CN117916572A - 用于样品的物理膨胀的方法及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种物理放大样品同时保存膨胀状态下的样品内的生物分子的方法，以及用于生产可膨胀的样品‑水凝胶复合体的方法。还提供了一种用于制备样品‑水凝胶复合体的水凝胶制剂和相关试剂盒。本发明提供的方法与不同的样品和样品染色方法兼容，适用于多种用途。
Description
交叉引用
本申请要求2021年6月15日提交的中国专利申请No.202110659668.7的权益，其通过引用完整并入本文。
发明领域
本公开涉及光学显微术，尤其涉及准备生物材料用于光学显微术，用于产生膨胀的生物材料的方法及其用途，以及用于生物材料的膨胀的组合物。
背景技术
光学显微术通过生物标本例如细胞、组织、甚至整个器官和生物体的光学放大的图像，提供了有价值的生物信息。然而，常规成像技术的空间分辨率受光衍射的限制，在光衍射受限的显微镜上可实现的最高分辨率在可见光谱区大约在200-250nm左右。然而，由于其尺寸超过衍射极限范围，大量的生物结构和系统不能通过常规光学显微镜分辨。随着超分辨率显微术的发展，克服光学显微术的衍射极限成为可能，从而允许以低至20nm的分辨率对样品可视化。但是，这些技术需要专业和苛刻的成像条件以及昂贵和复杂的成像设置，以及额外的技术培训来使用这些设置。由于突破衍射限制需要高度结构化的发光，因此由于光散射和吸收的存在这些技术对于厚结构和样品(例如组织切片、完整器官或生物体)难以达到期望效果。
目前，存在几种方法使得生物样品的物理放大能够在常规显微镜下实现超分辨率成像。所有开发的方法都基于原始膨胀显微术(ExM)方案，包括在可膨胀水凝胶的化学组成或样品处理的条件方面的多种改良。然而，目前可用的方案具有根本性的限制和技术缺点，阻碍了膨胀显微术方法在生物和生物医学研究中的广泛应用。
目前可用的方案利用特殊的化学试剂组合物进行样品处理，以便在膨胀后保持水凝胶中的生物分子。这些组合物是昂贵且化学不稳定的。低化学稳定性需要在使用前在室内新鲜制备化学组合物。这需要对具有化学背景的人员进行特别培训。总之，试剂的高成本、试剂的化学不稳定性以及需要化学背景使得目前可用的ExM方法难以由普通的生命科学或生物医学实验室实施。
因此，目前可用的ExM方案高度专业化并且只能应用于某些样品的准备。例如，蛋白质保留ExM只能用于组织切片或薄组织样品。使用不同化学试剂和水凝胶组合物的MAP技术(WO2017/190101A1)通常适用于大的生物样品。这使得为所需应用选择正确的方案变得复杂化。
存在对改进的成像技术的迫切需要，从而能够在常规的衍射限制的显微镜下实现对各种样品类型(包括大型样品，例如组织切片、完整器官或整个生物体)的超分辨率成像。
发明内容
本公开提供了能够物理放大生物样品同时保存呈膨胀状态的样品内的生物分子的方法等。该方法在本文中称为“Octa-ExM”。Octa-ExM方法通过对生物样本的可逆和可调节的物理放大，能够实现在常规显微镜下对生物样本中的亚衍射限制结构成像。本文的方法可以在线性维度以高达8-10倍使样品膨胀，并且可以应用于许多生物样品而不会使样品变形或分解。
与先前的ExM方案相比，本文提供的Octa-ExM方法易于在任何实验室中实现并且易于获得。它与多种样品的准备相容，从组织培养物到大组织块和整个器官。Octa-ExM方案中使用的化学试剂化学稳定、便宜且可商购，其应用不需要化学背景。
此外，Octa-ExM与所有样品染色的标准方法相容，包括免疫组织化学、荧光蛋白和化学染料。Octa-ExM相比于先前方案的另一个优点是其更快的样品制备时间，这有助于将超分辨率成像流程化。
在一个方面，本公开提供了一种将样品物理膨胀以用于显微术的方法，包括：
(a)使样品与一种或多种双功能锚定剂接触，其中双功能锚定剂包括生物分子反应性化学基团和水凝胶反应性化学基团；
(b)用水凝胶前体溶液(即单体溶液)灌注样品或将样品埋入水凝胶前体溶液中，并发生聚合以形成样品-水凝胶复合体；和
(c)将所述样品-水凝胶复合体与溶剂或水性溶液孵育以物理膨胀所述样品。
在某些实施方案中，步骤(a)和步骤(b)同时进行。例如，可以将样品用已经混合或添加有双功能锚定剂的水凝胶前体溶液灌注或包埋在其中。或者，可以将双功能锚定剂添加到已灌注到样品的水凝胶前体溶液中。在某些实施方案中，可以将双功能锚定剂与水凝胶前体溶液的混合物加入样品，然后进行聚合。具体地，所述双功能锚定剂可以是2-甲基丙烯醛(methacrolein)。
在某些实施方案中，待处理的样品是生物样品并选自但不限于，细胞(例如培养细胞)、生物组织、标本、活组织检查样品、完整器官及其部分、整个生物体例如细菌、真菌和病毒。样品可以是活的、固定的或保存的，例如是活的培养细胞、固定的组织切片(例如包埋在例如石蜡中的组织切片)、或新鲜冷冻组织。
在某些实施方案中，用于膨胀的样品是培养细胞，例如培养的肿瘤细胞系。在一些其他实施方案中，用于膨胀的样品是厚度为50μm或更小的组织切片，即薄的组织样品。在一些另外的实施方案中，用于膨胀的样品是厚度在30μm-400μm的范围内的组织样品，例如在30μm-100μm，100μm-200μm，200μm-300μm，300μm-400μm，50μm-150μm，150μm-250μm，和250μm-350μm的范围内。在一些别的实施方案中，用于膨胀的样品是厚度大于400μm的组织样品。在一些其他实施方案中，待膨胀的样品是整个器官或其部分。
在某些实施方案中，所述方法还包括固定步骤。固定步骤可以在步骤(a)之前、期间或之后通过用固定剂(如PFA)固定样品来进行。固定可以与锚定组合在一个步骤中进行，例如通过将样品与双功能锚定剂和固定剂的混合物一起孵育。在某些实施方案中，固定、锚定和灌注步骤可组合起来并同时(即在一个步骤中)进行。在这种情况下，水凝胶前体溶液在与样品接触之前可与锚定剂和固定剂混合。
在某些实施方案中，该方法进一步包括在膨胀样品-水凝胶复合体之前的均质化步骤。均质化步骤通常包括对样品-水凝胶复合体的物理、化学、物理化学、酶法或物理和酶法处理，以允许破坏分子间和分子内相互作用。特定地，均质化步骤可包括用蛋白酶、碱性缓冲剂、含有洗涤剂的碱性缓冲剂或在缓冲液中加热来处理样品-水凝胶复合体。在一些具体实施方案中，均质化步骤包括用非特异性蛋白酶如蛋白酶K来酶促消化样品。
在某些实施方案中，所述方法包括在任何一个上述的步骤(a)-(c)和均质化步骤之前或之后用标记物或标签(例如荧光标记物)染色样品。可以使用标准免疫染色方法(例如夹心抗体免疫染色)在膨胀之前、期间或之后对样品进行免疫染色。在一些具体实施方案中，如本文所公开的样品用一种或多种抗体和荧光染料染色，然后用双功能锚定剂处理。在一些其他实施方案中，样品-水凝胶复合体在均质化后用一种或多种抗体和/或荧光染料染色(即均质化后染色)。在一些别的实施方案中，在步骤(a)的同时将样品-水凝胶复合体用一种或多种抗体和/或荧光染料染色，任选地在一个步骤中进行进行步骤(a)、步骤(b)和染色。在一些进一步的实施方案中，样品例如培养的细胞经转基因工程化改造或载体投递以表达一种或多种荧光蛋白。
在某些实施方案中，如本文所公开的双功能锚定剂选自2-甲基丙烯醛、N-琥珀酰亚胺基丙烯酸酯(NSA)，N-(烯丙氧基羰氧基)-琥珀酰亚胺(NAS)，烯丙基缩水甘油醚(AGE)，丙烯酸缩水甘油酯(GAL)和甲基丙烯酸缩水甘油酯(GME)及其组合/混合物。在一些实施方案中，双功能锚定剂与单功能锚定剂例如1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDE)和/或甘油二缩水甘油醚(GDE)组合使用，以改善例如荧光保留。在一些实施方案中，仅使用一种双功能锚定剂例如2-甲基丙烯醛。在一些实施方案中，使用的锚定剂是AGE、GME、GAL、GME+BDE或AGE+BDE。例如，双功能锚定剂可以是GME+BDE，其中GME与BDE的摩尔比范围为约10:1至约1:10，或者是AGE+BDE，其中AGE与BDE的摩尔比范围为约10:1至约1:10，例如为10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:5、1:10。
在某些实施方案中，水凝胶前体溶液包含溶解在水或水性溶液中的一种或多种水凝胶单体或前体。所述一种或多种水凝胶单体包括但不限于，丙烯酸钠(SA)，甲基丙烯酸钠(SMA)，衣康酸(IA)，反式乌头酸(TAA)，乙基-2-(羟甲基)-丙烯酸酯(EHA)，N,N-亚甲基双丙烯酰胺(MBAA，又称为BIS)，N,N-二甲基丙烯酰胺(DMAA)，季戊四醇四丙烯酸酯(PT)，丙氧基化三羟甲基丙烷三丙烯酸酯(TPT)，季戊四醇三丙烯酸酯(PA)，二季戊四醇五丙烯酸酯或二季戊四醇六丙烯酸酯(DPHA)，三羟甲基丙烷三丙烯酸酯(TTA)，二(三羟甲基丙烷)-四丙烯酸酯(DiTA)，三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(TTMA)，甘油丙氧基化(1PO/OH)三丙烯酸酯(GPT)，乙氧基化三羟甲基丙烷三丙烯酸酯(TET)，季戊四醇烯丙基醚(PAE)，4-羟基-2-亚甲基丁酸钠(SHMB)，N,N-二甲基氨基丙基丙烯酰胺(DMPAA)和丙烯酰胺(AA)。在一些具体的实例中，选择的一种或多种水凝胶单体或前体是甲基丙烯酸钠(SMA)、N,N-二甲基丙烯酰胺(DMAA)和丙氧基化三羟甲基丙烷三丙烯酸酯(TPT)。DMAA与SMA的摩尔比可以在约30:1至约4:1、约20:1至约4:1、约10:1至约4:1、约5:1至约4:1、约30:1至约3:1、约20:1至约3:1、约10:1至约3:1、约5:1至约3:1、约30:1至约2:1、约20:1至约2:1、约10:1至约2:1、约5:1至约2:1的范围内或其间任何比率或子范围内。在一些实施方案中，DMAA与SMA的摩尔比为3.97:1。SMA与TPT的摩尔比可以在约1:0.0001至约1:0.4、约1:0.0002至约1:0.4、约1:0.0003至约1:0.4、约1:0.0004至约1:0.4、约1:0.0001至约1:0.3、约1:0.0002至约1:0.3、约1:0.0003至约1:0.3、约1:0.0004至约1:0.3、约1:0.0001至约1:0.2、约1:0.0002至约1:0.2、约1:0.0003至约1:0.2、约1:0.0004至约1:0.2、约1:0.0001至约1:0.1、约1:0.0002至约1:0.1、约1:0.0003至约1:0.1、约1:0.0004至约1:0.1的范围内或其间任何比率或子范围内。在一些实施方案中，SMA与TPT的摩尔比为1:0.0006。DMAA:SMA:TPT的摩尔比可以在约4:1:0.004至约4:1:0.095或约4:1:0.0004至约4:1:0.01的范围内。在一些具体的实施方案中，DMAA∶SMA的摩尔比在约30∶1至约2∶1的范围内，并且SMA与TPT的摩尔比在约1∶0.0001至约1∶0.4的范围内。在一些具体实施方案中，DMAA与SMA的摩尔比在6:1至2:1的范围内，SMA与TPT的摩尔比在1:0.0002至1:0.2的范围内，具体地，DMAA∶SMA∶TPT的摩尔比在3.97:1:0.0004至3.97:1:0.01的范围内或4:1:0.0004至4:1:0.01的范围内。在一些具体实施方案中，DMAA:SMA:TPT的摩尔比在(30±15):(1±0.5):(0.4±0.2)的范围内，例如约(30±10):(1±0.3):(0.4±0.13)、约(30±5):(1±0.15):(0.4±0.065)、约(30±1):(1±0.03):(0.4±0.013)、约(30±0.5):(1±0.05):(0.4±0.02)以及约30:1:0.4等。
在某些实施方案中，样品与双功能锚定剂接触与用水凝胶前体溶液灌注同时进行。在这种情况下，用包含双功能锚定剂(例如2-甲基丙烯醛)和水凝胶单体或前体的组合物渗透样品。任选地，该组合物还包含化学固定剂以原位形成样品-水凝胶复合体。在一些实施方案中，水凝胶前体溶液包含溶解在水中的超过30％(v/v)的水凝胶单体。在一些进一步的实施方案中，水凝胶制剂包含0.1至2％(v/v)的锚定剂，例如0.1至0.25％(v/v)的2-甲基丙烯醛。
在某些实施方案中，在聚合前向所述水凝胶前体溶液添加聚合活化剂或促进剂，例如VA-044、V50、APS、过硫酸钾或TEMED。在某些实施方案中，如上所述步骤(c)的使样品-水凝胶复合体膨胀包括将样品在纯水或水性缓冲液中孵育。在该步骤中，可以根据成像的要求通过调整孵育时间、水性缓冲液的摩尔渗透压浓度、温度等来获得不同的样品膨胀因子。例如，膨胀因子可以从大约2调整到8或更高。在一些实施方案中，在不存在均质化步骤的情况下，膨胀因子可以调整为2至3。优选地，样品-水凝胶复合体的膨胀是各向同性的。
在某些实施方案中，该方法还包括对膨胀的样品-水凝胶复合体进行成像。
在某些实施方案中，该方法还包括将膨胀的样品-水凝胶复合体缩回到其原始大小，例如，通过在高盐缓冲液中浸泡。
