CN1179050C

CN1179050C - 一种可进行寡聚核苷酸分子并行合成的方法及其装置

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Publication number: CN1179050C
Application number: CNB011080906A
Authority: CN
Inventors: 朱纪军; 李炯; 左敦稳; 陆祖宏
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2001-02-09
Filing date: 2001-02-09
Publication date: 2004-12-08
Anticipated expiration: 2021-02-09
Also published as: CN1308132A

Abstract

一种可进行寡聚核苷酸分子并行合成的方法及其装置。该方法和装置其特征在于：利用化合物合成的流路系统，在其流体通道中包含有多组固相载体，用于合成多种化合物；(A)构建一个可通过流体的通道；(B)该通道包含有若干可组装的单元，每个单元内部放置用于进行化合物分子合成的固相载体；(C)对若干不同载体的单元进行组合，使流体中的某一化学基团连接在固相载体表面上；(D)通过机械运动使含有不同的化学基团的流体和不同固相载体单元在空间上和时间上进行组合，可以在固相载体上合成不同的化合物。

Description

一种可进行寡聚核苷酸分子并行合成的方法及其装置

本发明一种可进行寡聚核苷酸分子并行合成的方法及其装置涉及的是一种用于高通量并行合成DNA等化合物的方法的装置。该方法其特征在于：选用化合物合成的流路系统，在其流体通道中包含有多组固相载体，用于合成多种化合物。该方法应用组合化学的原理，可并行地在不同的微珠等微小载体上同时进行大量的不同高分子化合物序列的合成。利用组合化学的原理，充分利用DNA合成单体溶液中单体过饱和的条件，通过多种化合物并行合成的方法，节省价格贵重的单体化合物，同时实现快速合成。并根据上述设想设计出一种新的多控针并行合成装置。

人类基因组(测序)计划(Human genome project)即将完成和后基因组计划的步入实施，一方面便利越来越多的动植物、微生物基因组序得以测定，基因序列数据正在以前所未有的速度迅速增长，研究基因在生命过程中的功能就成了全世界生命科学工作者共同的课题。建立新型杂交测序方法对大量的遗传信息进行高效、快速的检测、分析就显得格外重要了。基因芯片(又称DNA芯片、生物芯片)技术的出现为解决此类问题提供了光辉的前景。

基因芯片技术系指将大量控针分子固定于支持物上，再与标记的样品分子进行互补匹配识别，通过检测每个控针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。早在八十年代，Bains W.等人就将短的DNA片断固定到支持物上，借助杂交方式进行序列测定。基因芯片技术由于同时将大量探针固定于扶持物上，所以可以一次性对样品大量序列进行检测和分析，从而解决了传统核酸印迹杂交(Sonthern Blotting和Northern Blotting等)技术操作繁杂、自动化程度低、操作序列数量少、检测效率低等不足。而且，通过设计不同的探针阵列、使用特定的分析方法可使该技术可应用于多种不同的方面，如基因表达谱测定、突变检测、多态性分析、基因组文库作图及杂交测序等。

目前将寡聚核苷酸或短肽固定到固相支持物上的方法总体上有两种。即原位合成与合成点样两种。支持物有多种如玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜等，但需经特殊处理。原位合成的支持物在聚合反应前要先使其表面衍生出羟基或氨基(视所要固定的分子为核酸或寡肽而定)并与探针分子建立共价连接；点样用的支持物为使用权其表面带上正电荷以吸附带负电荷的探针分子，通常需包被以氨基硅烷或多聚赖氨酸等功能分子膜。目前，基因芯片的制备方法除了Affymetix采用原位合成方法以外，绝大多数基因芯片均通过-高速的点样仪，通过点样的针头把纳升级的不同生物探针样品分配到固体芯片表面。尽管基因芯片技术已经取得了迅速的发展，得到世人的瞩目，但仍然存在着许多难以解决的问题，例如制备成本昂贵、检测灵敏度较低、杂交效率低、时间长、特异性差、分析范围较狭窄等问题。特别是基因芯片的昂贵价格，限制了生物芯片技术的推广应用和基因芯片质量的改善。这些问题主要表现在样品的制备、探针合成与固定、分子的标记、数据的读取与分析等几个方面。

