CN117917998A - 用于确定流式细胞仪中光信号的光电检测器增益校正因子的方法 - Google Patents
用于确定流式细胞仪中光信号的光电检测器增益校正因子的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本公开的方面包括用于确定应用于流式细胞仪数据的光电检测器增益校正因子的方法。根据某些实施方案的方法包括跨过流动流的水平轴线的光检测系统检测光，在光检测系统的光电检测器通道(例如，成像光电检测器通道)中在跨过流动流的多个位置生成数据信号，以及响应于所生成的数据信号计算跨过流动流的每个位置的检测器增益校正因子。方法还包括将检测器增益校正因子应用于来自光电检测器通道(例如，非成像光电检测器通道)的数据信号，以生成经调整的信号强度。还描述了具有光源和光检测系统的系统(例如，粒子分析仪)，该光检测系统包括用于实施主题方法的光电检测器(例如，成像光电检测器)。还提供了非暂时性计算机可读存储介质和集成电路(例如FPGA)。
Description
相关申请的交叉引用
根据35U.S.C.§119(e)，本申请要求2021年7月13日提交的美国临时专利申请序列号63/221,277的申请日的优先权；该申请的公开内容通过引用以其整体并入本文。
引言
光检测通常用于表征样品(例如生物样品)的组分，例如当样品用于疾病或医学状况的诊断时。当样品被照射时，光可以被样品散射、透射通过样品以及由样品发射(例如，通过荧光)。样品组分的变化(例如形态、吸收率和荧光标记物的存在)可能会导致由样品散射、透射或发射的光发生变化。这些变化可以用于表征和识别样品中组分的存在。为了量化这些变化，光被收集并引导至检测器的表面。
一种利用光检测来表征样品中组分的技术是流式细胞术。流式细胞仪包括由光学器件、光电检测器和电子器件组成的光电检测系统，其能够有效地检测光信号并将其转换为相应的电信号。对电子信号进行处理以获得用户可以用来执行所需分析的参数。流式细胞仪包括不同类型的光电检测器来检测荧光信号。当光信号(从流式细胞仪中被分析的荧光样品中发出)入射到光电检测器上时，在其输出端生成与入射光信号成比例的电信号。光电检测器的增益由输出信号与输入信号的比决定。光电检测器的增益可以用于控制通过光电检测器的检测的操作范围，例如确保样品荧光以高置信度显示在光电检测器的操作范围内。
典型地，光电检测器的增益与电压正相关，使得可以通过调制施加到光电检测器的电压来控制光电检测器的增益。然而，这种相关性因许多参数而变得复杂，参数包括光电检测器的类型、入射光的波长以及温度。此外，流式细胞仪的光学部件的未对准或像差或机械光学漂移会导致来自光电检测器的信号强度的变化。用于照射样品的不同激光束在跨过流动流芯宽度(flow stream core width)的光束轮廓可能具有很大的变化，并且也可能由于激光漂移和环境变化，激光束强度轮廓也会随时间而变化。这种变化在校准的且正常工作的流式细胞仪中是不可接受的。
发明内容
本公开的方面包括用于确定应用于流式细胞仪数据的光电检测器增益校正因子的方法。根据某些实施方案的方法包括跨过流动流的水平轴线的光检测系统检测光，在光检测系统的光电检测器通道(例如，成像光电检测器通道)中在跨过流动流的多个位置生成数据信号，以及响应于所生成的数据信号计算跨过流动流的每个位置的检测器增益校正因子。方法还包括将检测器增益校正因子应用于来自光电检测器通道(例如，非成像光电检测器通道)的数据信号，以生成经调整的信号强度。还描述了具有光源和光检测系统的系统(例如，粒子分析仪)，所述光检测系统包括用于实施主题方法的光电检测器(例如，成像光电检测器)。还提供了非暂时性计算机可读存储介质和集成电路(例如FPGA)。
在实施主题方法时，跨过流动流的水平轴线检测光。在一些实例中，在跨过流动流的多个位置检测光。在某些实例中，在跨过流动流的多个位置同时检测光。在一些实施方案中，在成像光电检测器通道中在跨过流动流的多个位置生成数据信号。在某些实施方案中，响应于跨过流动流检测到的光，在光检测系统的成像光电检测器通道中生成数据信号。在一些实施方案中，在成像光电检测器通道中在跨过流动流的多个像素位置生成数据信号。数据信号可以在25个或更多像素位置(例如100个或更多像素位置，并且包括250个或更多像素位置)生成。在一些实例中，在每个像素位置确定数据信号的强度。在某些实例中，该方法包括基于通用数据信号来确定每个像素位置的峰值脉冲幅度。在某些实例中，该方法包括确定在每个像素位置的生成的数据信号的脉冲面积。在一些实施方案中，光检测系统包括光学耦合到一个或多个狭缝的光电检测器。在一些实例中，数据信号在多个光电检测器通道中针对跨过流动流的每个位置生成。在某些实例中，光检测系统包括光学耦合到具有多个开口的狭缝的光电检测器。在某些实例中，响应于在狭缝的多个开口中的每个开口之间检测到的光，在多个光电检测器通道中生成数据信号。
在一些实施方案中，该方法包括确定跨过流动流的多个位置的检测器增益校正因子，例如通过使用来自每个像素位置的成像检测器通道的计算的增益校正因子。在一些实例中，检测器增益校正因子是对每个像素位置的信号强度的调整，使得跨过流动流的数据信号之间的强度变化为5％或更小，例如3％或更小。在其他情况下，检测器增益校正因子是对每个像素位置的峰值脉冲幅度的调整，使得跨过流动流的峰值脉冲幅度之间的变化为5％或更小，例如3％或更小。在其他情况下，检测器增益校正因子是对每个像素位置的生成的数据信号的脉冲面积的调整，使得跨过流动流的脉冲面积之间的变化为5％或更小，例如3％或更小。在某些实施方案中，方法包括确定跨过流动流的像素位置之间的信号强度的变化，例如通过基于每个像素位置确定的数据信号强度来计算稳健变化系数(rCV)。
在一些实施方案中，所述方法包括将检测器增益校正因子应用于在光检测系统的一个或多个非成像光电检测器通道中生成的数据信号。在一些实例中，基于来自成像光电检测器通道的增益校正因子和来自非成像光电检测器通道的信号强度来计算对在一个或多个非成像光电检测器通道中生成的数据信号的检测器增益校正因子。在某些实施方案中，方法包括基于在每个像素位置确定的检测器增益校正因子来生成检测器增益校正因子数据文件。在一些实例中，数据增益校正因子数据文件包括从成像光电检测器通道确定的每个像素位置的检测器增益校正因子的表格。在一些实例中，方法包括将检测器增益校正因子数据文件应用于来自光检测系统的一个或多个非成像光电检测器通道的生成的数据信号。
本公开的方面还包括具有包括光电检测器(例如成像光电检测器)的光检测系统的系统(例如粒子分析仪)。在一些实施方案中，光检测系统被配置成跨过流动流的水平轴线检测光，并且在光电检测器通道中在跨过流动流的多个位置生成数据信号。在一些实施方案中，光检测系统包括光学耦合到一个或多个狭缝的光电检测器，例如光学耦合到具有多个开口的狭缝的光电检测器。在一些实施方案中，光检测系统被配置成响应于在狭缝的多个开口中的每个开口之间检测到的光，在多个光电检测器通道中生成数据信号。在某些实施方案中，光检测系统被配置成跨过流动流的水平轴线检测光，并且在成像光电检测器通道中在跨过流动流的多个像素位置(例如100个或更多像素位置，并且包括250个或更多像素位置)生成数据信号。在一些实例中，每个像素位置对应于跨过流动流的水平轴线的位置。在一些实施方案中，系统还包括处理器，所述处理器具有可操作地耦合到处理器的存储器，其中存储器包括存储在其上的指令，所述指令当由处理器执行时使得处理器响应于所生成的数据信号计算跨过流动流的每个像素位置的检测器增益校正因子。在一些实施方案中，该系统是粒子分析仪。在某些实例中，粒子分析仪被并入到流式细胞仪中，例如其中本文描述的一个或多个光电检测器被定位成检测来自流动流中粒子的光。
在一些实施方案中，该系统包括其上存储有指令的存储器，所述指令当由处理器执行时使得处理器确定在跨过流动流的每个位置(例如，在每个像素位置)的信号强度。在一些实例中，存储器包括用于基于通用数据信号来确定每个像素位置的峰值脉冲幅度的指令。在某些实例中，存储器包括用于确定每个像素位置所生成的数据信号的脉冲面积的指令。在一些实施方案中，存储器包括用于确定跨过流动流的多个位置的检测器增益校正因子的指令，例如通过使用来自每个像素位置的成像检测器通道的计算的增益校正因子。在一些实例中，存储器包括用于应用检测器增益校正因子作为对每个像素位置的信号强度的调整的指令，使得跨过流动流的数据信号之间的强度变化为5％或更小，例如3％或更小。在其他情况下，存储器包括用于应用检测器增益校正因子作为对每个像素位置的峰值脉冲幅度的调整的指令，使得跨过流动流的峰值脉冲幅度之间的变化为5％或更小，例如3％或更小。在其他情况下，存储器包括用于应用检测器增益校正因子作为对每个像素位置生成的数据信号的脉冲面积的调整的指令，使得跨过流动流的脉冲面积之间的变化为5％或更小，例如3％或更小。在某些实施方案中，存储器包括用于基于在每个像素位置的经确定的检测器增益校正因子来生成检测器增益校正因子数据文件的指令。在一些实例中，检测器增益校正因子数据文件存储在存储器中。在某些实施方案中，该系统包括其上存储有指令的存储器，所述指令当由处理器执行时使得处理器确定跨过流动流的像素位置之间的信号强度的变化，例如通过基于每个像素位置的确定的数据信号强度来计算稳健变化系数(rCV)。
本公开的方面还包括用于确定应用于流式细胞仪数据的光电检测器增益校正因子的非暂时性计算机可读存储介质。在实施方案中，非暂时性计算机可读存储介质包括用于利跨过流动流的水平轴线的光检测系统检测光的算法、用于在光检测系统的光电检测器通道(例如成像光电检测器通道)中在跨过流动流的多个位置(例如像素位置)生成数据信号的算法以及用于响应于所生成的数据信号计算跨过流动流的每个位置(例如像素位置)的检测器增益校正因子的算法。在一些实例中，非暂时性计算机可读存储介质包括用于在跨过流动流的多个位置同时检测光的算法。
在某些实施方案中，非暂时性计算机可读存储介质包括用于确定每个像素位置的生成的数据信号的强度的算法。在其他实施方案中，非暂时性计算机可读存储介质包括用于基于所生成的数据信号来确定每个像素位置的峰值脉冲幅度的算法。在其他实施方案中，非暂时性计算机可读存储介质包括用于确定每个像素位置的生成的数据信号的脉冲面积的算法。
在一些实施方案中，非暂时性计算机可读存储介质包括用于将检测器增益校正因子应用于在光检测系统的一个或多个非成像光电检测器通道中生成的数据信号的算法。在一些实例中，非暂时性计算机可读存储介质包括用于基于来自成像光电检测器通道的增益校正因子和来自非成像光电检测器通道的信号强度来计算在一个或多个非成像光电检测器通道中生成的数据信号的增益校正因子的算法。在一些实例中，非暂时性计算机可读存储介质包括用于对每个像素位置的信号强度施加调整，使得跨过流动流的数据信号之间的强度变化为5％或更小，例如3％或更小的算法。在一些实例中，非暂时性计算机可读存储介质包括用于对每个像素位置的峰值脉冲幅度施加调整，使得跨过流动流的峰值脉冲幅度之间的变化为5％或更小，例如3％或更小的算法。在一些实例中，非暂时性计算机可读存储介质包括用于对每个像素位置生成的数据信号的脉冲面积施加调整，使得跨过流动流的脉冲面积之间的变化为5％或更小，例如3％或更小的算法。在某些实例中，非暂时性计算机可读存储介质包括用于确定跨过流动流的像素位置之间的信号强度的变化的算法，例如通过基于每个像素位置的经确定的数据信号强度来计算稳健变化系数(rCV)。在某些实施方案中，非暂时性计算机可读存储介质包括基于所确定的应用于每个像素位置的数据信号的检测器增益校正因子的检测器增益校正因子数据文件。在一些实例中，数据增益校正因子数据文件作为每个像素位置的检测器增益校正因子的表格存储在非暂时性计算机可读存储介质中。
本公开的方面还包括被编程用于处理流式细胞仪数据的集成电路。在实施方案中，集成电路包括用于将检测器增益校正因子应用于来自光检测系统的光电检测器通道的数据信号的编程。在一些实例中，集成电路是现场可编程门阵列(FPGA)。在一些实例中，集成电路包括专用集成电路(ASIC)。在一些实例中，集成电路包括复杂可编程逻辑器件(CPLD)。在一些实施方案中，集成电路包括用于将检测器增益校正因子应用于来自检测器增益校正因子数据文件的跨过流动流的每个位置(例如像素位置)的数据信号的编程。
在一些实施方案中，集成电路包括用于将检测器增益校正因子应用于在光检测系统的一个或多个非成像光电检测器通道中生成的数据信号的编程。在一些实例中，集成电路包括用于基于来自成像光电检测器通道的增益校正因子和来自非成像光电检测器通道的信号强度来计算在一个或多个非成像光电检测器通道中生成的数据信号的增益校正因子的编程。在一些实例中，集成电路包括用于对每个像素位置的信号强度施加调整的编程，使得跨过流动流的数据信号之间的强度变化为5％或更小，例如3％或更小。在一些实例中，集成电路包括用于对每个像素位置的峰值脉冲幅度施加调整的编程，使得跨过流动流的峰值脉冲幅度之间的变化为5％或更小，例如3％或更小。在一些实例中，集成电路包括用于对每个像素位置生成的数据信号的脉冲面积施加调整的编程，使得跨过流动流的脉冲面积之间的变化为5％或更小，例如3％或更小。在某些实施方案中，集成电路包括用于在每个像素位置应用来自检测器增益校正因子数据文件的检测器增益校正因子的编程。在某些实例中，数据增益校正因子数据文件被编程到集成电路中，作为每个像素位置的检测器增益校正因子的表格。
附图说明
当结合附图阅读时，从以下详细描述中可以最好地理解本发明。在附图中包括以下图：
图1描绘了根据某些实施方案的用检测器增益校正因子来调整来自光电检测器的数据信号。
图2示出了根据某些实施方案的将在成像光电检测器通道中生成的检测器增益校正因子应用于一个或多个非成像光电检测器通道。
图3描绘了根据某些实施方案的用于确定应用于流式细胞仪数据的检测器增益校正因子的流程图。
图4A描绘了根据某些实施方案的粒子分析系统的功能框图。图4B描绘了根据某些实施方案的流式细胞仪。
图5描绘了根据某些实施方案的粒子分析仪控制系统的一个实例的功能框图。
图6A描绘了根据某些实施方案的粒子分选系统的示意图。
图6B描绘了根据某些实施方案的粒子分选系统的示意图。
图7描绘了根据某些实施方案的计算系统的框图。
具体实施方式
本公开的方面包括用于确定应用于流式细胞仪数据的光电检测器增益校正因子的方法。根据某些实施方案的方法包括跨过流动流的水平轴线的光检测系统检测光，在光检测系统的光电检测器通道(例如，成像光电检测器通道)中在跨过流动流的多个位置生成数据信号，以及响应于所生成的数据信号计算跨过流动流的每个位置的检测器增益校正因子。方法还包括将检测器增益校正因子应用于来自光电检测器通道(例如，非成像光电检测器通道)的数据信号，以生成经调整的信号强度。还描述了具有光源和光检测系统的系统(例如，粒子分析仪)，所述光检测系统包括用于实施主题方法的光电检测器(例如，成像光电检测器)。还提供了非暂时性计算机可读存储介质和集成电路(例如FPGA)。
在更详细地描述本发明之前，应当理解，本发明不限于所描述的特定实施方案，因此当然可以变化。还应当理解，本文使用的术语仅仅是为了描述特定实施方案的目的，而不是旨在进行限制，因为本发明的范围仅由所附的权利要求来限定。
在提供数值范围的情况下，应当理解，除非上下文另有明确规定，否则该范围的上限和下限之间的每个中间值(至下限单位的十分之一)以及该范围内的任何其他规定值或中间值都包含在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围内，并且也涵盖在本发明内，受所陈述的范围中任何具体排除的限值的约束。在所陈述的范围包括一个或两个限值时，排除这些所包括的限值中的任一个或两个的范围也包括在本发明中。
本文中给出了某些范围，其中数值前面带有术语“约”。术语“约”在本文中用于为其前面的精确数字以及接近或近似该术语前面的数字提供字面支持。在确定数字是否接近或近似具体列举的数字时，接近或近似的未列举的数字可以是这样的数字，该数字在其出现的上下文中提供了具体列举的数字的基本等同物。
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管与本文所述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料也可以用于本发明的实践或测试中，但现在描述代表性的说明性方法和材料。
本说明书中引用的所有公开和专利均以引用的方式并入本文，如同每个单独的公开或专利被具体且单独地指示为通过引用并入并且通过引用并入本文以公开和描述与所引用的公开相关的方法和/或材料。任何公开的引用是由于其公开在提交日期之前，并且不应该被解释为承认本发明无权由于先前的发明而早于这些公开。此外，所提供的公开日期可能与实际公开日期不同，这可能需要单独确认。
应当注意，如本文和所附权利要求所用，除非上下文另外明确指示，否则单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指示物。还应当注意，权利要求可以被起草成排除任何任选要素。正因如此，该陈述旨在作为使用诸如“唯一地”、“仅”等与权利要求要素的详述有关的专用术语或使用“负”限制的前置基础。
如本领域技术人员在阅读本公开内容后将明显的是，在不脱离本发明的范围或精神的情况下，本文描述和示出的每个单独的实施方案都具有离散的部件和特征，这些部件和特征可以容易地与任何其他若干个实施方案的特征分离或组合。任何列举的方法都可以按照列举的事件的顺序或按照逻辑上可能的任何其他顺序进行。
虽然为了语法流畅性和功能性解释，已经描述或将要描述该设备和方法，但是应当清楚地理解，除非根据35U.S.C.§112明确表述，否则权利要求不应被解释为必然以任何方式受到“装置”或“步骤”限制的限制，而是应当符合根据等同物的司法原则由权利要求提供的定义的含义和等同物的全部范围，并且在权利要求根据35U.S.C.§112明确表述的情况下，将根据35U.S.C.§112给予完全的法定等同物。
如上所述，本公开提供了用于确定应用于流式细胞仪数据的光电检测器增益校正因子的方法。在进一步描述本公开的实施方案中，首先更详细地描述用于利跨过流动流的水平轴线的光检测系统检测光、在光检测系统的光电检测器通道中在跨过流动流的多个位置生成数据信号以及响应于所生成的数据信号计算跨过流动流的每个位置的检测器增益校正因子的方法。接下来，描述了包括光源和光检测系统的系统，该光检测系统具有用于实施主题方法的光电检测器。还描述了非暂时性计算机可读存储介质和集成电路。
用于确定光电检测器增益校正因子的方法
本公开的方面包括用于确定应用于流式细胞仪数据的光电检测器增益校正因子的方法。在一些实施方案中，方法包括计算跨过流动流的水平轴线的多个位置的检测器增益校正因子。在一些实例中，当将计算的检测器增益校正因子应用于响应于检测到的光而生成的数据信号时，主题方法提供了跨过流动流的减小的光电检测器信号强度变化。在一些实例中，当将计算的检测器增益校正因子应用于响应于检测到的光而生成的数据信号时，本文所述的检测器增益校正因子提供了减小的稳健变化系数(rCV)，例如其中rCV减小5％或更多，例如减小10％或更多，例如减小25％或更多，例如减小50％或更多，例如减小75％或更多，例如减小90％或更多，并且包括减小99％或更多。在某些实例中，应用所计算的检测器增益校正因子足以减少或消除由粒子分析仪或流式细胞仪中未对准的光学部件引起的光电检测器信号强度变化，例如在粒子分析仪或流式细胞仪的一个或多个激光器未对准的情况下。在其他情况下，应用所计算的检测器增益校正因子足以减少或消除由利用具有高斯或超高斯光束轮廓的光源(例如，激光)对流动流的照射引起的光电检测器信号强度变化。在某些实施方案中，主题方法提供了光检测系统的增加的信噪比，例如其中光检测系统的信噪比增加5％或更多，例如增加10％或更多，例如增加25％或更多，例如增加50％或更多，例如增加75％或更多，例如增加90％或更多，并且包括增加99％或更多。在某些实例中，主题方法将信噪比增加2倍或更多，例如增加3倍或更多，例如增加4倍或更多，例如增加5倍或更多，并且包括增加10倍或更多。在某些实施方案中，本公开的方法足以将强度检测和定量的范围拓宽2倍或更多，例如拓宽3倍或更多，例如拓宽5倍或更多，例如拓宽10倍或更多，例如拓宽25倍或更多，例如拓宽50倍或更多，并且包括拓宽100倍或更多。
