他细胞并交换物质以在细胞之间传递信号。它们通过向其他细胞传递信号并影响它们来发挥生理和病理作用。
除了构成生物膜的脂质之外，外泌体还具有各种蛋白质组分，并且自然地用作细胞之间交换物质的手段，从而实现更有效的传质。预计它们的免疫原性和毒性也较低。
已知几乎所有哺乳动物细胞都会释放外泌体。外泌体的大小范围为30至200nm，由磷脂双层组成，外部为膜蛋白，内部包含蛋白质、mRNA、miRNA和非编码RNA，这意味着其结构允许稳定存储遗传信息。
外泌体是尺寸从30到200nm不等的生物纳米粒子，其由大多数细胞释放并包含释放它们的细胞的蛋白质和遗传信息。外泌体已被证明是向邻近或远处细胞传递信息的介质，并调节细胞周围的微环境。
现有的药物递送系统主要由人工合成材料组成，由于生物异质性，受体细胞对它们的摄取和它们穿越血脑屏障(BBB)受到限制。另一方面，外泌体是由人体自身细胞产生的，具有优异的生物相容性和低细胞毒性，因此不会引起免疫排斥或其他并发症。
外泌体具有药物易于内化的优势。此外，外泌体可以通过与细胞膜融合来携带信息。这样，递送到细胞的遗传信息和药物就可以被细胞的消化系统降解。
发明内容
技术问题
本发明寻求提供一种将针对半乳糖凝集素-3(一种癌症促进基因)的反义寡核苷酸开发成细胞源性天然或人工纳米囊泡以用作抗癌药物的方法。
技术方案
本发明的第一方面提供了药物组合物，其包含负载有基于反义寡核苷酸(ASO)的药物的细胞源性天然或人工纳米囊泡。
本发明的第二方面提供了药物组合物，其包含负载有靶向半乳糖凝集素-3的核酸药物的细胞源性天然或人工纳米囊泡。
本发明的第三方面提供了用于口腔或鼻吸入或静脉内施用的药物组合物，其包含负载有基于核酸的药物的细胞源性天然或人工纳米囊泡。
本发明的第四方面提供了用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包含负载有基于核酸的药物的脐带血干细胞源性天然或人工纳米囊泡。
本发明的第五方面提供了靶向半乳糖凝集素-3的反义寡核苷酸(ASO)，其是使用半乳糖凝集素-3编码序列(CDS)内的序列设计的。
以下，对本发明进行说明。
关于外泌体治疗学，有几种开发与亲本细胞非常相似的外泌体作为治疗剂的方法，以及在药物递送系统(DDS)中利用外泌体的方法。另一方面，干细胞的组织再生能力归功于外泌体。干细胞源性外泌体作为治疗剂比干细胞具有许多优势。首先，它们不是活细胞，这使得它们更容易储存和运输。它们也不太可能引起肿瘤和感染，因为它们不分裂。如果它们的功效相似，那么它们更容易开发成治疗剂。
半乳糖凝集素是20世纪70年代从动物中分离出来的，属于凝集素家族。迄今为止，总共已鉴定出15种亚型，它们通过诱导细胞间或细胞-基质相互作用参与细胞内的各种信号传导过程。半乳糖凝集素的表达影响细胞死亡、胚胎发生、炎症反应和癌症发展。其中，半乳糖凝集素-3在NSCLC组织中高度表达，已知半乳糖凝集素-3促进癌组织中癌细胞的生长并通过抑制免疫应答来促进癌症转移(图17)。
基因治疗通常涉及将DNA片段、miRNA、siRNA和lncRNA引入靶细胞，以逆转异常基因表达、诱导自杀基因表达、调节免疫应答并抑制血管生成。
如图12所示，反义核苷酸具有可靶向性的优势，因为它们附着在特定基因的序列上并充当诱导该基因功能丧失的机制。然而，如图13所示，由于它们的单链结构，它们不仅在单独治疗时不稳定，限制了它们作为通用药物的用途，而且无法使用当前的ASO递送方法在大多数组织和细胞类型中进行细胞内递送。
为了解决上述问题，本发明已证实，通过将这些反义核苷酸负载到作为天然纳米囊泡的外泌体中，或负载到通过挤压和压碎细胞制成的人工纳米囊泡中，增加了药物的稳定性，正常实现了抑制癌细胞增殖和迁移的效果。例如，本发明开发了一种利用反义寡核苷酸(ASO)的基因靶向药物，并证实了其在抑制作为与非小细胞肺癌的增殖和转移有关的基因，半乳糖凝集素-3的表达方面的有效性。换句话说，证实了半乳糖凝集素-3ASO作为抑制癌细胞增殖和转移的药物的功能，并且证实了将半乳糖凝集素-3ASO负载到纳米囊泡(包括外泌体和人工纳米囊泡)中的可能性。此外，我们已经证实，当与常规抗癌药物共同施用时，它可以通过增加癌细胞的敏感性来有效诱导癌细胞死亡。因此，本发明不仅使得能够利用负载到纳米囊泡中的反义寡核苷酸来生产抗癌药物，而且使得它们能够与现有的抗癌药物组合使用。
简而言之，本发明的一个特征是使用细胞源性纳米囊泡代替病毒载体作为核酸递送系统和/或使用具有高生物利用度的各种基于核酸的药物，特别是基于ASO的药物。通过将基于核酸的药物负载到细胞源性天然或人工纳米囊泡上，基于核酸的药物可以分布到细胞内液中。此外，根据本发明使用细胞源性纳米囊泡作为用于将治疗性核酸递送至靶细胞的工具可以提高治疗功效并避免副作用。
在本发明中，细胞源性天然纳米囊泡以及人工纳米囊泡可用作核酸递送系统。
由于可靠性、再现性、供体间差异以及亲代细胞内在特性的反映是细胞源性纳米囊泡制剂中的重要问题，因此当干细胞用作亲代细胞时，优选使用脐带血干细胞源性天然或人工纳米囊泡，并且当干细胞的固有特性(例如促进再生)影响癌细胞的增殖时，优选使用干细胞以外的适合待治疗疾病的细胞。
干细胞外泌体本身具有促进其他细胞增殖和迁移的能力，从而也促进癌细胞的增殖和迁移。然而，令人惊讶的是，我们发现，虽然单独使用脐带血干细胞源性外泌体治疗增加了癌细胞的增殖和迁移，但将脐带血干细胞源性外泌体与抑制癌细胞增殖和迁移的抗癌药物共同施用减少了癌细胞的增殖和迁移(图8和图9)。
据推测，源自脐带血干细胞的外泌体中所含的抗炎物质是源自其他组织的外泌体的量的五倍。这是因为炎症细胞释放的炎症物质与癌细胞的增殖、存活和诱导转移密切相关，而肿瘤微环境中的炎症具有促瘤作用，不仅有助于癌细胞的存活和增殖，而且促进血管生成和转移，破坏适应性免疫应答，并改变它们对激素和药物的反应性。
因此，基于上述发现，根据本发明，脐带血干细胞源性天然或人工纳米囊泡可用于预防或治疗癌症的药物组合物中，并且可用作药物递送系统(DDS)以用于预防或治疗癌症。
如本文所用，细胞源性天然纳米囊泡可互换地称为细胞外囊泡或外泌体(尺寸范围为30至200nm的细胞外囊泡)。
[细胞外囊泡]
细胞外囊泡是被脂质双层包围的纳米级囊泡，所有细胞都会将其释放到外部环境中以在细胞之间交换信息。
由于细胞外囊泡具有膜和腔以及与细胞相同的膜拓扑结构，因此可以对它们进行基因工程改造以表达各种膜蛋白并以相对准确的方式将药物递送至靶细胞或组织。此外，各种药物可以负载到细胞外囊泡的膜和腔中。当药物负载到腔中时，它们可以安全地递送到靶细胞。由于它们与细胞具有相同的膜，因此可以通过膜融合在腔中递送药物。
