CN117860947A - 一种促进慢性伤口愈合的天然碱性多糖功能复合体的制备方法及其应用 - Google Patents
一种促进慢性伤口愈合的天然碱性多糖功能复合体的制备方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种促进慢性伤口愈合的天然碱性多糖功能复合体的制备方法及其应用。方法包括(1)通过血管内皮生长因子与壳聚糖偶联形成载有生长因子的壳聚糖长链分子；(2)将载有生长因子的壳聚糖长链分子溶解于盐酸溶液，得到壳聚糖溶液，和明胶混合形成壳聚糖明胶混合溶液；(3)交联剂和壳聚糖明胶混合溶液交联，冷冻干燥后高温灭菌，形成促进慢性伤口愈合的天然碱性多糖功能复合体。用于腔道及较深伤口填塞，高效吸收伤口渗出液，释放生长因子促进组织再生和慢性伤口愈合，具有止血、镇痛、抗渗出、防黏连、防止感染和促愈合，减小疤痕等作用，应用于慢性伤口的各个阶段，实现不同慢性伤口阶段的统一方式护理，具有良好的临床应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及医用敷料技术领域，特别涉及一种促进慢性伤口愈合的天然碱性多糖功能复合体的制备方法及其应用。
背景技术
慢性伤口从定义上是指无法在伤口愈合的合理时间(通常为8～12周)内愈合，且容易复发的一类伤口，通常具有细胞外机制重构存在缺陷、再上皮化受抑制和长期的炎症反应等特点。一般将慢性伤口划分为静脉性溃疡、动脉性溃疡、糖尿病性溃疡、创伤性溃疡、压力性溃疡5类常见类型，其他还有由肿瘤和结缔组织疾病麻风等引起的创面。
目前慢性伤口的治疗措施为病因治疗与非手术治疗，原则是控制感染、促进愈合，主要为清洁创面、清除坏死组织，加强更换敷料及换药。创面敷料作为伤口处的覆盖物，在伤口愈合过程中，可以替代受损的皮肤起到暂时性屏障作用，避免或控制伤口感染，起到保护创口、创面，提供有利于创面愈合环境的医用卫生材料。
国内上市创面敷料多为传统敷料，如：创口贴、隔离敷料(如凡士林纱布)和其他常规的创面敷料，而新型创面敷料则以湿性敷料为主。传统敷料对创面虽有保护作用，但一般认为它对创面愈合无促进作用，如敷料中应用抗生素可能引起局部细菌耐药，影响创面愈合；亦或更换敷料时损伤肉芽组织，从而延迟创面愈合等。虽然一些方法能部分改善传统敷料的性能，但依然存在难以克服的先天缺陷。
新型创面敷料指在传统纱布类敷料基础上经过创新设计和技术改进得到的具有新的材料、功能或性能的敷料产品，具有伤口治疗和保护功能。根据敷料本身的构成与功能，新型创面敷料可分为相互作用型敷料与生物活性型敷料两类。相互作用型敷料包括高分子薄膜、水凝胶敷料、高分子泡沫和水胶体敷料。生物活性型敷料包括药物性敷料、动物源敷料、复合型敷料和人工皮肤。
其中高分子薄膜敷料吸收饱和后易致膜下渗液的积聚，可能诱发病原体滋生或加重创面感染，因此不适用于渗出性和感染性创面；泡沫敷料粘性差，敷料强度不高，易损坏，普遍不透明，难以观察创面情况，易受细菌污染，敷料孔隙大，创面肉芽组织易长入,更换敷料易造成脱膜困难；喷雾膜敷料易被创面渗液溶解，无抗感染作用，敷料保湿性差故创面水分丢失多，不适用于大面积创面，且粘附性和抗张强度均较差；水凝胶敷料通气性较差,它对液体的处理方式就是吸收了渗出物的水凝胶不污染伤口，短期不必更换敷料，但大量吸收渗出物后引起敷料膨胀，导致敷料与伤口分离，给细菌的侵入提供了机会；藻酸盐类敷料缺点在于有异味，无粘性，外观与创面感染脓性分泌物不易区分，易发硬引起创面再损伤；人工皮，主要是异体皮，存在来源受限、保存条件要求高、抗原性、有占位性、病原微生物易感染等临床问题及伦理学问题。