在一个方面，本公开提供了一种用于将样品保持在其膨胀状态的方法，包括用水凝胶前体溶液灌注样品并聚合以形成样品-水凝胶复合体，以及基于所用水凝胶的可膨胀特性进一步膨胀样品-水凝胶复合体。在一些实施方案中，水凝胶由DMAA、SMA和TPT形成。
在一个方面，本公开提供了一种产生大小可调节的样品-水凝胶复合体的方法。
在一个方面，本公开提供了一种用于各向同性地膨胀生物样品同时保留样品中的纳米级分子结构体系的方法。
在一个方面，本公开提供了一种从生物样品中提取纳米级分子结构体系和系统水平的细胞间连通性的方法。
在一个方面，本公开提供了一种用于对样品进行大小可调节的放大并保留原始功能状态下的生物分子的相对位置的方法。
在一些实施方案中，本文提供了一种用于生物样品的物理放大同时保存膨胀状态的生物分子的方法，包括以下步骤：
用双功能锚定剂对样品中的生物分子的功能化，其中该双功能锚定剂包括生物分子反应性化学基团和水凝胶反应性化学基团；
在生物样品中合成水凝胶-聚合物链网络，其中样品的生物分子通过共价键掺入水凝胶的聚合链中；
使形成的样品-水凝胶复合体均质化，从而破坏分子间和分子内相互作用；和
对均质化的样品-水凝胶复合体的物理放大以形成膨胀的样品。
在一个方面，本文提供了一种水凝胶制剂，其包含选自以下的一种或多种水凝胶单体：丙烯酸钠(SA)，甲基丙烯酸钠(SMA)，衣康酸(IA)，反式乌头酸(TAA)，乙基-2-(羟甲基)-丙烯酸酯(EHA)，N,N-亚甲基双丙烯酰胺(MBAA，又称为BIS)，N,N-二甲基丙烯酰胺(DMAA)，季戊四醇四丙烯酸酯(PT)，丙氧基化三羟甲基丙烷三丙烯酸酯(TPT)，季戊四醇三丙烯酸酯(PA)，二季戊四醇五丙烯酸酯或二季戊四醇六丙烯酸酯(DPHA)，三羟甲基丙烷三丙烯酸酯(TTA)，二(三羟甲基丙烷)-四丙烯酸酯(DiTA)，三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(TTMA)，甘油丙氧基化(1PO/OH)三丙烯酸酯(GPT)，乙氧基化三羟甲基丙烷三丙烯酸酯(TET)，季戊四醇烯丙基醚(PAE)，4-羟基-2-亚甲基丁酸钠(SHMB)，N,N-二甲基氨基丙基丙烯酰胺(DMPAA)和丙烯酰胺(AA)。
在某些实施方案中，在水凝胶制剂中，DMAA与SMA的摩尔比在30:1至3:1的范围内，SMA与TPT的摩尔比在1:0.0002至1:0.4的范围内。在一些进一步的实施方案中，DMAA与SMA的摩尔比在6:1至2:1的范围内，SMA与TPT的摩尔比在1:0.0002至1:0.2的范围内。
在某些实施方案中，水凝胶制剂制备为包含在水或缓冲液中稀释的DMAA、SMA和TPT的储备溶液。在某些实施方案中，水凝胶制剂制备为DMAA、SMA和TPT的未稀释的混合物。
在一个方面，本文提供了水凝胶制剂在膨胀样品并形成样品-水凝胶复合体中的用途。样品的生物分子可以通过共价键并入水凝胶的聚合物链中。
在一个方面，本文提供了包含如上所述的锚定剂和水凝胶制剂的组合物。在一些实施方案中，所述锚定剂是双功能锚定剂。在一些实施方案中，锚定剂是2-甲基丙烯醛。
在一个方面，本文提供了通过上述方法制备的样品-水凝胶复合体。
在一个方面，本文提供了试剂盒，其中所述试剂盒包含一个或多个容器，所述容器包含DMAA、SMA和/或TPT。在一些实施方案中，DMAA、SMA和TPT在分开的容器中，任选地各个容器中DMAA与SMA的摩尔比可在约30:1至3:1的范围内，而SMA和TPT的摩尔比可以在约1:0.0002至1:0.4的范围内。在一些实施方案中，试剂盒还包含含有双功能锚定剂如2-甲基丙烯醛的容器。
备选地，DMAA、SMA和TPT的至少两种混合在一个容器中。例如，在一个容器中，DMAA与SMA混合，DMAA与SMA的摩尔比可在约30:1至3:1的范围内。在另一个容器中，SMA与TPT混合，SMA与TPT的摩尔比可以在约1:0.0002至1:0.4的范围内。在一些实施方案中，DMAA:SMA:TPT的摩尔比可以在4:1∶0.0004至4:1∶0.095、4:1∶0.004至约4:1∶095、或4:1：0.0004至约4∶1∶0.01的范围内。在一些特定的实施方案中，DMAA∶SMA的摩尔比在约30:1至约2:1的范围内，SMA与TPT的摩尔比在约1:0.0001至约1:0.4的范围内，具体地，DMAA：SMA∶TPT的摩尔比在3.97:1:0.0004至3.97:1:0.01或4:1:0.0004至4:1:0.01的范围内。在一些特定实施方案中，DMAA:SMA:TPT的摩尔比范围为(30±15):(1±0.5):(0.4±0.2)，例如约(30±10):(1±0.3):(0.4±0.13)、约(30±5):(1±0.15):(0.4±0.065)、约(30±1):(1±0.03):(0.4±0.013)、约(30±0.5):(1±0.05):(0.4±0.02)和约30:1:0.4。任选地，将溶剂例如水或有机溶剂例如乙醇或四氢呋喃(THF)添加到DMAA、SMA和TPT以形成水凝胶前体的溶液。
在一些实施方案中，该试剂盒进一步包括一个或多个容器，所述容器包含选自2-甲基丙烯醛、AGE、GME、GAL、BDE和GDE的一种或多种锚定剂，例如仅2-甲基丙烯醛、仅AGE、仅GME、AGE+BDE或者GME+BDE。在一些实施方案中，试剂盒包括以下容器，该容器包括DMAA、SMA、TPT和一种或多种锚定剂的混合物，任选地，所述锚定剂是2-甲基丙烯醛。在一些实施方案中，试剂盒还包括一个或多个容器，该容器包含染色剂或标记剂(例如用于免疫染色的抗体)。在一些实施方案中，试剂盒包括容器，该容器包括DMAA、SMA、TPT、一种或多种锚定剂和染色剂的混合物。在一些实施方案中，试剂盒还包括一个或多个包含固定剂(例如PFA)的容器。在一些实施方案中，试剂盒包括以下容器，该容器包括固定剂和一种或多种锚定剂的混合物。
在一些实施方案中，试剂盒还包括以下组分中的一种或多种：包含选自VA-044、V50、TEMED、APS和过硫酸钾的凝胶化活化剂或促进剂的容器；包含均质化缓冲液的容器，例如基于变性剂的均质化缓冲溶液或基于蛋白酶K的均质化缓冲剂；包括均质化试剂例如蛋白酶的容器；包括常规缓冲液，例如PBS或MES缓冲液的容器；配置成在凝胶化之前容纳样品的凝胶化室，以及任选地包含用于密封凝胶化室的盖；成像室，所述成像室被配置为在凝胶化之后容纳所述样品；凝胶处理装置；冷却装置，如冰袋。在一些实施方案中，试剂盒适合在室温、-20℃或0℃-4℃的温度储存。
在一个方面，本文提供了如上所述的试剂盒用于准备生物样品进行物理膨胀。
在一个方面，本文提供了包含DMAA、SMA和TPT的试剂盒用于制备样品-水凝胶复合体。
在一个方面，本文提供了一种试剂盒，其中所述试剂盒包括一个或多个容器，该容器包含选自2-甲基丙烯醛、AGE、GME、GAL、BDE和GDE的锚定剂，所述锚定剂为例如2-甲基丙烯醛、AGE、GME、AGE+BDE或GME+BDE。在一些实施方案中，所述试剂盒还包含如上所述的一种或多种水凝胶单体。还提供了试剂盒用于将样品锚定于水凝胶聚合物的链中的用途。
从以下几个实施方案的参考附图进行的详细描述，本公开的前述和其他特征和优点将变得更加明显。
附图说明
图1显示了使用单轴张力测试的水凝胶的弹性模量和失败前应力(pre-failurestress)的测定。(a)代表性MAP水凝胶样品的应力-应变曲线。(b)代表性ExM水凝胶样品的应力-应变曲线。(c)代表性Octa-ExM水凝胶样品的应力-应变曲线。即使在80％的应变下Octa-ExM水凝胶也未破裂。
图2显示了Octa-ExM处理后HEK293T细胞中表达的荧光蛋白的荧光保留。(a)表达mTurquoise2、EGFP、mRuby2的和DAPI染色固定的HEK293T细胞的代表性荧光图像，其使用不同的锚定条件进行Octa-ExM(有关锚定条件的细节参见表2)。比例尺，100μm。(b)在Octa-ExM处理之后，如(a)中的实验的荧光定量(n＝2个转染重复/每种)。MeanFITC_Camera-绿色通道，EGFP；MeanTRITC_Camera-红色通道，mRuby2；MeanCFP_Camera-青色通道，mTurquoise2；MeanDAPI_Camera-蓝色通道，DAPI。
图3显示了Octa-ExM处理后HEK293T细胞中表达的荧光蛋白的荧光保留。(a)表达mTurquoise2、mRuby2的和DAPI染色固定的HEK293T细胞的代表性荧光图像，其使用不同的锚定条件进行Octa-ExM(有关锚定条件的细节参见表3)。比例尺，100μm。(b)在Octa-ExM处理之后，如(a)中的实验的荧光定量(n＝1个转染重复/每种)。橙色条，mRuby2；绿色条，mTurquoise2；蓝色条，DAPI。
图4显示了在Octa-ExM之前(左)和之后(右)，表达EGFP的HEK293T细胞的代表性图像，线性膨胀因子为约6.85。比例尺，100μm。
图5显示了HEK293T细胞中荧光融合的Octa-ExM成像。(a)在相同的成像条件下在Octa-ExM之前(左)和之后(右)，表达mTagBFP2-H2B融合蛋白的HEK293T细胞的代表性图像。比例尺，10μm。(b)固定(蓝色条)和Octa-ExM(橙色条)处理的细胞中显示的实验的荧光定量(来自两个独立样品，n＝40个细胞)。
图6显示了在用含有洗涤剂的碱性缓冲液均质化之后，用DAPI(蓝色)和针对Nup153核孔复合物的抗体(绿色)染色的HEK293T细胞的代表性Octa-ExM双色荧光图像。抗体染色是使用标准免疫组化方案在样品-水凝胶复合体上实施的。(a)蓝色通道(DAPI)中HEK293T细胞的荧光图像。(b)绿色通道(抗NUP50)中HEK293T细胞的荧光图像。(c)a和b中的图像重叠。(d)c中显示的细胞核的放大图。比例尺，100和50μm。
图7显示了使用Octa-ExM的空间分辨率的验证。(a)用针对微管蛋白的抗体(绿色)和DAPI(蓝色)染色的HeLa细胞的代表性荧光图像。比例尺，50μm。(b)a中显示的细胞在膨胀之前和之后的微管蛋白微管的强度概况(使用Zeiss LSM 800共聚焦显微镜进行膨胀前成像，使用63x NA1.4物镜；使用Nikon A1R共聚焦显微镜进行膨胀后成像，使用40x NA1.15物镜)。
图8显示了表达常规荧光蛋白的小鼠脑组织的Octa-ExM。(a)来自转基因系的表达Thy1-YFP的神经元的代表性荧光图像，其使用平铺光片显微镜(tiling light sheetmicroscope)获取。比例尺，500μm。(b)病毒注射的小鼠脑组织中表达GFP(绿色)和mCherry(红色)的神经元的代表性荧光图像，其使用旋转盘共聚焦显微镜获得。比例尺，100μm。(c)来自转基因系的表达Thy1-YFP的神经元的代表性荧光图像，其使用Z1光片显微镜获得。比例尺，500μm。(d)图像中感兴趣区域的放大图，显示树突棘。
图9显示了用突触后抗体(抗Homer1，红色)染色并转基因表达YFP(绿色)的小鼠脑切片的Octa-ExM。抗体染色在膨胀后进行，YFP通过内在荧光可视化。比例尺，50μm。
图10显示了来自小鼠乳腺的Octa-ExM。(a)用共聚焦显微镜获得的经抗微管蛋白抗体(红色)和DAPI(蓝色)染色的小鼠乳腺的低放大率荧光图像。比例尺，100μm。(b)用共聚焦显微镜获得的抗微管蛋白抗体(红色)和DAPI(蓝色)染色的小鼠乳腺的高放大率荧光图像。比例尺，100μm。
图11示出了根据本公开的一些实施方案，使用3.5cm MatTek皿组装胶凝室的示意图。
图12示出了根据本公开的一些实施方案，组装胶凝室并嵌放组织切片用于胶凝的示意图。胶凝室的组装和样品的嵌放包括：1)将一片Parafilm缠绕在载玻片(“底部载玻片”)上，并压在载玻片上，使其紧紧密封在载玻片上；2)在封有Parafilm的载玻片的每一端放置所需厚度的方形盖玻片，用作间隔；3)在两个间隔之间放置一滴胶凝溶液；4)将样品转移到胶凝溶液中；5)铺开样品并盖上盖玻片使其覆盖在间隔上；6)用胶凝溶液填充盖玻片下的其余空荡空间。
图13示出了来自小鼠的心脏、肝、肾、胸腺的Octa-ExM图。(左)在膨胀前用常规染料染色的小鼠组织的荧光图，用宽视野显微镜获取，比例尺1000μm；(中间)膨胀前小鼠组织的放大图，比例尺100μm；(右)Octa-ExM处理后小鼠组织的荧光图，比例尺100μm。
图14显示了使用活细胞和细胞培养物，使用荧光蛋白、小染料和抗体作为荧光标记进行快速Octa-ExM的工作流程。(a)rExM工作流程，具有合并的固定和锚定步骤。(b)rExM工作流程，具有合并的锚定和单体孵育步骤。
图15显示了以下的rExM成像：(a)在40X放大倍数下α-微管蛋白染色的HeLa细胞；(b)10倍放大的α-肌动蛋白染色的HeLa细胞；(c)20倍放大的Nup153染色的HEK293细胞；比例尺，50μm；(d)在绿色(左)和红色(中)通道中的表达H2B-mClover2和H2B-mRuby2融合蛋白的HEK细胞的rExM成像和合并图像(右)。HEK细胞用PFA/2-甲基丙烯醛混合物固定，并在没有化学锚定剂的单体溶液中凝胶化，比例尺为5μm。
图16显示了均质化后用DAPI(0.1μg/ml)和抗α-微管蛋白抗体染色的HeLa细胞的rExM成像。
