CN117916266A - 用于治疗aml的抗体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于治疗急性骨髓性白血病(AML)及弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)的抗CD25抗体。
Description
技术领域
本发明涉及用于治疗急性骨髓性白血病(AML)及弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)的抗CD25抗体。
背景技术
CD25，也称为白介素-2受体的α亚单位(IL2RA)，是实现IL-2的高亲和力结合及后续信号传导级联的表面抗原。CD25在依赖于IL-2消耗而生长的调节性T细胞(Treg)上组成性表达，且在新近活化的T细胞上暂时上调。IL-2为在抗原特异性T细胞的无性扩增及其效应功能的获取中发挥重要作用的关键细胞因子。已证实瘤内Treg的丰度且尤其Treg与效应T细胞(Teff)的比率可预测人类中的许多实体肿瘤的临床结果(Nishikawa及Sakaguchi,2014,Curr Opin Immunol 27,1-7；Wing等人,2019,Immunity 50,302-316)。实际上，Treg有助于免疫抑制性肿瘤微环境且已评估如果干种消耗其的策略。
CD25 Mab(RG6292)为非IL-2阻断型去岩藻糖基化IgG1抗体，已证实其在人类肿瘤外植体及癌症的临床前小鼠模型中有效地消耗Treg，同时允许IL-2至Teff的再分布及抗肿瘤适应性免疫反应的形成(Solomon等人,2020,Nature Cancer,1(12):1153-1166)。CD25Mab结合于CD25+靶细胞且其可结晶片段(Fc)结合于表达于效应细胞(如自然杀伤(NK)细胞、单核球及巨噬细胞)的表面上的Fc受体。CD25Mab通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)及抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)介导对靶细胞的杀伤。当前正在I期单一疗法研究中以及以与阿特珠单抗(Atezolizumab)(抗PD-L1抗体)的组合形式在Ib期临床试验中研究CD25Mab。
除在健康T细胞中的作用外，也已在多种血液恶性肿瘤中描述CD25表达(Flynn及Hartley,2017,Br J Haematol 179,20-35)，如T细胞淋巴瘤及B细胞淋巴瘤以及急性骨髓性白血病(AML)。具体而言，CD25似乎在AML及弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)中的肿瘤细胞亚群上表达，且其表达与较低存活率相关(Fujiwara等人,2013,Hematology 18,14-19；Gonen等人,2012,Blood 120,2297-2306)。
此外，一些证据表明CD25可能受限于白血病干细胞或具有AML中的祖细胞表达型的细胞(Aref等人,2020,Leuk Res Rep 13,100203；Kageyama Y等人,2018,PLOS One 13(12)e.0209295)。尽管近来在AML的治疗中取得进展，但认为这些细胞在疾病的传播及高复发率中起作用(Kantarjian等人,2021,Blood Cancer J 11,41)。相较于健康志愿者，在AML患者的骨髓中观测到更高的Treg频率，且Treg的丰度与AML患者中的较差结局相关(Dong等人,2020,Front Immunol 11,1710)。因此，需要用于AML及DLBCL的其他治疗选项。
用于AML的当前治疗选项包括蒽环霉素-阿糖胞苷(anthracyclines-cytarabine)疗法(诸如道诺霉素(daunorubicin)及阿糖胞苷疗法)、FLT3抑制剂(例如吉瑞替尼(gilteritinib)、米哚妥林(midostaurin)、索拉非尼(Sorafenib))、BCL-2抑制剂(例如维奈托克(venetoclax))、IDH抑制剂(例如恩西地平(enasidenib)、艾伏尼布(ivosidenib))、低甲基化剂(例如阿扎胞苷(azacitidine)、地西他滨(decitabine))及抗体疗法(例如CD33抗体奥佐米星吉妥单抗(gemtuzumab ozogamicin))及其组合疗法。
本发明人现已发现，抗CD25抗体(诸如CD25 Mab(RG6292))可能具有双重作用模式，其消耗抑制性Treg且对CD25+恶性细胞具有直接细胞毒性作用，从而提供可有效治疗AML及DLBLC的抗体。
发明内容
本发明提供用于治疗急性骨髓性白血病(AML)及弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)的抗CD25抗体。
在本发明的第一方面中，提供用于治疗急性骨髓性白血病或弥漫性大B细胞淋巴瘤的抗CD25抗体。
本发明的第二方面提供用于治疗急性骨髓性白血病或弥漫性大B细胞淋巴瘤的抗CD25抗体，其中该抗CD25抗体单独或与一种或多种其他治疗剂组合施用。抗CD25抗体及其他治疗剂用于独立、同时或依序施用。
本发明的第三方面提供抗CD25抗体与其他治疗剂的组合，该组合用于治疗急性骨髓性白血病或弥漫性大B细胞淋巴瘤，其中抗CD25抗体及该其他治疗剂用于独立、同时或依序施用。
本发明的第四方面提供用于治疗对象中的急性骨髓性白血病或弥漫性大B细胞淋巴瘤的方法，其包括向对象施用有效量的抗CD25抗体。
本发明的第五方面提供抗CD25抗体用于制造用以治疗急性骨髓性白血病或弥漫性大B细胞淋巴瘤的药剂的用途。
本发明的第六方面提供抗CD25抗体及另一治疗剂用于制造用以治疗急性骨髓性白血病或弥漫性大B细胞淋巴瘤的药剂的用途。
本发明的第七方面提供一种选择用抗CD25抗体治疗的患有急性骨髓性白血病的患者的方法，该方法包含：测定来自患者的样品中的靶细胞上的CD25的表达水平，其中如果细胞具有大于每细胞约900个CD25分子的表达水平，则患者适合于用抗体治疗。
本发明的第八方面提供一种选择用抗CD25抗体治疗的患有AML的患者的方法，该方法包含确定来自患者的样品中存在或不存在FLT3-ITD突变，其中如果样品中存在突变，则患者适合于用抗体治疗。
本发明的第九方面提供一种预测AML患者对用抗CD25抗体治疗的反应的方法，该方法包含确定来自患者的样品中存在或不存在FLT3-ITD突变，其中样品中存在突变则指示患者将对用抗CD25抗体治疗起反应。
本发明的第十方面提供一种治疗对象中的AML的方法，其包括向对象施用有效量的抗CD25抗体，其中该对象包含存在FLT3-ITD突变。
本发明的第十一方面提供一种预防AML患者中的复发或降低其风险的方法，该方法包含向患者施用抗CD25抗体。
本发明的第十二方面提供一种治疗已经历BCL-2抑制剂-低甲基化剂组合治疗的患者中的AML的方法，该方法包含向患者施用抗CD25抗体。
附图说明
图1-显示靶细胞上的CD25表达。在ADCC测定培养基中孵育17小时之后，使用BDquantibriteTM Beads测定四种靶细胞(iTreg、Pfeiffer、EOL-1及AML-22)表面上的CD25分子的密度。iTreg及Pfeiffer细胞的CD25密度显示于左侧Y轴上且EOL-1及AML-22的CD25密度显示于右侧Y轴上。检测限(L.O.D)表示在BD quantibriteTM Beads上存在的PE分子的最低数目且因此在低于此值时，无法保证以每个细胞计的PE分子的数目与中值荧光强度(MFI)之间的线性关系。
图2-显示通过CD25 Mab处理诱导的靶细胞上的ADCC电位及CD25密度。(A)以杀伤频率形式显示所测试的化合物(CD25 Mab或同型对照抗体)的ADCC活性。计算基于在不存在效应NK细胞及化合物的情况下，针对靶细胞数目标准化的靶细胞事件计数。在ADCC测定开始之后17小时进行流式细胞术分析。(B)显示在ADCC测定孵育之后17小时，使用BDquantibriteTM Beads测定的剩余存活靶细胞(EOL-1及AML-22)的表面上的CD25分子的密度。检测限(L.O.D)表示在BD quantibriteTM Beads上存在的PE分子的最低数目且因此在低于此值时，无法保证以每个细胞计的PE分子的数目与中值荧光强度(MFI)之间的线性关系。
图3-显示NK细胞上的CD16表达。(A)显示在与EOL-1或AML-22细胞及CD25 Mab或同型对照抗体共同孵育17小时之后，表达CD16的NK细胞的比例。(B)显示在与Pfeiffer细胞或iTreg及CD25Mab或同型对照抗体共同孵育17小时之后，表达CD16的NK细胞的比例。
图4-显示NK细胞上的CD69表达。(A)显示在与EOL-1或AML-22细胞及CD25 Mab或同型对照抗体共同孵育17小时之后，表达CD69的NK细胞的比例。(B)显示在与Pfeiffer细胞或iTreg及CD25Mab或同型对照抗体共同孵育17小时之后，表达CD69的NK细胞的比例。
图5-显示NK细胞上的CD25表达。(A)显示在与EOL-1或AML-22细胞及CD25 Mab或同型对照抗体共同孵育17小时之后，表达CD25的NK细胞的比例。(B)显示在与Pfeiffer细胞或iTreg及CD25Mab或同型对照抗体共同孵育17小时之后，表达CD25的NK细胞的比例。
图6-显示ADCC活性与CD25密度的相关性。(A)以针对各细胞株及NK细胞供体的所获得的最大信号而标准化的相对发光单位的频率形式显示所测试的化合物(CD25 Mab或同型对照抗体)的ADCC活性。结果由两个独立实验获得，其中从总共四个血液供体分离NK细胞。在ADCC测定开始之后16至20小时经由CytoTox-GloTM发光读数进行细胞毒性评估。(B)显示衍生自ADCC测定的EC50值，其中使用CytoTox-GloTM或流式细胞术的CD25 Mab的滴定作为读数(三个独立实验，各自使用两个NK细胞供体)。使用Prism 8(GraphPad software)及其内置非线性回归曲线拟合(log(激动剂)相对于反应、可变斜率、4个参数))来计算EC50值。(C)显示在ADCC测定开始之后16至20小时，使用BD quantibriteTM Beads测定的存活靶细胞(Pfeiffer、EOL-1及AML-22)表面上的CD25分子的密度。检测限(L.O.D)表示在BDquantibriteTM Bead上存在的PE分子的最低数目且因此在低于此值时，无法保证以每个细胞计的PE分子的数目与中值荧光强度(MFI)之间的线性关系。结果从三个独立实验获得。
图7-显示CD25+AML细胞及Treg的杀伤活性。(A)呈CD25+AML细胞杀伤的频率形式的10μg/ml的所测试的化合物(CD25 Mab或同型对照抗体)的杀伤活性。阳性对照EOL-1细胞株及四个AML患者样品用作靶细胞。在ADCC测定开始之后20小时进行流式细胞术分析。平均值+/-SEM表示由两个NK细胞供体及技术复制品获得的结果。使用多重t检验、霍姆-斯达克校正(Holm-Sidak correction)进行多重比较。(B)：如上文关于(A)所描述的Treg杀伤活性。平均值+/-SEM表示由AML Treg(n＝2)或健康BM Treg(n＝2)获得的结果。使用多重t检验、霍姆-斯达克校正进行多重比较。显著性水平如下所示：ns，不显著＝P>0.05；*，P≤0.05；**，P≤0.01；***，P≤0.001；****，P≤0.0001。
具体实施方式
本发明提供用于治疗对象中的急性骨髓性白血病(AML)或弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)的抗CD25抗体，及使用抗CD25抗体治疗对象中的急性骨髓性白血病或弥漫性大B细胞淋巴瘤的方法。
本发明人已发现，抗CD25抗体能够在广泛范围的CD25表达水平下消耗CD25+恶性细胞。本发明人已证实抗CD25抗体对CD25+AML及DLBCL细胞，尤其CD25+AML母细胞的直接杀伤。具体而言，本发明人已发现，尽管CD25在与AML相关的肿瘤细胞上的表达水平低，但抗CD25抗体仍有效杀伤这些肿瘤细胞。本发明人发现，抗CD25抗体可用于靶向具有低CD25表达的癌细胞，且因此也适用于治疗母细胞上的CD25表达水平低的癌症，诸如AML。
