CN117919202A

CN117919202A - 一种脂质纳米颗粒、阴离子聚合物协同脂质纳米颗粒核酸递送系统及其制备与应用

Info

Publication number: CN117919202A
Application number: CN202410097661.4A
Authority: CN
Inventors: 杨传旭; 高雪; 张宏倩
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2024-01-24
Filing date: 2024-01-24
Publication date: 2024-04-26

Abstract

本发明提供一种脂质纳米颗粒、阴离子聚合物协同脂质纳米颗粒核酸递送系统及其制备与应用。本发明脂质纳米颗粒中的可电离脂质分子的制备步骤简单高效、原料简单易得，对设备要求低，反应条件温和，纯化方式简单；所得脂质纳米颗粒用于制备阴离子聚合物协同脂质纳米颗粒核酸递送系统，所得核酸递送系统生物安全性高，核酸包封效率高，核酸递送效率高，转染效率佳，能够充分发挥核酸药物的治疗疗效，在肿瘤学、基因治疗等领域都具有广泛应用前景。

Description

一种脂质纳米颗粒、阴离子聚合物协同脂质纳米颗粒核酸递送系统及其制备与应用

技术领域

本发明涉及一种脂质纳米颗粒、阴离子聚合物协同脂质纳米颗粒核酸递送系统及其制备与应用，属于生物医药领域。

背景技术

近年来，核酸类药物治疗技术飞速发展。核酸作为一种新型生物药物，可以调控基因表达或产生治疗性蛋白质，能够特异性治疗多种疾病，包括传染病、癌症、免疫疾病和孟德尔疾病(包括神经系统疾病)等。然而，相较于许多小分子和蛋白质药物，裸核酸分子极易被核酸酶破坏降解，并被肾脏迅速清除，同时核酸分子具有亲水性、负电性和高分子量等理化性质，导致其难以穿过细胞膜到达作用位点。因此，核酸药物开发和应用的主要难点在于递送技术。递送系统的开发将解决核酸在体内递送存在的诸多问题，是提高核酸药物疗效的关键。

在病毒性传染病流行的背景下，以脂质纳米颗粒(LNP)为递送载体的mRNA疫苗快速投入到大量生产和使用中。这使得人们看到了脂质纳米颗粒核酸递送系统的应用价值及巨大潜力。在过去的几年中，核酸递送系统已经取得了巨大的进步，但只有少数核酸药物成功上市。大部分原因在于递送过程中存在许多生物学障碍，药物载体难以同时保证低毒性以及高递送效率。因此一种能够提高递送效率同时具有生物安全性的递送载体亟待开发。

目前，已有研究使用含有阳离子脂质组分的LNP来递送核酸药物，以增强细胞摄取来提高转染效率，然而由于其与核酸分子结合过于紧密，导致核酸分子在细胞质中难以被释放出来，进而难以发挥作用，且过于集中的正电荷具有细胞毒性，因此现有的LNP递送技术还需进一步优化。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供一种脂质纳米颗粒、阴离子聚合物协同脂质纳米颗粒核酸递送系统及其制备与应用。本发明脂质纳米颗粒中的可电离脂质分子的制备步骤简单高效、原料简单易得，对设备要求低，反应条件温和，纯化方式简单；所得脂质纳米颗粒用于制备阴离子聚合物协同脂质纳米颗粒核酸递送系统，所得核酸递送系统生物安全性高，核酸包封效率高，核酸递送效率高，转染效率佳，能够充分发挥核酸药物的治疗疗效，在肿瘤学、基因治疗等领域都具有广泛应用前景。

本发明的技术方案如下：

本发明第一方面，提供一种脂质纳米颗粒，包括如下质量百分比的组分：可电离脂质分子40％-80％，聚乙二醇功能化脂质5％-30％，类固醇10-40％。

根据本发明优选的，所述可电离脂质分子由烷基丙烯酸酯与胺基烃类经迈克尔加成反应制备得到。

优选的，烷基丙烯酯结构中的烷基碳原子数为1-20；优选为丙烯酸十四烷基酯。

优选的，胺基烃类结构中的烃基选自饱和或不饱和、支化或未支化的碳原子数为8-20的烃基，胺基烃类结构中的胺基数为1-5。优选的，胺基烃类为精胺、亚精胺、三(2-氨基乙基)胺、1,4-双(3-氨丙基)哌嗪、N,N-双(3-氨丙基)甲胺或N,N-二甲基亚二丙基三胺。最优选的为精胺。

