CN117887015A - 一种用于促进干细胞分泌抗炎因子的水凝胶及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于促进干细胞分泌抗炎因子的水凝胶，所述水凝胶由水凝胶预备液制备，所述水凝胶预备液包含质量体积百分数为0.5％‑2.5％的HAMA和5％的GelMA的溶质，溶液为光引发剂溶液。本发明还提供该水凝胶的制备方法，包括如下步骤：S1水凝胶预备液制备；S2水凝胶制备。本发明的水凝胶，同时具有较好的强度和细胞粘附能力，并且能够特异性的提升抗炎因子IL‑10的表达，能够在制备药物载体、细胞载体等产品中具有广泛的应用。
Description
技术领域
本发明涉及水凝胶材料领域，具体涉及一种用于促进干细胞分泌抗炎因子的制备方法，以及由该制备方法制得的水凝胶、以及该水凝胶的应用。
背景技术
水凝胶(Hydrogel)，是具有网状交联结构的水溶性高分子中引入一部分疏水基团和亲水残基，亲水残基与水分子结合，将水分子连接在网状内部，而疏水残基遇水膨胀的交联聚合物，性质柔软，能保持一定的形状，能吸收大量的水。现常用的水凝胶有：光固化水凝胶，如，甲基丙烯酰化明胶(Gelatin Methacryloyl，GelMA)、甲基丙烯酰化透明质酸(Hyaluronic acid Methacryloyl，HAMA)；温敏水凝胶，或称热响应水凝胶聚(在温度大于临界溶液温度LSTC时，性能会发生变化，产生明显的溶胶-凝胶转变和自动收缩性能)，如(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAAm)。
由于水凝胶性质柔软、能够吸收大量的水等特性，使得其在药物载体、微生物载体、细胞载体等方面有着广泛的应用，如在作为干细胞载体中的应用。如在炎症治疗过程中，细胞因子白介素IL-4、IL-10和IL-13能够促进成纤维细胞趋化和增殖以及胶原和ECM的产生，MSCs受到刺激能够分化，并通过旁分泌释放抗炎相关因子，MSCs与巨噬细胞之间的相互作用在促进炎症治疗中也起着重要作用。为了获得更多的抗炎因子，人们通过培养基进行繁育干细胞(如UMSC细胞)，水凝胶由于其特性也被应用在干细胞培养中，但现有的水凝胶对干细胞的抗炎功能并不具有提升作用。因此，一种既能够充当干细胞的载体、又能够促进干细胞的抗炎功能的水凝胶被值得期待。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够促进干细胞分泌抗炎因子的水凝胶，同时本发明还提供该水凝胶的制备方法、以及该水凝胶的应用。
为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种用于促进干细胞分泌抗炎因子的水凝胶，所述水凝胶由水凝胶预备液制备，所述水凝胶预备液包含质量体积百分数为0.5％-2.5％的HAMA和5％的GelMA的溶质，溶液为光引发剂溶液。
本发明中，进一步优选的方案为，所述水凝胶预备液包含质量体积百分数为0.5％的HAMA和5％的GelMA，以及光引发剂溶液；所述光引发剂溶液中光引发剂为LAP、溶剂为PBS溶液，所述光引发剂溶液中LAP的质量体积百分数为0.25％；所述水凝胶预备液中还具有FN溶液，所述FN溶液的溶剂为去离子水、浓度为1mg/mL；每1mL水凝胶预备液中含有10μL的FN溶液。
本发明中，进一步优选的方案为，所述干细胞为UMSC干细胞。
本发明中，进一步优选的方案为，所述抗炎因子为IL-10。
一种用于促进干细胞分泌抗炎因子的水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
S1水凝胶预备液制备：将GelMA固体溶解在光引发剂溶液中，接着加入HAMA固体，配制含质量体积百分数为0.5％-2.5％的HAMA和5％的GelMA的水凝胶预备液；
S2水凝胶制备：将步骤S1制得的水凝胶预备液在紫外光下固化成胶，即得。