CD25为IL-2受体的α链，且发现于经活化的T细胞、调节性T细胞、经活化的B细胞、一些NK T细胞、一些胸腺细胞、骨髓前体及寡树突神经胶质细胞上。也可在AML患者的母细胞上发现少量CD25表达。CD25与CD122及CD132结合以形成充当IL-2的高亲和力受体的异三聚体复合物。人类CD25的共有序列显示如下且鉴别为SEQ ID NO:1(Uniprot登录号P01589；对应于氨基酸22-240的成熟人类CD25的胞外域带下划线)。
如本文所使用，“抗CD25抗体”或“结合CD25的抗体”是指能够结合于IL-2受体的CD25亚单位的抗体。此亚单位也称为IL-2受体的α亚单位。
抗CD25抗体为能够特异性结合于IL-2受体的CD25亚单位(抗原)的抗体。“特异性结合(Specific binding/bind specifically/specifically bind)”应理解为意味着抗体对相关抗原具有小于约10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M或10-13M的解离常数(Kd)。在优选实施方式中，解离常数小于10-8M，例如在10-9M、10-10M、10-11M、10-12M或10-13M的范围内。
适用于本发明的抗CD25抗体包括例如WO2017/174331、WO2018/167104、WO2019/008386、WO2019/175215、WO2019/175216、WO2019/175217、WO2019/175220、WO2019/17522、WO2019/175223、WO2019/175224、WO2019/175226中所描述的抗体，其内容以引用的方式并入本文中。
如本文所使用，术语“抗体”是指完整免疫球蛋白分子以及其包括抗原结合位点的片段，且包括抗体的多克隆、单克隆、经基因工程改造及以其他方式经修饰的形式，包含(但不限于)嵌合抗体、人源化抗体、杂缀合及/或多特异性抗体(例如双特异性抗体、双抗体、三抗体及四抗体)，及抗体的抗原结合片段，包括例如Fab'、F(ab')2、Fab、Fv、rlgG、多肽-Fc融合体、单链变异体(scFv片段、VHH、Trans 鲨鱼单域抗体、单链或串联双抗体/>VHH、/>微型抗体、/>双环肽及其他替代性免疫球蛋白蛋白质骨架)。在一些实施方式中，抗体可能不具有在其天然产生的情况下将具有的共价修饰(例如附接聚糖)。在一些实施方式中，抗体可含有共价修饰(例如附接聚糖、可检测部分、治疗部分、催化部分或提供抗体的经改良的稳定性或施用的其他化学基团，诸如聚乙二醇)。在一些实施方式中，抗体可呈经遮蔽的抗体的形式(例如/>)。经遮蔽的抗体可包含特异性结合于抗体的抗原结合表面且干扰抗体的抗原结合的阻断或“遮蔽”肽。遮蔽肽通过可裂解接头(例如通过蛋白酶)连接至抗体。在所需环境下，例如肿瘤环境下的接头的选择性裂解允许遮蔽/阻断肽解离，使得肿瘤中发生抗原结合且因此限制潜在毒性问题。“抗体”也可指骆驼抗体(仅具有重链的抗体)及抗体样分子，诸如抗运载蛋白(Skerra(2008)FEBS J 275,2677-83)。在一些实施方式中，抗体为多克隆或寡克隆，其以抗体的集合形式产生，各自与单一抗体序列相关且与抗原内的具有或多或少的独特性的表位(诸如人类CD25胞外域内的与不同参考抗人类CD25抗体相关的不同表位)结合。如文献中所描述，可以单一制剂形式提供多克隆或寡克隆抗体以用于医学用途(Kearns JD等人,2015.MolCancer Ther.14:1625-36)。
本发明所使用的抗体可为单特异性、双特异性或多特异性的。“多特异性抗体”可对一种靶抗原或多肽的不同表位具有特异性或可含有对超过一种靶抗原或多肽具有特异性的抗原结合域。在本发明的一些实施方式中，抗体为单特异性的。在一些实施方式中，抗体以单价方式(也即，一个抗体:一个CD25分子的比率)结合CD25。在其他实施方式中，抗体为单特异性二价抗体，也即，抗体以一个抗体:两个CD25分子的比率结合CD25。
在本发明的一些实施方式中，抗体为单克隆的。抗体可另外或替代地为人源化或人类的。在另一实施方式中，抗体为人类抗体，或在任何情况下具有允许其在人类对象中使用及施用的形式及特征的抗体。
如本文所使用，“单克隆抗体”不限于经由融合瘤技术产生的抗体。术语“单克隆抗体”是指衍生自单一克隆(包括任何真核、原核或噬菌体克隆)的抗体，而非产生抗体的方法。
如本文所使用，“人类抗体”是指具有其中构架区及CDR区两者均衍生自人类生殖系免疫球蛋白序列的可变区的抗体。另外，如果抗体含有恒定区，则恒定区也衍生自人类生殖系免疫球蛋白序列。本发明的人类抗体可包括不由人类生殖系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机或位点特异性突变诱发或通过体内体细胞突变引入的突变)。
抗体(Ab)及免疫球蛋白(Ig)为具有相同结构特征的糖蛋白。免疫球蛋白可来自任何类别，诸如lgA、lgD、lgG、lgE或lgM。免疫球蛋白可是任何亚类的免疫球蛋白，诸如lgG1、lgG2、lgG3或lgG4。在本发明的优选实施方式中，抗CD25抗体来自IgG类别，优选lgG1亚类。在一个实施方式中，抗CD25抗体来自人类lgG1亚类。
在本发明的优选实施方式中，抗CD25抗体以高亲和力结合FcγR，优选以高亲和力结合活化受体。优选地，抗体以高亲和力结合FcγRI及/或FcγRIIa及/或FcγRIIIa。在特定实施方式中，抗体以小于约10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M的解离常数结合于至少一种活化Fcγ受体。
在一些实施方式中，抗体为IgG1抗体，优选为人类IgG1抗体，其能够结合于至少一种Fc活化受体。举例而言，抗体可结合于一种或多种选自FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIc、FcγRIIIa及FcγRIIIb的受体。在一些实施方式中，抗体能够结合于FcγRIIIa。在一些实施方式中，抗体能够结合于FcγRIIIa及FcγRIIa且任选地结合于FcγRI。在一些实施方式中，抗体能够以高亲和力，例如以小于约10-7M、10-8M、10-9M或10-10M的解离常数结合于这些受体。
在一些实施方式中，抗体以低亲和力结合抑制性受体FcγRIIb。在一些实施方式中，抗体以大于约10-7M、大于约10-6M或大于约10-5M的解离常数结合FcγRIIb。
在一些实施方式中，抗体可为去岩藻糖基化的。可使用本领域已知的技术修饰抗体的Fc区以改变糖基化型态。产生不具有或具有减少的岩藻糖基化型态的抗体的可用技术包括诸如GlyMAXX(ProBiogen)的市售技术及诸如在WO2011/035884中所公开的方法。
在一些实施方式中，抗CD25抗体诱导ADCC活性。抗CD25抗体展现针对CD25+靶细胞的ADCC活性。“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”(ADCC)是指细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如自然杀伤(NK)细胞、嗜中性白血球及巨噬细胞)识别靶细胞上的结合抗体且由此引起靶细胞的溶解。在一些实施方式中，抗CD25抗体诱导ADCP活性。“抗体依赖性细胞介导的吞噬作用”(ADCP)是指细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的吞噬细胞(诸如巨噬细胞)识别靶细胞上的结合抗体且由此引起靶细胞的吞噬作用。
本发明中所使用的抗CD25抗体可经由ADCC及ADCP活性起作用。可使用本领域已知及可用的分析法来测量ADCC及ADCP。
在本发明的一些实施方式中，抗CD25抗体不抑制白介素-2与CD25的结合。本文中提及的“不抑制白介素-2与CD25的结合”可替代地表示为抗CD25抗体为非IL-2阻断抗体或“非阻断”抗体(相对于在抗CD25抗体存在下不阻断IL-2与CD25的结合)，也即，抗体不阻断白介素-2与CD25的结合，且尤其不抑制白介素-2在表达CD25的细胞中的信号传导。本文中提及的非IL-2阻断抗体可替代地表示为“不抑制白介素-2与CD25的结合”的抗CD25抗体或表示为“不抑制IL-2的信号传导”的抗CD25抗体。所提及的“非阻断”、“非IL-2阻断”、“不阻断”或“无阻断”及其类似术语(相对于在抗CD25抗体存在下不阻断IL-2与CD25的结合)包括其中本发明的抗CD25抗体不阻断经由CD25进行的IL-2的信号传导的实施方式。也即，相较于在不存在抗体的情况下的IL-2信号传导，抗CD25抗体抑制小于50％的IL-2信号传导。在本文所描述的本发明的特定实施方式中，相较于在不存在抗体的情况下的IL-2信号传导，抗CD25抗体抑制小于约50％、40％、35％、30％，优选小于约25％的IL-2信号传导。
一些抗CD25抗体可允许IL-2与CD25的结合，但仍阻断经由CD25受体进行的信号传导。相较于在不存在抗CD25抗体的情况下的信号传导，非IL-2阻断抗CD25抗体允许IL-2与CD25的结合，以促进至少50％的经由CD25受体进行的信号传导水平。
可通过如例如WO2018/167104中所论述及如本领域已知的方法来测量经由CD25进行的IL-2信号传导。在存在及不存在抗CD25抗体试剂的情况下比较IL-2信号传导可在相同或基本上相同的条件下进行。
在一些实施方式中，可通过使用标准Stat-5磷酸化测定测量细胞中的磷酸化STAT5蛋白的含量来测定IL-2信号传导。举例而言，用于测量IL-2信号传导的Stat-5磷酸化测定可涉及在存在抗CD25抗体的情况下以10μg/ml的浓度培养PMBC细胞30分钟且接着添加不同浓度的IL-2(例如，以10U/ml或0.25U/ml、0.74U/ml、2.22U/ml、6.66U/ml或20U/ml的不同浓度)持续10分钟。随后细胞可经渗透且接着可通过利用流式细胞术分析的针对磷酸化STAT5肽的荧光标记抗体来测量STAT5蛋白的含量。IL-2信号传导的阻断百分比可计算如下：％阻断＝100×[(％Stat5+细胞无抗体组-％Stat5+细胞10μg/ml抗体组)/(％Stat5+细胞无Ab组)]。
非阻断抗CD25抗体的实例描述于WO2018/167104、WO2019/175215、WO2019/175216、WO2019/175217、WO2019/175220、WO2019/17522、WO2019/175223、WO2019/17524、WO2019/17526中，其内容以全文引用的方式并入本文中。
抗CD25抗体可特异性结合于人类CD25的胞外区内的表位。在一些实施方式中，抗体结合于不同于IL-2结合位点的表位且不阻断IL2与CD25的结合。
如本文所使用，“表位”是指抗原中的被抗体或抗原结合片段结合的部分。如本领域所熟知，表位可由连续氨基酸(线性表位)或通过蛋白质的三级折叠而并列的非连续氨基酸(构象表位)形成。由连续氨基酸形成的表位通常在暴露于变性溶剂后保留，而通过三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理后消失。
表位为构象的，这是因为其包含在抗原中非共价连续但当抗原呈相关构象时在三维空间中彼此靠近的抗原部分。举例而言，对于CD25，构象表位是包含CD25胞外域中的非连续氨基酸残基的表位；线性表位是包含CD25胞外域中连续氨基酸残基的表位。用于测定抗CD25抗体的表位的精确序列及/或特定氨基酸残基的方法为文献中已知的，包括与来自抗原序列的肽竞争结合于来自不同物种的CD25序列(截短及/或突变诱发(例如通过丙氨酸扫描或其他定点突变诱发))、基于噬菌体展示的筛选、酵母呈递技术或(共)结晶学技术。测定表位的空间构象的方法在本领域也熟知且包括例如x射线结晶学及2-D核磁共振。参见例如Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology,第66卷,GlennE.Morris编(1996)。因此，在一些实施方式中，抗CD25抗体可识别构象表位。