由于寡聚核苷酸合成探针的成本高一般基因芯片均采用cDNA制作探针，但cDNA的序列较长，包含有许多非特异的片段，从而使基因芯片的假阳性率较高(一般在40％左右)。因此发展对于大量不同寡聚核苷酸DNA探针的低成本合成技术将是大幅度降低基因芯片成本、提高基因芯片准确性、和提高杂交效率与灵敏度的一个重要方向。另外，量近国际上有人提出用微珠探针来代替DNA芯片的设想，即在不同的微珠载体上连接不同的核酸探针或蛋白质受体分子。通过标记上不同荧光分子的微珠来区别不同生物探针的微珠。这种微珠上的生物分子与溶液中的靶分子之间的反应为准均相反应，反应效率高，同时通过计数等方法来检测微珠载体的生物分子相互作用，因此具有重要的应用前景。在大量不同的微珠球上高效、低成本地合成不同的核酸分子就成为这一技术的关键。现有各种探针的化学合成方法包括单通道的化学合成仪和多通道的DNA合成仪以及组合化学合成仪，现已经查明的与组合化学合成仪相关的美国专利共23个，其实现主要采用流体的阀路控制进行化学物质的合成。其中的许多专利也是针对微珠或类似载体表面的合成。专利US5503805采用阀位流路控制和惰性气体驱动流体运动的技术，将微珠等固相载体在反应通道与主通道之间进行切换。根据该专利，一个大容腔用来装载微珠。混合的微珠通过管道分散到一系列分离的反应容器中，微珠与不同的化合物反应，然后又通过流道混合。如此循环往复在微珠表面获得不同的化合物，专利US6042789在96孔板内进行固相载体表面的合成，专利US6083682提出利用多孔板在不同层多孔板之间的薄膜上合成化合物。由于形成多孔板的阵列，可以达到高通量合成的目的。但是这些方法合成成本仍然居高不下。

申请者与其合作者在基因芯片的分子印章法原位合成和PCR芯片杂交条件控制和芯片的检测等方面进行了大量的研究工作。同时针对实验过程中探针合成的效率低、成本高，耗时长等缺点，以及在微珠载体上和微珠上合成不同的DNA探针的问题提出一种快速合成化合物探针的新思路。

本发明的目的就是针对目前大量不同DNA探针合成过程中合成成本高、速度慢等不足，提出一种可进行寡核苷酸分子并行合成的方法及其装置是基于组合化学原理的，充分利用DNA合成单体溶液中单体过饱和的条件，通过多化合物并行合成的方法，节省价格贵重的单体化合物，同时实现快速合成。一种可进行寡核苷酸分子并行合成的方法，其特征在于：利用化合物合成的流路系统，在其流体通道中包含有多组固相载体，用于合成多种化合物。(A)构建一个可通过流体的通道；(B)该通道包含有若干可组装的单元，每个单元内部放置用于进行化合物分子合成的固相载体；(C)对若干不同固相载体的单元进行组合，使流体中的某一化学基团连接在固相载体表面上；(D)通过机械运动使含有不同的化学基团的流体和不同固相载体单元在空间上和时间上进行组合，可以在因相载体上合成不同的化合物，并根据上述设想设计出一种新的多控针并行合成装置。一种可进行寡聚核苷酸分子并行合成的装置，其特片在于：(A)构建一个机械装置，其内部包含有通过流体的主通道，和若干可滑动的块体部件，在每个没动块本部件上固定有若干微小的空腔；(B)上述微小空腔，其内部可放置用于进行化合物分子合成的因相载体，并且其具有能够通过化学合成用的流体但阻挡固相载体的小孔。(C)控制滑动块体部件运动，可使不同的滑动块体部件上的某个微小腔体进入主通道。通过控制不同流体经主流道流入微小腔体内，与固相载体表面的化学基团反应；使流体中的某一化学合子连接在固相载体表面上；(D)通过机械运动使含有不同的化学基团的流体和不同微小腔体中的固相载体在空间上和时间上进行组合，可以在固相载体上合成不同的序列化合物。机械装置中的滑动块体部件的通道与主通道交叉，主通道的流体与滑动固体部件的微腔对准，滑动块体部件的机械运动可以由仪器控制。仪器包括数控软件组件，位置传感器，计算机或可编程控制器主控部件，步进电机或伺服电机驱动部件。在数控组件的控制下，按一定的控制模式控制探针的合成。

一种快速寡聚核苷酸分子合成的方法，包括现有的化合物合成仪的流路系统，在运动的固相载体上合成各种化合物探针。该快速化合物探针合成载体可进行不同的组合，可以获得各种可变化化合物探针。与现有的合成仪相比，可大大提高多种化合物的合成速度，合成成本也可大幅度降低。该方法有可能使大量不同DNA探针制备成本高的难题得到解决，从而使寡核苷酸基因芯片的成本有有效的降低，使之能够更广泛的应用。

其特征在于，该方法和装置包括：

(1)块体材料的微管道的制备：

方式(一)采用注塑成型的方法或机械加工的方法制备多孔的块体材料；

方式(二)采用融模浇注的方法获得微孔阵列的块体材料；

(2)微反应小池的制造

方式(一)采用注塑成型的方法获得微反应的小池，并将单个微池排列在滑道中形成活动微池；

方式(二)采用机械加工的方法在整体的棒料上加工出微池的阵列，同时在棒料上加工出滑道或将棒料安装在滑道上形成活动的微池阵列；

(3)池阵列的运动采用运动机构在控制器的作用下按空间的三维拓朴运动，微池的定位精度在0.1mm。

(4)化合物的固定方法

微池内的固相载体合成采用标准的合成工艺，将反应物质引入微池与微池内的固相载体表面反应，在微珠的表面利用物理或化学的方法修饰连接分子，将合成仪的合成液引入带密封接头微孔通道，微池在控制器的作用下运动到微孔通道，反应液流经微池与微池内的固相载体反应，获得微珠探针。