优选的，胺基烃类与烷基丙烯酯的摩尔比为1：1-6。优选的，胺基烃类与烷基丙烯酯的摩尔比为1：5。

优选的，可电离脂质分子的制备方法包括步骤：将烷基丙烯酸酯与胺基烃类混合均匀，经迈克尔加成反应得到可电离脂质分子。

进一步优选的，加成反应温度为80℃-100℃，反应时间为48-72小时，反应是在搅拌条件下进行的。进一步优选的，加成反应温度为85℃-95℃，反应时间为60-70小时。

进一步优选的，加成反应需要避光进行。

进一步优选的，加成反应所得反应液的后处理方法包括步骤：将反应液于无水乙醇中透析处理，然后经干燥得到可电离脂质分子。

根据本发明优选的，所述可电离脂质分子具有如下所示结构：

根据本发明优选的，聚乙二醇功能化脂质选自1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)-2000]、1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基-聚乙二醇2000、d-α琥珀酸生育酚聚乙二醇酯或二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000中的一种。优选的，聚乙二醇功能化脂质为1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基-聚乙二醇2000。

根据本发明优选的，类固醇选自胆固醇、β-谷甾醇、豆甾醇、谷甾醇、豆甾烷醇、谷甾烷醇、麦角固醇、胆甾烷醇、脱氢胆固醇、二氢胆固醇、羟基胆固醇或岩皂甾醇中的一种。优选的，类固醇选自胆固醇、β-谷甾醇、豆甾醇、豆甾烷醇、麦角固醇或岩皂甾醇中的一种。最优选的，所述类固醇为胆固醇。

本发明第二方面，提供一种脂质纳米颗粒的制备方法，包括步骤：将可电离脂质分子、聚乙二醇功能化脂质、类固醇溶解于乙醇溶剂中得到脂质预混溶液；在室温、涡旋条件下，将脂质预混溶液滴加至缓冲液中，得到脂质纳米颗粒溶液。

根据本发明优选的，脂质预混溶液中，可电离脂质分子的质量浓度为10-100mg/ml。优选的，脂质预混溶液中，可电离脂质分子的质量浓度为22.3mg/ml。

根据本发明优选的，缓冲液为醋酸-醋酸钠缓冲液，所述缓冲液pH为4-6。优选的，缓冲液pH为5.4。

根据本发明优选的，脂质预混溶液和缓冲液的体积比为1：25-35，优选为1:26。

根据本发明优选的，脂质预混溶液匀速逐滴滴加至缓冲液中；滴加完毕后，继续涡旋1-2分钟；室温静置10-30分钟，得到脂质纳米颗粒溶液。

根据本发明优选的，脂质纳米颗粒溶液可经干燥得到脂质纳米颗粒。

本发明第三方面，提供一种阴离子聚合物协同脂质纳米颗粒核酸递送系统，包括组分：脂质纳米颗粒、阴离子聚合物以及核酸类药物。

根据本发明优选的，所述阴离子聚合物选自聚-L-谷氨酸钠、海藻酸钠、葡聚糖硫酸钠、聚丙烯酸钠、透明质酸钠、肝素钠、羧甲基纤维素钠盐或羧甲基葡聚糖钠盐中的一种。优选的，所述阴离子聚合物为聚-L-谷氨酸钠、海藻酸钠、葡聚糖硫酸钠、透明质酸钠、肝素钠或羧甲基葡聚糖钠盐中的一种。更优选的，所述阴离子聚合物为聚-L-谷氨酸钠、葡聚糖硫酸钠或肝素钠中的一种。