在一些实施方式中，抗CD25抗体结合于表位，其中表位包含有包含于选自以下的一个或多个氨基酸区段中的一个或多个氨基酸残基：SEQ ID NO:1的氨基酸150-163(YQCVQGYRALHRGP)(SEQ ID NO:52)、SEQ ID NO:1的氨基酸166-186(SVCKMTHGKTRWTQPQLICTG)(SEQ ID NO:53)、SEQ ID NO:1的氨基酸42-56(KEGTMLNCECKRGFR)(SEQ ID NO:54)及SEQ ID NO:1的氨基酸70-88(NSSHSSWDNQCQCTSSATR)(SEQ ID NO:55)。优选地，表位包含有包含于选自以下的一个或多个氨基酸区段中的至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少十个、至少十一个、至少十二个、至少十三个、至少十四个、至少十五个、至少十六个、至少十七个、至少十八个或更多个氨基酸残基：SEQ ID NO:1的氨基酸150-163(YQCVQGYRALHRGP)(SEQ ID NO:52)、SEQ ID NO:1的氨基酸166-186(SVCKMTHGKTRWTQPQLICTG)(SEQ ID NO:53)、SEQ ID NO:1的氨基酸42-56(KEGTMLNCECKRGFR)(SEQ ID NO:54)及/或SEQ ID NO:1的氨基酸70-88(NSSHSSWDNQCQCTSSATR)(SEQ ID NO:55)。
在一些实施方式中，抗CD25抗体结合于人类CD25的表位，其中表位包含选自以下的至少一个序列：SEQ ID NO:1的氨基酸150-158(YQCVQGYRA)(SEQ ID NO:56)、SEQ ID NO:1的氨基酸176-180(RWTQP)(SEQ ID NO:57)、SEQ ID NO:1的氨基酸42-56(KEGTMLNCECKRGFR)(SEQ ID NO:54)及SEQ ID NO:1的氨基酸74-84(SSWDNQCQCTS)(SEQ IDNO:58)。此类抗体不抑制IL-2与CD25的结合。
在一个实施方式中，抗CD25抗体结合于包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列70-84(NSSHSSWDNQCQCTS)(SEQ ID NO:59)的表位。
原生抗体及免疫球蛋白通常为约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，其包含两个一致轻(L)链及两个一致重(H)链。各重链在氨基端处具有可变(VH)域，随后为多个恒定域。各轻链在氨基端处具有可变(VL)域且在羧基端处具有恒定域。
可变区能够与结构上互补的抗原标靶相互作用且其特征在于来自具有不同抗原特异性的抗体的氨基酸序列的差异。重链或轻链的可变区含有能够特异性结合于抗原标靶的氨基酸序列。这些序列内含有由于在具有不同特异性的抗体之间具有极高可变性而称为“高变”的较小序列。此类高变区也称为“互补决定区”或“CDR”区。
这些CDR区引起抗体对特定抗原决定子结构的基本特异性。CDR表示可变区内的非连续氨基酸区段，但与物种无关，已发现这些重要氨基酸序列在可变重链及轻链区内的方位位置在可变链的氨基酸序列内具有类似位置。对于各别重(H)链及轻(L)链，所有抗体的可变重链及轻链各自具有3个CDR区，各自与其他CDR区(称为H1、H2、H3、L1、L2、L3)不连续。本文中所指定的CDR区根据Kabat(Kabat等人,1977.J Biol Chem 252,6609-6616)来定义。
在一些实施方式中，抗CD25抗体选自由以下组成的组：
(a)抗体或其抗原结合片段，其包含：
重链可变区，其包含有包含SEQ ID NO:2-5中的任一者的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:6-11中的任一者的氨基酸序列的CDR-H2及包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR-H3，以及
轻链可变区，其包含有包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ IDNO:14的氨基酸序列的CDR-L2及包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-L3；
(b)抗体或其抗原结合片段，其包含：
重链可变区，其包含有包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ IDNO:24的氨基酸序列的CDR-H2及包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR-H3，以及
轻链可变区，其包含有包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ IDNO:27的氨基酸序列的CDR-L2及包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR-L3；以及
(c)抗体或其抗原结合片段，其包含：
重链可变区，其包含有包含SEQ ID NO:31-33中的任一者的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:34-38中的任一者的氨基酸序列的CDR-H2及包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的CDR-H3，以及
轻链可变区，其包含有包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ IDNO:41的氨基酸序列的CDR-L2及包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的CDR-L3。
在一些实施方式中，抗CD25抗体选自由以下组成的组：
(a)抗体或其抗原结合片段，其包含：
重链可变区，其包含有包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR-H2及包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR-H3；以及
轻链可变区，其包含有包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ IDNO:14的氨基酸序列的CDR-L2及包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-L3；
b)抗体或其抗原结合片段，其包含：
重链可变区，其包含有包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR-H2及包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR-H3；以及
轻链可变区，其包含有包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ IDNO:14的氨基酸序列的CDR-L2及包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-L3；
c)抗体或其抗原结合片段，其包含：
重链可变区，其包含有包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDR-H2及包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR-H3；以及
轻链可变区，其包含有包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ IDNO:14的氨基酸序列的CDR-L2及包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-L3；
d)抗体或其抗原结合片段，其包含：
重链可变区，其包含有包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR-H2及包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR-H3；以及
轻链可变区，其包含有包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ IDNO:14的氨基酸序列的CDR-L2及包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-L3；
e)抗体或其抗原结合片段，其包含：
重链可变区，其包含有包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR-H2及包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR-H3；以及
轻链可变区，其包含有包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ IDNO:14的氨基酸序列的CDR-L2及包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-L3；以及
f)抗体或其抗原结合片段，其包含：
重链可变区，其包含有包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR-H2及包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR-H3；以及
轻链可变区，其包含有包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ IDNO:14的氨基酸序列的CDR-L2及包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-L3。
在一些实施方式中，抗CD25抗体选自由以下组成的组：
a)包含有包含SEQ ID NO:16-21中的任一者的氨基酸序列的重链可变区及包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的轻链可变区的抗体；
b)包含有包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的重链可变区及包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的轻链可变区的抗体；以及
c)包含有包含SEQ ID NO:43-48中的任一者的氨基酸序列的重链可变区及包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列的轻链可变区的抗体。
在一些实施方式中，抗CD25抗体选自由以下组成的组：
a)包含有包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的重链可变区及包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的轻链可变区的抗体；
b)包含有包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的重链可变区及包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的轻链可变区的抗体；
c)包含有包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的重链可变区及包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的轻链可变区的抗体；
d)包含有包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的重链可变区及包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的轻链可变区的抗体；
e)包含有包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的重链可变区及包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的轻链可变区的抗体；