图17显示了夹心免疫染色与HeLa细胞的rExM成像的兼容性；进行了四轮第二抗体覆盖。(a-d)第二抗体染色的第1轮、2轮、3轮和4轮的图像；(e)荧光标记的单微管的宽度是通过用高斯曲线拟合轮廓并找到峰的FWHM来获得的，单微管在图像上随机分布(5<N<25)。
图18显示了在通过均质化初步膨胀后，通过进行多轮第二抗体染色验证的分辨率能力。(a)用抗α-微管蛋白抗体和DAPI标记的HeLa细胞的宽场图像；(b)荧光标记的扩展的HeLa细胞的共聚焦图像。(c-d)α-微管蛋白标记的Hela细胞的凝胶化后的共聚焦图像；进行四轮第二抗体覆盖，对指示的部分进行强度分析，其中(e)通过高斯拟合确定峰间距离的直方图。通过这里的膨胀因子6.7进行归一化，导致分辨率距离达到35.6nm。
图19显示了组织样品的(a)rExM和(b)rsExM的工作流程。
图20显示了组织rsExM方案的发展。(a)三种锚定剂化学物AGE、PFA和AA、以及2-甲基丙烯醛的实验时间方案和膨胀方案时间表。(b)Myelin染料1和染料2在不同膨胀条件下的荧光保留值。条件描述如表4所示。(c)高保留条件下染料的信号背景比(如图b所示)。(d)膨胀前后大脑切片的荧光图像。左侧，全脑切片；右，左脑切片图像中方框区域膨胀前后的放大图。长度膨胀比约为2.1。比例尺：左侧，1000um；放大图，100μm。所有长度比例均以膨胀前尺寸表示。
图21显示了放大倍数更高的脑组织的ExM成像。(a-c)膨胀前(a-b)和膨胀后(c)用GFP标记和Myelin染料1染色的小鼠脑切片的荧光图像。脑切片的长度膨胀比值为3.4。b-c显示图a中方框区域的放大视图。(d-e)在GFP和XHR550通道中的膨胀后的小鼠大脑纹状体的共聚焦图像，在c中标记为方框。(f-g)图e的合并通道中标记的放大结构。(h)g中沿白色箭头的标准化的荧光强度的多峰高斯拟合线概况。比例尺：(a)1000μm；(b-c)，100μm；(d-e)，20μm；(f-g)，1μm。所有长度比例均以膨胀前尺寸表示。
发明详述
本文阐述的公开内容和实施方案应被解释为仅示例性，而不是限制本发明的范围。虽然本文采用了特定术语，除非另有说明，否则它们均以通用和描述性的含义使用，而不是用于限制的目的。本文引用的所有参考文献，包括出版物、专利和专利申请通过引用整体并入本文。
定义
如本文所用，单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”意图还包括复数形式，除非上下文清楚地另外表明。
本文中与所述数值或数值范围一起使用的术语“约”是指包含所述数值或数值范围的变化(即，表示比所述数值或数值范围稍大或稍小，在所述数值的±20％、±10％、±5％、±1％、±0.5％、±0.1％或±一个标准偏差的范围内)。尽管已经努力确保所用数字(如范围、量、浓度等)的准确性，但应考虑到一些实验偏差。
如本文所用，术语“样品”是指所有种类的生物、化学或生物化学材料，包括但不限于细胞、培养细胞、生物组织、标本、活组织检查、完整器官、整个生物体，或原则上其他类型的目的样品，如细菌、真菌和病毒。通常地，所述样品适用于显微镜分析。
如本文所用，术语“膨胀显微术”或“ExM”是指通过使用聚合物系统膨胀生物样品来鉴别其中的小结构的样品制备手段。前提是将聚合物网络引入细胞或组织样品中，然后用化学反应物理地膨胀该聚合物网络以增加生物结构的尺寸。ExM的其中一个优势是允许用更广泛范围的显微术技术对那些小结构成像(参见例如Boyden等人，Science 347,543-548,2014；Paul W Tillberg等人，Nature Biotechnology第34卷，第987-992页，2016)。
如本文所用，术语“物理膨胀”和“膨胀”可交换使用。术语“可膨胀材料”或“可扩展材料”通常是指在与液体如水或其他溶剂接触时线性膨胀的材料。优选地，可膨胀材料在3个维度中均匀地膨胀，并且该材料是透明的，使得在膨胀时光可以通过样品。如本文所示例的，可膨胀材料是可膨胀的水凝胶。在一些实施方案中，可膨胀材料由其前体、单体或低聚物原位形成。例如，可以使用选自以下的单体，其含有水溶性基团，该水溶性基团含有可聚合的烯键不饱和基团。单体或低聚物可包含一种或多种取代或未取代的甲基丙烯酸酯，丙烯酸酯，丙烯酰胺，甲基丙烯酰胺，乙烯醇，乙烯胺，烯丙胺，烯丙基醇，包括其二乙烯交联剂(例如，N,N-亚烷基双丙烯酰胺)。前体在聚合前还可与聚合引发剂和交联剂混合。在优选的实施方案中，可膨胀性聚合物是聚丙烯酸酯和其共聚物或交联共聚物。可选地或另外地，可膨胀材料可以通过化学交联水溶性低聚物或聚合物原位形成。因此，本发明涵盖将可膨胀材料的前体(如水溶性前体)添加到样品中并使前体可以原位膨胀。
(I)Octa-ExM方法
膨胀样品用于超分辨率显微术
本公开提供了生物样品的物理放大的方法，其中将感兴趣的生物分子以及合成的荧光染料以功能性状态保留在样品-水凝胶复合体中，这对于它们的成像和鉴定至关重要。这类方法可用于实施用抗体、化学染料染色或表达荧光蛋白的培养细胞、组织切片或器官的纳米级成像。
本文公开的方法利用新的水凝胶制剂，涉及以前从未用于膨胀显微术的化学试剂。与所有先前使用的水凝胶相比，新的水凝胶具有优异的特性。首先，它可以在线性维度中膨胀多达8-10倍，从而在衍射受限的显微镜下使分辨率限制达到40nm。相比之下，目前可用的方案的最大膨胀因子在线性维度中小于4，因此将可实现的横向分辨率限制为80nm。一些方案可以在线性维度中将样品膨胀10倍，但由于用于膨胀的水凝胶的机械不稳定性，这些方案只能用于二维样品例如组织培养物或薄组织切片等。
此外，完全膨胀的水凝胶具有高机械稳定性，从而允许其应用于膨胀大型组织块、整个器官甚至整个生物体，而不会在其自身重量下变形和机械分解，这与其他水凝胶不同。
本公开还示出了某些化学锚定剂或其组合，这些化学锚定剂或组合能够更快地穿透较大的生物样品锚定生物分子并提供更高的荧光保留。本文的方法不仅适用于细胞和薄样品，而且还适用于大或稠厚的样品，其在用Octa-ExM方案处理后可以充分膨胀和光学上清楚地成像。
在某些实施方案中，本公开提供了一种用于感兴趣的生物样品的膨胀和成像的方法，其包括以下步骤：
(a)将生物样品与双功能锚定剂(仅双功能锚定剂或补充有单功能锚定剂)接触，并孵育足够的时间以进行化学反应；
(b)将样品埋入可膨胀的水凝胶制剂中以形成样品-水凝胶复合体，其中样品内的生物分子(蛋白质、核酸、脂质等)与水凝胶聚合物链共价结合；
(c)通过化学消化或物理化学处理对样品均质化(可选地，取决于所需的膨胀因子)；
(d)基于最终用户需求将样品-水凝胶复合体可调节地膨胀至期望的程度；和
(e)将膨胀的样品-水凝胶复合体成像。
上述双功能锚定剂可以提供在水溶液或有机溶剂溶液中。在一些实施方案中，包含双功能锚定剂的水溶液还包含固定剂，从而可以同时进行固定和锚定步骤。也可以在与双功能锚定剂接触之前或之后固定样品。
在一些实施方案中，步骤(a)和(b)同时进行。具体地，可以将样品包埋在包括双功能锚定剂和可膨胀水凝胶制剂两者的混合物中，使得锚定和包埋(以及聚合)步骤在一个步骤中进行。这使得样品-水凝胶复合体制备过程更快、更容易处理。
在一些其他实施方案中，在步骤(a)和(b)之间固定样品，即在与双功能锚定剂接触后并且在埋入水凝胶制剂之前。或者，样品的固定在其与水凝胶制剂接触的同时进行。固定也可以在步骤(b)之后进行。
在一些实施方案中，该方法还包括在均质化或膨胀后进行的染色步骤，其可以增强染色的荧光和由于表位的保存而使抗体可接近感兴趣的蛋白质。在一些其它实施方案中，染色步骤在锚定或聚合步骤之前或同时进行。
本发明的方法可以提供远低于光学显微术的衍射极限的空间分辨率，使得能够探索生物样品中的生物分子的空间体系，并将改进对不同的器官和组织的显微术研究，例如脑图谱、连接组研究以及新的诊断、个性化药物、组织病理学和其他医学用途。
准备用于膨胀的样品
在一个方面，本公开提供了要膨胀的感兴趣的样品。所述样品可以是新鲜的、冷冻或固定的(即保存的)。在某些实施方案中，在膨胀之前将目的样品固定。固定的样品是使用固定剂(例如甲醛)进行了组织学保存的样品。样品也可以包埋入坚固和通常硬质的介质例如石蜡、蜡、火棉或树脂中，从而可以切割成薄切片用于显微术检查。
固定可以通过常规方法进行。本领域技术人员将理解，根据将样品要组织学染色或以其他方式分析的目的来确定固定剂的选择。本领域技术人员还将理解，固定时间取决于组织样品的尺寸和所用的固定剂。举例来说，可以使用中性缓冲福尔马林、Bouin或多聚甲醛来固定样品。
在某些实施方案中，在膨胀之前、期间或之后对感兴趣的样品标记或加标签。通常，标记或标签将化学结合(例如，共价地、氢键键合或离子结合)样品或其组分。标签可以为特定靶标(例如，生物标志物或分子类别)选择性的，如可以用抗体或其他靶标特异性结合剂完成的。标签优选包含可视化组分，典型的是染料或荧光分子。例如，荧光标记的样品通过诸如但不限于免疫荧光、免疫组织化学或免疫细胞化学染色的技术进行标记以协助显微术分析。因此，标记物或标签优选地化学附着在样品或其靶组分上。
在一个优选的实施方案中，标记物或标签是抗体和/或荧光染料。此外，抗体或荧光染料可包含物理、生物或化学锚定剂或模块，其将样品与水凝胶或其它可膨胀材料附着或交联。
在一些实施方案中，标记的样品包含多于一种标记物。例如，每种标记物可以具有特定或可区分的荧光特性，例如可区分的激发和发射波长。此外，每种标记物可以具有不同的靶标特异性结合子，其选择性地用于样品中或样品组分的特定的和可区分的靶标。
待处理的样品是生物学、化学或生化材料，并选自但不限于，细胞、培养细胞、生物组织、标本、活组织检查样品、完整器官、整个生物体、细菌、真菌和病毒。样品可以是活的、固定或保存的，例如活的培养细胞或固定的组织切片。
在某些实施方案中，用于膨胀的样品是培养细胞，例如培养的肿瘤细胞系。在一些其他实施方案中，用于膨胀的样品是厚度为50μm或更小的组织切片，即薄组织样品。在一些别的实施方案中，用于膨胀的样品是厚度在30μm-400μm范围内的组织样品，例如在30μm-100μm，100μm-200μm，200μm-300μm，300μm-400μm，50μm-150μm，150μm-250μm，和250μm-350μm的范围内。在一些别的实施方案中，用于膨胀的样品是厚度大于400μm的组织样品或整个器官。
样品的锚定
在膨胀之前，将生物样品(例如固定或活的)与化学锚定剂接触或用锚定溶液(存在或不存在化学固定剂)灌注，并孵育足够的时间以进行化学反应。锚定溶液可以包括一种或多种锚定剂。在一些实施方案中，锚定步骤可以在埋放步骤之前进行。在一些实施方案中，在将样品包埋到溶液中之前，将锚定剂添加到水凝胶前体溶液中。在一些其他实施方案中，在将样品包埋到水凝胶前体溶液中之后，将锚定剂(任选地还有固定剂)加入到水凝胶前体溶液中。在一个实施方案中，锚定剂是2-甲基丙烯醛。
术语“锚定剂”和“交联剂”在本文中可以互换使用。化学锚定剂优选是包含生物分子反应性化学基团和水凝胶反应性化学基团的双功能锚定剂。在某些实施方案中，含有一种或多种功能性的化学锚定剂将反应基团附着于生物样品内的目的生物分子的功能性基团(例如，伯胺或巯基)，所述生物分子可以是蛋白质、核酸、脂质、蛋白聚糖、脂多糖等。化学锚定剂使样品中的生物分子功能化，从而在样品埋入步骤中与水凝胶聚合物的生长的链反应，由此将功能化的生物分子共价锚定到水凝胶网中。
化学锚定剂经常在锚定溶液中提供。在一些实施方案中，通过将化学锚定剂溶解或稀释在水性缓冲液，例如PBS、MES缓冲液或包含50mM碳酸钠、50mM碳酸氢钠和10mM 10％(v/v)Triton X-100的缓冲液中来制备锚定剂溶液。锚定剂溶液还可以包含固定剂。本领域技术人员可以容易地基于所选择的锚定剂确定缓冲液的组分。
在某些优选的实施方案中，化学锚定剂包括两种不同的功能性基团，一种用于生物分子的功能化，第二种用于与生长的聚合物链反应。生物分子的功能化可以在化学固定期间进行，即在活的样品或新冷冻的样品上进行，或化学固定之后即在固定和保存了的样品上进行。双功能化学锚定剂的两种不同的功能性基团可以通过各种长度和结构的化学间隔物(包括支链间隔物)分隔开来。
在一些实施方案中，生物分子反应性化学基团包括但不限于，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯、环氧基、醛基、甲酰胺基团，其可以与蛋白质、肽、核酸和/或脂质上的氨基或羧酸基团反应。水凝胶反应性基团包括但不限于乙烯基、烯丙基、丙烯酸根、甲基丙烯酸根、丙烯腈、丙烯酰胺基团。
在某些实施方案中，用于将蛋白质和核酸或其他生物分子直接与任何水凝胶聚合物链交联的化学锚定剂是选自2-甲基丙烯醛，N-琥珀酰亚胺基丙烯酸酯(NSA)，N-(烯丙氧基羰氧基)-琥珀酰亚胺(NAS)，烯丙基缩水甘油醚(AGE)，丙烯酸缩水甘油酯(GAL)和甲基丙烯酸缩水甘油酯(GME)的一种或多种。例如，用NSA或NAS处理分别用丙烯酰胺或烯丙氧基羰基氧酰胺基功能团修饰蛋白质上的胺，其允许功能化蛋白在聚合过程中锚定到水凝胶。用AGE、GAL或GME处理分别用烯丙基、丙烯酸根或甲基丙烯酸根功能性基团修饰蛋白质、脂质和核酸上的胺，其允许功能化生物分子在聚合过程中锚定到水凝胶。