根据本发明优选的，所述核酸类药物选自信使RNA(mRNA)、小干扰RNA(siRNA)、微小RNA(microRNA)、反义寡核苷酸(ASO)、DNA或核酸适配体。优选的，所述核酸类药物为绿色荧光蛋白mRNA(mEGFP)或荧光素酶mRNA(mFluc)。

根据本发明优选的，所述脂质纳米颗粒与核酸类药物的质量比为10-40:1。优选的，所述脂质纳米颗粒与核酸类药物的质量比为30:1。

根据本发明优选的，所述核酸类药物与阴离子聚合物的电荷比为1:0.1-20。优选的，所述核酸类药物与阴离子聚合物的电荷比为1:0.2-10。所述核酸类药物与阴离子聚合物的电荷比是指：每摩尔核酸类药物所带电荷数与每摩尔阴离子聚合物所带电荷数之比。

本发明第四方面，提供上述阴离子聚合物协同脂质纳米颗粒核酸递送系统的制备方法，包括步骤：将阴离子聚合物和核酸类药物溶液充分混合均匀，加入脂质纳米颗粒溶液混合均匀，室温静置，得到阴离子聚合物协同脂质纳米颗粒核酸递送系统。

根据本发明优选的，核酸类药物溶液的溶剂为无酶水，核酸类药物溶液的质量浓度为0.01-10mg/ml；优选的，核酸类药物溶液的质量浓度为0.1-1mg/ml。

根据本发明优选的，脂质纳米颗粒溶液为脂质纳米颗粒的乙醇溶液或脂质纳米颗粒的乙醇-缓冲液溶液；脂质溶液的质量浓度为0.5-2mg/ml；优选的，脂质纳米颗粒溶液的质量浓度为1.25mg/ml。优选的，脂质纳米颗粒的乙醇-缓冲液溶液中，缓冲液为醋酸-醋酸钠缓冲液，缓冲液pH为4-6，优选pH为5.4；乙醇和缓冲液的体积比为1：25-35，优选为1:30。

根据本发明优选的，室温静置时间为10-30分钟。

本发明第五方面，提供上述脂质纳米颗粒在具有预防性或治疗性的核酸递送载体中的应用。

本发明第六方面，提供上述脂质纳米颗粒或阴离子聚合物协同脂质纳米颗粒核酸递送系统在预防或治疗疾病药物中的应用。

本发明第七方面，提供上述脂质纳米颗粒或阴离子聚合物协同脂质纳米颗粒核酸递送系统在对象中诱导蛋白质表达的药物中的应用。优选的，所述对象是哺乳动物。

根据本发明优选的，所述给药方式包括：静脉注射、肌肉注射、气管给药、皮下注射或口服。

本发明的技术特点及有益效果如下：

1、本发明可电离脂质分子由烷基丙烯酯和胺基烃类经迈克尔加成所得，原料简单易得，制备步骤简单高效，对设备要求低，反应条件温和，纯化方式简单。烷基丙烯酯优选为十四烷基丙烯酯，胺基烃类优选为精胺，所得到的可电离脂质分子在后续的应用中转染效果最好，递送核酸类药物效果最佳。

2、本发明脂质纳米颗粒中，可电离脂质分子，作为脂质纳米颗粒中的核心成分，可促进细胞内吞和内涵体逃逸，从而增强转染效果；类固醇可增强脂质纳米颗粒的稳定性；而聚乙二醇功能化脂质裸露在脂质纳米颗粒表面，通过降低颗粒聚集进一步促进颗粒稳定性，并且可以减少肾脏和单核吞噬细胞系统介导的清除，增强药物的递送效果。故其配方即可电离脂质、类固醇和聚乙二醇功能化脂质三者的种类以及配比关系对药物递送效率具有一定影响。本发明脂质纳米颗粒中，可电离脂质分子、类固醇与聚乙二醇功能化脂质三者种类合适，配比适宜，最后制备出的脂质纳米颗粒才能在后续应用中效果佳。

