CN117915951A - 抗protac抗体及复合物 - Google Patents

抗protac抗体及复合物 Download PDF

Info

Publication number
CN117915951A
CN117915951A CN202280059032.1A CN202280059032A CN117915951A CN 117915951 A CN117915951 A CN 117915951A CN 202280059032 A CN202280059032 A CN 202280059032A CN 117915951 A CN117915951 A CN 117915951A
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
protac
binding
cells
gne987
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202280059032.1A
Other languages
English (en)
Inventor
M·里克尔
S·耶格
N·拉舍
D·肯宁
C·施勒特尔
H·施奈德
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Merck Patent GmbH
Original Assignee
Merck Patent GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Merck Patent GmbH filed Critical Merck Patent GmbH
Publication of CN117915951A publication Critical patent/CN117915951A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39583—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials not provided for elsewhere, e.g. haptens, coenzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/55—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound the modifying agent being also a pharmacologically or therapeutically active agent, i.e. the entire conjugate being a codrug, i.e. a dimer, oligomer or polymer of pharmacologically or therapeutically active compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6875—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody being a hybrid immunoglobulin
    • A61K47/6879—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody being a hybrid immunoglobulin the immunoglobulin having two or more different antigen-binding sites, e.g. bispecific or multispecific immunoglobulin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明涉及单特异性或双特异性抗体或其抗体片段或融合蛋白，其能够与蛋白水解靶向嵌合体(PROTAC)的VHL配体降解部分(降解决定子)结合并且任选地与靶蛋白结合。本发明还涉及此类抗体或其抗体片段或融合蛋白和PROTACS的复合物(PAX)，以及它们的制备方法，及其各自的医疗与非医疗用途。