本文方法中使用的化学锚定剂可以包含2-甲基丙烯醛、NSA、NAS、AGE、GAL和GME的一种或由其组成。在一些特定实施方案中，化学锚定剂包含AGE。在一些其他实施方案中，化学锚定剂包含GME。在一些其他实施方案中，化学锚定剂包含GAL。在一些其他实施方案中，化学锚定剂包含NAS或NSA。这些锚定剂可以以不同比率例如约1:10、1:20、1:30、1:40、1:50、1:100、1:150、1:200在锚定剂缓冲液中稀释，取决于选择的缓冲液和锚定剂、期望的反应速率和锚定效果等。
本文方法中使用的化学锚定剂可以包含2-甲基丙烯醛、NSA、NAS、AGE、GAL和GME中的两种或更多种。另外，双功能锚定剂如NSA、NAS、AGE、GAL和GME可以与其他类型的锚定剂如单功能锚定剂组合使用。单功能锚定剂是包含生物分子反应性基团但不包括与水凝胶聚合物链反应的功能性基团的锚定剂，例如1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDE)或甘油二缩水甘油醚(GDE)。
在一些其他实施方案中，化学锚定剂包括AGE、GAL和GME的一种或多种与BDE和GDE中的一种或多种组合。具体地，Octa-ExM方法中使用的化学锚定剂可包含选自以下的组合：AGE+BDE、GME+BDE、GAL+BDE、AGE+GDE、GME+GDE和GAL+GDE。优选地，化学锚定剂包含AGE+BDE或GME+BDE。
不同的锚定剂可以以不同的比率组合，例如本文方法中使用的锚定剂组合可包含摩尔比为约1：1的AGE和BDE。所有试剂均是市售的，化学稳定且相对安全(可用于常规生物实验室)。
水凝胶聚合或凝胶化
如上文公开的，用水凝胶前体溶液渗透(例如灌注、注入、浸渍、添加或其他混合方式)或埋入水凝胶前体溶液中，其中样品内的生物分子(已由交联剂功能化或正通过交联剂功能化)与水凝胶聚合物链共价结合并产生样品-水凝胶复合体。样品-水凝胶复合体包括可膨胀的聚合物网络。
水凝胶前体溶液通常包含溶解在水性溶液(例如水)中的一种或多种水凝胶单体、低聚物或前体。与水凝胶相关的术语“单体”或“前体”可以在本文中交换使用，包括构建水凝胶聚合物链的小单位的单体、共聚单体和交联剂。除了水凝胶前体之外，水凝胶前体溶液还可包含聚合活化剂(例如APS、过硫酸钾、VA-044等)或促进剂(例如TEMED)。水通常用作形成水凝胶的分散介质，但也可以使用其他溶剂。
水凝胶前体将与样品聚合和/或交联以形成水凝胶-样品复合体。在某些实施方案中，水凝胶的前体包含但不限于，丙烯酸钠(SA)，甲基丙烯酸钠(SMA)，衣康酸(IA)，反式乌头酸(TAA)，乙基-2-(羟甲基)-丙烯酸酯(EHA)，N,N-亚甲基双丙烯酰胺(MBAA，又称为BIS)，N,N-二甲基丙烯酰胺(DMAA)，季戊四醇四丙烯酸酯(PT)，丙氧基化三羟甲基丙烷三丙烯酸酯(TPT)，季戊四醇三丙烯酸酯(PA)，二季戊四醇五丙烯酸酯或二季戊四醇六丙烯酸酯(DPHA)，三羟甲基丙烷三丙烯酸酯(TTA)，二(三羟甲基丙烷)-四丙烯酸酯(DiTA)，三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(TTMA)，甘油丙氧基化(1PO/OH)三丙烯酸酯(GPT)，乙氧基化三羟甲基丙烷三丙烯酸酯(TET)，季戊四醇烯丙基醚(PAE)，4-羟基-2-亚甲基丁酸钠(SHMB)，N,N-二甲基氨基丙基丙烯酰胺(DMPAA)和丙烯酰胺(AA)的一种或多种。所有试剂均是市售的，化学稳定且相对安全(可用于常规生物实验室)。
例如，如果要将目的样品埋入聚丙烯酸钠中，则在整个样品上灌注包含单体丙烯酸钠和丙烯酰胺以及交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺的溶液。一旦样品渗透，则溶液被激活以形成聚丙烯酸钠。优选地，包含单体的溶液是水性的。
可以制备水凝胶前体溶液的储备溶液并在使用前稀释。储备溶液可具有高浓度(w/w)的前体，例如约50％或更高，约75％或更高，约80％或更高，约90％或更高。在应用到样品上之前，储备溶液可稀释成约30-50％的浓度。
期望水凝胶在膨胀状态下保持高机械稳定性以实现可调节和可逆的膨胀。优选地，水凝胶前体溶液中含有的用于形成水凝胶的前体包含DMAA、SMA和TPT。本发明人惊讶地发现，使用DMAA、SMA和TPT作为水凝胶前体，获得的水凝胶的机械稳定性高于以前ExM及其各种修改方案获得的其他水凝胶的机械稳定性。包含DMAA、SMA和TPT的水凝胶制剂(本文中命名为“Octa-ExM水凝胶制剂”)被证明具有优越的机械强度和膨胀因子性质的结合。可以以各种比例混合所述前体以形成能在水性缓冲液中可调节和可逆地膨胀至在线性维度中多达十倍的水凝胶。例如，DMAA与SMA的摩尔比可以在约30:1至约4:1的范围内，而SMA与TPT的摩尔比可以在约1:0.004至约1:0.4的范围内。例如，DMAA:SMA:TPT的摩尔比可以在约4:1:0.004至4:1:0.095的范围内。在一些实施方案中，DMAA:SMA:TPT的摩尔比在(30±15):(1±0.5):(0.4±0.2)的范围内，例如约(30±10):(1±0.3):(0.4±0.13)、约(30±5):(1±0.15):(0.4±0.065)、约(30±1):(1±0.03):(0.4±0.013)、约(30±0.5):(1±0.015):(0.4±0.006)、约(30±0.5):(1±0.05):(0.4±0.02)以及约30:1:0.4。优选地，制剂中包含的DMAA:SMA:TPT的摩尔比范围约为(30±3):(1±0.1):(0.4±0.04)，例如约(30±2):(1±0.06):(0.4±0.03)、约(30±1):(1±0.03):(0.4±0.01)、约(30±0.5):(1±0.05):(0.4±0.02)。在一些特定的实施方案中，构成制剂的DMAA:SMA:TPT的摩尔比为约30:1:0.4、约33:1.1:0.44、约27:0.9:0.36、约32:1.06:0.43、约28:0.94:0.37、约31:1.03:0.41、约29:0.97:0.39、约30.5:1.05:0.42、约29.5:0.95:0.38等。
具体地，在一个实施方案中，DMAA：SMA：TPT在水凝胶制剂中以摩尔比约30：1：0.4混合。如实施例1中所示，Octa-ExM水凝胶与其他膨胀显微术中使用的水凝胶的比较显示了其优异的弹性性质和在较高膨胀因子时改进的机械稳定性(见表1A，图1)。即使在80％的应变下，Octa-ExM水凝胶也未破裂，而MAP和ExM水凝胶分别在和时破裂。
水凝胶前体溶液可以通过将DMAA、SMA和TPT(任选地在THF中)混合到水中来制备。水凝胶前体溶液的pH范围优选为6-7，例如约6.5。水凝胶前体溶液可以在使用前新鲜配制，或者制备储液并在使用前稀释。
在一些实施方案中，水凝胶前体溶液还包含聚合活化剂和/或促进剂以诱导聚合或凝胶化，所述活化剂和/或促进剂例如但不限于过硫酸铵、过硫酸钾、TEMED、VA-044或其组合。聚合活化剂可以在使用前，即灌注样品之前与水凝胶前体溶液混合。
在一些实施方案中，样品用包含如上所述的化学锚定剂、水凝胶制剂和聚合活化剂/促进剂的组合物灌注。或者，在与水凝胶前体溶液接触之前用锚定剂处理待凝胶化的样品。
均质化
优选地，在进一步膨胀前对样品-水凝胶复合体进行均质化。如本文所用，“均质化”是指机械、物理、化学、生物化学或优选地酶促消化、瓦解或分解样品，使其不会抵抗膨胀。
在某些实施方案中，在膨胀之前进行酶促均质化，并且包括根据样品类型和尺寸用特异性或非特异性蛋白酶处理样品-水凝胶复合体达合适的时间。例如，酶促均质化包括将样品-水凝胶复合体暴露于相应缓冲液中的蛋白酶K或胰蛋白酶。在某些备选的实施方案中，通过使用富含碱性洗涤剂(例如SDS)的缓冲液进行物理化学均质化，从而保留表位功能。
在一些特定的实施方案中，均质化通过将样品-水凝胶复合体与均质化溶液孵育达足量的时间来进行。均质化溶液可以通过将蛋白酶(例如蛋白酶K)与均质化缓冲液混合来制备。很多均质化溶液是本领域中确立且常规使用的。均质化溶液可以实验室内部容易地制备或者商购。
备选地，也可以通过将样品-水凝胶复合体与包含碱性洗涤剂(例如十二烷基硫酸钠，pH为7.0-10.0)的均质化缓冲液温育达足量的时间来完成均质化。
优选地，消化和瓦解样品不会影响水凝胶的结构，而是破坏样品的结构。因此，可膨胀材料对于样品消化和瓦解应基本上是惰性的。期望消化程度足以破坏样品的机械结构的完整性。
均质化处理允许目的蛋白质在膨胀后或均质化后通过抗体染色标记。在这样的实施方案中，目的蛋白质如蛋白质在分子去拥挤的环境中标记，从而改善可达性以及由此改善抗体染色的效率。
均质化方法允许克服几种限制。首先，它有助于克服天然组织的拥挤环境中递送抗体所固有的局限性4-6。密集包装的蛋白质(例如在突触中)表位被屏蔽因此阻碍抗体渗透。
其次，它进一步提高了荧光成像的可实现的分辨率，因为与膨胀后蛋白质之间的空间相比，抗体的大小变得可忽略。它对成像技术具有超出抗体尺寸的分辨率特别重要。由于在荧光显微术中观察到的是荧光标记而非目的蛋白质的定位，第二抗体的荧光团通常与目的蛋白质相离从而如果成像的分辨率低于30nm就引入假标记。如果在均质化和膨胀后进行免疫染色，则抗体引入的空间误差减少，减少的因子等同于线性膨胀因子。这是Octo-ExM的一个重要优势，是常规的超分辨率成像技术不具备的。
膨胀样品-水凝胶复合体
均质化后，基于最终用户的需求实施对样品-水凝胶复合体的可调节膨胀，达到期望的程度。复合体可以在三维中各向同性膨胀，优选具有纳米级精度。
去除均质化缓冲液后，将溶剂或液体添加到样品-水凝胶复合体中，然后其被复合体吸收并引起膨胀。在样品-水凝胶复合体可用水膨胀的情况下，可以使用水溶液。在一些实施方案中，添加水允许埋入的样品在三维中膨胀其原始尺寸的8倍至10倍或更多。因此，样品的体积可以增加100倍或更多。这是因为聚合物嵌入了整个样品中，因此当聚合物膨胀(生长)时，它也会使样品膨胀。组织样品本身因而变得更大。令人惊讶的是，当材料各向同性膨胀时，锚定的标记物或标签保持其相对空间关系。
大多数应用的目标往往是达到最高可能的空间分辨率，使用不同的ExM方案来对亚细胞结构进行成像。最高可实现的分辨率用膨胀因子来定义，出于简便，通过整体凝胶膨胀测量2,7,8。结果表明，在一些ExM方案中，水凝胶的膨胀因子大于包埋的生物样品，从而在表观分辨率的测定中引入了假标记9。如实施例验证的，使用Octa-ExM方案基于包埋的样品计算的线性膨胀因子约为7.0。
本文公开的方法可包括锚定、均质化和染色过程的不同组合。在一些实施方案中，通过使用含有洗涤剂的碱性缓冲液进行均质化步骤，其提供内源蛋白质上的表位保留。然后对培养的细胞(例如阴性HEK293T细胞)进行抗体染色，其使用标准方法标记内源性Nup153复合物。标准免疫染色如预期的得到Nup153的优异图像质量，显示生物样品中的内源蛋白的高表位保留。此外，膨胀的样品-水凝胶复合体可以用DAPI染色以突出显示DNA。
Octa-ExM方法与固定后和膨胀前的标准抗体染色兼容。Octa-ExM方案与荧光蛋白以及样品-水凝胶复合体膨胀之前或之后使用抗体进行的标准免疫荧光方法相容，在常规成像装置下提供高达50nm的横向分辨率。
在某些实施方案中，本发明实现内源性蛋白质的抗体染色，然后用含有洗涤剂的碱性缓冲液进行更温和的瓦解处理。由于分子去拥挤，当生物分子之间的距离增加暴露更多的表位时，膨胀后染色可使抗体更快穿透到厚的组织标本中，有更高的标记密度，并更有效的对稠密包装的蛋白复合物和结构(例如突触)染色。为了利用厚组织染色的分子去拥挤，本文公开的Octa-ExM方法可以采用更温和的处理来进行机械均质化以保留组织标本中的表位和荧光蛋白的内在荧光。如本文显示的，使用Octa-ExM方案处理转基因表达或病毒注射表达荧光蛋白的小鼠脑切片，其中采用温和处理然后用标准免疫组织化学方案进行抗体染色。膨胀后样品的荧光成像表明，Octa-ExM方案实现了对难以染色的结构(如突触)的有效的膨胀后免疫组织化学染色，以及遗传编码探针的荧光的保留。也在其他小鼠组织(如乳腺)上测试了使用Octa-ExM方案的膨胀前染色。将乳腺用针对微管蛋白的抗体和DAPI染色然后进行Octa-ExM处理，保留了足够的荧光强度，以在常规的共聚焦显微镜下可视化感兴趣的结构。Octa-ExM使用标准递送方法实现了抗体和荧光探针的有效膨胀后染色。
在另外的实施方案中，本发明提供了一组用于生物样品的膨胀和随后在膨胀状态下的生物化学或光谱表征的方法，其中包括或不包括染色。如本文所用，术语“生物样品”通常是指代但不限于包括组织、细胞或其任何组分、任何器官的全部或部分的生物或生物化学样品，所述器官包括但不限于脑，脊髓，心脏，肺，肝，肾，胃，结肠，骨骼，肌肉，皮肤，腺体，淋巴结，生殖器，乳房，胰腺，前列腺，膀胱，甲状腺和眼。