f)包含有包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的重链可变区及包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的轻链可变区的抗体；以及
g)包含重链可变区及轻链可变区的抗体，该重链可变区包含与SEQ ID NO:16-21中的任一者具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性的序列，该轻链可变区包含与SEQ ID NO:22具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性的序列。
示例性抗体的互补决定区(HCDR1-3及LCDR1-3)以及重链及轻链可变区的SEQ IDNO提供于下表中：
表1：
| 抗体 | HCDR1 | HCDR2 | HCDR2 | VH | LCDR1 | LCDR2 | LCDR3 | VL |
| aCD25-a-686 | 2 | 6 | 12 | 16 | 13 | 14 | 15 | 22 |
| aCD25-a-686-m1 | 2 | 7 | 12 | 17 | 13 | 14 | 15 | 22 |
| aCD25-a-686-m2 | 3 | 8 | 12 | 18 | 13 | 14 | 15 | 22 |
| aCD25-a-686-m3 | 2 | 9 | 12 | 19 | 13 | 14 | 15 | 22 |
| aCD25-a-686-m4 | 4 | 10 | 12 | 20 | 13 | 14 | 15 | 22 |
| aCD25-a-686-m5 | 5 | 11 | 12 | 21 | 13 | 14 | 15 | 22 |
| aCD25-a-674 | 23 | 24 | 25 | 29 | 26 | 27 | 28 | 30 |
| aCD25-a-646 | 31 | 34 | 39 | 43 | 40 | 41 | 42 | 49 |
| aCD25-a-646-m1 | 32 | 35 | 39 | 44 | 40 | 41 | 42 | 49 |
| aCD25-a-646-m2 | 33 | 36 | 39 | 45 | 40 | 41 | 42 | 49 |
| aCD25-a-646-m3 | 33 | 37 | 39 | 46 | 40 | 41 | 42 | 49 |
| aCD25-a-646-m4 | 33 | 35 | 39 | 47 | 40 | 41 | 42 | 49 |
| aCD25-a-646-m5 | 33 | 38 | 39 | 48 | 40 | 41 | 42 | 49 |
此类抗体进一步描述于WO2019/175216、WO2019/175217及WO2019/1175222中。其内容以引用的方式并入本文中。
在本文中称为aCD25-a-686的抗体也可称为RG6292。在优选实施方式中，抗CD25抗体为RG6292。称为“RG6292”的抗CD25抗体为去岩藻糖基化人类IgG1单克隆抗体。RG6292含有具有序列SEQ ID NO:50的重链序列及具有序列SEQ ID NO:51的轻链序列。
已知此类抗体为“非IL-2阻断”抗体且不抑制IL-2与CD25的结合。
也可使用上文所定义的抗体的变异体。抗体的变异体包括其中各CDR序列的序列包含具有以下的氨基酸序列的抗体：
(i)与其至少85％一致性，及/或
(ii)相对于SEQ ID NO:2-15、23-28或31-42的一个、两个或三个氨基酸取代。
抗体的变异体也包括其中各轻链及重链的序列包含具有以下的氨基酸序列的抗体：
(i)与其至少80％一致性，及/或
(ii)相对于SEQ ID NO:16-22、29-30或43-51的一个、两个、三个、四个或五个氨基酸取代。
举例而言，本发明的一个实施方式提供一种用于治疗AML的抗CD25抗体，其选自包含以下的组：
a)抗体或其抗原结合片段，其包含：
-重链可变区，其包含有包含与SEQ ID NO:2-5中的任一者具有至少85％序列一致性的氨基酸序列的CDR-H1、包含与SEQ ID NO:6-11中的任一者具有至少85％序列一致性的氨基酸序列的CDR-H2及包含与SEQ ID NO:12具有至少85％序列一致性的氨基酸序列的CDR-H3，以及
-轻链可变区，其包含有包含与SEQ ID NO:13具有至少85％序列一致性的氨基酸序列的CDR-L1、包含与SEQ ID NO:14具有至少85％序列一致性的氨基酸序列的CDR-L2及包含与SEQ ID NO:15具有至少85％序列一致性的氨基酸序列的CDR-L3；
b)抗体或其抗原结合片段，其包含：
-重链可变区，其包含有包含相对于SEQ ID NO:2-5中的任一者具有一个、两个或三个氨基酸取代的氨基酸序列的CDR-H1、包含相对于SEQ ID NO:6-11中的任一者具有一个、两个或三个氨基酸取代的氨基酸序列的CDR-H2及包含相对于SEQ ID NO:12具有一个、两个或三个氨基酸取代的氨基酸序列的CDR-H3，以及
-轻链可变区，其包含有包含相对于SEQ ID NO:13具有一个、两个或三个氨基酸取代的氨基酸序列的CDR-L1；包含相对于SEQ ID NO:14具有一个、两个或三个氨基酸取代的氨基酸序列的CDR-L2及包含相对于SEQ ID NO:15具有一个、两个或三个氨基酸取代的氨基酸序列的CDR-L3；以及
c)抗体或其抗原结合片段，其包含：
-重链可变区，其包含：
i)与SEQ ID NO:16-21中的任一者具有至少80％序列一致性的氨基酸序列；或
ii)与SEQ ID NO:16-21相比具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸取代的氨基酸序列；及
-轻链可变区，其包含：
i)与SEQ ID NO:22具有至少80％序列一致性的氨基酸序列；或
ii)与SEQ ID NO:22相比具有一个、两个、三个、四个或五个氨基酸取代的氨基酸序列。
本领域已知的一致性百分比(％)为两个或更多个多肽序列或两个或更多个聚核苷酸序列之间的关系，其通过将序列进行比较而确定。在本领域，一致性也意味着多肽或聚核苷酸序列之间的序列相关性程度，视具体情况可通过此类序列串之间的匹配所确定。当存在多种用于测量两个多肽或两个聚核苷酸序列之间的一致性的方法时，通常在计算机程序中对用于确定一致性的方法进行编码。用于测定两个序列之间的一致性的优选计算机程序包括(但不限于)GCG程序包(Devereux,等人,Nucleic Acids Research,12,387(1984)、BLASTP、BLASTN及FASTA(Atschul等人,J.Molec.Biol.215,403(1990))。两个氨基酸序列或两个核酸序列的一致性百分比通过进行序列比对以达到最佳比较目的(例如，可将间隙引入第一序列中以实现最佳序列比对)且将对应位置处的氨基酸残基或核苷酸进行比较来确定。“最佳比对”为产生最高一致性百分比的两个序列的比对。一致性百分比通过所比较的序列中的一致氨基酸残基或核苷酸的数目来确定(也即，一致性％＝一致位置数/总位置数×100)。一般来说，除非上下文另有指定或暗示，否则本文中所提及的一致性％是指沿整个分子的长度的一致性％。
在一些实施方式中，抗CD25抗体杀伤癌症、Treg、AML母细胞及/或PMBC细胞。在一些实施方式中，抗体杀伤具有大于每细胞约900个CD25分子的CD25表达水平的Treg细胞及母细胞。优选地，抗体杀伤具有大于每细胞约1000个CD25分子，优选在每细胞约1000个至40000个、约1000个至约5000个或约1000个至约2500个CD25分子的范围内的CD25表达水平的Treg细胞及母细胞。
特异性细胞上的CD25的表达水平也可称为CD25密度且为每细胞CD25分子的数目的测量结果。细胞上的CD25的表达水平或密度可如实施例中所论述及本领域已知，例如通过流式细胞术来测定。相较于具有高CD25表达的细胞(诸如Treg细胞)，具有每细胞约1000个CD25分子的CD25的细胞视为低表达CD25细胞。此类低表达CD25细胞包括AML母细胞。
在本发明的一些实施方式中，抗CD25抗体用于杀伤低表达CD25细胞，诸如CD25+AML母细胞。
在一些实施方式中，当抗体及NK细胞与每细胞表达900至5000个CD25分子的细胞共同孵育时，抗CD25抗体诱导NK细胞上的CD16表达减少至多25％。优选地，NK细胞为CD56dim NK细胞。CD16表达的减少可通过例如实施例中所论述及本领域已知的方法测量。
本发明涉及急性骨髓性白血病(AML)或弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)的治疗。优选地，本发明涉及急性骨髓性白血病(AML)的治疗。急性骨髓性白血病(AML)为血液癌，其中存在骨髓谱系群体的异常细胞(诸如骨髓母细胞、红血球及血小板)的生长，其在骨髓中增殖及积聚且扩散至血液中。用于AML的分类方案为本领域已知的，例如AML的WHO 2008分类及法国-美国-英国(French-American-British；FAB)分类。弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)为非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma)的侵袭性类型。
抗CD25抗体可用于靶向患者的AML母细胞。在一些实施方式中，来自所治疗的对象的肿瘤细胞上的CD25表达水平为每细胞至少约900个CD25分子。在一些实施方式中，来自所治疗对象的肿瘤细胞上的CD25表达水平在每细胞约900至约5000个CD25分子的范围内。
如本文所使用，所提及的AML或DLBCL的“治疗(treatment/treat/treating)”是指部分或完全缓解、改善、减轻、抑制一种或多种症状、延迟其发作、降低其严重程度及/或降低其发生率的物质(例如，抗CD25抗体)的任何施用。积极治疗效果可为例如癌细胞数目减少，也即，AML母细胞减少。
本文所描述的本发明的任何实施方式中的对象优选为哺乳动物，优选为猫、犬、马、驴、绵羊、猪、山羊、牛、仓鼠、小鼠、大鼠、兔或天竺鼠，但最优选对象为人类。因此，在本文所描述的本发明的所有方面中，对象优选为人类。对象在本文中也可称为患者。
本文所描述的有效治疗癌症患者的疗法的用量方案可根据诸如以下的因素而变化：患者的疾病状态、年龄及体重以及疗法在对象中诱发抗癌反应的能力。抗CD25抗体可以治疗有效量使用。如本文所使用，术语“治疗有效量”意味着当根据治疗性给药方案向患有或易患疾病及/或病况的群体施用时足以治疗此类疾病及/或病况的量(例如，药剂或医药组合物的量)。治疗有效量为降低疾病、病症及/或病况的一种或多种症状的发生率及/或严重度，使其稳定及/或延迟其发作的量。本领域普通技术人员将了解，“治疗有效量”实际上不需要在特定对象中实现成功治疗。
适当剂量的选择将在本领域技术人员的能力范围内。举例而言，0.01、0.1、0.3、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40或50mg/kg。在一些实施方式中，此类量为当向相关群体(也即，以治疗给药方案)施用时，根据已确定与所需或有益结果相关的给药方案适合于施用的单位用量(或其整体部分)。用量也可因施用途径、治疗周期，或因此随剂量递增方案而变化，该剂量递增方案可用于确定与以递增剂量形式施用抗体有关的最大耐受剂量及剂量限制毒性(如果存在)。
在一些实施方式中，给药方案包含复数个剂量，其各自彼此间隔相同长度的时段。或者，给药方案包含复数个剂量及将分隔个别剂量的至少两个不同时段。在一些实施方式中，给药方案内的所有剂量具有相同单位剂量。或者，给药方案内的不同剂量具有不同的量。在一些实施方式中，给药方案包含以第一剂量进行的第一次给药，接着为以不同于第一剂量的第二剂量进行的一次或多次额外给药。给药方案可包含以第一剂量进行的第一次给药，接着为以与第一剂量相同的第二剂量进行的一次或多次额外给药。在一些实施方式中，给药方案在跨越相关群体施用时与所需或有益结果相关(也即，为治疗给药方案)。