Description

抗PROTAC抗体及复合物
1技术领域
本发明涉及单特异性或双特异性抗体或其抗体片段或融合蛋白，其能够与蛋白水解靶向嵌合体(PROTAC)的VHL配体降解部分(降解决定子(degron))结合，并且任选地与靶蛋白结合。本发明还涉及此类抗体或其抗体片段或融合蛋白与PROTACS的复合物(PAX)，以及它们的制备方法，及其各自的医疗与非医疗用途。
2背景技术
2.1不需要的蛋白质–PROTAC的降解
细胞维持和正常功能需要控制细胞蛋白质的降解。例如，调节性蛋白质的降解触发细胞周期中的事件，例如DNA复制、染色体分离等。因此，蛋白质的这种降解对细胞的增殖、分化和死亡具有影响。虽然蛋白质抑制剂可以阻断或降低细胞中的蛋白质活性，但蛋白质降解是降低活性或完全去除靶蛋白的另一种可能性。因此，利用细胞的蛋白质降解途径可以提供一种降低或去除蛋白质活性的方法。细胞的主要降解途径之一被称为泛素-蛋白酶体系统。在该系统中，蛋白质被E3泛素连接酶标记为蛋白酶体降解，所述连接酶与蛋白质结合并将泛素分子转移到蛋白质上。E3泛素连接酶是包括E1和E2泛素连接酶的途径的一部分，所述连接酶使泛素可用于E3泛素连接酶催化的向蛋白质的转移。为利用这种降解途径用于所希望的蛋白质，已经开发了PROTAC。PROTAC可以使E3泛素连接酶与所希望的蛋白质接近，从而使其泛素化并标记为降解。PROTAC是异双官能分子，包含与E3泛素连接酶结合的一个结构基序和与希望降解的蛋白质结合的另一个基序。这些基团通常用接头(linker)连接。
在约600种E3连接酶中仅一小部分已成功应用于靶向的蛋白质降解，即MDM2、凋亡蛋白抑制物(IAP)、HECT和RBR家族成员、RNF4、DCAF16、EAP1-Nrf2、Von-Hippel-Lindau(VHL)和Cereblon(CRBN)，其中最后两种发挥了最大作用。VHL是一种已确立的E3连接酶底物受体，其紧密结合羟基化的HIF-1α。基于HIF-1α的羟脯氨酰结合位点周围的肽结构，衍生出更多的药物类小分子配体，这些配体已经成功地应用于产生嵌合的蛋白质降解物(Shanique,A.和Crews,C.,J.Biol.Chem 296(2021)100647)。
广泛应用的配体是VH032(图1A)，一种以强亲和力与VHL结合的VHL配体(Galdeano,C.等人J.Med.Chem.57(2014)8657-8663)。它为开发额外的VHL配体(如VH298)铺平了道路(Soares,P.等人J.Med.Chem.61(2018)599-618)，因为VH032容忍(tolerate)取代，尤其是乙酰基基团的取代(Ciulli,A和Ishida,T.SLAS 7Discovery 26(2021)484-502)。
随着沙利度胺(thalidomide)作为CRBN配体的作用模式的阐明，CRBN变得可用于在靶向的蛋白质降解中应用。各种靶蛋白已经通过CRBN的参与而降解(Shanique,A.和Crews,C.,J.Biol.Chem.296(2021)100647)。
通过使用嵌合降解物招募前面提及的E3连接酶，已经实现了很多蛋白质的靶向的蛋白降解。实例包括：CRBN、VHL、Tau、DHODH、FKBP12、AR、ERα、RAR、CRABP-II、ALK、CK2、CDK8和CDK9、BTK、PI3K、TBK1、FLT3、BTK、RTK例如EGFR、HER2和cMET、ERK1和ERK2、BCR-ABL、RIPK2、BCL6、PCAF/GCN5、BRD4和HDAC6、TRIM24、SIRT2、BRD9(Scheepstra,M.,Comput.Struct.Biotec.17(2019)160–176；US2018/0125821；US 2015/0291562；US2017/0065719 A1)。
综合来看，对于组装异双官能的降解物存在许多策略。在一个实例(US2017/0065719 A1)中，降解物主要通过活化的羧基官能团与酰胺的缩合反应合成。因此，将VHL配体VH032及其衍生物与含有活化的羧酸的接头结构反应。所述接头结构携带末端胺，所述末端胺在脱保护后与蛋白质结合剂(binder)的活化的羧酸官能团反应。然而，该合成策略高度依赖于必须进行修饰的配体的化学性质。在另一实例中，使用炔丙基溴化物或炔丙基甲苯磺酸酯的烷基化反应来修饰7-羟基-沙利度胺的羟基基团。所得化合物携带点击化学手柄，其随后用于通过铜(I)催化的叠氮化物炔烃环加成反应获得整个降解物(Wurz,R.P.等人J.Med.Chem.61(2018)453-461)。
降解雄激素受体的ARV-110和降解雌激素受体的ARV-471(Arvinas,Inc.)是临床开发中最前沿的两种PROTAC，最近已进入II期。然而，几种异双官能降解物已经到达了针对多种靶标的I期临床开发，例如BCL-XL的PROTAC DT2216降解物(Dialectic,Inc.)和IRAK4降解物KT474(Kymera/Sanofi S.A.)。
尽管许多报道的PROTAC是高效的降解物，但它们通常不是组织特异性的，因为它们利用了具有广泛表达谱的E3连接酶。组织特异性降解可以优化治疗窗口，并最大限度地减少广谱PROTAC的副作用，增加其作为药物或化学工具的潜力。然而，迄今为止，利用受限的组织分布的E3连接酶的PROTAC还没有报道，并且开发新的E3连接酶配体仍然是一个重大的挑战(Maneiro,M.等人ACS Chemical Biology 5(2020)1306–1312)。PROTAC开发中的另一个挑战是它们在小鼠中的循环半衰期很短，只有几个小时(Pillow,T.H.等人,ChemMedChem 15(2020)17–25；Burslem,G.M.等人,J.Am.Chem.Soc.140(2018)16428-16432)。
此外，PROTAC的功效经常因其低渗透性而受到阻碍(Klein,V.G.等人,ACSMed.Chem.Lett.11(2020)1732–1738)，这限制了其进入细胞和诱导蛋白质降解的能力。
因此，本领域存在对于增强并将PROTAC靶向递送到含有待降解的蛋白质靶标的细胞的持续需求。
为满足这一需求，已经尝试通过使用类似于抗体-药物缀合物(ADC)的共价抗体-PROTAC缀合物来增强PROTAC向特定细胞的递送。此类构建体利用了抗体赋予的细胞靶标选择性结合和增强的药代动力学。
2.2靶向药物递送–抗体-药物缀合物(ADC)
ADC的基本概念相当简单。前提条件是允许在分子基础上鉴别例如癌细胞和健康细胞的抗原。例如，这可以是某种细胞表面受体，其在肿瘤细胞中被严重上调。针对这种抗原的抗体可以作为高效的细胞毒性剂即“有效载荷(payload)”的靶向性媒介物。为形成ADC，细胞毒性剂需要经由在循环中稳定的接头共价连接到抗体上，以避免有效载荷的过早释放。在施用后，ADC在患者全身分布，并与肿瘤细胞表面的抗原结合。然后抗体-抗原复合物被细胞内化，并通过内源性细胞内运输途径引导至溶酶体。在到达溶酶体后，ADC被降解，从而释放其有毒物质。然后，游离毒素可以与其细胞内靶标结合，并因此诱导癌细胞的细胞凋亡和杀伤。在一些情况下，毒素可以离开癌细胞，并同样作用于相邻的理想的癌细胞。这个过程被称为旁观者效应，并且其程度取决于所应用的接头和药物。另一方面，健康细胞基本上得以幸免，因为抗体只应当结合并将毒素递送给表达该抗原的癌细胞。
已被批准用于治疗癌症的ADC包括HER2靶向性DM1缀合物Kadcyla、Adcetris、携带微管蛋白抑制剂MMAE的抗CD30 ADC以及CD33靶向性卡奇霉素ADC Mylotarg。
ADC的设计是一项多学科的工作，因为它们由生物技术生产的生物分子和化学合成的高效力小分子药物组成。这两个实体都是单独产生的，然后结合成高度复杂的杂合分子。因此，从单个组分的设计到缀合物的最终生产，ADC开发的整个过程都伴随着重大的技术挑战。根据术语“抗体-药物缀合物”，ADC的主要组分是药物和抗体。然而，为了偶联这些实体，需要将mAb与药物连接的接头。谨慎选择这种接头，同时考虑mAb和有效载荷，对最终ADC的功效和安全性至关重要。在血流中，接头应尽可能稳定，以防止有效载荷过早释放，否则可能导致全身的脱靶毒性。但是，一旦ADC已经到达靶细胞，有效载荷就必须是有活性的，不受所连接的接头的阻碍。另外，接头的长度和化学性质可以对ADC的药代动力学和药效学产生强烈影响。ADC使用的接头主要分类为不可切割的和可切割的。不可切割接头在循环和细胞中都是稳定的，而可切割接头被设计为通过靶细胞内的特定细胞内机制降解。从上文可以清楚地看出，为给定的ADC设计适合的接头本身就是一个挑战。
虽然ADC的所有三个部分，即抗体、接头和细胞毒性的有效载荷决定了最终缀合物的关键特性，但一个同样重要的参数是这些组分的组装方式。接头和有效载荷通过化学合成产生，它们要么作为直接与mAb缀合的组合的接头-有效载荷结构，要么作为在ADC生成过程中先后组装的单独组分。在这两种情况下，小分子都需要与mAb缀合，且不会损害其有利特性，这是一个重大的技术挑战。ADC生成过程中需要控制的主要参数是与每个抗体缀合的接头-药物的数量，称为药物/抗体比率(DAR)，以及该结构连接在抗体表面的位置(缀合位点)。这两个参数都可以决定性地影响ADC的若干种特性，包括其稳定性和药代动力学行为，并最终还影响其毒性和功效属性。一方面，用于ADC的弹头(warhead)大多数是疏水性的，并且增加的DAR可以显著地改变整体疏水性，并严重干扰最终缀合物的蛋白质稳定性。另一方面，根据其效力，需要一定量的药物才能达到足够活性的ADC。然而，不仅是DAR，而且缀合位点和化学作用都严重影响这些参数。例如，几项研究已经表明，某些位点对具有挑战性的有效载荷示出优异的容忍性，并通过在抗体表面提供有利微环境和空间屏蔽，产生比其他位点更稳定的缀合物。因此，找到这些组分即接头、药物和mAb的有利组合以及合适的DAR、缀合策略和缀合位点是开发有效和安全的治疗剂的关键(Dickgiesser,S.等人,Introduction to Antibody Engineering,Springer(2021)189-214)。
2.3具有PROTAC作为有效载荷的ADC
一种特殊类型的ADC是降解物(degrader)ADC，其中药物由蛋白质降解物代表。这里，需要将接头连接到降解物上，以促进与抗体的缀合。除了选择正确的接头，在降解物上确认合适的连接位点也至关重要，无论是在弹头、降解决定子还是接头部分中都是如此。一些出版物已经证明了这一概念的可行性。
一个实例是雌激素受体α(ERα)降解物，所述降解物经由与工程化的半胱氨酸缀合而共价连接至HER2靶向性抗体上。因此，降解物必须在ERα靶向性部分或XIAP结合剂上用蛋白酶可切割接头进行化学修饰。在接头连接在弹头上的降解物ADC的情况下，在HER2过表达的MCF7细胞中实现了ERα降解，而在亲代MCF7细胞中则观察到显著更少的降解。测试了其他的接头选择。VHL配体的羟脯氨酰残基的羟基基团用碳酸酯接头修饰，所述接头经由活化的二硫化物与HER2抗体缀合。此外，将含有二磷酸酯的接头连接至VHL配体的羟脯氨酰残基。在这两种情况下，该缀合物都缺乏选择性(Dragovich,P.S.等人,Bioorg.Med.Chem.Lett.30(2020)126907)。
除了ERα作为降解物ADC的细胞内PROTAC靶标外，BRD4也作为靶蛋白进行了深入研究。一个实例显示了BRD4降解物选择性递送至HER2阳性细胞，导致经由HER2靶向性抗体的BRD4降解。经由半胱氨酸缀合和点击化学的组合来缀合降解物，使用VHL配体的羟脯氨酰残基上的酸性可切割酯键(Maneiro,M.等人ACS Chemical Biology 5(2020)1306–1312)。在另一个实例中，BRD4降解物GNE987与CLL1靶向性抗体的工程化半胱氨酸缀合，达到DAR为6。因此，用包含用于缀合的活化二硫化物的酸可切割的碳酸酯接头修饰PROTAC。该缀合物在小鼠异种移植物模型中显著改善了PROTAC的药代动力学分布和体内功效，同时具有良好的耐受性(Pillow,T.H.等人,ChemMedChem 15(2020)17–25)。
该小组在另外两份出版物中对BRD4降解物缀合物进行了深入研究(Dragovich,P.S.等人,J.Med.Chem.64(2021)2534–2575；Dragovich,P.S.等人,J.Med.Chem.64(2021)2576–2607)。已经基于STEAP1和HER2抗体制备了BRD4降解物的多种缀合物。该工作的重点是研究连接ADC和降解物的理想接头，以及该接头在靶蛋白配体、E3连接酶配体上或在靶蛋白配体和E3连接糖配体之间的接头上的理想连接点。因此，评估了若干种靶蛋白配体，包括掺入了用于接头连接的合适化学手柄的JQ1衍生物。在靶蛋白和E3连接酶配体之间的接头的情况下，测试了多种变体，包括PEG和脂肪族链，以及具有掺入的用于接头连接的化学手柄的版本。此外，对VHL配体的衍生物进行了评估，所述衍生物经化学修饰以允许接头连接。该缀合物能够诱导受体选择性的蛋白质降解，但仅有几种显示出选择性细胞毒性。这些出版物强调了嵌合的降解物与抗体的缀合的复杂性。对于提及的降解物缀合物，已经提交了两个专利申请(WO 2020/086858；WO 2017/201449)。
除此之外，在靶向HER2的专利文献中还发现了BRD4降解物缀合物(WO 2019/140003A1)，并且研究了BRD4和PLK1的双降解物作为CD33靶向性抗体的有效载荷(WO 2020/073930A1)。此外，TGFβR2降解物已与HER2和TROP2抗体缀合，用于靶向递送(WO2018/227018A1；WO2018/227023A1)。
2.4向靶细胞递送药物的非共价方法
已经描述了用于非共价的药物递送的多种方法，其中药物总是需要与配体或半抗原化学连接，所述配体或半抗原与抗体结合或可以被抗体结合。
例如，吉西他滨用亲和性配体4-巯基乙基吡啶进行化学修饰，所述配体与抗体上的几个位点结合。通过将抗体与经亲和性配体修饰的吉西他滨混合而组装了ADC，所述ADC能够诱导对靶标阳性的癌细胞的选择性毒性并且具有与未修饰的抗体相当的药代动力学性质。在小鼠异种移植物模型中观察到吉西他滨ADC的肿瘤消退作用(Gupta,N.等人,Nat.Biomed.Eng.3(2019)917–929)。
此外，一些方法使用半抗原地高辛来修饰小分子例如抗癌药物多柔比星或荧光团Cy5、siRNA、蛋白质如GFP以及皂草素(Saporin)，以促进细胞的药物递送(Metz,S.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.108(2011)8194–8199；Schneider,B.等人,Mol.Ther.-NucleicAcids 1(2012)e46；Mayer,K.等人,Int.J.Mol.Sci.16,(2015)27497–27507)。
此外，可以使用结合EGFR并同时结合可替宁的双特异性抗体，向EGFR阳性细胞递送细胞毒性药物倍癌霉素(Duocarymcin)DM。为了向靶细胞递送倍癌霉素DM，合成了C-和N-末端携带可替宁的肽，并且将4个倍癌霉素DM分子经由可切割的缬氨酸-瓜氨酸接头连接到该肽上。该构建体在表达EGFR的A549小鼠异种移植模型中进行了测试，其超过了同种型对照构建体的抗肿瘤作用(Jin,J.等人,Exp.Mol.Med.50(2018),67)。类似的构建体也用于向mPDGFRβ-阳性细胞递送倍癌霉素(Kim,S.等人,Methods 154(2019)125–135)。
其他各种出版物详细阐述了使用半抗原修饰的化合物和抗-半抗原抗体进行复合的概念(Yu,B.等人,Angew.Chemie-Int.Ed.58(2019)2005–2010；Kim,H.等人,Mol.Pharm.16(2019)165–172；Kilian,T.等人,Nucleic Acids Res.,47(2019)e55)。
一种类似的方法使用Tubulysin A与Fc结合蛋白(例如蛋白A或G)的共价缀合，从而与抗体组装复合物，用于靶向药物递送(Maso,K.等人,Eur J Pharm Biopharm 142(2019)49-60)。
虽然有许多使用半抗原化的化合物以及抗-半抗原抗体或与抗体结合的亲和性配体/蛋白的非共价药物递送的实例，但使用未经修饰的药物进行非共价药物递送的实例极少。
尽管进行了所有这些尝试，但仍然需要良好限定的、有效且特异性的用于PROTACS的递送平台，其可广泛用于在靶标处有效释放有效载荷。
3发明内容
本发明涉及单特异性或双特异性抗体或其抗体片段或融合蛋白，其能够与蛋白水解靶向嵌合体(PROTAC)的VHL配体降解决定子(degron)结合并且在双特异性抗体的情况下与靶蛋白结合。本发明还涉及此类抗体或其抗体片段或融合蛋白与PROTACS的复合物，它们的制备方法及其各自的医疗与非医疗用途。此类PROTAC-抗体复合物在下文中被称为“PAX”。
在一个实施方案中，靶蛋白是靶细胞上的细胞表面抗原，其中向所述靶细胞递送PROTAC。在递送后，PROTAC被释放到靶细胞的胞质溶胶中，在那里它与待降解的靶蛋白结合，从而通过细胞的蛋白酶体启动降解。
与共价连接的抗体药物缀合物(ADC)相比，PAX的优点是不需要特定的制造步骤以将PROTAC连接到抗体。另一个优点是，一旦PAX已经释放了其PROTAC有效载荷，它就可以立即进行新的PROTAC结合和靶向递送循环，例如已经离开了其先前已被递送到的靶细胞的PROTAC分子的循环。
另一优点是改善的药代动力学性质，因为预期PROTAC在PAX中的复合可在患者体内延长PROTAC的半衰期。由于PROTAC与抗-PROTAC抗体的复合，该复合物的稳定性决定PROTAC的清除率。只要PROTAC与抗体复合，由于抗体的高分子量，它就不能被肾清除。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体包含：a)由两条全长抗体重链和两条全长抗体轻链组成的单特异性二价抗体，其中每条链仅包含一个可变结构域；b)两个单特异性单价单链抗体(scFv)，每个抗体由抗体重链可变结构域、抗体轻链可变结构域和在所述抗体重链可变结构域与所述抗体轻链可变结构域之间的单链-接头组成；任选地c)(b)中的scFv的两个或更多个额外的拷贝，其与所述scFv融合，以及任选地d)连接a)、b)和/或c)的肽接头。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体包含：a)由两条全长抗体重链和两条全长抗体轻链组成的单特异性二价抗体，其中每条链仅包含一个可变结构域；b)两个重链单结构域(VHH)抗体，各自由一个抗体可变结构域组成；任选地c)(b)中VHH的两个或更多个额外的拷贝，其与所述VHH融合；和任选地d)连接a)、b)和/或c)的肽接头。
本领域技术人员能够理解，所述肽接头的存在或其长度对本发明的性能没有影响。然而，在一个实施方案中，所述肽接头由1-50个氨基酸，优选1-35个氨基酸、更优选3-20个氨基酸、并且甚至更优选12-18个氨基酸，例如15个氨基酸组成。
在一个实施方案中，所述肽接头将抗体重链和/或轻链的C末端与scFv或VHH的N末端连接。
在一个实施方案中，所述scFv或VHH融合至抗体重链的C末端。
在一个实施方案中，所述抗体不包含scFv或VHH的额外拷贝。
在一个实施方案中，所述单特异性二价抗体的可变区与靶蛋白结合，并且scFv或VHH与PROTAC结合。
在备选的实施方案中，所述单特异性二价抗体的可变区与PROTAC结合，并且scFv或VHH与靶蛋白结合。
在一个实施方案中，所述VHL配体是VH032或其衍生物。
在一个实施方案中，所述双特异性抗体的特征在于靶蛋白是细胞表面抗原，例如肿瘤抗原。在优选的实施方案中，靶蛋白是HER2、CD33、CLL1、EGFR、CD19、CD20、CD22、B7H3(CD276)、CD30、CD37、CEACAM5、cMET、MUC1、ROR1、CLDN18.2、TROP2、BCMA、CD25、CD70、CD74、CD79b、TROP2、cMET、STEAP1、NaPi2b、PSMA、整联蛋白α-V、FRα、MUC16、间皮素、CEACAM5、CanAg–MUC1糖型、EpCAM、HER3或TNC。在更优选的实施方案中，靶蛋白是HER2、CD33、CLL1或EGFR。
然而，本领域技术人员理解，本发明将与任何靶蛋白一起工作，所述靶蛋白建立了与患者体内存在的任何细胞相比的用于靶向的PROTAC递送的细胞子集。
本发明的另一个方面是用于治疗易受某种靶蛋白降解影响的疾病的方法，其中向有需要的患者施用PAX。
可以设想，本文公开的PAX可用于治疗多种疾病或病症。示例性的过度增殖性病症包括良性或恶性实体瘤和血液学病症，例如白血病和淋巴系统恶性肿瘤。其他病症包括神经元的、神经胶质的、星形细胞的、下丘脑的、腺的、巨噬细胞的、上皮的、基质的、囊胚腔的、炎症性的、血管生成的和免疫学的病症(包括自身免疫性病症)。
本发明的另一个方面是包含本发明的PAX的药物组合物。在另一个方面，所述药物组合物用于靶向癌症疗法。
在其他方面，本发明的抗体用于检测和/或定量PROTAC，或用于纯化目的PROTAC(例如，从制造过程的杂质/副产物中纯化)。
4附图说明
图1：VHL配体VH032和衍生物的化学结构。(A)VH032的结构。(B)基于VH032的VHL配体的马库什结构。(C)表示用于将基于VH032的降解决定子连接到不同弹头的接头的不同出口载体(exit vector)(R1、R2、R3)的示意图，示例性地显示了MZ1、AT1和ACBl1弹头。MIC2抗体容忍出口载体R1和R2，导致结合PROTAC MZ1和PROTAC AT1。
图2：针对细胞表面抗原和PROTAC的双特异性融合蛋白的氨基酸序列。粗体：抗PROTAC抗体MIC2的序列，其中对CDR序列加下划线；斜体：接头序列；加下划线的：抗体片段序列(抗EGFR VHH序列或抗-HER2 scFv。
图3：根据本发明的一系列可能的BsAb变体的图形描绘。
图4：基于VH032的半抗原的化学结构。
图5：来自MALDI-MS测量的cBSA和huFc和相应单独半抗原的半抗原与载体蛋白质比率。
图6：用于杂交瘤筛选以鉴定抗VH032抗体的研究计划。
图7：确定亲和力的测定原理。A)MIC2固定在SPR芯片上。分析物流过抗体并被捕获。捕获PROTAC后，改变缓冲液，并且PROTAC可以再次解离。B)PROTAC与抗体的结合被观察为信号的增加，而解离导致信号的减少。这示例性地显示了MIC2与PROTAC MZ1的结合。
图8(a)和(b)：在SPR测定中测试结合的基于VH032的PROTAC。
图9：双特异性抗体aEGFRxMIC2、aHER2xMIC2与亲本抗体MIC2相比对若干种PROTAC的结合评估。亲和力参数分为结合速率和解离速率以及亲和力。
图10：经由SE-HPLC分析的载荷依赖性复合。随着理论上载荷的增加，峰值分布从未复合的抗体(0％载荷)(左侧)、半载荷的(50％载荷；抗体:PROTAC摩尔比＝1:1)抗体的峰向全载荷的(100％载荷；抗体:PROTAC摩尔比＝1:2)抗体的峰移动。
图11：未经纯化的和经纯化的aEGFRxMIC2+GNE987复合物的SE-HPLC曲线。紫色：未经纯化的样品；蓝绿色：脱盐的样品。
图12：未经纯化的和经纯化的aEGFRxMIC2+GNE987复合物的峰值分布。
图13：aEGFRxMIC2+GNE987复合物随时间的峰值分布。
图14：接头修饰的GNE987的化学结构。
图15：BRD4水平的示例性荧光图像。较高的绿色荧光与较高的BRD4丰度相关。当未处理的细胞具有最强荧光时，用4nM GNE987、靶向EGFR的C225-L328C-GNE987和装载GNE987的aEGFRxMIC2处理的细胞荧光减弱。在用4nM装载GNE987的非结合的aHER2xMIC2处理时，与靶向EGFR的复合物相比荧光增强。绿色荧光以灰色阴影描述。
图16：BRD4水平定量。A)在整个研究的浓度范围内，GNE987、C225-L328C-GNE987和aEGFRxMIC2+GNE987对BRD4水平具有相当的作用，而aHER2xMIC2+GNE987降解BRD4的程度较小。B)在所有分析物为4nM浓度下诱导的BRD4降解。
图17：aEGFRxMIC2+GNE987和对照的剂量反应曲线图。将测试化合物的连续稀释液添加至MDAMB468细胞，并且在3天孵育后评估每种单独化合物对细胞活力的影响。当靶向EGFR的aEGFRxMIC2+GNE987在50％(1:1)载荷时与基准C225-L328C-GNE987和GNE987具有相当的效力时，非结合的对照MIC2+GNE987和aHER2xMIC2+GNE987在50％(1:1)载荷时具有降低的效力。
图18：aEGFRxMIC2+GNE987和对照的剂量反应曲线图。PROTAC GNE987具有最高效力，之后是25％载荷的aEGFRxMIC2+GNE987。50％(1:1)载荷的非结合的对照MIC2+GNE987和aHER2xMIC2+GNE987对细胞活力的作用降低。
图19：经研究的分子(N＝3个生物学重复)的IC50值图。
图20：用PROTAC-ADC和PROTAC穿梭(shuttle)处理的HEPG2细胞的剂量反应曲线。
图21：降解BRD4的GNE987和其具有PEG接头的类似物GNE987P的分子结构。
图22：与单独的GNE987P相比，复合的aEGFRxMIC2+GNE987P在表达EGFR的MDAMB468细胞上，在浓度范围0.1-10nM内显示增加的细胞毒性作用，表明靶向的递送。与非靶向的MIC2+GNE987P的复合完全降低了GNE987P的细胞毒性。
图23：单独的GNE987或与aEGFRxMIC2复合的GNE987历经72h的小鼠血浆稳定性。
图24：与GNE987复合的双特异性抗体aEGFRxMIC2在96h内的小鼠血浆稳定性。
图25：历经96h，在小鼠血浆中，50％载荷的复合物aEGFRxMIC2+GNE987的稳定性评估。将aEGFRxMIC2+GNE987复合物捕获在珠上，并收集上清液用于未结合的GNE987的LC-MS分析。之后，将与珠结合的aEGFRxMIC2+GNE987复合物从使用LC-MS进行GNE987定量的珠上洗脱。
图26：用于新世界骆驼科动物免疫以产生抗半抗原抗体的免疫计划。
图27：经由噬菌体展示用于抗体发现的生物素化的VH032。
图28：VHH融合蛋白相比未经修饰的亲本抗体的表达率。
图29：与缺少VHH MIC5的亲本抗体相比，CD33xMIC5或EGFRxMIC5分别与MV411和MDAMB468的细胞结合的流式细胞术分析。
图30：对装载和未装载PROTAC GNE987的结合CD33的CD33xMIC7与表达CD33的细胞系的细胞结合进行的比较。
图31：pH响应型VH032-pHAb染料的结构。
图32：历经6h，对CD33xMIC7向CD33阳性细胞MOLM13、MV411和U937和CD33阴性RAMOS细胞的内化进行流式细胞术分析。
图33：CD33xMIC7+GNE987(1:1)和DIGxMIC7+GNE987(1:1)在CD33阳性MV411细胞上的蛋白质印迹。图上方的浓度以mol/L给出。分子量标记的大小(右侧)以kDa给出。
图34：CD33xMIC7+GNE987(1:1)和DIGxMIC7+GNE987(1:1)在MV411细胞上的降解模式的蛋白质印迹分析。
图35：对依赖于CD33受体表达水平的细胞活力数据的比较。50％载荷的CD33xMIC5+GNE987诱导CD33阳性的MV411和MOLM13细胞上的细胞毒性，但对缺少CD33的RAMOS细胞仅具有较小影响。
图36：与GNE987在CD33阳性MV411细胞上的细胞毒性相比，装载25％、50％和75％PROTAC GNE987的CD33xMIC5的细胞毒性。
图37：与仅用PROTAC GNE987P相比，装载每个抗体不同量PROTAC GNE987P的CD33xMIC5抗体的细胞活力数据。
图38：与单独的PROTAC GNE987P相比，装载每个抗体PROTAC FLT3d1的CD33xMIC5抗体的细胞活力数据。在治疗后6天，对细胞活力进行分析。
图39：75％载荷的CD33xMIC5+GNE987(1:1.5)在预复合或未预复合的情况下对CD33阳性的MV411细胞和CD33阴性的RAMOS细胞的细胞活力测定。在未预复合的样品的情况下，将抗体(CD33xMIC5)和PROTAC(GNE987)分别添加至细胞悬浮液作为处理。在所述细胞上测试PROTAC GNE987作为参考。
图40：在CLL1阳性的MOLM13和U937细胞以及在CLL1阴性的K562细胞上，75％载荷(1:1.5)的CLL1xMIC7+GNE987P和DIGxMIC7+GNE987P的细胞活力测定。在所述细胞上测试仅用PROTAC GNE987作为参考。
图41：在CLL1阳性的MV411和U937细胞以及在CLL1阴性的RAMOS和K562细胞上，75％载荷(1:1.5)的CLL1xMIC7+GNE987、CLL1xMIC7+GNE987P和CLL1xMIC7+SIM1的细胞活力测定。在所述细胞上测试PROTAC GNE987、GNE987P和SIM1作为参考。
图42：在B7H3阳性的MV411和U937细胞以及B7H3阴性的RAMOS细胞上，75％载荷(1:1.5)的B7H3xMIC7+GNE987P或B7H3xMIC7+SIM1的细胞活力测定。在所述细胞上测试仅用PROTAC(GNE987P和SIM1)作为参考。
图43：在B7H3阳性的MV411和U937细胞以及B7H3阴性的RAMOS细胞上，75％载荷(1:1.5)的B7H3xMIC7+GNE987和DIGxMIC7+GNE987的细胞活力测定。在所述细胞上测试PROTACGNE987作为参考。
图44：在NAPI2B阳性的OVCAR3和NAPI2B阴性的SKOV3细胞上，装载GNE987、GNE987P或SIM1的NAPI2BxMIC7和DIGxMIC7以50％载荷(1:1)进行的细胞活力测定。在所述细胞上测试PROTAC GNE987、GNE987P和SIM1作为参考。
图45：对装载50％ PROTAC的EGFRxMIC5+GNE987和基于西妥昔单抗的结合EGFR的PROTAC-ADC(DAR＝1.62)在EGFR阴性的HEPG2细胞和EGFR阳性的MDAMB468细胞上的细胞毒性的比较。
图46：在雌性SCID褐色小鼠中在静脉内施用后，GNE987和81.3％载荷的MIC2+GNE987复合物的PK研究。
