CN117925580A - 一种β-葡萄糖苷酶GME7019、编码基因、工程菌及其应用 - Google Patents
一种β-葡萄糖苷酶GME7019、编码基因、工程菌及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于基因工程技术和生物医药领域，具体公开了一种β‑葡萄糖苷酶GME7019、编码基因、工程菌及其应用。该β‑葡萄糖苷酶GME7019的氨基酸序列如SEQID NO.1所示。本发明提出的β‑葡萄糖苷酶GME7019热稳定性好，pH稳定性广，并且具有良好的β‑葡萄糖苷键的水解活性，能将大量人参皂苷转化为稀有的人参皂苷Rg3；此外，该β‑葡萄糖苷酶GME7019还具有较强的金属离子耐受性并且能够在金属离子和有机试剂的条件下促进转化能力，使得其能够在未来的应用中可以克服水资源匮乏的压力，在市场上具有很好的推广和应用价值。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术和生物医药领域，具体涉及一种β-葡萄糖苷酶GME7019、编码基因、工程菌及其应用。
背景技术
包含爪哇正青霉在内的青霉菌在长期的进化过程中获得了特定的酶群，这些酶群可以分解难降解的木质纤维素，因此青霉菌是糖基水解酶的良好来源。青霉属可以生产出高性能的木质纤维素水解胞外酶，与其他真菌种类相比，青霉属具有易于回收、活性高、稳定性高等特点。此外，由于青霉菌具有丰富的遗传多样性，这些菌株也成为生产β-葡萄糖苷酶和其他工业酶的重要来源。因为海水具有取之不尽、用之不竭的特性，是真正可持续利用的资源。因此，可以通过海水代替淡水的方式，尽量减少消耗淡水，同时也可以减少对环境的污染。
人参皂苷是人参中最重要的一类药物活性成分，具有多种功效，如抗癌、抗衰老、抗氧化、抗过敏、抗疲劳等。但天然的人参皂苷糖化程度很高，具有复杂的三酰胺骨架和糖基修饰结构，其化学性质和药理作用复杂多变。在这些人参皂苷中，Rg3类虽然含量较低但生物活性最为显著，具有抗肿瘤、抗转移性、保护神经、保肝护肝、抗糖尿病和改善血管舒张等多重药理作用，最具有药物开发价值。因此，目前许多研究都集中在如何将大量的人参皂苷转化为人参皂苷20(S)-Rg3，后者具有更活跃的药物活性，这一过程主要是去除人参皂苷C-20碳上的葡萄糖糖基。
近年来，多项研究尝试利用微生物转化技术将人参皂苷Rb1转化为人参皂苷20(S)-Rg3，但均无明显效果。已有研究显示，黑曲霉和青霉菌等微生物所表达的粗酶成分复杂，其水解转化人参皂苷Rb1的能力选择性较差，因而受到极大限制。重组酶是另外一种实现人参皂苷转化的另一重要途径。重组酶能实现外源的高水平表达，也有少数重组β-葡萄糖苷酶可以在常温下将Rb1转化为Rg3，但其转化率很低，并且受制于底物浓度和Rg3产量的严格限制。到目前为止，尚未发现一种能够将大量人参皂苷转化为人参皂苷20(S)-Rg3的重组酶。
发明内容
在发明人的研究过程中，发明人对爪哇正青霉R57中发现的一种新的β-葡萄糖苷酶GM E7019进行了外源表达、纯化和生化表征。研究结果表明，这种β-葡萄糖苷酶GME7019对不同的糖苷和苷元具有多功能的水解活性，对人参皂苷都具有很好的转化活性。
在本发明的第一个方面，本发明提供了一种β-葡萄糖苷酶GME7019，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
