CN117849322A - 一种基于纳米孔的尿样中乙酰金刚烷胺的定量检测方法 - Google Patents
一种基于纳米孔的尿样中乙酰金刚烷胺的定量检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种基于纳米孔的尿样中乙酰金刚烷胺的定量检测方法，包括以下步骤：(1)配制磷脂溶液将其均匀涂覆于检测池小孔处并晾干；(2)制备磷脂双分子层膜；(3)在磷脂双分子层膜形成一个纳米孔插孔；(4)在Trans端加入γ环糊精溶液，在Cis端加入不同浓度的乙酰金刚烷胺溶液，并检测统计，建立乙酰金刚烷胺浓度标准曲线和标准曲线方程；(5)将乙酰金刚烷胺溶液替换成尿样检测，并与标准曲线对比。本发明采用γ环糊精作为适配体，可完全排除金刚烷胺对乙酰金刚烷胺的干扰。本发明采用纳米孔技术对尿样中乙酰金刚烷胺进行定量检测，具有方法简单，操作便捷，成本低廉的特点，可用来对患者进行癌症的筛选，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于纳米孔检测领域技术领域，具体涉及一种基于纳米孔的尿样中乙酰金刚烷胺的定量检测方法。
背景技术
世界上六分之一的死亡是由癌症导致的，癌症已成为继心血管疾病之后第二大致死疾病。目前公认的癌症防治策略是早期发现、早期诊断和早期治疗。世界卫生组织指出，癌症的早期发现是提高癌症治疗率的关键。亚精胺/精胺N1-乙酰转移酶(SSAT-1)是哺乳动物细胞中的限速酶，对精胺、亚精胺的代谢起到催化作用。SSAT-1在正常细胞中含量并不高，而在癌细胞中会过量表达，因此可以作为一种癌症检测指标。研究表明，抗病毒药物金刚烷胺是SSAT-1的特异性底物，SSAT-1可以将金刚烷胺乙酰化为乙酰金刚烷胺，并通过尿液排出体外，因此可以通过检测尿液中乙酰金刚烷胺的含量作为癌症早期发现和诊断的指标。2004年Sitar等人提出利用液相色谱—质谱联用的方法检测受试人群尿液中的乙酰金刚烷胺的含量，这一方法需要复杂的样品前处理，检测成本高，检测时间长。专利201480027413.7在此基础上使用拉曼光谱定量检测从尿样中固相萃取的乙酰金刚烷胺，但仍然存在处理步骤复杂，仪器要求高，检测成本高的问题。因此，发展一种方便、快捷、低成本的癌症筛查方法极为重要。
纳米孔技术是一项高通量孔传感分析技术，具有操作简单、方便快捷、成本低廉的优点，在蛋白质分析、DNA测序以及生物标记物的检测等方面具有广阔的应用前景。纳米孔检测技术基于脉冲阻塞传感原理，简单来说，离子流通过纳米孔产生稳定的基线电流，在分析物穿过纳米孔的过程中会对离子流产生阻塞，从而导致电流减小的信号产生。根据电流信号的变化幅值和持续时间可以实现对不同分析物的区分。研究表明，环糊精与金刚烷衍生物有良好的相互作用，疏水的金刚烷部分可以进入环糊精空腔形成主客体复合物。纳米孔技术已经被证明可以在β环糊精存在的条件下检测到金刚烷衍生物。然而，β环糊精较小的空腔不能区分金刚烷胺和乙酰金刚烷胺，因此未完全转化的金刚烷胺会对乙酰金刚烷胺的测定产生干扰。如何利用纳米孔技术对金刚烷胺存在时的乙酰金刚烷胺进行定量检测目前尚无报道。
发明内容
发明目的：为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种基于纳米孔的尿样中乙酰金刚烷胺的定量检测方法，在大量尿液主要成分存在的情况下，实现乙酰金刚烷胺的定量检测