图47：在30mg/kg静脉内施用后，具有理论载荷100％的CD33xMIC5+GNE987和CD33xMIC7+GNE987 PROTAC抗体复合物在C57BL/6N小鼠中的PK研究。显示了GNE987的检测到的浓度。
图48：进行比较的未经修饰的抗体CD33 Ab、抗体VHH融合蛋白CD33xMIC5和CD33xMIC7以及装载GNE987的CD33xMIC5和CD33xMIC7的清除率。
图49：在雌性CB17 SCID小鼠中的CD33xMIC7+GNE987的MV411异种移植物功效研究。与给予一次或两次的0.38mg/kg GNE987(在第1天和第8天)相比，将30mg/kg CD33xMIC7+GNE987给予一次或两次。此外，对给予一次(在第1天)30mg/kg CD33xMIC5+GNE987的功效进行评估，并且将仅用抗体(30mg/kg，CD33xMIC7)的效果作为对照。
图50(a-e)：从免疫新世界骆驼科动物获得的抗体VHH序列及噬菌体展示筛选。
图51：抗CLL1抗体6E7L4Hle的序列。
5表格列表
表1：本发明抗体的结合表位。
表2：使用MIC2的1:1动力学结合模型所获得的MIC2和PROTAC(参见图8的结构)的组合的亲和力参数KD、结合速率kon、解离速率koff的综述以及来源于稳态模型的PROTAC与MIC1结合的KD。NM＝未测量；NB＝未结合。
表3：对于实现所希望的载荷所需要的最终PROTAC浓度的概述。
表4：以25％和50％载荷与GNE987复合的结合EGFR的aEGFRxMIC2和非结合的对照MIC2的IC50值。
表5：结合EGFR的aEGFRxMIC2+GNE987复合物和对照在MDAMB468上的IC50值。效力和标准差来源于三个独立的实验。
表6：在PBS pH 6.8、5％ DMSO终浓度中抗体-PROTAC复合物的储存稳定性评估。
表7：使用噬菌体展示的抗体命中发现策略的文库特征。
表8：使用SPR确定的VHH克隆与PROTAC的亲和力(KD)。通过在抗CD33或抗CLL1抗体的重链的C末端添加，研究了作为抗体融合蛋白的VHH。N/D–未检测的(可以在图8中发现完整的PROTACS结构)。
表9：用于与VHH抗体片段融合的IgG型抗体骨架。
表10：靶向CD33的PAX的命名。
表11：在EGFR阳性MDAMB468细胞和MDAMB468阴性HEPG2细胞上，与PROTAC GNE987组合的结合CD33的吉妥珠单抗(gemtuzumab)(G)和基于结合EGFR的西妥昔单抗(c)的VHH融合蛋白的细胞谱分析。将IC50值用于计算选择性指数。
表12：用于蛋白质印迹分析的一抗。
表13：在CD33阳性MV411细胞和CD33阴性RAMOS细胞上，与PROTAC GNE987和GNE987P或单独的PROTAC组合的不同CD33xMIC7的细胞谱分析。以M描述IC50值。
表14：PROTAC ARV771、GNE987、GNE987P和EGFR阳性细胞和EGFR阴性HEPG2细胞的细胞谱分析。以M描述IC50值。
表15：在EGFR阳性细胞和EGFR阴性HEPG2细胞上，与PROTAC GNE987、GNE987P和SIM1组合的EGFRxMIC7(载荷为50％)的细胞谱分析。作为非内化对照，利用地高辛结合性DIGxMIC7融合蛋白。以平均值M描述IC50值。
表16：在EGFR阳性细胞和EGFR阴性HEPG2和低EGFR的MCF7细胞上，与PROTACARV771、GNE987、GNE987P和SIM1组合的EGFRxMIC7(载荷为75％)的细胞谱分析。作为非内化对照，利用地高辛结合性DIGxMIC7融合蛋白。
表17：在HER2阳性细胞和HER2阴性MDAMB468细胞上，与PROTAC GNE987、GNE987P和SIM1组合的HER2xMIC7(载荷为75％)的细胞谱分析。
表18：在TROP2阳性细胞和TROP2阴性SW620细胞上，与PROTAC GNE987组合的TROP2xMIC7(载荷为75％)的细胞谱分析。
表19：具有载荷MIC5和MIC7的基于CD33的VHH融合蛋白与未载荷PROTAC GNE987和亲本抗体CD33 Ab的药代动力学参数的总结。按30mg/kg施用分析物，并且描绘用于定量总抗体(t抗体)和PROTAC GNE987的PK参数。缩略词：t1/2：半衰期；Cmax：最大血清浓度；AUC0-inf：曲线下的面积至无限时间；Cl：清除率；Vss：分布的稳态体积；SD：标准差。
表20：这项工作范围的总结。研究的组合以表格形式描绘。
6发明详述
6.1定义
“PROTAC”(蛋白水解靶向嵌合体)是由两个活性结构域和接头组成的异双官能小分子，能够去除特定的不需要的蛋白质。与传统的酶抑制剂不同，PROTAC通过诱导选择性蛋白水解来起作用。PROTAC由两个共价连接的蛋白质结合分子组成：一个分子(在许多情况下)能够招募，并且另一个分子与想要降解的靶蛋白结合。将E3连接酶募集到靶蛋白上导致泛素化，随后通过蛋白酶体降解靶蛋白。所述概念最初由Deshaies和同事在2001年描述(Skamoto,K.M.等人.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98(2001)8554-8559)。
术语"抗体"包括单克隆抗体(包括具有免疫球蛋白Fc区的全长抗体)、具有多表位特异性的抗体组合物、多特异性抗体(特别是双特异性抗体)、双抗体和单链分子(例如，scFv)、单结构域抗体(纳米抗体，例如衍生自新世界骆驼科物种如羊驼属的VHH)以及抗体片段(例如，Fab、F(ab')2和Fv)。
术语"免疫球蛋白"(Ig)与本文的"抗体"可互换地使用。基本4链抗体单元是由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链组成的异四聚体糖蛋白。IgM抗体由5个基本异四聚体单元连同被称为J链的额外多肽组成，并且包含10个抗原结合位点，而IgA抗体包含2-5个基本4链单元，所述单元可以聚合以与J链组合形成多价聚合物。在IgG的情况下，4链单元通常为约150,000道尔顿。每条L链通过一个共价二硫键连接至H链，而两条H链通过一个或多个二硫键彼此连接，这取决于H链同种型。每条H和L链还具有规则间隔的链内二硫桥。每条H链在N末端处具有一个可变结构域(VH)，之后是对于每个α和γ重链同种型的三个恒定结构域(CH)以及对于μ和ε重链同种型的四个CH结构域。每条L链在N末端处具有可变结构域(VL)，之后在其另一端具有恒定结构域。VL与VH对齐，并且CL与重链(CH1)的第一恒定结构域对齐。据信特定的氨基酸残基形成轻链和重链可变结构域之间的界面。VH和VL的配对一起形成单一的抗原结合位点。对于不同种类抗体的结构和特性，参见例如，Schroeder,H.,Cavacini,L.,J.Allergy Clin.Immunol.125(2010),S41–S52。来自任何脊椎动物物种的L链可以基于它们恒定结构域的氨基酸序列被指定为一种或两种明显不同的类型，称为κ和λ。根据其重链(CH)的恒定结构域的氨基酸序列，免疫球蛋白可以被指定为不同类或同种型。存在五类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，具有分别指定为α、δ、ε、γ和μ的重链。基于CH序列和功能的相对较小的差异，γ和α类被进一步分为亚类，例如，人类表达以下亚类：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。
抗体的"可变区"或"可变结构域"是指抗体重链或轻链的氨基末端结构域。重链和轻链的可变结构域可以被分别称为"VH"和"VL"。这些结构域通常是抗体的最可变部分(相对于同类的其他抗体)，并包含抗原结合位点。
术语“可变”是指可变结构域的某些区段在抗体之间的序列上有很大差异。V结构域介导抗原结合并定义抗体对其抗原的特异性。然而，可变性并不是均匀分布在可变结构域的整个跨度上。相反，它集中在轻链和重链可变结构域中被称为高变区(HVR)的三个区段。可变结构域中更高度保守的部分被称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR区，主要采用β片层构型，由三个HVR连接，形成连接β片层结构的环，并且在一些情况下形成β片层结构的一部分。每条链中的HVR被FR区紧密地固定在一起，并且与来自另一条链的HVR一起有助于抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等人,SequencesofImmunological Interest,第五版,National Institute of Health,Bethesda,MD(1991))。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出各种效应子功能，例如抗体参与抗体依赖性细胞毒性。
如本文所用，术语“CDR”是指抗体可变结构域的互补决定区，所述互补决定区在序列上是高变的和/或形成结构上定义的环。通常，抗体包含六个CDR；三个在VH(H1、H2、H3)中，三个在VL(L1、L2、L3)中。在天然抗体中，H3和L3展示六个CDR的最大多样性，并且尤其是H3被认为在赋予抗体精细特异性方面发挥着独特的作用。参见，例如，Xu等人,Immunity13(2000)37-45；Johnson和Wu,Methods Mol.Biol.248(2003)1-25(Lo,ed.,Human Press,Totowa,NJ,2003)。事实上，天然存在的、仅由重链组成的骆驼科抗体在缺少轻链的情况下是功能性的和稳定的。参见，例如，Hamers-Casterman等人,Nature 363(1993)446-448；Sheriff等人,Nature Struct.Biol.3(1996)733-736。许多CDR描述正在使用。ImMunGeneTics(IMGT)独特的Lefranc编号(IMGT编号)(Lefranc,M.-P.等人,Dev.Comp.Immunol.27(2003)55-77)考虑了序列保守、来自X射线衍射研究的结构数据和高变环的表征，以便于定义FR和HVR。Kabat CDR基于序列可变性，并且也是常用的(Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版.Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))。Chothia涉及结构环的位置(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196(1987)901-917)。本文使用的CDR描述是根据IMGT编号的。
“框架”或“FR”残基是除本文定义的CDR残基之外的那些可变结构域残基。
术语“全长抗体”、“完整抗体”或“全抗体”可互换使用，是指呈基本上完整形式的抗体，而不是抗体片段。具体地，全抗体包括具有包括Fc区的重链和轻链的抗体。恒定结构域可以是天然序列恒定结构域(例如，人类天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。在一些情况下，完整的抗体可以具有一种或多种效应子功能。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选完整抗体的抗原结合和/或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体。抗体的木瓜蛋白酶消化产生了两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段和一个残留的“Fc”片段，这一命名反映了易于结晶的能力。Fab片段由整个L链连同H链的可变区结构域(VH)和一个重链的第一恒定结构域(CH1)组成。每个Fab片段就抗原结合方面是单价的，即它具有单个抗原结合位点。抗体的胃蛋白酶处理产生单个大的F(ab')2片段，其大致对应于具有不同抗原结合活性的两个二硫键连接的Fab片段，并且仍能够交联抗原。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于在CH1结构域的羧基末端处具有一些额外的残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab'-SH是本文对Fab’的命名，其中恒定结构域的一个或多个半胱氨酸残基带有游离巯基基团。F(ab')2抗体片段最初以Fab'片段对的形式产生，片段对之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其他化学偶联也是已知的。
"scFv"(单链Fv)是通常由基因融合物表达的共价连接的VH::VL异二聚体，所述基因融合物包括通过编码肽的接头连接的VH和VL编码基因。本发明的人scFv片段包括以适当构型保持的CDR，例如通过使用基因重组技术。二价和多价抗体片段可以通过单价scFv的结合自发形成，或可以通过肽接头(如二价sc(Fv)2)偶联单价scFv而生成。"dsFv"是通过二硫键稳定的VH::VL异二聚体。"(dsFv)2”表示通过肽接头偶联的两个dsFv。
术语"双特异性抗体"或"BsAb"表示包含两个不同抗原结合位点的抗体。因此，BsAb能够同时结合两个不同抗原。基因工程已被越来越频繁地用于设计、修饰和产生具有所需的一组结合特性和效应子功能的抗体或抗体衍生物，例如EP 2 050 764 A1中所述。
术语"多特异性抗体"表示包含两个或更多个不同抗原结合位点的抗体。
术语"杂交瘤"表示将通过用抗原免疫非人哺乳动物而制备的B细胞与来源于小鼠等的骨髓瘤细胞经历细胞融合而获得的细胞，所述细胞产生具有抗原特异性的所希望的单克隆抗体。
术语"双抗体"是指通过在VH和VL结构域之间构建具有短接头(约5-10个)残基的scFv片段(参见前述段落)制备的小抗体片段，从而实现V结构域的链间而非链内配对，因此产生二价片段，即，具有两个抗原结合位点的片段。双特异性双抗体是两个“交叉”scFv片段的异二聚体，其中两个抗体的VH和VL结构域存在于不同的多肽链上。双抗体更详细地描述于例如EP0404097；WO 93/11161；Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)6444-6448。
本文的单克隆抗体具体地包括"嵌合的"抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与来源于特定物种或属于特定抗体类或亚类的抗体中的相应序列同一或同源，而一条或多条链的剩余物与来源于另一物种或属于另一抗体类或亚类的抗体以及此类抗体的片段中的相应序列同一或同源，只要它们表现出所希望的生物活性即可。
非人(例如，鼠)抗体的"人源化”形式是嵌合抗体，含有来源于非人免疫球蛋白的最小序列。在一个实施方案中，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体HVR(下文定义的)的残基被来自非人物种(供体抗体)如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物的具有所希望的特异性、亲和力和/或能力的HVR的残基取代。在某些情况下，人免疫球蛋白的框架("FR")残基被相应的非人残基取代。此外，人源化抗体可包含受体抗体或供体抗体中未发现的残基。可以进行这些修饰以进一步完善抗体性能，例如结合亲和力。一般来说，人源化抗体将包含基本上所有或至少一个，并且通常是两个可变结构域，其中所有或基本上所有的高变环对应于非人免疫球蛋白序列的高变环，并且所有或基本上所有的FR区是人免疫球蛋白序列的FR区，尽管所述FR区可以包括一个或多个提高抗体性能(如结合亲和力、异构化作用、免疫原性等)的单独FR残基取代。在FR中的这些氨基酸取代的数量通常在H链中通常不超过6个，并且在L链中不超过3个。人源化抗体任选地还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)(通常是人免疫球蛋白的恒定区)的至少一部分。对于另外的细节，参见例如，Jones等人,Nature 321(1986)522-525；Riechmann等人,Nature 332(1988)323-329；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2(1992)593-596。还参见，例如，Vaswani和Hamilton,Ann.Allergy,Asthma and Immunol.1(1998)105-115；Harris,Biochem.Soc.Transactions 23(1995)1035-1038；Hurle和Gross,Curr.Op.Biotech.5(1994)428-433；以及美国专利号6,982,321和7,087,409。
"人抗体”是具有与由人产生的抗体的氨基酸序列相应的氨基酸序列和/或已经使用本文公开的用于制备人类抗体的任何技术制备的抗体。人抗体的这一定义特异性地排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。可以使用本领域已知的各种技术，包括噬菌体展示文库来生产人抗体。Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.227(1991)381；Marks等人,J.Mol.Biol.,222(1991)581。对于人单克隆抗体的制备还可用的是描述于Dijk和van deWinkel,Curr.Opin.Pharmacol.5(2001)368-74中的方法。可以通过向转基因动物施用抗原来制备人抗体，所述转基因动物已经被遗传修饰以产生部分或全部人抗体，以应答于抗原攻击，但所述抗原攻击内源性基因座已被失效，例如，OmniAb治疗性抗体平台(LigandPharmaceuticals)，免疫的异种小鼠(关于Xenomouse技术参见例如美国专利号6,075,181和6,150,584)等。关于经由人类B细胞杂交瘤技术产生的人类抗体，还参见例如Li等人,Proc.Natl.Acad.Set USA 103(2006)3557-3562。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从基本上同源的抗体的群体获得的抗体，即除了可能以少量存在的可能的天然存在的突变和/或翻译后修饰(例如，异构化、酰胺化)外，包含在所述群体内的各个抗体是相同的。单克隆抗体是针对单个抗原位点的高度特异性抗体。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂不同，每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性之外，单克隆抗体的优势在于它们是由杂交瘤培养物合成的，不受其他免疫球蛋白的污染。修饰语“单克隆”表明抗体的特性是由基本同源的抗体群体获得，并且不应理解为需要通过任何具体方法产生抗体。例如，可以通过多种技术制备按照本发明有待使用的单克隆抗体，包括例如，杂交瘤方法(例如，Kohler和Milstein,Nature 256(1975)495-497；Hongo等人,Hybridoma 14(1995)253-260,Harlow等人,Antibodies:ALaboratory Manual,(Cold Spring Harbor LaboratoryPress,第2版.1988)；Hammerling等人,在：Monoclonal Antibodies and T-CellHybridomas 563-681中(Elsevier,N.Y.,1981))，重组DNA方法(参见，例如，美国专利号4,816,567)，噬菌体展示技术(参见，例如，Sidhu等人,J.Mol.Biol.338(2004)299-310；Lee等人,J.Mol.Biol.340(2004)1073-1093；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(2004)12467-12472；和Lee等人,J.Immunol.Methods 284(2004)119-132,和在动物体内产生具有部分或全部人类免疫球蛋白基因座或编码人类免疫球蛋白序列的基因的人或类人抗体的技术(参见，例如，Jakobovits等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)2551；Jakobovits等人,Nature 362(1993)255-258；Bruggemann等人,Year in Immunol.7(1993)33；Fishwild等人,Nature Biotechnol.14:(1996)845-851；Neuberger,NatureBiotechnol.14(1996)826；以及Lonberg和Huszar,Intern.Rev.Immunol.13(1995)65-93。
与不具有这些改变的亲本抗体相比，“亲和力成熟的”抗体是指在其一个或多个HVR中具有一个或多个改变，从而导致抗体对抗原的亲和性改善的抗体。在一个实施方案中，亲和力成熟的抗体对靶抗原具有纳摩尔或甚至皮摩尔亲和力。亲和力成熟的抗体是通过本领域已知的程序产生的。例如，Marks等人,Biotechnology 10(1992)779-783描述了通过VH-和VL-结构域改组的亲和力成熟。HVR和/或框架残基的随机诱变描述于例如，Barbas等人Proc Nat.Acad.Sci.USA 91(1994)3809-3813；Schier等人Gene 169(1995)147-155；Yelton等人J.Immunol.155(1995)1994-2004；Jackson等人,J.Immunol.154(1995)3310-9；和Hawkins等人,J.Mol.Biol.226(1992)889-896中。
如本文所用，术语“特异性结合”或“特异性”是指可测量和可重复的相互作用，如靶标和抗体之间的结合，其在包括生物分子在内的异源分子群体的存在下决定靶标的存在。例如，与靶标(可以是表位)特异性结合的抗体是以比结合其他靶标更高亲和力、亲合力、更容易地和/或更长持续时间与该靶标结合的抗体。
“结合亲和力”通常是指分子(如抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(如抗原)之间的非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，如本文所用，"结合亲和力"、“与···结合”或“结合...”是指反映结合对成员(例如，抗体Fab片段和抗原)之间一比一相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以用离解常数(KD)来表示。亲和性可以通过本领域已知的常用方法来测量，包括本文所述的方法。低亲和力抗体通常缓慢地结合抗原并且倾向于容易解离，而高亲和力抗体通常更快地结合抗原并倾向于保持结合更长时间。测量结合亲和力的多种方法是本领域已知的，其中任何一种都可出于本发明的目的而使用。以下描述了用于测量结合亲和力，即结合强度的具体说明性和示例性实施方案。
根据本发明可以通过用抗体和抗原分子的Fab型进行的经放射性标记的抗原结合测定(RIA)，或通过用BIACORE仪器(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)使用表面等离子共振测定，或通过用Octet仪器(Fortébio,Fremont,CA)使用生物层干涉法测量本发明的"KD"或"KD值"。
如本文所用，术语“缀合物”是指与抗体共价连接的化学(非生物的)治疗剂，如与“复合物”相对比，所述复合物是指与抗体可变区(CDR)非共价结合的化学(非生物)治疗剂。
当在提及多肽(例如，抗体)或核苷酸序列时，"纯化的"或"分离的”是指在基本上不存在其他相同类型的生物大分子的情况下存在所述的分子。如本文所用，术语"纯化的"是指存在按重量计至少75％、85％、95％、96％、97％或98％的相同类型的生物大分子。编码特定多肽的"分离的"核酸分子是指基本上不含不编码主题多肽的其他核酸分子的核酸分子；然而所述分子可以包括一些不有害地影响所述组合物的基本特性的额外碱基或部分。
如本文所用，术语“降解决定子(degron)”是指PROTAC的降解部分，它是一种Von-Hippel-Lindau(VHL)配体。
如本文所用，术语“弹头(warhead)”是指与待降解的蛋白质(例如抑制物或这类靶蛋白)结合的PROTAC的部分。弹头部分在下文中还被称为“靶蛋白结合剂(binder)”或“蛋白质结合剂(binder)”或“PB”。
6.2本发明的抗体和抗体-PROTAC复合物(PAX)
发明人已经成功地产生和选择了特异性的抗-PROTAC抗体，特别是抗-VHL配体的抗体，其中所述抗体与PROTAC的VHL配体降解决定子特异性结合。
因此，在一方面，本发明涉及与VHL配体例如VH032或其衍生物结合的抗体。
发明人生成的抗-PROTAC抗体能够与VHL配体VH032结合，同时可容忍对MIC1和MIC2衍生的抗体而言如图1和表1概述的各种修饰。所述抗体容忍在位置R1和R2的所有研究的取代，所述取代包括连接VH032和靶蛋白结合剂的若干不同的接头结构。在R3处，尽管当靶蛋白结合部分经由接头连接至R3时抗体结合受到抑制，但可容忍氢和羟基取代。R4可以是氢或甲基。R5和R6都可以含有羟基基团，条件是它们之中另一个位置是氢。在位置R1、R2、R5和R6中未鉴定出不被容忍的取代。
基于文献综述的结构分析显示，招募VHL的49.2％的PROTAC是基于VHL配体VH032。29.5％的基于VHL的PROTAC利用携带额外甲基基团(R4＝Me，图1)的VH032的紧密衍生物。用于弹头连接的接头连接在位置R1(图1)中。其余基于VHL的PROTAC使用不同的构建模式，其中与弹头的连接是通过接头连接至R3来实现的，或携带其他修饰，例如R4中的羟基甲基。总之，本发明公开的抗-PROTAC抗体能够与至少79％的目前公众已知的基于VHL的PROTAC结合。
表1：本发明抗体的结合表位。
因此，在一个实施方案中，所述VH032衍生物可以由式I描述：
其中
R1或R2之一是连接到弹头(靶蛋白结合剂，PB)的接头，前提是
如果R2是弹头-接头，则R1是乙酰基，并且
如果R1是弹头-接头，则R2是甲基；
R3是H、OH、氰基、F、Cl、氨基或甲基；
R4是H或甲基；
R5、R6是H或OH，前提是
如果R6是H，则R5是OH，并且
如果R5是H，则R6是OH。
在更具体的实施方案中，
R1是PB-Q-(CH2-CH2-O)n-(CH2-CH2-CH2-O)m-(CH2)p-(C＝O)-，
其中
PB是蛋白质结合弹头；
Q是NH、C＝O或不存在；
n、m独立地是0、1、2、3或4；
p是0-10；
R2是甲基；
并且R3、R4、R5和R6如上所述。
在甚至更具体的实施方案中，
R1是PB-Q-(CH2-CH2-O)n-(CH2-CH2-CH2-O)m-(CH2)p-(C＝O)-，
其中
PB是蛋白质结合弹头；
Q是NH、C＝O或不存在；
(i)n、m、p是1；或
(ii)n是3或4；m是0；p是1；或
(iii)n是1；m是0；p是2；或
(iv)n是2；m是0；p是2；或
(v)n、m是0；p是6、7、8、9或10；
R2是甲基；
并且R3、R4、R5和R6如上所述。
在非常具体的实施方案中，
R1是PB-NH-(CH2-CH2-O)n-(CH2-CH2-CH2-O)m-(CH2)p-(C＝O)-，
其中
PB是蛋白质结合弹头；
(vi)Q是NH；n、m、p是1；或
(vii)Q是NH；n是3或4；m是0；p是1；或
(viii)Q不存在；n是1；m是0；p是2；或
(ix)Q不存在；n是2；m是0；p是2；或
(x)Q是NH或C＝O；n、m是0；p是6、7、8、9或10；
R2是甲基；
并且R3、R4、R5和R6如上所述。
在另一个更具体的实施方案中，
R1是乙酰基；
R2是PB-NH-(CH2)p-S-，其中PB是蛋白质结合弹头，并且p是1、2、3、4、5或6；
并且R3、R4、R5和R6如上所述。
在一个实施方案(A)中，抗体是全长抗体，其可变区包含负责结合PROTAC的CDR，所述CDR具有以下序列：
HC CDR1：G Y S X1 T X2 X3 Y(SEQ ID NO:1)；
HC CDR2：I T Y S G X4 T(SEQ ID NO:2)；
HC CDR3：X5 X6 Y X7 X8 X9 X10 X11 X12 X13 X14 X15(SEQ ID NO:3)；
LC CDR1：Q X16 X17 X18 X19 X20 X21 X22 X23 X24 Y(SEQ ID NO:4)；
LC CDR2：X25 X26 X27(SEQ ID NO:5)；
LC CDR3：X28 Q X29 X30 X31 X32 P Y T(SEQ ID NO:6)；
其中：X1是I或A；X2是G或N；X3是D或N；X4是G或A；X5是A或G；X6是K或Y；X7是G或Y；X8不存在或是A；X9不存在或是V；X10不存在或是P；X11是D或Y；X12是G或Y；X13是G或F；X14是R或A；X15是D或H；X16是S或G；X17是L或I；X18是S或不存在；X19是Y或不存在；X20是S或不存在；X21是D或不存在；X22是G或不存在；X23是N或G；X24是T或N；X25是L或Y；X26是V或A；X27是S或T；X28是V或L；X29是S或Y；X30是I或D；X31是H或E；和X32是V或Y。
在优选的实施方案中，所述CDR序列是
HC CDR1：G Y S I T G D Y(SEQ ID NO:7)；
HC CDR2：I T Y S G G T(SEQ ID NO:8)；
HC CDR3：A K Y G D G G R D(SEQ ID NO:9)；
LC CDR1：Q S L S Y SD G N T Y(SEQ ID NO:10)；
LC CDR2：L V S(SEQ ID NO:11)；
LC CDR3：V Q S I H V P Y T(SEQ ID NO:12)。
在非常具体的实施方案中，所述抗体对应于选自MIC 2序列SEQ ID No:13和14的一对轻链和重链序列，显示在图2中。
在另一个非常具体的实施方案中，所述抗体是BsAb，具有SEQ ID NO:13和15、或SEQ ID NO:13和16的重链和轻链序列，显示在图2(a)中，其中结合HER2的VHH或结合EGFR的scFv经由肽接头分别与其重链融合，如在图2(a)和(b)中显示。