3、本发明阴离子聚合物协同脂质纳米颗粒核酸递送系统在递送核酸类药物时具有诸多优点。首先，由于脂质纳米颗粒对核酸类药物具有良好的包封效率以及稳定性，这种系统可以有效地避免核酸药物未到达作用位点即降解的问题，即，使得核酸类药物具有良好的稳定性。其次，通过阴离子电性排斥的作用，可以促进核酸类药物在细胞内的释放，显著提高核酸药物递送效率以及转染效率，能够充分发挥核酸药物的治疗疗效。因此针对提高递送效率与增强转染效果，阴离子聚合物的用量及种类起重要作用。本发明中，当阴离子聚合物用量较少时，核酸递送系统被细胞内吞后，由于阴离子聚合物少，电性斥力弱，有效释放出的mRNA少；而当阴离子聚合物用量较多时，由于电性作用过大，导致脂质纳米颗粒对核酸类药物包封效率低，最终递送效果不好。因此阴离子聚合物的用量需适当，以使包封效率较高，转染效果较佳。另外不同的阴离子聚合物对纳米颗粒核酸递送系统也有不同的影响，本发明筛选了一系列阴离子聚合物，其中含有葡聚糖硫酸钠的核酸递送系统在体内外表现最为突出。最后，本发明药物递送系统具有良好的生物安全性。因此，本发明基于阴离子聚合物协同脂质纳米颗粒核酸递送系统在肿瘤学、基因治疗等领域都具有广泛应用前景。

附图说明

图1为实施例3-8和对比例1所得核酸递送系统中脂质纳米颗粒-阴离子聚合物-mRNA复合物的粒径、zeta电势表征图。

图2为实施例3-8和对比例1所得核酸递送系统的RNA包封效率图。

图3为试验例3中核酸递送系统在HeLa细胞内的荧光信号图，来表示该复合物的核酸递送效果。

图4A为试验例4中静脉注射DiR标记的核酸递送系统6小时后，小鼠活体及离体组织(心、肝、脾、肺、肾)荧光成像图；

图4B为试验例4中静脉注射DiR标记的核酸递送系统6小时后，小鼠离体组织(心、肝、脾、肺、肾)荧光定量分析图；

图5A为试验例4中静脉注射核酸递送系统(荧光素酶mRNA)6小时后，小鼠活体及离体组织(心、肝、脾、肺、肾)生物发光成像图；

图5B为试验例4中静脉注射核酸递送系统(荧光素酶mRNA)6小时后，小鼠活体及离体组织(心、肝、脾、肺、肾)生物发光定量分析图；

图6为试验例5中核酸递送系统细胞存活率评估图；

图7为试验例6中核酸递送系统经全身给药24h后心肝脾肺肾的病理学评价图。

具体实施方式

下面提供的案例是为了更好地说明本发明，但并不限定本发明的范围。

同时，除非特别说明，下面案例中使用的实验方法为常规方法，所使用的试剂和材料可以从商业渠道获得。

实施例1

一种用于核酸递送的可电离脂质分子的制备方法，步骤如下：

在避光条件下，将精胺和丙烯酸十四烷基酯以摩尔比1:5混合均匀，在90℃下搅拌反应65小时。将反应液于无水乙醇中透析处理，然后经烘干得到可电离脂质分子。

实施例2

一种用于核酸递送的脂质纳米颗粒，包括如下质量百分比的组分组成：可电离脂质分子(实施例1)66％，聚乙二醇功能化脂质(1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基-聚乙二醇2000，DMG-PEG)17％，类固醇(胆固醇)17％。

制备步骤如下：

将实施例1中可电离脂质分子的乙醇溶液、DMG-PEG乙醇溶液与胆固醇的乙醇溶液按比例混合均匀，得到脂质预混溶液；其中，可电离脂质分子的质量浓度为22.3mg/ml。在室温、涡旋条件下，按照预混溶液和缓冲液体积比为1:26的比例，将预混溶液匀速逐滴加入pH5.4的醋酸-醋酸钠缓冲液中，滴加完毕后继续涡旋1分钟，室温静置15分钟，得到浓度为1.25mg/ml的脂质纳米颗粒的胶体溶液LNP。