技术方案：本发明所述的一种基于纳米孔的尿样中乙酰金刚烷胺的定量检测方法，包括以下步骤：
(1)配制磷脂溶液，将其均匀涂覆于纳米孔检测平台的检测池小孔处并晾干，使磷脂分子均匀贴附在小孔周围，用于后续在此处形成磷脂双分子层膜；
(2)将KCl溶液添加到检测池两侧，并插入电极，通过电信号采集仪器实时监测电流，在Cis端加入1μL磷脂溶液，提拉溶液界面直到电流数值变为0，使磷脂双分子层膜在检测池小孔上形成；
(3)在Cis端加入极少量溶血素蛋白，并施加高电压促进蛋白形成一个纳米孔插孔；
(4)在Trans端加入γ环糊精溶液，在Cis端加入不同浓度的乙酰金刚烷胺溶液，在测试电压下对乙酰金刚烷胺进行检测；
(5)对不同浓度乙酰金刚烷胺信号进行统计，建立乙酰金刚烷胺浓度标准曲线和标准曲线方程；
(6)将步骤(4)中的不同浓度的乙酰金刚烷胺溶液替换成尿样，对乙酰金刚烷胺进行检测，并将检测数据与步骤(5)中的标准曲线对比。
所述纳米孔检测平台包括检测池、电极和膜片钳放大器，所述检测池为脂双层记录杯(perfusion bilayers cup)，购于Warner Instruments公司，型号为BCH-P。
进一步的，步骤(1)中所述磷脂为二植酰磷脂酰胆碱(DPhPC)，购于Avanti PolarLipids公司。
进一步的，步骤(1)中所述磷脂溶液是将磷脂溶于正癸烷溶液配制而成，浓度为10mg/mL。
进一步的，步骤(2)中所述KCl溶液浓度为1M，pH为7.3。
进一步的，步骤(2)中所述电极为Ag/AgCl电极，电信号采集仪器为膜片钳放大器(Axon 200B)
进一步的，步骤(3)中所述高电压为+150mV。
进一步的，步骤(4)中所述γ环糊精溶液浓度为40μM，测试电压为+80mV。
进一步的，步骤(4)中所述乙酰金刚烷胺浓度分别为1μM,5μM,10μM和15μM。
有益效果：与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下显著优点：本发明采用γ环糊精作为适配体，可以十分明显的区分金刚烷胺和乙酰金刚烷胺，并能完全排除金刚烷胺对乙酰金刚烷胺的干扰。本发明采用纳米孔技术对尿样中乙酰金刚烷胺进行检测和定量，具有方法简单，操作便捷，成本低廉的特点。可用来对患者进行病理状态监测和癌症的筛选，具有良好的应用前景。
附图说明
图1是本发明实施例1中纳米孔测试平台搭建示意图，其中图1a是小孔处涂覆磷脂溶液的检测池中的圆柱池，图1b是Trans侧凹槽内装入圆柱池的检测池，图1c是纳米孔测试平台示意图，图1d是纳米孔测试平台中单个纳米孔通道示意图；
图2是本发明实施例2中在Trans端加入40μMγ环糊精出现的电信号图，其中图2a是加入γ环糊精出现的电流轨迹图，图2b是加入γ环糊精出现的阻塞幅值分布图；
图3是本发明实施例2中在Cis端加入40μM乙酰金刚烷胺所致电信号图，其中图3a是其信号电流轨迹，图3b是其阻塞幅值分布图；
图4是本发明实施例2中在Cis端加入40μM金刚烷胺所致电信号图，其中图4a是其信号电流轨迹，图4b是其阻塞幅值分布图；
图5是本发明乙酰金刚烷胺浓度标准曲线图。
具体实施方式
为了使本领域技术人员更好地理解本发明方案，下面结合附图和实施方式对本发明作进一步的详细说明。此外，对本领域的研究人员来说熟知的公知结构及其说明进行了部分省略。
实施例1