在一个实施方案(B)中，所述抗体是VHH，其包含负责结合PROTAC的CDR，所述CDR具有以下序列：
CDR1：G X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7(SEQ ID NO:17)；
CDR2：X8 X9 X10 X11 X12 X13 X14 X15(SEQ ID NO:18)；
CDR3：X16 X17 X18 X19 X20 X21 X22 X23 X24 X25 X26 X27 X28 X29 X30 X31 X32 X33 X34X35 X36(SEQ ID NO:19)；
其中：X1是F或R；X2是T、A、S或R；X3是L或F；X4是D或N；X5是D或T；X6是Y或L；X7是A或T；X8是I、N或L；X9是S或T；X10是S或W；X11是S或N；X12是D或G；X13是G或D；X14是S或N；X15是A或T；X16是A、S或T；X17是A、V或I；X18是S、A、I或D；X19是T、Y、R或A；X20是R、Y或G；X21是V、S、L或T；X22是L、G、S或C；X23是S、A、C或P；X24是T、A、S或N；X25是P、I、V或D；X26不存在或是V或A；X27是D、S、R或不存在；X28是V、G或P；X29是D、T、G或R；X30是Q、I、T或R；X31是V、K或R；X32是R、I或Y；X33是Y、Q、F或A；X34是V或L；X35是E、P或D；X36是V、Y或A。
其中更具体地：X1是F；X2是T或S；X3是L或F；X4是D；X5是D；X6是Y；X7是A或T；X8是I；X9是S或T；X10是S；X11是S；X12是D；X13是G；X14是S；X15是A或T；X16是A或S；X17是V或A；X18是A或I；X19是T或Y；X20是G或R；X21是L或S；X22是C或S；X23是P或C；X24是A或S；X25是V或D；X26不存在或是V；X27是R或不存在；X28是G或P；X29是T或G；X30是Q或I；X31是K或R；X32是R、I或Y；X33是F或A；X34是L；X35是E或D；X36是V或Y。
在优选的实施方案中，所述CDR序列是图50(a)中示出的抗体YU734-F06(MIC7)的序列(SEQ ID NO:20)
CDR1：G F T L D D Y A(SEQ ID NO:21)
CDR2：I S SSD G S T(SEQ ID NO:22)
CDR3：S AI Y R L S C S V V R P T I R Y AL D Y(SEQ ID NO:23)
或图50(a)中示出的抗体YU733-G10(MIC5)的序列(SEQ ID NO:24)
CDR1：G F T F D D Y A(SEQ ID NO:25)
CDR2：I S SSD G S A(SEQ ID NO:26)
CDR3：AV AT G S C P A D G G Q K I F L E V(SEQ ID NO:27)
在非常具体的实施方案中，VHH对应于从图50(a-e)中显示的序列中选择的序列。
在优选的具体的实施方案中，VHH对应于图50(a)中显示的序列YU734-F06(MIC7，SEQ ID NO:20)或YU733-G10(MIC5，SEQ ID NO:24)。
在一个实施方案中，对于实施方案(B)的上文所述序列是BsAb的一部分，其中所述序列的N末端融合至能够与靶蛋白结合的全长抗体的C末端，任选地经由肽接头融合至能够与靶蛋白结合的全长抗体的C末端。
在优选的实施方案中，所述BsAb包含肽接头。在更优选的实施方案中，肽接头各自由GSGGGSGGSGGGGSG(SEQ ID NO:28)的1、2或3个重复序列组成。在甚至更优选的实施方案中，肽接头各自由GSGGGSGGSGGGGSG(SEQ ID NO:28)的1个重复序列组成。
如果全长抗体，则抗体优选是IgG1或IgG4型，以使FcRn受体能够结合。
在一个实施方案中，所述抗体是单特异性的，并且仅与PROTAC结合。所述抗体还可以是双特异性抗体(BsAb)，其中第二特异性是针对靶蛋白。
在BsAb的情况下，PROTAC的结合可以通过与全长抗体的重链或轻链或这二者的C末端或N末端或这两个末端融合的单链抗体而实现，而靶蛋白的结合通过全长抗体的可变区的六个CDR而实现。
或者，靶蛋白的结合通过与全长抗体的重链或轻链或这二者的C末端或N末端或这两个末端融合的单链抗体而实现，且PROTAC的结合通过全长抗体的可变区的六个CDR而实现。
根据本发明的BsAb变体的实例显示在图3中。
在优选的实施方案中，根据本发明的BsAb的靶蛋白是细胞表面蛋白，例如肿瘤抗原，例如HER2或EGFR。
6.3核酸、载体和宿主细胞
本发明的另一个方面涉及分离的核酸，其包含编码如上所定义的本发明抗体的核酸序列，或由其组成。
通常，所述核酸是DNA或RNA分子，其可以包含在任何合适的载体中，如质粒、粘粒、附加体、人工染色体、噬菌体或病毒载体。
术语"载体"、“克隆载体"和"表达载体”是指可以将DNA或RNA序列(例如，外源基因)引入宿主细胞，以便于转化宿主并促进引入序列的表达(例如，转录和翻译)的媒介物。因此，本发明的另外的方面涉及包含如上所定义的本发明核酸的载体。此类载体可以包含调节性元件，例如启动子、增强子、终止子等，以便在向个体施用后引起或直接表达所述多肽。
本发明的另外的方面涉及已被本发明的核酸和/或载体转染、感染或转化的宿主细胞。
术语"转化”是指将“外源"(即，外来的)基因、DNA或RNA序列引入宿主细胞，使得宿主细胞将表达所引入的基因或序列，以产生所希望的物质，通常是由所引入的基因或序列编码的蛋白质或酶。接受并表达引入的DNA或RNA的宿主细胞已被“转化”。
本发明的核酸可用于在合适的表达系统中产生本发明的抗体。术语"表达系统”是指在合适条件下的宿主细胞和相容性载体，其例如用于表达由载体携带并引入宿主细胞的外源DNA所编码的蛋白质。
常见的表达系统包括大肠杆菌(E.coli)宿主细胞和质粒载体、昆虫宿主细胞和杆状病毒载体、以及哺乳动物宿主细胞和载体。宿主细胞的其他实例包括但不限于原核细胞(如细菌)和真核细胞(如酵母细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞等)。具体的实例包括大肠杆菌(E.coli)、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)或酵母菌属(Saccharomyces)的酵母、哺乳动物细胞系(例如Vero细胞、CHO细胞、HEK细胞、3T3细胞、COS细胞等)。
6.4制备本发明抗体的方法
可以通过本领域已知的任何技术产生本发明的抗体，例如但不限于单独的或组合的任何化学、生物、遗传或酶技术。
在已知所希望的抗体的氨基酸序列时，本领域技术人员可以使用用于生产多肽的标准技术容易地生产所述抗体或免疫球蛋白链。例如，它们可以使用熟知的固相方法，使用可商购的肽合成设备(例如由Applied Biosystems,Foster City,California制造的设备)，并遵循制造商的说明书进行合成。或者，本发明的抗体和免疫球蛋白链可以通过重组DNA技术生产，这在本领域是熟知的。例如，这些多肽(例如，抗体)可以在将编码所需多肽的DNA序列掺入表达载体并将此类载体引入将表达所需多肽的合适的真核生物或原核生物宿主中后作为DNA表达产物获得，之后可以使用熟知的技术从所述宿主中分离它们。
在另外的方面，本发明涉及生产本发明抗体的方法，所述方法包括由以下组成的步骤：(i)培养根据本发明的经转化的宿主细胞；(ii)表达所述抗体；和(iii)回收所表达的抗体。
本发明的抗体可以通过常规免疫球蛋白纯化方法从培养基中适当地分离，所述方法例如蛋白A-琼脂糖、羟基磷灰石色谱、凝胶电泳、透析或亲和色谱。
本发明的Fab可以通过用蛋白酶(如木瓜蛋白酶)处理本发明的抗体(例如,IgG)来获得。此外，Fab可以通过将编码抗体的Fab的两条链的DNA序列插入用于原核生物表达或用于真核生物表达的载体中，并将载体引入原核或真核生物细胞(视情况而定)以表达Fab来产生。
可以用蛋白酶、胃蛋白酶处理本发明的抗体(例如，IgG)获得本发明的F(ab')2。此外，F(ab')2可以经由硫醚键或二硫键由下述Fab'结合而产生。
本发明的Fab’可以通过用还原剂(例如二硫苏糖醇)处理本发明的F(ab')2来获得。此外，Fab’可以通过将编码抗体Fab'链的DNA序列插入用于原核生物表达的载体或用于真核生物表达的载体中，并将载体引入原核或真核生物细胞(视情况而定)以进行其表达来产生。
6.5使PROTAC增溶和稳定化
PROTAC通常是疏水性的，这限制了它们在体内的可用性，而抗体通常是充分可溶的。因此，本发明的抗PROTAC抗体与PROTAC的降解决定子部分的结合可部分地将PROTAC掩蔽在周围的溶剂之外。其最终结果是抗体结合的增溶作用，即提高的溶解度，这对于体内施用和异种移植研究是有利的。
此外，PROTAC在所述弹头、接头和降解决定子部分中有几个代谢弱点(Goracci,L.等人,J.Med.Chem.63(2020)11615-11638)，这限制了它们的代谢稳定性。通过将PROTAC与本发明的抗体复合，PROTAC对代谢酶的空间可及性受到限制，导致代谢稳定性的提高。
6.6药物组合物
本发明的PAX可以与药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂以及任选地与缓释基质(包括但不限于可生物降解聚合物类、非生物降解聚合物类、脂类或糖类)混合从而形成药物组合物。
因此，本发明的另一方面涉及药物组合物，其包含本发明的PAX和药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。
"药用的"或"药学上可接受的"是指当视情况而定向哺乳动物、尤其是人施用时，不会产生不良的、过敏的或其他不希望的反应的分子实体和组合物。药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂是指任何类型的无毒固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封材料或制剂助剂。
如本文所用，"药学上可接受的载体"包括生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂等。合适的载体、稀释剂和/或赋形剂的实例包括但不限于以下的一种或多种：水、氨基酸、盐水、磷酸盐缓冲盐水、缓冲磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐；氨基酸和衍生物，如组氨酸、精氨酸、甘氨酸、脯氨酸、甘氨酰甘氨酸；无机盐，如氯化钠或氯化钙；糖或多元醇，例如右旋糖、甘油、乙醇、蔗糖、海藻糖、甘露醇；表面活性剂，如聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20、泊洛沙姆188等，及其组合。在许多情况下，在药物组合物中包括等渗剂例如糖、多元醇或氯化钠是有用的，并且制剂还可以包含抗氧化剂，例如色胺和/或稳定剂(例如吐温20)。
药物组合物的形式、施用途径、剂量和方案自然取决于待治疗的病症、疾病的严重程度、患者的年龄、体重和性别等。
本发明的药物组合物可配制用于胃肠外、静脉内、肌内或皮下施用等。
在一个实施方案中，药物组合物含有药学上可接受的用于注射用制剂的溶媒。这些可以是等渗的、无菌的盐水溶液(磷酸一钠或二钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙或氯化镁等或此类盐的混合物)、或干燥的、尤其是冷冻干燥的组合物，其根据情况在添加无菌水或生理盐水时，允许构成可注射溶液。
所述药物组合物可以通过药物组合装置施用。
用于施用的剂量可以作为各种参数的函数进行调整，例如作为所用的施用模式的函数、相关病理学的函数，或可替代地作为所希望的治疗持续时间的函数。
为制备药物组合物，可以将有效量的本发明的PAX溶解或分散在药学上可接受的载体或水性介质中。
适合于可注射用途的药物形式包括无菌水性溶液或分散液；制剂包括芝麻油、花生油或水性丙二醇；和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末；在所有这些情况下，所述形式必须是无菌的和可注射的，可使用适当的设备或系统递送而不会降解，并且其在制造和储存条件下必须是稳定的，并且必须防止微生物(如细菌和真菌)的污染作用。
无菌可注射溶液可以通过将活性化合物以所要求的量与任何以上列举的其他成分(根据需要)合并在适当的溶剂中、随后进行无菌过滤来制备。一般来讲，可以通过将各种灭菌的活性成分掺入无菌溶媒中制备分散液，所述无菌溶媒含有碱性分散介质和所需的来自以上列举的其他成分。就用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末而言，制备方法包括真空干燥和冷冻干燥技术，产生活性成分和来自其先前无菌过滤的溶液的任何其他所需成分的粉末。
例如，对于以水性溶液进行肠胃外施用，在需要时可以将溶液适当地缓冲，并且液体稀释剂首先用足够的盐水或葡萄糖使其等渗。这些水溶液特别适用于静脉内、肌内、皮下和腹膜内施用。在此方面，考虑到本申请，可以使用的无菌水性介质对于本领域技术人员将是已知的。例如，一个剂量可以溶解在1ml等渗NaCl溶液中，并添加至1000ml皮下灌注液中或在建议的输注部位注射(参见例如"Remington's Pharmaceutical Sciences”第15版，第1035-1038和1570-1580页)。剂量的一些变化将必然发生，这取决于接受治疗的个体的情况。在任何情况下，负责施用的人员都将确定单个个体的适当剂量。
本发明的PAX可以配制在治疗混合物中，以包含例如每剂量约0.01至100毫克等。
在一个具体的方面，第一药物组合物包含PAX，并且第二药物组合物仅包含所述PAX的PROTAC组分。
在另一个具体方面，第一药物组合物仅包含PAX的抗体组分，且第二药物组合物仅包括所述PAX的PROTAC组分。
6.7治疗方法和用途
如上下文所述，发明人已经发现，本发明的PAX能够有效地将给定的PROTAC递送至靶细胞。此外，他们已经显示，所述PAX将其PROTAC有效载荷释放到靶细胞的胞质溶胶中，在此处PROTAC介导其靶蛋白的降解。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了用作药物的PAX或其药物组合物。
在另一个方面，本发明提供了治疗受益于降解PROTAC的靶蛋白的疾病(例如癌症)的方法，该方法包括向有需要的个体施用本发明的PAX或药物组合物。
在具体的实施方案中，首先施用PAX或包含所述PAX的药物组合物，随后仅施用PAX的PROTAC组分或包含所述PROTAC的药物组合物，从而使释放了其PROTAC有效载荷的抗体与另外的PROTAC组分结合并将其递送至靶细胞。
在另一个具体的实施方案中，首先施用PAX的抗体组分或包含所述抗体的药物组合物，随后施用PAX的PROTAC组分或包含所述PROTAC的药物组合物，从而使抗体在体内与其PROTAC“抗原”结合并将其递送至靶细胞。
在另外的方面，将PAX的抗体组分用于：(i)增加PROTAC的体内半衰期(即，减缓降解)；(ii)作为PROTAC的延长释放制剂(即，使其在更长的时间内有效)；或(iii)作为抵消PROTAC的毒性作用的一种解毒剂，通过暂时中和毒性作用从而降低毒性阈值。
在一个实施方案中，PAX的抗体组分是抗体片段，例如Fc片段。
6.8非治疗用途
本发明的抗PROTAC抗体，优选单特异性抗体，也可以用于非治疗应用，例如检测、定量或纯化PROTAC。
在一个实施方案中，对于此类用途，将抗体固定在色谱柱或一些其他固体支持物上。
6.9试剂盒
最后，本发明还提供了包含至少一种本发明的抗体或PAX的试剂盒。
含有本发明PAX的试剂盒可用于治疗目的，其可以是单一疗法或联合疗法，在这种情况下，它们含有一种或多种另外的药物组合物，所述药物组合物包含额外的药物成分。治疗性试剂盒还可以包含带有施用说明的包装插页。
含有本发明抗体的试剂盒还可用于诊断或检测目的。在此类试剂盒中，抗体通常偶联到固体支持物上，例如组织培养板或珠(例如，琼脂糖珠)，并用于在体外检测和/或定量PROTAC，例如在ELISA或蛋白质印迹中。这种可用于检测的抗体可以对其提供标记，例如荧光标记或放射性标记。
7实施例
7.1抗PROTAC抗体MIC1和MIC2
7.1.1半抗原缀合
对于免疫原的制备和筛选化合物，将基于VH032的半抗原(VHL-1、VHL-6、VHL-7、VHL-c)(图4)单独溶解于缀合缓冲液(0.1M MES、0.9M NaCl、0.02％叠氮化钠；pH 4.7)中至终浓度为4mg/mL，并与10mg/mL牛血清白蛋白(BSA)或10mg/mL匙孔血蓝蛋白(KLH)、10mg/mL阳离子BSA(cBSA)和7mg/mL人Fc(huFc)(最终的蛋白质:半抗原摩尔比为1:100)的溶液混合。
向该混合物中添加10mg/mL 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)的水性溶液(最终的蛋白质EDC摩尔比1:1750)，并将反应物孵育过夜。将反应混合物用在磷酸盐缓冲盐水(PBS、0.137M NaCl、0.0027M KCl、0.01M Na2HPO4、0.0018M KH2PO4、pH 7.4)中预平衡的Zeba Spin脱盐柱(7K MWCO，Thermo Scientific)纯化。用Bradford试剂，使用未缀合的KLH或BSA作为标准品，确定蛋白质浓度。通过MALDI-MS，针对BSA和huFc缀合物测试缀合效率。针对每个单独的缀合可以导出大概的半抗原与载体蛋白比率(图5)。
7.1.2免疫和杂交瘤筛选
将BALB/c和CD-1小鼠以及SD大鼠用与作为免疫原性载体蛋白的匙孔血蓝蛋白(KLH)缀合的半抗原VHL-1、VHL-6和VHL-7(图4)的等摩尔混合物免疫。在注射免疫原后，使用ELISA，用BSA-半抗原缀合物对所有动物的血清进行两次抗体应答检查。动物显示免疫应答，由此使用杂交瘤筛选，针对VHL配体结合抗体进行免疫库筛选。图6显示详细的工作计划。
7.2MIC抗体的制造
根据制造商的说明，使用来自Life Technologies的相应转染试剂盒和介质，通过Expi293F细胞中重链和轻链的瞬时转染，表达单特异性抗体。将用于重链的50μg质粒DNA和用于轻链的100μg质粒DNA稀释在10mL OptiMEM培养基中。将536μL ExpiFectamine添加至10mL OptiMEM，随后在室温下孵育5min。然后，添加质粒稀释物。在室温下孵育20min后，将混合物添加至180mL Expi293细胞，细胞密度为2.9x106个活细胞/mL。将细胞悬浮液在37C、5％ CO2下、以80rpm、在潮湿气氛中进行孵育。18-22h后，添加1mL增强子1和10mL增强子2。在37℃下，用5％ CO2进行额外孵育4天后，同时在潮湿气氛中摇动，通过离心(30min，以3000rpm)收获抗体，并且用0.22μm瓶顶过滤器进行无菌过滤。
通过蛋白A亲和色谱，使用系统对上清液进行纯化，随后通过制备型SEC(HiLoad 16/60Superdex 200制备级)除去聚集物。使用Ultra离心过滤单元(30k MWCO，Amicon)对抗体进行浓缩，无菌过滤，并且通过UV–VIS光谱学，在280nm处确定蛋白质浓度。通过分析型SEC、SDS-PAGE和LC-MS来表征抗体。
7.3与PROTAC结合的抗体的通用性
通过表面等离子共振(SPR)，在Biacore T200仪器中确定命中抗体MIC1和MIC2与不同组的基于VH032的PROTAC的结合亲和力(图8)。运行缓冲液由PBS、0.05％ Tween-20、2％DMSO组成，并且将温度和流速分别设置为30℃和30μL/min。测定设置示例性地描述在图7中。使用标准EDC/NHS化学，在CM5传感器芯片上包被抗体(＝配体；2500RU)。将PROTAC(＝分析物)在运行缓冲液中连续地稀释(1μM–1.9nM)，在连续运行中注入到仪器中，并且由抗体捕获，导致相应的SPR应答增加。结合步骤(300s)后，将运行缓冲液注入600s，并且PROTAC从抗体解离，导致信号减少。每次运行后，通过注射10mM甘氨酸/HCl，pH 1.5，持续2x 30s，将结合的残余PROTAC从固定化的抗体中除去，以再生抗体用于下一个结合和解离循环。为补偿基质效应，从测量的SPR应答信号减去分析物对省略配体的失活(EDC/NHS，乙醇胺)参考表面的应答。此外，进行DMSO溶剂校正，并且从分析物应答减去运行缓冲液信号。校正的应答通过1:1动力学结合模型拟合，得到PROTAC的结合速率(kon)和解离速率(koff)及其解离常数(KD)。
对于与16个不同PROTAC组合的MIC2，亲和力参数以表格形式总结(表2)，具有相应的KD、结合速率kon和解离速率koff。16个PROTAC中的13个(81.3％)用纳摩尔KD与MIC2结合。表2还包括能够与未被MIC2结合的1个PROTAC结合的MIC1的亲和力数据。
表2：使用MIC2的1:1动力学结合模型所获得的MIC2和PROTAC(参见图8的结构)的组合的亲和力参数KD、结合速率kon、解离速率koff的综述以及来源于稳态模型的PROTAC与MIC1结合的KD。NM＝未测量；NB＝未结合。
7.4使用MIC2和PROTAC制造PAX
通过将甘氨酸-丝氨酸接头序列、随后是抗EGFR VHH抗体序列或抗HER2 scFv序列C末端基因融合至MIC2的重链，将抗体MIC2重新格式化为双特异性形式。如前所述进行了单特异性抗体的生产。选择EGFR和HER2，因为它们是在细胞的细胞表面上表达的肿瘤相关抗原，因此易于抗体结合。此外，它们已经被应用于抗体-药物缀合物的开发，就肿瘤模型可用性、充分表达和内化而言这支撑了它们作为靶标的实用性。
复合如下进行：在PBS pH 7.4中，将10μM(最终)aEGFRxMIC2或aHER2xMIC2与GNE987在DMSO中混合以实现所希望的载荷(表3)。添加含5％ Tween-20的PBS pH 7.4溶液至终浓度为0.3％。在25℃下，将样品在ThermoMixer上孵育3h，同时以650rpm摇动。不添加水性Tween-20，使用尺寸排阻色谱法用于复合物研究。
表3：对于实现所希望的载荷所需要的最终PROTAC浓度的概述。
再次评估对一组PROTAC的亲和力以确认PROTAC结合。总体而言，双特异性抗体的亲和力与MIC2的亲和力相当(图9)。
7.4.1载荷依赖性复合
aEGFRxMIC2载荷0、10％、25％、50％、75％和100％ GNE987 PROTAC，并立即注射到SEC系统中。抗体aEGFRxMIC2在3.15min被洗脱。第二个峰在3.48min处出现，其中增加的载荷对应于载荷一个PROTAC分子的抗体aEGFRxMIC2。进一步增加载荷导致在4.04min处出现第三个峰(每种抗体中两个PROTAC)。总体而言，随着载荷的增加，峰值分布向较晚的洗脱时间移动(图10)。
7.4.2完全载荷的复合物的纯化和复合物稳定性
向aEGFRxMIC2抗体装载200％ GNE987。根据制造商的说明书，将样品一分为二，并且使用Zeba Spin脱盐柱、40K MWCO、75μL将一部分脱盐至PBS pH 7.4。色谱图显示DMSO被去除且PROTAC在约5.7min被洗脱(图11)。
整合图11的峰，并针对未经纯化的和经纯化的抗体-PROTAC复合物绘制峰值分布(图12)。峰值分布不受脱盐过程的影响，这表明PAX可以从过量的PROTAC或其他小分子中纯化而不会对PROTAC载荷产生任何影响。
在室温下，以10μM的蛋白质浓度，在70h的时间段内对aEGFRxMIC2+GNE987复合物进行研究，以评估复合物在PBS pH 7.4中随时间的稳定性。峰值分布不受孵育时间增加的影响(图13)，表明复合物稳定性超过70h。
7.5PAX方法的功能性
7.5.1共价PROTAC-ADC
根据WO 2020086858 A1，通过将1(图14)与携带L328C突变的抗EGFR抗体西妥昔单抗(C225)缀合来制备对照PROTAC-ADC。根据质谱仪，最终缀合物具有1.62的药物/抗体比率，同时具有97.0％的单体含量。
7.5.2BRD4降解
由于BRD4降解后诱导的强烈药理作用(细胞死亡)，选择BRD4作为所公开的发明的模型蛋白。为评估靶向的BRD4降解，将MDA-MB-468细胞接种在黑色96孔透明底板(10,000细胞/孔)中，随后在湿度箱(37℃，5％ CO2)中孵育过夜。使用D300e数字分配器(Tecan)添加测试化合物，并孵育43h(37℃、5％ CO2、湿度箱)。将细胞用PBS洗涤3次，在室温下固定于2％(v/v)甲醛中持续15min，并再次洗涤(3x)。为使细胞透化，在室温下添加0.2％(v/v)Triton-X-100持续10min，并通过PBS洗涤(3x)除去。将孔用含3％(w/v)BSA的PBS在室温下封闭60min，洗涤两次，并将细胞用2.3μg/mL稀释在3％ BSA/PBS中的兔抗BRD4抗体(Abcam)在4℃下孵育60min过夜。在用PBS洗涤(3x)后，将细胞与二次标记的AF488山羊抗兔抗体(5μg/mL，在3％ BSA/PBS中)在黑暗中室温下孵育120min，洗涤两次，并用Hoechst33342(5μg/mL，3％ BSA/PBS)在黑暗中室温下将细胞核染色90min。最终的洗涤步骤后，将细胞保存在0.1％(w/v)叠氮化钠中，并转移至Cytation 5细胞成像读取器(Biotek)中。应用DAPI(nucleus)和绿色荧光蛋白质(BRD4)过滤立方体拍摄图像，并用BioTek gen5数据分析软件进行处理。对于核BRD4水平的定量分析，仅对用DAPI染色共定位的绿色荧光(AF488)计数。将绿色荧光标准化为细胞数，并相对于未经处理的细胞进行表示。
图15显示BRD4水平的示例性图像。重要的是注意到较高的荧光表明BRD4在MDAMB468细胞中的更高可用性。未经处理的细胞显示出最强的绿色荧光，其可被GNE987，基于EGFR抗体西妥昔单抗(短C225)的抗EGFR PROTAC-抗体-药物缀合物C225-L328C-GNE987和载荷50％ GNE987的aEGFRxMIC2介导的BRD4降解所抑制。这些分子对BRD4降解具有相当的影响。通过与不结合MDAMB468细胞的aHER2xMIC2复合可以降低GNE987的降解诱导。
细胞核中的荧光可用于定量分析物的降解效果(图16)。在整个浓度范围内，已经在荧光图像中观察到的趋势变得再次可见(图16A)。在4nM处理浓度处放大BRD4值，以便于更简单的比较(图16B)。GNE987具有最强的降解效果，剩余BRD4降至39.0％。载荷GNE987的aEGFRxMIC2和C225-L328C-GNE987以几乎相同的方式降解BRD4(分别为44.0％和44.2％)。与相应的aEGFRxMIC2+GNE987复合物相比，由载荷GNE987的aHER2xMIC诱导的降解达到57.3％，降低了13.3％。
结论
与GNE987复合的aEGFRxMIC2在表达EGFR的MDAMB468细胞中诱导BRD4降解，类似于PROTAC GNE987和PROTAC抗体药物缀合物C225-L328C-GNE987。由于缺少HER2表达，aHER2xMIC2+GNE987复合物不能进入MDAMB468细胞，观察到与GNE987复合的aHER2xMIC2ed减少了BRD4降解。
7.5.3通过递送抗体介导的BRD4降解性PROTAC的选择性细胞杀伤
BRD4降解已经被证明在若干细胞系上诱导有效的细胞杀伤，其中效力在纳摩尔至亚纳摩尔范围内(Pillow,T.H.等人,ChemMedChem 15(2020)17–25)。
将2000个细胞/孔接种到白色不透明384孔板中，然后在37℃和5％ CO2的湿度箱中孵育过夜。如章节7.4所述进行复合。
使用Tecan D300e分配器，基于抗体浓度将溶液添加至细胞中，并使用在PBS pH7.4和DMSO中的0.3％ TW20将所有孔标准化至相同体积。如果没有另外说明，则在3天后使用制造商方案中描述的CellTiter-Glo发光细胞活力测定法进行开发测定。简言之，将板平衡至室温持续30分钟。将100mL CellTiter-Glo缓冲液添加至CellTiter-Glo底物烧瓶并充分混合。将30μL试剂转移至每个孔。在室温下孵育3分钟，同时以550rpm摇动后，将板在室温下再孵育10分钟。发光是在Envision读取器上读取的。使用GraphPad Prism 8，通过将用样品处理的细胞标准化为未经处理的细胞来进行评估。用4点对数曲线拟合数据以确定IC50值。
在高表达EGFR的MDAMB468细胞上，BRD4降解性PROTAC GNE987以及结合EGFR的PROTAC抗体缀合物C225-L328C-GNE987(DAR＝1.62)和与50％ GNE987(1:1)复合的靶向EGFR的双特异性抗体aEGFRxMIC2具有相当的效力。GNE987的细胞毒性作用通过用VH032结合性抗体MIC2以及非结合性aHER2xMIC2+GNE987(1:1)进行孵育来阻抑(图17)。在经测试的浓度范围内，不具有PROTAC的双特异性抗体对细胞活力没有影响。
双特异性抗体和抗VH032抗体MIC2的载荷降低至25％，降低了靶向EGFR的复合物aEGFRxMIC2+GNE987(1:0.5)的效力。同时，在较低的载荷下，非结合的对照aHER2xMIC2和MIC2对细胞活力的影响也减少了(图18)。
非结合的对照复合物MIC2+GNE987和靶向EGFR的aEGFRxMIC2+GNE987的效力取决于复合物的载荷(表4)。
表4：与载荷为25％和50％的GNE987复合的结合EGFR的aEGFRxMIC2和非结合的对照MIC2的IC50值。
选择性指数可以通过将非结合的对照复合物的效力除以针对每个相应载荷的靶向EGFR的aEGFRxMIC2+GNE987复合物来计算。对于50％(1:1)载荷，选择性指数达到12.9，并且对于25％(1:0.5)载荷，选择性指数为29.4。
实验以生物学一式三份进行。分子的效力总结在表5中，并在图19中图示。
表5：结合EGFR的aEGFRxMIC2+GNE987复合物和对照在MDAMB468上的IC50值。
效力和标准差来源于三个独立的实验。
与非结合性aHER2xMIC2与GNE987的复合物相比，GNE987与结合EGFR的aEGFRxMIC2的复合物导致效力升高42倍，并且与非结合性MIC2抗体与GNE987的复合物相比较，导致效力升高21倍。