脂质纳米颗粒的胶体溶液LNP可经干燥得到脂质纳米颗粒。

实施例3

一种阴离子聚合物协同脂质纳米颗粒核酸递送系统的制备方法，包括步骤：

将阴离子聚-L-谷氨酸钠PGA(电荷密度为6.62nmol/μg)与mRNA的无酶水溶液(0.1mg/ml或1mg/ml，mRNA电荷密度为3.15nmol/μg)分别按照mRNA和阴离子聚-L-谷氨酸钠PGA的电荷比1:0.2、1:1、1:5、1:10混合均匀，得到阴离子聚合物与mRNA的混合液，再将实施例2方法制备的脂质纳米颗粒的胶体溶液LNP加入至混合液中，并迅速混合均匀，室温静置15分钟，得到阴离子聚合物协同脂质纳米颗粒核酸递送系统，命名为LNP-PGA-mRNA(或PGA)。其中，脂质纳米颗粒与mRNA的质量比为30：1。

实施例4

一种阴离子聚合物协同脂质纳米颗粒核酸递送系统的制备方法，如实施例3所述，所不同的是：阴离子聚合物为海藻酸钠AA(电荷密度为5.05nmol/μg)；其它步骤或条件同实施例3。所得阴离子聚合物协同脂质纳米颗粒核酸递送系统命名为LNP-AA-mRNA(或AA)。

实施例5

一种阴离子聚合物协同脂质纳米颗粒核酸递送系统的制备方法，如实施例3所述，所不同的是：阴离子聚合物为葡聚糖硫酸钠DSS(电荷密度为5.38nmol/μg)；其它步骤或条件同实施例3。所得阴离子聚合物协同脂质纳米颗粒核酸递送系统命名为LNP-DSS-mRNA(或DSS)。

实施例6

一种阴离子聚合物协同脂质纳米颗粒核酸递送系统的制备方法，如实施例3所述，所不同的是：阴离子聚合物为透明质酸钠HA(电荷密度为2.49nmol/μg)；其它步骤或条件同实施例3。所得阴离子聚合物协同脂质纳米颗粒核酸递送系统命名为LNP-HA-mRNA(或HA)。

实施例7

一种阴离子聚合物协同脂质纳米颗粒核酸递送系统的制备方法，如实施例3所述，所不同的是：阴离子聚合物为肝素钠HS(电荷密度为3.91nmol/μg)；其它步骤或条件同实施例3。所得阴离子聚合物协同脂质纳米颗粒核酸递送系统命名为LNP-HS-mRNA(或HS)。

实施例8

一种阴离子聚合物协同脂质纳米颗粒核酸递送系统的制备方法，如实施例3所述，所不同的是：阴离子聚合物为羧甲基葡聚糖钠盐DS(电荷密度为1.74nmol/μg)；其它步骤或条件同实施例3。所得阴离子聚合物协同脂质纳米颗粒核酸递送系统命名为LNP-DS-mRNA(或DS)。

对比例1

一种核酸递送系统的制备方法，包括步骤：

将mRNA的无酶水溶液(0.1mg/ml或1mg/ml)和实施例2方法制备的脂质纳米颗粒的胶体溶液LNP迅速混合均匀，室温静置15分钟，得到核酸递送系统，命名为LNP-mRNA(或nopolymer)。其中，脂质纳米颗粒与mRNA的质量比为30：1。

试验例1

对实施例3-8和对比例1(核酸递送系统制备方法中，mRNA的无酶水溶液的浓度为0.1mg/ml)所得核酸递送系统进行表征，如图1所示，所得复合物均为球形，水合粒径在150-250nm范围内，且分布较为均一，ζ电势随阴离子聚合物组分的增加而降低，并且在mRNA与阴离子聚合物电荷比1:10时，ζ电势均为负值。这说明此时阴离子聚合物过量加入，可能会影响后续试验中脂质纳米颗粒对核酸的包封效率以及细胞内吞效果。

试验例2

对实施例3-8和对比例1(核酸递送系统制备方法中，mRNA的无酶水溶液的浓度为0.1mg/ml)所得核酸递送系统的RNA包封效率进行测量，如图2所示，在mRNA与阴离子聚合物电荷比为1：1和1：0.2时，包封效率均超过80％。另外在mRNA与阴离子聚合物电荷比为1：1和1：0.2时，DSS、HS、PGA、AA、HA包封效率更优，均在90％以上。在mRNA与阴离子聚合物电荷比为1：5和1：10时，各组包封效率均有不同程度的下降，可能是由于加入过多的阴离子聚合物，导致负电荷过大，降低了脂质纳米颗粒对核酸的包封效果。