如本文中所描述的根据本发明的任何方面的抗CD25抗体可呈另外包含药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂的医药组合物形式。这些组合物包括例如，液体、半固体及固体剂量配制物，诸如液体溶液(例如，可注射溶液及可输注溶液)、分散液或悬浮液、锭剂、丸剂或脂质体。在一些实施方式中，优选形式可视预期施用模式及/或治疗应用而定。含有抗体的医药组合物可通过本领域已知的任何适当方法施用，包括(但不限于)经口、经黏膜、通过吸入、局部、经颊、经鼻、经直肠或肠胃外(例如静脉内、输注、瘤内、结节内、皮下、腹膜内、肌肉内、皮内、经皮或涉及物理破坏对象的组织且经由组织中的裂口施用医药组合物的其他类型的施用)。此类配制物可例如呈可注射或可输注溶液形式，其适用于皮内、瘤内或皮下施用，或适用于静脉内输注。施用可涉及间歇性给药。或者，投药可涉及在施用其他化合物的同时或在其间进行的持续至少所选时段的连续给药(例如灌注)。在一些实施方式中，所制备的抗体可具有保护其免于快速释放及/或降解的载剂，诸如控制释放配制物，诸如植入物、经皮贴片及微囊封递送系统。可使用可生物降解、生物兼容的聚合物。
举例而言，本领域技术人员将了解，递送途径(例如，经口对比静脉内对比皮下等)可影响剂量及/或所需剂量可影响递送途径。举例而言，当对特定部位或位置内的特定高浓度的药剂感兴趣时，焦点递送可为所需及/或适用的。在优化给定治疗方案的途径及/或给药时间表时考虑的其他因素可包括例如所治疗的特定癌症(例如，类型、阶段、位置等)、对象的临床病况(例如，年龄、整体健康状况等)、存在或不存在组合疗法及医学从业者已知的其他因素。医药组合物在制造及储存条件下通常应为无菌及稳定的。组合物可配制为溶液、微乳液、分散液、脂质体或适用于高药物浓度的其他有序结构。无菌可注射溶液可通过将所需量的抗体与以上所列举的成分中的一者或组合一起并入适合的溶剂中，视需要随后进行过滤灭菌来制备。如本文所论述，用于肠胃外施用的配制物包括(但不限于)存于油性或水性媒剂中的悬浮液、溶液、乳液；膏剂；及可植入持续释放型或可生物降解型配制物。无菌可注射配制物可使用无毒肠胃外可接受的稀释剂或溶剂制备。根据本发明使用的各医药组合物可包括药学上可接受的分散剂、湿润剂、悬浮剂、等张剂、包衣、抗菌及抗真菌剂、载剂、赋形剂、盐或稳定剂，其在所采用的剂量及浓度下对对象而言为无毒的。优选地，此类组合物也可包含与给定方法及/或施用部位兼容的用于治疗癌症的药学上可接受的载剂或赋形剂，例如用于肠胃外(例如皮下、皮内或静脉内注射)、瘤内或瘤周施用。如本文所使用，应用于用以配制如本文所公开的组合物的载剂、稀释剂或赋形剂的术语“药学上可接受”意味着该载剂、稀释剂或赋形剂必须与组合物的其他成分兼容且对其接受者无毒。
在一些实施方式中，抗CD25抗体可为具有其他治疗剂的组合疗法的一部分。因此，本发明的第二方面提供一种用于治疗AML或DLBCL的抗CD25抗体，其中该抗CD25抗体与一种或多种其他治疗剂组合施用。本发明的第三方面提供抗CD25抗体与一种或多种用于治疗AML或DLBCL的其他治疗剂的组合。抗CD25抗体及其他治疗剂用于独立、同时或依序施用。
抗CD25抗体可与以下组合施用：共刺激抗体、化学疗法及/或放射线疗法(通过在体外进行照射或通过施用放射性缀合的化合物)、基于细胞因子的疗法、靶向疗法、疫苗或佐剂或其任何组合。“组合”可指在施用抗CD25抗体之前、同时或之后施用额外疗法。抗CD25抗体及其他治疗剂可用于独立、同时或依序施用。
抗CD25抗体及其他治疗剂可经由相同或不同递送途径及/或根据不同时间表施用。或者或另外，在一些实施方式中，第一活性剂的一个或多个剂量与一种或多种其他活性剂基本上同时施用且在一些实施方式中，经由常用途径及/或作为单一组合物的一部分一起施用。
在一些实施方式中，其他治疗剂可选自一种或多种FLT3抑制剂(例如吉瑞替尼、米哚妥林、索拉非尼、奎扎替尼(quizartinib)、克拉尼布(crenolanib))、BCL-2抑制剂(例如维奈托克)、IDH抑制剂(例如恩西地平、艾伏尼布)、低甲基化剂(例如阿扎胞苷、地西他滨)、其他抗体(例如CD33抗体，诸如奥佐米星吉妥单抗)及其组合。在一些实施方式中，抗CD25抗体可与蒽环霉素-阿糖胞苷疗法(诸如道诺霉素及阿糖胞苷疗法)以及任选地选用的其他治疗剂组合使用。在一些实施方式中，抗体与BCL-2抑制剂及低甲基化剂组合使用。在一些实施方式中，抗CD25抗体与维奈托克以及任选地选用的其他治疗剂(诸如阿扎胞苷)组合使用。
其他治疗剂包括(但不限于)其他化学治疗剂，诸如细胞毒性药物。化学治疗剂包括(但不限于)烷基化剂、蒽环霉素、埃博霉素(epothilone)、亚硝基脲、伸乙亚胺/甲基三聚氰胺、磺酸烷基酯、烷基化剂、抗代谢物、嘧啶类似物、表鬼臼毒素(epipodophylotoxin)、酶，诸如L-天冬酰胺酶；生物反应调节剂，诸如IFNα、IFN-γ、IL-2、IL-12、G-CSF及GM-CSF；铂配合物(诸如顺铂、奥沙利铂及卡铂)、蒽二酮、经取代的尿素(诸如羟基尿素)、甲基肼衍生物(包括N-甲基肼(MIH)及丙卡巴肼)、肾上腺皮质抑制剂，诸如米托坦(mitotane)(o,p'-DDD)及氨鲁米特；激素及拮抗剂，包括肾上腺皮质类固醇拮抗剂，诸如泼尼松(prednisone)及等效物、地塞米松(dexamethasone)及氨鲁米特；孕激素，诸如羟孕酮己酯、乙酸甲羟孕酮及乙酸甲地孕酮；雌激素，诸如己烯雌酚及乙炔基雌二醇等效物；抗雌激素，诸如他莫昔芬(tamoxifen)；雄激素，包括丙酸睾固酮及氟甲睾酮/等效物；抗雄激素，诸如氟他胺(flutamide)、促性腺激素释放激素类似物及亮丙立德(leuprolide)；及非类固醇抗雄激素，诸如氟他胺。
在一些实施方式中，其他治疗剂可为免疫检查点抑制剂。在一些实施方式中，本发明也提供用抗CD25抗体与至少一种免疫检查点抑制剂的组合治疗AML。如本文所使用，“免疫检查点”或“免疫检查点蛋白”是指属于免疫系统中的抑制性路径、尤其用于调节T细胞反应的蛋白质。在正常生理条件下，免疫检查点对预防自体免疫至关重要，尤其在对病原体的反应期间。癌细胞可改变免疫检查点蛋白的表达的调节以避开免疫监视。
免疫检查点蛋白的实例包括(但不限于)PD-1、CTLA-4、BTLA、KIR、LAG3、TIGIT、CD155、B7H3、B7H4、VISTA及TIM3以及OX40、GITR、ICOS、4-1BB及HVEM。免疫检查点蛋白也可指与其他免疫检查点蛋白结合的蛋白质。此类蛋白质包括PD-L1、PD-L2、CD80、CD86、HVEM、LLT1及GAL9。免疫检查点抑制剂可抑制免疫检查点蛋白。举例而言，免疫检查点抑制剂可为特异性结合于免疫检查点抑制剂的抗体，或其可为免疫检查点蛋白的其他拮抗剂。
在本发明的一些实施方式中，免疫检查点蛋白为PD-1或PD-L1，且免疫检查点抑制剂可为PD-1或PD-L1的抑制剂，也即，PD-1或PD-L1拮抗剂。在另一实施方式中，免疫检查点抑制剂经由抗PD-1或抗PD-L1抗体干扰PD-1/PD-L1相互作用。本领域已知的抗PD-1抗体包括纳武单抗(Nivolumab)及帕博利珠单抗(Pembrolizumab)。抗PD-L1抗体包括诸如阿特珠单抗(MPDL3280A)的抗体。
在一些实施方式中，其他治疗剂可为癌症疫苗。本发明的另一实施方式提供用抗CD25抗体与癌症疫苗的组合治疗AML。如本文所使用的“癌症疫苗”是指施用癌症患者且经设计以经由强化患者的自身免疫反应来消除癌细胞的治疗性癌症疫苗。癌症疫苗包括肿瘤细胞疫苗(自体及同种异体)、树突状细胞疫苗(离体产生及肽活化)、基于蛋白质/肽的癌症疫苗及基因疫苗(基于DNA、RNA及病毒的疫苗)。因此，治疗性癌症疫苗原则上可用于抑制难以用常规疗法(诸如手术、放射疗法及化学疗法)治疗的晚期癌症及/或复发性肿瘤的进一步生长。基于肿瘤细胞的疫苗(自体及同种异体)包括经基因修饰以分泌可溶性免疫刺激剂(诸如细胞因子(IL-2、IFN-g、IL12、GMCSF、FLT3L))、针对免疫调节受体(PD-1、CTLA-4、GITR、ICOS、OX40、4-1BB)的单链Fv抗体及/或以在其膜上表达免疫刺激受体的配体(诸如ICOS-配体、4-1BB配体、GITR-配体及/或OX40配体等)的疫苗。在一些实施方式中，癌症疫苗可为GVAX抗肿瘤疫苗。
在一些实施方式中，组合疗法不包含施用癌症疫苗与抗CD25抗体的组合。
在一些实施方式中，抗CD25抗体不与另一治疗剂缀合，例如抗CD25抗体不呈抗体-药物缀合物形式。在一些实施方式中，抗CD25抗体不为特司林卡米单鲁单抗(camidanlumabtesirine)(ADCT-301)。特司林卡米单鲁单抗为经由二肽可裂解接头与吡咯并苯并二氮杂(pyrrolobenzodiazepine；PBD)二聚体缀合的称为/>-TAC的抗CD25抗体。
在本发明的一些实施方式中，抗CD25抗体以单一疗法形式施用。举例而言，当抗CD25抗体以单一疗法形式施用时，抗CD25抗体为所施用的唯一治疗活性剂，例如施用以治疗AML或DLBCL的唯一治疗活性剂。
本发明的第四方面提供用于治疗对象中的AML或DLBCL的方法，其包括向对象施用有效量的抗CD25抗体。
本发明的第五方面提供抗CD25抗体用于制造用以治疗AML或DLBCL的药剂的用途。本发明的这些其他方面的抗CD25抗体可为关于第一方面所描述的抗CD25抗体。
治疗AML的方法也可包含施用一种或多种其他治疗剂。在一些实施方式中，如上文所描述，方法进一步包含施用一种或多种免疫检查点抑制剂、癌症疫苗、FLT3抑制剂、BCL-2抑制剂、IDH抑制剂、低甲基化剂、其他抗体及其组合，或与蒽环霉素-阿糖胞苷疗法组合施用。其他治疗剂可独立、同时或依序施用。
本发明的第六方面提供抗CD25抗体及其他治疗剂用于制造用以治疗AML或DLBCL的药剂的用途，其中抗CD25抗体及其他治疗剂用于独立、同时或依序施用。
本发明的第四、第五及第六方面的其他治疗剂可为关于本发明的第一、第二及第三方面所定义。
本发明也涉及选择用抗CD25抗体治疗的患有急性骨髓性白血病(AML)的患者。本发明的第七方面提供一种用于选择用抗CD25抗体治疗的患有AML的患者的方法，其包括测定来自患者的样品中的靶细胞上的CD25的表达水平，其中如果细胞具有大于每细胞约900个CD25分子的表达水平，则患者适合于用抗体治疗。
该方法可用于测定患者是否适于用抗CD25抗体治疗。当来自患者的靶细胞具有大于每细胞约900个、优选大于1000个CD25分子的表达水平时，患者将适于用抗CD25抗体治疗。由此方法可进一步包含向患者施用抗CD25抗体的步骤。
该方法也可包含确定样品中是否存在功能性FcR+效应细胞的步骤。
该方法也可包含自对象获取样品。样品可为来自对象的生物组织或体液样品。在一些实施方式中，样品是来自患者的骨髓样品。
靶细胞上CD25的表达水平可通过本领域已知的方法测定，包括例如实施例中所论述的流式细胞术。
具有FLT3内生性连续性复制(FLT3 internal tandem duplication)(FLT3-ITD)突变的AML患者与不良预后及增加的复发风险相关(Dohner等人,2017,Blood 129(4)424-447)。FLT-ITD突变涉及FLT3的近膜域内的至少3个至超过1000个核苷酸的连续性复制。本发明人也意外地发现，相较于FLT3野生型，携带FLT3-ITD突变的AML患者显示出表达CD25的AML细胞的强盛行率。因此，具有FLT3-ITD突变的患者可为抗CD25抗体疗法的目标。FLT3-ITD突变的存在也可用作生物标志物以鉴别、诊断及/或预测AML患者是否将受益于抗CD25抗体疗法(单独或与其他用于治疗AML的治疗剂组合)。
因此，本发明的第八方面包含一种选择用抗CD25抗体治疗的患有急性骨髓性白血病的患者的方法，该方法包含确定来自患者的样品中存在或不存在FLT3-ITD突变，其中如果样品中存在突变，则患者适合于用抗体治疗。该方法可用于鉴别患者是否尤其适合于抗CD25抗体疗法。
如果确定患者具有FLT3-IRD突变，则该方法可进一步包含向患者施用抗CD25抗体。抗CD25抗体可为如上文关于本发明的其他方面所定义。
本发明的第九方面提供一种预测AML患者对用抗CD25抗体治疗的反应的方法，该方法包含确定来自患者的样品中存在或不存在FLT3-ITD突变，其中样品中存在突变则指示患者将对用抗CD25抗体治疗起反应。