细胞外囊泡治疗性使用的最大优势之一来自其低免疫原性。由于细胞外囊泡源自细胞，因此免疫原性较低。例如，已知源自间充质干细胞(MSC)的细胞外囊泡具有非常低的免疫原性风险。因此，它们有助于所负载药物具有更长的使用寿命和更高的生物利用度。此外，它们的大小使它们能够穿过血脑屏障，从而被运输到体内的所有组织。
细胞外囊泡含有多种生物活性物质，包括蛋白质、脂质、核酸和代谢物，其组成根据其来源细胞的类型和状况而变化。虽然某些组分是所有细胞外囊泡共有的，但其他组分是细胞类型特异性的。
与来源的细胞相比，哺乳动物细胞源性细胞外囊泡含有更高水平的磷脂酰丝氨酸、胆固醇、鞘磷脂和GM3神经节苷脂。细胞外囊泡中存在的脂质有助于其形成、稳定性和发挥功能。磷脂酰丝氨酸参与细胞外囊泡的形成，而胆固醇、鞘磷脂和GM3神经节苷脂共同增加细胞外囊泡的稳定性。此外，癌细胞源性细胞外囊泡已显示可以通过鞘磷脂促进血管生成。
除了mRNA和miRNA之外，还已知rRNA、tRNA和DNA存在于细胞外囊泡中。虽然一些RNA的存在量与其来源的细胞相似，但某些RNA在细胞外囊泡中的含量比其来源的细胞中的含量更高，这表明RNA与蛋白质一样，受到导致与其在细胞外囊泡中组织化的相同机制的调节。
由于细胞外囊泡具有生理功能，并且可以被靶向，用于递送至特定细胞或组织，因此它们可用作疾病治疗、药物递送和疫苗。
由于细胞外囊泡不是活细胞，因此可以长期储存和运输。而且由于它们不分裂，哺乳动物源性细胞外囊泡不太可能致瘤。
由于膜蛋白如四跨膜蛋白、纤连蛋白和蛋白聚糖，细胞外囊泡的摄取效率很高，但也可以根据靶细胞进行定制。
富含血管细胞粘附分子1和整合素α4的细胞外囊泡增强了纳米囊泡的对接和内皮细胞的摄取。
由于细胞外囊泡体积小，因此细胞外囊泡可以通过转胞吞作用(胞吞作用，然后在另一侧形成多囊泡体并释放)或通过内皮细胞之间的连接以双向方式穿过血脑屏障。
细胞外囊泡在细胞间通讯中的固有和独特特性使其可用作核酸递送系统。细胞外囊泡介导的运输似乎非常有效，允许将更高剂量的治疗剂释放到肿瘤中，从而减少血液中的量并减少副作用。除了递送治疗剂之外，细胞外囊泡还具有功能用途。它们可以通过激活细胞表面上的受体、将其内容物递送到细胞质内、递送内部亲水性分子、脂质双层中的亲脂性分子以及表面上的两亲性分子，经多种方式发出信号。
[制备细胞源性天然或人工纳米囊泡(外泌体+人工纳米囊泡)]
天然或人工纳米囊泡可以分别从细胞中释放或制备。
纳米囊泡是对直径为纳米级的袋状物质的描述。典型的纳米囊泡是外泌体，它作为可以替代细胞治疗剂的生物相容性药物递送系统而受到关注。
自然释放的外泌体的量有限，且生产率低。方法包括开发分离和纯化技术以增加外泌体的产量，或使用不同的培养条件来增加从细胞中释放的速率。
人工纳米囊泡是由细胞人工制造的外泌体，比自然分泌的外泌体生产率高得多。
分离外泌体的方法包括超速离心、超滤和层析，外泌体的功能特性、纯度、浓度和大小根据分离方法而变化。
成体干细胞释放的外泌体已被证明对周围细胞具有优异的再生和抗炎作用。
基于纳米囊泡的制剂的大规模生产对于临床转化的成功至关重要。然而，由于自然释放的细胞外囊泡的量是有限的，因此已经尝试使用人工纳米囊泡作为细胞外囊泡模拟物的治疗。人工纳米囊泡是通过将细胞本身压碎成外泌体而制成的，这解决了外泌体最大的缺点，即大规模生产的问题，并且具有在纳米囊泡形成过程中高效负载药物的优势。
用于生产人工纳米囊泡的方法包括利用多孔膜的连续挤出或重复挤出。另外，本发明可以通过利用高压均化器或纳米分散器来生产人工纳米囊泡。
通常，小细胞的直径约为20μm，在体内的活动性有限。然而，外泌体由于其固有的小尺寸而具有能够穿过血脑屏障的优势，从而使它们能够将活性成分递送到身体的各个部位。因此，利用细胞本身并将其粉碎成外泌体的大小，具有到达身体各个部位、同时含有高含量细胞内活性成分的优势。
此外，细胞作为生物体的基本结构和活性单位，可以在体外培养并用于制药、组织工程和治疗药物开发。细胞具有适应周围环境的能力，因此即使在同一细胞种类内，细胞的粘附、生长、迁移和分化也会因培养环境而异。此外，最近在再生医学领域受到广泛关注的干细胞可以通过在培养物中施加适当的刺激来诱导分化成所需的细胞并生长。此外，人工纳米囊泡含有人工纳米囊泡从其衍生的细胞的各种分子成分(例如，蛋白质和RNA)。因此，人工纳米囊泡的蛋白质组成可以根据人工纳米囊泡所从其衍生的细胞的培养条件(例如，培养期间细胞接收的分子信号)而变化。
例如，根据本发明的由干细胞产生的人工纳米囊泡可以大量提供具有独特脂质双层结构的纳米级人工纳米囊泡，并且由于人工纳米囊泡中含有大量的各种生长因子，因此，可以通过成纤维细胞的增殖和活化来发挥组织再生和抗衰老作用、增加胶原蛋白合成以及伤口愈合作用。
[药物负载方法]
主要有3种方法将药物负载到纳米囊泡中。
第一种是利用超速离心机，通过离心力诱导溶剂中的药物流入囊泡中。
第二种是电穿孔，它是一种在短时间内膜外侧的电荷变负、膜内侧的电荷变正，在膜上产生孔，药物通过该孔进入囊泡的方法。
第三种方法利用这样的方法：当细胞被压碎并重新形成球体时，悬浮在悬浮液中的药物自然地掺入囊泡球体中。
人工纳米囊泡的收率远高于自然释放的细胞外囊泡，且药物递送效率相似。
[单链反义寡核苷酸(ASO)的修饰]
在本发明中，基于反义寡核苷酸(ASO)的药物包括其中至少一个序列的一些或全部碱基被硫代磷酸酯和/或2'-O-甲基基团修饰的基于ASO的药物。
如图12所示，ASO的工作原理是用ASO的DNA序列靶向特定基因的mRNA序列，诱导该位点降解，从而使翻译过程无法进行，导致功能丧失。自1978年发现以来，已有四种基于ASO的药物获得了美国FDA的批准。然而，8至50个碱基对的核苷酸结构在体内不太稳定，这作为药物在功效和利用方面是不利的。
单链ASO领域始于1978年，当时合成了具有磷酸二酯主链的ASO。不幸的是，磷酸二酯键高度带电、具有高亲水性并且容易被核酸酶裂解。对单核苷酸(硫代磷酸酯)进行修饰，其中一个磷酸基团的氧被硫原子取代，可以大大增加对磷酸二酯酶的抗性并增加疏水性。1984年，第一个完全硫代磷酸酯ASO被合成，极大地提高了其稳定性和递送能力。
为了提高ASO的功效和药理学特性，可以对2'羟基(OH)进行化学修饰。这可以增加与目标mRNA的结合亲和力，从而减少ASO的总长度。
两种替代的反义化合物方法是用中性磷酸二酰胺吗啉寡聚物(PMO)或肽核酸(PNA)主链取代带电磷酸键和核糖糖苷主链，以维持正确的核碱基间距。其结果是形成选择性且牢固地与目标mRNA结合的高度稳定分子。然而，由于PMO和PNA缺乏磷酸二酯主链，因此它们无法激活RNA酶H(基因沉默所需的)，而是可以替代地用作空间阻滞剂和用于外显子跳跃的SSO。