该β-葡萄糖苷酶GME7019来源于爪哇正青霉R57的基因组中筛选到的基因GME7019并且在大肠杆菌中表达所得到的，发明人发现其具有良好的β-葡萄糖苷键的水解活性，对人参皂苷Rb1、Rb2和Rd都具有较好的转化能力。其在40℃-60℃温度范围内表现出最高活力和良好的温度稳定性，具有较好的耐高温能力；同时还能够在pH＝5.0-9.0的范围内表现出极高的稳定性(可以承受较宽的pH范围)。此外，该β-葡萄糖苷酶GME7019还具有较强的金属离子耐受性(如Cu2+、Co2+和Zn2+)，而且在这些金属离子的作用下，GME7019的热稳定性能够显著提高。
在本发明的第二个方面，还提供了所述β-葡萄糖苷酶GME7019的编码基因；所述编码基因的序列如SEQ ID NO.2(原始序列)或SEQ ID NO.3(密码子优化后的序列)所示。在NCBI对其氨基酸序列(SEQ ID NO.1)的比对中，与Aspergillus fischeri NRRL 181糖苷水解酶最高相似度，为70.25％，经过密码子优化后的序列与Paenibacillus yonginensis中的糖苷水解酶具有最高相似度，为95.24％。因此，GME7019所编码的β-葡萄糖苷酶可以被认定为一个新酶。
由于青霉菌和大肠杆菌的亲缘关系较远，密码子偏好性有所差异，所以本发明选择通过基因合成的方式对目的基因进行密码子优化，使其能够更好的实现外源表达。
通过密码子优化本发明中的β-葡萄糖苷酶GME7019真核基因后，在大肠杆菌BL21(DE3)中通过0.1mM的IPTG诱导表达，经超声破碎得到粗酶，经Ni-NTA亲和层析纯化，经SDS-PAGE验证，得到纯化酶。酶学性质分析发现，该酶热稳定性好，pH稳定性广。该酶在pH为5-9时比较稳定，在4℃的不同缓冲溶液中，经过24h的孵育，其活性仍保持在80％以上。由于海水的酸碱度在7.9-8.4之间，而该酶此酸碱度范围内酶的活性没有任何损失，因此它可以在未来的应用中可以克服水资源匮乏的压力。同时，本发明β-葡萄糖苷酶GME7019还能将大量人参皂苷转化为稀有的人参皂苷，其转化人参皂苷的能力受到有机试剂(Zn2+、Co2+和Cu2+)的促进，这一特性也为应用于生物转化提供了良好的先决条件。本发明的β-葡萄糖苷酶GME7019的制备方法简单，在市场上具有很好的推广和应用价值。
在本发明的第三个方面，本发明还提供了一种含有所述编码基因的工程菌。具体是将β-葡萄糖苷酶GME7019的编码基因与pET-28a载体相连得到重组质粒；将重组质粒转入表达宿主菌E.coliBL21(DE3)中，经0.1mM IPTG诱导产酶后，用Ni-NTA柱纯化β-葡萄糖苷酶GME7019。并基于此提供了一种所述工程菌的全细胞催化剂的制备方法，包括第一步骤：将含有所述编码基因的阳性克隆大肠杆菌接种(接种比例为1:100)至含50μg/mL的LB培养基中，37℃，180rpm震荡培养直至OD600达到0.4-0.6，然后冰浴20min，随后加入终浓度为0.1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，于37℃和180rpm的条件下震荡培养12h。其中，所述第一步骤后还包括第二步骤，所述第二步骤的具体过程为：离心(条件优选为5000×g，4，℃20min)收集细胞后用缓冲液(优选包括500mM NaH2PO4，300mM氯化钠，10mM咪唑，pH7.4)进行洗涤，过滤后将沉淀悬浮于裂解液中，进行超声细胞破碎，然后将得到的菌悬液进行离心，上清液纯化。其中，所述裂解液的pH为7.4，包括：500mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠，10mM咪唑。
在本发明的第四个方面，本发明还提供了所述β-葡萄糖苷酶GME7019在催化人参皂苷Rb1和人参皂苷Rd制备人参皂苷Rg3中的应用。其中，催化制备人参皂苷Rg3的反应在50mM柠檬酸和pH＝4的磷酸盐缓冲液体系下进行。