在第十方面中，本发明提供一种治疗对象中的急性骨髓性白血病的方法，其包括向对象施用有效量的抗CD25抗体，其中对象包含FLT3-ITD突变的存在。该方法也可包含确定来自患有AML的患者的样品中的FLT3-ITD突变的存在。
当患者诊断为患有AML时，患者可诊断为患有特征在于具有FLT3-ITD突变的AML。Dohner等人,2017,Blood 129(4)424-447。如果患者诊断为患有特征在于存在FLT3-ITD突变的AML，则本文所描述的抗CD25抗体可尤其适用于AML的治疗。
FLT3-ITD突变的存在或不存在可通过本领域已知的方法确定。参见例如SpencerDH等人,2013Journal Molecular Diagnostics,第15(1)卷,81-83、Engen C等人,2021,Molecular Oncology,第15卷,2300-2317。举例而言，突变的存在或不存在可通过选自DNA测序及突变筛选技术的组中的方法来确定。
样品可为来自患者的血液或骨髓样品。在一些实施方式中，预测或选择方法是体外方法。
本发明的第十一方面提供一种预防AML患者中的复发或降低其风险的方法，该方法包含向患者施用抗CD25抗体。抗CD25抗体可为如上文关于本发明的其他方面所定义。
抗CD25抗体可用于靶向LSC(白血病干细胞)及/或不成熟AML母细胞或具有祖细胞表达型的细胞以帮助预防或降低复发的风险。
方法可进一步包含施用一种或多种其他治疗剂。该一种或多种其他治疗剂可为如关于本发明的第一、第二及第三方面所定义。在一个实施方式中，其他治疗剂为FLT3抑制剂。在另一实施方式中，一种或多种其他治疗剂为BCL-2抑制剂与低甲基化剂的组合，例如维奈托克及阿扎胞苷的组合。抗CD25抗体及其他治疗剂可用于独立、同时或依序施用。
本发明的第十二方面包含一种治疗已经历BCL-2抑制剂-低甲基化剂组合治疗的患者中的AML的方法，该方法包含向患者施用抗CD25抗体。抗CD25抗体可为如上文所描述。在一个实施方式中，BCL-2抑制剂-低甲基化剂组合治疗包含维奈托克-阿扎胞苷组合。
本发明人已发现，用BCL-2抑制剂及低甲基化剂(诸如维奈托克及阿扎胞苷的组合)治疗的AML患者仍显示可检测的CD25+AML细胞水平。因此，用抗CD25抗体(单独、同时或依序施用)进一步治疗AML患者可帮助防止复发及疾病发展。
本发明也提供一种用于本发明的以上其他方面的方法中的抗CD25抗体。
本文中通过术语“包含”来描述的方面及实施方式的范围内可包括其他特征或步骤。也应理解，描述为“包含”的方面及实施方式也描述其中术语“包含”由术语“基本上由……组成”或“由……组成”替换的方面及实施方式。
词组“选自包含……的组”可由词组“选自由……组成的组”替换，且反之亦然，与该等词组在本文中何处出现无关。
也应理解，除非上下文另外要求，否则本申请公开上文所描述的以上方面及实施方式中的任一者与其他方面及实施方式的所有组合。类似地，除非上下文另外要求，否则本申请公开优选及/或任选地存在的特征(单独或与任何其他方面一起)的所有组合。
现将借助于以下实施例及参考附图进一步描述本发明，这些实施例旨在用于帮助本领域普通技术人员实施本发明且不旨在以任何方式限制本发明的范围。
实施例
实施例1
细胞及抗体
Pfeiffer肿瘤细胞(ATCC)(已建立的大B细胞淋巴瘤悬浮细胞株)在含有20％FBS(Gibco)、1XGlutamax(Gibco)、1X非必需氨基酸(Gibco)及1％丙酮酸钠(Gibco)的RPMI1640培养基(Gibco)中培养。EOL-1肿瘤细胞(DSMZ)(已建立的急性骨髓性白血病悬浮细胞株)在含有10％FBS(Gibco)、1XGlutamax(Gibco)、1X非必需氨基酸(Gibco)及1％丙酮酸钠(Gibco)的RPMI 1640培养基(Gibco)中培养。
AML22细胞衍生自AML患者且通过在NSG小鼠中植入来扩增。由于这些患者衍生的细胞不能在体外培养，因此在测定当天将其解冻且直接使用。
通过在iTreg培养基中用Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28(1×106个珠粒/毫升，珠粒与细胞的比率为1:1，Gibco)活化10天来由未经处理的CD4+T细胞分化体外诱导的Treg(iTreg)细胞，该iTreg培养基由补充有以下的X-Vivo 15(Lonza)组成：10％热灭活人类AB血清(Sigma)、1X Glutamax(Gibco)、N-乙酰半胱氨酸(2mg/mL，Sigma)、1％丙酮酸钠(Gibco)、1X HEPES(Gibco)、1X非必需氨基酸(Gibco)、50μM 2-巯基乙醇(Thermo FisherScientific)、普留净(Proleukin)/阿地白介素(Aldesleukin)(300U/mL，Novartis)、10ng/mL重组人类转化生长因子-β1(R&D Systems)及100ng/mL雷帕霉素(rapamycin)(Sigma)。使用人类未经处理的CD4+T细胞分离试剂盒II(Miltenyi Biotec)从人类PBMC分离未经处理的CD4+T细胞。通过人类CD3、CD4、CD25及FoxP3共同表达的流式细胞术分析来确认iTreg的纯度(>90％)。在测定当天将冷冻保存的iTreg解冻且直接使用。
CD25 Mab(也称为RG6292)为使用GlymaxX技术产生的去岩藻糖基化人类IgG1mAb，其为表达CD25的靶细胞赋予增强的ADCC能力。人类IgG1同型对照抗体购自Biolegend。
人类PBMC及NK细胞分离
在Histopaque-1077(Sigma-Aldrich)上使用标准密度-梯度分离，自白血球层(根据赫尔辛基宣言(Declaration of Helsinki)，苏黎世献血中心(Zurich Blood DonationCenter))分离来自健康供体的人类PBMC。使用人类NK细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec)分离NK细胞且在含有10％FCS(Gibco)、1X Glutamax(Gibco)及普留净/阿地白介素(100U/mL，Novartis)的RPMI 1640培养基(Gibco)中活化过夜。
利用流式细胞术读数的ADCC测定
在测定培养基(含有2％FBS(Gibco)及1X Glutamax(Gibco)的RPMI 1640(Gibco))中以2:1的效应细胞与靶细胞的比率(每孔80,000个NK细胞及40,000个靶细胞)将靶细胞(Pfeiffer、EOL-1、AML22、iTreg)与经活化的初级NK细胞混合。以7倍连续稀释物形式将化合物(CD25 Mab或同型对照物)添加至U型底96孔板(TPP)中，其中起始最终浓度为21μg/mL。将测定板以300rpm放置在定轨振荡器上持续5分钟以混合细胞及抗体。在室温下预孵育15分钟之后，在37℃/5％CO2下孵育板持续17小时。
细胞在室温下用稀释于PBS(BD)中的FSV440UV存活率染料染色10分钟。细胞用FACS缓冲液(含有0.1％BSA的PBS)洗涤且在4℃下在FACS缓冲液中用针对人类CD16(3G8)、CD45(HI30)、CD34(8G12)、CD56(5.1H11)、CD3(UCHT1)、CD20(2H7)、CD117(YB5.B8)、CD25(24212)、CD123(9F5)、CD69(FN50)、CD4(A161A1)、CD127(A019D5)的荧光染料缀合抗体染色30分钟。在用FACS缓冲液进行的两个洗涤步骤之后，将细胞固定且在室温下使用FoxP3转录因子染色组(eBioscience)渗透60分钟。对于核内染色，细胞随后在室温下在1X PERM缓冲液中针对人类FoxP3(259D)、Bcl-2(Bcl-2/100)及Ki-67(Ki67)染色45分钟。样品用1X PERM缓冲液洗涤两次且再悬浮于FACS缓冲液中以用于采集。用于流式细胞术的所有抗体均来自Biolegend、BD或R&D Systems。
用5-雷射A5 Symphony仪器(BD)采集样品。用FlowJo v10.6.2及Prism 8(GraphPad software)进行数据分析。
利用发光读数的ADCC测定
在分析法培养基(含有2％FBS(Gibco)及1X Glutamax(Gibco)的RPMI 1640(Gibco))中以2:1的效应细胞与靶细胞的比率(每孔20,000个NK细胞及10,000个靶细胞)将靶细胞(Pfeiffer、EOL-1、AML22)与经活化的初级NK细胞混合。以7倍连续稀释物形式将化合物(CD25 Mab或同型对照物)添加至白色384孔平底组织培养板(Falcon)中，其中起始最终浓度为21μg/mL。将测定板以300rpm放置在定轨振荡器上持续5分钟以混合细胞及抗体。在室温下预孵育15分钟之后，在37℃/5％CO2下孵育板持续16至20小时。
测定板在不加盖的情况下在室温下平衡约15分钟。细胞毒性根据制造商的说明书使用CytoTox-GloTM细胞毒性分析法(Promega)来测量。简言之，以1至4倍稀释度(最终体积为每孔40μl)将经复原的AAF-GloTM试剂添加至各孔中。在室温下孵育测定板持续15至60分钟，随后使用Tecan Spark 10M发光读板器(500ms积分时间)进行发光测量。用Prism 8(GraphPad software)进行数据分析。
通过流式细胞术对CD25密度进行定量
BD quantibriteTMBeads用于估计每细胞结合的抗体(ABC)，如果PE:mAb比率为1:1，则其等效于每细胞的PE分子的数目。如果采用PE缀合的抗人类CD25抗体的单价结合，则CD25分子的数目等效于细胞表面上的PE分子的数目。
细胞分析法样品及珠粒通过相同仪器设定在5-激光Symphony仪器(BD)上获取。用FlowJo v10.6(Tree Star)及Prism 8(GraphPad software)进行流式细胞术数据的分析。根据制造商的说明书确定每个珠粒的Log10 PE分子相对于Log10荧光的线性回归以及每个细胞的PE分子的数目的内插。
在四个表达CD25的靶细胞上对CD25密度进行定量。
结果
为分析CD25 Mab杀伤具有低CD25表达水平的AML细胞的能力，进行抗体依赖性细胞毒性(ADCC)分析法，其比较具有一系列CD25表达水平的靶细胞。使用BD quantibriteTM珠粒来对CD25密度(每个细胞的分子数目)进行定量。如果采用抗体的单价结合，则CD25分子的数目等效于细胞表面上的PE分子的数目。
如图1中所示，iTreg及DLBCL细胞株Pfeiffer的CD25表达水平相对较高，而AML细胞株EOL-1及患者衍生的AML22细胞在其表面上具有较低数目的CD25受体。这些结果在ADCC测定培养基中孵育单独的靶细胞之后17小时获得。
尽管CD25 Mab具有驱动与CD25的结合的亲合力且因此优先触发具有高CD25表达水平的细胞的杀伤(Solomon等人,Nat Cancer(2020)第1(12)卷,第1153-1166页)，但在EOL-1及AML-22作为靶细胞的情况下的CD25 Mab的ADCC能力与CD25高靶细胞的ADCC能力相当。在与CD25 Mab共同孵育17小时之后，NK细胞杀伤超过80％的靶细胞(图2A)，然而在同型对照抗体的情况下未观测到特异性杀伤。在最高同型对照物浓度(21μg/mL)下观测到的EOL-1细胞株杀伤的增加可能归因于非特异性活性。虽然所测试的两种细胞株的EC50值类似(约0.03μg/mL)，但在不存在化合物的情况下的基线杀伤不同。实际上，经活化的NK细胞杀伤了40％至50％的AML-22，相比之下，EOL-1细胞杀伤了20％。AML-22细胞为在体外培养时存活率快速下降的初级细胞且我们假设其可表达使其对NK细胞介导的杀伤更敏感的分子。
还评定在17小时ADCC测定结束时仍存活的靶细胞上的CD25密度(图2B)。发现在高于0.4μg/mL的CD25 Mab浓度下，靶细胞表达每细胞1,000至1,500个CD25分子。此外，CD25表达水平分别为每细胞约800及400个受体的周边及瘤内人类常规CD4及CD8 T细胞似乎并不是由CD25 Mab进行的消耗的目标(数据未示出)。因此，这指示CD25 Mab触发杀伤所需的靶细胞上的CD25表达的阈值可能为每细胞约1,000个受体。由于初级人类AML骨髓样品(CD25+AML母细胞及Treg)中的CD25密度在1,000至4,000的范围内(数据未示出)时，预期发现这些细胞的消耗。