在实施主题方法时，用光检测系统从流动流的水平轴线检测光。如下文更详细描述的，在一些实施方案中，来自流动流的光在成像光电检测器通道中在跨过流动流的多个位置被检测到。在一些实施方案中，方法包括照射穿过流动流传播的粒子，跨过5μm或更大，例如10μm或更大，例如15μm或更大，例如20μm或更大，例如25μm或更大，例如50μm或更大，例如75μm或更大，例如100μm或更大，例如250μm或更大，例如500μm或更大，例如750μm或更大的流动流的查询区域，例如如跨过1mm或更大，例如2mm或更大，例如3mm或更大，例如4mm或更大，例如5mm或更大，例如6mm或更大，例如7mm或更大，例如8mm或更大，例如9mm或更大并且包括10mm或更大的查询区域。在一些实例中，流动流中被照射的粒子是多光谱粒子，例如具有一种或多种荧光团的珠(下面将更详细地描述)。
在一些实施方案中，方法包括用连续波光源照射流动流中的粒子，例如其中光源提供不间断的光通量并且保持对流动流中粒子的照射，而光强度几乎没有不期望的变化。在一些实施方案中，连续光源发射非脉冲的照射或非频闪照射。在某些实施方案中，连续光源提供基本上恒定的发射的光强度。例如，方法可以包括用连续光源照射流动流中的粒子，所述连续光源在照射的时间间隔期间提供变化10％或更小，例如9％或更小，例如8％或更小，例如7％或更小，例如6％或更小，例如5％或更小，例如4％或更小，例如3％或更小，例如2％或更小，例如1％或更小，例如0.5％或更小，例如0.1％或更小，例如0.01％或更小，例如0.001％或更小，例如0.0001％或更小，例如0.00001％或更小的发射光强度，并且包括在照射的时间间隔期间发射的光强度变化0.000001％或更小的情况。光输出的强度可以用任何方便的方案来测量，包括但不限于扫描狭缝轮廓仪、电荷耦合器件(CCD，例如增强型电荷耦合器件ICCD)、定位传感器、功率传感器(例如热电堆功率传感器)、光功率传感器、能量计、数字激光光度计、激光二极管检测器以及其他类型的光电检测器。
在其他实施方案中，方法包括用脉冲光源照射穿过流动流传播的粒子，例如其中以预定的时间间隔发射光，每个时间间隔具有预定的照射持续时间(即脉冲宽度)。在某些实施方案中，方法包括利用脉冲光源在流动流的每个查询区域中用周期性闪光照射粒子。例如，每个光脉冲的频率可以是0.0001kHz或更大，例如0.0005kHz或更大，例如0.001kHz或更大，例如0.005kHz或更大，例如0.01kHz或更大，例如0.05kHz或更大，例如0.1kHz或更大，例如0.5kHz或更大，例如1kHz或更大，例如2.5kHz或更大，例如5kHz或更大，例如10kHz或更大，例如25kHz或更大，例如50kHz或更大并且包括100kHz或更大。在某些实例中，通过光源的脉冲照射的频率范围为0.00001kHz至1000kHz，例如0.00005kHz至900kHz，例如0.0001kHz至800kHz，例如0.0005kHz至700kHz，例如0.001kHz至600kHz，例如0.005kHz至500kHz，例如0.01kHz至400kHz，例如0.05kHz至300kHz，例如0.1kHz至200kHz并且包括1kHz至100kHz。每个光脉冲的光照射的持续时间(即脉冲宽度)可以变化并且可以是0.000001ms或更大，例如0.000005ms或更大，例如0.00001ms或更大，例如0.00005ms或更大，例如0.0001ms或更大，例如0.0005ms或更大，例如0.001ms或更大，例如0.005ms或更大，例如0.01ms或更大，例如0.05ms或更大，例如0.1ms或更大，例如0.5ms或更大，例如1ms或更大，例如2ms或更大，例如3ms或更大，例如4ms或更大，例如5ms或更大，例如10ms或更大，例如25ms或更大，例如50ms或更大，例如100ms或更大并且包括500ms或更大。例如，光照射的持续时间可以在0.000001ms至1000ms，例如0.000005ms至950ms，例如0.00001ms至900ms，例如0.00005ms至850ms，例如0.0001ms至800ms，例如0.0005ms至750ms，例如0.001ms至700ms，例如0.005ms至650ms，例如0.01ms至600ms，例如0.05ms至550ms，例如0.1ms至500ms，例如0.5ms至450ms，例如1ms至400ms，例如5ms至350ms的范围内并且包括10ms至300ms。
流动流可以用任何方便的光源照射，并且可以包括激光和非激光光源(例如发光二极管)。在某些实施方案中，方法包括用激光器(例如脉冲或连续波激光器)照射粒子。例如，激光器可以是二极管激光器，例如紫外二极管激光器、可见光二极管激光器和近红外二极管激光器。在其他实施方案中，激光器可以是氦氖(HeNe)激光器。在一些实例中，激光器是气体激光器，例如氦氖激光器、氩激光器、氪激光器、氙激光器、氮激光器、CO2激光器、CO激光器、氩氟(ArF)准分子激光器、氪氟(KrF)准分子激光器、氙氯(XeCl)准分子激光器或氙氟(XeF)准分子激光器或其组合。在其他情况下，主题系统包括染料激光器，例如芪激光器、香豆素激光器或罗丹明激光器。在其他情况中，感兴趣的激光器包括金属蒸汽激光器，例如氦镉(HeCd)激光器、氦汞(HeHg)激光器、氦硒(HeSe)激光器、氦银(HeAg)激光器、锶激光器、氖铜(NeCu)激光器、铜激光器或金激光器及其组合。在其他情况中，主题系统包括固态激光器，例如红宝石激光器、Nd:YAG激光器、NdCrYAG激光器、Er:YAG激光器、Nd:YLF激光器、Nd:YVO4激光器、Nd:YCa4O(BO3)3激光器、Nd:YCOB激光器、钛蓝宝石激光器、铥YAG激光器、镱YAG激光器、三氧化二镱激光器或铈掺杂的激光器及其组合。
在一些实施方案中，光源输出特定波长，例如200nm至1500nm，例如250nm至1250nm，例如300nm至1000nm，例如350nm至900nm并且包括400nm至800nm。在某些实施方案中，连续波光源发射具有365nm、385nm、405nm、460nm、490nm、525nm、550nm、580nm、635nm、660nm、740nm、770nm或850nm的波长的光。
流动流可以由光源从任何合适的距离照射，例如在0.001mm或更大，例如0.005mm或更大，例如0.01mm或更大，例如0.05mm或更大，例如0.1mm或更大，例如0.5mm或更大，例如1mm或更大，例如5mm或更大，例如10mm或更大，例如25mm或更大的距离并且包括在100mm或更大的距离。此外，流动流的照射可以以任何合适的角度进行，例如以在10°至90°，例如15°至85°，例如20°至80°，例如25°至75°的范围并且包括30°至60°的角度，例如以90°的角度。
检测来自跨过流动流的水平轴线的多个不同位置的光。在实施方案中，方法可以包括检测跨过流动流的10个位置(例如，预定长度的区段)或更多位置的光，例如跨过流动流的水平轴线的25个或更多位置，例如50个或更多位置，例如75个或更多位置，例如100个或更多位置，例如150个或更多位置，例如200个或更多位置，例如250个或更多位置，并且包括500个或更多位置。在一些实施方案中，从跨过流动流的每个位置同时检测光。在一些实施方案中，用成像光电检测器检测来自流动流的光，例如其中成像光电检测器在多个像素位置中同时检测跨过流动流的光。例如，来自流动流的光可以用成像光电检测器在跨过流动流的10个或更多像素位置检测，例如跨过流动流的水平轴线的25个或更多像素位置，例如50个或更多像素位置，例如75个或更多像素位置，例如100个或更多像素位置，例如150个或更多像素位置，例如200个个或更多像素位置，例如250个或更多像素位置，并且包括500个或更多像素位置。在一些实例中，每个像素位置对应于跨过流动流的水平轴线的不同位置。
光电检测器可以是任何方便的光检测协议，包括但不限于光电传感器或光电检测器，例如有源像素传感器(APS)、雪崩光电二极管(APD)、象限光电二极管、图像传感器、电荷耦合器件(CCD)、增强型电荷耦合器件(ICCD)、发光二极管、光子计数器、测照射热计、热电检测器、光敏电阻、光伏电池、光电二极管、光电倍增管、光电晶体管、量子点光电导体或光电二极管及其组合，以及其他光电检测器。在某些实施方案中，光电检测器是光电倍增管，例如每个区域的有效检测表面积范围为0.01cm2至10cm2，例如0.05cm2至9cm2，例如，例如0.1cm2至8cm2，例如0.5cm2至7cm2并且包括1cm2至5cm2的光电倍增管。
在某些实施方案中，光检测系统包括光学耦合到狭缝的一个或多个光电检测器。取决于光电检测器的有效检测表面的尺寸，根据某些情况的狭缝具有矩形(或其他多边形形状)开口，该开口具有0.01mm至2mm，例如0.1mm至1.9mm，例如0.2mm至1.8mm，例如0.3mm至1.7mm，例如0.4mm至1.6mm的宽度并且包括0.5mm至1.5mm的宽度以及0.01mm至2mm，例如0.1mm至1.9mm，例如0.2mm至1.8mm，例如0.3mm至1.7mm，例如0.4mm至1.6mm的长度，并且包括0.5mm至1.5mm的长度。在某些实例中，狭缝的宽度为1mm或更小，例如0.9mm或更小，例如0.8mm或更小，例如0.7mm或更小，例如0.6mm或更小，例如0.5mm或更小，并且包括0.4mm或更小的宽度。在某些实施方案中，狭缝包括沿着流动流的纵向轴线延伸的开口。在某些实例中，光检测系统包括光电检测器，该光电检测器被光学耦合到具有多个开口的狭缝，例如具有2个或更多开口，例如3个或更多开口，例如4个或更多开口，例如5个或更多开口，例如6个或更多开口，例如7个或更多开口，例如8个或更多开口，例如9个或更多开口的狭缝，并且包括具有10个或更多开口的狭缝。在某些实施方案中，光检测系统被配置成响应于在狭缝的多个开口中的每个开口之间检测到的光，在多个光电检测器通道中生成数据信号。
光可以由光电检测器在一个或多个波长下测量，例如在2个或更多波长下，例如在5个或更多不同波长下，例如在10个或更多不同波长下，例如在25个或更多不同波长下，例如在50个或更多不同波长下，例如在100个或更多不同波长下，例如在200个或更多不同波长下，例如在300个或更多不同波长下测量，并且包括在400个或更多不同波长下测量来自流动流中的粒子的光。可以连续地或以不连续的间隔测量光。在一些实例中，感兴趣的检测器被配置成连续地进行光的测量。在其他情况下，感兴趣的检测器被配置成以离散的间隔进行测量，例如每0.001毫秒、每0.01毫秒、每0.1毫秒、每1毫秒、每10毫秒、每100毫秒并且包括每1000毫秒或者一些其他间隔测量光。
在每个离散的时间间隔期间，可以一次或多次进行来自跨过流动流的光的测量，例如2次或更多次，例如3次或更多次，例如5次或更多次，并且包括10次或更多次。在某些实施方案中，来自流动流的光被光电检测器测量2次或更多次，其中在某些情况下数据被平均。
在实施根据某些实施方案的主题方法时，在光检测系统的成像光电检测器通道中在跨过流动流的多个像素位置生成数据信号，例如在跨过流动流的10个或更多像素位置，例如在25个或更多像素位置，例如在50个或更多像素位置，例如在75个或更多像素位置，例如在100个或更多像素位置，例如在150个或更多像素位置，例如在200个或更多像素位置，例如在250个或更多像素位置，并且包括在跨过流动流的水平轴线的500个或更多像素位置。在一些实例中，方法包括确定每个像素位置的数据信号的强度。在一些实例中，确定每个像素位置生成的数据信号的峰值幅度。在一些实例中，确定每个像素位置生成的数据信号的脉冲面积。在某些实例中，方法包括在每个像素位置绘制生成的数据信号的信号强度、峰值幅度和脉冲面积中的一个或多个。在一些实施方案中，评估跨过流动流的水平轴线的所生成的数据信号的信号强度、峰值幅度或脉冲面积的变化。在某些实施方案中，方法包括计算跨过流动流的所生成的数据信号的信号强度、峰值幅度或脉冲面积中的一个或多个的稳健变化系数。例如，可以基于在每个像素位置的绘制的数据信号来计算数据信号强度的稳健变化系数。
基于跨过流动流的所生成的数据信号，为成像光电检测器通道中的每个像素位置计算检测器增益校正因子。在一些实施方案中，通过确定对每个像素位置的信号强度的调整来计算检测器增益校正因子，使得在跨过流动流的数据信号之间几乎没有强度变化。换句话说，当检测器增益校正因子被应用于每个像素位置的数据信号时，数据信号强度跨过流动流的水平轴线表现出均匀性。例如，检测器增益校正因子可以是对每个像素位置的信号强度的调整，使得跨过流动流的数据信号之间的强度变化为10％或更小，例如9％或更小，例如8％或更小，例如7％或更小，例如6％或更小，例如5％或更小，例如4％或更小，例如3％或更小，例如2％或更小，例如1％或更小，例如0.5％或更小，例如0.1％或更小，例如0.05％或更小，例如0.01％或更小并且包括0.001％或更小。
在一些实施方案中，在一个或多个像素位置的检测器增益校正因子是加法调整，其中检测器增益校正因子增加了一个或多个像素位置的数据信号强度。在其他实施方案中，一个或多个像素位置的检测器增益校正因子是减法调整，其中检测器增益校正因子降低了一个或多个像素位置的数据信号强度。在一些实施方案中，将检测增益校正因子应用于成像光电检测器通道中在每个像素位置生成的数据信号足以将跨过流动流的数据信号强度的稳健变化系数降低0.1％或更多，例如0.2％或更多，例如0.3％或更多，例如0.4％或更多，例如0.5％或更多，例如0.6％或更多，例如0.7％或更多，例如0.8％或更多，例如0.9％或更多，例如1.0％或更多，例如1.5％或更多，例如2.0％或更多，并且包括将跨过流动流的数据信号强度的稳健变化系数降低2.5％或更多。
图1描绘了根据某些实施方案的用检测器增益校正因子调整来自光电检测器的数据信号。如101所示，来自光电检测器的数据信号跨过多个像素位置表现出不均匀的强度。在一些实例中，这种不均匀的光电检测器信号强度可能是由用于照射流动流的激光的未对准或不规则性引起的。例如，用于照射流动流的激光可以具有由柱面透镜(例如鲍威尔透镜(Powell len))生成的不规则平顶光束轮廓，或者可以与一个或多个光学部件未对准。在某些实例中，不均匀的光电检测器信号强度可能是由使用具有高斯或超高斯光束轮廓的激光照射流动流引起的。如本文所述，基于成像光电检测器通道中生成的数据信号为每个像素位置(例如像素1-100)计算检测器增益校正因子。在102中示出了每个像素位置的检测器增益校正因子的曲线图。将102的检测器增益校正因子应用于101的数据信号在103所示的每个像素位置生成经校正的数据信号。与101的数据信号相比，经校正的数据信号103的稳健变化系数(rCV)降低了1.6％(从101的4.9％的rCV降低到103的3.3％的rCV)。
在一些实施方案中，方法包括将经确定的检测器增益校正因子应用于在光检测系统的一个或多个非成像光电检测器通道中生成的数据信号。例如，在每个像素位置经确定的检测器增益校正因子可以应用于在光检测系统的2个或更多非成像光电检测器通道(例如3个或更多，例如4个或更多，例如8个或更多，例如12个或更多，例如16个或更多，例如24个或更多，例如32个或更多，例如48个或更多，例如64个或更多)中生成的数据信号，并且包括在光检测系统的128个或更多非成像光电检测器通道中生成的数据信号。在这些实施方案中，应用经确定的检测器增益校正因子足以在非成像光电检测器通道中生成数据信号，所述数据信号跨过流动流几乎没有信号强度变化，例如其中在每个非成像光电检测器通道中跨过流动流的数据信号的强度变化为10％或更小，例如9％或更小，例如8％或更小，例如7％或更小，例如6％或更小，例如5％或更小，例如4％或更小，例如3％或更小，例如2％或更小，例如1％或更小，例如0.5％或更小，例如0.1％或更小，例如0.05％或更小，例如0.01％或更小并且包括0.001％或更小。
在一些实施方案中，应用于来自非成像光电检测器通道的数据信号的检测器增益校正因子是加法调整，其中检测器增益校正因子增加了数据信号强度。在其他实施方案中，应用于来自非成像光电检测器通道的数据信号的检测器增益校正因子是减法调整，其中检测器增益校正因子降低了数据信号强度。在某些实施方案中，将检测器增益校正因子应用于非成像光电检测器通道中的数据信号足以将跨过流动流的非成像光电检测器数据信号强度的稳健变化系数降低0.1％或更多，例如0.2％或更多，例如0.3％或更多，例如0.4％或更多，例如0.5％或更多，例如0.6％或更多，例如0.7％或更多，例如0.8％或更多，例如0.9％或更多，例如1.0％或更多，例如1.5％或更多，例如2.0％或更多，并且包括将跨过流动流的数据信号强度的稳健变化系数降低2.5％或更多。
图2示出了根据某些实施方案的将在成像光电检测器通道中计算的检测器增益校正因子应用于一个或多个非成像光电检测器通道。用来自5个不同激光束的激光照射粒子(例如珠或细胞)，每个激光束跨过流动流的水平轴线。成像激光束被用于照射跨过流动流。成像光束生成粒子的成像信号。这些信号包含每个粒子的像素位置。基于成像光电检测器通道中每个像素位置生成的数据信号来计算检测器增益校正因子。成像光电检测器通道中的每个像素位置对应于跨过流动流的水平轴线的位置。非成像光束在没有像素位置信息的情况下为每个粒子生成信号。当每个像素位置的激光强度或收集效率不同时，收集的信号将在粒子之间变化(例如，导致高rCV)。来自成像光电检测器通道的像素位置可以用于执行检测器增益校正，以补偿成像光电检测器通道和非成像光电检测器通道的粒子之间的变化。为此，使用在成像光电检测器通道中计算的检测器增益校正因子来计算用于应用在一个或多个非成像光电检测器通道中生成的数据信号的检测器增益校正因子。
在某些实施方案中，方法包括基于在每个像素位置的经确定的检测器增益校正因子来生成检测器增益校正因子数据文件。在一些实例中，数据增益校正因子数据文件包括从成像光电检测器通道确定的每个像素位置的检测器增益校正因子的表格。在一些实例中，方法包括将检测器增益校正因子数据文件应用于一组或多组数据信号，例如存储在存储器中的数据信号。如下文更详细描述的，检测器增益校正因子数据文件可以应用于来自光电检测器通道的数据信号，其中集成电路(例如现场可编程门阵列)用检测器增益校正因子数据文件编程。
图3描绘了根据某些实施方案的用于确定应用于流式细胞仪数据的检测器增益校正因子的流程图。在停止301处，光源跨过流动流的水平轴线照射粒子。用具有成像光电检测器的光检测系统检测来自粒子的光。在步骤302，在跨过流动流的多个像素位置生成来自成像光电检测器通道的数据信号。在步骤303，基于生成的数据信号，在每个像素位置计算检测器增益校正因子。在某些实例中，步骤303中的每个像素位置的增益校正因子被计算为对每个像素位置的信号强度的调整，使得跨过流动流的数据信号之间的强度变化为5％或更小，例如3％或更小，或者其中光电检测器通道中的数据信号的计算的rCV减少1％或更多，例如1.5％或更多。在步骤304，将增益校正因子应用于来自成像光电检测器通道的数据信号，以在每个像素位置生成来自成像光电检测器的数据信号，所述数据信号跨过流动流是均匀的。在步骤305，基于来自成像光电检测器通道的增益校正因子来计算增益校正因子，并将其应用于来自一个或多个非成像光电检测器通道的数据信号，以生成来自每个非成像光电检测器的数据信号，该数据信号跨过流动流是均匀的。在一些实例中，在每个像素位置的计算的增益校正因子用于生成检测器增益校正因子数据文件(步骤306)，该数据文件可以应用于先前或稍后收集的数据信号(步骤307)。