此外，在EGFR阴性细胞系HEPG2上研究了与50％ GNE987复合的aEGFRxMIC2以及aHER2xMIC2，连同若干个基准，包括单独的PROTAC GNE987、非靶向性MIC2+GNE987复合物和PROTAC-ADC靶向性EGFR(C225_L328C-GNE987)(图20)。虽然PROTAC自身对HEPG2细胞具有强抗增殖作用，其中IC50值为3.1nM，所有基于抗体的构建体具有IC50值>100nM。与GNE987复合的aEGFRxMIC2和MIC2阻抑GNE987的毒性最强并在100nM处仅诱导最小毒性(约10％)。
结论
细胞活力测定数据支撑BRD4降解数据。A)与PROTAC-ADC C225-L328C-GNE987和PROTAC GNE987相比，aEGFRxMIC2+GNE987(50％)复合物对表达EGFR的MDAMB468细胞表现出类似的细胞毒性作用。B)不能进入细胞，因为它们完全缺乏靶向性部分(MIC2+GNE987(50％))或因为抗体的靶受体不在MDAMB468(aHER2xMIC2+GNE987(50％))上表达的抗体复合物具有降低的抗增殖作用。此外，在不表达EGFR的HEPG2细胞上，与缺少靶向性部分的单独的PROTAC相比，所有基于抗体的复合物和缀合物的细胞毒性降低。
7.5.4额外PROTAC的靶向递送
为证明另一个PROTAC的靶向递送，将具有亲水性PEG接头的GNE987类似物GNE987P(图21)与MIC2或aEGFRxMIC2复合，并且在表达EGFR的MDAMB468细胞上进行孵育(图22)。在0.1–10nM的浓度范围内，与单独的GNE987P相比，aEGFRxMIC2+GNE987P介导增加的细胞毒性，表明通过aEGFRxMIC2的GNE987P的靶向细胞内递送，而非结合的对照构建体MIC2+GNE987P的毒性显著更低。
7.6小鼠血清稳定性
将抗体aEGFRxMIC2与GNE987混合，使得终浓度各自为40μM。将混合物在室温下孵育2小时，同时以650rpm摇动。将15％(vol/vol)2M HEPES缓冲液pH 7.55添加至来自Biowest(批号S18169S2160)的小鼠血清，随后进行无菌过滤。
使用小鼠血清-HEPES混合物，将aEGFRxMIC2+GNE987和GNE987稀释至5μM，并且在37℃和5％ CO2下孵育0、2、4、6、24、48、72和96小时。通过在-20℃下冷冻停止孵育。
使用LC-MS，对PROTAC GNE987的浓度进行定量。与aEGFRxMIC2复合的GNE987和GNE987在72小时内是稳定的(图23)。
另外，在小鼠血清中孵育96小时的样品中对完整aEGFRxMIC2抗体的浓度进行定量。使用总抗体ELISA进行定量(图24)。完整抗体的浓度不受影响，表明双特异性抗体的高血浆稳定性。
另外，将与GNE987复合的aEGFRxMIC2在小鼠血清中孵育0和96小时，随后对样品进行亲和力捕获测定。因此，将珠涡旋并转移到1.5mL LoBind管中，然后用500μL HBS-E缓冲液洗涤三次。将0.2μg/μL生物素SP(长间隔子)AffiniPure山羊抗人IgG(Fcγ片段特异性)添加至珠中，并在旋转器上孵育2h。将珠用500μL HBS-E缓冲液洗涤三次。将20μL 0.5μg/μL样品用HBS-E缓冲液稀释至0.1μg/μL，添加至珠中，并在旋转器上孵育2h。收集上清液。将100μL乙腈添加至珠中，然后以1000rpm进行30min孵育，并且收集洗脱液。使用LC-MS/MS从上清液和洗脱液中定量GNE987。
在血清上清液中未检测到GNE987，而洗脱液仍包含96.7％与抗体结合的完整GNE987。令人惊讶地，在洗脱液中96h后仍能检测到抗体结合的GNE987，表明其具有高稳定性(图25)。
7.7储存稳定性
在复合(6mg/mL、650rpm、3h、室温)后，通过在4℃下的冰箱中孵育超过96h，以及快速冷冻复合物并在-80℃下储存24h或在-20℃下储存96h来评估抗体-PROTAC复合物的储存稳定性。随后检查样品的可见变化，使用DLS测量来评估多分散性，并通过SE-HPLC测量载荷(表6)。具有多分散性高达15％的样品被认为是单分散的。
表6：在PBS pH 6.8，最终的5％ DMSO中抗体PROTAC复合物的储存稳定性评估。
数据不仅表明因为多分散性和载荷基本保持不变复合物的高储存稳定性，而且由于在MIC2存在下疏水性GNE987不沉淀，观察到对PROTAC疏水性的屏蔽作用。
7.8基于VHH的抗体和PAX
7.8.1免疫
用替代性基于KLH的和基于cBSA的免疫原使新世界骆驼科动物(美洲驼)(NWC)免疫(计划图26)。用huFc半抗原缀合物进行血清ELISA测定，以监测VHL配体特异性免疫应答。所有动物在免疫后均表现出免疫应答。
7.8.2抗体基因文库
从三个经免疫的NWC的免疫库中生成免疫文库，用于选择VHL配体特异性抗体。从动物的血液中分离外周血单核细胞(PBMC)。提取、纯化RNA并用于cDNA合成。然后，将cDNA库用于通过PCR扩增VHH基因序列，克隆到VHH抗体噬菌体展示载体中，并用于转化大肠杆菌(E.coli)。通过连续稀释和菌落计数来确定抗体基因文库的大小。此外，插入率通过cPCR确定，并且通过DNA序列分析确定具有功能性ORF的克隆数量。然后，将转化的细菌繁殖，并用于抗体噬菌体颗粒的包装。在纯化抗体噬菌体颗粒后，通过抗体-噬菌体颗粒的SDS-PAGE、蛋白质印迹和抗pIII免疫印迹染色来检查抗体pIII融合蛋白的存在。以下给出文库特征的综述(表7)：
表7：使用噬菌体展示的抗体命中发现策略的文库特征。
7.8.3抗体发现
首先，从文库中清除非特异性或交叉反应性抗体噬菌体。出于此目的，将文库在固定化的链霉亲和素、磁性链霉亲和素珠和BSA的存在下孵育。从进一步选择中除去与阴性抗原结合的抗体-噬菌体。
之后，选择经清除的文库用于靶抗原特异性抗体。出于此目的，获得VH032和具有侧胺的聚乙二醇化交联剂的缀合物(Sigma-Aldrich；图27)，并经由生物素-NHS-酯偶联进行生物素化。将生物素化的VH032纯化，并通过HPLC进行分析。首先，将生物素化的VH032添加至经清除的文库制备物中。捕获与生物素化的靶抗原结合的抗体噬菌体，并使用磁性链霉亲和素珠从溶液中回收。将珠用BSA溶液(含有0.05％ Tween20)和PBS洗涤多次，以便于除去非特异性或弱结合的抗体噬菌体颗粒。通过胰蛋白酶处理从珠中洗脱抗原特异性抗体噬菌体，并通过大肠杆菌感染来挽救。短时间繁殖后，将细菌与M13K07辅助噬菌体共感染，并诱导抗体噬菌体扩增。如上所述，将源自免疫文库的经扩增的噬菌体用于另外两个选择循环。
7.8.4抗体筛选
在抗体噬菌体选择后，通过ELISA对单克隆抗体克隆的结合特征进行分析。对于免疫文库，使用第二和第三选择循环后的选择输出。挑选384个单一克隆用于细菌中的VHH抗体表达。通过ELISA对以下项测试产物的结合特异性：
链霉亲和素+生物素化的VH032
链霉亲和素
人类Fc-VHL-1
人类Fc
抗体克隆被鉴定为抗原特异性，条件是：
ELISA结合信号相对阳性抗原为≥0.1
ELISA结合信号相对于阴性抗原为≤0.1
阳性和阴性抗原之间的信号与噪声(S/N)比率为≥10
所有562个命中物均用于DNA序列分析，以鉴定具有独特抗体序列(≥CDR中的1个氨基酸差异)的抗体。从NWC文库中鉴定出113个独特克隆。
为鉴定具有最佳结合亲和力的克隆，进行了BLI脱落率测量。首先，由独特克隆产生含有VHH的培养上清液。之后，对抗体片段与固定在BLI链霉亲和素传感器上的生物素化VHL的结合和解离进行测量。将结合曲线用1:1结合模型拟合，并计算解离速率。
基于脱落率和抗体序列信息，选择10个主要克隆(命名为MIC5–MIC14)用于转换为最终格式。
7.8.5抗体转换
通过PCR从噬菌粒DNA中扩增VHH基因，并将其克隆到两种不同的IgG表达载体中。一种表达载体编码靶向EGFR的西妥昔单抗IgG抗体。另一种表达载体编码CD33靶向性吉妥珠单抗IgG抗体。为将VHH抗体片段插入表达载体中，将其基因融合至IgG抗体重链的C末端。将抗体片段与IgG重链经由短的GS-接头(GSGGGSGGSGGGGSG(SEQ ID NO:28))分开，生成以下形式：HC-接头-VHH。
在序列验证和制备转染级DNA后，将HEK细胞用一个VHH克隆的表达载体瞬时转染。抗体由HEK细胞产生并分泌到培养基中持续7天。通过离心从细胞中清除培养上清液后，将IgG抗体通过蛋白A亲和色谱进行纯化。将缓冲液调节至PBS后，通过UV/VIS光谱法确定抗体的蛋白质浓度。在还原条件下，通过SDS-PAGE对抗体的完整性和纯度进行评估。通过ELISA测定抗体与靶抗原的功能性结合活性。
此外，使用相同的程序生产亲本抗体，以便能够比较亲本抗体与融合蛋白的表达率。图28中举例说明了与西妥昔单抗和吉妥珠单抗的VHH融合物的数据，表明VHH融合物对可生产性没有重大影响。
7.8.6与PROTAC结合的VHH的可逆性
通过SPR对蛋白质-PROTAC相互作用的动力学和亲和力参数进行评估。在25℃下，经由标准胺偶联程序，将抗PROTAC VHH克隆MIC5-MIC14固定化为在CM5(系列S)传感器芯片上的CD33或CLL1抗体融合物(在章节7.9中描述了融合蛋白的制造和所用的接头)。在固定之前，将芯片的羧甲基化表面用400mM 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺和100mMN-羟基琥珀酰亚胺活化7min。将作为CD33和CLL1抗体融合物的命中抗PROTAC VHH稀释为10mM乙酸酯中10μg/mL，pH 4.5，并且固定在活化的表面芯片上持续7min，以便于达到3,000至6,000个应答单元(RU)。用10min注射1M乙醇胺pH 8封闭剩余活化的羧甲基化基团。在固定过程中，将由10mM HEPES pH 7.4和150mM NaCl组成的HBS-N用作背景缓冲液。
将PROTAC预稀释于DMSO中，以1:50稀释于运行缓冲液(12mM磷酸盐pH 7.4、137mMNaCl、2.7mM KCl、0.05％ Tween20、2％ DMSO)中，并使用两倍稀释系列，从1μM至0.002μM，以十种不同浓度注射。进行DMSO溶剂校正(1％-3％)以解释大部分信号的变化并获得高质量的数据。相互作用分析循环包括300秒的样品注射(30μL/min；结合阶段)和之后的900秒缓冲液流(解离阶段)。
通过首先减去从对照表面(参考流量通道)记录的结合应答，随后从活性流量通道(固定的靶蛋白)减去缓冲液空白注射来对所有传感图进行处理。将所有数据集拟合到简单的1:1Langmuir相互作用模型中以确定动力学速率常数。在25℃下，在Biacore 8k+(Cytiva,Uppsala,Sweden)上进行实验，并使用提供的Biacore Insight Evaluation软件对相互作用进行评估。
将结果总结在表8中。本研究的PROTAC是基于其化学结构选择的，以测试尽可能多样化的一组分子。一般来说，所有抗体都以次纳摩尔至三位数纳摩尔亲和力结合一系列PROTAC。
在所有经测试的变体中，MIC7抗PROTAC VHH以单位数纳摩尔甚至次纳摩尔亲和力与绝大多数PROTAC结合时具有最有利的结合图谱。MIC7克隆容忍所有PROTAC，其中与蛋白质结合部分的接头存在于R1和R2中，而不存在于R3中。关于接头化学，没有观察到对任何种类的MIC7-PROTAC结合的负面影响。此外，MIC7容忍R4中常见的甲基基团。最后，用CLL1结合性抗体MIC7 VHH融合物(CLL1xMIC7)代替结合CD33的抗体融合物进行的SPR PROTAC结合测量表明，PROTAC结合不受与其他抗体融合的影响，因为结合亲和力不受影响(表8)。
表8：使用SPR确定VHH克隆与PROTAC的亲和力(KD)。通过在抗CD33或抗CLL1抗体的重链上添加C末端，研究了作为抗体融合蛋白的VHH。N/D–未检测的(可以在图8中发现完全的PROTACS结构)
7.9基于VHH的PAX的制造
将VHH抗体片段融合至IgG型抗体的重链和轻链，以允许将PROTAC递送至各种疾病相关的细胞系。如下制备融合物：抗体的重链或轻链或重链和轻链在c末端通过接头(GSGGGSGGSGGGGSG(SEQ ID NO:28))延长，然后是VHH的序列(例如，YU734-F06(MIC7))。通过这种方式，可以生成如图3所示的双特异性抗体，所述抗体能够识别细胞表面受体，并同时与PROTAC的VHL配体结合。可以将接头-VHH(接头：GSGGGSGGSGGGGSG(SEQ ID NO:28))序列与HC、LC或两者融合多次，作为重复单元(如接头-VHH-接头-VHH，即，两个重复)。每条链最多3个接头-VHH与HC、LC或两者融合。命名如下：经由以上提及的接头，与一个MIC7 VHH融合至每条重链C末端的CD33靶向性抗体被命名为CD33xMIC7。这是以下命名法的唯一例外，所述命名法用于所有其他构建体：在此，应用一般的式：CD33xMIC7NHML，其中N和M是2、4、6。“H”表示融合是在重链上进行的，并且“L”表示融合到LC。如果没有VHH融合至HC或LC，则相应的字母消失。例如，与两个MIC7 VHH(接头-VHH-接头-VHH，即两个重复序列)融合至每条重链C末端以及每条轻链C末端的CD33靶向性抗体被称为CD33xMIC74H4L。用于生成双特异性融合蛋白和骨架改变的抗体骨架描述在表9中。表10通过实例方式，显示了PAX靶向性CD33的命名法。
表9：与VHH抗体片段融合的IgG型抗体骨架
在章节7.2中进行抗体生产。如下进行复合以产生PAX：将10μM(最终)抗体-VHH融合物与DMSO中基于VHL的PROTAC在PBS pH 7.4中混合以获得所希望的载荷(表3)。确定用于体内应用的PAX按68.8μM的抗体浓度复合。
为了分配，添加PBS pH 7.4溶液中的5％ Tween-20至终浓度为0.3％。在25℃下，将样品在ThermoMixer上孵育3h，同时以650rpm摇动。
表10：靶向CD33的PAX的命名。
7.10基于VHH的PAX的细胞表征
7.10.1作为西妥昔单抗和吉妥珠单抗(gemtuzumab)的融合物，基于VHL的PROTAC结合抗体的片段细胞谱分析
基于吉妥珠单抗(gemtuzumab)和西妥昔单抗的VHH融合物通过将VHH经由接头(GSGGGSGGSGGGGSG(SEQ ID NO:28))c末端基因连接至章节7.9中所述的各自抗体的HC。在表达和纯化后，抗体融合蛋白以1:1比率载荷GNE987(50％载荷)。通过这种方式，可以关于VHH抗体片段诱导靶阳性细胞上的细胞杀伤(如章节7.10.5所述)或防止非选择性摄取到非靶向细胞中的能力来表征10个VHH抗体片段。将结果描述于表11中。作为选择性的度量，引入了选择性指数。首先，通过将基于吉妥珠单抗(gemtuzumab)的构建体的效力除以基于西妥昔单抗的构建体的效力，获得了允许在相同的细胞环境中比较构建体的选择性指数。在这种情况下，克隆MIC5-MIC8具有最高的选择性指数，这证明了这些构建体在细胞培养基中、3天孵育时间内与PROTAC结合。其次，基于西妥昔单抗的构建体对EGFR阴性HEPG2细胞的效力除以相同构建体对EGFR阳性MDAMB468细胞的效力，这是由受体-表达依赖性摄取介导的选择性的量度。在这种情况下，构建体MIC7-MIC10产生最高的选择性指数。指示高选择性的一个额外参数是在HEPG2细胞上载荷PROTAC的融合蛋白的效力，其中预期没有细胞毒性。单独的PROTAC在HEPG2上具有2.6nM的IC50值。这表明PROTAC已经在细胞外释放，导致有效力的细胞杀伤。与此相反，基于VHH的构建体产生了强大的解毒作用，其效力>100nM。总体而言，克隆MIC5、MIC7和MIC10表现出有希望的特性，特别是当考虑到亲和力时(章节7.8.6)。
表11：在EGFR阳性MDAMB468细胞和MDAMB468阴性HEPG2细胞上，与PROTAC GNE987组合的结合CD33的吉妥珠单抗(gemtuzumab)(G)和基于结合EGFR的西妥昔单抗(c)的VHH融合蛋白的细胞谱分析。将IC50值用于计算选择性指数。
7.10.2骨架抗体的细胞结合不受VHH融合物和PAX载荷PROTAC的影响
使用流式细胞术，对经由描述于章节7.9中的接头(GSGGGSGGSGGGGSG(SEQ ID NO:28))，与结合CD33的抗体吉妥珠单抗(gemtuzumab)(IgG4-PG-SPLE)或结合EGFR的抗体西妥昔单抗连接的VHH融合物与细胞结合的影响进行了研究。因此，对不具有VHH MIC5融合物的CD33xMIC5和CD33 Ab与表达CD33的MV411细胞的结合进行了评估。将1x105个MV411或MDAMB468细胞接种在圆底96孔板中，用含有1％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)的PBS pH 7.4洗涤三次，然后与各自的抗体在冰上孵育30min。随后，将细胞用PBS pH 7.4、1％(w/v)BSA洗涤三次，并与经荧光标记的二抗Alexa Fluor 488AffiniPure Fab片段山羊抗人IgG(H+L)在冰上孵育30min。随后，将细胞用PBS pH 7.4、1％(w/v)BSA洗涤三次。在IntellicytiQue3 Screener上，通过流式细胞术对细胞进行分析，并经由IntelliCyt ForeCytEnterprise Client Edition 8.0(R3)软件进行分析。将细胞培养在RPMI-1640+10％ FCS中。直接比较表明，添加VHH MIC5对细胞结合没有影响(图29)。
随后，研究了与PROTAC融合的抗体-VHH的载荷在多大程度上影响细胞结合行为。因此，对于结合CD33的抗体-VHH融合物CD33xMIC7，测定了与HL60、MOLM13、MV411、RAMOS和U937的细胞结合。对相同分子载荷90％ GNE987的结合进行了评估。作为同种型非结合的对照，使用地高辛结合抗体。在用于细胞染色之前，将CD33xMIC7在25℃下孵育3h，并以650rpm在PBS中摇动，PBS含有1％ FCS与按1.8倍摩尔过量5％ DMSO溶解的GNE987。在用5％ DMSO孵育时对同种型非结合的对照进行分析。从每个细胞系中，每种条件下取200,000个细胞，离心，并在4℃下，与各自的抗体、抗体-VHH融合物或PAX在200μl PBS(含1％ FCS，按10μg/ml的浓度)中孵育45min。在用含有1％ FCS的PBS进行淬灭和一个洗涤步骤后，随后用荧光素标记的抗人类抗体#607(1:50)将样品再处理45min。在用含有1％ FCS的PBS淬灭后，将细胞重悬浮于含有1μg/mL碘丙啶(PI)染色的PBS中，在Becton Dickinson FACSCalibur流式细胞仪上进行分析的过程中排除死细胞。使用来自Turku Bioscience的Flowing软件进行定量分析。将细胞培养在RPMI-1640+10％ FCS中。
如图30所示，具有PROTAC的抗体-VHH融合物的载荷对结合没有影响。同种型对照抗体显示出与细胞系组的结合强烈减少。
7.10.3CD33 PAX(含pHAb染料)内化到CD33阳性细胞中
为阐明PAX摄取是否由受体介导的内吞作用介导，CD33xMIC7载荷pH应答性VH032-pHAb染料(图31)。VH032-pHAb染料是pH传感器，在pH>7时仅表现出最小的荧光，但在酸性pH下表现出显著增强的荧光。因此，CD33xMIC7+VH032-pHAb染料在受体介导的内化后运输到酸性内体和溶酶体囊泡中，应产生增强的荧光信号。在用于细胞染色之前，将CD33xMIC7在25℃下孵育2h过夜，以650rpm在PBS中，PBS含有按1.8倍摩尔过量5％DMSO-溶解的VH032-pHAb染料。将CD33阳性MOLM13、MV411、U937和受体阴性RAMOS细胞用所得的PAX或用单独的VH032-pHAb染料处理，作为对照。从每个细胞系中取每种条件下200,000个细胞，离心，并与PAX在200μL PBS和10μg/ml浓度下的1％ FCS中在37℃下孵育6h，并以650rpm在黑暗中摇动。作为对照，将细胞用等摩尔浓度的VH032-pHAb染料单独处理。在用含有1％ FCS的PBS进行一个洗涤步骤后，将细胞重悬浮于含1％ FCS的400μl PBS中，并在Becton DickinsonFACSCalibur流式细胞仪上进行细胞计数分析。没有进行用碘丙啶(PI)对死细胞的染色以省去对VHL-pHAb染料的干扰。使用来自BD biosciences的FlowJo进行定量分析。将细胞培养在RPMI-1640+10％ FCS中。
与对照相比，对于用CD33xMIC7+VH032-pHAb染料处理的细胞在所有CD33阳性细胞系上都发现了增强的荧光信号，而对于受体阴性RAMOS细胞没有发现增强的平均荧光强度(图32)。这些结果表明PAX是经由受体介导的抗体内化而被吸收的。
7.10.4CD33xMIC7+GNE987 PAX诱导靶向细胞中的BRD4降解
为表明PAX可以介导靶蛋白在靶向细胞中降解，进行BRD4蛋白质印迹降解测定(图33和图34)。因此，按不同的浓度，将CD33阳性MV411细胞用CD33xMIC7+GNE987或DIGxMIC7+GNE987处理作为非结合性PAX对照，并且将单独的GNE987作为对照。将MV411细胞在补充有10％ FCS和青霉素-链霉素的RPMI-1640培养基中进行培养。将MV411细胞按1百万个细胞/ml于2ml培养基中接种于12孔板，并在37℃和5％ CO2下于细胞培养箱中培养过夜。如章节7.4所述进行复合。GNE987仅在相同条件下进行预孵育，但不存在抗体。随后，使用Tecan分配器，用各自浓度的CD33xMIC7+GNE987(1:1)、DIGxMIC7+GNE987(1:1)或GNE987通过纳米滴分散处理细胞。将所有条件标准化为0.0005％(v/v)DMSO和3.0E-5％Tween20。将细胞在37℃和5％ CO2下的细胞培养箱中孵育24h。收集经处理的细胞，在PBS中洗涤，并在补充有Roche cOmplete蛋白酶抑制剂混合物的细胞裂解缓冲液(20mM TRIS pH7.4、100mM NaCl、1mM EDTA、0.5％ TritonX-100)裂解细胞颗粒。在冰上孵育10min后，通过在15,000xg、4℃下离心来清除粗裂解物，并用丙酮沉淀清除的裂解物。将干燥的颗粒溶解在SDS载荷的缓冲液中。经由Mettler Toledo UV5Nano光度计测定蛋白质浓度。将样品(50μg/泳道)应用于4-12％ Bis-Tris SDS-PAGE凝胶(Thermo Fisher Scientific)。凝胶运行后，将样品转移到硝化纤维素膜(Sigma Aldrich)上，用0.1％ TBS-Tween20中的5％脱脂奶封闭膜，并与指示的一抗(表12)一起孵育。
表12：用于蛋白质印迹分析的一抗
靶标 宿主 供应商 工作稀释 缓冲液
BRD4 兔 Cell Signaling Technology 1:1000 5％脱脂奶，0.1％TBS-T
肌动蛋白 小鼠 Thermo Fisher 1:10.000 5％脱脂奶，0.1％TBS-T
在与相应的经HRP标记的抗兔/小鼠二抗(GE-Healthcare)以1:10,000稀释孵育后，使用ECL溶液(Advansta)和x射线胶片(GE-Healthcare)检测印迹。用ImageJ软件(1.53K版，NIH)分析结果。将背景减去的BRD4信号标准化为相应的肌动蛋白信号，并将溶剂对照的标准化的BRD4信号设置为100％。
正如预期的那样，用单独的GNE987处理发现BRD4降解。此外，对于CD33xMIC7+GNE987观察到浓度依赖性BRD4降解，而在所有浓度下，未观察到非结合性PAX对照DIGxMIC7+GNE987的降解(图33和图34)。这些结果表明PAX能够介导目的细胞内蛋白质的浓度依赖性和细胞型(靶受体)选择性降解。
7.10.5CD33xMIC5+GNE987 PAX诱导依赖于受体表达和PAX载荷的细胞毒性作用
按照下述程序进行了若干个细胞活力实验：
将不同培养基中的细胞接种到经白细胞培养物处理的平底且透明的多孔板中，然后在37℃和5％ CO2下于湿度箱中孵育过夜。如章节7.4所述进行复合。
基于抗体浓度，使用纳米滴分散，用Tecan D300e数字分配器将溶液添加至细胞，并使用在PBS pH 7.4和DMSO中的0.3％ TW20将所有孔标准化为相同体积至最终的溶剂浓度为0.05％ DMSO和0.003％ TW20。在37℃、5％或10％ CO2下依赖于培养基进行孵育。如果没有另外说明，则在3天后使用制造商方案中描述的CellTiter-Glo发光细胞活力测定法开发测定。简言之，将板平衡至室温持续30分钟。将100mL CellTiter-Glo缓冲液添加至CellTiter-Glo底物烧瓶并充分混合。将30μL试剂转移至每个孔。在室温下孵育3分钟，同时以550rpm摇动后，将板在室温下再孵育10分钟。发光是在来自Perkin Elmer的Envision读取器上读取的。将单独的溶剂和硼替佐米(Bortezomib)(1.0E-05M)分别作为高对照(100％活力)和低对照(0％活力)。将原始数据转换为相对于高对照和低对照的细胞活力百分比，将所述细胞活力百分比分别设置为100％和0％。使用GraphPad Prism软件，用可变斜率S形响应拟合模型，用0％活力作为底部约束且100％活力作为顶部约束，进行IC50计算。浓度对应于PAX中PROTAC的浓度。
研究了PAX技术基于其细胞表面受体表达是否以及在多大程度上可以介导细胞的细胞选择性靶向。因此，通过将MIC5基因融合到HC上，然后载荷PROTAC GNE987，产生CD33靶向性PAX。然后在CD33阳性和CD33阴性细胞上测试PAX。
在MV411和MOLM13细胞而不是RAMOS细胞的情况下，用预载荷50％ GNE987的CD33xMIC5的连续稀释液对CD33阳性MV411和MOLM13细胞以及CD33阴性RAMOS细胞进行处理导致活细胞在3天孵育后减少(图35)。这表明CD33xMIC5介导GNE987 PROTAC摄取到受体阳性细胞中，同时防止摄取到受体阴性细胞中，并因此使PAX能够选择性地将PROTAC递送到靶向细胞中。
CD33xMIC5构建体的细胞毒性可以通过增加或减少载荷PROTAC GNE987来调节(图36)。当载荷从25％增加到50％或甚至75％时，与GNE987组合的CD33xMIC5的细胞毒性对MV411细胞的细胞毒性可以增加。这表明可以根据需要通过调整载荷的PROTAC的量来调适PAX的细胞杀伤特性。
7.10.6CD33xMIC5与GNE987P的复合物可以提高单独的PROTAC GNE987P的细胞杀伤效力
到目前为止，表明可以利用PAX技术将PROTAC GNE987递送到靶细胞，并且尚不清楚它是否也适用于其他PROTAC。因此，选择了另一种PROTAC用于进一步研究，即GNE987P，并研究了PAX技术是否也可以介导对该PROTAC的选择性。
因此，将CD33阳性MV411和MOLM13以及CD33阴性RAMOS细胞用具有25％至75％载荷的CD33xMIC5+GNE987P和单独的PROTAC GNE987P进行处理(图37)。在两种CD33阳性细胞系上，CD33xMIC5+GNE987P的组合比单独的PROTAC GNE987P更有效力，并且CD33xMIC5+GNE987P的效力依赖于载荷，其中更高的载荷导致更高的效力。总体而言，在CD33阴性细胞上未观察到高达150nM的毒性。可以得出结论，使用抗体复合物促进PROTAC靶向递送的概念可能更具普遍性，因为第二个PROTAC被选择性地递送至表达CD33的细胞。此外，据观察，所述技术提供了甚至通过靶向递送到细胞中来提高某些PROTAC的效力的可能性。
7.10.7CD33xMIC5可以用于递送FLT3降解物至CD33阳性细胞
为了将PAX方法扩展到另一个细胞内靶标，研究了FLT3降解物是否可以使用抗体-PROTAC复合物特异性地递送至表达CD33的细胞。因此，将CD33阳性MOLM13和CD33阴性RAMOS细胞用具有75％载荷的CD33xMIC5+FLT3d1进行处理，并将单独的PROTAC FLT3d1作为对照(图38)。在CD33阳性MOLM13细胞上，观察到CD33xMIC5+FLT3d1的细胞毒性。在CD33受体阴性RAMOS细胞上，没有观察到细胞毒性。这表明CD33xMIC5可能用于递送FLT3降解物至CD33阳性细胞。根据章节7.10.5中所述的程序进行测定，其中略有修改，即用PROTAC或PAX处理细胞持续6天。实验再次表明，PAX能够根据受体状态将PROTAC递送至靶细胞。此外，实验表明PAX技术可以转移至另一个PROTAC降解性FLT3中以进一步支撑PAX方法的通用性。
7.10.8可以通过在细胞上单独应用抗体和PROTAC来完成PROTAC GNE987与CD33xMIC5的复合
在另一个实验中，研究了CD33xMIC5与PROTAC GNE987的预复合是否对于细胞靶受体依赖性细胞杀伤是必要的。因此，将CD33xMIC5与GNE987复合3小时以达到75％的载荷，并添加至CD33阳性MV411和CD33阴性RAMOS细胞。此外，将CD33xMIC5添加至以上提及的细胞，并在随后单独地添加GNE987，以便达到75％的载荷。有趣地，单独添加CD33xMIC5和GNE987产生了与具有相同载荷的预复合的CD33xMIC5+GNE987 PAX相同的结果(图39)。
这些结果表明，PAX的预复合不是通过PAX用于细胞表面受体依赖性细胞杀伤的先决条件。
7.10.9可以通过增加与靶向抗体融合的VHH PROTAC结合剂的数量来增加PAX的PROTAC载荷
为增加可以通过单个PAX分子递送至靶细胞的PROTAC的数量，增加了连接至细胞靶向性IgG的融合PROATC结合性VHH单元的数量。更详细地，将MIC7 PROATC结合性VHH以不同数量融合至重链、轻链上的CD33靶向性抗体的C末端或融合到二者的组合上。抗体片段通过短接头与IgG重链和任何额外的片段分离。对于另外的详细信息，参见章节7.9。然后研究了VHH片段与靶向性抗体的不同位点的基因融合如何影响所得PAX的效力。