根据现代伤口医学对新型暂时性创面覆盖敷料的要求，研究一种同时具备良好的吸液性、屏障功能性、生物安全性、抗菌性、顺应性、适当通透性、减轻疼痛、促进创面愈合、使用方便的新型创伤敷料，是临床的迫切需要。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。本发明提供了一种促进慢性伤口愈合的天然碱性多糖功能复合体的制备方法，所制备的促进慢性伤口愈合的天然碱性多糖功能复合体可用于医用敷料领域。可用于腔道及较深伤口填塞，可高效吸收伤口渗出液，释放生长因子促进组织再生和慢性伤口愈合，具有止血、镇痛、抗渗出、防黏连、防止感染和促愈合，减小疤痕等作用，有望应用于慢性伤口的各个阶段，实现不同慢性伤口阶段的统一方式护理，具有良好的临床应用价值。
壳聚糖是甲壳素脱乙酰基的产物，化学名称为β-1,4-聚-D-氨基葡萄糖，是一种天然碱性多糖，作为甲壳素的衍生物，具有良好的生物相容性，可降解性、吸附性、抗菌性以及止血、加速伤口愈合等性能。
壳聚糖是巨噬细胞的阳性趋化剂，能够激活和诱导各种生长因子，作用于周围缺损的细胞，加快七增值，并加速细胞吞噬作用降解碎片。壳聚糖还可抑制伤口处Ι型骨胶原的产生，促进Ш型胶原蛋白的分泌以及肉芽组织和上皮组织的生成，减少伤口收缩，从而起到促进伤口愈合和减小疤痕的作用。
本法设计制备的天然碱性多糖功能复合体柔软细腻，可用于腔道及较深伤口填塞，多孔结构具备较高吸液倍数，可高效吸收伤口渗出液，吸液后形成交联凝胶结构不会粘连伤口便于清创，并且可以释放生长因子促进组织的再生和慢性伤口的愈合，复合体吸液后形成的凝胶具有较高的含水量，可保护创面并形成湿性环境以促进伤口愈合。天然碱性多糖功能复合体具有止血、镇痛、抗渗出、防黏连、防止感染和促愈合，减小疤痕等作用，良好的生物相容性、生物降解性和无毒性，有望应用于慢性伤口的各个阶段，实现不同慢性伤口阶段的统一方式护理，具有良好的临床应用价值。
本发明通过血管内皮生长因子(VEGF)与壳聚糖进行偶联形成具有载有生长因子的壳聚糖长链分子结构；然后通过盐酸溶液溶解，而后加入明胶形成混合溶液。混合溶液与交联剂溶液进行交联，经冷冻干燥，高温处理后辐照灭菌，即可得到一种促进慢性伤口愈合的天然碱性多糖功能复合体。
本发明所提供的制备方法操作方便、成本低，制备的天然碱性多糖功能复合体柔软细腻，可用于腔道及较深伤口填塞，多孔结构具备较高吸液倍数，可高效吸收伤口渗出液，吸液后形成交联凝胶结构不会粘连伤口便于清创，并且可以释放生长因子促进组织的再生和慢性伤口的愈合，复合体吸液后形成的凝胶具有较高的含水量，可保护创面并形成湿性环境以促进伤口愈合。天然碱性多糖功能复合体具有止血、镇痛、抗渗出、防黏连、防止感染和促愈合，减小疤痕等作用，良好的生物相容性、生物安全性、生物降解性和无毒性，有望应用于慢性伤口的各个阶段，实现不同慢性伤口阶段的统一方式护理，具有良好的临床应用价值。
具体而言，本发明提供了如下技术方案：
本发明提供了一种促进慢性伤口愈合的天然碱性多糖功能复合体的制备方法，包括：
(1)通过血管内皮生长因子(VEGF)与壳聚糖偶联形成载有生长因子的壳聚糖长链分子；
(2)将所述载有生长因子的壳聚糖长链分子溶解于盐酸溶液中，得到壳聚糖溶液，然后和明胶混合形成壳聚糖明胶混合溶液；
(3)将交联剂和壳聚糖明胶混合溶液进行交联，冷冻干燥，高温处理后灭菌，形成所述促进慢性伤口愈合的天然碱性多糖功能复合体。
根据本发明的实施例，以上所述的促进慢性伤口愈合的天然碱性多糖功能复合体的制备方法还可以进一步包括如下技术特征：
在本发明的一些实施例中，所述的壳聚糖为药用级，所述壳聚糖的脱乙酰度为50％～98％。
在本发明的一些实施例中，所述的盐酸溶液的浓度范围为0.1～1(w/v)％。
在本发明的一些实施例中，所述交联剂选自醛类化合物、聚环氧化合物、生物交联剂中的至少一种。
在本发明的一些实施例中，所述交联剂通过戊二醛和京尼平混合溶解于去离子水并进行高温促溶得到，所述高温促溶的温度为30～100℃，所述高温促溶的时间为1～10h。
在本发明的一些实施例中，步骤(1)进一步包括：
(1-1)将血管内皮生长因子(VEGF)分散在PB缓冲液中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化；
(1-2)加入壳聚糖偶联反应，然后析出沉淀，冷冻干燥即得到所述载有生长因子的壳聚糖长链分子；