用于确定光电检测器增益校正因子的系统
本公开的方面还包括具有光检测系统的系统(例如，粒子分析仪)，所述光检测系统包括成像光电检测器。根据某些实施方案的系统包括用于照射流动流的光源和光检测系统，所述光检测系统被配置成跨过流动流的水平轴线检测光并且在多个像素位置在成像光电检测器通道中生成数据信号。在一些实施方案中，光源是连续波光源，例如其中光源提供不间断的光通量并保持对流动流中的粒子的照射，而光强度几乎没有不期望的变化。在一些实施方案中，连续光源发射非脉冲的照射或非频闪照射。在某些实施方案中，连续光源提供基本上恒定的发射光强度。例如，连续光源可以在照射的时间间隔期间提供变化10％或更小，例如变化9％或更小，例如变化8％或更小，例如变化7％或更小，例如变化6％或更小，例如变化5％或更小，例如变化4％或更小，例如变化3％或更小，例如变化2％或更小，例如变化1％或更小，例如变化0.5％或更小，例如变化0.1％或更小，例如变化0.01％或更小，例如变化0.001％或更小，例如变化0.0001％或更小，例如变化0.00001％或更小的发射光强度，并且包括在照射的时间间隔期间发射光强度变化0.000001％或更小的情况。光输出的强度可以用任何方便的方案来测量，包括但不限于扫描狭缝轮廓仪、电荷耦合器件(CCD，例如增强型电荷耦合器件ICCD)、定位传感器、功率传感器(例如热电堆功率传感器)、光功率传感器、能量计、数字激光光度计、激光二极管检测器以及其他类型的光电检测器。
在一些实施方案中，光源包括一个或多个脉冲光源，例如以预定的时间间隔发射光，每个时间间隔具有预定的照射持续时间(即脉冲宽度)。在某些实施方案中，脉冲光源被配置成用周期性闪光照射光电检测器。例如，每个光脉冲的频率可以是0.0001kHz或更大，例如0.0005kHz或更大，例如0.001kHz或更大，例如0.005kHz或更大，例如0.01kHz或更大，例如0.05kHz或更大，例如0.1kHz或更大，例如0.5kHz或更大，例如1kHz或更大，例如2.5kHz或更大，例如5kHz或更大，例如10kHz或更大，例如25kHz或更大，例如50kHz或更大并且包括100kHz或更大。在某些实例中，通过光源的脉冲照射的频率范围为0.00001kHz至1000kHz，例如0.00005kHz至900kHz，例如0.0001kHz至800kHz，例如0.0005kHz至700kHz，例如0.001kHz至600kHz，例如0.005kHz至500kHz，例如0.01kHz至400kHz，例如0.05kHz至300kHz，例如0.1kHz至200kHz并且包括1kHz至100kHz。每个光脉冲的光照射的持续时间(即脉冲宽度)可以变化并且可以是0.000001ms或更大，例如0.000005ms或更大，例如0.00001ms或更大，例如0.00005ms或更大，例如0.0001ms或更大，例如0.0005ms或更大，例如0.001ms或更大，例如0.005ms或更大，例如0.01ms或更大，例如0.05ms或更大，例如0.1ms或更大，例如0.5ms或更大，例如1ms或更大，例如2ms或更大，例如3ms或更大，例如4ms或更大，例如5ms或更大，例如10ms或更大，例如25ms或更大，例如50ms或更大，例如100ms或更大并且包括500ms或更大。例如，光照射的持续时间可以在0.000001ms至1000ms，例如0.000005ms至950ms，例如0.00001ms至900ms，例如0.00005ms至850ms，例如0.0001ms至800ms，例如0.0005ms至750ms，例如0.001ms至700ms，例如0.005ms至650ms，例如0.01ms至600ms，例如0.05ms至550ms，例如0.1ms至500ms，例如0.5ms至450ms，例如1ms至400ms，例如5ms至350ms的范围内并且包括10ms至300ms。
光源可以包括激光和非激光光源(例如发光二极管)。在某些实施方案中，系统包括激光器，例如脉冲激光器或连续波激光器。例如，激光器可以是二极管激光器，例如紫外二极管激光器、可见光二极管激光器和近红外二极管激光器。在其他实施方案中，激光器可以是氦氖(HeNe)激光器。在一些实例中，激光器是气体激光器，例如氦氖激光器、氩激光器、氪激光器、氙激光器、氮激光器、CO2激光器、CO激光器、氩氟(ArF)准分子激光器、氪氟(KrF)准分子激光器、氙氯(XeCl)准分子激光器或氙氟(XeF)准分子激光器或其组合。在其他情况下，主题系统包括染料激光器，例如芪激光器、香豆素激光器或罗丹明激光器。在其他情况下，感兴趣的激光器包括金属蒸汽激光器，例如氦镉(HeCd)激光器、氦汞(HeHg)激光器、氦硒(HeSe)激光器、氦银(HeAg)激光器、锶激光器、氖铜(NeCu)激光器、铜激光器或金激光器及其组合。在其他情况下，主题系统包括固态激光器，例如红宝石激光器、Nd:YAG激光器、NdCrYAG激光器、Er:YAG激光器、Nd:YLF激光器、Nd:YVO4激光器、Nd:YCa4O(BO3)3激光器、Nd:YCOB激光器、钛蓝宝石激光器、铥YAG激光器、镱YAG激光器、二氧化二钇激光器或铈掺杂的激光器及其组合。
光源可以被配置成输出特定波长，例如200nm至1500nm，例如250nm至1250nm，例如300nm至1000nm，例如350nm至900nm并且包括400nm至800nm。在某些实施方案中，连续波光源发射波长为365nm、385nm、405nm、460nm、490nm、525nm、550nm、580nm、635nm、660nm、740nm、770nm或850nm的光。
光源可以定位在距离流动流的任何合适的距离，例如在0.001mm或更大，例如0.005mm或更大，例如0.01mm或更大，例如0.05mm或更大，例如0.1mm或更大，例如0.5mm或更大，例如1mm或更大，例如5mm或更大，例如10mm或更大，例如25mm或更大的距离，并且包括在100mm或更大的距离。光源可以以任何合适的角度定位，例如以在10°至90°，例如15°至85°，例如20°至80°，例如25°至75°的范围并且包括30°至60°的角度，例如以90°的角度。
在实施方案中，光检测系统被配置成检测来自跨过流动流的水平轴线的多个不同位置的光。在一些实施方案中，光检测系统被配置为在10个位置(例如预定长度的区段)或更多位置检测跨过流动流的光，例如跨过流动流的水平轴线的25个或更多位置，例如50个或更多位置，例如75个或更多位置，例如100个或更多位置，例如150个或更多位置，例如200个或更多位置，例如250个或更多位置，并且包括500个或更多位置。在一些实施方案中，光检测系统被配置成同时检测来自跨过流动流的每个位置的光。在一些实施方案中，光检测系统包括成像光电检测器，该成像光电检测器在多个像素位置同时检测跨过流动流的光。例如，成像光电检测器可以被配置成在跨过流动流的10个或更多像素位置检测来自流动流的光，例如跨过流动流的水平轴线的25个或更多像素位置，例如50个或更多像素位置，例如75个或更多像素位置，例如100个或更多像素位置，例如150个或更多像素位置，例如200个或更多像素位置，例如250个或更多像素位置，并且包括跨过流动流的水平轴线的500个或更多像素位置。在一些实例中，每个像素位置对应于跨过流动流的水平轴线的不同位置。
光电检测器可以是任何方便的光检测协议，包括但不限于光电传感器或光电检测器，例如有源像素传感器(APS)、雪崩光电二极管(APD)、象限光电二极管、图像传感器、电荷耦合器件(CCD)、增强型电荷耦合器件(ICCD)、发光二极管、光子计数器、测照射热计、热电检测器、光敏电阻、光伏电池、光电二极管、光电倍增管、光电晶体管、量子点光电导体或光电二极管及其组合，以及其他光电检测器。在某些实施方案中，光电检测器是光电倍增管，例如每个区域的有效检测表面积范围为0.01cm2至10cm2，例如0.05cm2至9cm2，例如，例如0.1cm2至8cm2，例如0.5cm2至7cm2并且包括1cm2至5cm2的光电倍增管。
在某些实施方案中，光检测系统包括光学耦合到狭缝的一个或多个光电检测器。取决于光电检测器的有效检测表面的尺寸，根据某些情况的狭缝具有矩形(或其他多边形形状)开口，该开口具有0.01mm至2mm，例如0.1mm至1.9mm，例如0.2mm至1.8mm，例如0.3mm至1.7mm，例如0.4mm至1.6mm的宽度并且包括0.5mm至1.5mm的宽度以及0.01mm至2mm，例如0.1mm至1.9mm，例如0.2mm至1.8mm，例如0.3mm至1.7mm，例如0.4mm至1.6mm的长度并且包括0.5mm至1.5mm的长度。在某些实例中，狭缝的宽度为1mm或更小，例如0.9mm或更小，例如0.8mm或更小，例如0.7mm或更小，例如0.6mm或更小，例如0.5mm或更小，并且包括0.4mm或更小的宽度。在某些实施方案中，狭缝包括沿着流动流的纵向轴线延伸的开口。在某些实例中，光检测系统包括光电检测器，所述光电检测器被光学耦合到具有多个开口的狭缝，例如具有2个或更多开口，例如3个或更多开口，例如4个或更多开口，例如5个或更多开口，例如6个或更多开口，例如7个或更多开口，例如8个或更多开口，例如9个或更多开口的狭缝，并且包括具有10个或更多开口的狭缝。在某些实施方案中，光检测系统被配置成响应于在狭缝的多个开口中的每个开口之间检测到的光，在多个光电检测器通道中生成数据信号。
光检测系统的光电检测器可以被配置为在一个或多个波长处测量光，例如在2个或更多波长处，例如在5个或更多不同波长处，例如在10个或更多不同波长处，例如在25个或更多不同波长处，例如在50个或更多不同波长处，例如在100个或更多不同波长处，例如在200个或更多不同波长处，例如在300个或更多不同波长处测量光，并且包括在400个或更多不同波长处测量来自流动流中的粒子的光。可以连续地或以不连续的间隔测量光。在一些实例中，感兴趣的检测器被配置成连续地进行光的测量。在其他情况下，感兴趣的检测器被配置成以离散的间隔进行测量，例如每0.001毫秒、每0.01毫秒、每0.1毫秒、每1毫秒、每10毫秒、每100毫秒并且包括每1000毫秒或者一些其他间隔测量光。
光电检测器可以被配置成在每个离散时间间隔期间一次或多次进行来自流动流的光的测量，例如2次或更多次，例如3次或更多次，例如5次或更多次并且包括10次或更多次。在某些实施方案中，来自流动流的光被光电检测器测量2次或更多次，其中在某些情况下数据被平均。
在实施方案中，系统包括处理器，所述处理器具有可操作地耦合到处理器的存储器，其中所述存储器包括存储在其上的指令，所述指令当由处理器执行时使得处理器响应于所生成的数据信号计算跨过流动流的每个像素位置的检测器增益校正因子。在一些实例中，存储器包括用于在跨过流动流的多个像素位置计算检测器增益校正因子的指令，例如在跨过流动流的10个或更多像素位置，例如在25个或更多像素位置，例如在50个或更多像素位置，例如在75个或更多像素位置，例如在100个或更多像素位置，例如在150个或更多像素位置，例如在200个或更多像素位置，例如在250个或更多像素位置，并且包括在跨过流动流的水平轴线的500个或更多像素位置计算检测器增益校正因子的指令。
在一些实例中，存储器包括用于确定每个像素位置的数据信号强度的指令。在一些实例中，存储器包括用于确定每个像素位置生成的数据信号的峰值幅度的指令。在一些实例中，存储器包括用于确定每个像素位置生成的数据信号的脉冲面积的指令。在某些实例中，存储器包括用于绘制每个像素位置生成的数据信号的信号强度、峰值幅度和脉冲面积中的一个或多个的指令。在一些实施方案中，存储器包括用于评估跨过流动流的水平轴线的所生成的数据信号的信号强度、峰值幅度或脉冲面积的变化的指令。在某些实施方案中，存储器进一步包括用于计算跨过流动流的所生成的数据信号的信号强度、峰值幅度或脉冲面积中的一个或多个的稳健变化系数的指令。例如，可以基于在每个像素位置的绘制的数据信号来计算数据信号强度的稳健变化系数。
系统包括处理器，所述处理器具有可操作地耦合到所述处理器的存储器，其中所述存储器包括存储在其上的指令，所述指令当由处理器执行时使得所述处理器基于跨过流动流的所生成的数据信号来计算成像光电检测器通道中每个像素位置的检测器增益校正因子。在一些实施方案中，通过确定对每个像素位置的信号强度的调整来计算检测器增益校正因子，使得在跨过流动流的数据信号之间几乎没有强度变化。例如，检测器增益校正因子可以是对每个像素位置的信号强度的调整，使得跨过流动流的数据信号之间的强度变化为10％或更小，例如9％或更小，例如8％或更小，例如7％或更小，例如6％或更小，例如5％或更小，例如4％或更小，例如3％或更小，例如2％或更小，例如1％或更小，例如0.5％或更小，例如0.1％或更小，例如0.05％或更小，例如0.01％或更小并且包括0.001％或更小。
在一些实施方案中，一个或多个像素位置的检测器增益校正因子是加法调整，其中检测器增益校正因子增加了一个或多个像素位置的数据信号强度。在其他实施方案中，一个或多个像素位置的检测器增益校正因子是减法调整，其中检测器增益校正因子降低了一个或多个像素位置的数据信号强度。在一些实施方案中，将检测增益校正因子应用于成像光电检测器通道中在每个像素位置的所生成的数据信号足以将跨过流动流的数据信号强度的稳健变化系数(rCV)降低0.1％或更多，例如0.2％或更多，例如0.3％或更多，例如0.4％或更多，例如0.5％或更多，例如0.6％或更多，例如0.7％或更多，例如0.8％或更多，例如0.9％或更多，例如1.0％或更多，例如1.5％或更多，例如2.0％或更多，并且包括将跨过流动流的数据信号强度的稳健变化系数降低2.5％或更多。
在一些实施方案中，存储器包括用于将检测器增益校正因子应用于在光检测系统的一个或多个非成像光电检测器通道中生成的数据信号的指令。在一些实例中，存储器包括用于基于来自成像光电检测器通道的增益校正因子和来自非成像光电检测器通道的信号强度来计算在一个或多个非成像光电检测器通道中生成的数据信号的增益校正因子的指令。例如，存储器包括用于将检测器增益校正因子应用于在光检测系统的2个或更多非成像光电检测器通道(例如3个或更多，例如4个或更多，例如8个或更多，例如12个或更多，例如16个或更多，例如24个或更多，例如32个或更多，例如48个或更多，例如64个或更多)中并且包括在光检测系统的128个或更多非成像光电检测器通道中生成的数据信号的指令。在这些实施方案中，存储器包括用于应用经确定的检测器增益校正因子，以便在非成像光电检测器通道中生成数据信号的指令，所述数据信号表现出跨过流动流几乎没有信号强度变化，例如其中在每个非成像光电检测器通道中跨过流动流的数据信号的强度变化为10％或更小，例如9％或更小，例如8％或更小，例如7％或更小，例如6％或更小，例如5％或更小，例如4％或更小，例如3％或更小，例如2％或更小，例如1％或更小，例如0.5％或更小，例如0.1％或更小，例如0.05％或更小例如0.01％或更小并且包括0.001％或更小。
在一些实施方案中，应用于来自非成像光电检测器通道的数据信号的检测器增益校正因子是加法调整，其中检测器增益校正因子增加了数据信号强度。在其他实施方案中，应用于来自非成像光电检测器通道的数据信号的检测器增益校正因子是减法调整，其中检测器增益校正因子降低了数据信号强度。在某些实施方案中，存储器包括用于将检测器增益校正因子应用于非成像光电检测器通道中的数据信号，以便将跨过流动流的非成像光电检测器数据信号强度的稳健变化系数降低0.1％或更多的指令，例如0.2％或更多，例如0.3％或更多，例如0.4％或更多，例如0.5％或更多，例如0.6％或更多，例如0.7％或更多，例如0.8％或更多，例如0.9％或更多，例如1.0％或更多，例如1.5％或更多，例如2.0％或更多，并且包括将跨过流动流的数据信号强度的稳健变化系数降低2.5％或更多。
在某些实施方案中，存储器包括用于基于在每个像素位置确定的检测器增益校正因子来生成检测器增益校正因子数据文件的指令。在一些实例中，数据增益校正因子数据文件包括从成像光电检测器通道确定的每个像素位置的检测器增益校正因子的表格。在一些实例中，存储器包括用于将检测器增益校正因子数据文件应用于一组或多组存储的数据信号(例如存储在存储器中的数据信号)的指令。
在某些实施方案中，系统进一步包括被配置成在流动流中传播样品的流动池。可以使用将流体样品传播到样品查询区域的任何方便的流动池，其中在一些实施方案中，流动池包括限定纵向轴线的近端圆柱形部分和终止于平坦表面的远端截头圆锥形部分，所述平坦表面具有横向于纵向轴线的孔口。近端圆柱形部分的长度(如沿着纵向轴线测量的)可以在从1mm到15mm，例如从1.5mm到12.5mm，例如从2mm到10mm，例如从3mm到9mm并且包括从4mm到8mm的范围内变化。远端截头圆锥形部分的长度(如沿着纵向轴线测量的)也可以在从1mm到10mm例如从2mm到9mm，例如从3mm到8mm并且包括从4mm到7mm的范围内变化。在一些实施方案中，流动池喷嘴室的直径可以在从1mm到10mm，例如从2mm到9mm，例如从3mm到8mm并且包括从4mm到7mm的范围内变化。
在某些实例中，流动池不包括圆柱形部分，并且整个流动池内室为截头圆锥形。在这些实施方案中，截头圆锥形内室的长度(如沿着横向于喷嘴孔口的纵向轴线测量的)可以在1mm至15mm，例如1.5mm至12.5mm，例如2mm至10mm，例如3mm至9mm并且包括4mm至8mm的范围内。截头圆锥形内室的近端部分的直径可以在1mm至10mm，例如2mm至9mm，例如3mm至8mm并且包括4mm至7mm的范围内。
在一些实施方案中，样品流动流从流动池的远端的孔口发出。取决于流动流的期望的特性，流动池孔口可以是任何合适的形状，其中感兴趣的横截面形状包括但不限于：直线横截面形状(例如正方形、矩形、梯形、三角形、六边形等)、曲线横截面形状(例如圆形、椭圆形)以及不规则形状(例如耦合到平面顶部部分的抛物线形底部部分)。在某些实施方案中，感兴趣的流动池具有圆形孔口。喷嘴孔口的尺寸可以变化，在一些实施方案中范围为1mm至20000mm，例如2mm至17500mm，例如5mm至15000mm，例如10mm至12500mm，例如15mm至10000mm，例如25mm至7500mm，例如50mm至5000mm，例如75mm至1000mm，例如100mm至750mm并且包括150mm至500mm。在某些实施方案中，喷嘴孔口为100mm。
在一些实施方案中，流动池包括被配置为向流动池提供样品的样品注射端口。在实施方案中，样品注射系统被配置为向流动池内室提供合适的样品流。取决于流动流的期望的特性，通过样品注射端口输送到流动池室的样品的速率可以为1mL/min或更大，例如2mL/min或更大，例如3mL/min或更大，例如5mL/min或更大，例如10mL/min或更大，例如15mL/min或更大，例如25mL/min或更大，例如50mL/min或更大并且包括100mL/min或更大，其中在一些实例中，通过样品注射端口输送到流动池室的样品的速率为1mL/秒或更大，例如2mL/秒或更大，例如3mL/秒或更大，例如5mL/秒或更大，例如10mL/秒或更大，例如15mL/秒或更大，例如25mL/秒或更大，例如50mL/秒或更大并且包括100mL/秒或更大。
样品注射端口可以是定位在内室的壁中的孔口，或者可以是位于内室的近端的导管。在样品注射端口是定位在内室的壁中的孔口的情况下，样品注射端口孔口可以是任何合适的形状，其中感兴趣的横截面形状包括但不限于：直线横截面形状(例如正方形、矩形、梯形、三角形、六边形等)、曲线横截面形状(例如圆形、椭圆形等)以及不规则的形状(例如耦合到平面顶部部分的抛物线形底部部分)。在某些实施方案中，样品注射端口具有圆形孔口。样品注射端口孔口的尺寸可以根据形状而变化，在某些实例中，具有范围为0.1mm至5.0mm，例如0.2至3.0mm，例如0.5mm至2.5mm，例如0.75mm至2.25mm，例如1mm至2mm并且包括1.25mm至1.75mm，例如1.5mm的开口。