本发明中，进一步优选的方案为，所述步骤S1的光固化水凝胶预备液中还具有FN溶液，所述FN溶液的溶剂为去离子水、浓度为1mg/mL；每1mL水凝胶预备液中含有10μL-50μL的FN溶液。
本发明中，进一步优选的方案为，所述步骤S1中的光引发剂溶液中光引发剂为LAP、溶剂为PBS溶液，所述光引发剂溶液中LAP的质量体积百分数为0.25％。
本发明中，进一步优选的方案为，所述步骤S1具体为：将LAP固体加入PBS溶液中，在水浴锅中40℃避光溶解15分钟，然后置于4℃温度下备用，得到LAP光引发剂溶液，其中，LAP光引发剂溶液中LAP的质量体积百分数为0.25％；然后，将GelMA固体加入LAP光引发剂溶液中，在水浴锅60℃避光溶解30分钟；接着在避光环境下，加入HAMA固体，室温搅拌至HAMA固体全部溶解，即得。
本发明中，进一步优选的方案为，所述步骤S1的水凝胶预备液中：HAMA的质量百分数为0.5％、GelMA的质量百分数为5％。
本发明中，进一步优选的方案为，所述步骤S1的水凝胶预备液中还包括FN溶液，每1mL水凝胶预备液中含有10μL的FN溶液。
本发明还提供上述各制备方法制得的水凝胶；上述水凝胶，可以广泛应用于制备抗炎药物、药物载体、医用植入材料等任意一产品中。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：本发明的水凝胶通过采用GelMA、HAMA两种凝胶的组合，能够使得水凝胶的机械强度性能、以及细胞粘附性能均表现良好，而机械强度性能的提升能够进一步避免水凝胶发生塌陷，并且其同时具有较好的机械强度性能和细胞粘附性能；并且能够特异性的提升干细胞抗炎因子IL-10的表达；同时本发明的制备方法简单已操作，易于工业生产，应用广泛。
下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
附图说明
图1为实施例1中“GelMA、HAMA以及FN的配比的确定实验”中的水凝胶压缩模量测试数据图；
图2为实施例1中“GelMA、HAMA以及FN的配比的确定实验”中的细胞增殖及荧光效果图；
图3为实施例1中“GelMA、HAMA以及FN的配比的确定实验”中的细胞增殖效果放大图；
图4为实验例1中实施例的水凝胶样品1和对照组所培养的UMSC干细胞所表达的IL-4的含量测试数据对比图；
图5为实验例1中实施例的水凝胶样品2和对照组所培养的UMSC干细胞所表达的IL-10的含量测试数据对比图；
图6为实验例1中实施例的水凝胶样品3和对照组所培养的UMSC干细胞所表达的IL-13的含量测试数据对比图；
其中，图4-图6中的“3IL-con”表示对照组，GHF表示实施例1的水凝胶样本。
具体实施方式
下面，结合附图以及具体的实施方式对本发明做进一步的描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，一下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合成新的实施例。除特殊说明的之外，具体实施方式中的实施例与实验例，其中的设备和试剂材料均从市场途径获得，具体的实施例是示范性的，仅用于解释本申请，而不能理解作为本申请保护范围的限制。
一种用于促进干细胞分泌抗炎因子的水凝胶，所述水凝胶由水凝胶预备液制备，所述水凝胶预备液包含质量体积百分数为0.5％-2.5％的HAMA和5％的GelMA的溶质，溶液为光引发剂溶液；
本发明中，进一步优选的方案为，所述水凝胶预备液包含质量体积百分数为0.5％的HAMA和5％的GelMA，以及光引发剂溶液；所述光引发剂溶液中光引发剂为LAP、溶剂为PBS溶液，所述光引发剂溶液中LAP的质量体积百分数为0.25％；所述水凝胶预备液中还具有FN溶液，所述FN溶液的溶剂为去离子水、浓度为1mg/mL；每1mL水凝胶预备液中含有10μL的FN溶液。
一种用于促进干细胞分泌抗炎因子的水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