研究在经由抗体Fc部分与CD56dim NK细胞上所表达的FcγRIIIa(CD16)受体的结合进行的靶接合之后，NK细胞上的功能性标记的表达。此NK细胞的亚群表示人类末梢血液中最普遍的群体(占NK细胞的90％)且与CD56brightCD16neg NK细胞亚群(有效ADCC介体)相反。
在与低CD25密度EOL-1及AML-22靶细胞接合之后，观测到NK细胞上CD16的适度下调(图3A)。相比之下，在效应细胞与高CD25密度的Pfeiffer及iTreg靶细胞共同孵育之后，CD16表达以CD25 Mab剂量依赖性方式大幅降低(图3B)。因此，结果指示CD16下调的强度与靶细胞上的CD25密度相关。
另外，NK细胞的功能性可通过活化标记CD69及CD25的上调来测量。在所有所测试的靶细胞中，在用CD25 Mab处理之后，CD69的表达以剂量依赖性方式增加。与AML22靶细胞的高基线杀伤的观测结果类似，CD69基线表达也增加。实际上，当与AML22共同孵育时且在不存在药物化合物的情况下，45-60％的NK细胞表达CD69(图4A)。综合而言，这些结果表明AML22靶细胞表达受体或分泌诱导强NK细胞基线活化程度的因子。另一方面，当与其他三种靶细胞接触时，仅20％的NK细胞在基线处表达CD69，且该表达在CD25 Mab处理之后增加至80％(图4B)。
也观测到NK细胞上CD25的上调，且上调的强度与靶细胞上的CD25密度成比例。如图5A中所示，与低密度CD25+靶细胞(AML22及EOL-1)共同孵育的NK细胞显示CD25表达适度地增加20％。相比之下，当暴露于具有高CD25密度的靶细胞时，多达60％的经CD25 Mab处理的NK细胞表达CD25(图5B)。值得注意的是，尽管CD25表达增加，但NK细胞计数仍不受影响，表明不存在误伤迹象(数据未示出)。
为提高通过流式细胞术获得的结果的可信度，使用四个NK细胞供体及发光读数(CytoTox-GloTM细胞毒性分析法)进行ADCC测定。如图6A中所示，在三种靶细胞(AML22、Pfeiffer、EOL-1)中观测到一致及类似的杀伤活性。由剂量反应曲线计算的EC50值显示在基于流式细胞术与基于发光的ADCC读数之间获得类似结果。举例而言，使用CytoTox-GloTM的EOL-1靶细胞的EC50值为0.035μg/mL(+/-0.011SEM)且通过流式细胞术获得的值为0.030(+/-0.007SEM)μg/mL(图6B)。CD25 Mab对具有每孔1,500至38,000个受体的范围内的CD25密度的靶细胞显示有效杀伤活性(图6C)。由于人类样品中的CD25密度处于此表达范围内(数据未示出)，我们预期AML及DLBCL患者的人类PBMC及肿瘤中的靶细胞的有效杀伤，其限制条件为存在功能性FcR+效应细胞。
这些实验证实CD25+AML及DLBCL细胞的直接杀伤。抗体能够消耗具有广泛范围的CD25表达水平的CD25+恶性细胞。由于人类样品中的表达水平在此范围内且已证实CD25Mab的经由Treg消耗而发挥的间接作用，我们预测CD25 Mab的双重作用模式将与AML及DLBCL的治疗有关。CD25 Mab可消耗抑制性Treg且对AML及DLBCL的CD25+恶性细胞具有直接细胞毒性作用。
实施例2
初级人类样品
AML患者的人类末梢血液单核细胞(PBMC)及骨髓单核细胞(BMMC)购自DiscoveryLife Sciences。在相关机构审查委员会(Institutional Review Board；IRB)或伦理委员会(Ethics Committee)的批准下收集样品。使用标准密度-梯度离心自白血球层(苏黎士献血中心(Zurich Blood Donation Center))分离健康供体(HD)PBMC。所有人类样品均根据赫尔辛基宣言自HD或已提供书面知情同意书的患者收集。
NK细胞分离
使用人类NK细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec)分离NK细胞且在含有10％FCS(Gibco)、1X Glutamax(Gibco)及普留净/阿地白介素(100U/mL，Novartis)的RPMI 1640培养基(Gibco)中活化过夜。
ADCC测定
在测定培养基(含有2％FBS(Gibco)及1X Glutamax(Gibco)的RPMI 1640(Gibco))中以2:1的效应细胞与靶细胞的比率(每孔80,000个NK细胞及40,000个靶细胞)将EOL-1阳性对照细胞株或含有表达CD25的靶细胞的AML患者样品与经活化的初级NK细胞混合。以10μg/mL的浓度将化合物(CD25Mab(RG6292)或同型对照物(人类IgG1同型对照抗体，Biolegend，QA16A12))添加至U型底96孔板(TPP)中。将测定板以300rpm放置在定轨振荡器上持续5分钟以混合细胞及抗体。在室温下预孵育15分钟之后，将样品在37℃/5％CO2下孵育20小时。如以下章节中所描述进行流式细胞术读取。在样品采集之前添加PrecisionCount BeadTM(Biolegend)且基于针对在不存在同种异体效应NK细胞及化合物的情况下的靶细胞数目标准化的绝对计数(每微升的细胞数目)来计算杀伤活性。
结果
已证实CD25 Mab对EOL-1细胞株及AML22细胞的细胞毒性(实施例1)，我们设法评定其对AML患者材料的功能活性。为此目的，我们选择具有最高的CD25+AML细胞频率的四名患者且进行离体ADCC测定。我们证实饱和抗体浓度下的所有样品中的CD25+AML细胞的特异性杀伤(图7(A))。此外，我们评定相同实验配置下的Treg杀伤且发现CD25 Mab处理有效消耗AML及HD Treg两者(图7(B))。综合而言，这些结果提供在使用HD NK细胞的AML患者样品中CD25 Mab的双重作用模式的概念验证。
实施例3
流式细胞术集合设计、染色及采集
我们遵循用于集合设计及最佳验证的最新规范(Liechti等人,2021,Nat Immunol22,1190-1197)。值得注意的是，对所有抗体进行滴定且利用荧光减一(Fluorescence-minus-one；FMO)对照与生物学对照(不具有一种或一组标志物的细胞群体)的组合来验证各集合。
冷冻保存的AML患者及HD样品在含有10％FBS(Gibco)的DMEM/F-12培养基(Gibco)中解冻。细胞与人类TruStain FcX(Biolegend)一起孵育且用稀释于PBS中的Zombie NIR(Biolegend)活力染料染色。接着，细胞用针对表面抗原的荧光团缀合抗体(HLA-DR(G46-6)、CD16(3G8)、CD45(HI30)、CD33(P67.6)、CD45RA(HI100)、CD34(8G12)、CD56(5.1H11)、CD3(UCHT1)、CD19(HIB19)、CD117(YB5.B8)、CD25(24212)、CD123(9F5)、CD69(FN50)、CD4(A161A1)、CD8a(RPA-T8)、CD71(M-A712)、CD127(A019D5)、CD14、CD38(HIT2)、CD235A(HIR2)、CLEC12A(50C1)、PD-1(EH12.1)、TIM3(7D3))在含有FACS缓冲液(含有0.1％BSA的PBS)及光亮染色缓冲液(BD)的染色缓冲液中染色。使用FoxP3转录因子染色组(eBioscience)固定及渗透细胞，且随后在1X PERM缓冲液中针对细胞内抗原(FoxP3(259D)、Bcl-2(Bcl-2/100)及Ki-67(Ki67))进行染色。用5-激光Aurora光谱血细胞计数器(Cytek)采集样品。
通过软件进行预处理步骤(应用补偿矩阵、门控活的单细胞)。单独地检查未混合文件且视需要使用集成软件调整手动溢出补偿。值得注意的是，仅需要轻微修饰。导出通过所有质量控制步骤的FCS文件的事件以通过R进行进一步计算分析。
计算流式细胞术数据分析
我们使用以患者为中心的方法来鉴别CD25+AML集群(cluster)及Treg且分别对各患者应用下文所描述的计算分析工作流。将FCS文件加载至R中且按flowCore R程序包的插图中所描述进行处理。将Logicle转化应用于表达矩阵。目测检查各标记的密度曲线且定义阈值以允许对阳性及阴性表达进行定量，其类似于通过传统手动门控来指定的阳性截止值。
使用统一流形逼近与投影(UMAP)算法作为uwot R程序包的一部分进行降维。在高维空间中通过PhenoGraph(Levine等人,2015,Cell 162,184-197)进行不受监督的分群，且其结果在UMAP图上以彩色重叠图形式显现。基于标记表达手动合并及标注算法产生的集群，以便达成生物学上有意义的细胞群。下游分析在适当时报导细胞丰度、标记表达以及阳性细胞分数。滤出对CD45表达呈阴性的细胞及存在于集合中的所有其他标记(非免疫细胞)以及极小的集群(<0.05％)。
通过手动圈选来验证由计算分析鉴别的CD25+细胞群。用Prism v8.4.2(GraphPadSoftware)生成图式。
结果
FLT3基因中的内生性连续性复制(ITD)存在于约25％的AML患者中，且与不良预后及增加的复发风险相关(Dohner等人,2010,Blood 115,453-474)。
使用AML患者样品的高维流式细胞术分析，我们证实FLT3-ITD突变的存在引起CD25+AML细胞的盛行率的强富集(数据未示出)，如先前由其他研究人员所报导(Angelini等人,2015,Clin Cancer Res 21,3977-3985；Aref等人,2020,Leuk Res Rep 13,100203)。
此外，我们观测到BCL-2在具有不成熟表达型的CD25+AML集群上大量表达(数据未示出)。此发现结果与证实白血病干细胞腔室中的高BCL-2表达的先前报导(Lagadinou等人,2013；Cell Stem Cell 12,329-341，Renders等人,2021,Blood 138,3469-3469)一致。有趣的是，在用低甲基化剂与维奈托克的组合(HMA-VEN)治疗的全部四名患者中检测到CD25+AML集群。
因此，这些结果支持用抗CD25抗体治疗具有FLT3-ITD突变的AML患者。这些结果也支持将抗CD25抗体与例如FLT3抑制剂或BCL-2抑制剂(例如维奈托克)以组合治疗形式用于治疗AML，尤其降低复发的风险。
上述说明中所提及的所有出版物均以引用的方式并入本文中。在不脱离本发明的范围及精神的情况下，所描述的本发明的方法及系统的各种修改及变化将对本领域技术人员显而易见。尽管已结合特定优选实施方式描述本发明，但应理解，所要求保护的本发明不应不当地受限于此类特定实施方式。实际上，对于分子生物学、细胞免疫学或相关领域的技术人员而言显而易见的用于实施本发明的所描述的模式的各种修改旨在在以下权利要求的范围内。
本申请中所提及的序列的概述提供于下表中：
表2：
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Claims (68)
1.一种抗CD25抗体，其用于治疗对象中的急性骨髓性白血病(AML)或弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。
2.根据权利要求1所述的用途的抗CD25抗体，其中相较于在不存在所述抗体的情况下的IL-2信号传导，所述抗CD25抗体抑制小于50％的经由CD25进行的所述IL-2信号传导。
3.根据权利要求2所述的用途的抗CD25抗体，其中相较于在不存在所述抗体的情况下的IL-2信号传导，所述抗CD25抗体抑制小于25％的经由CD25进行的所述IL-2信号传导。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的用途的抗CD25抗体，其中所述抗体选自由以下组成的组：
(a)抗体，其包含：
重链可变区，其包含有包含SEQ ID NO:2-5中的任一者的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:6-11中的任一者氨基酸序列的CDR-H2及包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR-H3，以及