所述冷冻干燥依次包括预冻温度下处理、初次干燥处理以及解析干燥处理：
所述预冻温度为-50℃、时间为5h，
所述初次干燥的温度为0℃、时间为16h，
所述解析干燥的温度为25℃，时间为20h。
在本发明的一些实施例中，步骤(3)所述冷冻干燥进一步包括：预冻温度下处理、初次干燥处理以及解析干燥处理：
所述预冻温度为-50～-30℃、时间为5～15h，
所述初次干燥的温度为0～10℃、时间为4～18h，
所述解析干燥的温度为20～30℃，时间为4～12h。
在本发明的一些实施例中，所述高温处理为在40～60℃下通风干燥2～3小时。
在本发明的一些实施例中，所述灭菌为γ射线辐照灭菌，辐照剂量为15～35KGy。
本发明的第二方面提供了一种促进慢性伤口愈合的天然碱性多糖功能复合体，根据第一方面任一实施例所述的制备方法获得。
本发明的第三方面提供了一种促进慢性伤口愈合的天然碱性多糖功能复合体在医用敷料领域中的用途，所述促进慢性伤口愈合的天然碱性多糖功能复合体为第二方面所述的促进慢性伤口愈合的天然碱性多糖功能复合体。
本发明所取得的有益效果为：
本发明所提供的制备方法操作方便、成本低，制备的天然碱性多糖功能复合体柔软细腻，可用于腔道及较深伤口填塞，多孔结构具备较高吸液倍数，可高效吸收伤口渗出液，吸液后形成交联凝胶结构不会粘连伤口便于清创，并且可以释放生长因子促进组织的再生和慢性伤口的愈合，复合体吸液后形成的凝胶具有较高的含水量，可保护创面并形成湿性环境以促进伤口愈合。天然碱性多糖功能复合体具有止血、镇痛、抗渗出、防黏连、防止感染和促愈合，减小疤痕等作用，良好的生物相容性、生物降解性和无毒性，有望应用于慢性伤口的各个阶段，实现不同慢性伤口阶段的统一方式护理，具有良好的临床应用价值。
附图说明
图1是根据本发明所提供的促进慢性伤口愈合的天然碱性多糖功能复合体的外观图。
图2是根据本发明的实施例提供的促进慢性伤口愈合的天然碱性多糖功能复合体的联合背衬制备小样图。
图3是根据本发明的实施例提供的促进慢性伤口愈合的天然碱性多糖功能复合体的物理表征-扫描电子显微镜观察图。
图4是根据本发明的实施例提供的促进慢性伤口愈合的天然碱性多糖功能复合体的物理表征-扫描电子显微镜观察图。
图5是根据本发明的实施例提供的促进慢性伤口愈合的天然碱性多糖功能复合体吸液24小时之后的状态图。
图6是根据本发明提供的不同实施例和对比例在脊柱上的实验位置图。
图7是根据本发明提供的不同实施例和对比例所制备的产品的促愈合动物实验结果图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
本发明提供了一种促进慢性伤口愈合的天然碱性多糖功能复合体的制备方法，包括：
(1)通过血管内皮生长因子(VEGF)与壳聚糖偶联形成载有生长因子的壳聚糖长链分子；
(2)将所述载有生长因子的壳聚糖长链分子溶解于盐酸溶液中，得到壳聚糖溶液，然后和明胶混合形成壳聚糖明胶混合溶液；
(3)将交联剂和壳聚糖明胶混合溶液进行交联，冷冻干燥，高温处理后灭菌，形成所述促进慢性伤口愈合的天然碱性多糖功能复合体。
所制备的促进慢性伤口愈合的天然碱性多糖功能复合体的联合背衬制备小样图可以参考图2所示。本发明所提供的制备方法操作方便、成本低，制备的天然碱性多糖功能复合体柔软细腻，可用于腔道及较深伤口填塞，多孔结构具备较高吸液倍数，可高效吸收伤口渗出液，吸液后形成交联凝胶结构不会粘连伤口便于清创，并且可以释放生长因子促进组织的再生和慢性伤口的愈合，复合体吸液后形成的凝胶具有较高的含水量，可保护创面并形成湿性环境以促进伤口愈合。天然碱性多糖功能复合体具有止血、镇痛、抗渗出、防黏连、防止感染和促愈合，减小疤痕等作用，良好的生物相容性、生物降解性和无毒性，有望应用于慢性伤口的各个阶段，实现不同慢性伤口阶段的统一方式护理，具有良好的临床应用价值。
所形成的天然碱性多糖功能复合体的实物如图1所示。