本发明的有益效果为：本发明提出的β-葡萄糖苷酶GME7019热稳定性好，pH稳定性广，并且具有良好的β-葡萄糖苷键的水解活性，能将大量人参皂苷转化为稀有的人参皂苷Rg3；此外，该β-葡萄糖苷酶GME7019还具有较强的金属离子耐受性并且能够在金属离子和有机试剂的条件下促进转化能力，使得其能够在未来的应用中可以克服水资源匮乏的压力，在市场上具有很好的推广和应用价值。
附图说明
图1所示为实施例1本发明所述GME7019基因的信号肽预测结果图；
图2所示为GME7019基因质粒的双酶切琼脂糖凝胶图；
图3所示为实施例2验证GME7019导入E.coli BL21(DE3)的菌落PCR琼脂糖凝胶图；
图4所示为纯化的β-葡萄糖苷酶GME7019经过Ni-NTA纯化后的纯度鉴定结果图：泳道1为蛋白Marker，泳道2为IPTG诱导后的粗蛋白，泳道3为经过Ni-NTA纯化后的蛋白；
图5所示为β-葡萄糖苷酶GME7019最适反应温度的测定结果图，横坐标为温度，纵坐标为相对酶活，单位％；
图6所示为β-葡萄糖苷酶GME7019热稳定性的测定结果图，横坐标为温度，纵坐标为相对酶活，单位％；
图7所示为β-葡萄糖苷酶GME7019最适反应pH的测定结果图，横坐标为pH，纵坐标为相对酶活，单位％；
图8所示为β-葡萄糖苷酶GME7019的pH稳定性的测定结果图，横坐标为pH，纵坐标为相对酶活，单位％；
图9所示为金属离子对β-葡萄糖苷酶GME7019热稳定性的影响；
图10所示为人参皂苷Rg3的转化途径；
图11所示为β-葡萄糖苷酶GME7019对人参皂苷Rb1和Rd转化的TLC分析。
具体实施方式
以下将结合实施例和附图对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整的描述，以充分地理解本发明的目的、方案和效果。
实施例1：编码β-葡萄糖苷酶GME7019的GME7019基因的获得及克隆
1.基因的筛选
将实验室现有菌株爪哇正青霉R57进行全基因组测序，并对糖苷水解酶基因进行分析和分类，从中挑出全部β-葡萄糖苷酶基因。通过qRT-PCR(Real-time fluorescencequantitative PCR)的方式对β-葡萄糖苷酶基因进行筛选，分析qRT-PCR数据分析发现表达量上调相对较高的β-葡萄糖苷酶基因为GME7019，上调倍数为2.34倍。由此选择GME7019为研究对象。
2.信号肽分析
由于进行原核表达时，表达的蛋白为胞内蛋白，涉及信号肽的去除，所以我们进行信号肽的分析。使用在线软件SignalP5.0Server和Expasy(https://www.expasy.org/)预测信号肽信息以及对该酶的理化性质进行分析。图1所示为实施例1本发明所述GME7019基因的信号肽预测结果图。
3.密码子优化
由于青霉菌和大肠杆菌的亲缘关系较远，密码子偏好性有所差异，所以我们选择通过基因合成的方式对目的基因进行密码子优化，使其能够更好的实现外源表达。
4.GME7019基因的克隆
将GME7019除去信号肽，并完成目的基因合成，将目的基因连接到pET-28a载体上，重组载体命名为pET-28a-GME7019。将重组载体导入克隆载体E.coli DH5α中保存。
(1)质粒的提取
将带有重组载体的E.coliDH5α在添加了卡那霉素抗性的LB固体培养基上划线培养、分离单菌落，一旦菌落清晰可见，挑取单菌落，进行震荡扩大培养，待菌液OD600达到0.6后用质粒小提试剂盒提取质粒，质粒提取成功后进行转化。
(2)单双酶切验证
双酶切体系如表1所示，通过琼脂糖凝胶电泳验证双酶切片段大小，验证基因合成是否成功(见图2)。
表1
实施例2：β-葡萄糖苷酶GME7019的制备
1.筛选阳性克隆