[基于核酸的药物]
除了上述ASO之外，负载到本发明的细胞源性天然或人工纳米囊泡中的基于核酸的药物可以是mRNA、miRNA、rRNA、tRNA和DNA。
与ASO和miRNA相比，外泌体中很难包裹大的mRNA。然而，在人工纳米囊泡的情况下，囊泡的大小可以很容易地控制，因此将mRNA负载到囊泡中相对容易。
如本文所用，基于核酸的药物包括天然或人工合成的核酸以及修饰的核酸。
通过本发明的细胞源性天然或人工纳米囊泡递送的mRNA可以增加靶细胞中那些mRNA编码的蛋白质的表达，或者，如如果递送miRNA，可能会降低靶细胞中那些miRNA所靶向的mRNA的表达。
由于其对靶RNA或DNA的高度选择性，基于RNA的治疗剂可以选择性抑制人类和病毒耐药基因的表达，调控mRNA的剪接，靶向参与表观遗传调控的非编码RNA(ncRNA)，增加靶基因的数量，表达基因和修饰基因组。这些是无法通过小分子抑制剂或抗体实现的治疗作用模式。基于RNA的治疗剂也是唯一能够演化为跟上癌症突变和传染病病毒感染步伐的治疗剂。第二代RNA化学技术极大地提高了RNA治疗剂的稳定性，减少了意想不到的副作用，并最大限度地提高了靶点的药理活性。
[负载药物的类型(基于核酸的药物和常规抗癌药物)]
除了上述基于核酸的药物之外，可以负载到纳米囊泡中的药物的类型不受限制。除了顺铂和5-FU等常规化疗药物外，靶向半乳糖凝集素-3等其他癌症相关基因的ASO也是可能的。还可以利用已经离体进行了广泛测试的靶向特定基因的siRNA。此外，还可以负载调节基因表达的miRNA家族。
例如，外泌体可以人工负载有短干扰RNA(siRNA)或miRNA以抑制特定基因的表达，然后用作药物递送载体。例如，可以通过电穿孔将靶向癌症基因KRAS(G12D)的siRNA引入间充质干细胞源性外泌体中。
为了将外泌体特异性地递送至特定细胞或将特定的mRNA放入外泌体中，可以基于基因工程改造的细胞来创建外泌体。例如，为了将外泌体特异性地递送至乳腺癌细胞，可以将与整合素αV(乳腺癌细胞的标志物)结合的肽融合的蛋白质放入外泌体中；将能够杀死癌细胞的药物(例如阿霉素)递送到外泌体中；或者为了将mRNA包装到外泌体中，可以将RNA结合部分与外泌体标志物蛋白CD63融合，以通过外泌体递送特定的mRNA。
[纳米囊泡的细胞来源和脐带血干细胞]
本发明的天然或人工纳米囊泡的细胞来源范围从树突细胞、网织红细胞、红细胞、单核细胞和巨噬细胞到包括间充质干细胞(MSC)和人类iPSC在内的能够通过遗传操作的永久谱系的细胞系(例如HEK293细胞)。MSC是生产本发明的用于临床试验的天然或人工纳米囊泡的主要来源。MSC源性细胞外囊泡可以轻松扩展并且对患者安全。
干细胞的种类包括胚胎干细胞、成体干细胞和逆分化干细胞，其中成体干细胞来源于血液、骨髓、脂肪等，与胚胎干细胞不同，不存在伦理问题。
成体干细胞是未分化的细胞，其在需要时会分化成特定组织的细胞。成体干细胞可以是但不限于间充质干细胞、间充质基质细胞或多能干细胞。
间充质干细胞通过释放各种生长因子和细胞因子(例如上皮生长因子和成纤维细胞生长因子)来刺激成纤维细胞产生胶原蛋白、纤连蛋白和弹性蛋白，从而在再生中发挥重要作用。
间充质干细胞(MSC)是能够分化为神经元、脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞、肌肉细胞、心脏组织和其他内皮或上皮细胞的祖细胞。这些细胞可以通过基因或蛋白质表达来进行表型定义。因此，MSC可以根据其分化潜力进行表型和/或功能表征。MSC可以从多种来源收集，包括但不限于骨髓、血液、骨膜、真皮、脐带血和/或基质(例如华顿氏胶)和胎盘。根据MSC对细胞培养皿的贴附情况，可以从多个来源分离MSC，例如骨髓单核细胞、脐带血、脂肪组织和胎盘组织。
与源自人胚胎的胚胎干细胞不同，成体干细胞源自已经生长的身体组织，例如骨髓或脑细胞，因此具有避免伦理争议的优势。如本文所用，成体干细胞可以源自但不限于脐带、脐带血、骨髓、脂肪、肌肉、神经、皮肤、羊膜或胎盘。
由间充质干细胞或树突细胞产生的外泌体具有其自身的生理活性，并且正在被探索用于治疗目的。
特别地，间充质干细胞修复或再生受损组织的活性被认为是由于由间充质干细胞的外泌体而不是间充质干细胞本身递送的生长因子。已有报道称，源自MSC的外泌体可有效治疗移植物抗宿主病，移植物抗宿主病是造血干细胞移植的副作用。
骨髓或脂肪来源的干细胞是使用侵入性方法从供体中提取的，而脐带血干细胞是从分娩后废弃的脐带血中提取的，其优势是对供体不具有侵入性，并且供体之间的脐带血干细胞效价差异较小。
如果干细胞用于产生本发明的天然或人工纳米囊泡，则它们可以从脐带血干细胞释放或制备。与脂肪或骨髓来源的成体干细胞不同，脐带血干细胞的优势是，由于脐带血是在供体的妊娠周期(40周)内形成的，因此它们的功效不会因供体的状况而存在差异。
脐带血间充质干细胞(UCB-MSC)含有多种生长因子，包括EGF、VEGF、TGF、HGF、FGF、IGF和PDGF。因此，由脐带血间充质干细胞产生的人工纳米囊泡中负载的生长因子如EGF可促进成纤维细胞增殖、细胞迁移和胶原蛋白合成。
在可以获得成体干细胞的组织(脂肪、骨髓、脐带血)中，从脐带血中分离的外泌体含有最多的再生和抗炎因子。源自脐带血干细胞的外泌体含有的抗炎物质是来自其他组织的外泌体的五倍。
[负载有基于核酸的药物的纳米囊泡的配制]
根据本发明产生的纳米囊泡可以根据预期用途以多种方式配制。根据本发明的负载有基于核酸的药物的细胞源性天然或人工纳米囊泡的制剂可以被浓缩、胶凝化、冻干并在水溶液中重构，而不显著改变其性质。
药物纳米制剂在将治疗药物有效递送至疾病部位方面具有令人难以置信的前景。不幸的是，人工纳米载体(主要是脂质体和聚合物纳米颗粒)由于不利的药代动力学和通过网状内皮系统(RES)从血液循环中被快速清除而显示出有限的应用。此外，它们中的许多都具有高细胞毒性、低生物降解性以及无法穿过包括血脑屏障在内的生物屏障。
本发明中用作药物递送系统的细胞源性天然或人工纳米囊泡具有高生物利用度、优异的生物相容性和低免疫原性。
在本发明中用作药物递送系统的细胞源性天然或人工纳米囊泡能够将其上负载的基于核酸的药物递送至靶组织、细胞和器官。与人工纳米载体类似，本发明的细胞源性天然或人工纳米囊泡可以改善基于游离核酸的药物的基本性质，例如稳定性和溶解度，并保护基于核酸的药物免于在血流中降解。它们还可以提供针对细胞外核酸酶的保护。