壳聚糖是一种天然高分子多糖，不仅可生物降解、低毒、生物相容性好，且具有抗酸、抗溃疡，促进伤口愈合等特性，使其广泛应用于生物医疗敷料领域。壳聚糖作为一种少见的天然碱性多糖，其结构中富含游离的氨基，将其置于稀酸中，其葡萄糖氨基则转化为R-NH3+，即形成聚阳离子凝胶溶液。在本发明的一些实施例中，所述的壳聚糖为药用级，所述壳聚糖的脱乙酰度50％～98％，否则会影响产品吸液性能及止血效果。
在本发明的一些实施方式中，所述盐酸溶液的浓度范围为0.1～1(w/v)％。
在本发明的一些实施例中，所述的明胶为药用级。明胶是一种生物蛋白大分子，由胶原蛋白水解后生成，因其来源丰富，成本相对较低，且具有良好的生物降解及生物相容性。所述交联剂可为化学交联剂。天然交联剂等的一种或多种。在本发明的一些实施例中，所述交联剂选自醛类化合物、聚环氧化合物、生物交联剂中的至少一种。其中，醛类化合物(如戊二醛和乙二醛)，这类交联剂交联效率较高，但易残留毒性；生物交联剂目前常用的有栀子苷提取物(如京尼平)，细胞毒性较低，生物相容性好，应用于食品、医疗等多个领域。
在本发明的一些实施方式中，所述交联剂通过戊二醛和京尼平混合溶解于去离子水中，并进行高温促溶得到，所述高温促溶的温度为30～100℃，所述高温促溶的时间为1～10h。例如高温促溶的温度可以为40～60摄氏度，直至交联剂完全溶解。
在本发明的一些实施方式中，步骤(1)进一步包括：
(1-1)将血管内皮生长因子(VEGF)分散在PB缓冲液(pH7.2)中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化；
(1-2)加入壳聚糖反应，然后析出沉淀，冷冻干燥即得到所述载有生长因子的壳聚糖长链分子；
所述冷冻干燥依次包括预冻温度下处理、初次干燥处理以及解析干燥处理：
所述预冻温度为-50℃、时间为5h，
所述初次干燥的温度为0℃、时间为16h，
所述解析干燥的温度为25℃，时间为20h。
将血管内皮生长因子(VEGF)分散在PB缓冲液(pH7.2)中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，将羧基活化之后，马上加入壳聚糖，反应2～10h之后使用冰乙醚析出沉淀，冷冻干燥后即得到有载有生长因子的壳聚糖长链分子。
在本发明的一些实施方式中，步骤(3)中所述冷冻干燥依次包括预冻温度下处理、初次干燥处理以及解析干燥处理：
所述预冻温度为-50～-30℃、时间为5～15h，
所述初次干燥的温度为0～10℃、时间为4～18h，
所述解析干燥的温度为20～30℃，时间为4～12h。
温度的控制显著影响壳聚糖-明胶功能性体系的凝胶化时间、力学性能、功能性的溶胀率等性能，从而影响天然碱性多糖功能复合体的相关性能。在制备时，热处理和冷冻干燥的温度和时间需根据制备条件的不同进行调整，最终取得最佳处理工艺，提高复合体孔隙率，形成适宜的孔径大小，孔径均匀，持续释放生长因子，加快伤口上皮化过程，缩短伤口愈合周期，促进组织再生，并增加对渗出液的吸收能力，并增加复合体柔软度便于腔道填塞，并最终形成成型良好的凝胶，具备较高的机械性能，便于去除防止粘连。经过上述冷冻干燥处理，所获得的天然碱性多糖功能复合体的各方面性能俱佳。
在本发明的一些实施方式中，所述灭菌为γ射线辐照灭菌，辐照剂量为15～35KGy。
本发明还提供了一种促进慢性伤口愈合的天然碱性多糖功能复合体，根据上述所述的制备方法获得。
在本发明的一些实施方式中，所述天然碱性多糖功能复合体包括壳聚糖，明胶和交联剂，所述壳聚糖的质量浓度为1～5％(w/w)，明胶的质量浓度为0.5～1(w/w)％，交联剂的质量浓度为0.1～0.5(w/w)％。
下面通过具体实施例对于本发明的技术方案进行说明。需要说明的是，这些实施例仅用来方便本领域技术人员理解，不应看做是对本发明保护范围的限制。未做特殊说明的情况下，实施例中所用到的试剂均可以通过商购获得。
实施例1
实施例1提供了一种促进慢性伤口愈合的天然碱性多糖功能复合体，其通过下述方法制备获得：