在某些实施方案中，加入纯水或其它水性缓冲液允许样品-水凝胶复合体在线性维度中从样品初始尺寸膨胀高达8倍，并保持高机械稳定性和弹性。机械稳定性和弹性均允许容易地处理膨胀的样品，而不会使样品-水凝胶复合体机械变形从而保持其完整性。这些性质至关重要，因为其确保了不存在可能由样品-水凝胶复合体的变形或破裂引起的假成像。结果，样品体积可以在三维体积上增加512倍，而且是各向同性地，即在所有维度等同。各向同性膨胀的发生是由于以下情况，贯穿样品形成的可膨胀聚合物的分子链膨胀将生物分子分开，使得组织样品本身变得更大。重要的是，膨胀后生物分子的相对位置保持不变。膨胀后，样品-水凝胶复合体可以使用光学显微镜进行成像，使得能够有效可视化小于经典衍射极限的特征。由于膨胀后样品-水凝胶复合体是透明的，因此可以采用任何能够大容量成像的常规显微镜。
一旦膨胀，可以探测组织中一种或多种蛋白质的存在和/或位置。考虑到蛋白质的不同位置和功能以及蛋白质检测试剂的可用性，例如但不限于现有的大抗体库(接近100,000种抗体)，蛋白质组是用于多分辨率成像的理想对象。
如本文所示，一个重要方面是本公开的方法还可以包括对感兴趣组织的抗体染色和成像的重复循环，而没有显著的表位损失。因此，不仅可以将组织线性膨胀，而且也使它们足够稳健以耐受重复的抗体染色和清理，而不对表位质量有可感知的影响。
可以在任何光学显微镜上对具有埋入的目的样品的膨胀材料成像，从而允许有效成像在经典衍射极限以下的特征。由于所得标本优选是透明的，能够大容积、宽视野、3-D扫描的常规显微镜也可以与膨胀的样品联合使用。
(II)快速膨胀显微术(rExM)
在一个方面，本文提供了一种基于Octa-ExM的改进的样品制备方法，其被称为Rapid-ExM(rExM)。rExM通过将多个样品处理程序合并到一个步骤中，实现了更快的样品处理。与上述Octa-ExM处理相比，rExM方案具有两个变化。在一个变化中，通过将混合的化学固定剂和化学锚定剂(例如PFA和2-甲基丙烯醛)应用于样品来同时进行化学固定和蛋白质锚定。在另一个变化中，蛋白质锚定和水凝胶前体溶液孵育可以组合成一个步骤。这些变化可以减少样品制备的时间和劳力。
rExM方案与多种样品染色方法兼容。在一些实施方案中，在进行rExM之前样品可以是已经经过免疫染色的，例如可以首先使用针对α-微管蛋白、α-肌动蛋白或Nup15的标准抗体对HeLa细胞进行染色。在一些其他实施方案中，样品在rExM和均质化后用抗体和小染料(例如抗α-微管蛋白抗体和DAPI)染色。均质化可以使用抗原保存处理完成。
rExM方案与夹心免疫测定法兼容，使荧光信号扩增能够提高成像质量。重要的是，应用于rExM处理样品的夹心免疫测定不会像在膨胀前染色中那样引起细胞结构增大(Cho等人，2020)。
(III)快速染色ExM(rsExM)
在一个方面，本文提供了一种基于rExM的改进的样品制备方法，称为快速染色ExM(rsExM)。rsExM通过将蛋白质锚定、染色和单体孵育结合到一个步骤中，进一步加速了样品处理。rsExM方案的制备速度比之前报道的任何方案快3倍(见图20a)。
(IV)试剂盒
本文还提供了用于实施主题方法的试剂盒，其中所述试剂盒通常包括如上所述的用于形成水凝胶的前体(包括单体、低聚物和交联剂)。试剂盒可以放置在-20℃储存至少6个月，也可以放置在4℃或环境温度保存至少3个月。试剂盒的组件在储存时是稳定的，并且保持了成像质量。
在一些优选实施方案中，试剂盒进一步包括双功能锚定剂，例如2-甲基丙烯醛。可以将锚定剂与前体混合以形成混合溶液，然后将样品嵌入到混合溶液中。优选地，所述前体是DMAA、SMA和TPT。前体可以存在于试剂盒中的分开的容器中，例如DMAA存在于第一容器中，SMA存在于第二容器中，TPT存在于第三容器中，并且在使用前进行混合。
备选地，以下任何形式也是合适的：在第一容器中DMAA和SMA混合在一起(以一定比例范围)，第二容器中包含TPT；在第一容器中DMAA和TPT混合在一起(在一定比例范围内)，第二容器中包含SMA；在第一容器中SMA和TPT混合在一起(以一定比率范围)，而第二容器中包含DMAA。容器可以组合构造在一起或者分开放置。
在一些其他实施方案中，试剂盒包括容器，该容器包含已经混合在一起的DMAA、SMA和TPT，其摩尔比范围为(30±3):(1±0.1):(0.4±0.04)，例如约(30±2):(1±0.06):(0.4±0.03)，约(30±1):(1±0.03):(0.4±0.01)，约(30±0.5):(1±0.05):(0.4±0.02)和约30：1：0.4。在一些其它实施方案中，DMAA∶SMA的摩尔比在约30:1至约2:1的范围内，SMA与TPT的摩尔比在约1:0.0001至约1:0.4的范围内。在一些具体实施方案中，DMAA与SMA的摩尔比在6:1至2:1的范围内，SMA与TPT的摩尔比在1:0.0002至1:0.2的范围内。具体地，DMAA∶SMA∶TPT的摩尔比率在3.97:1:0.0004至3.97:1:0.01的范围内或4:1:0.0004至4:1:0.01的范围内。
在一些实施方案中，试剂盒包含含有DMAA、SMA和TPT的水凝胶前体溶液。
所述试剂盒可进一步在容器中包括一种或多种用于使样品功能化的锚定剂，其可以选自2-甲基丙烯醛，AGE，GME，GAL，BDE和GDE。在一些实施方案中，锚定剂是单独的2-甲基丙烯醛，AGE，GME或GAL。在一些其他实施方案中，锚定剂是存在于分开的容器中的AGE和BDE组合或GME和BDE组合，或者或在一个容器中混合在一起的AGE+BDE组合或GME+BDE组合。在一些进一步的实施方案中，试剂盒包括含有水凝胶前体和锚定剂的混合物的容器。
试剂盒可以进一步包括包含诸如PFA的固定剂的容器。PFA可以已经溶解在PBS中。在一些进一步的实施方案中，试剂盒包括含有固定剂和锚定剂的混合物的容器。
试剂盒可以进一步包括含有染色剂或标记剂例如抗体或染料的容器。在一些进一步的实施方案中，试剂盒包括含有染色剂和锚定剂的混合物的容器。在一些进一步的实施方案中，试剂盒包括含有染色剂、水凝胶前体和锚定剂的混合物的容器。固定剂与锚定剂以及锚定剂与单体溶液的混合物在储存条件下是稳定的，并且可以在不影响性能的情况下运输。
所述试剂盒可以进一步包括以下容器，该容器包含要在聚合之前添加的聚合活化剂或促进剂。所述聚合活化剂或促进剂可以选自但不限于VA-044，TEMED，过硫酸钾和APS。优选地，聚合活化剂(例如APS)最后在冰上并且正好在用水凝胶前体溶液灌注样品之前加入到水凝胶前体溶液中。
试剂盒可进一步包括包含均质化缓冲液的容器。具体而言，均质化缓冲液可包含蛋白酶或碱性洗涤剂(例如SDS)，或在使用前补充有蛋白酶或碱性洗涤剂(例如SDS)。在一些实施方案中，试剂盒包括包含蛋白酶K的容器。在一些实施例中，试剂盒包括包含常用缓冲液(例如PBS)的容器，以便于溶液的制备。
容器应理解为是指可以容纳或包容(例如水凝胶制剂的)液体或固体组分的任何结构；示例性容器包括瓶，注射器，小瓶，小袋，胶囊，安瓿，药筒等。通过使用其他组件(例如包裹小瓶的铝箔袋)或通过选择容器本身的材料属性(例如琥珀色玻璃小瓶或不透明注射器)，可以使容器免受可见光、紫外线或红外线的辐射。
试剂盒还可包括混合装置，用于将前体混合在一起以产生本发明的制剂。试剂盒还可以包括凝胶处理设备，例如软刷，镊子和/或将水凝胶前体溶液注入到样品上的递送设备(可以包括或可以不包括混合元件)，等等。
在一些实施方案中，试剂盒包含以下一种或多种组件：
凝胶室，其被配置为在凝胶化之前容纳样品，并且可选地，包含盖子以密封凝胶室；成像室，其配置为在凝胶化之后容纳样品；凝胶处理装置；和冷却装置(例如冰袋)。
试剂盒还可包括其他组件，例如干燥剂或其他保持试剂盒中水含量控制的工具，传达试剂盒所经历的最高温度的指示器等，这些组件是产品运输和储存过程中保持良好的状态所需要的。
在一些实施方案中，试剂盒包括用于形成如上所述的样品-水凝胶复合体的凝胶室。凝胶室被配置为包括空腔、孔或空间，用于在胶凝之前容纳样品，例如以皿的形式，例如MatTek皿。胶凝室还可包括覆盖空腔、孔或空间的盖(例如盖玻片)。
在一些实施方案中，试剂盒还包括配置成在凝胶化之后容纳样品的膨胀室。该试剂盒可包括多个这种腔室，例如包装在一起的数十个皿以便于使用。
本文所述的试剂盒可以储存至少6个月，并与一些试剂一起在冰上或室温运输，可以包括包装到合适容器中用于分发的试剂的各种组合。用于部署和形成本发明的水凝胶复合体的试剂盒的实例包括但不限于：
包含DMAA、SMA和TPT的混合物的容器，DMAA、SMA和TPT的摩尔比为30：1：0.4，因此用户在使用前无需称重化学品。该试剂盒可以包括超过一个这样的容器。提供注射器，该注射器包含适合于添加至前体以形成水凝胶前体溶液的缓冲液。可以将水凝胶前体溶液抽入注射器中并添加到功能化样品中。该试剂盒进一步包括各自分别包含锚定剂，用于蛋白酶处理的均质化缓冲液，用于洗涤剂处理的均质化缓冲液，蛋白酶，标记剂(例如染料)和/或聚合活化剂的容器；
包含溶液A的容器，溶液A可以是溶于PBS的PFA或PFA与化学锚定剂(例如2-甲基丙烯醛)的混合物；
包含溶液B的容器，溶液B可以是水凝胶单体/前体溶液、补充有化学锚定剂(例如2-甲基丙烯醛)的水凝胶单体溶液、或补充有化学锚定剂(例如2-甲基丙烯醛)和特定染料的单体溶液；
包含溶液C的容器，溶液C可以是基于变性剂的均质化缓冲液或基于蛋白酶K(ProK)的均质化缓冲液；
包含溶液D的容器，溶液D可以是ProK储液；
包含选自VA-044、V50、TEMED、APS的凝胶化活化剂或促进剂的容器；
包括可用于配制所需溶液的普通缓冲液(例如1x PBS)的容器。
此外，试剂盒可以包含不同形式的模具或凝胶化室，其适用于多种样品的凝胶化，包括但不限于细胞培养物、整个器官、组织切片、整个生物体。
除上述组件外，本发明的试剂盒通常还包括使用试剂盒的成分实施主题方法的说明书。通常将用于实施本主题方法的说明书记录在合适的记录介质上。例如，说明书可以印刷在诸如纸或塑料等的基材上。这样，说明书可以作为包装插页存在于试剂盒中，或在试剂盒或其组分的容器的标签中(即与包装或子包装连在一起)。在其他实施方案中，说明书作为电子存储数据文件存在，该电子存储数据文件存在于合适的计算机可读存储介质上，例如CD-ROM。在其他实施方案中，试剂盒中不存在实际的说明书，而是从远程源(例如通过网络)获得说明书的指示。该实施方案的一个示例是一种试剂盒，其包括网址，在该网址上可以查看和/或可以从其下载说明书。与说明书一样，用于获得说明书的方法被记录在合适的材料上。
提供以下实施例以更好地说明要求保护的发明，并且不被解释为限制本发明的范围。下面的所有特定组合物、材料和方法全部或部分地落入本发明的范围内。这些特定的组合物，材料和方法不旨在限制本发明，而是仅仅例示了落入本发明的范围内的具体实施方案。本领域技术人员可以在不付出创造性劳动和不脱离本发明的范围的情况下，开发等同的组合物、材料和方法。应当理解，可以在本文描述的过程中进行许多变化，同时仍然留在本发明的范围内。发明人的意图是包括这种变化在本发明的范围内。
实施例
下面实验中使用的示例性试剂、材料和储存条件如表A所示。试剂的体积或质量可以根据用户的需要按比例上调或下调。
表A.
实施例1：不同水凝胶的弹性和稳定性测试
在该实施例中，系统地测量和量化在MAP1，EXM2，10X3和Octa-ExM中使用的各种水凝胶的膨胀因子和机械性质(表1A)。通过将相应的单体以表1A中所示的摩尔比混合来制备用于MAP，EXM，10X和Octa-ExM水凝胶的凝胶化溶液。将单体溶液分别进行以下补充以启动聚合：MAP为0.1％w/v的VA-044，ExM为0.2％w/v的过硫酸铵和0.2％w/v的TEMED，10X为0.4％w/v的过硫酸钾，Octa-ExM为0.3％w/v的VA-044。为了进行凝胶化，将3.5cm MatTek皿中的空腔填充有活化的单体溶液，盖玻片覆盖。然后，将MatTek皿转移至真空烘箱，并在黑暗中在37℃在N2气中孵育2小时。聚合后，膨胀水凝胶并评估膨胀因子。使用CMT-50计算机控制电子通用测试机测量水凝胶的机械性质。
表1A.各种水凝胶的膨胀因子和机械性能。
a由于10x水凝胶在膨胀状态下的机械性能差而不适用。值是均值±标准偏差。
与其他膨胀显微术的水凝胶相比，Octa-ExM水凝胶显示出其优异的弹性性能，以及在较高膨胀因子下的改善的机械稳定性(表1A，图1)。即使在80％的应变下，Octa-ExM水凝胶也不会破裂，而MAP和ExM水凝胶分别在和破裂。
还测试了不同比率的SMA：DMAA：TPT。发明人发现，宽范围的比率均获得具有期望的膨胀因子和机械强度的凝胶(表1B)，表明SMA +DMAA+TPT的组合是广泛可用的。
表1B
a在模拟真正实验的手动处理(即从一个皿转移到另一个皿、摇动、摇晃和使用手术刀剖开)之后，通过目视检查完全膨胀的水凝胶样品观察其裂纹和断裂情况来获得机械稳定性。
实施例2：使用不同条件膨胀细胞
在该实施例中，系统地测量和量化了多种Octa-ExM工作流中各种荧光蛋白的荧光保留(表2)。选定的荧光蛋白(FP)在人胚胎肾(HEK293T)细胞中共表达，并在表2所示的不同条件下处理。
表2.使用各种锚定剂的Octa-ExM中，HEK293T细胞中选择的荧光蛋白(mTurquoise2、EGFP、mRuby2)和DAPI染色的荧光保留。
FR-荧光保留。
AGE+BDE：AGE与BDE摩尔比为1:1.
GME+BDE：GME与BDE摩尔比为1:1.