纳米孔测试平台的搭建，包括以下步骤：
(1)磷脂溶液配制：取1mg二植酰磷脂酰胆碱，将其溶于100μL正癸烷溶液，制备10mg/mL的磷脂溶液。
(2)制备磷脂双分子层膜：取1μL步骤(1)制备的磷脂溶液，将其均匀涂覆于图1a所示检测池的圆柱池小孔处，静置15min，使正癸烷溶液自然挥发晾干，磷脂分子均匀贴附在小孔周围。将圆柱池放入图1b所示方形池Trans侧凹槽内组装成完整检测池，在Trans和Cis端分别加入1M KCl溶液并插入Ag/AgCl电极，通过膜片钳放大器实时监测电流。取1μL磷脂溶液加入Cis端，并用吸管不断提拉溶液界面直到电流变为0，这标志着磷脂双分子层膜在小孔上成功形成。
(3)在磷脂膜上插入溶血素纳米孔：取极少量的溶血素蛋白加入检测池Cis端，并施加+150mV电压促进蛋白插孔。当电流从0变为150pA时即证明一个纳米孔插孔成功。若电流成倍增大，则证明有多个纳米孔插入磷脂。此时需施加+300mV电压打破磷脂膜并重复步骤(2)和步骤(3)，直至只有一个纳米孔稳定存在于磷脂膜上即可完成纳米孔测试平台的搭建。图1c是纳米孔测试平台示意图，图1d是纳米孔测试平台中单个纳米孔通道示意图。
实施例2
纳米孔测试平台定量检测乙酰金刚烷胺，包括以下步骤：
(1)使用实施例1搭建的纳米孔测试平台，将电压调至0mV，通过调整膜片钳放大器上的offset旋钮将电流调至0pA校准仪器，然后将电压调至+80mV开始测试，此时电流为80pA左右。
(2)在检测池Trans端加入40μMγ环糊精并搅拌均匀，一段时间后开始出现γ环糊精的信号。如图2a所示，γ环糊精导致的信号阻塞幅值约为67％，如图2b所示，阻塞信号平稳且均一。
(3)在检测池Cis端加入不同浓度的乙酰金刚烷胺，一段时间后，在γ环糊精信号的基础上开始出现二级信号，这是乙酰金刚烷胺进入γ环糊精空腔所致。图3a为加入40μM乙酰金刚烷胺所致信号电流轨迹图，图3b为加入40μM乙酰金刚烷胺所致阻塞幅值分布图，在γ环糊精信号的基础上出现了二级信号，证明在γ环糊精存在的条件下，可以对乙酰金刚烷胺进行检测。
(4)统计四组不同浓度(1μM,5μM,10μM,15μM)的乙酰金刚烷胺信号产生频率，建立乙酰金刚烷胺浓度标准曲线图。图5乙酰金刚烷胺浓度标准曲线图中●代表本实施例中得到的数据。
实施例3
纳米孔测试平台在过量金刚烷胺存在下定量检测乙酰金刚烷胺，包括以下步骤：
(1)使用实施例1搭建的纳米孔测试平台，将电压调至0mV，通过调整膜片钳放大器上的offset旋钮将电流调至0pA校准仪器，然后将电压调至+80mV开始测试，此时电流为80pA左右。
(2)在检测池Trans端加入40μMγ环糊精并搅拌均匀，一段时间后开始出现γ环糊精的信号。
(3)在检测池Cis端加入8μM乙酰金刚烷胺和400μM金刚烷胺进行测试。
(4)图5乙酰金刚烷胺浓度标准曲线图中▲代表本实施例中得到的数据，很好地符合标准曲线，证明金刚烷胺对乙酰金刚烷胺的定量没有干扰。
实施例4
纳米孔测试平台定量检测尿样中的乙酰金刚烷胺，包括以下步骤：
(1)获取尿样：包括以下尿液成分166mM尿素、300μM尿酸、5.2mM肌酐酸和1M KCl的人工尿液被用于制备具有金刚烷胺400μM和乙酰金刚烷胺分别为5μM、10μM的两组尿样。
(2)使用实施例1搭建的纳米孔测试平台，将Trans池中的KCl溶液换为模拟尿液，将电压调至0mV，通过调整膜片钳放大器上的offset旋钮将电流调至0pA校准仪器，然后将电压调至+80mV开始测试，此时电流为80pA左右。