1.载有生长因子的壳聚糖长链分子制备：取血管内皮生长因子(VEGF)分散在PB缓冲液(pH7.2)中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，将羧基活化之后，马上加入壳聚糖，反应4h之后使用冰乙醚析出沉淀，冷冻干燥，所述冷冻干燥依次包括预冻温度下处理、初次干燥处理以及解析干燥处理：
所述预冻温度为-50℃、时间为5h，
所述初次干燥的温度为0℃、时间为16h，
所述解析干燥的温度为25℃，时间为20h。
冷冻干燥后即得到载有生长因子的壳聚糖长链分子。
2.将所制备的载有生长因子的壳聚糖溶解于0.1(w/v)％的乙酸溶液中，在磁力搅拌器下搅拌2h。将明胶置于去离子水中并30℃高温促溶，而后加入到壳聚糖溶液中，形成壳聚糖明胶混合溶液。将戊二醛和京尼平交联剂混合液(混合比例1：1，v/v)溶解于去离子水中并50℃高温促溶。
3.在冰浴条件下，应用磁力搅拌器持续搅拌，将交联剂混合液逐滴加入到壳聚糖和明胶的混合液中，并持续搅拌0.5h，形成功能性溶液。在功能性溶液中，使壳聚糖的终浓度分别为:1.6％(w/v)，明胶的终浓度为0.6％(w/v)，交联剂混合液终浓度为:0.1％(w/v)。将功能性溶液缓慢倒入7cm×10cm×2cm长方体模具中，置于37℃恒温箱一段时间后冷冻干燥，冷冻干燥依次包括预冻温度下处理、初次干燥处理以及解析干燥处理：
所述预冻温度为-40℃、时间为5h，
所述初次干燥的温度为0℃、时间为18h，
所述解析干燥的温度为30℃，时间为12h。
出箱后高温处理，即50℃下通风干燥2小时。
包装密封并辐照灭菌，即可得到促进慢性伤口愈合的天然碱性多糖功能复合体。
实施例2
实施例2提供了一种促进慢性伤口愈合的天然碱性多糖功能复合体，其通过下述方法制备获得：
1.有载有生长因子的壳聚糖长链分子制备：取血管内皮生长因子(VEGF)分散在PB缓冲液(pH7.2)中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，将羧基活化之后，马上加入壳聚糖，反应8h之后使用冰乙醚析出沉淀，冷冻干燥，所述冷冻干燥依次包括预冻温度下处理、初次干燥处理以及解析干燥处理：
所述预冻温度为-50℃、时间为5h，
所述初次干燥的温度为0℃、时间为16h，
所述解析干燥的温度为25℃，时间为20h。
冷冻干燥后即得到载有生长因子的壳聚糖长链分子。
2.将所制备的载有生长因子的壳聚糖溶解于0.2(w/v)％的乙酸溶液中，在磁力搅拌器下搅拌1.5h。将明胶置于去离子水中并40℃高温促溶，而后加入到壳聚糖溶液中，形成壳聚糖明胶混合溶液。将戊二醛和京尼平交联剂混合液(混合比例1：1，v/v)溶解于去离子水中并50℃高温促溶。
3.在冰浴条件下，应用磁力搅拌器持续搅拌，将交联剂混合液逐滴加入到壳聚糖和明胶的混合液中，并持续搅拌1h，形成功能性溶液。在功能性溶液中，使壳聚糖的终浓度分别为2％(w/v)，明胶的终浓度为0.6％(w/v)，交联剂混合液终浓度为0.1％(w/v)。将功能性溶液缓慢倒入7cm×10cm×2cm长方体模具中，置于40℃恒温箱一段时间后冷冻干燥，冷冻干燥依次包括预冻温度下处理、初次干燥处理以及解析干燥处理：
所述预冻温度为-35℃、时间为5h，
所述初次干燥的温度为0℃、时间为18h，
所述解析干燥的温度为30℃，时间为12h。
出箱后高温处理，即50℃下通风干燥2小时。
包装密封并辐照灭菌，即可得到促进慢性伤口愈合的天然碱性多糖功能复合体。
对比例1
对比例1提供了不含生长因子的天然碱性多糖复合体，其通过下述方法制备获得：
1.将壳聚糖溶解于0.2(w/v)％的乙酸溶液中，在磁力搅拌器下搅拌1.5h。将明胶置于去离子水中并40℃高温促溶，而后加入到壳聚糖溶液中，形成壳聚糖明胶混合溶液。将戊二醛和京尼平交联剂混合液(混合比例1：1，v/v)溶解于去离子水中并50℃高温促溶。