表3.使用各种锚定剂的Octa-ExM中，HEK293T细胞中选择的荧光蛋白(mRuby2、mTurquoise2)和DAPI染色的荧光保留。
获得相同细胞的固定细胞的图像与Octa-ExM后的图像并比较(图2a，图3a)。所有FP在使用各种锚定剂的Octa-ExM膨胀后均保留其荧光，在每个通道中保留的荧光足以使用常规显微镜获得高质量成像(n＝2个独立转染/每种；图2-3，表2-3)，DAPI荧光虽然保留水平略低，但也足以进行成像。
测试不同的锚定组合物并显示表达荧光蛋白并用DAPI染色的培养细胞的可调节膨胀，保留了足以使用普通成像设置的高质量可视化的高水平荧光。与其他膨胀方法相比，用于样品处理和膨胀的优化程序显著减少了获得超分辨率图像的时间(对于其他膨胀方案为2天，Octa-ExM为6小时)。荧光蛋白和DAPI以高效率保留膨胀凝胶中的荧光(表2-3和图2-3)。
实施例3：用于培养细胞或薄组织切片(50μm或更低)的Octa-ExM
如下进行表达荧光蛋白或用抗体染色的培养细胞或薄组织切片(50μm或更低)的Octa-ExM程序，凝胶化在3.5cm MatTek皿中进行。
3.1样品准备
3.1.1HeLa细胞中微管的固定和免疫染色
将培养的HeLa细胞悬浮液沉淀，吸出细胞培养基。把500μL细胞骨架提取缓冲液(Triton X-100 0.5％，PIPES 0.1M，EGTA 1mM，氯化镁1mM)加到玻璃载玻片，并在室温下与样品孵育1分钟。然后吸掉细胞骨架提取缓冲液，加入1ml微管固定溶液并在室温下孵育10分钟。类似地，然后吸掉微管固定溶液(PFA3％和戊二醛0.1％，在1×PBS中)，加入1mL还原溶液(硼氢化钠0.1％，在1×PBS中)并在室温下温育7分钟。同样，将还原溶液吸出，加入1mL淬灭溶液(1×PBS中的甘氨酸100mM)并在室温下孵育10分钟。然后吸出淬灭溶液，将300μL封闭介质(MaxBlock封闭介质)加到玻璃，并在室温下温育2小时。然后，吸出封闭介质，加入1mL洗涤介质(MaxWash洗涤介质)并在室温下孵育10分钟。
然后，将样品细胞与加到玻璃片的一抗溶液在室温孵育2小时，洗涤，与稀释的二抗溶液在室温在黑暗中(例如，通过用铝箔包裹)孵育2小时，然后再洗涤。通过使用荧光显微镜对样品进行成像来检查细胞固定和免疫染色结果。微管显示出明亮、连续但模糊的线，具有低背景荧光，表明它们成功固定和免疫染色。
3.1.2培养细胞的一般固定
沉淀培养的细胞悬浮液，吸出细胞培养基。将1.5ml 4％PFA加入样品中，在室温下孵育10分钟，然后在室温下用PBS洗涤几次，并在4℃储存直至进一步处理。
3.1.3组织的固定和切片
小鼠心脏用1x PBS和新制备的1X PBS中冰冷4％PFA灌注。将目的器官(小鼠脑、肾、肝、心脏、胸腺或乳腺)解剖并在4℃在4％PFA中在黑暗中孵育过夜。通过将管轻柔翻转用PBS洗涤样品两次，每次洗涤翻转5次。然后，将组织以适当的厚度切片并在4℃储存在PBS中直至进一步处理。
3.2蛋白锚定
通过将100μl锚定剂储液在1.9ml锚定剂缓冲液中稀释来制备新鲜的锚定剂溶液，总体积为2mL(1:20稀释)(表A)。加入2ml稀释的锚定剂溶液以覆盖整个盖玻片并防止在孵育期间样品干燥。在黑暗中在37℃下孵育2小时。对于组织切片样品，将组织切片放入有2mL稀释的锚定剂溶液的Eppendorf管，并在黑暗中在37℃孵育2小时。该步骤的估计实验时间约为2小时，动手时间为1至5分钟。
3.3凝胶化
凝胶化溶液通过以450：39：10：1的体积比混合预冷的Stock 8X、ddH2O、过硫酸铵溶液和TEMED(表A)并涡旋15秒来制备，然后立即置于冰上以避免过早的聚合。
将3.5cm MatTek皿中的孔覆盖盖玻片，盖玻片已经用乙醇彻底清洗以除去油脂和其他机械污染，并立即通过壁和盖玻片之间的1毫米间隙填充预冷的凝胶化溶液(见图11)。然后，将样品转移至真空烘箱，并在黑暗中在37℃在N2气中孵育2小时。该步骤的估计实验时间约为3小时，动手时间为10至30分钟。
3.4均质化
将样品从真空烘箱中取出，并且在不损坏所形成的样品-水凝胶复合体的情况下小心地除去盖玻片。然后，将样品-水凝胶复合体转移到培养皿中(参见图11)。通过将蛋白酶K(ProK)与均质化缓冲液以1：250体积比(用于细胞培养物)或1：100体积比(用于组织切片)混合制备均质化溶液。将2ml均质化溶液加入到培养皿中的凝胶化样品中，并在黑暗中在37℃孵育2小时(或在室温过夜)。在均质化溶液中孵育时，凝胶经历了约2倍的线性膨胀。该步骤的估计实验时间约为2小时(可选：过夜)，动手时间为1至5分钟。
3.5膨胀
随后，吸出均质化溶液并将凝胶转移到允许样品从其原始尺寸膨胀8倍的线性膨胀的皿中。确保将细胞朝向底部。加入纯水以覆盖整个凝胶，在黑暗中在室温下孵育0.5小时，并且该步骤再重复三次。再次，加入新鲜的纯水以覆盖凝胶，并在黑暗中在室温下温育4小时(或过夜)。该步骤的估计实验时间约为6小时(可选：过夜)，动手时间为10至30分钟。
3.6成像
去除含有样品的皿中的液体，并将凝胶移动到载玻片上用于显微镜成像。
实施例4：厚度为30μm-400μm的组织样品的Octa-ExM
使用荧光蛋白或免疫染色对厚度为30μm-400μm的组织样品的Octa-ExM程序如下进行。免疫染色也可以在样品-水凝胶复合体均质化之后进行。
4.1样品准备
样品制备遵循免疫组织化学的常规方案来制备未染色的或抗体染色的组织切片样品。
4.2蛋白锚定
通过将100μl锚定剂储液在1.9ml锚定剂缓冲液中稀释来制备新鲜的锚定剂溶液，总体积为2mL(1:20稀释)(表A)。使用软刷将储存在PBS中的组织切片转移到具有2mL稀释的锚定剂溶液的Eppendorf管中，并在37℃下在黑暗中孵育2小时。该步骤的估计实验时间约为2小时，动手时间为1至5分钟。
4.3凝胶化
当切片的厚度高于50μm时，在黑暗中在4℃在1.5mL微量离心管中过夜孵育在Stock8X中的切片。对于厚度50μm或更低的切片，可以省略该孵育。将玻璃载玻片包裹到一片石蜡膜中，将该片石蜡膜轻轻按压到载玻片的所有表面上(见图11)。将相应厚度的矩形盖玻片(用作间隔物)放置在石蜡膜包裹的玻璃载玻片的每一端。均匀地压在盖玻片使其粘附在石蜡膜的表面上。
凝胶化溶液通过以450：39：10：1的体积比混合预冷的Stock 8X、ddH2O、过硫酸铵溶液和TEMED并涡旋15秒来制备，然后立即置于冰上以避免过早的聚合。在两个间隔物之间的石蜡膜上加入80μL凝胶化溶液。使用刷子将切片从微量离心管转移到放置在石蜡膜上的凝胶化溶液的液滴中，并轻轻涂抹组织以避免其折叠。立即，将另一个盖玻片(“顶部盖玻片”)轻轻放在组织样品的顶部并确保与间隔物充分重叠。顶部盖玻片的边缘将搁置在间隔物上以形成胶凝室。切片应定位在凝胶室的中间。
通过侧面间隙缓慢地用预冷的凝胶化溶液填充组装的胶凝室，确保样品所有侧完全被覆盖。然后将样品转移至真空烘箱，并在黑暗中在37℃下在N2气中孵育2小时。该步骤的估计实验时间约为3小时(切片的厚度低于50μm)或过夜(切片的厚度高于50μm)，动手时间为10至30分钟。
4.4均质化
将样品从真空烘箱中取出，并且小心地取出用石蜡膜包裹的玻璃载玻片而不损坏形成的样品-水凝胶复合体。然后，将样品-水凝胶复合体转移到培养皿中。
对于具有荧光蛋白或用抗体染色的样品，通过将蛋白酶K(ProK)与均质化缓冲液以1：100的比例混合来制备均质化溶液。将2ml均质化溶液加入到培养皿中的凝胶化样品中，并在黑暗中在37℃孵育2小时(或在室温下过夜)。在均质化溶液中孵育时，凝胶经历了约2倍的线性膨胀。该步骤的估计实验时间约为2小时(可选：过夜)，动手时间为1至5分钟。
或者，当在均质化后进行抗体染色时，通过用含有洗涤剂的碱性溶液处理来均质化样品-水凝胶复合体。对于这种均质化，可以通过在洗涤剂(例如，pH7.0至10.0的200mM十二烷基硫酸钠)存在下在一定温度(例如，37-95℃)孵育样品-水凝胶复合体足够的时间段来实现。用含有洗涤剂的碱性溶液处理后，用缓冲液洗涤样品-水凝胶复合体以除去痕量的SDS，并根据常规方案用抗体染色。
4.5膨胀
随后，除去均质化溶液并将凝胶转移到允许样品从其原始尺寸膨胀8倍的线性膨胀的皿中。加入1×SSC/PBS以覆盖整个凝胶，在室温下在黑暗中孵育30分钟，通过使用0.1×SSC/PBS或纯净水重复该步骤数次。最后，加入新鲜的纯水以覆盖凝胶，并在黑暗中在室温孵育4小时(或过夜)。该步骤的估计实验时间约为6小时(可选：过夜)，动手时间为10至30分钟。
4.6成像
除去含有样品的皿中的液体，将凝胶移动到载玻片上用于显微镜成像。
实施例5：使用不同标记和均质化策略对细胞进行Octa-ExM
将使用AGE锚定剂的Octa-ExM方案与几种主要标记策略组合，包括带有荧光蛋白的融合蛋白以及在膨胀前后进行免疫染色。靶向常见结构如组蛋白2B(H2B)、微管蛋白、核孔复合物153(Nup153)来成像10-13。
在HEK293T细胞中H2B与表达的蓝色荧光蛋白mTagBFP2融合来进行H2B的成像。在固定或Octa-ExM处理后使用蛋白酶K消化均质化，进行细胞成像(图5a)。膨胀前后荧光的定量显示出荧光保留超过原始亮度的62％(图5b)。基于埋入样品的膨胀计算的Octa-ExM方案的线性膨胀因子为7.0±0.4(n＝6个样品；图4)。在Octa-ExM的这种情况下，在常规衍射受限显微镜下可实现的理论上的横向分辨率为35-40nm。
使用含有洗涤剂的碱性缓冲液来进行机械均质化的Octa-ExM方案，并使用标准方法抗体染色标记内源性Nup153复合物，来处理HEK293T细胞(不表达任何荧光蛋白)。标准免疫染色如预期的得到Nup153的优异图像质量，显示在生物样品中的内源蛋白的高表位保留(图6)。此外，膨胀的样品-水凝胶复合体可以用DAPI染色以突出显示DNA(图6)。
还确定Octa-ExM方案与固定后和膨胀前的标准抗体染色兼容。固定并用荧光标记的抗体(以可视化内源微管蛋白结构)和DAPI(以将染色质染色)染色的HeLa细胞进行Octa-ExM方案，具有ProK均质化步骤(图7a)。膨胀样品的荧光显微术表明，Octa-ExM方案有效地锚定并保留使用标准方法投递到样品的荧光缀合的二抗的荧光。它还保留了在膨胀之前进行的DAPI染色。
比较了7倍线性膨胀之前和之后的HeLa细胞中的微管蛋白图像。使用具有63xNa1.4物镜的Zeiss LSM 800共聚焦显微镜成像的膨胀之前的微管的半最大全宽度(FWHM)为200nm(图7b)。在具有40x NA1.15物镜的尼康A1R共聚焦显微镜下，7x线性膨胀后的微管具有50nm FWHM，表明在考虑使用的物镜的NA(数值孔径)的分辨率超过6倍的改进(图7b)。因此，Octa-ExM方案与荧光蛋白质和样品-水凝胶复合体膨胀之前或之后使用抗体递送的标准免疫荧光方法兼容，在常规成像设置下提供达到50nm的横向分辨率。
实施例6：使用不同标记和均质化策略在组织上进行Octa-ExM
已经证明了Octa-ExM方案可用于膨胀培养的细胞，接着确定Octa-ExM也适用于三维组织。经转基因或使用病毒载体递送的荧光蛋白在生命科学研究中被广泛用于完整组织和生物体中蛋白质或细胞的光学标记。Octa-ExM方案用于膨胀表达各种荧光蛋白的完整哺乳动物组织。完整组织的均质化可以通过蛋白水解消化或用含有洗涤剂的碱性缓冲剂处理足够的时间来有效地实现。
获得表达Thy1-YFP(经转基因或经病毒注射)的小鼠脑组织，并进行Octa-ExM处理，包括通过蛋白水解消化或用含有洗涤剂的碱性缓冲液处理进行的均质化步骤。在这两种情况下，常规荧光蛋白均保留了足够的荧光水平以实现常规共焦显微镜以及定制和市售的平铺光片成像系统下的超分辨率成像(图8a，b，c)。可以观察和定义表达Thy1-YFP的神经元上的树突棘的具体结构(图8d)。用Octa-ExM处理的大型组织样品是光学上清晰的，具有的折射率与水相匹配，因为膨胀状态的样品-水凝胶复合体99.9％由水组成。这允许使用常规荧光显微镜深入大样品进行多色超分辨率成像，成像深度仅受到所使用物镜的工作距离的限制。
使用Octa-ExM方案处理表达THY1-YFP的小鼠脑切片，其中进行温和处理然后使用标准免疫组织化学方案进行抗体染色。膨胀样品的荧光成像表明，Octa-ExM方案实现了对难以染色的结构(如突触)的有效的膨胀后免疫组织化学染色，以及遗传编码探针的荧光保留(图9)。还在其他小鼠组织(如乳腺、心脏、肝、肾、胸腺)上测试了使用Octa-ExM方案的膨胀前染色(图10和图13)。对乳腺进行微管蛋白抗体和DAPI染色然后进行Octa-ExM处理保留了足够的荧光强度，实现了在常规的共聚焦显微镜下对目的结构的可视化(图10)。Octa-ExM使用标准递送方法提供了抗体和荧光探针的有效的膨胀后染色。
实施例7：对细胞培养物的快速膨胀显微术(rExM)
7.1具有膨胀后染色的细胞培养rExM方案
在本实施例中，发明人将几个样品处理程序组合成一个步骤，以观察是否可以实现更快的样品处理。该处理被称为快速ExM(rExM)。与Octa-ExM相比，rExM方案有两个变化。在一个变化中，通过将化学固定剂和化学锚定剂的混合物例如PFA和2-甲基丙烯醛应用于样品来同时进行化学固定和蛋白质锚定。在另一个变化中，蛋白质锚定和单体溶液孵育结合为一个步骤。两个变化的一般工作流程见图14。
rExM方案与多种样品染色方法兼容。在一种改良形式中，rExM可以成功应用于免疫染色的样品，例如，使用针对α-微管蛋白、α-肌动蛋白或Nup153的标准抗体进行微管蛋白染色的HeLa细胞(图15)。在rExM的另一个改良形式中，均质化后用抗体和小染料(抗α-微管蛋白抗体和DAPI(0.1μg/ml))对HeLa细胞进行染色。在这种改良形式中，均质化使用抗原保存处理完成(图16)。
rExM方法与夹心免疫测定法兼容，后者能够进行荧光信号放大以提高成像质量(图17)。重要的是，应用于rExM处理样品的夹心免疫测定不会像用于膨胀前染色那样导致细胞结构增大(Cho等人，2020)(图17)。rExM方案的各向同性膨胀得到了验证，这是确认可用于超分辨率成像方法的重要特征，并使用传统衍射限制显微镜对分辨率进行了表征，分辨率达到36nm(图18)。每种改良形式的方案如下所述。
a.细胞培养
在标记细胞样品之前，将细胞在37℃、5％ CO2的潮湿培养箱中培养。使用的细胞是HEK293细胞系和HeLa细胞系。培养基为DMEM，含有10％(v/v)胎牛血清(Thermofisher，GibcoTM)(FBS)。可以在培养基中加入1％青霉素-链霉素以最大限度地减少细菌污染。用于细胞维持的另外试剂包括：胰蛋白酶(0.25％胰蛋白酶-EDTA 1×；Thermofisher，GibcoTM)和磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
细胞在含有DMEM和10％FBS的MatTek培养皿中培养，使用前应达到60％-80％的密度。在适合细胞自然生长的条件下，可以使用其他培养基作为替代品。
b.固定
样品用PBS洗涤一次，然后在固定缓冲液中固定，在此用冰冷的1×PBS中4％多聚甲醛(PFA)在室温下固定10分钟。根据目标蛋白质和结构，在固定之前可以容许对样品的额外操作，以最大化蛋白质保留。例如，为了在HeLa细胞样品中观察微管，可以在固定之前用细胞骨架保存缓冲溶液(0.1M1,4-哌嗪二乙磺酸(PIPES)、1mM乙二醇四乙酸(EGTA)、0.5％v/v Triton X-100和1mM MgCl2)提取细胞骨架结构。此外，可以用猝灭溶液(1×PBS中的100mM甘氨酸)保存微管蛋白结构。
在此我们将固定剂-锚定剂溶液引入样品中，该固定剂-锚定剂溶液是PFA(3.5％w/v)和锚定剂分子(0.5％w/v)的混合物。其他组合可以在调整处理时间的情况下使用。锚定剂分子可以是能够与氨基形成共价键并连接蛋白质的不饱和醛。该组合通过提供暴露于锚定剂分子的过量氨基而提供对细胞蛋白质的更有效的锚定。固定剂-锚定剂溶液的处理时间可以根据样品类型从10分钟至30分钟调整。
尽管使用了固定剂-锚定剂溶液，但固定后仍可使用0.25％(v/v)的Triton X-100进行透化。
c.锚定剂-储液8X凝胶化