轻链可变区，其包含有包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-L2及包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-L3；
(b)抗体，其包含：
重链可变区，其包含有包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR-H2、包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR-H3，以及
轻链可变区，其包含有包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR-L2及包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR-L3；以及
(c)抗体，其包含：
重链可变区，其包含有包含SEQ ID NO:31-33中的任一者的氨基酸序列的CDR-H1、包含SEQ ID NO:34-38中的任一者的氨基酸序列的CDR-H2及包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的CDR-H3，以及
轻链可变区，其包含有包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的CDR-L1、包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的CDR-L2及包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的CDR-L3。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的用途的抗CD25抗体，其中所述抗体为RG6292。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的用途的抗CD25抗体，其中所述抗体结合于包含选自以下的至少一个序列的表位：SEQ ID NO:1的氨基酸150-158、SEQ ID NO:1的氨基酸176-180、SEQ ID NO:1的氨基酸42-56及SEQ ID NO:1的氨基酸74-84。
7.根据权利要求6所述的用途的抗CD25抗体，其中所述抗体结合于包含SEQ ID NO:1的氨基酸70-84的表位。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的用途的抗CD25抗体，其中所述抗体杀伤癌细胞、Treg细胞、AML母细胞及/或PMBC细胞。
9.根据权利要求8所述的用途的抗CD25抗体，其中所述抗体杀伤具有每细胞大于约900个CD25分子的CD25表达水平的Treg细胞及母细胞。
10.根据权利要求9所述的用途的抗CD25抗体，其中所述抗体杀伤具有每细胞大于约1000个CD25分子的CD25表达水平的Treg细胞及母细胞。
11.根据权利要求10所述的用途的抗CD25抗体，其中所述抗体杀伤具有在每细胞约1000个至约40000个CD25分子的范围内的CD25表达水平的Treg细胞及母细胞。
12.根据权利要求11所述的用途的抗CD25抗体，其中所述抗体杀伤具有在每细胞约1000个至约5000个CD25分子的范围内的CD25表达水平的Treg细胞及母细胞。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的用途的抗CD25抗体，其中所述抗体诱导ADCC活性。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的用途的抗CD25抗体，其中所述抗体为单克隆抗体。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的用途的抗CD25抗体，其中所述抗体为IgG抗体。
16.根据权利要求15所述的抗CD25抗体，其中所述抗体为IgG1抗体。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的用途的抗CD25抗体，其中所述抗体为单特异性抗体。
18.根据权利要求17所述的抗CD25抗体，其中所述抗体为二价单特异性抗体。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的用途的抗CD25抗体，其中所述抗体为去岩藻糖基化。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的用途的抗CD25抗体，其中所述抗体为人类或人源化抗体。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的用途的抗CD25抗体，其中当所述抗体及NK细胞与每细胞表达900至5000个CD25分子的细胞共同孵育时，所述抗体诱导NK细胞上的CD16表达减少至多25％。
22.根据权利要求21所述的用途的抗CD25抗体，其中所述NK细胞为CD56dim NK细胞。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的用途的抗CD25抗体，其中所述抗体不与其他治疗剂缀合。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的用途的抗CD25抗体，其中所述抗体与一种或多种其他治疗剂组合施用。
25.根据权利要求24所述的用途的抗CD25抗体，其中所述一种或多种其他治疗剂选自免疫检查点抑制剂、癌症疫苗、FLT3抑制剂、BCL-2抑制剂、IDH抑制剂、低甲基化剂、蒽环霉素及其组合。
26.根据权利要求25所述的用途的抗CD25抗体，其中所述免疫检查点抑制剂为PD-1拮抗剂。
27.根据权利要求26所述的用途的抗CD25抗体，其中所述PD-1拮抗剂为抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体。
28.根据权利要求25所述的用途的抗CD25抗体，其中所述抗体与BCL-2抑制剂组合使用。
29.根据权利要求28所述的用途的抗CD25抗体，其中所述BCL-2抑制剂为维奈托克。
30.根据权利要求25所述的用途的抗CD25抗体，其中所述低甲基化剂为阿扎胞苷。
31.根据权利要求25所述的用途的抗CD25抗体，其中所述一种或多种其他治疗剂为FLT3抑制剂。
32.根据权利要求25所述的用途的抗CD25抗体，其中所述抗体与BCL-2抑制剂及低甲基化剂组合使用。
33.根据权利要求1至23中任一项所述的用途的抗CD25抗体，其中所述抗体以单一疗法形式使用。
34.根据权利要求1至33中任一项所述的用途的抗CD25抗体，其中来自所述对象的肿瘤细胞上的CD25表达水平为每细胞至少约900个CD25分子。
35.根据权利要求1至35中任一项所述的抗CD25抗体，其中来自所述对象的肿瘤细胞上的CD25表达水平在每细胞约900个至约5000个CD25分子的范围内。
36.一种如权利要求1至23中任一项所定义的抗CD25抗体与一种或多种其他治疗剂的组合，所述组合用于治疗急性骨髓性白血病或弥漫性大B细胞淋巴瘤，其中所述抗CD25抗体及所述其他治疗剂用于独立、同时或依序施用。
37.根据权利要求36所述的用途的组合，其中所述一种或多种其他治疗剂如权利要求25至32中任一项所定义。
38.一种治疗对象中的急性骨髓性白血病(AML)或弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)的方法，其包括向所述对象施用有效量的抗CD25抗体。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述抗体如权利要求1至23中任一项所定义。
40.根据权利要求38或权利要求39所述的方法，其中所述抗CD25抗体以单一疗法形式施用。
41.根据权利要求38或39所述的方法，其中所述方法进一步包含施用一种或多种其他治疗剂，例如权利要求25至32中任一项所定义的治疗剂。
42.根据权利要求38至41中任一项所述的方法，其中来自所述对象的肿瘤细胞上的CD25表达水平为每细胞至少约900个CD25分子。
43.根据权利要求42所述的方法，其中来自所述对象的肿瘤细胞上的CD25表达水平在每细胞约900个至约5000个CD25分子的范围内。
44.抗CD25抗体用于制造用以治疗急性骨髓性白血病或弥漫性大B细胞淋巴瘤的药剂的用途。
45.根据权利要求44所述的用途，其中所述抗体如权利要求1至23中任一项所定义。
46.根据权利要求44或权利要求45所述的用途，其中所述抗CD25抗体以单一疗法形式使用。
47.根据权利要求44或45所述的用途，其中所述用途与一种或多种其他治疗剂组合，例如，如权利要求25至32中任一项所定义的治疗剂。
48.抗CD25抗体与其他治疗剂的组合用于制造用以治疗急性骨髓性白血病或弥漫性大B细胞淋巴瘤的药剂的用途。
49.根据权利要求48所述的用途，其中所述抗体如权利要求1至23中任一项所定义。
50.根据权利要求48或49所述的用途，其中所述其他治疗剂如权利要求25至32中任一项所定义。
51.一种选择用抗CD25抗体治疗的患有急性骨髓性白血病的患者的方法，所述方法包含测定来自所述患者的样品中的靶细胞上的CD25的表达水平，其中如果所述细胞具有大于每细胞约900个CD25分子的表达水平，则所述患者适合于用所述抗体治疗。
52.根据权利要求51的方法，其中所述样品为来自所述患者的骨髓样品。
53.根据权利要求51或52中任一项所述的方法，其中所述靶细胞为母细胞及/或Treg细胞。
54.根据权利要求51至53中任一项所述的方法，其中所述CD25的表达水平通过流式细胞术测定。
55.根据权利要求51至54中任一项所述的方法，其进一步包含如果确定所述患者具有大于每细胞900个CD25分子的表达水平，则向所述患者施用所述抗CD25抗体。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述抗CD25抗体如权利要求1至23中任一项所定义。
57.一种选择用抗CD25抗体治疗的患有AML的患者的方法，所述方法包含确定来自所述患者的样品中存在或不存在FLT3-ITD突变，其中如果所述样品中存在所述突变，则所述患者适合于用所述抗体治疗。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述方法进一步包含如果确定所述患者具有FLT3-ITD突变，则向所述患者施用所述抗CD25抗体。
59.一种预测AML患者对用抗CD25抗体治疗的反应的方法，所述方法包含确定来自所述患者的样品中存在或不存在FLT3-ITD突变，其中所述样品中存在所述突变则指示患者将对用所述抗CD25抗体治疗起反应。
60.一种治疗对象中的急性骨髓性白血病(AML)的方法，其包括向所述对象施用有效量的抗CD25抗体，其中所述对象包含FLT3-ITD突变的存在。
61.根据权利要求60所述的方法，其中所述方法进一步包含确定来自患有AML的患者的样品中存在FLT3-ITD突变。
62.根据权利要求57至59或61中任一项所述的方法，其中所述样品为来自所述患者的血液或骨髓样品。
63.根据权利要求57至59或61至62中任一项所述的方法，其中所述突变的存在或不存在通过选自DNA测序及突变筛选技术的组中的方法确定。
64.一种预防AML患者中的复发或降低其风险的方法，所述方法包含向所述患者施用抗CD25抗体。
65.根据权利要求64所述的方法，其中所述方法进一步包含施用一种或多种其他治疗剂。
66.根据权利要求65所述的方法，其中所述一种或多种治疗剂如权利要求25至32中任一项所定义。
67.一种治疗已经历BCL-2抑制剂-低甲基化剂组合治疗的患者中的AML的方法，所述方法包含向所述患者施用抗CD25抗体。
68.根据权利要求57至67中任一项所述的方法，其中所述抗CD25抗体如权利要求1至23中任一项所定义。
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