本发明的细胞源性天然或人工纳米囊泡的膜是相对刚性的脂质双层，其可以提供掺入的基于核酸的药物的持续且延长的释放。此外，与大多数合成纳米载体不同，本发明的细胞源性天然或人工纳米囊泡可以穿过生物屏障，包括血脑屏障(BBB)，使得它们特别可用于治疗神经退行性疾病。
此外，本发明的细胞源性天然或人工纳米囊泡具有低免疫原性和低细胞毒性。因此，本发明的细胞源性天然或人工纳米囊泡还优选由分离的自体细胞制备。
本发明的细胞源性天然或人工纳米囊泡可被设计为表现出组织特异性，以使得能够迁移至特定的细胞类型或发炎组织。本发明的天然或人工纳米囊泡可以具有反映其来源(即亲本细胞)的内在生物活性，这可以为掺入的基于核酸的药物提供额外的治疗功效。
从不同类型的细胞释放/制备的天然或人工纳米囊泡的生物活性是巨大且有前景的。然而，由于制剂的可靠性、再现性和供体间变化很重要，所以期望根据待治疗的疾病的特征来制备本发明的细胞源性天然或人工纳米囊泡。
[肺泡结构和施用途径]
如图15所示，呼吸系统的主要功能是通过将含氧血液泵送到全身来递送氧气。呼吸通过口、鼻、气管、肺和膈肌进行。首先，氧气通过鼻子和口腔进入呼吸系统，然后通过喉和气管进入胸腔。在胸腔内，气管分为两个较小的管道，称为支气管。每个支气管进一步分开，形成树状分支。直接进入肺部的支气管进一步分成许多细支气管，细支气管的末端连接到称为肺泡的微小囊。
成年男性约有600万个肺泡，其是被毛细血管包围的气囊。肺泡的总横截面积为70至90m2，约为人体皮肤总面积的50倍。
图16显示肺泡的结构。肺的表面活性物质是II型肺泡细胞分泌的磷脂和蛋白质的组合，其通过削弱水分子之间的氢键来降低表面张力，因此表面张力通常不会导致肺泡塌陷。
另一方面，上皮组织的功能是排列器官的内部和表面。上皮组织是单层或多层层状细胞的致密排布，上皮组织排列在器官或中空器官或体腔的内部。上皮组织总是具有暴露于体外或体腔内部的顶面和通过基底膜(一种非细胞物质)与其他组织连接的基底面。
上皮组织提供了一层覆盖物，所述覆盖物将一种组织与另一种组织分开，并将身体与外部环境分开。上皮组织的结构与其功能密切相关。
例如，心脏和血管的内壁、肺的肺泡和肾的肾小球是单层鳞状上皮，所述单层鳞状上皮具有单层排布的扁平细胞，扁平细胞执行过滤和扩散功能，而肺的肺泡上皮非常薄，以便于气体交换(图16)。
因此，如图16所示，根据本发明的负载有基于核酸的药物的细胞源性天然或人工纳米囊泡可以通过口/鼻吸入，通过气管(气道)直接递送至肺泡，也可以在静脉内施用后通过毛细血管递送至肺泡。
[抑制靶细胞增殖和/或迁移的能力]
癌症是体内正常细胞发生突变时形成的一类异常细胞(癌细胞)。癌细胞不受人体内正常调节机制的控制，无序增殖，转移到其他器官(正常组织)并重复增殖，最终损害这些器官(组织)的功能。
根据本发明，负载有基于核酸的药物的细胞源性天然或人工纳米囊泡可以降低靶细胞、特别是癌细胞的增殖和/或迁移能力，并且可通过口腔或鼻腔途径施用、吸入或静脉内注射途径用于强力预防或治疗肺癌、特别是非小细胞肺癌。
[通过口腔或鼻道吸入]
当空气或其他气体进入肺部时，就会发生吸入或吸气。
通过口腔或鼻腔吸入，药物通过气道粘膜和肺上皮的大表面积快速吸收，起效迅速，几乎与静脉内注射相同。由于根据本发明的负载有基于核酸的药物的细胞源性天然或人工纳米囊泡被局部且直接地转运至作用位点，因此该途径使全身副作用最小化。此外，吸入施用途径允许快速吸收并立即起效，从而允许进行剂量滴定和针对肺部的局部效应。因此，与口服或肠胃外剂量相比，可以使用较低的剂量。
因此，根据本发明的负载有基于核酸的药物的细胞源性天然或人工纳米囊泡可以配制为气态或分散在气雾剂中。
当通过口腔吸入施用时，它们应分散成比通过鼻腔途径施用时更小的液滴，以便它们可以通过气管(气道)递送到肺部。递送到肺部的深度取决于液滴的大小。液滴越小，递送的深度越深，吸收的量也越大。在这种情况下，根据本发明的负载有基于核酸的药物的细胞源性天然或人工纳米囊泡可以从肺内部进入血流。
以这种方式施用的药物相对较少，因为必须仔细监测吸入以确保在指定的时间范围内施用适当的量。此外，可能需要专门的设备来通过吸入途径施用药物。为了递送专门作用于肺部的剂量，可以使用雾化的计量容器(称为吸入器)，或者可以使用气体施用方法。
另一方面，与吸入途径类似，当通过喷雾施用时，它必须以小颗粒形式递送才能到达肺部。喷雾可以使用专门的设备来完成，最常见的是超声波或喷射喷雾器系统。正确使用该设备有助于使递送到肺部的药物量最大化。
[静脉内注射施用]
先前的研究已经证实，通过静脉内注射注入体内的细胞外囊泡沿着血流在体内循环，到达并驻留在肝脏和肺部(图18)。因此，可以通过利用自然作用于肺部的机制来诱导将细胞外囊泡内的物质递送至肺组织的效果，而无需对囊泡的外部进行任何特定操作，并且无需赋予对特定组织的靶向功能。因此，根据本发明的包含负载有基于核酸的药物的细胞源性天然或人工纳米囊泡的肺癌治疗剂可以利用外泌体来解决药物全身作用的限制，从而导致治疗效果降低和严重的副作用。
[药物组合物]
药物组合物还可包含药学上可接受浓度的盐、缓冲剂、防腐剂、相容性载体和/或另一种(即，次要)治疗剂。
药物组合物的每种组分应当是药学上可接受的形式。
药学上可接受的载体是参与携带或运输预防或治疗活性剂的药学上可接受的物质、组合物或载体，例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或封装材料。每种载体必须是“可接受的”，因为它与制剂的其他成分相容并且对受试者无害。可用作药学上可接受的载体的物质的一些实例是糖类，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；二醇类，例如丙二醇；多元醇类，例如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；酯类，例如油酸乙酯、月桂酸乙酯；缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；注射用蒸馏水；等渗盐水；林格氏(Ringer's)溶液；乙醇；磷酸盐缓冲溶液；以及药物制剂中使用的其他无毒相容性材料。
在本公开中，药物组合物可以配制用于治疗肺部疾病。因此，药物组合物还可包含可用于治疗肺病的其他治疗剂(次要药剂)。如本文所用，治疗剂是指可用于预防、治疗和/或控制肺部疾病例如本文所讨论的那些疾病的任何药剂。这些包括但不限于表面活性物质、吸入一氧化氮、阿米脱林双甲酰酯、免疫调节剂和抗氧化剂。免疫调节剂的实例包括类固醇和皮质类固醇，例如但不限于甲基泼尼松龙。抗氧化剂的实例包括但不限于超氧化物歧化酶。