将蛋白锚定剂(在一个实施例中为2-甲基丙烯醛)与等分试样的单体溶液(30％w/v DMAA、8.6％w/v SMA、0.03％w/v TPT和0.1％v/v Triton X-100)预混。该溶液可在-80℃至4℃的温度下储存长达6个月。在替代固定方案的情况下，其中固定剂含有化学锚定剂(在一个实例中为2-甲基丙烯醛)，单体溶液则不包括化学锚定剂。在-80℃至+4℃的储存条件下，固定剂与化学锚定剂的混合物在很长一段时间内是稳定的，可储存长达6个月。在将单体溶液加入孔中之前，加入0.1％v/v TEMED和0.1％w/v APS并涡旋10秒。用一块载玻片盖住玻璃底孔，使玻璃底孔和载玻片的边缘之间有一个小间隙。将混合溶液缓慢注入玻璃底孔和载玻片的空隙中，避免产生气泡。
将样品和溶液在20℃至50℃的真空烘箱中的无氧环境中孵育2至10小时，以使单体和锚定分子聚合。
d.均质化
均质化可以用蛋白酶或广泛使用的蛋白质变性洗涤剂例如十二烷基硫酸钠(SDS)进行。如果随后应进行免疫测定，则不建议使用蛋白酶来消化细胞。这里使用蛋白酶K，工作浓度为8u/ml。在加入凝胶之前，将蛋白酶加入消化缓冲液中，消化缓冲液由50mM Tris、25mM乙二胺四乙酸(EDTA)、0.5％v/v Triton X-100和0.8M NaCl组成。可以在均质化之前将凝胶放入6厘米的培养皿中，为凝胶膨胀提供空间。在培养皿中加入含有蛋白酶K的均质化缓冲液，并在25℃至50℃孵育2至24小时。
通过使用SDS，表位被保留用于均质化后的配体结合。在通过均质化膨胀的过程中，蛋白质-蛋白质间隙增大，从而能够更有效地结合靶蛋白。
e.均质化后夹心免疫测定
可以用缀合相同荧光团的两种类型的相反第二抗体进行多轮免疫染色(夹心免疫测定)，以放大荧光信号并提高精细蛋白质结构的分辨率。在每轮染色中结合抗体的放大将提供更好的分辨能力，并为荧光染料如Alexa 488和Alexa 647提供更长的荧光保留时间。
为了进行多轮染色，应将样品封闭在封闭缓冲液(1-5％w/v BSA，在1×PBS中)中，并在4℃至25℃孵育。根据样品和水凝胶的大小和厚度，可以选择振荡，也可以使用替代的封闭缓冲液，例如1×PBS中的脱脂奶粉(1-5％w/v)。靶蛋白被一级抗体溶液特异性识别(针对靶分子的一级抗体，在溶于1×PBS的1-5％w/v BSA中的建议工作浓度)。为了对均质化后的样品进行多轮免疫染色，引入了两种与相同荧光染料缀合的相反二抗。其中一种二级抗体应特异性识别一级抗体，并添加到样品中。每轮染色在4℃至25℃可持续2至12小时。在每轮扩增之间用PBS洗涤三次，每次10分钟。例如，山羊抗兔二抗应与兔抗山羊抗体组合。
f.膨胀
样品膨胀可以通过用生理盐水柠檬酸钠(SSC)溶液或纯水进行梯度洗涤来完成。为了最大限度地减少对样品的破坏，可以使用1×、0.5×、0.25×、0.1×、0.05×SSC溶液的梯度。对于每次梯度膨胀，将样品在室温下储存1小时。在室温下用双蒸馏水浸泡凝胶30分钟，然后在室温下换成新的双蒸馏水过夜，使其充分膨胀。
7.2组织的快速膨胀显微术
rExM方案可应用于组织，包括但不限于活组织、新鲜冷冻组织、化学固定组织。与图14所示的细胞培养物应用类似，用于组织的rExM有几个修改。在一种修改中，固定和蛋白质锚定可以同时进行，在另一种修改中将锚定和单体孵育结合为一个步骤(图19a)。作为rExM的另外修改，我们开发了快速染色ExM，简称rsExM。在rsExM中，不同的样品处理步骤，即蛋白质锚定、染色和单体孵育，合并为一个步骤(图19b)。rsExM方案比以前报道的任何方案都快3倍(图20)。将rsExM方案与包括ExM和MAP在内的其他先前发表的方案进行比较，结果显示Myelin结合染料具有更高的荧光保留率(图20)。我们进一步证明，rsExM方案可与Myelin染料染色结合应用于表达GFP的脑组织(图21)。由于超过4倍的膨胀，可以以纳米级分辨率观察轴突(通过GFP观察)和髓鞘(通过髓磷脂染料观察)(图21)。
用于荧光染料染色的rsExM方案是根据上面公开的原始Octa-ExM方案进行的，另外具有下面描述的几个修改。对快速染色方案进行了优化，并与其他方案进行了比较，显示出其优越的性能。每个使用的方案的一般工作流程如图20a所示。简言之，在一种修改中(上文公开的原始Octa-ExM方案和论文(Ku等人，2016)中描述的MAP方案)，在4℃与锚定剂溶液孵育并用PBS洗涤后，组织切片随后在4℃与含有工作浓度髓磷脂特异性染料的活化单体溶液孵育。去除染料后，将切片与新制备的活化单体溶液在4℃短暂孵育，然后转移到加湿培养箱中进行凝胶化。均质化和膨胀程序按照原始方案进行。在rsExM方案的情况下，锚定、染色和单体孵育同时进行，时间更短。有关所用化学品的详细说明，请参阅下面的表4(由于上一部分已涵盖Octa ExM成分，因此不包括在内)。总之，这些变化可以减少样品制备的时间和劳力。
7.3使用2-甲基丙烯醛作为锚定剂对培养细胞的rExM
这里测试了用不同的双功能锚定剂2-甲基丙烯醛进行锚定的效果。本发明人还测试了锚定和凝胶化是否可以在一个步骤中进行。
固定
将Hela细胞或HEK 293细胞用PBS洗涤一次并放入平板中。在1xPBS(4％PFA)中制备PFA固定剂，冷却至4℃并添加到平板中。将板孵育10分钟，然后用PBS洗涤。
锚定和凝胶化
将TEMED(0.1％w/v)、2-甲基丙烯醛(0.1％v/v)和APS(0.1％w/v)加入等分试样的8X储备溶液中，并将混合物加入MatTek培养皿的孔中(各约200μl)。然后用一块较厚的载玻片覆盖孔，并在4℃下培养2小时。之后，将培养皿转移到真空烘箱中，其中包含另一个装有水的小盘以保持湿度。使用真空泵将空气泵出真空烘箱以获得半真空，从而进一步减少气泡。随后，将氮气注入真空烘箱中以达到大气压。然后将板在37℃放置3h以使水凝胶完全聚合。
凝胶化后的均质化(SDS)
将样品-水凝胶复合体与4mL蛋白质变性缓冲液在95℃的真空烘箱中和大气压下孵育3h。然后，将样品-水凝胶复合体取出并储存在1×PBS中。
夹心免疫染色
将样品-水凝胶复合体与封闭溶液(在1×PBS中的3％BSA)在室温下孵育2h。加入一级抗体溶液(在3％BSA/1×PBS中的1:500A单克隆一级抗体)并在室温下孵育2h。然后，在室温下在黑暗中加入二抗溶液(在3％BSA/1×PBS中的1:1000B-抗-A单克隆抗体)2h。将混合物用1×PBS洗涤3次，每次10分钟。随后在黑暗中加入相反二抗溶液(在3％BSA/1×PBS中的1:1000A-抗-B单克隆抗体)，然后用1×PBS洗涤三次，每次10分钟。将先前步骤重复1-2次。
DAPI染色(可选，用于细胞核观察)
将DAPI染色溶液(在1×PBS中的10μg/ml DAPI)添加到样品-水凝胶复合体中，然后用3mL的1×PBSs洗涤三次，每次在室温15分钟。
膨胀和成像
在室温下用降低浓度的柠檬酸钠盐水缓冲液洗涤凝胶：1×SSC 1小时，0.5×SSC1h，0.25×SSC 1H，0.1×SSC 1 1h，然后0.05×SSC 1h，然后在双蒸馏水中膨胀凝胶3次，每次在室温1小时，之后成像。
结果
如图16、17和18所示的结果表明，在一个步骤中进行锚定和凝胶化可以成功地获得培养细胞的膨胀和清晰的成像。因此，可以进一步简化和加速膨胀方案的处理。
7.4锚定和凝胶化前免疫染色的rExM
在此，发明人进一步测试了在锚定和凝胶化之前进行免疫染色的效果。
固定
以与实施例7中所述相同的方式进行样品固定。
免疫染色
将样品与封闭溶液(在1×PBS中的3％BSA)在室温下孵育2h。加入一级抗体溶液(在3％BSA/1×PBS中的1:500A单克隆一级抗体)并在室温下孵育2h。然后，在室温下在黑暗中加入二抗溶液(在3％ BSA/1×PBS中的1:1000B-抗-A单克隆抗体)2h。将混合物用1×PBS洗涤3次，每次10分钟。
锚定和凝胶化
将TEMED(0.1％w/v)、2-甲基丙烯醛(0.1％v/v)和APS(0.1％w/v)加入等分试样的8X储备溶液中，并将混合物加入MatTek培养皿的孔中(各约200μl)。然后用一块较厚的载玻片覆盖孔，并在4℃培养2小时。之后，将培养皿转移到真空烘箱中，其中包含另一个装有水的小板以保持湿度；使用真空泵将空气泵出真空烘箱以获得半真空，从而进一步减少溶液中的气泡。随后，将氮气注入真空烘箱中以达到大气压。然后将板在37℃放置3h以使水凝胶完全聚合。
蛋白酶K均质化
将ProK(8μ/ml)加入蛋白酶K消化缓冲液中。将样品-水凝胶复合体在4℃孵育过夜或在室温在黑暗中孵育3小时。
DAPI染色(可选，用于DNA读测)
将样品-水凝胶复合体在5xSSC中平衡，然后与含5mg/mL DAPI的3mL5x SSCT在RT下孵育30分钟。之后，将样品-水凝胶复合体用3mL 5x SSCT洗涤三次，每次在RT15分钟。
膨胀和成像
凝胶在室温下用浓度降低的生理盐水柠檬酸钠(SSC)缓冲液洗涤：2.5xSSC 1小时，0.5×SSC 1小时、0.25×SSC 1小时，然后0.05×SSC 1小时。随后，将凝胶转移到5.5厘米的培养皿中，并用15ml ddH2O洗涤超过5次，每次在室温下2小时。之后，在成像前，将凝胶在双蒸馏水中膨胀3次，每次在常温下1小时。
结果
图15a、b、c中的结果显示，在锚定和凝胶化之前的免疫染色可以成功地获得培养细胞的膨胀和清晰的成像。
7.5在一个步骤中完成固定和锚定的rExM
在此测试了在一个步骤中进行固定和锚定的效果。
固定和锚定
将Hela细胞或HEK 293细胞用PBS洗涤一次并置于平板中。制备PFA固定剂和2-甲基丙烯醛的混合物(在1×PBS中的3.5％PFA和0.5％2-甲基丙烯醛)，冷却至4℃，并加入板中。将板在冰上孵育15分钟，然后用PBS洗涤。
凝胶化
将TEMED(0.1％w/v)和APS(0.1％w/v)加入等分试样的8X储备溶液中，并将单体溶液加入MatTek培养皿的孔中(各约200μl)。然后用一块较厚的载玻片覆盖孔，并在4℃下培养30分钟。之后，将培养皿转移到真空烘箱中，该烘箱包含另一个装有水的小板以保持湿度。使用真空泵将空气泵出真空烘箱以获得半真空，从而进一步减少溶液中的气泡。随后，将氮气注入真空烘箱中以达到大气压。重复真空泵送和氮气注入步骤4次。然后将板在37℃下放置3h以使水凝胶完全聚合。
凝胶化后的均质化(SDS)
将样品-水凝胶复合体与4mL蛋白质变性缓冲液在95℃的真空烘箱中和大气压下孵育3h。然后，将样品-水凝胶复合体取出并储存在1×PBS中。
蛋白酶K均质化
将ProK(8u/ml)加入蛋白酶K消化缓冲液(0.5％w/v Triton X-100，1mM EDTA，50mM Tris，1M NaCl)中。将样品-水凝胶复合体在室温下在4℃孵育3小时。
DAPI染色(可选，用于细胞核观察)
将DAPI染色溶液(在1×PBS中的10μg/ml DAPI)添加到样品-水凝胶复合体中，然后用3mL的1×PBS洗涤三次，每次在室温15分钟。
膨胀和成像
在室温下用降低浓度的柠檬酸钠盐水缓冲液洗涤凝胶：1×SSC 1h，0.5×SSC 1h，0.25×SSC 1H，0.1×SSC 1 1h，然后0.05×SSC 1h，然后在双蒸馏水中膨胀凝胶3次，每次在室温1小时，之后成像。为了储存样品，成像后在4℃将样品重新水合在4mL 5x SSCT中。
结果
图15d中的结果显示，在一个步骤中固定和锚定可以成功地获得培养细胞的膨胀和清晰的成像。因此，可以进一步简化和加速膨胀方案的处理过程。
实施例8：快速染色ExM方案
在本实施例中，发明人测试了将蛋白质锚定、染色和单体孵育结合到一个步骤中用于样品制备的效果。
8.1使用与Octa ExM相同的水凝胶前体进行快速染色ExM
用rsExM对组织样品进行水凝胶的原位聚合物合成
制备由30％(v/v)DMAA、8.6％(w/v)SMA、0.032％(w/v)TPT、0.1％ Triton X-100、1×PBS组成的单体溶液1，或Octa-ExM方案中描述的其他水凝胶组合物，如需要用HCl或NaOH调整pH＝6.5-8.5，并在室温储存以施用(储存条件可从-20℃至室温变化)。紧接在凝胶化之前，添加化学品APS、TEMED和2-甲基丙烯醛，最终浓度为0.2–0.3％(w/v)APS、0.1–0.25％(v/v)TEMED和0.1–0.25％(v/v)2-甲基丙烯醛。
或者，单体溶液可以与2-甲基丙烯醛混合，并在应用前储存较长时间而不影响其性能(这是向最终用户提供即用试剂的主要方式之一)。
为了染色，将染料加入到具有最终工作浓度的孵育溶液中(与染料方案中所述的组织染色相同)。将组织切片与活化的且添加染料的单体溶液在4℃下孵育1小时。在与单体溶液孵育并任选地用PBS洗涤和使用新鲜的单体溶液凝胶化后，使用载玻片覆盖组织切片并转移到凝胶化室中。将组织载玻片与新制备的活化单体溶液在4℃下孵育30分钟，以使单体溶液扩散到组织中，同时防止过早凝胶化，然后将其转移到37℃下含氮气的湿润容器中2-3小时，以完成凝胶化。
用rsExM进行样品消化和膨胀
凝胶化后，将凝胶化的组织切片小心地从覆盖的载玻片上分离。然后将样品在室温下浸泡在均质化缓冲液(50mM Tris(pH 8)、1mM EDTA、0.5％Triton X-100、1M NaCl，室温下pH＝8)中2-4小时(从4℃到50℃达30分钟到8小时筛选宽范围的条件，产生类似的结果，具有以下相关性即温度越高孵育时间越短)，其补充有终浓度为4单位/mL的蛋白酶K。均质化的样品在RT下用1xPBS洗涤三次，然后用双去离子水浸泡0.5-1小时以膨胀。在新鲜的ddH2O中重复该步骤3-5次，直到膨胀因子达到最大值。最后将样品储存在4℃用于成像。
在膨胀之前和之后测量相同的感兴趣区域(ROI)的直径，以确定膨胀因子。计算出的膨胀与原始直径的比值就是膨胀因子。
8.2快速染色ExM方案与其他单体溶液结合使用
在PBS中漂洗后，将组织切片在锚定剂溶液1(在1×PBS缓冲液中的4％PFA和30％AA)中于4℃孵育过夜，然后用PBS洗涤用于以下步骤。将组织切片与单体溶液1(30％ AA(w/v)、10％ SA (w/v)、0.1％双丙烯酰胺(w/v)和1×PBS)在4℃孵育8h。这些单体溶液也用APS/TEMED(0.2％/0.2％)或VA-044(0.1％)活化。同时，将荧光染料(如在染料方案中所述)添加到最终工作浓度的活化的单体溶液中。
然后，将样品转移到具有氮气的加湿容器中，在42℃下保持3小时(0.1％(w/v)VA-044活化)或在37℃保持2小时(0.2％(w/v)/0.2％(v/v)APS/TEMED活化)，以完全凝胶化。然后将凝胶化的组织切片小心地从覆盖的载玻片上分离。接下来将样品在室温下浸入均质化缓冲液(50mM Tris(pH8)，1mM EDTA，0.5％Triton X-100，1M NaCl，室温pH＝8)中2-6小时，其中加入最终浓度为8单位/mL的蛋白酶K。均质化的样品在RT下用1xPBS洗涤三次，然后用双去离子水浸泡0.5-1小时以膨胀。在新鲜的ddH2O中重复该步骤3-5次，直到膨胀因子达到最大值。样品最终储存在4℃。
使用与快速染色ExM方案相同的实验程序来比较单体溶液1，不同之处是用于完全凝胶化的APS/TEMED的最终浓度有微小变化。详见表4。
ExM期间荧光染料保留的量化
通过对ExM之前和之后的整个组织切片进行成像来量化荧光染料的保留值(图20)。单体孵育后，用10x 0.45NA物镜拍摄组织切片的宽视野荧光图像。在凝胶化和充分均质化并用1x PBS洗涤后，在相同的成像条件下拍摄组织切片的图像(膨胀因子大致达到2)。在成像过程中，不同光学配置面板的实际激发功率和曝光时间是相同的。利用纤维束、胼胝体和前连合的ROI分析组织过程中的荧光损失。通过背景校正膨胀前后图像的ROI的荧光强度，并通过分割区域标准化来计算荧光保留。
表4.膨胀条件的说明。
注：表中所示的荧光保留值是针对用Myelin染料1染色的脑组织切片计算的。
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(8)Chang,J.-B.；Chen,F.；Yoon,Y.-G.；Jung,E.E.；Babcock,H.；Kang,J.S.；Asano,S.；Suk,H.-J.；Pak,N.；Tillberg,P.W.；Wassie,A.T.；Cai,D.；Boyden,E.S.Iterative Expansion Microscopy.Nat.Methods 2017.https://doi.org/10.1038/nmeth.4261.