在某些实例中，样品注射端口是位于流动池内室的近端的导管。例如，样品注射端口可以是被定位成使样品注射端口的孔口与流动池孔口成一直线的导管。在样品注射端口是被定位成与流动池孔口成一直线的导管的情况下，样品注射管的横截面形状可以是任何合适的形状，其中感兴趣的横截面形状包括但不限于：直线横截面形状(例如正方形、矩形、梯形、三角形、六边形等)、曲线横截面形状(例如圆形、椭圆形)以及不规则形状(例如耦合到平面顶部部分的抛物线形底部部分)。导管的孔口可以根据形状而变化，在某些实例中，具有范围为0.1mm至5.0mm，例如，0.2至3.0mm，例如，0.5mm至2.5mm，例如0.75mm至2.25mm，例如1mm至2mm并且包括1.25mm至1.75mm，例如1.5mm的开口。样品注射端口的尖端的形状可以与样品注射管的横截面形状相同或不同。例如，样品注射端口的孔口可以包括带斜角的尖端，所述带斜角的尖端具有范围为1°至10°，例如2°至9°，例如3°至8°，例如4°至7°的斜角并且包括5°的斜角。
在一些实施方案中，流动池还包括被配置成向流动池提供鞘液的鞘液注射端口。在实施方案中，鞘液注射系统被配置为向流动池内室提供鞘液流，例如与样品结合以生成围绕样品流动流的鞘液的层压的流动流。取决于流动流的期望的特性，输送到流动池室的鞘液的速率可以为25mL/秒或更大，例如50mL/秒或更大，例如75mL/秒或更大，例如100mL/秒或更大，例如250mL/秒或更大，例如500mL/秒或更大，例如750mL/秒或更大，例如1000mL/秒或更大并且包括2500mL/秒或更大。
在一些实施方案中，鞘液注射端口是定位在内室的壁中的孔口。鞘液注射端口孔口可以是任何合适的形状，其中感兴趣的横截面形状包括但不限于：直线横截面形状(例如正方形、矩形、梯形、三角形、六边形等)、曲线横截面形状(例如圆形、椭圆形)以及不规则形状(例如耦合到平面顶部部分的抛物线形底部部分)。样品注射端口孔口的尺寸可以根据形状而变化，在某些实例中，具有范围为0.1mm至5.0mm，例如0.2至3.0mm，例如0.5mm至2.5mm，例如0.75mm至2.25mm，例如1mm至2mm并且包括1.25mm至1.75mm，例如1.5mm的开口。
在一些实施方案中，系统进一步包括与流动池流体连通的泵，以使流动流传播通过流动池。可以采用任何方便的流体泵方案来控制通过流动池的流动流的流动。在某些实例中，系统包括蠕动泵，例如具有脉冲阻尼器的蠕动泵。主题系统中的泵被配置成以适合于检测来自流动流中样品的光的速率输送流体通过流动池。在一些实例中，流动池中的样品流动的速率为1mL/min(微升每分钟)或更高，例如2mL/min或更大，例如3mL/min或更大，例如5mL/min或更大，例如10mL/min或更大，例如25mL/min或更大，例如50mL/min或更大，例如75mL/min或更大，例如100mL/min或更大，例如250mL/min或更大，例如500mL/min或更大，例如750mL/min或更大并且包括1000mL/min或更大。例如，系统可以包括泵，所述泵被配置成使样品以一定的速率流过流动池，所述速率的范围为1mL/min至500mL/min，例如1uL/min至250uL/min，例如1uL/min至100uL/min，例如2mL/min至90mL/min，例如3mL/min至80mL/min，例如4mL/min至70mL/min，例如5mL/min至60mL/min并且包括10mL/min至50mL/min。在某些实施方案中，流动流的流动流速为5mL/min至6mL/min。
在某些实施方案中，具有如上所述的多个光电检测器的光检测系统是粒子分析仪(例如粒子分选机)的一部分或位于粒子分析仪(例如粒子分选机)中。在某些实施方案中，主题系统是流式细胞术系统，其包括作为光检测系统的一部分的光电二极管和放大器部件，用于检测由流动流中的样品发出的光。合适的流式细胞术系统可以包括但不限于在Ormerod(编辑)，《流式细胞术：一种实用的方法(Flow Cytometry:A PracticalApproach)》,牛津大学出版社(Oxford Univ.Press)(1997)；Jaroszeski等人(编辑),《流式细胞术方案(Flow Cytometry Protocols)》,分子生物学方法(Methods in MolecularBiology)No.91、Humana出版社(1997)；《实用流式细胞术(Practical Flow Cytometry)》，第3版，Wiley-Liss(1995)；Virgo等人(2012)《临床生物化学年鉴(Ann Clin Biochem)》.Jan；49(pt 1):17-28；Linden等人,《血栓形成和止血研讨会(Semin Throm Hemost.)》2004年10月；30(5):502-11；Alison等人,《病理学杂志(JPathol)》,2010年12月；222(4):335-344；和Herbig等人,(2007)《治疗药物载体系统的评论(Crit Rev Ther Drug CarrierSyst.)》24(3):203-255中描述的那些；它们的公开内容通过引用并入本文。在某些实例中，感兴趣的流式细胞术系统包括BD Biosciences FACSCantoTM流式细胞仪、BD BiosciencesFACSCantoTMII流式细胞仪、BD AccuriTM流式细胞仪、BD AccuriTM C6 Plus流式细胞仪、BD Biosciences FACSCelestaTM流式细胞仪、BD Biosciences FACSLyricTM流式细胞仪、BD Biosciences FACSVerseTM流式细胞仪、BD Biosciences FACSymphonyTM流式细胞仪、BD Biosciences LSRFortessaTM流式细胞仪、BD Biosciences LSRFortessaTM X-20流式细胞仪、BD Biosciences FACSPrestoTM流式细胞仪、BD Biosciences FACSViaTM流式细胞仪和BD Biosciences FACSCaliburTM细胞分选器、BD Biosciences FACSCountTM细胞分选器、BD Biosciences FACSLyricTM细胞分选器、BD Biosciences ViaTM细胞分选器、BDBiosciences InfluxTM细胞分选器、BD Biosciences JazzTM细胞分选器、BD BiosciencesAriaTM细胞分选器、BD Biosciences FACSAriaTMII细胞分选器、BD BiosciencesFACSAriaTMIII细胞分选器、BD Biosciences FACSAriaTMFusion细胞分选器和BDBiosciences FACSMelodyTM细胞分选器、BD Biosciences FACSymphonyTM S6细胞分选器等。
在一些实施方案中，主题系统是流式细胞术系统，例如在美国专利号10,663,476；10,620,111；10,613,017；10,605,713；10,585,031；10,578,542；10,578,469；10,481,074；10,302,545；10,145,793；10,113,967；10,006,852；9,952,076；9,933,341；9,726,527；9,453,789；9,200,334；9,097,640；9,095,494；9,092,034；8,975,595；8,753,573；8,233,146；8,140,300；7,544,326；7,201,875；7,129,505；6,821,740；6,813,017；6,809,804；6,372,506；5,700,692；5,643,796；5,627,040；5,620,842；5,602,039；4,987,086；4,498,766中描述的那些；它们的公开内容通过引用以其整体并入本文。
在一些实施方案中，主题系统是粒子分选系统，所述粒子分选系统被配置为利用封闭的粒子分选模块对粒子进行分选，例如在美国专利公开第2017/0299493号(其公开内容通过引用并入本文)中描述的那些粒子分选系统。在某些实施方案中，使用具有多个分选决策单元的分选决策模块对样品的粒子(例如细胞)进行分选，例如在美国专利公开第2020/0256781号(其公开内容通过引用并入本文)中所述的那些分选决策单元。在一些实施方案中，主题系统包括具有偏转板的粒子分选模块，如2017年3月28日提交的美国专利公开第2017/0299493号(其公开内容通过引用并入本文)中所述。
在某些实例中，本发明的流式细胞术系统被配置成用于通过使用射频标记发射(FIRE)的荧光成像对流动流中的粒子进行成像，例如在Diebold等人，《自然光子学(NaturePhotonics)》Vol.7(10)；806-810(2013)中描述的以及在美国专利号9,423,353；9,784,661；9,983,132；10,006,852；10,078,045；10,036,699；10,222,316；10,288,546；10,324,019；10,408,758；10,451,538；10,620,111；和美国专利公开号2017/0133857；2017/0328826；2017/0350803；2018/0275042；2019/0376895和2019/0376894中描述的那些，它们的公开内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，系统是粒子分析仪，其中粒子分析系统401(图4A)可以用于分析和表征粒子，有或没有将粒子物理分选到收集容器中。图4A示出了用于基于计算的样品分析和粒子表征的粒子分析系统的功能框图。在一些实施方案中，粒子分析系统401是流动系统。图4A所示的粒子分析系统401可以被配置成全部或部分执行例如本文所述的方法。粒子分析系统401包括流体学系统402。流体学系统402可以包括样品管405和样品管内的移动流体柱，或者与样品管405和样品管内的移动流体柱耦合，其中样品的粒子403(例如细胞)沿着公共样品路径409移动。
粒子分析系统401包括检测系统404，该检测系统404被配置为当每个粒子沿着公共样品路径通过一个或多个检测站时从每个粒子收集信号。检测站408通常是指公共样品路径的监测区域407。在一些实施方式中，检测可以包括在粒子403穿过监测区域407时检测光或粒子403的一种或多种其他性质。在图4A中，示出了具有一个监测区域407的一个检测站408。粒子分析系统401的一些实施方式可以包括多个检测站。此外，一些检测站可以监测多于一个区域。
每个信号被分配信号值以形成每个粒子的数据点。如上所述，该数据可以被称为事件数据。数据点可以是多维数据点，包括为粒子测量的相应性质的值。检测系统404被配置成在第一时间间隔中收集一系列此类数据点。
粒子分析系统401还可以包括控制系统306。控制系统406可以包括一个或多个处理器、振幅控制电路和/或频率控制电路。所示的控制系统可以在操作上与流体学系统402相关联。控制系统可以被配置成基于泊松分布和由检测系统404在第一时间间隔期间收集的数据点的数量来生成第一时间间隔的至少一部分的计算的信号频率。控制系统406可以进一步被配置成基于第一时间间隔的部分中的数据点的数量来生成实验信号频率。控制系统406还可以将实验信号频率与计算的信号频率或预定的信号频率进行比较。
图4B示出了根据本发明的说明性实施方案的用于流式细胞术的系统400。系统400包括流式细胞仪410、控制器/处理器490和存储器495。流式细胞仪410包括一个或多个激发激光器415a-415c、聚焦透镜420、流动室425、前向散射检测器430、侧向散射检测器435、荧光收集透镜440、一个或多个分束器445a-445g、一个或多个带通滤波器450a-450e、一个或多个长通(“LP”)滤波器455a-455b以及一个或多个荧光检测器460a-460f。
激发激光器115a-c发射激光束形式的光。在图4B的示例性系统中，从激发激光器415a-415c发射的激光束的波长分别为488nm、633nm和325nm。激光束首先被引导通过一个或多个分束器445a和445b。分束器445a透射488nm的光并反射633nm的光。分束器445b透射紫外光(波长在10至400nm范围内的光)并且反射488nm和633nm的光。
激光束然后被引导到聚焦透镜420，该聚焦透镜420将光束聚焦到流动室425内的流体流的样品的粒子所在的部分上。流动室是流体学系统的一部分，该流体学系统将流中的粒子(通常一次一个粒子)引导至聚焦的激光束以用于查询。流动室可以包括台式细胞仪中的流动池或空气中流动细胞仪中的喷嘴尖端。
来自激光束的光通过衍射、折射、反射、散射和吸收与样品中的粒子相互作用，并根据粒子的特性(例如粒子的尺寸、内部结构和附着于粒子或天然存在于粒子上或粒子中的一种或多种荧光分子的存在)以各种不同的波长重新发射。荧光发射以及衍射光、折射光、反射光和散射光可以通过分束器445a-445g、带通滤波器450a-450e、长通滤波器455a-455b和荧光收集透镜440中的一个或多个被路由到前向散射检测器430、侧向散射检测器435和一个或多个荧光检测器460a-460f中的一个或多个。
荧光收集透镜440收集从粒子-激光束相互作用中发出的光，并且将该光导向一个或多个分束器和滤波器。带通滤波器(例如带通滤波器450a-450e)允许窄范围的波长通过滤波器。例如，带通滤波器450a是510/20滤波器。第一个数字代表光谱带的中心。第二个数字提供了光谱带的范围。因此，510/20滤波器在光谱带的中心的每一侧延伸10nm，或从500nm到520nm。短通滤波器传输波长等于或短于规定的波长的光。长通滤波器(例如长通滤波器455a-455b)透射波长等于或长于规定波长的光的光。例如，长通滤波器455a(其是670nm的长通滤波器)透射等于或长于670nm的光。通常选择滤波器来优化检测器对特定荧光染料的特异性。可以配置滤波器，使得传输到检测器的光的光谱带接近荧光染料的发射峰。
分束器将不同波长的光以不同的方向引导。分束器可以通过滤波器性质(例如短通和长通)来表征。例如，分束器445g是620SP分束器，这意味着分束器445g透射波长为620nm或更短的光，并且在不同方向上反射波长大于620nm的光。在一个实施方案中，分束器445a-445g可以包括光学反射镜，例如二向色镜(dichroic mirror)。
前向散射检测器430被定位成稍微偏离穿过流动池的直接光束的轴线，并且被配置成检测衍射光，即主要在前向方向上跨过或绕过粒子的激发光。由前向散射检测器检测到的光强度取决于粒子的整体尺寸。前向散射检测器可以包括光电二极管。侧向散射检测器435被配置成检测来自粒子的表面和内部结构的折射和反射光，并且倾向于随着结构的粒子复杂性的增加而增加。可以由一个或多个荧光检测器460a-460f来检测来自与粒子相关联的荧光分子的荧光发射。侧向散射检测器435和荧光检测器可以包括光电倍增管。在前向散射检测器430、侧向散射检测器435和荧光检测器处检测到的信号可以被检测器转换成电信号(电压)。该数据可以提供关于样品的信息。
本领域技术人员将认识到，根据本发明的实施方案的流式细胞仪不限于图4B描绘的流式细胞仪，而是可以包括本领域中已知的任何流式细胞仪。例如，流式细胞仪可以在各种波长和各种不同配置下具有任何数量的激光器、分束器、滤波器和检测器。
在操作中，细胞仪的操作由控制器/处理器490控制，并且来自检测器的测量数据可以存储在存储器495中并由控制器/处理器490处理。虽然没有明确示出，但是控制器/处理器190被耦合到检测器以接收来自检测器的输出信号，并且还可以被耦合到流式细胞仪400的电气和机电部件以控制激光器、流体流动参数等。在系统中还可以提供输入/输出(I/O)能力497。存储器495、控制器/处理器490和I/O 497可以完全作为流式细胞仪410的组成部分提供。在此类实施方案中，显示器也可以形成I/O能力497的一部分，用于向细胞仪400的用户呈现实验数据。可替代地，存储器495和控制器/处理器490以及I/O能力中的一些或全部可以是诸如通用计算机的一个或多个外部设备的一部分。在一些实施方案中，存储器495和控制器/处理器490中的一些或全部可以与细胞仪410无线或有线通信。控制器/处理器490结合存储器495和I/O 497可以被配置成执行与流式细胞仪实验的准备和分析相关的各种功能。
图4B所示的系统包括六个不同的检测器，这些检测器检测如由从流动池425到每个检测器的光束路径中的滤波器和/或分路器的配置所定义的六个不同波长带(在本文中，对于给定的检测器，其可以称为“滤波器窗口”)中的荧光。用于流式细胞仪实验的不同荧光分子将在其自身的特征波长带中发光。用于实验的特定荧光标记物及其相关的荧光发射带可以被选择为通常与检测器的滤波器窗口一致。然而，随着提供了更多的检测器，并且使用了更多的标记物，滤波器窗口和荧光发射光谱之间的完美对应是不可能的。通常确实，尽管特定荧光分子的发射光谱的峰值可能位于一个特定检测器的滤波器窗口内，但该标记物的一些发射光谱也将与一个或多个其他检测器的滤波器窗口重叠。这可以被称为溢出(spillover)。I/O497可以被配置为接收关于流式细胞仪实验的数据，该流式细胞仪实验具有一组荧光标记物和具有多个标志物的多个细胞群，每个细胞群具有多个标志物的子集。I/O 497还可以被配置为接收将一个或多个标志物分配给一个或多个细胞群的生物数据、标志物密度数据、发射光谱数据、将标记物分配给一个或多个标志物的数据以及细胞仪配置数据。流式细胞仪实验数据例如标记物光谱特性和流式细胞仪配置数据也可以存储在存储器495中。控制器/处理器490可以被配置为评估标记物到标志物的一个或多个分配。
图5示出了用于分析和显示生物事件的粒子分析仪控制系统(例如分析控制器500)的一个实例的功能框图。分析控制器500可以被配置为实施用于控制生物事件的图形显示的各种过程。
粒子分析仪或分选系统502可以被配置成获取生物事件数据。例如，流式细胞仪可以生成流式细胞术事件数据。粒子分析仪502可以被配置为向分析控制器500提供生物事件数据。在粒子分析仪或分选系统502和分析控制器500之间可以包括数据通信通道。生物事件数据可以经由数据通信通道被提供给分析控制器500。
分析控制器500可以被配置成从粒子分析仪或分选系统502接收生物事件数据。从粒子分析仪或分选系统502接收的生物事件数据可以包括流式细胞术事件数据。分析控制器500可以被配置为向显示设备506提供包括生物事件数据的第一绘图的图形显示。例如，分析控制器500还可以被配置为将感兴趣的区域呈现为由显示设备506显示的生物事件数据群体周围的门，覆盖在第一绘图上。在一些实施方案中，门可以是绘制在单参数直方图或双变量图上的一个或多个感兴趣的图形区域的逻辑组合。在一些实施方案中，显示器可以用于显示粒子参数或饱和的检测器数据。
分析控制器500可以进一步被配置为在门内的显示设备506上显示生物事件数据，不同于门外的生物事件数据中的其他事件。例如，分析控制器500可以被配置为使得包含在门内的生物事件数据的颜色与门外的生物事件数据的颜色不同。显示设备506可以被实施为监视器、平板电脑、智能手机或被配置成呈现图形界面的其他电子设备。