根据7.10.5中所述的细胞活力测定程序，在CD33阳性MV411和CD33阴性RAMOS细胞上研究了以表13中所述的复合比率与GNE987或GNE987P复合的VHH-抗体融合物。在与GNE987P组合的情况下，相同抗体载荷不同比率的GNE987P，并因此处理浓度与抗体浓度相关。所有融合物显示细胞表面受体依赖性细胞毒性。与单独的PROTAC相比，一些载荷GNE987P的VHH-抗体融合物甚至显示出在阳性MV411细胞上增强的效力，和在受体阴性RAMOS细胞上减少的细胞毒性。这进一步表明了这种方法的通用性以生成具有复杂特性的多个PAX。
表13：在CD33阳性MV411细胞和CD33阴性RAMOS细胞上，与PROTAC GNE987和GNE987P或单独的PROTAC组合的不同CD33xMIC7的细胞谱分析。以M描述IC50值。
7.10.10CLL1xMIC7-PROTAC复合物诱导选择性细胞毒性依赖于CLL1介导的摄取
到目前为止，本发明的范围仅限于CD33靶向性抗体，并因此研究了是否可以使用除CD33靶向性抗体之外的其他抗体以细胞选择性方式递送PROTAC。
为了将PROTAC靶向表达CLL1的细胞，使用CLL1结合性抗体和PROTAC结合性克隆MIC7构建融合蛋白。因此，CLL1结合性抗体的HC通过接头在c末端被延长，随后是产生CLL1xMIC7的MIC7序列。此外，以相同的方式修饰地高辛抗体以获得同种型对照。将CLL1阳性MOLM13和U937细胞以及CLL1阴性K562细胞用具有75％载荷的CLL1xMIC7+GNE987P或DIGxMIC7+GNE987P进行处理，或将单独的PROTAC GNE987P作为对照。按照上述程序进行测定。在两种CLL1阳性细胞系上，观察到CLL1xMIC7+GNE987P的细胞毒性，而没有观察到DIGxMIC7+GNE987P的细胞毒性(图40)。这再次表明受体阳性细胞中的摄取是通过将PAX靶向所希望的细胞来介导的。此外，这表明该技术可以应用于不同的抗体骨架，突出了该方法的通用性。
在额外的实验中，将CLL1阳性MV411和U937或CLL1阴性RAMOS和K562细胞用具有75％载荷的CLL1xMIC7+GNE987、CLL1xMIC7+GNE987P或CLL1xMIC7+SIM1进行处理，或将GNE987、GNE987P或单独的SIM1作为对照。按照上述程序进行测定。在两种CLL1阳性细胞系中，观察到CLL1xMIC7 PROTAC组合的细胞毒性，而在CLL1阴性K562和RAMOS细胞上观察到细胞毒性显著降低至没有(图41)。这再次表明受体阳性细胞中的摄取是通过将PAX靶向所希望的细胞来介导的。此外，这表明了该技术可以应用于不同抗体骨架，支撑了本发明的通用性。此外，表明PROTAC的选择是非常灵活的，因为使用PAX方法将总共3种不同的PROTAC递送至CLL1表达细胞。
7.10.11B7H3xMIC7-PROTAC复合物诱导选择性细胞毒性依赖于B7H3介导的摄取
为了进一步拓宽本发明的范围，研究了使用B7H3靶向性抗体以细胞选择性方式递送PROTAC是否可能。为了将PROTAC靶向表达B7H3的细胞，使用B7H3结合性抗体和PROTAC结合性克隆MIC7构建融合蛋白。因此，B7H3结合性抗体的HC通过接头在c末端被延长，随后是产生B7H3xMIC7的MIC7序列。将B7H3阳性MV411、U937和MOLM13以及B7H3阴性RAMOS细胞用具有75％载荷的B7H3xMIC7+GNE987P和B7H3xMIC7+SIM1进行处理，并将单独的PROTACGNE987P和SIM1作为对照。按照上述程序进行测定。在所有的B7H3阳性细胞系上，对于所有B7H3xMIC7 PROTAC组合观察到细胞毒性(图42)。在B7H3受体阴性RAMOS细胞上，对于所有B7H3xMIC7 PROTAC组合没有发现细胞毒性，而用单独的PROTAC进行的处理导致最高但不是细胞类型特异性的细胞毒性。这表明B7H3xMIC7介导GNE987P和SIM1被摄取到受体阳性细胞中，而防止其被摄取到受体阴性细胞中。实验再次表明，PAX能够根据受体状态将PROTAC递送至靶细胞。此外，实验表明PAX技术可以转移至另一个抗体骨架中以进一步突出该方法的通用性。
在另一个实验中，将B7H3阳性MV411、U937和MOLM13以及B7H3阴性RAMOS细胞用具有75％载荷的B7H3xMIC7+GNE987或DIGxMIC7+GNE987进行处理，并将单独的PROTAC GNE987作为对照。按照上述程序进行测定。在所有B7H3阳性细胞系上，对于所有B7H3xMIC7+GNE987构建体观察到细胞毒性，而对于同种型对照DIGxMIC7+GNE987发现显著降低的毒性(图43)。在B7H3受体阴性RAMOS细胞上，与单独的PROTAC相比，对于B7H3xMIC7+GNE987发现较少的细胞毒性。这进一步表明B7H3xMIC7介导GNE987P和SIM1 PROTAC被摄取到受体阳性细胞中，而它防止其被摄取到受体阴性细胞中。
7.10.12EGFRxMIC7-PROTAC复合物诱导PROTAC载荷依赖性和EGFR介导的细胞类型选择性的细胞毒性
为了将PROTAC靶向表达EGFR的细胞，使用结合EGFR的抗体西妥昔单抗和PROTAC结合性克隆MIC7构建融合蛋白。因此，西妥昔单抗的HC通过接头在c末端被延长，随后是产生EGFRxMIC7的MIC7序列。此外，以相同的方式修饰地高辛抗体以获得同种型对照。将高表达EGFR的OVCAR3和SKOV3以及低表达EGFR的HEPG2用如上所述的EGFRxMIC7和DIGxMIC7载荷50％ PROTAC、GNE987、GNE987P或SIM1进行处理，以确定这些构建体的效力(表14)。单独PROTAC的效力总结在表14中。虽然所有DIGxMIC7+PROTAC组合的IC50>100nM，但与PROTACGNE987和SIM1组合的EGFRxMIC7诱导的细胞杀伤的IC50值在个位数nM范围内。与高表达EGFR的OVCAR3和SKOV3相比，对于所有构建体，与所有PROTAC组合的EGFRxMIC7对低表达EGFR的HEPG2的毒性降低(两位数至三位数nM范围)。总体而言，GNE987P组合是无活性的。实验再次表明，PAX能够根据受体状态将PROTAC递送至靶细胞。
表14：PROTAC ARV771、GNE987、GNE987P和EGFR阳性细胞和EGFR阴性HEPG2细胞的细胞谱分析。以M描述IC50值。
细胞系 ARV771 GNE987 GNE987P SIM1
A431 6,5E-08 3,4E-10 5,0E-08 3,0E-09
A549 1,5E-07 1,4E-09 1,5E-07 1,7E-08
HCC827 9,1E-08 7,7E-10 7,7E-08 6,5E-09
HEPG2 8,9E-08 2,6E-09 1,2E-07 1,4E-08
MCF7 2,6E-08 1,5E-10 1,5E-08 1,5E-09
MDAMB468 4,9E-08 4,1E-10 5,0E-08 7,1E-09
OVCAR3 4,0E-10 2,0E-08 2,8E-09
SKOV3 3,2E-08 6,1E-10 3,5E-08 2,4E-09
表15：在EGFR阳性细胞和EGFR阴性HEPG2细胞上，与PROTAC GNE987、GNE987P和SIM1组合的EGFRxMIC7(载荷50％)的细胞谱分析。作为非内化对照，利用地高辛结合性DIGxMIC7融合蛋白。以平均值(M)描述IC50值。
在另一个实验中，EGFRxMIC7以75％载荷分别载荷PROTAC ARV771、GNE987、GNE987P和SIM1，并对一系列具有不同EGFR表达水平的细胞进行处理(表16)。总体而言，非结合的对照DIGxMIC7(载荷75％ GNE987\GNE987P和SIM1)相比结合EGFR的EGFRxMIC7(载荷相同的PROTAC)的效力更低。
表16：在EGFR阳性细胞和EGFR阴性HEPG2和低EGFR的MCF7细胞上，与PROTACARV771、GNE987、GNE987P和SIM1组合的EGFRxMIC7(载荷75％)的细胞谱分析。作为非内化对照，利用地高辛结合性DIGxMIC7融合蛋白。
总之，已经表明PAX也可以将PROTAC靶向肿瘤细胞。还表明，摄取依赖于EGFR受体表达水平，并因此由通过EGFRxMIC7+PROTAC复合物结合EGFR的活跃摄取而驱动，随后进行内化和PROTAC释放。通过测试非结合同种型对照PAX也显示出由活性EGFR介导的摄取驱动的细胞选择性，所述同种型对照显示出显著较小的细胞毒性。
7.10.13与GNE987、GNE987P和SIM1复合的NAPI2BxMIC7展示出细胞选择性细胞毒性
为了将PROTAC靶向表达NAPI2B的细胞，使用NAPI2B结合性抗体XMT1535和PROTAC结合性克隆MIC7构建融合蛋白。因此，NAPI2B结合性抗体的HC通过接头在c末端被延长，随后是产生NAPI2BxMIC7的MIC7序列。将NAPI2B阳性OVCAR3和NAPI2B阴性SKOV3细胞用具有50％载荷的NAPI2BxMIC7+GNE987、NAPI2BxMIC7+GNE987P、NAPI2BxMIC7+SIM1或DIGxMIC7+GNE987、DIGxMIC7+GNE987P或DIGxMIC7+SIM1进行处理，并将PROTAC GNE987、GNE987P和单独的SIM1作为对照。按照上述程序进行测定。在NAPI2B阳性OVCAR3上，对于所有NAPI2BxMIC7 PROTAC组合观察到细胞毒性(图44)。在NAPI2B受体阴性SKOV3细胞上，对于所有NAPI2BxMIC7 PROTAC组合没有发现细胞毒性，而用单独的PROTAC进行的处理导致在所有细胞系中观察到的最高细胞毒性且独立于NAPI2B受体表达状态。这表明NAPI2BxMIC7介导GNE987、GNE987P和SIM1被摄取到受体阳性细胞中，而防止其被摄取到受体阴性细胞中。实验再次表明，PAX能够根据受体状态将PROTAC递送至靶细胞。此外，实验表明PAX技术可以转移至另一个抗体骨架中以进一步突出该方法的多功能性。
7.10.14与PROTAC GNE987、GNE987P和SIM1复合的HER2xMIC7显示HER2依赖性细胞毒性
为了将PROTAC靶向表达HER2的细胞，使用HER2结合性抗体曲妥珠单抗和PROTAC结合性克隆MIC7构建融合蛋白。因此，HER2结合性抗体的HC通过接头在c末端被延长，随后是产生HER2xMIC7的MIC7序列。将HER2阳性SKBR3和NCIN87细胞和HER2阴性MDAMB468细胞用具有75％载荷的HER2xMIC7+GNE987、HER2BxMIC7+GNE987P、HER2xMIC7+SIM1进行处理，并将PROTAC GNE987、GNE987P和单独的SIM1作为对照。按照上述程序进行测定。在HER2阳性SKBR3和NCIN87上，对于所有HER2xMIC7 PROTAC组合观察到细胞毒性(表17)。在HER2受体阴性MDAMB468细胞上，对于所有HER2xMIC7PROTAC组合没有发现细胞毒性，而用单独的PROTAC进行的处理导致在所有细胞系中明显的细胞毒性且独立于HER2受体表达状态。这表明HER2xMIC7介导GNE987、GNE987P和SIM1被摄取到受体阳性细胞中，而防止其被摄取到受体阴性细胞中。实验再次表明，PAX能够根据受体表达状态将PROTAC递送到靶细胞。此外，实验表明PAX技术可以转移至另一个抗体骨架中以进一步突出该方法的通用性。
表17：在HER2阳性细胞和HER2阴性MDAMB468细胞上，与PROTAC GNE987、GNE987P和SIM1组合的HER2xMIC7(载荷75％)的细胞谱分析。
7.10.15TROP2xMIC7+GNE987介导TROP2依赖性细胞毒性
为了进一步拓宽本发明的范围，研究了使用TROP2靶向性抗体以细胞选择性方式递送PROTAC是否可能。为了将PROTAC靶向表达TROP2的细胞，使用TROP2结合性抗体赛妥珠单抗和PROTAC结合性克隆MIC7构建融合蛋白。因此，TROP2结合性抗体的HC通过接头在c末端被延长，随后是产生TROP2xMIC7的MIC7序列。将TROP2阳性A431、SKBR3、MDAMB468、NCIN87、SKOV3细胞和TROP2阴性SW620细胞用具有75％载荷的TROP2xMIC7+GNE987进行处理，或将单独的PROTAC GNE987作为对照。按照章节7.10.5中所述的程序进行测定。在所有TROP2阳性A431、SKBR3、MDAMB468、NCIN87和SKOV3细胞中，对于TROP2xMIC7+GNE987观察到细胞毒性(表18)。在TROP2阴性SW620细胞上，与单独的GNE987相比，对于TROP2xMIC7+GNE987发现降低的细胞毒性。这些结果表明TROP2xMIC7介导GNE987被摄取到受体阳性细胞中，而减少其被摄取到受体阴性细胞中。实验再次表明，PAX能够根据受体表达状态将PROTAC递送到靶细胞。此外，实验表明PAX技术可以转移至另一个抗体骨架中以进一步突出该方法的通用性。
表18：在TROP2阳性细胞和TROP2阴性SW620细胞上，与PROTAC GNE987组合的TROP2xMIC7(载荷为75％)的细胞谱分析。
细胞系 TROP2xMIC7+GNE987的IC50[M] GNE987的IC50[M]
A431 2.9E-09 3.4E-10
SKBR3 1.3E-08 3.9E-10
MDAMB468 2.1E-08 4.1E-10
NCIN87 4.1E-09 5.3E-10
SKOV3 5.6E-08 6.1E-10
SW620 7.1E-08 8.4E-10
7.10.16PAX和PROTAC-ADC的相当的细胞毒性
为理解PAX技术与共价连接的PROTAC-ADC如何比较，将章节7.5.10中所述的EGFR-IgGl-L328C-GNE987 PROTAC-ADC(DAR 1.62)连同载荷50％GNE987的EGFRxMIC5在EGFR阳性MDAMB468和EGFR阴性HEPG2细胞上进行了研究。为了更好地进行比较，处理浓度与抗体浓度相关。据观察，两种构建体对MDAMB468细胞具有相同的效力，并且显示对HEPG2细胞较少但相当的细胞毒性作用(图45)。这表明，尽管PROTAC仅以非共价方式结合，但PAX可以实现与共价PROTAC-ADC的效果相当的选择性细胞杀伤。此外，与PROTAC-ADC相比，这种效果可以用较低的DAR来实现。
7.11PROTAC与抗PROTAC抗体的复合可以显著改善药代动力学分布
研究了PROTAC GNE987与PROTAC结合性抗体MIC2的复合是否以及在多大程度上影响PROTAC的总体药代动力学分布。因此，如下进行药代动力学研究：
按0.4mg/kg，在水中2％(v/v)DMSO/20％(v/v)(羟基丙基β-环糊精)Kleptose，以5mL/kg给药体积，使褐色雌性SCID小鼠(n＝9，复合型)接受单尾静脉内(i.v.)推注注射单独的PROTAC(GNE987)。对于MIC2+GNE987(抗体：药物比率为1：2)，按等效剂量为0.4mg/kgGNE987和30mg/kg MIC2，在PBS的5％(v/v)DMSO中，以给药体积为5mL/kg，使褐色雌性SCID小鼠(n＝12，复合型)接受单尾静脉内(i.v.)推注注射PROTAC。
对于单独的PROTAC，在静脉施用后，按0.1(G(组)1)、0.5(G2)、1(G3)、2(G1)、4(G3)、6(G2)和24h(G3)，在异氟醚麻醉下，舌下采集连续的血液样品(n＝3)，用乙烯二胺四乙酸(K3-EDTA)作为抗凝剂，并且进一步处理以获得血浆。
对于MIC2+GNE987，如上所述在静脉施用后，按0.1(G(组)1)、0.5(G2)、1(G3)、2(G4)、6(G2)、24h(G1、G3)、30(G3)、48(G3、G4))、72(G1、G2)和96h(G2)采集连续的血液样品(n＝3)，并且进一步处理以获得血浆。
对于样品制备，将10μL血浆用10μL甲醇稀释，并用80μL含有拉贝洛尔内标物(2.5μg/mL)的乙腈沉淀在LowBind(蛋白质)板中。摇动/涡旋1min后，将样品过滤(在聚丙烯过滤器上Captiva过滤，0.45μm孔径)，并将120μL甲醇:水(1:1，v/v)添加至滤液，并在4℃下储存，直到分析，并在注射前放入自动进样器。分析在LC-MS/MS系统上进行，所述系统由耦合到QTRAP 6500+(Sciex)质谱仪的UPLC组成。流动相A为含0.1％甲酸的水，并且流动相B为含0.1％甲酸的甲醇。梯度在1.5min内以10％ B至95％ B开始，并在95％ B下保持2min，然后在0.5min内降至10％ B，并保持在10％ B持续2min。在来自Agilent Technologies的Poroshell 120EC-C18柱上，2.7μm颗粒，3x 50mm进行色谱法。流速为0.6mL/min，并且循环时间(注射到注射)大约为6分钟。样品注射体积为10μL。GNE987的MRM转换为779.2(m/z,z＝1)，并且对于拉贝洛尔(IS)为91(m/z,z＝1)。用于定量的校准曲线基于0.5(定量下限)至10000(定量上限)ng/mL范围内的标准品，其中5个校准点最小值和最小75％的校准标准品在其标称值的±20％内。
通过基于中尺度诊断技术(MSD，LLC.，Rockville，MD)的配体结合测定(LBA)确定总抗体浓度。所有的孵育步骤均在22℃下进行，伴随轻微搅动。将所有洗涤步骤(200μL/孔)均用含有PBS pH 7.4和0.01％ Tween 20的PBS-T，使用平板洗涤器ELx405(BioTekinstruments Inc.,Winooski,VT)进行。首先，将2.5μg/mL生物素-SP-缀合的AffiniPure山羊抗人IgG，Fcy片段特异性(Jackson ImmunoResearch Europe Ltd.，JIR，Cambridgeshire，United Kingdom，#109-065-098)涂布在MSD GOLD 96孔链霉亲和素QUICKPLEX板(MSD，#L55SA)上2h。之后，将板洗涤三次。将血浆样品、标准品和质量对照品在稀释缓冲液中连续稀释，所述稀释缓冲液由PBS pH 7.4、0.05％ Tween 20和3.0％(w/v)BSA组成，并且在板上孵育1h。将板再次洗涤，并用0.6μg/mL小鼠抗人IgG孵育1h，其为F(ab’)2片段特异性(JIR，#209-005-097)，且先前根据制造程序用MSD GOLG SULFO-TAG(MSD，#R31AA-1)进行标记。在最终的洗涤步骤后，将具有表面活性剂的150μL 2x MSD读取缓冲液T(MSD，#R92TC)添加至每个孔，并且将板在MESO Quickplex SQ120读板器(MSD)上读取。将Watson LIMS软件(7.5版，ThermoFisher Scientific Inc.)用于用5PL(Marquart)方程拟合标准曲线，加权因子1/Y2，并计算血浆样品的总mAb浓度。定量的下限(LLOQ)是50ng/mL。
将PROTAC GNE987的半衰期确定为5.8小时，这与文献中报道的半衰期处于相同范围内(2.8小时，Pillow,T.H.等人,ChemMedChem 15(2020)17–25)。PROTAC GNE987与MIC2的复合导致小鼠中PROTAC GNE987的半衰期为14.7h，这相当于半衰期提高了2.5倍。
此外，PAX CD33xMIC5+GNE987和CD33xMIC7+GNE987是100％理论载荷生成的，并在由Charles River Laboratories Italia,Calco,Italy提供的C57BL/6N近交小鼠(N＝每组2只雄性和雌性)中进行的PK研究中进行了研究。使7-8周龄小鼠接受30mg/kg(对应于0.38mg/kg PROTAC)CD33xMIC5+GNE987和CD33xMIC7+GNE987，将单独的CD33抗体、CD33xMIC5或CD33xMIC7作为单剂量，将其静脉注射入尾静脉。使用微量取样技术(每次取血20mL)，从所有动物中连续收集样品。施用后，在随后三周中在第1天和第7天取两份血液样品。将每个样品收集在预冷的(0-4℃)Minivette POCT EDTA管中，转移到MicrovetteCB300 EDTA中，并在4℃下以2500×g离心10min。将获得的血浆转移到新的小瓶中，并立即在-80℃下储存直到进行进一步分析。PK研究、动物处理和实验按照D.Lvo.2014/26和指令2010/63/EU进行。这项研究是在Instituto di Ricerche Biomediche Antoine Marxer,Colleretto Giacosa,Italy进行的。研究所得到了意大利卫生部的完全授权。
通过基于中尺度诊断技术(MSD，LLC.，Rockville，MD)的配体结合测定(LBA)确定总抗体浓度。所有的孵育步骤均在22℃下进行，伴随轻微搅动。将所有洗涤步骤(200μL/孔)均用含有PBS pH 7.4和0.01％ Tween 20的PBS-T，使用平板洗涤器ELx405(BioTekinstruments Inc.,Winooski,VT)进行。首先，将2.5μg/mL生物素-SP-缀合的AffiniPure山羊抗人IgG，Fcy片段特异性(Jackson ImmunoResearch Europe Ltd.，JIR，Cambridgeshire，United Kingdom，#109-065-098)涂布在MSD GOLD 96孔链霉亲和素QUICKPLEX板(MSD，#L55SA)上2h。之后，将板洗涤三次。将血浆样品、标准品和质量对照品在稀释缓冲液中连续稀释，所述稀释缓冲液由PBS pH 7.4、0.05％ Tween 20和3.0％(w/v)BSA组成，并且在板上孵育1h。将板再次洗涤，并用0.6μg/mL小鼠抗人IgG孵育1h，其为F(ab’)2片段特异性(JIR，#209-005-097)，且先前已根据制造程序用MSD GOLG SULFO-TAG(MSD，#R31AA-1)进行标记。在最终的洗涤步骤后，将具有表面活性剂的150μL 2x MSD读取缓冲液T(MSD，#R92TC)添加至每个孔，并且将板在MESO Quickplex SQ120读板器(MSD)上读取。将Watson LIMS软件(7.5版，ThermoFisher Scientific Inc.)用于用5PL(Marquart)方程拟合标准曲线，加权因子1/Y2，并计算血浆样品的总mAb浓度。定量(LLOQ)的下限是50ng/mL。
通过液体色谱法串联质谱(LC-MS/MS)，使用SCIEX 5500三重四极杆与阳性模式的涡轮离子喷雾源(ITS)(SCIEX，Redwood City，CA，USA)来确定MSC2734242的浓度。使用Waters ACQUITY UPLC BEH(C18，2.1x 50mm，1.7μm)柱实现色谱分离，所述柱安装在WatersACQUITY I类UPLC系统(Milford，MA，USA)中，配置有100μL延伸环线。用于A相(H2O:ACN 95:5，0.1％甲酸)和B相(ACN:H2O 95:5，0.1％甲酸)的色谱梯度在0.350mL/min的流速下为0.25min的100％ A等度，随后是2.25min梯度至100％ B，伴随随后在100％ B下进行0.75min的洗涤步骤，并且在初始条件下进行2.5min的再调整。
通过蛋白质沉淀技术从C57BL/6N小鼠血浆样品中提取MSC2734242。在PhenomenexImpact蛋白质沉淀板(Phenomenex，Torrance，CA，USA，CE0-7565)上，将3μL血浆样品在100μL含50ng/mLMSC2737500的乙腈(用作内标物)中沉淀。振荡5分钟(900rpm)后，通过真空过滤所有孔，并收集在干净的96孔板中，然后用100μL含有2.5％甲酸的水溶液稀释，并进行LC-MS/MS分析。所有试剂均为LC-MS级或等效试剂。
将Watson LIMS软件(7.5版，ThermoFisher Scientific Inc.)用于在线性回归上对面积比(分析物信号/内标物信号)拟合标准曲线，加权因子1/X2，并计算血浆样品的总MSC2734242浓度。定量的下限(LLOQ)为5ng/mL，并且定量的完全范围为5-2000ng/mL。
使用Phoenix WinNonlin 8.3.4版(Pharsight Corporation，USA)，通过非房室模型分析(NCA)估计主要PK参数。已经从总抗体和MSC2734242分析物的个体血浆浓度相对于施用后的时间获得或计算了药代动力学参数。
将个体的血浆浓度-时间分布用于参数估计。计算出低于定量限(BQL)的所有PK样品的浓度被视为缺失值，以更好地估计AUC0-inf、清除率和分布体积。只有当线性回归的末端阶段中至少有三个时间点可量化时，才计算末端半衰期(t1/2)和(与曲线的末端对数线性部分相关的一阶速率常数)值。低于BQL的值被视为0ng/mL用于描述性统计。总体而言，GNE987与CD33xMIC5和CD33xMIC7的复合导致PROTAC在小鼠中的半衰期显著更长，分别为29.6h和105h(图47)。令人印象深刻地，在接受CD33xMIC7+GNE987的组中，即使在21d(504h)后，小鼠血浆GNE987的浓度仍然平均为69ng/mL，而PROTAC GNE987浓度在25h后已经降至LLOQ以下。结果表明，抗体复合可能通过PROTA与抗体复合而强烈地增加例如，肿瘤细胞对PROTAC的暴露。
如果VHH融合物的生成和各自融合蛋白的载荷PROTAC GNE987确实改变了清除率，则对PK研究的抗体清除率进行比较，得出结论(图48)。未经修饰的CD33抗体的清除率和相同抗体与VHL-PROTAC结合性VHH MIC5和MIC7(CD33xMIC5/7)的融合相似，这表明VHH融合物对清除率的影响很小。此外，抗体-VHH融合蛋白CD33xMIC5和CD33xMIC7与PROTAC GNE987的载荷对抗体清除率没有影响。得出结论，VHL-PROTAC结合性VHH的添加以及与PROTAC的复合对PK分布没有影响。
后项研究的药代动力学参数总结在表19中。
表19：具有载荷MIC5和MIC7的基于CD33的VHH融合蛋白与未载荷PROTAC GNE987和亲本抗体CD33 Ab的药代动力学参数的总结。按30mg/kg施用分析物，并且描绘用于定量总抗体(t抗体)和PROTAC GNE987的PK参数。缩略词：t1/2：半衰期；Cmax：最大血清浓度；AUC0-inf：曲线下的面积至无限时间；Cl：清除率；Vss：分布的稳态体积。SD：标准差。
7.12在MV411小鼠异种移植模型中有效的CD33xMIC7+GNE987 PROTAC-抗体复合物
在免疫受损的小鼠中异种移植人类白血病MV411细胞。在未经治疗的雌性CB17SCID小鼠的左腹皮下注射三百万个MV411细胞。在平均肿瘤大小达到45mm2后，开始将不同治疗组的动物随机化并开始治疗。将对照组用媒介物处理。将测试组用0.38mg/kg GNE987和30mg/kg CD33xMIC7+GNE987(载荷0.38mg/kg GNE987)处理一次(在第1天)。进一步，将两个组在第1天用30mg/kg CD33xMIC7+GNE987(载荷0.38mg/kg GNE987)处理两次，随后在第8天用0.38mg/kg GNE987处理或在第1天和第8天用0.38mg/kg GNE987处理。此外，一组接受30mg/kg CD33xMIC5+GNE987(载荷0.38mg/kg GNE987)一次(在第1天)，并且另一组接受不含PROTAC的抗体对照30mg/kg CD33xMIC7一次(在第1天)。在肿瘤达到最大肿瘤大小(225mm2)之前停止各个组(图49)。
虽然单独的抗体对媒介物对照没有显著的相关作用，但PROTAC GNE987诱导了抗肿瘤作用。然而，在大约第4天，肿瘤再次开始发展，显示出与媒介物对照相同的生长率。在第1天和第8天给药GNE987的组中，再次给药GNE987诱导抗增殖作用，直到再次给药后大约第3天，其中肿瘤开始再次生长。单剂量的CD33xMIC7+GNE987导致肿瘤生长抑制，直到肿瘤进展的第15天。在第1天用30mg/kg CD33xMIC7+GNE987(载荷0.38mg/kg GNE987)给药的组中，然后在第8天用0.38mg/kg GNE987治疗，再次给药导致持续的肿瘤生长抑制，直到第23天。与媒介物相比，用CD33xMIC5+GNE987的治疗诱导了肿瘤生长延迟，但与CD33xMIC7+GNE987相比，效果要差得多。
总体而言，在等效PROTAC剂量下，CD33xMIC7载荷GNE987的抗肿瘤作用优于单独的PROTAC。有趣地，CD33xMIC7+GNE987的抗肿瘤作用甚至可以通过在第8天简单地重新给药GNE987来增强。这表明单独GNE987的额外给药对接受CD33xMIC7+GNE987的组有明显的益处，并且可能地是CD33xMIC7从血清中捕获PROTAC GNE987，并将其积聚肿瘤位点处。这些结果通过施用与肿瘤特异性抗原以及与PROTAC结合的双特异性抗体，随后施用未复合的PROTAC(例如，口服可应用型)为预靶向肿瘤开辟了途径。通过这种方法，单独施用的PROTAC可以靶向所希望的组织，而无需之前在体外制造PAX。
当比较抗PROTAC克隆MIC5和MIC7时，明显的是与CD33xMIC5+GNE987相比，CD33xMIC7+GNE987诱导更强的抗肿瘤作用。CD33的结合不影响肿瘤生长，如用CD33xMIC7处理所证明的，这支撑了通过将CD33xMIC7载荷PROTAC GNE987驱动的抗肿瘤作用。
8总结
本发明公开了一种前所未有的递送技术，能够经由非共价PROTAC抗体复合物(PAX)靶向递送PROTAC。值得注意的是，PAX技术允许靶向递送未经修饰的活性PROTAC，这与非共价药物递送领域中的其他方法不同，在所述非共价药物递送领域中，活性药物物质通常用半抗原进行修饰。本发明包括将PROTAC递送到多种细胞类型，这取决于它们的细胞表面受体表达。那些受体包括但不限于：CD33、CLL1、TROP2、HER2、EGFR、NAPI2B和B7H3。关于PROTAC，本发明的通用性通过选择性递送多种结构上不同的PROTAC(GNE987、ARV771、SIM1、GNE987P、SIM1和FLT3d1)来证明。还已经证明，该平台通过利用模块化抗体工程性策略，使用一种抗体，提供了递送多达12个PROTAC分子的可能性。此外，本发明表明抗体复合可以显著改善靶细胞对PROTAC的暴露。最后，发明人能够在体内异种移植模型中验证PAX技术。表20给出了概述。
表20：这项工作范围的总结。研究的组合以表格形式描绘。