S1水凝胶预备液制备：将GelMA固体溶解在光引发剂溶液中，接着加入HAMA固体，配制含质量体积百分数为0.5％-2.5％的HAMA和5％的GelMA的水凝胶预备液；
S2水凝胶制备：将步骤S1制得的水凝胶预备液在紫外光下固化成胶，即得。
明胶(Gelatin)是经胶原蛋白适度水解和热变性得到的天然生物高分子材料，其具有和胶原相似的氨基酸序列。甲基丙烯酰化明胶(Gelatin Methacryloyl,GelMA)为烯烃双键改性明胶，其可通过紫外及可见光在光引发剂作用下迅速固化成胶。GelMA光固化水凝胶兼具天然和合成生物材料的特征，其具有适于细胞生长和分化的三维(3D)结构。GelMA水凝胶具有优异的生物相容性和细胞反应特性，例如提供合适的细胞粘附位点及蛋白水解降解性，其可以取代人工基底膜或其他天然胶原蛋白水凝胶。
透明质酸(Hyaluronic acid,HA)是由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰-D-氨基葡萄糖作为双糖结构单元的天然糖胺多糖聚合物。是动物组织细胞外基质的成分，具有良好的锁水保湿性能，在脑组织、滑膜液和玻璃体中含量较高。HA在细胞增殖、分化、形态发生、炎症和伤口愈合等许多生物学过程中发挥重要作用。甲基丙烯酰化透明质酸(Hyaluronic acidMethacryloyl,HAMA)是通过在透明质酸分子链上引入甲基丙烯基团进而赋予其光固化能力。
GelMA水凝胶细胞粘附性好，但机械强度性能较差，如在其中加入HAMA，虽然能提升机械强度性能，但会使凝胶的粘附细胞能力变差。为了改善凝胶的机械强度性能并且保持对细胞的粘附能力，发明人通过实验分析得出“含质量体积百分数5％的GelMA、0.5％的HAMA”的水凝胶，虽然加入了HAMA，但对细胞粘附能力较相同浓度的GelMA水凝胶并没有明显的差异，而且其机械强度性能得到了明显的提高，而机械强度性能的提升能够进一步避免水凝胶发生塌陷；而其余比例的加入GelMA、HAMA的水凝胶，在其培养上的细胞成团状分布，粘附细胞能力较差。通过本发明的水凝胶对干细胞进行培养，可以发现抗炎因子IL-10的分泌量得到了特异性提升。
为了进一步提升本发明水凝胶对细胞的粘附性能，可以做这样的设置，所述步骤1的光固化水凝胶预备液中还添加有FN(纤连蛋白)溶液，所述FN溶液的溶剂为去离子水、浓度为1mg/mL；每1mL光固化水凝胶预备液中具有10μL-50μL的FN溶液；通过加入FN溶液，能够使得水凝胶对细胞粘附性能进一步提升，并且还能提升水凝胶材料的生物相容性；发明人通过实验发现，每1mL光固化水凝胶预备液中添加10μL的FN溶液，其粘附性能较其他浓度的粘附性能更好，并且水凝胶的生物相容性也得到提升。
对于光引发剂、温敏水凝胶的交联剂的选择，发明人通过实验分析发现，选用本发明的光引发剂LAP【苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂】、以及交联剂MBA(N，N-亚甲基双丙烯酰胺)及相应的浓度、比例，例举为“所述步骤S1中的LAP光引发剂溶液中LAP的质量体积百分数为0.25％、溶剂为PBS溶液”，交联成胶效果较好。
对于避光环境，可以选择在棕色瓶中进行，如将相应的水凝胶预备液置入棕色瓶中进行混合、搅拌等操作。
本发明中，进一步优选的方案为，所述步骤S1具体为：将LAP固体加入PBS溶液中，在水浴锅中40℃避光溶解15分钟，然后置于4℃温度下备用，得到LAP光引发剂溶液，其中，LAP光引发剂溶液中LAP的质量体积百分数为0.25％；然后，将GelMA固体加入LAP光引发剂溶液中，在水浴锅60℃避光溶解30分钟；接着在避光环境下，加入HAMA固体，室温搅拌至HAMA固体全部溶解，即得。
本发明中，干细胞可以选自市售的干细胞或者经生物工程培养的干细胞，如为UMSC干细胞(人脐带间充质干细胞)。
本发明还提供上述各制备方法制得的水凝胶；上述水凝胶，可以广泛应用于制备抗炎药物、药物载体、医用植入材料等任意一产品中。