2.在冰浴条件下，应用磁力搅拌器持续搅拌，将交联剂混合液逐滴加入到壳聚糖和明胶的混合液中，并持续搅拌1h，形成功能性溶液。在功能性溶液中，使壳聚糖的终浓度分别为2％(w/v)，明胶的终浓度为0.6％(w/v)，交联剂混合液终浓度为0.1％(w/v)。将功能性溶液缓慢倒入7cm×10cm×2cm长方体模具中，置于40℃恒温箱一段时间后冷冻干燥，冷冻干燥依次包括预冻温度下处理、初次干燥处理以及解析干燥处理：
所述预冻温度为-40℃、时间为5h，
所述初次干燥的温度为0℃、时间为18h，
所述解析干燥的温度为30℃，时间为12h。
出箱后高温处理，即50℃下通风干燥2小时。
包装密封并辐照灭菌，即可得到不含生长因子的天然碱性多糖复合体。
对比例2
对比例2提供了一种促进慢性伤口愈合的天然碱性多糖功能复合体，其通过下述方法制备获得：
1.有载有生长因子的壳聚糖长链分子制备：取血管内皮生长因子(VEGF)分散在PB(pH7.2)中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，将羧基活化之后，马上加入壳聚糖，反应8h之后使用冰乙醚析出沉淀，冷冻干燥，所述冷冻干燥依次包括预冻温度下处理、初次干燥处理以及解析干燥处理：
所述预冻温度为-50℃、时间为5h，
所述初次干燥的温度为0℃、时间为16h，
所述解析干燥的温度为25℃，时间为20h。
冷冻干燥后即得到载有生长因子的壳聚糖长链分子。
2.将所制备的载有生长因子的壳聚糖溶解于0.2(w/v)％的乙酸溶液中，在磁力搅拌器下搅拌1.5h。将明胶置于去离子水中并40℃高温促溶，而后加入到壳聚糖溶液中，形成壳聚糖明胶混合溶液。将戊二醛和京尼平交联剂混合液(混合比例1：1，v/v)溶解于去离子水中并50℃高温促溶。
3.在冰浴条件下，应用磁力搅拌器持续搅拌，将交联剂混合液逐滴加入到壳聚糖和明胶的混合液中，并持续搅拌1h，形成功能性溶液。在功能性溶液中，使壳聚糖的终浓度分别为2％(w/v)，明胶的终浓度为0.6％(w/v)，交联剂混合液终浓度为0.1％(w/v)。将功能性溶液缓慢倒入7cm×10cm×2cm长方体模具中，置于40℃恒温箱一段时间后冷冻干燥，冷冻干燥依次包括预冻温度下处理、初次干燥处理以及解析干燥处理：
所述预冻温度为-15℃、时间为5h，
所述初次干燥的温度为0℃、时间为18h，
所述解析干燥的温度为30℃，时间为12h。
出箱后高温处理，即50℃下通风干燥2小时。
包装密封并辐照灭菌，即可得到促进慢性伤口愈合的天然碱性多糖功能复合体。
试验例1外观
以实施例1和对比例2为例，取实施例1和对比例2所制备的促进慢性伤口愈合的天然碱性多糖功能复合体进行外观观察，其外观如图1-A所示。实施例1制备的天然碱性多糖功能复合体的表面颜色均匀、细腻，手感柔软。对比例2制备的复合体外宽颜色不均匀，且质感粗糙，不柔软，如图1-B所示。
试验例2物理表征
取实施例2所制备的促进慢性伤口愈合的天然碱性多糖功能复合体进行孔径大小检测，经过扫描电子显微镜观察，如图3和图4所示(图3和图4为不同放大倍数下的扫描电子显微镜图)，可见海绵为多孔结构，孔径约30～100μm，孔径大小及分布均匀，孔径误差≤70μm。
试验例3孔隙率测定
取实施例1，实施例2，对比例1，对比例2，所制备的促进慢性伤口愈合的天然碱性多糖功能复合体进行孔隙率测定，方法为：将一定质量的样品置于体积为V1的乙醇中，脱泡，样品和乙醇的总体积记为V2，则(V2－V1)为样品的绝对密实体积；将含乙醇的样品取出，记所剩乙醇体积为V3，则样品中所含乙醇的体积(V1－V3)为样品孔隙所占的体积。因此，样品的总体积(表观体积)V＝(V2－V1)+(V1－V3)＝V2－V3。
孔隙率可表示为：P＝(V1－V3)/(V2－V3)。测试结果见表1。
表1样品孔隙率
| 名称 | 孔隙率 |
| 实施例1样品 | 82％ |
| 实施例2样品 | 70％ |
| 对比例1样品 | 81％ |
| 对比例2样品 | 59％ |
试验例4吸液倍数测定