本发明提出的寡聚核苷酸分子并行合成装置直接连接到单通道或多通道的合成仪上，采用标准的流体接口连接。微池的反应环境可以采用物理或化学的方法加速反应的进行。

下面结合附图对本发明的具体实施作进一步说明。

图1为多孔块体材料的主视图。

图2为多孔体材料的左视图。

图3为固定微池的滑块。

图4为多孔块体材料与滑块组装的三维视图。

图5为仪器总体控制图。

以上附图中，图1、2分别为本发明的块体材料的主视图(A)和左视图(B)。块体材料1的内部通道2和若干滑块通道3通过各种成型的方法获得相互交叉的微通道。通道2为流体流经的主通道。通道3为微池及其固定滑道的通道。

图3为滑块及滑块上固定的微池。按照化合物合成的要求，在滑块6上固定安装作微池5或在滑块加工出微池5，微池5内安放微珠等固相载体。为了保证足够的液体和气体的密封，滑道2上在相邻微池5的之间滑块6上装配密封器件4。

图4为寡聚核苷酸分子并行合成装置的装配示意图。DNA合成仪通道的入口和出口与该合成装置的块体1相接。固相载体放在微池5同，微池安装在可以平行运动的滑块6上，滑块6插入块体材料1的滑道3与主流道2在空间相交叉连接。于是从标准DNA合成仪中化学合成的单体、脱保护试剂以及清洗液等按一定的次序流经主通道，滑块在机构的作用下按设计的要求将微池推到主通道，随着流体流经主通道，不同空间位置的微池内的微珠固相反应，从而微珠上化学连接上了不同的单体，在微珠载体上获得设计的探针阵列。

图5为仪器的总控流程图。由于主流道采用标准的合成仪进行，各种探针在微池内的反应通过改变在流道中的维持的空间组合获得。微池的空间组合采用计算机或类似的控制器编程而得。滑道的定位精度在0.1mm左右。为了监控流体的运动，在流道的出入口利用合成仪的压力传感进行监测。

以下结合实例进行进一步说明。

实例：应用40种DNA探针同时合成装置

(一)块体材料的加工和滑道微池的加工

采用注塑成型的方法在块体材料表面获得孔道，孔道的内表面采用精加工获得高的表面粗超度Ra0.32-0.64um，块体材料采用聚四氟乙烯或钛合金或不锈钢材料。微池可以与滑道分开加工。为了防止微珠的流失，在微池的底面固定过滤膜层。同时在设计上保证反应所需要的微环境。

(二)仪器的总成

该合成仪系统包括标准DNA合成仪或其他具有相同功能的合成仪，数控软件组件，位置传感器，多孔块体材料和滑块微池组件，计算机或可编程控制器主控部件，步进电机或伺服电机驱动部件，DNA合成仪的输入流体通过管道接口与多孔块体材料上的主通道相连，并且主流道的出口与DNA合成仪的出口相连接。在数控组件的控制下，按图4的控制模式控制探针的合成。

(三)探针的合成

假设在滑道上共有5个微池，滑道有10个，按组合化学的原理可以合成25种不同的探针，设微池的排列为X坐标，滑道的排列为Y坐标，从而空间的组合为(X_i，Y_j)I＝1，2，3，4，5；j＝1，2，3，4，5；采用标准的数控编程技术，将(X_i，Y_jT_t)的坐标输入程序的设计流程，T为合成的顺序。滑道在运动部件如步进电机的驱动下在孔道中运动，微池在主通道中的定位由定位传感器反馈控制，合成完毕，取出微池中的微珠即可获得合成的不同探针的阵列。

Claims

1、一种可进行寡聚核苷酸分子并行合成的方法，其特征在于：利用化合物合成的流路系统，在其流体通道中包含有多组固相载体，用于合成多种化合物；(A)构建一个可通过流体的通道；(B)该通道包含有若干可组装的单元，每个单元内部放置用于进行化合物分子合成的固相载体；(C)对若干不同载体的单元进行组合，使流体中的某一化学基团连接在固相载体表面上；(D)通过机械运动使含有不同的化学基团的流体和不同固相载体单元在空间上和时间上进行组合，可以在固相载体上合成不同的化合物。

2、一种可进行寡聚核苷酸分子并行合成的装置，其特征在于：(A)构建一个机械装置，其内部包含有可通过流体的主通道，和若干可滑动的块体部件，在每个滑动块体部件上固定若干微小的空腔，(B)上述微小空腔，其内部可放置用于进行化合物分子合成的固相载体，并且其具有能够通过化学合成用的流体但阻挡固相载体的小孔；(C)机械装置中的滑动块体部件的通道与主通道交叉，主通道的流体与滑动固体部件的微腔对准，滑动块体部件的机械运动可以由仪器控制；固相载体放在微池内，微池安装在可以平行运动的滑块上，滑块插入块体材料的滑道与主流道在空间相交叉连接，DNA合成仪的出口与入口和块体的主流道相连接。