(3)在检测池Trans端加入40μMγ环糊精并搅拌均匀，一段时间后开始出现γ环糊精的信号。
(4)在检测池Cis端加入步骤(1)中的两组尿样进行测试。
(5)图5乙酰金刚烷胺浓度标准曲线图中■代表本实施例中得到的数据，很好地符合标准曲线，证明纳米孔测试平台可有效检测和定量尿液中的乙酰金刚烷胺。
综上所述，本发明提供了一种基于纳米孔的尿样中乙酰金刚烷胺的定量检测方法，通过纳米孔传感方法实现了对乙酰金刚烷胺的定量，并证明过量的金刚烷胺和尿液主要成分均对定量没有影响，该方法有望通过实际尿液样品对癌症进行初步诊断，在对患者进行病例状态监测和癌症筛查领域有很好的推广前景。
Claims (10)
1.一种基于纳米孔的尿样中乙酰金刚烷胺的定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)配制磷脂溶液，将其均匀涂覆于纳米孔检测平台的检测池小孔处并晾干，使磷脂分子均匀贴附在小孔周围，用于后续在此处形成磷脂双分子层膜；
(2)将KCl溶液添加到检测池两侧，并插入电极，通过电信号采集仪器实时监测电流，在Cis端加入1μL磷脂溶液，提拉溶液界面直到电流数值变为0，使磷脂双分子层膜在检测池小孔上形成；
(3)在Cis端加入极少量溶血素蛋白，并施加高电压促进蛋白形成一个纳米孔插孔；
(4)在Trans端加入γ环糊精溶液，在Cis端加入不同浓度的乙酰金刚烷胺溶液，在测试电压下对乙酰金刚烷胺进行检测；
(5)对不同浓度乙酰金刚烷胺信号进行统计，建立乙酰金刚烷胺浓度标准曲线和标准曲线方程；
(6)将步骤(4)中的不同浓度的乙酰金刚烷胺溶液替换成尿样，对乙酰金刚烷胺进行检测，并将检测数据与步骤(5)中的标准曲线对比。
2.根据权利要求1所述的基于纳米孔的尿样中乙酰金刚烷胺的定量检测方法，其特征在于，步骤(1)中所述磷脂为二植酰磷脂酰胆碱。
3.根据权利要求1所述的基于纳米孔的尿样中乙酰金刚烷胺的定量检测方法，其特征在于，步骤(1)中所述磷脂溶液是将磷脂溶于正癸烷溶液配制而成，浓度为10mg/mL。
4.根据权利要求1所述的基于纳米孔的尿样中乙酰金刚烷胺的定量检测方法，其特征在于，步骤(2)中所述KCl溶液浓度为1M，pH为7.3。
5.根据权利要求1所述的基于纳米孔的尿样中乙酰金刚烷胺的定量检测方法，其特征在于，步骤(2)中所述电极为Ag/AgCl电极。
6.根据权利要求1所述的基于纳米孔的尿样中乙酰金刚烷胺的定量检测方法，其特征在于，步骤(2)中所述电信号采集仪器为膜片钳放大器。
7.根据权利要求1所述的基于纳米孔的尿样中乙酰金刚烷胺的定量检测方法，其特征在于，步骤(3)中所述高电压为+150mV。
8.根据权利要求1所述的基于纳米孔的尿样中乙酰金刚烷胺的定量检测方法，其特征在于，步骤(4)中所述γ环糊精溶液浓度为40μM。
9.根据权利要求1所述的基于纳米孔的尿样中乙酰金刚烷胺的定量检测方法，其特征在于，步骤(4)中所述乙酰金刚烷胺浓度分别为1μM,5μM,10μM和15μM。
10.根据权利要求1所述的基于纳米孔的尿样中乙酰金刚烷胺的定量检测方法，其特征在于，步骤(4)中所述测试电压为+80mV。
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