试验例3

对实施例3-8和对比例1(核酸递送系统制备方法中，mRNA的无酶水溶液的浓度为0.1mg/ml)所得核酸递送系统以0.2μg/ml的mRNA浓度对HeLa细胞进行处理，其中所述mRNA为EGFP mRNA。在37℃、5％CO₂条件下静置24小时后，用荧光显微镜记录mEGFP在HeLa细胞中的表达情况，并用流式细胞仪对荧光进行定量分析。

如图3所示，在mRNA与阴离子聚合物电荷比为1：1时，相较于no polymer组，DSS、HS、PGA三组荧光信号值大大增强，为no polymer组的2-5倍左右，同时其效果亦明显优于HA、AA、DS。在效果最为明显的DSS组中，荧光信号值先随mRNA与阴离子聚合物电荷比降低而增强，在电荷比为1：1时达到最高值，而后随电荷比持续降低而降低，这可能是由于在电荷比1：5、1：10时，负电荷过多，包封效果不佳，所负载的mRNA减少；在细胞内吞时，过多的负电荷难以与带负电的细胞膜结合，从而导致转染效果不佳。PGA、HS这两组亦有相同的趋势。即电荷比为1：1时，核酸药物递送效果最佳，转染效果最优。

试验例4

根据试验例3的实验结果，选取试验例3中所得核酸递送系统LNP-DSS-mRNA、LNP-HS-mRNA、LNP-PGA-mRNA以及LNP-mRNA(上述核酸递送系统的制备方法中，阴离子聚合物与mRNA的电荷比均为1：1，mRNA的无酶水溶液的浓度为1mg/ml)进行小鼠体内实验。以0.2mg/kg的mRNA剂量将核酸递送系统经静脉注入小鼠体内，其中所述mRNA为荧光素酶mRNA。静脉注射6小时后观察核酸递送系统在小鼠心、肝、脾、肺、肾各器官中的聚集情况与表达效果。如图4AB中所示，使用DiR荧光分子标记了脂质纳米颗粒，然后通过活体荧光成像技术对小鼠进行观察，并比较其荧光信号的强度。此外，还通过离体荧光成像观察了基于阴离子聚合物的脂质纳米颗粒与mRNA复合物在不同器官中的聚集情况，并对各器官中的荧光信号进行了定量分析。结果显示，较对比例no polymer，DSS、HS、PGA三组荧光信号均增强，同时与nopolymer组相同的是，DSS、HS、PGA三组核酸递送系统均在肝脾两个器官中分布，其中大量位于肝脏，这说明添加阴离子聚合物组分后，并未显著改变脂质纳米颗粒在各个组织中的分布，并且能够更多地在肝脏中聚集。

为了研究核酸递送系统在各个器官中的转化效率，以0.2mg/kg的mRNA剂量将核酸递送系统LNP-DSS-mRNA、LNP-HS-mRNA、LNP-PGA-mRNA以及LNP-mRNA(上述核酸递送系统的制备方法中，阴离子聚合物与mRNA的电荷比均为1：1，mRNA的无酶水溶液的浓度为1mg/ml)经静脉注入小鼠体内，其中所述mRNA为荧光素酶mRNA(mLuc)；并在6小时后在小鼠的皮下注射促荧光素酶底物，15分钟内观察各个器官中的生物发光信号。如图5AB中所示，使用小动物成像仪拍摄小鼠活体及离体组织(心、肝、脾、肺、肾)的生物发光信号，并对其进行定量分析，以此来评价脂质纳米颗粒-阴离子聚合物-mRNA及脂质纳米颗粒-mRNA复合物对于体内mLuc的转染效果。由结果可知，较对比例no polymer组，添加阴离子聚合物组分DSS、HS、PGA后，体内转染效果增强了2-5倍。其中DSS、HS两组信号值较no polymer组增强5倍左右，表达效果增强明显，故DSS、HS组递送系统更优。由此可得，基于阴离子聚合物的脂质纳米颗粒核酸递送系统在体内具有优异的转染效果。