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(14)Yehlin Cho等人FRACTAL:Signal amplification of immunofluorescencevia cyclic staining of target molecules,Nanoscale,Issue 46,2020
Claims (54)
1.一种用于样品的物理膨胀同时保存膨胀状态下的样品内的生物分子的方法，其包括：
(a)使所述样品与一种或多种双功能锚定剂接触，其中所述双功能锚定剂包含生物分子反应性化学基团和水凝胶反应性化学基团；
(b)用水凝胶前体溶液灌注所述样品或将所述样品埋放到水凝胶前体溶液中，并发生聚合以形成样品-水凝胶复合体；和
(c)将所述样品-水凝胶复合体与溶剂或水性溶液孵育以物理膨胀所述样品。
2.根据权利要求1的方法，其中所述方法还包括在步骤(b)和步骤(c)之间对所述样品-水凝胶复合体进行均质化。
3.根据权利要求1或2的方法，其中所述方法还包括在步骤(a)之前、期间或之后用固定剂(如PFA)固定所述样品。
4.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述样品选自细胞(例如培养的细胞)、生物组织(例如组织切片)、标本、活组织检查样品、完整器官或其部分以及整个生物体(例如细菌、真菌或病毒)。
5.根据权利要求4的方法，其中所述样品是厚度为50μm或更小的组织切片，或厚度范围为30μm-400μm的组织样品。
6.根据前述权利要求中任一项的方法，其中通过用双功能锚定剂和水凝胶前体溶液的混合物灌注所述样品来同时进行步骤(a)和(b)。
7.根据权利要求3-6中任一项的方法，其中通过将所述样品与双功能锚定剂和固定剂的混合物一起孵育来同时进行步骤(a)和固定，任选地，通过将所述样品用双功能锚定剂、固定剂和水凝胶前体溶液的混合物灌注来同时进行步骤(a)、步骤(b)和固定。
8.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述双功能锚定剂选自2-甲基丙烯醛，N-琥珀酰亚胺基丙烯酸酯(NSA)，N-(烯丙氧基羰氧基)-琥珀酰亚胺(NAS)，烯丙基缩水甘油醚(AGE)，丙烯酸缩水甘油酯(GAL)和甲基丙烯酸缩水甘油酯(GME)及其任何组合/混合物。
9.根据权利要求8的方法，其中所述双功能锚定剂是2-甲基丙烯醛。
10.根据权利要求8的方法，其中所述双功能锚定剂选自AGE、GAL和GME中的一种或多种，并任选地补充有单功能锚定剂例如1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDE)和甘油二缩水甘油醚(GDE)。
11.根据权利要求10的方法，其中所述双功能锚定剂选自AGE和GME，并任选地补充有BDE。
12.根据权利要求11的方法，其中在使用GME+BDE或AGE+BDE作为锚定剂的情况下，GME与BDE的摩尔比或AGE与BDE的摩尔比范围为约10:1至约1:10，例如约1:1。
13.根据权利要求2-12中任一项的方法，其中所述均质化通过对样品-水凝胶复合体的物理、化学、物理化学、和/或酶处理来进行。
14.根据权利要求13的方法，其中所述所述样品-水凝胶复合体的均质化通过用蛋白酶、碱性缓冲剂(例如含洗涤剂的碱性缓冲剂)或在缓冲液中加热处理来进行。
15.根据权利要求13或14所述的方法，其中所述均质化通过用非特异性蛋白酶例如蛋白酶K酶促消化来进行。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述水凝胶前体溶液包含水凝胶聚合物的单体或前体，并且任选地包含化学固定剂。
17.根据权利要求16的方法，其中所述单体或前体选自丙烯酸钠(SA)，甲基丙烯酸钠(SMA)，衣康酸(IA)，反式乌头酸(TAA)，乙基-2-(羟甲基)-丙烯酸酯(EHA)，N,N-亚甲基双丙烯酰胺(MBAA)，N,N-二甲基丙烯酰胺(DMAA)，季戊四醇四丙烯酸酯(PT)，丙氧基化三羟甲基丙烷三丙烯酸酯(TPT)，季戊四醇三丙烯酸酯(PA)，二季戊四醇五丙烯酸酯或二季戊四醇六丙烯酸酯(DPHA)，三羟甲基丙烷三丙烯酸酯(TTA)，二(三羟甲基丙烷)-四丙烯酸酯(DiTA)，三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(TTMA)，甘油丙氧基化(1PO/OH)三丙烯酸酯(GPT)，乙氧基化三羟甲基丙烷三丙烯酸酯(TET)，季戊四醇烯丙基醚(PAE)，4-羟基-2-亚甲基丁酸钠(SHMB)，N,N-二甲基氨基丙基丙烯酰胺(DMPAA)和丙烯酰胺(AA)的一种或多种。
18.根据权利要求16或17的方法，其中所述前体包含SMA、DMAA和TPT。
19.根据权利要求18的方法，其中DMAA与SMA的摩尔比在30:1至3:1的范围内，SMA与TPT的摩尔比在1:0.0002至1:0.4的范围内。
20.根据权利要求18或19的方法，其中DMAA与SMA的摩尔比在2:1至6:1的范围内，SMA与TPT的摩尔比在1:0.0002至1:0.2的范围内。
21.根据前述权利要求中任一项的方法，其中在聚合前向所述水凝胶前体溶液添加聚合活化剂或促进剂，例如VA-044、V50、APS、过硫酸钾或TEMED。
22.根据前述权利要求中任一项的方法，其还包括在步骤(a)、(b)、(c)、均质化或固定之前、期间或之后用标记物或标签对样品染色，任选地染色在均质化之后进行。
23.根据权利要求22的方法，其中使用标准免疫染色方法如夹心抗体染色对样品进行免疫染色。
24.根据权利要求22或23的方法，其中在步骤(a)之前或均质化之后用一种或多种抗体和/或荧光染料对样品染色。
25.根据权利要求22或23的方法，其中在步骤(a)的同时将样品-水凝胶复合体用一种或多种抗体和/或荧光染料染色，任选地在一个步骤中进行步骤(a)、步骤(b)和染色。
26.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述样品表达一种或多种荧光蛋白，任选地，所述一种或多种荧光蛋白在步骤(b)期间被锚定到样品-水凝胶复合体的聚合物链上。
27.根据前述权利要求中任一项的方法，其中在步骤(c)期间，将样品-水凝胶复合体与纯水或水性缓冲液孵育足够长的时间。
28.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述样品-水凝胶复合体具有2至8的可调节线性膨胀因子。
29.根据前述权利要求中任一项的方法，还包括通过显微术对膨胀的样品成像。
30.根据前述权利要求中任一项的方法，还包括通过在高盐缓冲液中浸泡使样品-水凝胶复合体返回到其原始大小。
31.通过根据前述权利要求中任一项的方法产生的样品-水凝胶复合体。
32.一种样品-水凝胶复合体，其中样品与水凝胶互连以形成聚合物链网络，所述样品在3个维度中各向同性地以2至8的可调节膨胀因子进行膨胀，并且其中水凝胶由SMA、DMAA和TPT制备产生。
33.一种用于膨胀生物样品的方法，其包括：
使样品与一种或多种双功能锚定剂接触，其中所述双功能锚定剂包含生物分子反应性化学基团和水凝胶反应性化学基团；
用水凝胶前体溶液灌注样品或将样品埋放到水凝胶前体溶液中，并发生聚合以形成样品-水凝胶复合体；
通过用蛋白酶、碱性缓冲剂(例如含洗涤剂的碱性缓冲液)或在缓冲液中加热处理样品-水凝胶复合体来进行均质化；和
将样品-水凝胶复合体与溶剂或水性溶液孵育以物理膨胀样品。
34.一种用于产生可膨胀的样品-水凝胶复合体的方法，其包括：
使样品与一种或多种双功能锚定剂接触，其中所述双功能锚定剂包含生物分子反应性化学基团和水凝胶反应性化学基团；和
用水凝胶前体溶液灌注样品或将样品埋放到水凝胶前体溶液中，并发生聚合以形成样品-水凝胶复合体。
35.一种水凝胶制剂，其包含DMAA、SMA和TPT，任选地DMAA与SMA的摩尔比在30:1至3:1的范围内，SMA与TPT的摩尔比在1:0.0002至1:0.4的范围内。
36.根据权利要求35的水凝胶制剂，其中DMAA与SMA的摩尔比在6:1至2:1的范围内，SMA与TPT的摩尔比在1:0.0002至1:0.2的范围内。
37.根据权利要求35-36中任一项的水凝胶制剂，其中所述水凝胶制剂制备为包含DMAA、SMA和TPT的稀释于水或缓冲液的储备溶液。
38.根据权利要求35-37中任一项的水凝胶制剂，其中所述水凝胶制剂制备为DMAA、SMA和TPT的未稀释的混合物。
39.水凝胶制剂在生物样品的物理膨胀中的用途，其中所述水凝胶制剂包含水凝胶前体，所述水凝胶前体包含甲基丙烯酸钠(SMA)、N,N-二甲基丙烯酰胺(DMAA)和丙氧基化三羟甲基丙烷三丙烯酸酯(TPT)。
40.一种试剂盒，其中所述试剂盒包含一个或多个容器，所述容器包含甲基丙烯酸钠(SMA)、N,N-二甲基丙烯酰胺(DMAA)和丙氧基化三羟甲基丙烷三丙烯酸酯(TPT)的一种或多种。
41.权利要求40的试剂盒，其中DMAA、SMA和TPT在分开的容器中，任选地，DMAA、SMA和TPT在每个容器中的量的摩尔比如下：DMAA与SMA的摩尔比在30:1至3:1的范围内，SMA与TPT的摩尔比在1:0.0002至1:0.4的范围内。
42.权利要求40或41的试剂盒，其中DMAA、SMA和TPT的至少两种混合在容器中。
43.权利要求42的试剂盒，其中DMAA、SMA和TPT混合在一起，并且DMAA与SMA的摩尔比在6:1至2:1的范围内，SMA与TPT的摩尔比在1:0.0002至1:0.2的范围内，任选地，DMAA、SMA和TPT溶解在溶剂例如水中。
44.权利要求40-43中任一项的试剂盒，其中所述试剂盒还包含一个或多个容器，所述容器包含选自2-甲基丙烯醛、AGE、GME、GAL、BDE和GDE的一种或多种锚定剂，例如包含2-甲基丙烯醛、AGE、GME、AGE+BDE或GME+BDE。
45.权利要求44的试剂盒，其中所述试剂盒包含含有DMAA、SMA、TPT以及一种或多种锚定剂的混合物的容器，任选地，所述锚定剂是2-甲基丙烯醛。
46.权利要求40-45中任一项的试剂盒，其中所述试剂盒还包含含有染色剂或标记剂(例如用于免疫染色的抗体)的一个或多个容器。
47.权利要求46的试剂盒，其中所述试剂盒包含含有DMAA、SMA、TPT、一种或多种锚定剂以及染色剂的混合物的容器。
48.权利要求40-47中任一项的试剂盒，其中所述试剂盒还包含含有固定剂如PFA的一个或多个容器。
49.权利要求48的试剂盒，其中所述试剂盒包含含有固定剂和一种或多种锚定剂的混合物的容器。
50.权利要求40-49中任一项的试剂盒，其中所述试剂盒还包含一种或多种以下组分：
包含选自VA-044、TEMED、APS和过硫酸钾的凝胶活化剂或促进剂的容器；
包含均质化缓冲液，例如基于变性的均质化缓冲液或基于蛋白酶K的均质化缓冲液的容器；
包含常规缓冲液如PBS或MES缓冲液的容器；
凝胶室，其被配置为在凝胶化之前容纳样品，以及任选地包含盖以封闭该凝胶室；
成像室，其配置为在凝胶化之后容纳样品；
凝胶处理装置；和
冷却装置，例如冰袋。
51.权利要求40-50中任一项的试剂盒，其中所述试剂盒适合于存储在室温、-20℃或0℃-4℃的温度。
52.权利要求40-51中任一项的试剂盒，其用于生物样品的物理膨胀或样品-水凝胶复合体的制备。
53.用于将样品锚定到水凝胶聚合物链的试剂盒，其包含一个或多个容器，所述容器包含选自2-甲基丙烯醛、AGE、GME、GAL、BDE和GDE的锚定剂，例如所述锚定剂为2-甲基丙烯醛、AGE、GME、AGE+BDE或GME+BDE。
54.权利要求53的试剂盒，其还包含一种或多种水凝胶单体，所述单体选自丙烯酸钠(SA)，甲基丙烯酸钠(SMA)，衣康酸(IA)，反式乌头酸(TAA)，乙基-2-(羟甲基)-丙烯酸酯(EHA)，N,N-亚甲基双丙烯酰胺(MBAA)，N,N-二甲基丙烯酰胺(DMAA)，季戊四醇四丙烯酸酯(PT)，丙氧基化三羟甲基丙烷三丙烯酸酯(TPT)，季戊四醇三丙烯酸酯(PA)，二季戊四醇五丙烯酸酯或二季戊四醇六丙烯酸酯(DPHA)，三羟甲基丙烷三丙烯酸酯(TTA)，二(三羟甲基丙烷)-四丙烯酸酯(DiTA)，三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(TTMA)，甘油丙氧基化(1PO/OH)三丙烯酸酯(GPT)，乙氧基化三羟甲基丙烷三丙烯酸酯(TET)，季戊四醇烯丙基醚(PAE)，4-羟基-2-亚甲基丁酸钠(SHMB)，N,N-二甲基氨基丙基丙烯酰胺(DMPAA)，丙烯酰胺(AA)及其组合，任选地所述水凝胶单体为DMAA、SMA和TPT。
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