选择E.coliBL21(DE3)作为β-葡萄糖苷酶基因GME7019外源表达的载体。将重组载体转入E.coli BL21(DE3)中，并筛选阳性克隆，PCR验证挑除假阳性，便于后续外源表达。
(1)PCR扩增体系如下：
表2 PCR扩增反应体系
| 2*Es Tag MIX | 12.5μL |
| 上游引物 | 1μL |
| 下游引物 | 1μL |
| 菌液 | 1μL |
| ddH2O | 补充至总体积25μL |
(2)扩增条件如下：94℃，2min；35cycles：(94℃，1min；55℃，1min；72℃，1min)；72℃，10min；4℃，30min。
取PCR产物5μL，在1％琼脂糖凝胶中进行电泳分析(见图3)，见单一且大小合适的条带为阳性克隆子。
2.β-葡萄糖苷酶GME7019的表达和纯化
(1)β-葡萄糖苷酶GME7019的诱导表达
将筛选到的阳性克隆子于LB液体培养基(含50μg/ml卡那霉素)中扩大培养。将活化的菌株按1：100的比例接种于含Kana(50μg/ml)的LB培养基中，37℃，180rpm震荡培养。当OD600达到0.5时，将菌悬液冰浴20min，随后加入终浓度为0.1mM的IPTG[IPTG的母液：50mg/mL(0.2mmol/mL)]，并设置不加IPTG的摇瓶作为对照，两者同时在37℃，180rpm震荡培养12h，用于诱导蛋白表达，初步对酶活进行测定。
(2)粗酶液的获得
离心(5000×g，4℃，20min)收集细胞，用缓冲液(500mM NaH2PO4，300mM氯化钠，10mM咪唑，pH7.4)洗涤两次，之后将沉淀重新悬浮于裂解液中(500mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠，10mM咪唑，pH7.4)，100mL培养基的菌体最后悬浮于7mL缓冲液。并在冰水混合物中进行超声细胞破碎(按照大肠杆菌超声破碎的标准方法进行)。将得到的菌悬液在4℃下以9000×g离心25min，并分离上清和沉淀，测定蛋白含量和酶活，且每一个组分都进行SDS-PAGE，最终得到纯化的β-葡萄糖苷酶GME7019；具体操作过程如下：
将洗涤过的菌体，用裂解液(pH7.4)7mL重悬，超声波破壁(220W，超声5s，间歇5s，破碎12min)。将破壁后得到的菌悬液在4℃、9000×g离心25min，分离上清和沉淀，测定蛋白含量和β-葡萄糖苷酶GME7019的酶活。β-葡萄糖苷酶GME7019的纯化：将上清液(即粗酶溶液)与Ni-NTA填充物混合，在冰上摇晃1小时。然后将混合物转移到纯化柱中，并用洗涤缓冲液(PBS，20mM咪唑，pH7.4)冲洗以去除杂质。随后用洗脱缓冲液(PBS，200mM咪唑，pH7.4)洗脱目标蛋白。以牛血清白蛋白溶液为标准，用BCA蛋白试剂盒测定蛋白质含量。采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法测定重组蛋白的分子量。
通过此过程得到的纯化的β-葡萄糖苷酶GME7019，通过SDS-PAGE电泳后考马斯亮蓝染色鉴定β-葡萄糖苷酶GME7019的纯度，结果如图所示；由图4可见，目标蛋白通过His标签纯化后，在81kDa处有轻微条带，与预测的分子量不符合，原因是由于是真核基因在原核中表达，缺失了复杂的翻译后修饰，导致分子量比预测小。使用pNPG(对硝基苯基-β-D-葡萄糖苷)作为底物测定纯化后的β葡萄糖苷酶活性，结果是显示活性正常，因此表明已经纯化得到GME7019蛋白。
实施例2：β-葡萄糖苷酶GME7019的理化性质分析
酶活力单位(U)定义为：在测定条件下，每分钟产生1μmol pNP所需的酶量为一个活力单位；所有测定实验均进行三次技术平行，结果取平均值；