分析控制器500可以被配置为从第一输入设备接收识别门的门选择信号。例如，第一输入设备可以被实施为鼠标510。鼠标510可以向分析控制器500发起门选择信号，识别待在显示设备506上显示或经由显示设备506操作的门(例如，当光标位于期望的门上或期望的门内时，通过在期望的门上或在期望的门中点击)。在一些实施方式中，第一设备可以被实施为键盘508或用于向分析控制器500提供输入信号的其他设备，例如触摸屏、触笔、光学检测器或语音识别系统。一些输入设备可以包括多种输入功能。在此类实现方式中，输入功能每个都可以被认为是输入设备。例如，如图5所示，鼠标510可以包括鼠标右键和鼠标左键，它们中的每一个都可以生成触发事件。
触发事件可以导致分析控制器500改变显示数据的方式、数据的哪些部分实际显示在显示设备506上，和/或提供输入以进行进一步处理，例如选择感兴趣的群体用于粒子分选。
在一些实施方案中，分析控制器500可以被配置成检测何时通过鼠标510启动门选择。分析控制器500可以进一步被配置为自动修改绘图可视化以促进门控过程。该修改可以基于由分析控制器500接收的生物事件数据的特定分布。
分析控制器500可以连接到存储设备504。存储设备504可以被配置为接收和存储来自分析控制器500的生物事件数据。存储设备504还可以被配置为接收和存储来自分析控制器500的流式细胞术事件数据。存储设备504可以进一步被配置成允许通过分析控制器500检索生物事件数据，例如流式细胞术事件数据。
显示设备506可以被配置成从分析控制器500接收显示数据。显示数据可以包括生物事件数据的绘图和概述绘图的部分的门。显示设备506可以进一步被配置成根据从分析控制器500接收的输入并结合来自粒子分析仪502、存储设备504、键盘508和/或鼠标510的输入来改变所呈现的信息。
在一些实施方式中，分析控制器500可以生成用户界面以接收用于分选的示例性事件。例如，用户界面可以包括用于接收示例性事件或示例性图像的控件(control)。示例性事件或图像或示例性门可以在收集样品的事件数据之前提供，或者基于样品的一部分的初始事件集提供。
图6A是根据本文呈现的一个实施方案的粒子分选系统600(例如，粒子分析仪或分选系统502)的示意图。在一些实施方案中，粒子分选系统600是细胞分选系统。如图6A所示，液滴形成换能器602(例如压电振荡器)被耦合到流体导管601，该流体导管601可以耦合到喷嘴603、可以包括喷嘴603或者可以是喷嘴603。在流体导管601内，鞘液604流体动力学地将包含粒子609的样品流体606聚焦到移动的流体柱608(例如流)中。在移动的流体柱608内，粒子609(例如，细胞)被排成一列以跨过由照射源612(例如，激光器)照射的监测区域611(例如，激光流相交的地方)。液滴形成换能器602的振动导致移动的流体柱608分裂成多个液滴610，其中一些液滴包含粒子609。
在操作中，检测站614(例如，事件检测器)识别感兴趣的粒子(或感兴趣的细胞)何时跨过监测区域611。检测站614馈送到定时电路628中，定时电路628又馈送到闪光充电电路630中。在由定时液滴延迟(Δt)通知的液滴中断点处，可以向移动的流体柱608施加闪光充电，使得感兴趣的液滴携带电荷。感兴趣的液滴可以包括一个或多个待分选的粒子或细胞。然后，可以通过激活偏转板(未示出)将带电的液滴偏转到例如收集管或多孔或微孔样品板的容器中来分选带电的液滴，其中孔或微孔可以与特别感兴趣的液滴相关联。如图6A所示，液滴可以收集在排放容器638中。
检测系统616(例如，液滴边界检测器)用于在感兴趣的粒子经过监测区域611时自动确定液滴驱动信号的相位。示例性的液滴边界检测器描述在美国专利第7,679,039号(其通过引用以其整体并入本文)中。检测系统616允许仪器精确地计算每个检测到的粒子在液滴中的位置。检测系统616可以馈送到振幅信号620和/或相位信号618中，该振幅信号620和/或相位信号618又馈送到(经由放大器622)振幅控制电路626和/或频率控制电路624中。振幅控制电路626和/或频率控制电路624又控制液滴形成换能器602。振幅控制电路626和/或频率控制电路624可以包含在控制系统中。
在一些实施方式中，分拣电子设备(例如，检测系统616、检测站614和处理器640)可以与被配置成存储检测到的事件和基于检测到的事件的分选决策的存储器耦合。分选决策可以包含在粒子的事件数据中。在一些实施方式中，检测系统616和检测站614可以被实施为单个检测单元或被通信耦合，使得事件测量结果可以由检测系统616或检测站614之一收集并提供给非收集元件。
图6B是根据本文呈现的一个实施方案的粒子分选系统的示意图。图6B所示的粒子分选系统600包括偏转板652和654。电荷可以经由倒钩中的流充电线施加。这生成了包含用于分析的粒子610的液滴流610。可以用一个或多个光源(例如激光器)照射粒子以生成光散射和荧光信息。例如通过分选电子设备或其他检测系统(在图6B中未示出)来分析粒子的信息。偏转板652和654可以被独立控制以吸引或排斥带电的液滴，从而将液滴朝向目的收集容器(例如672、674、676或678中的一个)引导。如图6B所示，可以控制偏转板652和654以将粒子沿着第一路径662朝向容器674引导或沿着第二路径668朝向容器678引导。如果粒子不是感兴趣的(例如，在规定的分选范围内不显示散射或照明信息)，则偏转板可以允许粒子继续沿着流动路径664行进。此类不带电的液滴可以例如经由抽吸器670进入废物容器。
可以包括分选电子设备以启动测量值的收集、接收粒子的荧光信号并且确定如何调节偏转板以引起粒子的分选。图6B所示的实施方案的示例性实施方式包括由美国BD公司(Becton,Dickinson和Company)(新泽西州富兰克林湖(Franklin Lakes,NJ))商业提供的BD FACSAriaTM系列流式细胞仪。
计算机控制的系统
本公开的方面进一步包括计算机控制的系统，其中系统进一步包括一个或多个计算机，用于本文所述的方法的完全自动化或部分自动化。在一些实施方案中，系统包括具有计算机可读存储介质的计算机，在计算机可读存储介质上存储有计算机程序，其中计算机程序在被加载到计算机上时包括用于利跨过流动流的水平轴线的光检测系统检测光的指令、用于在光检测系统的成像光电检测器通道中在跨过流动流的多个像素位置生成数据信号的指令以及用于响应于所生成的数据信号计算跨过流动流的每个像素位置的检测器增益校正因子的指令。
在一些实例中，计算机程序包括用于在跨过流动流的多个位置同时检测光的指令。
在某些实施方案中，计算机程序包括用于确定每个像素位置生成的数据信号的强度的指令。在其他实施方案中，计算机程序包括用于基于生成的数据信号确定每个像素位置的峰值脉冲幅度的指令。在其他实施方案中，计算机程序包括用于确定每个像素位置生成的数据信号的脉冲面积的指令。
在一些实施方案中，计算机程序包括用于将检测器增益校正因子应用于在光检测系统的一个或多个非成像光电检测器通道中生成的数据信号的指令。在一些实例中，计算机程序包括用于对每个像素位置的信号强度施加调整，使得跨过流动流的数据信号之间的强度变化为10％或更小的指令，例如9％或更小，例如8％或更小，例如7％或更小，例如6％或更小，例如5％或更小，例如4％或更小，例如3％或更小，例如2％或更小，例如1％或更小，例如0.5％或更小，例如0.1％或更小，例如0.05％或更小，例如0.01％或更小并且包括0.001％或更小。在一些实例中，计算机程序包括用于对每个像素位置的峰值脉冲幅度施加调整，使得跨过流动流的峰值脉冲幅度之间的变化为10％或更小的指令，例如9％或更小，例如8％或更小，例如7％或更小，例如6％或更小，例如5％或更小，例如4％或更小，例如3％或更小，例如2％或更小，例如1％或更小，例如0.5％或更小，例如0.1％或更小，例如0.05％或更小，例如0.01％或更小并且包括0.001％或更小。在一些实例中，计算机程序包括用于对每个像素位置生成的数据信号的脉冲面积施加调整，使得跨过流动流的脉冲面积之间的变化为10％或更小的指令，例如9％或更小，例如8％或更小，例如7％或更小，例如6％或更小，例如5％或更小，例如4％或更小，例如3％或更小，例如2％或更小，例如1％或更小，例如0.5％或更小，例如0.1％或更小，例如0.05％或更小，例如0.01％或更小并且包括0.001％或更小。在某些实例中，计算机程序包括用于确定跨过流动流的像素位置之间的信号强度变化的指令，例如通过基于每个像素位置确定的数据信号强度来计算稳健变化系数(rCV)。在某些实施方案中，计算机程序包括用于将检测器增益校正因子应用于非成像光电检测器通道中的数据信号，以便将跨过流动流的非成像光电检测器数据信号强度的稳健变化系数降低0.1％或更多的指令，例如0.2％或更多，例如0.3％或更多，例如0.4％或更多，例如0.5％或更多，例如0.6％或更多，例如0.7％或更多，例如0.8％或更多，例如0.9％或更多，例如1.0％或更多，例如1.5％或更多，例如2.0％或更多，并且包括将跨过流动流的数据信号强度的稳健变化系数降低2.5％或更多。
在某些实施方案中，计算机程序包括基于应用于每个像素位置的数据信号的所确定的检测器增益校正因子的检测器增益校正因子数据文件。在一些实例中，数据增益校正因子数据文件作为每个像素位置的检测器增益校正因子的表格被存储在计算机程序中。
在实施方案中，系统包括输入模块、处理模块和输出模块。主题系统可以包括硬件部件和软件部件两者，其中硬件部件可以采用一个或多个平台的形式，例如服务器的形式，使得功能元件，即系统的执行特定任务(例如管理信息的输入和输出、处理信息等)的那些元件可以通过在系统所代表的一个或多个计算机平台上和跨过该一个或更多计算机平台执行软件应用来实施。
系统可以包括显示器和操作者输入设备。操作者输入设备可以是例如键盘、鼠标等。处理模块包括处理器，该处理器可以访问其上存储有用于执行主题方法的步骤的指令的存储器。处理模块可以包括操作系统、图形用户界面(GUI)控制器、系统存储器、存储器存储设备和输入输出控制器、高速缓冲存储器、数据备份单元和许多其他设备。处理器可以是商业上可获得的处理器，或者它可以是可用的或将要可用的其他处理器之一。处理器执行操作系统，并且操作系统以熟知的方式与固件和硬件接口，并且有助于处理器协调和执行各种计算机程序的功能，这些计算机程序可以用各种编程语言(例如Java、Perl、C++、其他高级或低级语言及其组合)编写，如本领域中已知的。操作系统通常与处理器协作，协调并执行计算机的其他部件的功能。操作系统还根据已知技术提供调度、输入输出控制、文件和数据管理、存储器管理、以及通信控制和相关服务。处理器可以是任何合适的模拟或数字系统。在一些实施方案中，处理器包括模拟电子器件，该模拟电子器件允许用户基于第一光信号和第二光信号手动地将光源与流动流对准。在一些实施方案中，处理器包括提供反馈控制(例如如负反馈控制)的模拟电子器件。
系统存储器可以是各种已知或未来的存储器存储设备中的任何一种。实例包括任何通常可用的随机存取存储器(RAM)、磁介质(例如常驻硬盘或磁带)、光学介质(例如读写光盘)、闪速存储器设备或其他存储器存储设备。存储器存储设备可以是各种已知或未来的设备中的任何一种，包括光盘驱动器、磁带驱动器、可移动硬盘驱动器或软盘驱动器。这种类型的存储器存储设备通常从程序存储介质(未示出)读取和/或向该程序存储介质写入，所述程序存储介质例如分别是光盘、磁带、可移动硬盘或软盘。这些程序存储介质中的任何一种，或者现在使用的或以后可能开发的其他介质，都可以被认为是计算机程序产品。如将理解的，这些程序存储介质通常存储计算机软件程序和/或数据。计算机软件程序(也称为计算机控制逻辑)通常存储在系统存储器和/或与存储器存储设备结合使用的程序存储设备中。
在一些实施方案中，描述了一种计算机程序产品，包括其中存储有控制逻辑(计算机软件程序，包括程序代码)的计算机可用介质。控制逻辑当由计算机的处理器执行时使得处理器执行本文描述的功能。在其他实施方案中，一些功能主要使用例如硬件状态机在硬件中实现。硬件状态机的实现以便执行本文所描述的功能对于相关领域的技术人员将是显而易见的。
存储器可以是处理器可以在其中存储和检索数据的任何合适的设备，例如磁学、光学或固态存储设备(包括磁盘或光盘或磁带或RAM，或任何其他合适的设备，固定的或便携式的)。处理器可以包括通用数字微处理器，该通用数字微处理器由携带必要程序代码的计算机可读介质适当地编程。程序可以通过通信通道被远程地提供给处理器，或者使用与存储器相关联的那些设备中的任何一个预先保存在计算机程序产品(例如存储器或一些其他便携式或固定的计算机可读存储介质)中。例如，磁盘或光盘可以承载程序，并且可以由盘写入器/读取器读取。本发明的系统还包括例如以计算机程序产品形式的程序、用于实践如上所述的方法的算法。根据本发明的程序可以记录在计算机可读介质(例如可以由计算机直接读取和访问的任何介质)上。此类介质包括但不限于：磁存储介质，例如软盘、硬盘存储介质和磁带；光学存储介质，例如CD-ROM；电存储介质，例如RAM和ROM；便携式闪速驱动器；以及这些类别的混合，例如磁存储介质/光学存储介质。
处理器还可以访问通信通道以与远程位置的用户通信。远程位置意指用户不直接与系统接触，而是将输入信息从外部设备中继到输入管理器，所述外部设备例如连接到广域网(“WAN”)、电话网络、卫星网络或任何其他合适的通信通道的计算机，包括移动电话(即智能电话)。
在一些实施方案中，根据本公开的系统可以被配置成包括通信接口。在一些实施方案中，通信接口包括用于与网络和/或另一设备通信的接收器和/或发射器。通信接口可以被配置成用于有线或无线通信，包括但不限于射频(RF)通信(例如，射频识别(RFID)、Zigbee通信协议、WiFi、红外、无线通用串行总线(USB)、超宽带(UWB)、通信协议和蜂窝通信，例如码分多址(CDMA)或全球移动通信系统(GSM)。
在一个实施方案中，通信接口被配置为包括一个或多个通信端口，例如物理端口或接口，例如USB端口、RS-232端口或任何其他合适的电连接端口，以允许主题系统和其他外部设备之间的数据通信，所述外部设备例如被配置成用于类似的补充数据通信的计算机终端(例如，在医生的办公室或在医院环境中)。
在一个实施方案中，通信接口被配置成用于红外通信、通信或任何其他合适的无线通信协议，以使主题系统能够与其他设备，例如计算机终端和/或网络、支持通信的移动电话、个人数字助理或用户可以结合使用的任何其他通信设备通信。
在一个实施方案中，通信接口被配置为通过蜂窝电话网络、短消息服务(SMS)、与连接到互联网的局域网(LAN)上的个人计算机(PC)的无线连接或者在WiFi热点处与互联网的WiFi连接来提供利用互联网协议(IP)的数据传输的连接。
在一个实施方案中，主题系统被配置为经由通信接口与服务器设备无线通信，例如使用例如802.11或RF协议或IrDA红外协议的通用标准。服务器设备可以是另一个便携式设备，例如智能电话、个人数字助理(PDA)或笔记本电脑；或者更大的设备，例如台式计算机、电器等。在一些实施方案中，服务器设备具有显示器，例如液晶显示器(LCD)，以及输入设备，例如按钮、键盘、鼠标或触摸屏。
在一些实施方案中，通信接口被配置为使用上述通信协议和/或机制中的一个或多个与网络或服务器设备自动或半自动地传送存储在主题系统中的数据，例如存储在任选的数据存储单元中的数据。
输出控制器可以包括用于向用户呈现信息的各种已知显示设备中的任何一种的控制器，无论用户是人还是机器，无论是本地的还是远程的。如果显示设备之一提供视觉信息，则该信息通常可以在逻辑上和/或在物理上被组织为图像元素的阵列。图形用户界面(GUI)控制器可以包括多种已知或未来的软件程序中的任何一种，用于在系统和用户之间提供图形输入和输出界面，并且用于处理用户输入。计算机的功能元件可以经由系统总线相互通信。这些通信中的一些可以在替代实施方案中使用网络或其他类型的远程通信来实现。输出管理器还可以根据已知技术例如通过互联网、电话或卫星网络向远程位置的用户提供由处理模块生成的信息。通过输出管理器的数据的呈现可以根据各种已知技术来实现。作为一些实例，数据可以包括SQL、HTML或XML文档、电子邮件或其他文件，或者其他形式的数据。数据可以包括互联网URL地址，使得用户可以从远程源检索另外的SQL、HTML、XML或其他文档或数据。主题系统中存在的一个或多个平台可以是任何类型的已知计算机平台或将来要开发的类型，尽管它们通常将属于通常被称为服务器的一类计算机。然而，它们也可以是主机架计算机、工作站或其他计算机类型。它们可以经由任何已知或未来类型的电缆或包括无线系统在内的其他通信系统(联网或以其他方式)连接。它们可以位于同一位置，或者它们可以在物理上分开。可能取决于所选择的计算机平台的类型和/或构造，可以在任何计算机平台上采用各种操作系统。合适的操作系统包括Windows NTò、Windows XP、Windows7、Windows 8、iOS、Sun Solaris、Linux、OS/400、Compaq Tru64 Unix、SGI IRIX、Siemens Reliant Unix等。
图7描绘了根据某些实施方案的示例性的计算设备700的总体架构。图7中描绘的计算设备700的总体架构包括计算机硬件和软件部件的布置。计算设备700可以包括比图7所示的元件更多(或更小)的元件。然而，没有必要为了提供能够实现的公开内容而示出所有这些通常常规的元件。如所示出的，计算设备700包括处理单元710、网络接口720、计算机可读介质驱动器730、输入/输出设备接口740、显示器750和输入设备760，所有这些都可以通过通信总线彼此通信。网络接口720可以提供到一个或多个网络或计算系统的连接。处理单元710因此可以经由网络从其他计算系统或服务器接收信息和指令。处理单元710还可以与存储器770通信以及从存储器770通信，并且进一步经由输入/输出设备接口740为任选的显示器750提供输出信息。输入/输出设备接口740还可以接受来自任选的输入设备760的输入，所述任选的输入设备760例如键盘、鼠标、数字笔、麦克风、触摸屏、手势识别系统、语音识别系统、游戏手柄、加速度计、陀螺仪或其他输入设备。
存储器770可以包含计算机程序指令(在一些实施方案中被分组为模块或部件)，处理单元710执行这些计算机程序指令以便实施一个或多个实施方案。存储器770通常包括RAM、ROM和/或其他持久性计算机可读介质、辅助性计算机可读介质或非暂时性计算机可读介质。存储器770可以存储操作系统772，该操作系统772提供计算机程序指令供处理单元710在计算设备700的一般管理和操作中使用。存储器770可以进一步包括用于实施本公开的各方面的计算机程序指令和其他信息。
非暂时性计算机可读存储介质
本公开的各方面进一步包括具有用于实践主题方法的指令的非暂时性计算机可读存储介质。可以在一台或多台计算机上使用计算机可读存储介质，用于实践本文所述的方法的系统的完全自动化或部分自动化。在某些实施方案中，根据本文描述的方法的指令可以以“编程”的形式被编码到计算机可读介质上，其中如本文使用的术语“计算机可读介质”是指参与向计算机提供指令和数据以用于执行和处理的任何非暂时性存储介质。合适的非暂时性存储介质的实例包括软盘、硬盘、光盘、磁-光盘、CD-ROM、CD-R、磁带、非易失性存储卡、ROM、DVD-ROM、蓝光光盘、固态硬盘和网络附加存储(NAS)，无论此类设备是在计算机内部还是在计算机外部。包含信息的文件可以“存储”在计算机可读介质上，其中“存储”意味着记录信息，使得它可以在以后由计算机访问和检索。本文描述的计算机实现的方法可以使用可以以任何数量的计算机编程语言中的一种或多种编写的程序来执行。此类语言包括例如Java(Sun Microsystems公司,加利福尼亚州圣克拉拉(Santa Clara,CA))、Visual Basic(Microsoft公司,华盛顿州雷德蒙(Redmond,WA))和C++(AT&T公司，新泽西州贝德明斯特(Bedminster,NJ))以及任何许多其他语言。