试验例5

对实施例3-8(上述核酸递送系统的制备方法中，阴离子聚合物与mRNA的电荷比为1：1、1：10，mRNA的无酶水溶液的浓度为0.1mg/ml)所得核酸递送系统进行体外生物安全性评价。将HeLa细胞与脂质纳米颗粒-阴离子聚合物-核酸复合物在37℃下进行共同孵育。24小时后，用CCK-8法检测HeLa细胞活性。如图6所示，细胞存活率均在80％以上，表明本发明的基于阴离子聚合物的脂质纳米颗粒在细胞上具有良好的生物安全性能。

试验例6

将实施例5(上述核酸递送系统的制备方法中，阴离子聚合物与mRNA的电荷比为1：1，mRNA的无酶水溶液的浓度为1mg/ml)和对比例1制备的核酸递送系统进行体内生物安全性评价。

将核酸递送系统按照0.2mg/kg的mRNA剂量静脉注入小鼠体内，24小时后，对小鼠的心、肝、脾、肺、肾进行H&E染色以进行病理学检查。如图7所示，与未经处理的小鼠与脂质纳米颗粒-核酸复合物相比，经脂质纳米颗粒-阴离子聚合物(DSS)-核酸复合物处理的小鼠各器官均未出现明显病变，表明本发明的基于阴离子聚合物的脂质纳米颗粒在实现有效转染的剂量下在体内具有良好的生物安全性。

Claims

1.一种脂质纳米颗粒，其特征在于，包括如下质量百分比的组分：可电离脂质分子40％-80％，聚乙二醇功能化脂质5％-30％，类固醇10-40％。

2.根据权利要求1所述脂质纳米颗粒，其特征在于，所述可电离脂质分子由烷基丙烯酸酯与胺基烃类经迈克尔加成反应制备得到；

优选的，烷基丙烯酯结构中的烷基碳原子数为1-20；优选为丙烯酸十四烷基酯；

优选的，胺基烃类结构中的烃基选自饱和或不饱和、支化或未支化的碳原子数为8-20的烃基，胺基烃类结构中的胺基数为1-5；进一步优选的，胺基烃类为精胺、亚精胺、三(2-氨基乙基)胺、1,4-双(3-氨丙基)哌嗪、N,N-双(3-氨丙基)甲胺或N,N-二甲基亚二丙基三胺；最优选的为精胺；

优选的，胺基烃类与烷基丙烯酯的摩尔比为1：1-6；进一步优选的，胺基烃类与烷基丙烯酯的摩尔比为1：5；

优选的，所述可电离脂质分子具有如下所示结构：

3.根据权利要求1所述脂质纳米颗粒，其特征在于，包括以下条件中的一项或多项：

i、聚乙二醇功能化脂质选自1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)-2000]、1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基-聚乙二醇2000、d-α琥珀酸生育酚聚乙二醇酯或二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000中的一种；优选的，聚乙二醇功能化脂质为1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基-聚乙二醇2000；

ii、类固醇选自胆固醇、β-谷甾醇、豆甾醇、谷甾醇、豆甾烷醇、谷甾烷醇、麦角固醇、胆甾烷醇、脱氢胆固醇、二氢胆固醇、羟基胆固醇或岩皂甾醇中的一种；优选的，类固醇选自胆固醇、β-谷甾醇、豆甾醇、豆甾烷醇、麦角固醇或岩皂甾醇中的一种；最优选的，所述类固醇为胆固醇。

4.如权利要求1-3任意一项所述脂质纳米颗粒的制备方法，包括步骤：将可电离脂质分子、聚乙二醇功能化脂质、类固醇溶解于乙醇溶剂中得到脂质预混溶液；在室温、涡旋条件下，将脂质预混溶液滴加至缓冲液中，得到脂质纳米颗粒溶液；