1.酶活的测定方法
采用pNPG法测定β-葡萄糖苷酶GME7019的酶活：以5mM的对硝基苯基-β-D-葡萄糖苷(pNPG)为底物，其与酶液反应的产物为对硝基苯酚(pNP)，产物为黄色，且在405nm处有最大吸收，所以通过测量生成的pNP的量来确定酶活的大小。
方法：取3mL配制好的柠檬酸-磷酸氢二钠溶液(pH4.8)，加入5mM的pNPG(用柠檬酸-磷酸氢二钠溶液(pH4.8)配制)3mL，体系内加水0.8mL后50℃预热5min，预热完成后加入酶液0.2mL，50℃反应30min，随后加入1M碳酸钠静置5min显色，同时以灭活的酶液做对照，最后在405nm下测定pNP的含量，从而确定酶活的大小。
2.温度对酶活性的影响
在pH5下测定不同温度下β-葡萄糖苷酶GME7019的活性。分别于30、40、50、60、70、80和90℃下，测定其酶活力。最高酶活性对应的温度为最适温度，与最高活性(100％)相对比，计算每个温度处的比酶活。
为了确定酶的热稳定性，将纯化的蛋白溶液置于不同温度的水浴中孵育0、0.5、1、1.5和2h，在最佳反应条件下测定酶的残留活性。
3.pH值对酶活性的影响
在最适温度下测定了不同pH值下的酶活性。使用McIlvaine(pH3.0-8.0)、硼酸盐生理盐水(pH8.0-9.0)和甘氨酸-NaOH(pH9.0-10.5)缓冲液。以最高酶活性对应的pH值为最适pH，并计算每个pH处的酶活性相对于最高活性(100％)的相对酶活。
为了检测酶在不同pH下的稳定性，将纯化的酶在不同pH的缓冲液中4℃孵育24h，并在最佳反应条件下测定酶的残留活性。
4.金属离子对β-葡萄糖苷酶GME7019酶活性的影响
在金属离子最终浓度为1mM和5mM时，研究了不同金属阳离子对β-葡萄糖苷酶GME7019活性的影响。Cu2+和Fe2+对β-葡萄糖苷酶GME4060活性强烈抑制，Mg2+和Fe3+对酶活性有轻微的抑制作用。然而，大多数其他二价金属阳离子对β-葡萄糖苷酶GME7019的活性有不同的影响。其中，在Zn2+、Mn2+和Co2+的作用下β-葡萄糖苷酶GME7019的活性显著提高。在反应体系中Co2+和Mn2+的终浓度为5mM时，催化效率是无金属离子时的1.2倍。这一结果与新热原菌rBglA的观察结果相似，表明Co2+和Mn2+可能是蛋白质结构或催化活性中心成分的稳定因子。但EDTA对酶活性的影响不显著，说明螯合剂EDTA对β-葡萄糖苷酶GME7019活性没有影响。
5.金属离子对β-葡萄糖苷酶GME7019热稳定性的影响
接下来，我们将GME7019与Zn2+、Co2+和Mn2+在60℃下孵育0、1和2小时。图5所示的结果表明，Mn2+显著提高了β-葡萄糖苷酶GME7019在高温下的热稳定性。最终浓度为5mM的Mn2+与β-葡萄糖苷酶GME7019一同在60℃下孵育2小时后仍可保持约40％的活性，而不含金属离子的β-葡萄糖苷酶GME7019仅能保持约20％。
6.有机试剂对β-葡萄糖苷酶GME7019酶活性的影响。
我们测试了不同有机试剂对β-葡萄糖苷酶GME7019活性的影响，在终浓度为0.1％和1％时，SDS对GME7019活性强烈抑制，Triton X-100对活性轻微抑制。大多数其他有机试剂对GME7019的活性有不同的影响。其中，Glycerin、β-Mercaptoethanol、DMSO、Methanol和Polyethylene glycol都显著提高了β-葡萄糖苷酶GME7019的活性。在终浓度为1％时，加入Glycerin、DMSO和Methanol的反应体系的催化效率是无金属离子对照的近1.1倍。这一结果表明，该酶可在有机溶剂的存在下用于生物转化，同时也显示了某些特殊人参皂苷的有机溶解性。