对于肺部疾病的治疗，第二药剂可以是肺表面活性物质。“肺表面活性物质”是脂蛋白混合物，其可用于保持肺气道开放(例如，通过防止肺泡壁彼此粘附)。肺表面活性物质可以包括磷脂，例如二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰甘油(PG)；胆固醇；和蛋白质，如SP-A、B、C和D。肺表面活性物质可以源自天然存在的来源，例如牛或猪的肺组织。实例包括AlveofactTM(来自牛肺灌洗液)、CurosurfTM(来自切碎的猪肺)、InfasurfTM(来自小牛肺灌洗液)和SurvantaTM(来自切碎的牛肺；额外成分包括DPPC、棕榈酸和三棕榈酸甘油酯)。肺表面活性物质也可以是合成的。实例包括ExosurfTM(由DPPC与十六烷醇和thyroxapol的组合组成)、PumactantTM或人工肺扩张化合物(ALEC)(由DPPC和PG组成)、KL-4(DPPC、棕榈酰油酰磷脂酰甘油、棕榈酸和模拟SP-B的合成肽)和VenticuteTM(由DPPC、PG、棕榈酸和重组SP-C组成)。肺表面活性物质可以从商业供应商处获得。
“有效量”是实现期望结局的药剂的量。绝对量将取决于多种因素，包括选择用于施用的材料、施用是单剂量还是多剂量、以及包括年龄、身体状况、体型大小、体重和疾病阶段在内的个体患者参数。这些因素是本领域普通技术人员众所周知的并且可以通过简单的常规实验来解决。
在一种实施方式中，有效量是药剂不会在受试者中引起毒性的剂量。在一种实施方式中，有效量是药剂减少对受试者的毒性的剂量。用于测量毒性的方法是相关领域众所周知的(例如，肝、脾和/或肾的活组织检查/组织学；针对肝毒性的丙氨酸转移酶、碱性磷酸酶和胆红素测试；以及针对肾毒性的肌酸酐水平)。
有效剂量水平可以基于包括个体的类型和严重程度、年龄、性别、疾病类型、药物活性、对药物的敏感性、施用时间、施用途径和消除率、治疗持续时间、伴随药物的因素以及医学领域众所周知的其他因素而确定。此外，如本领域技术人员所认识到的，有效量可以根据治疗途径、赋形剂的使用以及与其他药剂一起使用的可能性而变化。
“治疗”或“治愈”包括但不限于预防、减少或阻止疾病的发生，减少或消除疾病的症状，或预防疾病。
受试者可以是人或脊椎动物或哺乳动物，包括但不限于啮齿动物(例如大鼠或小鼠)、狗、猫、马、牛、猪、绵羊、山羊、火鸡、鸡和灵长类动物(例如猴子)。本公开的方法可用于治疗需要治疗的受试者。需要治疗的受试者可以是处于发生疾病的风险中的受试者(例如，通过基因测试)或患有疾病的受试者。
在一种实施方式中，将包含负载有基于核酸的药物的细胞源性天然或人工纳米囊泡的组合物以丸剂剂量施用于受试者。“丸剂剂量(bolus dose)”是指单次施用离散量的药剂、药物或其他化合物以达到治疗有效水平。在一种实施方式中，考虑到重复施用所述负载有基于核酸的药物的纳米囊泡，包括二、三、四、五或更多个剂量的所述负载有基于核酸的药物的纳米囊泡。在一些情况下，可以连续施用负载有基于核酸的药物的纳米囊泡。重复或连续施用可以在数小时(例如，1-2、1-3、1-6、1-12、1-18或1-24小时)、数天(例如，1-2、1-3、1-4、1-5、1-6或1-7天)或数周(例如1-2周、1-3周或1-4周)内进行，这取决于正在治疗的病症的严重程度。如果给药是重复但不连续的，则剂量之间的时间可以是数小时(例如4小时、6小时或12小时)、数天(例如1天、2天、3天、4天、5天或6天)、或数周(例如，1周、2周、3周或4周)。剂量之间的时间可以相同或不同。
负载有基于核酸的药物的纳米囊泡可以通过导致递送至肺或其他组织的任何途径施用。全身施用途径，例如静脉推注单次注射或连续输注，是合适的。考虑到更直接的途径，例如鼻内施用、支气管内施用(例如，通过插管)和吸入(例如，通过口腔或鼻的气雾剂)，并且这些途径可能更合适，特别是在需要快速作用的情况下。气溶胶是液体作为小颗粒分散在气体中的混悬剂，并且包括含有此类颗粒的细雾或喷雾。气雾化是通过将液体混悬剂转化为小颗粒或液滴而产生气雾剂的过程。这可以使用气雾剂递送系统来完成，例如加压包或喷雾器。喷雾器包括空气喷射(即气动)、超声波和振动网式喷雾器，它们例如使用合适的推进剂，例如但不限于二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体。除了喷雾器之外，用于肺部递送的其他装置包括但不限于计量吸入器(MDI)和干粉吸入器(DPI)。用于吸入器或吹气器的例如明胶的胶囊和药筒可以用冻干的负载有基于核酸的药物的纳米囊泡和合适的粉末基质(例如乳糖或淀粉)配制。
当需要进行全身递送时，负载有基于核酸的药物的纳米囊泡可以配制用于通过注射进行肠胃外施用，包括大量单次注射或连续输注。可注射制剂可以以单位剂型提供，例如，含有或不含防腐剂的安瓿或多剂量容器。该组合物可以采取在油性或水性媒介中的水性混悬剂、溶液或乳液的形式，并且可以含有配制剂，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油，例如芝麻油，或合成脂肪酸酯，例如油酸乙酯或甘油三酯。水性注射混悬剂可以含有增加混悬剂粘度的材料，例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。任选地，混悬剂还可以含有合适的稳定剂或增加溶解度的试剂。可选择地，负载有基于核酸的药物的纳米囊泡可以是用于在使用前与合适的载体(例如注射用无菌蒸馏水)组合的冻干形式或其他粉末或固体形式。
应当理解，向根据本公开治疗的受试者施用的其他药剂可以通过任何合适的途径施用，包括口服施用、鼻内施用、支气管内施用、吸入、静脉内施用等。本领域普通技术人员将了解此类次要激动剂的常规施用途径。
负载有基于核酸的药物的纳米囊泡可立即使用，或者可选择地，可在使用前短期和/或长期储存，例如冷冻保存。通常，冷冻介质中包含蛋白酶抑制剂，因为它们在长期储存期间提供纳米囊泡的完整性。冷冻低于-20℃是不期望的，因为它会增加纳米囊泡活性的损失。更优选在-80℃以下快速冷冻，因为它可以保留活性。为了增强负载有基于核酸的药物的纳米囊泡的生物活性的保存，可以使用冷冻介质的佐剂。这些佐剂与用于冷冻保存完整细胞的佐剂类似，并且可以包括但不限于DMSO、甘油和聚乙二醇。
本发明的药物制剂通常与药学上可接受的肠胃外载体一起配制为用于以单位剂量注射形式肠胃外施用，即推注、静脉内和瘤内注射。将具有所需纯度的负载有基于核酸的药物的细胞源性天然或人工纳米囊泡与药学上可接受的稀释剂、载体、赋形剂或稳定剂随机混合以形成冻干制剂或水溶液。
有益效果