在一些实施方案中，感兴趣的计算机可读存储介质包括存储在其上的计算机程序，其中计算机程序在加载到计算机上时包括指令，该指令具有用于利跨过流动流的水平轴线的光检测系统检测光的算法、用于在光检测系统的成像光电检测器通道中在跨过流动流的多个像素位置生成数据信号的算法以及用于响应于所生成的数据信号计算跨过流动流的每个像素位置的检测器增益校正因子的算法。在一些实例中，非暂时性计算机可读存储介质包括用于在跨过流动流的多个位置同时检测光的算法。
在某些实施方案中，非暂时性计算机可读存储介质包括用于确定每个像素位置生成的数据信号的强度的算法。在其他实施方案中，非暂时性计算机可读存储介质包括用于基于所生成的数据信号来确定每个像素位置的峰值脉冲幅度的算法。在其他实施方案中，非暂时性计算机可读存储介质包括用于确定每个像素位置生成的数据信号的脉冲面积的算法。在某些实例中，非暂时性计算机可读存储介质包括用于绘制每个像素位置生成的数据信号的信号强度、峰值幅度和脉冲面积中的一个或多个的算法。在一些实施方案中，非暂时性计算机可读存储介质包括用于评估跨过流动流的水平轴线的所生成的数据信号的信号强度、峰值幅度或脉冲面积的变化的算法。在某些实施方案中，非暂时性计算机可读存储介质包括用于计算跨过流动流的所生成的数据信号的信号强度、峰值幅度或脉冲面积中的一个或多个的稳健变化系数的算法。例如，数据信号强度的稳健变化系数可以基于在每个像素位置的绘制的数据信号来计算。
在一些实施方案中，非暂时性计算机可读存储介质包括用于基于跨过流动流的生成的数据信号来计算成像光电检测器通道中每个像素位置的检测器增益校正因子的算法。在一些实施方案中，通过确定对每个像素位置的信号强度的调整来计算检测器增益校正因子，使得跨过流动流的数据信号之间几乎没有强度变化。例如，检测器增益校正因子可以是对每个像素位置的信号强度的调整，使得跨过流动流的数据信号之间的强度变化为10％或更小，例如9％或更小，例如8％或更小，例如7％或更小，例如6％或更小，例如5％或更小，例如4％或更小，例如3％或更小，例如2％或更小，例如1％或更小，例如0.5％或更小，例如0.1％或更小，例如0.05％或更小，例如0.01％或更小并且包括0.001％或更小。在一些实施方案中，非暂时性计算机可读存储介质包括用于将检测增益校正因子应用于在成像光电检测器通道中在每个像素位置生成的数据信号的算法，以便将跨过流动流的数据信号强度的稳健变化系数(rCV)降低0.1％或更多，例如0.2％或更多，例如0.3％或更多，例如0.4％或更多，例如0.5％或更多，例如0.6％或更多，例如0.7％或更多，例如0.8％或更多，例如0.9％或更多，例如1.0％或更多，例如1.5％或更多，例如2.0％或更多，并且包括将跨过流动流的数据信号强度的稳健变化系数降低2.5％或更多。
在一些实施方案中，非暂时性计算机可读存储介质包括用于将检测器增益校正因子应用于在光检测系统的一个或多个非成像光电检测器通道中生成的数据信号的算法。在一些实例中，非暂时性计算机可读存储介质包括用于基于来自成像光电检测器通道的增益校正因子和来自非成像光电检测器通道的信号强度来计算在一个或多个非成像光电检测器通道中生成的数据信号的增益校正因子的算法。例如，非暂时性计算机可读存储介质包括用于将经确定的检测器增益校正因子应用于在光检测系统的2个或更多非成像光电检测器通道(例如3个或更多，例如4个或更多，例如8个或更多，例如12个或更多，例如16个或更多，例如24个或更多，例如32个或更多，例如48个或更多，例如64个或更多)中并且包括在光检测系统的128个或更多非成像光电检测器通道中生成的数据信号的算法。在这些实施方案中，非暂时性计算机可读存储介质包括用于应用检测器增益校正因子的算法，以便在非成像光电检测器通道中生成数据信号，所述数据信号跨过流动流几乎没有信号强度变化，例如其中在每个非成像光电检测器通道中跨过流动流的数据信号的强度变化为10％或更小，例如9％或更小，例如8％或更小，例如7％或更小，例如6％或更小，例如5％或更小，例如4％或更小，例如3％或更小，例如2％或更小，例如1％或更小，例如0.5％或更小，例如0.1％或更小，例如0.05％或更小，例如0.01％或更小并且包括0.001％或更小。
在某些实施方案中，非暂时性计算机可读存储介质包括用于基于在每个像素位置确定的检测器增益校正因子来生成检测器增益校正因子数据文件的算法。在一些实例中，数据增益校正因子数据文件包括从成像光电检测器通道确定的每个像素位置的检测器增益校正因子的表格。在一些实例中，非暂时性计算机可读存储介质包括用于将检测器增益校正因子数据文件应用于一组或多组存储的数据信号(例如存储在存储器中的数据信号)的算法。
非暂时性计算机可读存储介质可以在具有显示器和操作者输入设备的一个或多个计算机系统上使用。操作者输入设备可以是例如键盘、鼠标等。处理模块包括处理器，所述处理器能够访问其上存储有用于执行主题方法的步骤的指令的存储器。处理模块可以包括操作系统、图形用户界面(GUI)控制器、系统存储器、存储器存储设备和输入输出控制器、高速缓冲存储器、数据备份单元和许多其他设备。处理器可以是商业上可获得的处理器，或者它可以是可用的或将要可用的其他处理器之一。处理器执行操作系统，并且操作系统以熟知的方式与固件和硬件接口，并且有助于处理器协调和执行各种计算机程序的功能，所述计算机程序可以以各种编程语言(例如Java、Perl、C++、其他高级或低级语言以及其组合)编写，如本领域中已知的。操作系统通常与处理器协作，协调并执行计算机的其他部件的功能。操作系统还根据已知技术提供调度、输入输出控制、文件和数据管理、存储器管理、以及通信控制和相关服务。
集成电路器件
本公开的各方面还包括具有用于实践根据某些实施方案的主题方法的编程的集成电路器件。在一些实施方案中，感兴趣的集成电路器件包括现场可编程门阵列(FPGA)。在其他实施方案中，集成电路器件包括专用集成电路(ASIC)。在其他实施方案中，集成电路器件包括复杂可编程逻辑器件(CPLD)。在一些实施方案中，集成电路包括用于将检测器增益校正因子应用于在光检测系统的一个或多个非成像光电检测器通道中生成的数据信号的编程。在一些实例中，集成电路包括用于基于来自成像光电检测器通道的增益校正因子和来自非成像光电检测器通道的信号强度来计算在一个或多个非成像光电检测器通道中生成的数据信号的增益校正因子的编程。例如，集成电路器件包括用于将检测器增益校正因子应用于在光检测系统的2个或更多非成像光电检测器通道(例如3个或更多，例如4个或更多，例如8个或更多，例如12个或更多，例如16个或更多，例如24个或更多，例如32个或更多，例如48个或更多，例如64个或更多)中并且包括在光检测系统的128个或更多非成像光电检测器通道中生成的数据信号的编程。在这些实施方案中，集成电路器件包括用于应用检测器增益校正因子的编程，以便在非成像光电检测器通道中生成数据信号，所述数据信号表现出跨过流动流几乎没有信号强度变化，例如其中在每个非成像光电检测器通道中跨过流动流的数据信号的强度变化为10％或更小，例如9％或更小，例如8％或更小，例如7％或更小，例如6％或更小，例如5％或更小，例如4％或更小，例如3％或更小，例如2％或更小，例如1％或更小，例如0.5％或更小，例如0.1％或更小，例如0.05％或更小，例如0.01％或更小并且包括0.001％或更小。
在某些实施方案中，集成电路器件包括用于在每个像素位置应用来自检测器增益校正因子数据文件的检测器增益校正因子的编程。在一些实例中，数据增益校正因子数据文件包括从成像光电检测器通道确定的每个像素位置的检测器增益校正因子的表格。在一些实例中，集成电路器件包括用于将检测器增益校正因子数据文件应用于一组或多组存储的数据信号(例如存储在存储器中的数据信号)的编程。
套件(kit)
本公开的各方面进一步包括套件，其中套件包括在本文中描述的光检测系统的一个或多个部件。在一些实施方案中，套件包括多个光电检测器和用于主题系统的程序，例如以计算机可读介质的形式(例如，闪存驱动器、USB存储器、光盘、DVD、蓝光光盘等)或用于从互联网web协议或云服务器下载程序的指令。套件还可以包括光学调节部件，例如透镜、反射镜、滤波器、光纤、波长分离器、针孔、狭缝、准直协议及其组合。
套件可以进一步包括用于实施主题方法的指令。这些指令可以以多种形式存在于主题套件中，其中的一种或多种可以存在于套件中。这些指令可以存在的一种形式是作为印刷的信息存在于合适的介质或基底(例如，其上印刷有信息的一张或多张纸)上、套件的包装中、包装插入物中等。这些指令的另一种形式是其上记录有信息的计算机可读介质，例如磁盘、光盘(CD)、便携式闪存驱动器等。可能存在的这些指令的另一种形式是网站地址，该网站地址可以用于经由互联网访问经移除的站点的信息。
多光谱荧光粒子
如上所述，在一些实施方案中，主题方法包括照射流动流中的粒子。在一些实例中，流动流中的经照射的粒子是具有一种或多种荧光团的粒子(例如珠)。根据某些实施方案的感兴趣的粒子可以包括单峰多荧光团珠，其跨过所有光源波长(例如，跨过系统的所有LED或激光器)以及跨过光电检测器的检测波长提供明亮的光电检测器信号。
在实施方案中，主题粒子被配制成(例如，在流体组合物(fluidic composition)中)用于在如上所述被光源照射的流动流中流动。每个粒子可以具有一种或多种不同类型的荧光团，例如2种或更多种、或3种或更多种、或4种或更多种、或5种或更多种、或6种或更多种、或7种或更多种、或8种或更多种、或9种或更多种、或10种或更多种、或11种或更多种、或12种或更多种、或13种或更多种、或14种或更多种、或15种或更多种、16种或更多种、或17种或更多种、或18种或更多种、或19种或更多种、或20种或更多种、或25种或更多种、或30种或更多种、或35种或更多种、或40种或更多种、或45种或更多种、50种或更多种不同类型的荧光团。例如，每个粒子可以包括2种、或3种、或4种、或5种、或6种、或7种、或8种、或9种、或10种、或11种、或12种、或13种、或14种、或15种、或16种、或17种、或18种、或19种、或20种不同类型的荧光团。
在实施方案中，每个荧光团与粒子稳定地缔合。稳定地缔合意指荧光团不容易从粒子中解离以与液体介质(例如水性介质)接触。在一些实施方案中，一个或多个荧光团与粒子共价缀合。在其他实施方案中，一个或多个荧光团与粒子物理缔合(即非共价结合)。在其他实施方案中，一个或多个荧光团与粒子共价缀合，并且一个或多个荧光团与粒子物理缔合。
在一些实施方案中，每个粒子包括2种或更多种不同类型的荧光团。如果任何两个荧光团因分子式、激发最大值和发射最大值中的一个或多个而彼此不同，则认为它们是不同的。因此，不同的或有区别的荧光团在化学组成方面或在荧光团的一种或多种性质方面可以彼此不同。例如，不同的荧光基团可以在激发最大值和发射最大值中的至少一个方面彼此不同。在一些实例中，不同的荧光团因它们的激发最大值而彼此不同。在一些实例中，不同的荧光团因它们的发射最大值而彼此不同。在一些实例中，不同的荧光团因它们的激发最大值和发射最大值两者而彼此不同。因此，在包括第一荧光团和第二荧光团的实施方案中，第一荧光团和第二荧光团可以因激发最大值和发射最大值中的至少一个而彼此不同。例如，第一荧光团和第二荧光团可以因激发最大值、因发射最大值或因激发最大值和发射最大值两者而彼此不同。如果给定的一组荧光团在激发最大值或发射最大值方面彼此不同，则可以认为它们是不同的，其中在一些实例中，此类差异的幅度(magnitude)为5nm或更大，例如10nm或更大，包括15nm或更大，其中在一些实例中，该差异的幅度的范围为5至400nm，例如10至200nm，包括15至100nm，例如25至50nm。
根据某些实施方案的感兴趣的荧光团具有范围从100nm至800nm，例如150nm至750nm，例如200nm至700nm，例如250nm至650nm，例如300nm至600nm并且包括从400nm至500nm的激发最大值。根据某些实施方案，感兴趣的荧光团具有范围从400nm至1000nm，例如450nm至950nm，例如500nm至900nm，例如550nm至850nm并且包括从600nm至800nm的发射最大值。在某些实例中，荧光团是发光染料，例如峰值发射波长为200nm或更大的荧光染料，例如250nm或更大，例如300nm或更大，例如350nm或更大，例如400nm或更大，例如450nm或更大，例如500nm或更大，例如550nm或更大，例如600nm或更大，例如650nm或更大，例如700nm或更大，例如750nm或更大，例如800nm或更大，例如850nm或更大，例如900nm或更大，例如950nm或更大，例如1000nm或更大并且包括1050nm或更大。例如，荧光团可以是具有范围从200nm至1200nm，例如300nm至1100nm，例如400nm至1000nm，例如500nm至900nm的峰值发射波长的荧光染料，并且包括具有600nm至800nm的峰值发射波长的荧光染料。在某些实施方案中，主题多光谱粒子通过激光提供稳定的激发，所述激光在349nm(UV激光器)、488nm(蓝色激光器)、532nm(Nd:YAG固态激光器)、640nm(红色激光器)和405nm(紫色激光器)的波长照射。在某些实例中，主题多光谱粒子提供通过光源跨过全光谱检测带(例如从350nm到850nm)的稳定激发。
在一些实例中，每个粒子包括荧光团，该荧光团响应于通过光源的照射而发射荧光。在一些实施方案中，感兴趣的荧光团可以包括但不限于适用于分析应用(例如流式细胞术、成像等)的染料，例如吖啶染料、蒽醌染料、芳基甲烷染料、二芳基甲烷染料(例如二苯基甲烷染料)、含叶绿素的染料、三芳基甲烷染料(例如三苯基甲烷染料)、偶氮染料、重氮染料、硝基染料、亚硝基染料、酞菁染料、花青染料、不对称花青染料、醌亚胺染料、吖嗪染料、二氨吖嗪染料(eurhodin dye)、番红染料、茚满、靛酚染料、氟染料、噁嗪染料、噁唑酮染料、噻嗪染料、噻唑染料、呫吨染料、芴染料、派洛宁染料(pyronin dye)、氟染料、罗丹明染料、菲啶染料，以及结合两种或更多种上述染料(例如串联)的染料、具有一种或多种单体染料单元的聚合物染料以及其两种或更多种上述染料的混合物。大量染料可从各种来源商购获得，例如如Molecular Probes(俄勒冈州尤金市(Eugene,OR))、Dyomics GmbH(德国耶拿(Jena,Germany))、Sigma-Aldrich(密苏里州圣路易斯(St.Louis,MO))、Sirigen公司(加利福尼亚州圣巴巴拉(Santa Barbara，CA))和Exciton(俄亥俄州代顿市(Dayton,OH))。例如，荧光团可以包括4-乙酰胺基-4’-异硫氰基芪-2,2’二磺酸；吖啶及其衍生物，例如吖啶、吖啶橙、吖啶黄、吖啶红和吖啶异硫氰酸酯；别藻蓝蛋白、藻红蛋白、紫苏色素-叶绿素蛋白、5-(2’-氨基乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)；4-氨基-N-[3-乙烯基磺酰基)苯基]萘酰亚胺-3,5二磺酸酯(Lucifer黄VS)；N-(4-苯胺基-1-萘基)马来酰亚胺；邻氨基苯甲酰胺；明亮的黄色(Brilliant Yellow)；香豆素及其衍生物，例如香豆素、7-氨基-4-甲基香豆素(AMC，香豆素120)、7-氨基-4-三氟甲基香豆素(香豆冉151)；花青和衍生物，例如四氯四溴荧光素(cyanosine)、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5和Cy7；4’,6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)；5’,5”-二溴邻苯三酚-磺酞(溴邻苯三酚红)；7-二乙基氨基-3-(4’-异硫氰酸苯基)-4-甲基香豆素；二乙基氨基香豆素；二亚乙基三胺五乙酸酯；4,4’-二异硫氰酸二氢-二苯乙烯-2,2’-二磺酸；4,4’-二异硫氰酸二苯乙烯-2,2’-二磺酸；5-[二甲基氨基]萘-1-磺酰氯(DNS，丹磺酰氯(dansyl chloride))；4-(4’-二甲基氨基苯偶氮)苯甲酸(DABCYL)；4-二甲基氨基苯基偶氮苯-4’-异硫氰酸酯(DABITC)；曙红和衍生物例如曙红和曙红异硫氰酸酯；赤藓红和衍生物，例如赤藓红B和赤藓红异硫氰酸酯；乙锭(ethidium)；荧光素和衍生物，例如5-羧基荧光素(FAM)、5-(4,6-二氯三嗪-2-基)氨基荧光素(DTAF)、2’7’-二甲氧基-4’5’-二氯-6-羧基荧光素(JOE)、异硫氰酸荧光素(FITC)、荧光素氯三嗪基、萘荧光素和QFITC(XRITC)；荧光胺；IR144；IR1446；绿色荧光蛋白(GFP)；珊瑚礁荧光蛋白(RCFP)；LissamineTM；丽丝胺罗丹明(Lissamine rhodamine)，Lucifer黄；孔雀石绿异硫氰酸酯；4-甲基伞形酮；邻甲酚酞(ortho cresolphthalein)；硝基酪氨酸；副玫瑰苯胺(pararosaniline)；尼罗红；俄勒冈绿(Oregon Green)；酚红；B-藻红蛋白；邻苯二甲醛；芘和衍生物，例如芘、芘丁酸酯和琥珀酰亚胺基1-芘丁酸酯；活性红4(CibacronTMBrilliant Red 3B-A)；罗丹明和衍生物，例如6-羧基-X-罗丹明(ROX)、6-羧基罗丹明(R6G)、4,7-二氯罗丹明丽丝胺、罗丹明B磺酰氯、罗丹明(Rhod)、罗丹明B、罗丹明123、罗丹明X异硫氰酸酯、磺基罗丹明B、磺基罗丹明101、磺基罗丹明101的磺酰氯衍生物(德克萨斯红)、N,N,N’,N’-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)、四甲基罗丹明和四甲基罗丹明异硫氰酸酯(TRITC)；核黄素；玫红酸和铽螯合物衍生物；呫吨；染料共轭聚合物(即连接聚合物的染料)，例如异硫氰酸荧光素-葡聚糖以及结合两种或更多种染料(例如串联)的染料、具有一种或多种单体染料单元的聚合物染料以及两种或更多种上述染料的混合物或其组合。
在一些实例中，荧光团是聚合物染料。在该方法的一些情况下，聚合物染料包括共轭聚合物。共轭聚合物(CP)的特征在于离域电子结构，其包括交替的不饱和键(例如双键和/或三键)和饱和键(例如单键)的骨架，其中π电子可以从一个键移动到另一个键。因此，共轭主链可以赋予聚合物染料延伸的线性结构，在聚合物的重复单元之间具有有限的键角。例如，蛋白质和核酸虽然也是聚合的，但在一些实例中，不会形成延伸的杆状结构，而是折叠成更高级的三维形状。此外，CP可以形成“刚性棒”聚合物主链，并且在沿着聚合物主链的单体重复单元之间经历有限的扭曲(例如扭转)角。在一些实例中，聚合物染料包括具有刚性棒结构的CP。聚合物染料的结构特征可以对分子的荧光性质生成影响。
感兴趣的聚合物染料包括但不限于Gaylord等人在美国公开号20040142344、20080293164、20080064042、20100136702、20110256549、20110257374、20120028828、20120252986、20130190193、20160264737、20160266131、20180231530、20180009990、20180009989和20180163054(它们的公开内容通过引用以其整体并入本文)中；以及Gaylord等人,《美国化学学会杂志(J.Am.Chem.Soc.)》,2001,123(26),第6417–6418页；Feng等人,《化学学会评论(Chem.Soc.Rev.)》,2010,39,2411-2419；和Traina等人,《美国化学学会杂志》,2011,133(32),第12600–12607页(它们的公开内容通过引用以其整体并入本文)中描述的那些染料。