为了提升成胶的稳定性和避免杂质的干扰，可以做这样的设置，将步骤S1得到的水凝胶预备液通过0.22μm的过滤器过滤，然后再进行步骤S2的成胶操作。
本发明的PBS溶液是指，pH值为7.2-7.4的磷酸盐缓冲溶液。
实施例1：GelMA、HAMA以及FN的配比的确定实验
基于GelMA水凝胶细胞粘附性好，但机械强度性能较差，如在其中加入HAMA，虽然能提升机械强度性能，但会使凝胶的粘附细胞能力变差。为了改善凝胶的机械强度性能并且保持对细胞的粘附能力，发明人向GelMA水凝胶预备液中加入最终含量为0.5％-2.5％的HAMA固体材料，分别配制了G5H0.5(其中，G指代GelMA，5表示水凝胶材料中的GelMA的质量体积百分数为5％；对应的，H表示HAMA，0.5％表示水凝胶材料中的HAMA质量体积百分数为0.5％；其他组别的指代与本组一致，后续组别不做赘述)、G5H1、G5H2.5三种不同材料配比的水凝胶。
利用UMSC验证细胞粘附能力，观察细胞在水凝胶表面的粘附水平以及简单观察了机械强度变化(具体的机械性能参见说明书图中图1的水凝胶压缩模量测试数据图，图1中的GelMA组对应于5％GelMA水凝胶的压缩模量曲线，GH组表示“5％GelMA+0.5％HAMA”水凝胶的压缩模量曲线，GHF组表示“5％GelMA+0.5％HAMA+10FN”水凝胶的压缩模量曲线)，从图中数据可以看出，加入HAMA能够提升水凝胶的机械性能，添加FN能够进一步提升水凝胶的机械性能。
经过实验验证，G5H1、G5H2.5两种水凝胶材料对于UMSCs的粘附能力有明显降低，细胞成团状分布(具体细胞粘附能力的测试参见说明书附图中图2的细胞增殖及荧光效果图，在上述水凝胶上培养UMSCs细胞，培养5天，每天观察一次)；G5H0.5水凝胶上的细胞粘附能力较5％GelMA水凝胶没有明显的降低，且机械强度有了明显升高，因此在后续材料配比中选择5％GelMA+0.5％HAMA这个浓度配比。
为了提升水凝胶材料细胞粘附能力、以及提高水凝胶材料的生物相容性，向每毫升上述水凝胶中分别加入10μL、50μL FN溶液，与G5H0.5进行对比，观察细胞在水凝胶表面的粘附水平(具体细胞粘附能力的测试参见说明书附图中图3的水凝胶细胞增值效果放大图，在上述水凝胶上培养UMSCs细胞，培养7天，在第2天、第5天、第7天各观察一次，其中，“GelMA”组表示对应于“5％GelMA”水凝胶组测观察的细胞增殖效果放大图，“GelMA+HAMA”组对应“G5H0.5”水凝胶组测观察的细胞增殖效果放大图，“GelMA+HAMA+10FN”组对应的“G5H0.5+10FN”水凝胶组测观察的细胞增殖效果放大图，“Ge lMA+HAMA+50FN”组对应的“G5H0.5+50FN”水凝胶组测观察的细胞增殖效果放大图)。实验发现G5H0.5+10FN的细胞粘附水平优于其他两组。因此以5％GelMA+0.5％HAMA+10FN(即每毫升上述水凝胶中加入10μL的FN溶液)配比的水凝胶作为用于细胞负载的有效组分。
实施例2
一种用于促进干细胞分泌抗炎因子的水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
S1水凝胶预备液制备：将GelMA固体溶解在光引发剂溶液中，接着加入HAMA固体，配制含质量体积百分数为0.5％的HAMA和5％的GelMA的水凝胶预备液；
S2水凝胶制备：将步骤S1制得的水凝胶预备液在紫外光下30s固化成胶，即得；
所述步骤S1的光固化水凝胶预备液中还具有FN溶液，所述FN溶液的溶剂为去离子水、浓度为1mg/mL；每1mL水凝胶预备液中含有10μL的FN溶液；
所述步骤S1、S2中的光引发剂溶液中光引发剂为LAP、溶剂为PBS溶液，所述光引发剂溶液中LAP的质量体积百分数为0.25％；
所述步骤S1具体为：将LAP固体加入PBS溶液中，在水浴锅中40℃避光溶解15分钟，然后置于4℃温度下备用，得到LAP光引发剂溶液，其中，LAP光引发剂溶液中LAP的质量体积百分数为0.25％；然后，将GelMA固体加入LAP光引发剂溶液中，在水浴锅60℃避光溶解30分钟；接着在避光环境下，加入HAMA固体，室温搅拌至HAMA固体全部溶解，即得。