根据本发明，负载有反义寡核苷酸的天然或人工纳米囊泡在与常规化疗剂组合施用时抑制癌细胞的增殖和迁移并增加其药物敏感性。此外，细胞源性天然或人工纳米囊泡可以以相对较低的成本生产，同时利用细胞治疗剂的优势，并且预期通过与传统免疫肿瘤药物不同的机制靶向癌细胞。
附图说明
图1是分析半乳糖凝集素-3ASO处理后肺癌细胞系(A549)中半乳糖凝集素-3基因表达降低的图。
图2是分析半乳糖凝集素-3ASO处理后肺癌细胞系(A549)中半乳糖凝集素-3蛋白质表达降低的图。
图3是显示半乳糖凝集素-3ASO处理后肺癌细胞系中细胞增殖减少的图，以及确认细胞迁移抑制的细胞染色后拍摄的照片。
图4是确认半乳糖凝集素-3ASO与抗癌药物顺铂的共同施用促进癌细胞死亡并增加对抗癌药物的敏感性的染色后死细胞照片。
图5是使用多孔膜分析通过电穿孔和细胞挤出负载到纳米囊泡中的半乳糖凝集素-3ASO以确定负载程度和效率后拍摄的照片。
图6是将半乳糖凝集素-3ASO负载到纳米囊泡中然后纯化未负载ASO以获得纯的负载有ASO的纳米囊泡的方法的结果图。
图7是显示用负载有半乳糖凝集素-3ASO的人工纳米囊泡处理降低肺癌细胞系(A549)中半乳糖凝集素-3基因表达的图。
图8为确认用负载有半乳糖凝集素-3ASO的脐带血干细胞外泌体和人工纳米囊泡处理后肺癌细胞的细胞增殖能力降低的增殖细胞染色后拍摄的照片；以及显示负载有半乳糖凝集素-3ASO的外泌体和人工纳米囊泡处理后肺癌细胞的细胞增殖能力的图。
图9为确认用负载有半乳糖凝集素-3ASO的脐带血干细胞外泌体和人工纳米囊泡处理后肺癌细胞的细胞迁移能力降低的迁移细胞染色后拍摄的照片；以及显示负载有半乳糖凝集素-3ASO的外泌体和人工纳米囊泡处理后肺癌细胞的细胞迁移能力的图。
图10为确认用负载有半乳糖凝集素-3ASO的HEK293细胞外泌体和人工纳米囊泡处理后肺癌细胞的细胞增殖能力降低的增殖细胞染色后拍摄的照片；以及显示负载有半乳糖凝集素-3ASO的外泌体和人工纳米囊泡处理后肺癌细胞的细胞增殖能力的图。
图11为确认用负载有半乳糖凝集素-3ASO的HEK293细胞外泌体和人工纳米囊泡处理后肺癌细胞的细胞迁移能力降低的迁移细胞染色后拍摄的照片；以及显示负载有半乳糖凝集素-3ASO的外泌体和人工纳米囊泡处理后肺癌细胞的细胞迁移能力的图。
图12是ASO结合并降解靶基因的mRNA以诱导基因功能丧失的机制的示意图(科学(Science)，2020年3月27日；第367卷，第6485期)。
图13示出了具有40亿年历史的脂质双层屏障，其阻止RNA进入。
图14是总结纳米囊泡中不同药物递送方法的优点和缺点的图。
图15是说明呼吸系统的结构和功能的示意图。
图16是示出肺泡的结构的示意图。
图17说明了半乳糖凝集素的功能，其在肺癌细胞中高度表达并促进癌细胞增殖和转移(Chang WA，2017，Oncology Letters)。
图18是确定静脉内施用细胞外囊泡后体内积聚部位的结果(Sci Rep.2019Jul11；9(1):10041)。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行更详细的说明。但以下实施例旨在清楚地说明本发明的技术特征，并不限制本发明的保护范围。
实施例1.制备半乳糖凝集素-3ASO
为了构建靶向半乳糖凝集素-3的ASO，随机选择半乳糖凝集素-3编码序列内每个位点包含20个连续碱基的三个ASO序列。为了靶向半乳糖凝集素-3，我们使用SEQ ID No.1至3中的每个序列设计了ASO，然后将硫代磷酸酯和2'-O-甲基基团添加到每个序列的碱基上以增加ASO的细胞内摄取和稳定性。
[表1]
| 编号 | 靶位点 |
| 位点1(SEQ ID NO.1) | cat gat gcg tta tct ggg tc |
| 位点2(SEQ ID NO.2) | ggc cac tga ttg tgc ctt at |
| 位点3(SEQ ID NO.3) | act ggg gaa ggg aag aaa ga |
使用以SEQ ID No.1至3设计的每个半乳糖凝集素-3ASO进行的初步实验，确认了所有三种ASO在降低半乳糖凝集素-3表达方面具有相同的功能。因此，在以下实施例中，以根据SEQ ID No.1设计的ASO进行的实验结果作为代表进行说明。
另外，由于从整个半乳糖凝集素-3编码序列的3个位点中随机选择SEQ ID No.1至3的序列，因此可以通过利用整个半乳糖凝集素-3编码序列的除SEQ ID No 1至3以外的位点序列来生产半乳糖凝集素-3ASO。
实施例2.将半乳糖凝集素-3ASO负载到纳米囊泡中
2-1)通过电穿孔
使用超速离心机(50,000至150,000×g，1～3h)纯化并浓缩从脐带血干细胞的细胞培养物中分离的外泌体。通过纳米颗粒追踪分析对外泌体进行计数，并将1×10^10至4×10^10个外泌体稀释在100μl Invitrogen NeonTMR缓冲液中。向100μl制备的外泌体中添加100至1,000pmol的半乳糖凝集素-3ASO。使用Invitrogen NeonTM电穿孔仪在以下条件下进行电穿孔转染：100μl外泌体、1000-2000V、5-20ms和1-3个脉冲。通过IZON qEV原始尺寸排阻色谱(SEC)纯化去除残留的ASO。
2-2)挤出机
使用TrypLE收集培养物中的脐带血干细胞并用PBS洗涤两次。细胞计数后，通过以1×10^5至10×10^5个细胞/ml重悬于PBS中制备细胞悬液。将半乳糖凝集素-3ASO添加至细胞悬液中以达到100至1,000pmol/ml。使用Avanti迷你挤出机，使用0.1至0.8μm WhatmanTM膜过滤器挤出1ml细胞悬液。通过总共2至10次往复运动来挤出和研磨细胞。使用超速离心机(50,000至150,000×g，1-3小时)对挤出和研磨的样品进行纯化和浓缩。通过IZON qEV原始尺寸排阻色谱(SEC)纯化去除残留的ASO。
为了确认半乳糖凝集素-3ASO掺入外泌体和人工纳米囊泡中，对电穿孔前后和排阻前后残留的ASO进行电泳并检查条带，实验组中条带厚度减少，从而确认ASO被掺入纳米囊泡中(图5)。
负载有半乳糖凝集素-3ASO的外泌体和人工纳米囊泡的分离和纯化确认，在SEC过程中获得3至6个级分之间的样品产生了纯净地纯化的外泌体和人工纳米囊泡，而没有残留ASO(图6)。
实施例3.肺癌细胞系培养
在37℃、5％CO2培养箱中于补充有10％胎牛血清(FBS)、PrimocinTM(100μg/ml)的RPMI1640培养基中培养非小细胞肺癌细胞系。每2至3天更换一次培养基，并在细胞生长至培养皿底部的80％时进行传代。
实施例4.半乳糖凝集素-3ASO处理后肺癌细胞中半乳糖凝集素-3基因表达分析