聚合物染料可以具有一种或多种期望的光谱性质，例如特定的最大吸收波长、特定的最大发射波长、消光系数、量子产率等(参见例如Chattopadhyay等人的“明亮紫色荧光团：用于免疫荧光实验的一类新的超亮荧光化合物(Brilliant violet fluorophores:Anew class of ultrabright fluorescent compounds for immunofluorescenceexperiments)”，细胞术部分A(Cytometry Part A)，81A(6)，456-466，2012)。在一些实施方案中，聚合物染料具有280nm至475nm之间的吸收曲线。在某些实施方案中，聚合物染料具有在280nm和475nm范围内的吸收最大值(激发最大值)。在一些实施方案中，聚合物染料吸收波长在280nm和475nm之间的范围内的入射光。在一些实施方案中，聚合物染料具有在400nm至850nm(例如415nm至800nm)范围内的最大发射波长，其中感兴趣的发射最大值的具体实例包括但不限于：421nm、510nm、570nm、602nm、650nm、711nm和786nm。在一些实例中，聚合物染料具有在选自由410nm至430nm、500nm至520nm、560nm至580nm、590nm至610nm、640nm至660nm、700nm至720nm和775nm至795nm组成的组的范围内的最大发射波长。在某些实施方案中，聚合物染料具有421nm的最大发射波长。在一些实例中，聚合物染料具有510nm的最大发射波长。在一些实例中，聚合物染料具有570nm的最大发射波长。在某些实施方案中，聚合物染料具有602nm的最大发射波长。在一些实例中，聚合物染料具有650nm的最大发射波长。在某些实例中，聚合物染料具有711nm的最大发射波长。在一些实施方案中，聚合物染料具有786nm的最大发射波长。在某些实例中，聚合物染料具有421nm±5nm的最大发射波长。在一些实施方案中，聚合物染料具有510nm±5nm的最大发射波长。在某些实例中，聚合物染料具有570nm±5nm的最大发射波长。在一些实例中，聚合物染料具有602nm±5nm的最大发射波长。在一些实施方案中，聚合物染料具有650nm±5nm的最大发射波长。在某些实例中，聚合物染料具有711nm±5nm的最大发射波长。在一些实例中，聚合物染料具有786nm±5nm的最大发射波长。在某些实施方案中，聚合物染料具有选自由421nm、510nm、570nm、602nm、650nm、711nm和786nm组成的组的发射最大值。
可以使用的特定聚合物染料包括但不限于BD Horizon BrilliantTM染料，例如BDHorizon BrilliantTM紫色染料(例如BV421、BV510、BV605、BV650、BV711、BV786)；BDHorizon BrilliantTM紫外线染料(例如，BUV395、BUV496、BUV737、BUV805)；和BD HorizonBrilliantTM蓝色染料(例如，BB515)(BD Biosciences，加利福尼亚州圣何塞(San Jose,CA))。
粒子可以是用于由如上所述的光源照射的任何方便的形状。在一些实例中，粒子是固体载体，所述固体载体被成形为或配置为圆盘、球体、卵形、立方体、块状、锥形等，以及不规则形状。粒子的质量可以变化，在一些实例中，范围为0.01mg至20mg，例如0.05mg至19.5mg，例如0.1mg至19mg，例如0.5mg至18.5mg，例如1mg至18mg，例如1.5mg至17.5mg，例如2mg至15mg并且包括3mg至10mg。粒子可以具有0.01mm2或更大，例如0.05mm2或更大，例如0.1mm2或更大，例如0.5mm2或更大，例如1mm2或更大，例如1.5mm2或更大，例如2mm2或更大，例如2.5mm2或更大，例如3mm2或更大，例如3.5mm2或更大，例如4mm2或更大，例如4.5mm2或更大并且包括5mm2或更大的表面积，例如如使用顶点系统或等同物确定的。
粒子的尺寸可以根据需要变化，其中在一些实例中，粒子具有范围为0.01mm至10mm，例如0.05mm至9.5mm，例如0.1mm至9mm，例如0.5mm至8.5mm，例如1mm至8mm，例如1.5mm至7.5mm，例如2mm至7mm，例如2.5mm至6.5mm并且包括3mm至6mm的最长尺寸。在某些实例中，粒子具有范围为0.01mm至5mm，例如0.05mm至4.5mm，例如0.1mm至4mm，例如0.5mm至3.5mm并且包括1mm至3mm的最短尺寸。
在某些实例中，感兴趣的粒子是多孔的，例如其中粒子具有范围为5μ至100μ，例如10μ至90μ，例如15μ至85μ，例如20μ至80μ，例如25μ至75μ并且包括30μ至70μ，例如50μ的孔隙率，如例如使用毛细管流量孔隙率计或等同物确定的。
粒子可以由任何方便的材料形成。在一些实施方案中，感兴趣的是具有低自发荧光或没有自发荧光的粒子，例如珠。合适的材料包括但不限于玻璃材料(例如硅酸盐)、陶瓷材料(例如磷酸钙)、金属材料和聚合物材料等，例如如聚乙烯、聚丙烯、聚四氟乙烯、聚偏二氟乙烯等。在一些实例中，粒子由固体载体形成，所述固体载体例如如在美国公开申请公开号美国专利第9,797,899号(其公开内容通过引用并入本文)中所述的多孔基质。因此，粒子的表面积可以是任何合适的大孔或微孔基材，其中合适的大孔和微孔基材包括但不限于陶瓷基质、玻璃料(例如烧结玻璃)、聚合物基质以及金属-有机聚合物基质。在一些实施方案中，多孔基质是玻璃料。术语“玻璃料”在本文中以其常规含义使用，是指由烧结的粒状固体(例如玻璃)形成的多孔组合物。玻璃料可以具有根据用于制备玻璃料的烧结粒子的类型而变化的化学成分，其中可以使用的玻璃料包括但不限于由铝硅酸盐、三氧化二硼、硼磷硅酸盐玻璃、硼硅酸盐玻璃、陶瓷釉料、钴玻璃、蔓越莓玻璃、氟磷酸盐玻璃、氟硅酸盐玻璃、熔融石英、二氧化锗、金属和硫化物嵌入的硼硅酸盐、含铅玻璃、磷酸盐玻璃、五氧化二磷玻璃、磷硅酸盐玻璃、硅酸钾、钠钙玻璃、六偏磷酸钠玻璃、硅酸钠、碲酸盐玻璃、铀玻璃、镜质体(vitrite)及其组合。在一些实施方案中，多孔基质是玻璃料，例如硼硅酸盐、铝硅酸盐、氟硅酸盐、硅酸钾或硼磷硅酸盐玻璃料。
在一些实施方案中，粒子由多孔有机聚合物形成。感兴趣的多孔有机聚合物根据样品体积、样品中的组分以及存在的测定试剂而变化，并且可以包括但不限于多孔聚乙烯、聚丙烯、聚四氟乙烯(PTFE)、聚偏二氟乙烯(PVDF)、乙烯乙酸乙烯酯(EVA)、聚碳酸酯、聚碳酸酯合金、聚氨酯、聚醚砜、其共聚物及组合。例如，感兴趣的多孔聚合物包括由单体单元组成的均聚物、杂聚物和共聚物，所述单体单元例如苯乙烯、单亚烷基烯丙基单体例如乙基苯乙烯、α-甲基苯乙烯、乙烯基甲苯和乙烯基乙苯；(甲基)丙烯酸酯，例如(甲基)丙烯酸甲酯、(甲基)丙烯酸乙酯、(甲基)丙烯酸丁酯、(甲基)丙烯酸异丁酯、(甲基)丙烯酸异癸酯、(甲基)丙烯酸2-乙基己酯、(甲基)丙烯酸月桂酯、(甲基)丙烯酸硬脂酯、(甲基)丙烯酸环己酯和(甲基)丙烯酸苄酯；含氯单体，例如氯乙烯、亚乙烯基氯和氯甲基苯乙烯；丙烯腈化合物，例如丙烯腈和甲基丙烯腈；以及乙酸乙烯酯、丙酸乙烯酯、n-十八烷基丙烯酰胺、乙烯、丙烯和丁烷及其组合。
在一些实施方案中，粒子由金属有机聚合物基质形成，例如具有包含金属例如铝、钡、锑、钙、铬、铜、铒、锗、铁、铅、锂、磷、钾、硅、钽、锡、钛、钒、锌或锆的骨架结构的有机聚合物基质。在一些实施方案中，多孔金属有机基质是有机硅氧烷聚合物，包括但不限于甲基三甲氧基硅烷、二甲基二甲氧基硅烷、四乙氧基硅烷、甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷、双(三乙氧基甲硅烷基)乙烷、双(三乙氧基甲硅烷基)丁烷、双(三乙氧基甲硅烷基)戊烷、双(三乙氧基甲硅烷基)己烷、双(三乙氧基甲硅烷基)庚烷、双(三乙氧基甲硅烷基)辛烷及其组合的聚合物。
效用
主题方法、系统和计算机系统发现在期望校准或优化光检测系统的光电检测器的各种应用中的用途。主题方法和系统还发现在具有多个光电检测器的光检测系统中的用途，这些光电检测器用于分析和分选流体介质中的样品(例如生物样品)中的粒子组分。本公开还发现在流式细胞仪中的用途，其中期望提供这样的流式细胞仪，该流式细胞仪在细胞分选期间具有改进的细胞分选精度、增强的粒子收集、降低的能量消耗、粒子充电效率、更精确的粒子充电和增强的粒子偏转。在实施方案中，本公开减少了在用流式细胞仪进行样品分析期间对用户输入或手动调整的需求。在某些实施方案中，主题方法和系统提供了全自动方案，使得在使用期间对流式细胞仪的调整几乎不需要人工输入(如果有的话)。
尽管有所附的权利要求，本公开也由以下条款限定：
1.一种用于确定应用于流式细胞仪数据的检测器增益校正因子的方法，所述方法包括：
跨过流动流的水平轴线的光检测系统检测光；
在所述光检测系统的光电检测器通道中在跨过所述流动流的多个位置生成数据信号；和
响应于所生成的数据信号，计算跨过所述流动流的每个位置的检测器增益校正因子。
2.根据1所述的方法，其中在跨过所述流动流的多个位置同时检测光。
3.根据1-2中任一项所述的方法，其中所述方法包括确定跨过所述流动流的每个位置所生成的数据信号的强度。
4.根据1-3中任一项所述的方法，其中所述方法包括基于所生成的数据信号确定跨过所述流动流的每个位置的峰值脉冲幅度。
5.根据1-4中任一项所述的方法，其中所述方法包括确定跨过所述流动流的每个位置所生成的数据信号的脉冲面积。
6.根据3-5中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括基于跨过所述流动流的每个位置的所确定的数据信号强度来计算稳健变化系数(rCV)。
7.根据1-6中任一项所述的方法，其中所述检测器增益校正因子包括对跨过所述流动流的每个位置的信号强度的调整，使得跨过所述流动流的数据信号之间的强度变化为5％或更小。
8.根据1-6中任一项所述的方法，其中所述检测器增益校正因子包括对跨过所述流动流的每个位置的信号强度的调整，使得跨过所述流动流的数据信号之间的强度变化为3％或更小。
9.根据1-8中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括生成检测器增益校正因子数据文件，所述检测器增益校正因子数据文件包括针对跨过所述流动流的每个位置的经计算的检测器增益校正因子。
10.根据1-9中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括将针对跨过所述流动流的每个位置的经计算的检测器增益校正因子应用于在所述光检测系统的一个或多个非成像光电检测器通道中生成的数据信号。
11.根据1-10中任一项所述的方法，其中所述光检测系统包括光学耦合到一个或多个狭缝的光电检测器。
12.根据11所述的方法，其中所述数据信号在多个光电检测器通道中针对跨过所述流动流的每个位置生成。
13.根据11-12中任一项所述的方法，其中所述光检测系统包括光学耦合到具有多个开口的狭缝的光电检测器。
14.根据13所述的方法，其中响应于在所述狭缝中的所述多个开口中的每个开口之间检测到的光，在多个光电检测器通道中生成所述数据信号。
15.根据1-14中任一项所述的方法，其中所述方法包括：
在所述光检测系统的成像光电检测器通道中在跨过所述流动流的多个像素位置生成数据信号；和
响应于所生成的数据信号，计算跨过所述流动流的每个像素位置的检测器增益校正因子。
16.根据15所述的方法，其中每个像素位置对应于跨过所述流动流的水平轴线的位置。
17.根据15-16中任一项所述的方法，其中所述方法包括确定每个像素位置生成的数据信号的强度。
18.根据15-17中任一项所述的方法，其中所述方法包括基于生成的数据信号来确定每个像素位置的峰值脉冲幅度。
19.根据15-17中任一项所述的方法，其中所述方法包括确定每个像素位置生成的数据信号的脉冲面积。
20.根据17-19中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括基于每个像素位置的所确定的数据信号强度来计算稳健变化系数(rCV)。
21.根据15-20中任一项所述的方法，其中所述检测器增益校正因子包括对每个像素位置的信号强度的调整，使得跨过所述流动流的数据信号之间的强度变化为5％或更小。
22.根据15-20中任一项所述的方法，其中所述检测器增益校正因子包括对每个像素位置的信号强度的调整，使得跨过所述流动流的数据信号之间的强度变化为3％或更小。
23.根据15-22中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括生成检测器增益校正因子数据文件，所述检测器增益校正因子数据文件包括针对每个像素位置的经计算的检测器增益校正因子。
24.根据15-23中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括将针对跨过所述流动流的每个像素位置的经计算的检测器增益校正因子应用于在所述光检测系统的一个或多个非成像光电检测器通道中生成的数据信号。
25.根据1-24中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括用光源照射穿过所述流动流传播的粒子。
26.根据25所述的方法，其中所述光源包括两个或更多激光器。
27.根据25-26中任一项所述的方法，其中所述粒子包括多光谱荧光珠。
28.根据1-27中任一项所述的方法，其中在集成电路上计算跨过所述流动流的每个位置的检测器增益校正因子。
29.根据28所述的方法，其中所述集成电路包括现场可编程门阵列(FPGA)。
30.一种处理流式细胞仪数据的方法，所述方法包括将检测器增益校正因子应用于来自光检测系统的光电检测器通道的数据信号，其中所述检测器增益校正因子通过以下计算：
在所述光检测系统的光电检测器通道中在跨过流动流的水平轴线的多个位置生成数据信号；和
响应于所生成的数据信号，计算跨过所述流动流的每个位置的检测器增益校正因子。
31.根据30所述的方法，其中所述方法包括将检测器增益校正因子应用于来自检测器增益校正因子数据文件的跨过所述流动流的每个位置的数据信号。
32.根据31所述的方法，其中所述检测器增益校正因子数据文件包括跨过所述流动流的每个位置的检测器增益校正因子的表格。
33.根据30-32中任一项所述的方法，其中所述检测器增益校正因子包括对跨过所述流动流的每个位置的信号强度的调整，使得跨过所述流动流的数据信号之间的强度变化为5％或更小。
34.根据30-32中任一项所述的方法，其中所述检测器增益校正因子包括对跨过所述流动流的每个位置的信号强度的调整，使得跨过所述流动流的数据信号之间的强度变化为3％或更小。
35.根据30-34中任一项所述的方法，其中所述光检测系统包括光学耦合到一个或多个狭缝的光电检测器。
36.根据35所述的方法，其中所述数据信号在多个光电检测器通道中针对跨过流动流的每个位置生成。
37.根据35-36中任一项所述的方法，其中所述光检测系统包括光学耦合到具有多个开口的狭缝的光电检测器。
38.根据权利要求37所述的方法，其中响应于在狭缝中的多个开口中的每个开口之间检测到的光，在多个光电检测器通道中生成数据信号。
39.根据30-38中任一项所述的方法，其中所述方法包括：
在所述光检测系统的成像光电检测器通道中在跨过所述流动流的水平轴线的多个像素位置生成数据信号；和
响应于所生成的数据信号，计算跨过流动流的每个像素位置的检测器增益校正因子。
40.根据39所述的方法，其中所述方法包括将检测器增益校正因子应用于来自检测器增益校正因子数据文件的跨过流动流的每个像素位置的数据信号。
41.根据40所述的方法，其中所述检测器增益校正因子数据文件包括每个像素位置的检测器增益校正因子的表格。
42.根据39-41中任一项所述的方法，其中每个像素位置对应于跨过所述流动流的水平轴线的位置。
43.根据39-42中任一项所述的方法，其中所述检测器增益校正因子包括对每个像素位置的信号强度的调整，使得跨过所述流动流的数据信号之间的强度变化为5％或更小。
44.根据39-42中任一项所述的方法，其中所述检测器增益校正因子包括对每个像素位置的信号强度的调整，使得跨过所述流动流的数据信号之间的强度变化为3％或更小。
45.一种粒子分析仪，包括：
包括成像光电检测器的光检测系统，其中所述光检测系统被配置成：
跨过流动流的水平轴线检测光；
在光检测系统的光电检测器通道中在跨过所述流动流的多个位置生成数据信号；和
处理器，所述处理器包括可操作地耦合到所述处理器的存储器，其中所述存储器包括存储在其上的指令，所述指令当由所述处理器执行时，使得所述处理器响应于所生成的数据信号计算跨过流动流的每个位置的检测器增益校正因子。
46.根据45所述的粒子分析仪，其中所述存储器包括用于确定在跨过所述流动流的每个位置的所生成的数据信号的信号强度的指令。
47.根据45-46中任一项所述的粒子分析仪，其中所述存储器包括用于确定在跨过所述流动流的每个位置的所生成的数据信号的峰值脉冲幅度的指令。
48.根据45-47中任一项所述的粒子分析仪，其中所述存储器包括用于确定每个像素位置所生成的数据信号的脉冲面积的指令。
49.根据45-48中任一项所述的粒子分析仪，其中所述存储器包括基于在跨过所述流动流的每个位置的所确定的数据信号强度来计算稳健变化系数(rCV)的指令。
50.根据45-49中任一项所述的粒子分析仪，其中所述检测器增益校正因子包括对跨过所述流动流的每个位置的信号强度的调整，使得跨过所述流动流的数据信号之间的强度变化为5％或更小。
51.根据45-50中任一项所述的粒子分析仪，其中所述检测器增益校正因子包括对跨过所述流动流的每个位置的信号强度的调整，使得跨过所述流动流的数据信号之间的强度变化为3％或更小。
52.根据45-51中任一项所述的粒子分析仪，其中所述存储器包括用于生成检测器增益校正因子数据文件的指令，所述检测器增益校正因子数据文件包括针对跨过所述流动流的每个位置的经计算的检测器增益校正因子。
53.根据45-52中任一项所述的粒子分析仪，其中所述光检测系统包括光学耦合到一个或多个狭缝的光电检测器。
54.根据53所述的粒子分析仪，其中所述光检测系统被配置成在多个光电检测器通道中针对跨过所述流动流的每个位置生成数据信号。
55.根据53-54中任一项所述的粒子分析仪，其中所述光检测系统包括光学耦合到包括多个开口的狭缝的光电检测器。
56.根据55所述的粒子分析仪，其中所述光检测系统被配置为响应于在所述狭缝中的多个开口中的每个开口之间检测到的光，在多个光电检测器通道中生成数据信号。
57.根据45-56中任一项所述的粒子分析仪，其中所述光检测系统被配置成在所述光检测系统的成像光电检测器通道中在跨过所述流动流的多个像素位置生成数据信号；并且
所述存储器包括用于响应于所生成的数据信号计算跨过所述流动流的每个像素位置的检测器增益校正因子的指令。
58.根据57所述的粒子分析仪，其中每个像素位置对应于跨过所述流动流的水平轴线的位置。
59.根据57-58中任一项所述的粒子分析仪，其中所述存储器包括用于确定每个像素位置生成的数据信号的信号强度的指令。
60.根据57-59中任一项所述的粒子分析仪，其中所述存储器包括用于确定每个像素位置生成的数据信号的峰值脉冲幅度的指令。
61.根据57-60中任一项所述的粒子分析仪，其中所述存储器包括用于确定每个像素位置生成的数据信号的脉冲面积的指令。
62.根据57-61中任一项所述的粒子分析仪，其中所述存储器包括基于每个像素位置确定的数据信号强度计算稳健变化系数(rCV)的指令。
63.根据57-62中任一项所述的粒子分析仪，其中所述检测器增益校正因子包括对每个像素位置的信号强度的调整，使得跨过所述流动流的数据信号之间的强度变化为5％或更小。
64.根据57-62中任一项所述的粒子分析仪，其中所述检测器增益校正因子包括对每个像素位置的信号强度的调整，使得跨过所述流动流的数据信号之间的强度变化为3％或更小。