优选的，脂质预混溶液中，可电离脂质分子的质量浓度为10-100mg/ml；进一步优选的，脂质预混溶液中，可电离脂质分子的质量浓度为22.3mg/ml；

优选的，缓冲液为醋酸-醋酸钠缓冲液，所述缓冲液pH为4-6；进一步优选的，缓冲液pH为5.4；

优选的，脂质预混溶液和缓冲液的体积比为1：25-35，优选为1:26；

优选的，脂质预混溶液匀速逐滴滴加至缓冲液中；滴加完毕后，继续涡旋1-2分钟；室温静置10-30分钟，得到脂质纳米颗粒溶液；

优选的，脂质纳米颗粒溶液可经干燥得到脂质纳米颗粒。

5.一种阴离子聚合物协同脂质纳米颗粒核酸递送系统，其特征在于，包括组分：脂质纳米颗粒、阴离子聚合物以及核酸类药物。

6.根据权利要求5所述阴离子聚合物协同脂质纳米颗粒核酸递送系统，其特征在于，包括以下条件中的一项或多项：

i、所述阴离子聚合物选自聚-L-谷氨酸钠、海藻酸钠、葡聚糖硫酸钠、聚丙烯酸钠、透明质酸钠、肝素钠、羧甲基纤维素钠盐或羧甲基葡聚糖钠盐中的一种；优选的，所述阴离子聚合物为聚-L-谷氨酸钠、海藻酸钠、葡聚糖硫酸钠、透明质酸钠、肝素钠或羧甲基葡聚糖钠盐中的一种；更优选的，所述阴离子聚合物为聚-L-谷氨酸钠、葡聚糖硫酸钠或肝素钠中的一种；

ii所述核酸类药物选自信使RNA(mRNA)、小干扰RNA(siRNA)、微小RNA(microRNA)、反义寡核苷酸(ASO)、DNA或核酸适配体；优选的，所述核酸类药物为绿色荧光蛋白mRNA(mEGFP)或荧光素酶mRNA(mFluc)；

iii、所述脂质纳米颗粒与核酸类药物的质量比为10-40:1；优选的，所述脂质纳米颗粒与核酸类药物的质量比为30:1；

iv、所述核酸类药物与阴离子聚合物的电荷比为1:0.1-20；优选的，所述核酸类药物与阴离子聚合物的电荷比为1:0.2-10。

7.如权利要求5-6任意一项所述阴离子聚合物协同脂质纳米颗粒核酸递送系统的制备方法，包括步骤：将阴离子聚合物和核酸类药物溶液充分混合均匀，加入脂质纳米颗粒溶液混合均匀，室温静置，得到阴离子聚合物协同脂质纳米颗粒核酸递送系统；

优选的，核酸类药物溶液的溶剂为无酶水，核酸类药物溶液的质量浓度为0.01-10mg/ml；进一步优选的，核酸类药物溶液的质量浓度为0.1-1mg/ml；

优选的，脂质纳米颗粒溶液为脂质纳米颗粒的乙醇溶液或脂质纳米颗粒的乙醇-缓冲液溶液；脂质溶液的质量浓度为0.5-2mg/ml；进一步优选的，脂质纳米颗粒溶液的质量浓度为1.25mg/ml；进一步优选的，脂质纳米颗粒的乙醇-缓冲液溶液中，缓冲液为醋酸-醋酸钠缓冲液，缓冲液pH为4-6，优选pH为5.4；乙醇和缓冲液的体积比为1：25-35，优选为1:30；

优选的，室温静置时间为10-30分钟。

8.如权利要求1-3任意一项所述脂质纳米颗粒在具有预防性或治疗性的核酸递送载体中的应用。

9.如权利要求1-3任意一项所述脂质纳米颗粒或权利要求5-6任意一项所述阴离子聚合物协同脂质纳米颗粒核酸递送系统在预防或治疗疾病药物中的应用。

10.如权利要求1-3任意一项所述脂质纳米颗粒或权利要求5-6任意一项所述阴离子聚合物协同脂质纳米颗粒核酸递送系统在对象中诱导蛋白质表达的药物中的应用；优选的，所述对象是哺乳动物。