A549细胞以4,000至8,000个细胞/cm2接种在培养皿中，并在37℃、5％CO2培养箱中孵育24小时。使用Lipofectamine将100至1,000pmol半乳糖凝集素-3ASO转染至细胞中。在37℃、5％CO2培养箱中培养24至48小时后，用PBS洗涤细胞并使用TrypLE收获细胞。将细胞离心以除去上清液，并将细胞沉淀物重悬于PBS中并离心以除去上清液。
使用PureLinkTMRNA微型试剂盒(Invitrogen)分离和定量总RNA以合成cDNA。
使用表2所列引物将合成的A579 cDNA进行实时PCR以确定半乳糖凝集素-3的表达。一种管家基因GAPDH被用作负载对照。
[表2]
为了确定由表1中的序列制成的半乳糖凝集素-3ASO是否正常发挥作用以降低肺癌细胞中半乳糖凝集素-3的基因表达，用ASO处理肺癌细胞并使用表2中的序列进行分析，确认了肺癌细胞系A549中的半乳糖凝集素-3基因表达通过半乳糖凝集素-3ASO处理而降低(图1)。
实施例5.半乳糖凝集素-3ASO处理后肺癌细胞中半乳糖凝集素-3蛋白表达分析
按照与实施例4相同的方式获得用半乳糖凝集素-3ASO处理的肺癌细胞后，进行蛋白质印迹以确定细胞中半乳糖凝集素-3的蛋白表达。用含有磷酸酶抑制剂混合物(Sigma)的细胞裂解液(200ng/ml苯甲基磺酰氟、1％ TritonX-100、150mM NaCl、50mM Tris)裂解细胞沉淀物，以诱导细胞内蛋白质洗脱。在10％ SDS聚丙烯酰胺凝胶上电泳后，将裂解物转移至Immobilon P膜上。然后用半乳糖凝集素-3抗体探测膜，并使用ECL试剂盒通过显色检测半乳糖凝集素-3条带。
分析显示肺癌细胞系A549中的半乳糖凝集素-3蛋白表达通过半乳糖凝集素-3ASO处理而降低(图2)。
经过RNA水平下的反应，最后是蛋白质水平下的反应，可能需要几个小时到几天的时间才能在蛋白质水平上看到效果，并且在某些情况下，ASO诱导的减少会在短时间内出现(少于24小时)然后恢复到原来的状态。图2显示了ASO处理后第1天和第4天的蛋白表达水平，并且显示半乳糖凝集素-3ASO处理在超过4天以及长时间内抑制蛋白表达，从而确认其作为药物发挥了足够的功能。
实施例6.半乳糖凝集素-3ASO处理后的肺癌细胞增殖测定
A549细胞以4,000至8,000个细胞/cm2接种在培养皿中，并在37℃、5％CO2培养箱中孵育24小时。除去所有现有培养基后，使用Lipofectamine在1％FBS培养基中将100至1,000pmol半乳糖凝集素-3ASO转染至细胞中。在37℃、5％CO2培养箱中培养24和48小时后对细胞进行计数。
结果显示，肺癌细胞系A549的细胞增殖能力通过半乳糖凝集素-3ASO处理而降低(图3左)。在实施例5的情况下(图2)，确认了半乳糖凝集素-3ASO处理引起蛋白质表达的减少，从而表明由于蛋白质表达的减少而诱导了细胞增殖和迁移的减少。
图3中的图显示了细胞增殖程度的相对比较，这不是对细胞数量的量化，而是实验组的细胞增殖程度与作为“1”的对照组的细胞增殖程度进行的比较。
另一方面，H-358是与A549相同的NSCLC细胞系之一，如图3所示，半乳糖凝集素-3ASO在其他NSCLC细胞系中显示出相同的功效，而不仅仅是A549细胞系，表明半乳糖凝集素-3ASO可以在整个NSCLC中使用。
实施例7.半乳糖凝集素-3ASO处理后的肺癌细胞迁移测定
将A549细胞以0.5至2×10^4个细胞/孔接种到跨孔(trans-well)插入孔中，并在37℃、5％CO2培养箱中孵育24小时。除去所有现有培养基后，在无血清培养基条件下使用Lipofectamine将100至1,000pm半乳糖凝集素-3ASO转染至细胞中。在37℃、5％CO2培养箱中培养2小时后，将500μl补充有10％FBS、PrimocinTM(100μg/ml)的RPMI 1640培养基分配到插入孔的底板上。37℃、5％CO2培养箱培养48小时后，进行结晶紫染色。在光学显微镜下观察迁移到插入孔膜另一侧的细胞。
结果确认了，肺癌细胞系A549的细胞迁移能力通过半乳糖凝集素-3ASO处理而降低(图3右)。
如图3所示，肺癌细胞的迁移在Galection-3ASO处理后的第二天被抑制。
实施例8.半乳糖凝集素-3ASO处理后癌细胞对抗癌药物的敏感性分析A549肺癌细胞以2×10^4至10×10^4个细胞/cm2的细胞计数在培养皿上贴壁，然后使用Lipofectamine以100至1,000pmol的浓度将半乳糖凝集素-3ASO转染至细胞中。用10-50uM顺铂处理24小时后，使用24小时后活和死测定试剂盒(Live&DeadAssay Kit)通过荧光显微镜确定细胞死亡程度。
结果显示，半乳糖凝集素-3ASO与常规化疗抗癌剂共同施用增加了肺癌细胞系A549的凋亡，从而导致对化疗剂的敏感性增加(图4)。
实施例9.用负载有半乳糖凝集素-3ASO的人工纳米囊泡处理后肺癌细胞中半乳糖
凝集素-3基因表达的分析
A549细胞以4,000至8,000个细胞/cm2接种在培养皿中，并在37℃、5％CO2培养箱中孵育24小时。第二天，将它们用0.5至2×10^9负载有半乳糖凝集素-3ASO的人工纳米囊泡处理。在37℃、5％CO2培养箱中培养24小时后，如实施例4所述分析半乳糖凝集素-3基因表达。
分析确认，肺癌细胞系A549中的半乳糖凝集素-3基因表达通过用负载有半乳糖凝集素-3ASO的人工纳米囊泡处理而降低(图7)。
图1显示使用脂质体(lipofectamine)试剂将没有纳米囊泡的半乳糖凝集素-3ASO转染至细胞后细胞内半乳糖凝集素-3基因表达的程度。脂质体(Lipofectamine)是一种人工诱导脂质体形成并使物质进入细胞的试剂，但由于其固有的毒性和加工问题，不可能在实际药物生产中使用。因此，图1中的结果首次确认了半乳糖凝集素(Galectin)-3ASO具有正常功能，并且图7中，半乳糖凝集素-3ASO被负载到人工纳米囊泡中，无需用脂质体(lipofectamine)等试剂处理即可自然进入细胞，确认了抑制半乳糖凝集素-3表达的功效。
实施例10：脐带血干细胞外泌体和人工纳米囊泡(不含或含有半乳糖凝集素-
3ASO)对肺癌细胞系(A549)增殖和迁移的影响
(实验组说明)
对照：无处理(阴性对照)
外泌体：脐带血干细胞外泌体处理组
GAL-3外泌体：负载有半乳糖凝集素-3ASO的脐带血干细胞外泌体处理组
ANV：未负载的脐带血干细胞人工纳米囊泡处理组
GAL-3ANV：负载有半乳糖凝集素-3ASO的脐带血干细胞人工纳米囊泡处理组
10-1.用负载有半乳糖凝集素-3ASO的纳米囊泡处理后肺癌细胞增殖测定