65.根据57-64中任一项所述的粒子分析仪，其中所述存储器包括用于生成检测器增益校正因子数据文件的指令，所述检测器增益校正因子数据文件包括针对每个像素位置的经计算的检测器增益校正因子。
66.根据57-65中任一项所述的粒子分析仪，其中所述存储器包括用于将针对跨过所述流动流的每个像素位置的经计算的检测器增益校正因子应用于在所述光检测系统的一个或多个非成像光电检测器通道中生成的数据信号的指令。
67.根据45-66中任一项所述的粒子分析仪，进一步包括用于照射穿过所述流动流传播的粒子的光源。
68.根据67所述的粒子分析仪，其中所述光源包括两个或更多激光器。
69.一种非暂时性计算机可读存储介质，包括存储在其上的用于确定应用于流式细胞仪数据的检测器增益校正因子的指令，所述指令包括：
跨过流动流的水平轴线的光检测系统检测光的算法；
用于在所述光检测系统的光电检测器通道中在跨过所述流动流的多个位置生成数据信号的算法；和
响应于所生成的数据信号，计算跨过所述流动流的每个位置的检测器增益校正因子的算法。
70.根据69所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中所述非暂时性计算机可读存储介质包括用于同时检测跨过所述流动流的多个位置的光的算法。
71.根据69-70中任一项所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中所述非暂时性计算机可读存储介质包括用于确定在跨过所述流动流的每个位置的所生成的数据信号的强度的算法。
72.根据69-71中任一项所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中所述非暂时性计算机可读存储介质包括用于基于所生成的数据信号来确定跨过所述流动流的每个位置的峰值脉冲幅度的算法。
73.根据69-72中任一项所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中所述非暂时性计算机可读存储介质包括用于确定在跨过所述流动流的每个位置的所生成的数据信号的脉冲面积的算法。
74.根据69-73中任一项所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中所述非暂时性计算机可读存储介质包括，所述算法用于基于在跨过所述流动流的每个位置的所确定的数据信号强度来计算稳健变化系数(rCV)的算法。
75.根据69-74中任一项所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中所述检测器增益校正因子包括对跨过所述流动流的每个位置的信号强度的调整，使得跨过所述流动流的数据信号之间的强度变化为5％或更小。
76.根据69-74中任一项所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中所述检测器增益校正因子包括对跨过所述流动流的每个位置的信号强度的调整，使得跨过所述流动流的数据信号之间的强度变化为3％或更小。
77.根据69-76中任一项所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中所述非暂时性计算机可读存储介质包括用于生成检测器增益校正因子数据文件的算法，所述检测器增益校正因子数据文件包括针对跨过所述流动流的每个位置的经计算的检测器增益校正因子。
78.根据69-77中任一项所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中所述非暂时性计算机可读存储介质包括用于将针对跨过所述流动流的每个位置的经计算的检测器增益校正因子应用于在所述光检测系统的一个或多个非成像光电检测器通道中生成的数据信号的算法。
79.根据69-78中任一项所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中所述非暂时性计算机可读存储介质包括：
用于在所述光检测系统的成像光电检测器通道中在跨过所述流动流的多个像素位置生成数据信号的算法；和
响应于所生成的数据信号，计算跨过所述流动流的每个像素位置的检测器增益校正因子的算法。
80.根据79所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中每个像素位置对应于跨过所述流动流的水平轴线的位置。
81.根据79-80中任一项所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中所述非暂时性计算机可读存储介质包括用于确定每个像素位置的生成的数据信号的强度的算法。
82.根据79-81中任一项所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中所述非暂时性计算机可读存储介质包括用于基于所生成的数据信号确定每个像素位置的峰值脉冲幅度的算法。
83.根据79-82中任一项所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中所述非暂时性计算机可读存储介质包括用于确定每个像素位置的生成的数据信号的脉冲面积的算法。
84.根据81-83中任一项所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中所述非暂时性计算机可读存储介质包括用于基于每个像素位置的所确定的数据信号强度来计算稳健变化系数(rCV)的算法。
85.根据79-84中任一项所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中所述检测器增益校正因子包括对每个像素位置的信号强度的调整，使得跨过所述流动流的数据信号之间的强度变化为5％或更小。
86.根据79-84中任一项所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中所述检测器增益校正因子包括对每个像素位置的信号强度的调整，使得跨过流动流的数据信号之间的强度变化为3％或更小。
87.根据79-86中任一项所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中所述非暂时性计算机可读存储介质包括用于生成检测器增益校正因子数据文件的算法，所述检测器增益校正因子数据文件包括针对每个像素位置的经计算的检测器增益校正因子。
88.根据79-87中任一项所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中所述非暂时性计算机可读存储介质包括用于将针对跨过所述流动流的每个像素位置的经计算的检测器增益校正因子应用于在所述光检测系统的一个或多个非成像光电检测器通道中生成的数据信号的算法。
89.根据79-88中任一项所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中所述非暂时性计算机可读存储介质包括用于用光源照射穿过所述流动流传播的粒子的算法。
90.根据89所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中所述粒子包括多光谱荧光珠。
91.一种非暂时性计算机可读存储介质，包括存储在其上的用于处理流式细胞仪数据的指令，所述指令包括用于将检测器增益校正因子应用于来自光检测系统的光电检测器通道的数据信号的算法，其中所述检测器增益校正因子通过以下计算：
在所述光检测系统的成像光电检测器通道中在跨过流动流的水平轴线的多个位置生成数据信号；和
响应于所生成的数据信号，计算跨过所述流动流的每个位置的检测器增益校正因子。
92.根据91所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中所述非暂时性计算机可读存储介质包括用于将检测器增益校正因子应用于来自检测器增益校正因子数据文件的跨过流动流的每个位置的数据信号的算法。
93.根据91所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中所述检测器增益校正因子数据文件包括跨过所述流动流的每个位置的检测器增益校正因子的表格。
94.根据91-93中任一项所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中所述检测器增益校正因子包括对跨过所述流动流的每个位置的信号强度的调整，使得跨过所述流动流的数据信号之间的强度变化为5％或更小。
95.根据91-93中任一项所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中所述检测器增益校正因子包括对跨过所述流动流的每个位置的信号强度的调整，使得跨过所述流动流的数据信号之间的强度变化为3％或更小。
96.根据91-95中任一项所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中所述非暂时性计算机可读存储介质包括算法，所述算法用于：
在光检测系统的成像光电检测器通道中在跨过流动流的水平轴线的多个像素位置生成数据信号；和
响应于所生成的数据信号，计算跨过所述流动流的每个像素位置的检测器增益校正因子。
97.根据96所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中所述非暂时性计算机可读存储介质包括用于将检测器增益校正因子应用于来自检测器增益校正因子数据文件的跨过流动流的每个像素位置的数据信号的算法。
98.根据97所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中所述检测器增益校正因子数据文件包括用于每个像素位置的检测器增益校正因子的表格。
99.根据96-98中任一项所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中每个像素位置对应于跨过所述流动流的水平轴线的位置。
100.根据96-99中任一项所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中所述检测器增益校正因子包括对每个像素位置的信号强度的调整，使得跨过所述流动流的数据信号之间的强度变化为5％或更小。
101.根据96-99中任一项所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中所述检测器增益校正因子包括对每个像素位置的信号强度的调整，使得跨过所述流动流的数据信号之间的强度变化为3％或更小。
102.一种被编程用于处理流式细胞仪数据的集成电路，所述编程包括用于将检测器增益校正因子应用于来自光检测系统的光电检测器通道的数据信号的算法，其中所述检测器增益校正因子通过以下计算：
在所述光检测系统的成像光电检测器通道中在跨过流动流的水平轴线的多个位置生成数据信号；和
响应于所生成的数据信号，计算跨过流动流的每个位置的检测器增益校正因子。
103.根据102所述的集成电路，其中所述集成电路包括用于将检测器增益校正因子应用于来自检测器增益校正因子数据文件的跨过流动流的每个位置的数据信号的编程。
104.根据103所述的集成电路，其中所述检测器增益校正因子数据文件包括用于跨过所述流动流的每个位置的检测器增益校正因子的表格。
105.根据102-104中任一项所述的集成电路，其中所述检测器增益校正因子包括对跨过所述流动流的每个位置的信号强度的调整，使得跨过所述流动流的数据信号之间的强度变化为5％或更小。
106.根据102-104中任一项所述的集成电路，其中所述检测器增益校正因子包括对跨过所述流动流的每个位置的信号强度的调整，使得跨过所述流动流的数据信号之间的强度变化为3％或更小。
107.根据102-106中任一项所述的集成电路，其中所述集成电路包括用于以下的编程：
在光检测系统的成像光电检测器通道中在跨过流动流的水平轴线的多个像素位置生成数据信号；和
响应于所生成的数据信号，计算跨过所述流动流的每个像素位置的检测器增益校正因子。
108.根据107所述的集成电路，其中所述集成电路包括用于将检测器增益校正因子应用于来自检测器增益校正因子数据文件的跨过流动流的每个像素位置的数据信号的编程。
109.根据107所述的集成电路，其中所述检测器增益校正因子数据文件包括用于每个像素位置的检测器增益校正因子的表格。
110.根据107-109中任一项所述的集成电路，其中每个像素位置对应于跨过所述流动流的水平轴线的位置。
111.根据107-110中任一项所述的集成电路，其中所述检测器增益校正因子包括对每个像素位置的信号强度的调整，使得跨过所述流动流的数据信号之间的强度变化为5％或更小。
112.根据107-110中任一项所述的集成电路，其中所述检测器增益校正因子包括对每个像素位置的信号强度的调整，使得跨过所述流动流的数据信号之间的强度变化为3％或更小。
113.根据102-112中任一项所述的集成电路，其中所述集成电路是现场可编程门阵列(FPGA)。
114.根据102-112中任一项所述的集成电路，其中所述集成电路包括专用集成电路(ASIC)。
115.根据102-112中任一项所述的集成电路，其中所述集成电路包括复杂可编程逻辑器件(CPLD)。
尽管为了清楚理解的目的，已经通过图示和实例的方式对前述发明进行了一些详细描述，但是鉴于本发明的教导，对于本领域普通技术人员显而易见的是，在不脱离所附权利要求的精神或范围的情况下，可以对其进行某些改变和修改。
相应地，上文仅说明了本发明的原理。应该理解，本领域技术人员将能够设计出多种布置，尽管这样的布置没有在这里明确地描述或示出，但体现了本发明的原理并且被包括在本发明的精神和范围内。此外，本文记载的所有示例和条件性语言主要意图帮助读者理解本发明的原理和发明人为推进现有技术而贡献的概念，并且应被解释为不限于这些具体描述的示例。此外，本文记载的本发明的原理、方面、和实施方式以及其具体示例的所有陈述意图涵盖其结构和功能的等同物。另外，意图在于这样的等同物包括当前已知的等同物和未来所发展的等同物，即，执行相同功能的发展的任何元件，而不论结构如何。此外，本文公开的任何内容都不旨在奉献给公众，无论此类公开是否在权利要求中明确陈述。
因此，本发明的范围不意图限于在此示出和描述的示例性实施方式。相反，本发明的范围和精神由所附权利要求来体现。在权利要求中，仅当在权利要求中的此类限制的开头引用确切短语“用于……的装置”或确切短语“用于……的步骤”时，35 U.S.C.§112(f)或35U.S.C.§112(6)被明确定义为被援引用于权利要求中的限制；如果在权利要求的限制中没有使用此类精确短语，则35 U.S.C.§112(f)或35U.S.C.§112(6)未被援引。
Claims (15)
1.一种用于确定应用于流式细胞仪数据的检测器增益校正因子的方法，所述方法包括：
跨过流动流的水平轴线的光检测系统检测光；
在所述光检测系统的光电检测器通道中在跨过所述流动流的多个位置生成数据信号；和
响应于所生成的数据信号，计算跨过所述流动流的每个位置的检测器增益校正因子。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法包括在跨过所述流动流的每个位置每个位置确定以下中的一项或多项：
所生成的数据信号的强度；
所生成的数据信号的峰值脉冲幅度；或
所生成的数据信号的脉冲面积。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述方法进一步包括基于在跨过所述流动流的每个位置的所确定的数据信号强度来计算稳健变化系数(rCV)。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述方法包括：
在所述光检测系统的成像光电检测器通道中在跨过所述流动流的多个像素位置生成数据信号；和
响应于所生成的数据信号，计算跨过所述流动流的每个像素位置的检测器增益校正因子。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括生成检测器增益校正因子数据文件，所述检测器增益校正因子数据文件包括针对跨过所述流动流的每个位置的经计算的检测器增益校正因子。
6.一种粒子分析仪，包括：
包括成像光电检测器的光检测系统，其中所述光检测系统被配置成：
跨过流动流的水平轴线检测光；
在所述光检测系统的光电检测器通道中在跨过所述流动流的多个位置生成数据信号；和
处理器，所述处理器包括可操作地耦合到所述处理器的存储器，其中所述存储器包括存储在其上的指令，所述指令当由所述处理器执行时，使得所述处理器响应于所生成的数据信号来计算跨过所述流动流的每个位置的检测器增益校正因子。
7.根据权利要求6所述的粒子分析仪，其中所述存储器包括用于在跨过所述流动流的每个位置确定以下中的一项或多项的指令：
所生成的数据信号的强度；
所生成的数据信号的峰值脉冲幅度；或
所生成的数据信号的脉冲面积。
8.根据权利要求6-7中任一项所述的粒子分析仪，其中所述存储器包括用于基于在跨过所述流动流的每个位置的所确定的数据信号强度来计算稳健变化系数(rCV)的指令。
9.根据权利要求6-8中任一项所述的粒子分析仪，其中所述光检测系统被配置成在所述光检测系统的成像光电检测器通道中在跨过所述流动流的多个像素位置生成数据信号；并且
所述存储器包括用于响应于所生成的数据信号来计算跨过所述流动流的每个像素位置的检测器增益校正因子的指令。
10.根据权利要求6-9中任一项所述的粒子分析仪，其中所述存储器包括用于生成检测器增益校正因子数据文件的指令，所述检测器增益校正因子数据文件包括针对跨过所述流动流的每个位置的经计算的检测器增益校正因子。
11.一种非暂时性计算机可读存储介质，包括存储在其上的用于确定应用于流式细胞仪数据的检测器增益校正因子的指令，所述指令包括：
跨过流动流的水平轴线的光检测系统检测光的算法；
用于在所述光检测系统的光电检测器通道中在跨过所述流动流的多个位置生成数据信号的算法；和
响应于所生成的数据信号，计算跨过所述流动流的每个位置的检测器增益校正因子的算法。
12.根据权利要求11所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中所述非暂时性计算机可读存储介质包括用于在跨过所述流动流的每个位置确定以下中的一项或多项的算法：
所生成的数据信号的强度；
所生成的数据信号的峰值脉冲幅度；或
所生成的数据信号的脉冲面积。
13.根据权利要求11-12中任一项所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中所述非暂时性计算机可读存储介质包括：
用于在所述光检测系统的成像光电检测器通道中在跨过所述流动流的多个像素位置生成数据信号的算法；和
响应于所生成的数据信号，计算跨过所述流动流的每个像素位置的检测器增益校正因子的算法。
14.根据权利要求11-13中任一项所述的非暂时性计算机可读存储介质，其中所述非暂时性计算机可读存储介质包括用于生成检测器增益校正因子数据文件的算法，所述检测器增益校正因子数据文件包括针对跨过所述流动流的每个位置的经计算的检测器增益校正因子。
15.一种被编程用于处理流式细胞仪数据的集成电路，所述编程包括用于将检测器增益校正因子应用于来自光检测系统的光电检测器通道的数据信号的算法，其中所述检测器增益校正因子通过以下计算：
在所述光检测系统的成像光电检测器通道中在跨过流动流的水平轴线的多个位置生成数据信号；和
响应于所生成的数据信号，计算跨过所述流动流的每个位置的检测器增益校正因子。
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