实验例1
取本发明实施例1的水凝胶，接种UMSC细胞，观察记录不同时间点的细胞生长粘附水平，在D5时间点收集培养48h上清液，用于后续Elisa测定上清中IL-4、IL-10、IL-13表达量。
收集上述水凝胶中细胞培养D5上清，将培养相同周期正常孔板培养细胞收得的细胞上清作为对照组，收集以上2组样品上清，用于Elisa试剂盒检测。首先根据预实验得到各样品适合的稀释倍数，随后随机选取实施例1水凝胶三个样品，各样品制备3个复孔用于抗炎因子检测，其中样品1及其对照组样品用于检测IL-4、其中样品2及其对照组样品用于检测IL-10、其中样品3及其对照组样品用于检测IL-13。测得的数据参见图4-图6，可以看出：实施例1的水凝胶上的干细胞IL-4和IL-13的分泌/表达有下降的趋势，而IL-10的蛋白分泌量提高2倍多，本发明的水凝胶对抗炎因子IL-10的表达能够起到特异性的促进和提升作用。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种用于促进干细胞分泌抗炎因子的水凝胶，其特征在于，所述水凝胶由水凝胶预备液制备，所述水凝胶预备液包含质量体积百分数为0.5％-2.5％的HAMA和5％的GelMA的溶质，溶液为光引发剂溶液。
2.一种用于促进干细胞分泌抗炎因子的水凝胶，其特征在于，所述水凝胶预备液包含质量体积百分数为0.5％的HAMA和5％的GelMA，以及光引发剂溶液；所述光引发剂溶液中光引发剂为LAP、溶剂为PBS溶液，所述光引发剂溶液中LAP的质量体积百分数为0.25％；所述水凝胶预备液中还具有FN溶液，所述FN溶液的溶剂为去离子水、浓度为1mg/mL；每1mL水凝胶预备液中含有10μL的FN溶液。
3.根据权利要求1所述的水凝胶，其特征在于，所述干细胞为UMSC干细胞。
4.根据权利要求1所述的水凝胶，其特征在于，所述抗炎因子为IL-10。
5.一种根据权利要求1所述的用于促进干细胞分泌抗炎因子的水凝胶的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
S1水凝胶预备液制备：将GelMA固体溶解在光引发剂溶液中，接着加入HAMA固体，配制含质量体积百分数为0.5％-2.5％的HAMA和5％的GelMA的水凝胶预备液；
S2水凝胶制备：将步骤S1制得的水凝胶预备液在紫外光下固化成胶，即得。
6.根据权利要求3所述水凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤S1的光固化水凝胶预备液中还具有FN溶液，所述FN溶液的溶剂为去离子水、浓度为1mg/mL；每1mL水凝胶预备液中含有10μL-50μL的FN溶液。
7.根据权利要求5所述水凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤S1中的光引发剂溶液中光引发剂为LAP、溶剂为PBS溶液，所述光引发剂溶液中LAP的质量体积百分数为0.25％。
8.根据权利要求5所述水凝胶的制备方法，其特征在于所述步骤S1具体为：将LAP固体加入PBS溶液中，在水浴锅中40℃避光溶解15分钟，然后置于4℃温度下备用，得到LAP光引发剂溶液，其中，LAP光引发剂溶液中LAP的质量体积百分数为0.25％；然后，将GelMA固体加入LAP光引发剂溶液中，在水浴锅60℃避光溶解30分钟；接着在避光环境下，加入HAMA固体，室温搅拌至HAMA固体全部溶解，即得。
9.根据权利要求5所述水凝胶的制备方法，其特征在于所述步骤S1的水凝胶预备液中：HAMA的质量百分数为0.5％、GelMA的质量百分数为5％。
10.一种根据权利要求1-4任一项所述的水凝胶，其在制备抗炎药物、药物载体、医用植入材料中任意一种产品中的应用。
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