A549细胞以4,000至8,000个细胞/cm2接种在培养皿中，并在37℃、5％CO2培养箱中培养24小时。除去所有现有培养基后，用1％ FBS培养基处理0.5×10^9至2×10^9外泌体和人工纳米囊泡。在37℃、5％CO2培养箱中培养24和48小时后对细胞进行计数。
结果显示，负载有半乳糖凝集素-3ASO的纳米囊泡处理减少了肺癌细胞系A549的增殖(图8)。图8中的图显示相对细胞增殖率的比较。
如图8中外泌体/人工纳米囊泡的图中所示，我们发现半乳糖凝集素-3ASO在负载到通过压碎细胞制成的外泌体和人工纳米囊泡中时同样有效。
10-2.负载有半乳糖凝集素-3ASO的纳米囊泡处理后肺癌细胞迁移测定
将A549细胞以0.5至2×10^4个细胞/孔接种到跨孔(trans-well)插入孔中，并在37℃、5％CO2培养箱中孵育24小时。除去所有现有培养基后，用无血清培养基处理0.5×10^9至2×10^9外泌体和人工纳米囊泡。在37℃、5％CO2培养箱中培养2小时后，将500μl补充有10％FBS、PrimocinTM(100μg/ml)的RPMI1640培养基分配到插入孔的底板上。37℃、5％CO2培养箱培养48小时后，进行结晶紫染色。在光学显微镜下观察迁移到插入孔膜另一侧的细胞。
结果确认，肺癌细胞系A549的迁移能力通过用实施例2中制备的负载有半乳糖凝集素-3ASO的人工纳米囊泡处理而降低(图9)。
(结论)
就不含半乳糖凝集素-3ASO的脐带血干细胞外泌体和人工纳米囊泡而言，它们按照干细胞的固有特性促进肺癌细胞系的增殖和迁移，从而促进周围细胞的增殖和迁移。然而，携带半乳糖凝集素-3ASO的脐带血干细胞外泌体和人工纳米囊泡通过抑制半乳糖凝集素-3基因表达(促进非小细胞肺癌的增殖/迁移)抵消了干细胞的固有特性(促进细胞增殖/迁移)，从而导致与不携带半乳糖凝集素-3的外泌体和人工纳米囊泡(Exosome&ANV)相比，增殖/迁移效果受到抑制，进而导致肺癌细胞的增殖和迁移能力与未经任何处理的对照实验组相似。
实施例11：不含和含有半乳糖凝集素-3ASO的HEK293细胞外泌体和人工纳米囊泡
对肺癌细胞系(A549)的增殖和迁移的影响
为了排除在负载有半乳糖凝集素-3ASO的人工纳米囊泡对肺癌细胞系增殖和迁移的影响中的干细胞固有特性，利用非干细胞HEK293细胞产生负载有半乳糖凝集素-3ASO的人工纳米囊泡，然后按照与实施例10相同的方式用肺癌细胞系处理，观察半乳糖凝集素-3ASO的功效。对肺癌细胞系增殖和迁移的影响如图10和11所示。
(实验组说明)
未处理(NC)：无处理(阴性对照)
对照_ANV：未负载的HEK293细胞源性人工纳米囊泡处理组
GAL-3_ANV：负载有半乳糖凝集素-3ASO的HEK293细胞源性人工纳米囊泡处理组
(结论)
虽然不含半乳糖凝集素-3ASO的HEK293细胞源性人工纳米囊泡与未处理的阴性对照表现相似，但含有半乳糖凝集素-3ASO的HEK293细胞源性人工纳米囊泡抑制了肺癌细胞系的增殖和迁移。这证实了HEK293细胞源性人工纳米囊泡充当载体，可以复制ASO的功效，而不影响HEK293细胞自身的特性。
序列表自由文本
<110>株式会社普里莫里斯(PRIMORIS Co.,Ltd.)
<120>含有负载有基于反义寡核苷酸的药物的细胞源性天然或人工纳米囊泡的药物组合物
<130>P2021-0009
<150>KR 2021/085716
<151>2021-06-30
<160>3
<170>KoPatentIn 3.0
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>1
catgatgcgt tatctgggtc 20
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>2
ggccactgat tgtgccttat 20
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>反义寡核苷酸
<400>3
actggggaag ggaagaaaga
Claims (16)
1.一种药物组合物，包含负载有基于反义寡核苷酸(ASO)的药物的细胞源性天然或人工纳米囊泡。
2.一种药物组合物，包含负载有靶向半乳糖凝集素-3的核酸药物的细胞源性天然或人工纳米囊泡。
3.一种用于口腔或鼻吸入或静脉内施用的药物组合物，包含负载有基于核酸的药物的细胞源性天然或人工纳米囊泡。
4.一种用于预防或治疗癌症的药物组合物，包含负载有基于核酸的药物的脐带血干细胞源性天然或人工纳米囊泡。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的药物组合物，其中，所述天然或人工纳米囊泡由人胚胎肾细胞或脐带血干细胞释放或制备。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的药物组合物，其中，所述基于ASO的药物或基于核酸的药物是基于ASO的药物，在基于ASO的药物中，至少一个序列的一些或全部碱基被硫代磷酸酯和/或2'-O-甲基基团修饰。
7.根据权利要求1至3中任一项所述的药物组合物，其中，所述药物组合物用于预防或治疗癌症。
8.根据权利要求1、3或4所述的药物组合物，其中，所述基于ASO的药物或基于核酸的药物靶向半乳糖凝集素-3。
9.根据权利要求1至4中任一项所述的药物组合物，其中，使用SEQ ID NO.1至3中的一个或多个序列工程改造所述基于ASO的药物或基于核酸的药物以靶向半乳糖凝集素-3。
10.根据权利要求1、2或4所述的药物组合物，其中，所述药物组合物是用于口服或鼻吸入或用于静脉内施用的制剂。
11.根据权利要求1至4中任一项所述的药物组合物，其中，所述药物组合物用于预防或治疗肺癌。
12.根据权利要求1至4中任一项所述的药物组合物，其中，所述药物组合物与非基于核酸的药物共同施用。
13.根据权利要求1至4中任一项所述的药物组合物，其中，所述药物组合物降低靶细胞的增殖和/或迁移能力。
14.根据权利要求1至4中任一项所述的药物组合物，其中，所述药物组合物增加对共同施用的抗癌药物的易感性。
15.一种靶向半乳糖凝集素-3的反义寡核苷酸(ASO)，其使用半乳糖凝集素-3编码序列(CDS)内的序列设计。
16.根据权利要求15所述的靶向半乳糖凝集素-3的反义寡核苷酸(ASO)，其使用SEQ IDNO 1至3的一个或多个序列设计以靶向半乳糖凝集素-3。
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