取实施例1，实施例2，对比例1，对比例2所制备的样品，进行吸液倍数测定，方法为：在容量瓶中用去离子水溶解8.298g氯化钠和0.368g二水氯化钙并稀释至1L；将已知质量的5cm×5cm大小的样品置于培养皿内，加入预热至37℃的试验液，其质量为样品的80倍±0.5g；移入干燥箱内，在37±1℃下保持30min；用镊子夹持样品一角，悬垂30s，称量。以每100cm2(对于贴于创面上的敷料)每克样品(对于腔洞敷料)吸收溶液的平均质量表示吸收量，平行试验3次。测试结果见表2。
表2样品吸液倍数
| 名称 | 吸液倍数 |
| 实施例1样品 | 75 |
| 实施例2样品 | 58 |
| 对比例1样品 | 71 |
| 对比例2样品 | 11 |
试验例5吸液后状态测试
取实施例1，实施例2，对比例1，对比例2，进行吸液后状态测试，方法为：在容量瓶中用去离子水溶解8.298g氯化钠和0.368g二水氯化钙并稀释至1L；将已知质量的5cm×5cm大小的样品置于培养皿内，加入预热至37℃的试验液，其质量为样品的80倍±0.5g；移入干燥箱内，在37±1℃下保持24h；用镊子夹持样品一角，悬垂30s，观察是否可用镊子夹起，凝胶状态。
结果发现，实施例1样品、实施例2样品、对比例1样品容易被镊子夹起，对比例2样品不容易被镊子夹起。以实施例1样品为例，如图5所示。
对比实施例1和对比例2发现，实施例1设置预冻温度更低，样品在更低温度下快速结晶，形成形貌更细腻，吸液倍数、孔隙率更高，吸液24小时之后形成的凝胶机械强度高，容易被镊子夹起去除。
在制备时，热处理和冷冻干燥的温度和时间需根据制备条件的不同进行调整，最终取得最佳处理工艺，提高复合体孔隙率，形成适宜的孔径大小，孔径均匀，持续释放生长因子，加快伤口上皮化过程，缩短伤口愈合周期，促进组织再生，并增加对渗出液的吸收能力，并增加复合体柔软度便于腔道填塞，并最终形成成型良好的凝胶，具备较高的机械性能，便于去除防止粘连。经过上述冷冻干燥处理，所获得的天然碱性多糖功能复合体的各方面性能俱佳。
试验6促愈合动物实验
取SD大鼠(雌性健康，体重300g±30g)6只，并标记为1～6号；备皮；3％戊巴比妥钠(1mL/100g)静脉腹腔麻醉；消毒、铺单；无菌条件下分别于SD大鼠脊柱两侧上下各1.0m直径的背部皮肤用活检打孔器全层环形切除，形成直径1.0cm的圆形皮肤缺损创面4个，伤至筋膜层，如图6所示，标记分为实施例1组，对比例1组，空白对照组，对照组。
取各组纱布。采用实施例1所制备的产品外敷并压迫1min，然后采用二级透明薄膜敷料固定；采用对比例1所制备的产品外敷并压迫1min，然后采用二级透明薄膜敷料固定；对照组用生理盐水湿纱布轻压1min，然后采用二级透明薄膜敷料固定；空白对照不做处理，独笼饲养。中途不作任何创面消毒及换药。
术后每天用透明膜描记创面大小，测定创面残余面积，记录实验组、对照组、空白组创面残余面积，绘制制创面愈合率与时间变化的函数关系图。
计算公式为：愈合率(％)＝[(A0-At)/A0]×100％
其中，A0：原始创面面积；At：未愈合创面面积。
观察各组创面有无红、肿、热等局部炎性体征，观察并对比实验组、对照组、空白组创面组织渗出血情况，深层肉芽组织增生及细胞浸润情况，胶原组织增生、创面皱缩及上皮化情况，并记录。
实验结果：
从图7(图7中纵坐标为愈合率，横坐标为时间(小时))中可以看出，实施例1的产品和和对比例1的产品的促愈合效果，优于对照组及空白对照组，证明了该制备工艺条件下的制备的复合体敷料，具有促进伤口愈合的功效。对比实施例1和对比例1结果可知，载有生长因子的复合体敷料，其促愈合效率优于未添加生长因子的复合体。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体实施方式”、或“一些实施方式”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (10)
1.一种促进慢性伤口愈合的天然碱性多糖功能复合体的制备方法，其特征在于，包括：
(1)通过血管内皮生长因子(VEGF)与壳聚糖偶联形成载有生长因子的壳聚糖长链分子；
(2)将所述载有生长因子的壳聚糖长链分子溶解于盐酸溶液中，得到壳聚糖溶液，然后和明胶混合形成壳聚糖明胶混合溶液；