7.动力学参数的测定
用不同浓度的对硝基苯基-β-D-葡萄糖苷(0.2-2.2mM)测定酶的动力学参数。反应在50mM柠檬酸/磷酸盐缓冲液(pH4)中进行，在60℃下反应2min。Km(mM)和kcat(1/s)是由米氏方程中的线性Burk图确定的。为了计算催化常数kcat，将蛋白质的量除以亚基分子量91088.42Da。以牛血清白蛋白为标准蛋白，采用BCA蛋白含量测定试剂盒测定蛋白浓度。
8.水解活性
采用人参皂苷Rb1和Rd测定β-葡萄糖苷酶GME7019的水解活性。反应在50mM柠檬酸/磷酸盐缓冲液(pH4)中进行，将1mg/mL的人参皂苷Rb1和Rd分别与β-葡萄糖苷酶GME7019反应，在37℃下过夜反应，采用正丁醇萃取终止反应。
通过TLC对其转化能力进行初步判定展开剂比例为：氯仿：甲醇：水为：7:3:0.5，从而挑选出对其有水解活性的底物。结果显示，β-葡萄糖苷酶GME7019对人参皂苷Rb1和Rd具有较好的水解活性，将其β-1,6糖苷键水解生产稀有人参皂苷Rg3。根据这一特点，可以将β-葡萄糖苷酶GME7019应用到Rg3的生产中去，以减少酸处理或碱处理过程中所产生的环境污染。
以上所述，只是本发明的较佳实施例而已，本发明并不局限于上述实施方式，只要其以相同的手段达到本发明的技术效果，都应属于本发明的保护范围。在本发明的保护范围内其技术方案和/或实施方式可以有各种不同的修改和变化。
Claims (10)
1.一种β-葡萄糖苷酶GME7019，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种权利要求1所述β-葡萄糖苷酶GME7019的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于，所述编码基因的序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。
4.根据权利要求3所述的编码基因，其特征在于，所述编码基因的序列如SEQ ID NO.3所示。
5.一种含有权利要求2至4任一项所述编码基因的工程菌。
6.一种权利要求5所述工程菌的全细胞催化剂的制备方法，其特征在于，包括第一步骤：将所述编码基因的阳性克隆大肠杆菌接种至含50μg/mL的LB培养基中，37℃，180rpm震荡培养直至OD600达到0.4-0.6，然后冰浴20min，随后加入终浓度为0.1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，于37℃和180rpm的条件下震荡培养12h。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述第一步骤后还包括第二步骤，所述第二步骤的具体过程为：离心收集细胞后用缓冲液进行洗涤，过滤后将沉淀悬浮于裂解液中，进行超声细胞破碎，然后将得到的菌悬液进行离心，上清液纯化。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述裂解液的pH为7.4，包括：500mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠，10mM咪唑。
9.权利要求1所述的β-葡萄糖苷酶GME7019在催化人参皂苷Rb1和人参皂苷Rd制备人参皂苷Rg3中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，催化制备人参皂苷Rg3的反应在50mM柠檬酸和pH＝4的磷酸盐缓冲液体系下进行。
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