Claims (34)

1.一种分离的抗体，其能够与PROTAC的VHL配体降解决定子结合。
2.根据权利要求1所述的抗体，所述抗体是单特异性抗体。
3.根据权利要求1或2所述的抗体，所述抗体是IgG型的全长抗体或其片段或单结构域抗体或单链抗体。
4.根据权利要求3所述的抗体，其中所述全长抗体是IgG1或IgG4型的抗体。
5.根据权利要求3所述的抗体，其中所述单结构域抗体是VHH抗体。
6.根据权利要求3所述的抗体，其中所述单链抗体是单特异性单价单链抗体(scFv)。
7.根据权利要求1或3-6中任一项所述的抗体，所述抗体是双特异性抗体，其中所述第二结合能力是针对靶蛋白。
8.根据权利要求7所述的抗体，所述抗体包含：
a)由两条全长抗体重链和两条全长抗体轻链组成的单特异性二价抗体，其中每条链仅包含一个可变结构域；
b)两个单特异性单价单链抗体(scFv)，每个抗体由抗体重链可变结构域、抗体轻链可变结构域以及在所述抗体重链可变结构域与所述抗体轻链可变结构域之间的单链-接头组成，和任选地
c)肽接头，其连接部分(a)的C末端和部分(b)的N末端。
9.根据权利要求7所述的抗体，所述抗体包含：
a)由两条全长抗体重链和两条全长抗体轻链组成的单特异性二价抗体，其中每条链仅包含一个可变结构域；
b)两个可变两个重链单结构域(VHH)抗体，各自由一个抗体可变结构域组成；和任选地
c)肽接头，其连接部分(a)的C末端和部分(b)的N末端。
10.根据权利要求9所述的抗体，其中部分(b)的所述两个重链单结构域(VHH)抗体的N末端和部分(a)的所述单特异性二价抗体的C末端经由肽接头连接。
11.根据权利要求8-10中任一项所述的抗体，其中部分(a)的所述可变结构域能够结合靶蛋白，并且部分(b)的所述可变结构域能够结合所述PROTAC的VHL配体降解决定子。
12.根据权利要求8-10中任一项所述的抗体，其中部分(b)的所述可变结构域能够结合靶蛋白，并且部分(a)的所述可变结构域能够结合所述PROTAC的降解决定子。
13.根据权利要求11或12所述的抗体，其中所述PROTAC的降解决定子是式I的VH032衍生物：
其中
R1或R2之一是连接到弹头的接头，前提是
如果R2是接头，则R1是乙酰基，并且
如果R1是接头，则R2是甲基；
R3是H、OH、氰基、F、Cl、氨基或甲基；
R4是H或甲基；
R5、R6是H或OH，前提是
如果R6是H，则R5是OH，并且
如果R5是H，则R6是OH。
14.根据权利要求13所述的抗体，其中
R1是PB-Q-(CH2-CH2-O)n-(CH2-CH2-CH2-O)m-(CH2)p-(C＝O)-，
其中
PB是蛋白质结合弹头；
Q是NH、C＝O或不存在；
n、m独立地是0、1、2、3或4；
p是0-10；
R2是甲基；
并且R3、R4、R5和R6如权利要求13中所述。
15.根据权利要求14所述的抗体，其中
R1是PB-Q-(CH2-CH2-O)n-(CH2-CH2-CH2-O)m-(CH2)p-(C＝O)-，
其中
PB是蛋白质结合弹头；
Q是NH、C＝O或不存在；
(xi)n、m、p是1；或
(xii)n是3或4；m是0；p是1；或
(xiii)n是1；m是0；p是2；或
(xiv)n是2；m是0；p是2；或
(xv)n、m是0；p是6、7、8、9或10；
R2是甲基；
并且R3、R4、R5和R6如权利要求13中所述。
16.根据权利要求13所述的抗体，其中
R1是乙酰基；
R2是PB-NH-(CH2)p-S-，其中PB是蛋白质结合弹头，
并且p是1、2、3、4、5或6；
并且R3、R4、R5和R6如权利要求13中所述。
17.根据权利要求13所述的抗体，其中所述PROTAC选自图8(a)和8(b)中显示的PROTAC。
18.根据权利要求1、3-17中任一项所述的抗体，其中所述靶蛋白是细胞表面蛋白。
19.根据权利要求18所述的抗体，其中所述细胞表面蛋白是肿瘤抗原。
20.根据权利要求19所述的抗体，其中所述细胞表面蛋白是Her2、CD33、CLL1、TROP2、NAPI2B、B7H3或EGFR。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的抗体，其中能够结合PROTAC的降解决定子的所述可变结构域是全长抗体的可变结构域，并且包含以下CDR序列：
HC CDR1：G Y S X1 T X2 X3 Y(SEQ ID NO:1)；
HC CDR2：I T Y S G X4 T(SEQ ID NO:2)；
HC CDR3：X5 X6 Y X7 X8 X9 X10 X11 X12 X13 X14 X15(SEQ ID NO:3)；
LC CDR1：Q X16 X17 X18 X19 X20 X21 X22 X23 X24 Y(SEQ ID NO:4)；
LC CDR2：X25 X26 X27(SEQ ID NO:5)；
LC CDR3：X28 Q X29 X30 X31 X32 P Y T(SEQ ID NO:6)；
其中：X1是I或A；X2是G或N；X3是D或N；X4是G或A；X5是A或G；X6是K或Y；X7是G或Y；X8不存在或是A；X9不存在或是V；X10不存在或是P；X11是D或Y；X12是G或Y；X13是G或F；X14是R或A；X15是D或H；X16是S或G；X17是L或I；X18是S或不存在；X19是Y或不存在；X20是S或不存在；X21是D或不存在；X22是G或不存在；X23是N或G；X24是T或N；X25是L或Y；X26是V或A；X27是S或T；X28是V或L；X29是S或Y；X30是I或D；X31是H或E；和X32是V或Y。
22.根据权利要求1-20中任一项所述的抗体，其中能够结合PROTAC的降解决定子的所述可变结构域是VHH抗体的可变结构域，并且包含以下CDR序列：
CDR1：G X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7(SEQ ID NO:17)；
CDR2：X8 X9 X10 X11 X12 X13 X14 X15(SEQ ID NO:18)；
CDR3：X16 X17 X18 X19 X20 X21 X22 X23 X24 X25 X26 X27 X28 X29 X30 X31 X32 X33 X34 X35X36(SEQ ID NO:19)；
其中：X1是F或R；X2是T、A、S或R；X3是L或F；X4是D或N；X5是D或T；X6是Y或L；X7是A或T；X8是I、N或L；X9是S或T；X10是S或W；X11是S或N；X12是D或G；X13是G或D；X14是S或N；X15是A或T；X16是A、S或T；X17是A、V或I；X18是S、A、I或D；X19是T、Y、R或A；X20是R、Y或G；X21是V、S、L或T；X22是L、G、S或C；X23是S、A、C或P；X24是T、A、S或N；X25是P、I、V或D；X26不存在或是V或A；X27是D、S、R或不存在；X28是V、G或P；X29是D、T、G或R；X30是Q、I、T或R；X31是V、K或R；X32是R、I或Y；X33是Y、Q、F或A；X34是V或L；X35是E、P或D；X36是V、Y或A。
23.根据权利要求22所述的抗体，其中
X1是F；X2是T或S；X3是L或F；X4是D；X5是D；X6是Y；X7是A或T；X8是I；X9是S或T；X10是S；X11是S；X12是D；X13是G；X14是S；X15是A或T；X16是A或S；X17是V或A；X18是A或I；X19是T或Y；X20是G或R；X21是L或S；X22是C或S；X23是P或C；X24是A或S；X25是V或D；X26不存在或是V；X27是R或不存在；X28是G或P；X29是T或G；X30是Q或I；X31是K或R；X32是R、I或Y；X33是F或A；X34是L；X35是E或D；X36是V或Y。
24.根据权利要求23所述的抗体，其中
CDR1是GFSFDDYA(SEQ ID NO:21)
CDR2是ISSSDGST(SEQ ID NO:22)
CDR3是SAIYRLSCSVVRPTIRYALDY(SEQ ID NO:23)。
25.根据权利要求23所述的抗体，其中
CDR1是GFTFDDYA(SEQ ID NO:25)
CDR2是ISSSDGSA(SEQ ID NO:26)
CDR3是AVATGSCPADGGQKIFLEV(SEQ ID NO:27)。
26.上述权利要求任一项所述的单特异性抗体用于检测、定量或纯化PROTAC的体外用途。
27.根据权利要求1、3-25中任一项所述的双特异性抗体和PROTAC的复合物(PAX)，其中所述双特异性抗体与所述PROTAC的降解决定子结合。
28.根据权利要求26所述的复合物(PAX)，其中所述PROTAC的所述降解决定子和所述接头是如权利要求13-17中任一项所述。
29.药物组合物，其包含根据权利要求27或28所述的复合物和一种或多种另外的药学上可接受的成分。
30.根据权利要求27或28所述的复合物用于将PROTAC递送至靶细胞的用途，所述靶细胞表达待降解的靶蛋白。
31.通过向有需要的患者施用根据权利要求27或28所述的复合物来治疗疾病的方法，其中所述疾病受益于所述PROTAC对于待降解的靶蛋白的降解。
32.根据权利要求27或28所述的复合物(PAX)，其用于治疗疾病，所述疾病受益于所述PROTAC对于待降解的靶蛋白的降解。
33.根据权利要求27或28所述的复合物(PAX)，其用于治疗疾病，所述疾病受益于所述PROTAC对于待降解的靶蛋白的降解，其中首先施用所述PAX，随后仅施用所述PAX的PROTAC组分。
34.根据权利要求27或28所述的复合物(PAX)，其用于治疗疾病，所述疾病受益于所述PROTAC对于待降解的靶蛋白的降解，其中首先施用所述PAX的抗体组分，随后施用所述PAX的PROTAC组分。
CN202280059032.1A 2021-07-02 2022-07-01 抗protac抗体及复合物 Pending CN117915951A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP21183460 2021-07-02
EP21183460.1 2021-07-02
PCT/EP2022/068347 WO2023275394A1 (en) 2021-07-02 2022-07-01 Anti-protac antibodies and complexes