(3)将交联剂和壳聚糖明胶混合溶液进行交联，冷冻干燥，经高温处理后灭菌，形成所述促进慢性伤口愈合的天然碱性多糖功能复合体。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述壳聚糖为药用级，所述壳聚糖的脱乙酰度为50％～98％。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述盐酸溶液的质量浓度范围为0.1～1(w/v)％。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述交联剂选自醛类化合物、聚环氧化合物、生物交联剂中的至少一种。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述交联剂通过戊二醛和京尼平混合溶解于去离子水中，并进行高温促溶得到，所述高温促溶的温度为30～100℃，所述高温促溶的时间为1～10h。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)进一步包括：
(1-1)将血管内皮生长因子(VEGF)分散在PB缓冲液中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化；
(1-2)加入壳聚糖偶联反应，然后析出沉淀，冷冻干燥即得到所述载有生长因子的壳聚糖长链分子；
所述冷冻干燥依次包括预冻温度下处理、初次干燥处理以及解析干燥处理：
所述预冻温度为-50℃、时间为5h，
所述初次干燥的温度为0℃、时间为16h，
所述解析干燥的温度为25℃，时间为20h。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述冷冻干燥依次包括预冻温度下处理、初次干燥处理以及解析干燥处理：
所述预冻温度为-50～-30℃、时间为5～15h，
所述初次干燥的温度为0～10℃、时间为4～18h，
所述解析干燥的温度为20～30℃，时间为4～12h。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述高温处理为在40～60℃下通风干燥2～3小时；所述灭菌为γ射线辐照灭菌，辐照剂量为15～35KGy。
9.一种促进慢性伤口愈合的天然碱性多糖功能复合体，其特征在于，根据权利要求1～8中任一项所述的制备方法获得。
10.权利要求9所述的促进慢性伤口愈合的天然碱性多糖功能复合体在医用敷料领域中的用途。
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|---|---|---|---|
| CN202410039324.XA CN117860947A (zh) | 2024-01-11 | 2024-01-11 | 一种促进慢性伤口愈合的天然碱性多糖功能复合体的制备方法及其应用 |
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Publications (1)
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| CN117860947A true CN117860947A (zh) | 2024-04-12 |
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Family Applications (1)
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- 2024-01-11 CN CN202410039324.XA patent/CN117860947A/zh active Pending
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