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117915951A true CN117915951A (zh) 2024-04-19

Family

ID=77042680

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202280059032.1A Pending CN117915951A (zh) 2021-07-02 2022-07-01 抗protac抗体及复合物

Country Status (10)

Country Link
EP (1) EP4362976A1 (zh)
JP (1) JP2024526259A (zh)
KR (1) KR20240029062A (zh)
CN (1) CN117915951A (zh)
AU (1) AU2022304258A1 (zh)
CA (1) CA3225636A1 (zh)
CL (1) CL2023003961A1 (zh)
IL (1) IL309780A (zh)
MX (1) MX2024000002A (zh)
WO (1) WO2023275394A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024141496A1 (en) * 2022-12-27 2024-07-04 Merck Patent Gmbh Vhh anti-protac antibodies and complexes

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
ATE297465T1 (de) 1991-11-25 2005-06-15 Enzon Inc Verfahren zur herstellung von multivalenten antigenbindenden proteinen
AU760562B2 (en) 1997-12-05 2003-05-15 Scripps Research Institute, The Humanization of murine antibody
EP2050764A1 (en) 2007-10-15 2009-04-22 sanofi-aventis Novel polyvalent bispecific antibody format and uses thereof
AU2015247817C1 (en) 2014-04-14 2022-02-10 Arvinas Operations, Inc. Imide-based modulators of proteolysis and associated methods of use
US10772962B2 (en) 2015-08-19 2020-09-15 Arvinas Operations, Inc. Compounds and methods for the targeted degradation of bromodomain-containing proteins
JP2019522633A (ja) 2016-05-20 2019-08-15 ジェネンテック， インコーポレイテッド Ｐｒｏｔａｃ抗体コンジュゲート及び使用方法
EP3535265A4 (en) 2016-11-01 2020-07-08 Arvinas, Inc. PROTACS TARGETING ON TAU PROTEIN AND RELATED METHODS FOR USE
WO2018227018A1 (en) 2017-06-07 2018-12-13 Silverback Therapeutics, Inc. Antibody conjugates of immune-modulatory compounds and uses thereof
WO2018227023A1 (en) 2017-06-07 2018-12-13 Silverback Therapeutics, Inc. Antibody construct conjugates
CA3088059A1 (en) 2018-01-10 2019-07-18 Development Center For Biotechnology Antibody protac conjugates
CN111018857B (zh) 2018-10-09 2023-06-02 嘉兴优博生物技术有限公司 靶向蛋白酶降解平台(ted)
CN113056287A (zh) 2018-10-24 2021-06-29 豪夫迈·罗氏有限公司 缀合的化学降解诱导剂及使用方法

Also Published As

Publication number Publication date
IL309780A (en) 2024-02-01
KR20240029062A (ko) 2024-03-05
CL2023003961A1 (es) 2024-07-12
EP4362976A1 (en) 2024-05-08
AU2022304258A1 (en) 2024-02-15
WO2023275394A1 (en) 2023-01-05
MX2024000002A (es) 2024-07-09
CA3225636A1 (en) 2023-01-05
JP2024526259A (ja) 2024-07-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11833120B2 (en) Binding protein drug conjugates comprising anthracycline derivatives
JP2022120070A (ja) 抗ｃｄ７１抗体、活性化可能抗ｃｄ７１抗体、およびその使用方法
CN110845615B (zh) 抗-egfr抗体及抗体药物偶联物
JP2022065115A (ja) 抗ｃｄ１６６抗体、活性化可能抗ｃｄ１６６抗体、およびその使用方法
KR20190134654A (ko) Cd147 항체, 활성화가능한 cd147 항체, 그리고 이를 만들고, 이용하는 방법
AU2016258988A1 (en) Anti-ITGa3 antibodies, activatable anti-ITGa3 antibodies, and methods of use thereof
JP2018509182A (ja) 抗ｐｄｌ１抗体、活性化可能抗ｐｄｌ１抗体、およびその使用方法
TWI780237B (zh) 抗－ｃｄ７１可活化之抗體藥物共軛物及其使用方法
US20220000971A1 (en) Methods and compounds for targeting sortilin receptors and inhibiting vasculogenic mimicry
TW201731879A (zh) 抗５ｔ４抗體和抗體－藥物共軛體
JP2021527640A (ja) 酵素的に切断可能なリンカーおよび改善された活性プロファイルを有する、ｃｘｃｒ５に対して向けられるバインダー／活性薬剤複合体
CN117915951A (zh) 抗protac抗体及复合物
CN114904015A (zh) 包含抗cldn18.2的抗体或其抗原结合片段的抗体药物偶联物及其用途
AU2021207461A1 (en) Anti-Gal3 antibodies and methods of use
CN114641498A (zh) 结合amhrii的抗体药物缀合物及其在治疗癌症中的用途
WO2023143315A1 (zh) 一种靶向ror1的抗体或其抗原结合片段及其应用
CN118843642A (zh) 针对FRα的结合分子
WO2024141496A1 (en) Vhh anti-protac antibodies and complexes
WO2023169328A1 (zh) 一种靶向ror1的结合分子及其应用
KR20240159839A (ko) FRα에 대한 결합 분자
CN117999101A (zh) 靶向EGFR的Fc抗原结合片段-药物缀合物
CN113286618A (zh) 抗体药物偶联物和用于抗体的药物递送的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination