CN117838868A - miR-103-3p在ADSCs移植中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及miR‑103‑3p在ADSCs移植中的应用。本发明充分证明了miR‑103‑3p/FGF2功能轴通过增强HIF‑1α的活性促进血管内皮细胞迁移和血管形成。并深入探究了其作用机制，低氧诱导ADSCs旁分泌FGF2增加，FGF2通过增强HIF‑1α的活性，改善共培养血管内皮细胞血管生成，miR‑103‑3p通过靶向抑制FGF2表达，降低HIF‑1α活性，介导共培养血管内皮细胞迁移和血管生成功能受损；且抑制miR‑103‑3p后能够显著增加FGF2表达，增强HIF‑1α活性，改善缺血低氧皮瓣的修复。本发明在目前ADSCs移植尚未取得突破性进展的客观环境下，有望为临床高ADSCs移植的可行性及临床应用提供理论基础，且通过miRNA作为干预新生血管形成的手段是一种快捷有效、安全实用的方法，具有显著的临床应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物医药和分子生物学技术领域，具体涉及miR-103-3p在ADSCs移植中的应用。
背景技术
脂肪来源的干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）是一种从脂肪组织中分离得到的具有多向分化潜能的多能干细胞，属于间充质干细胞（MSCs）的一种。ADSCs不仅能够分化为脂肪细胞，还能够分化为骨、软骨、神经、心肌、血管内皮等多种类型的细胞，在组织再生和器官修复方面具有广泛的应用前景。
间充质干细胞具有独特的自我更新和多向分化潜能是再生医学中细胞治疗最有吸引力的细胞来源。MSCs的多种来源包括胎盘、脐带血、外周血、骨骼肌、成人骨髓、肺、羊水和脂肪组织。在这些来源中，脂肪组织来源的间充质干细胞因其丰度和可及性优势常用于细胞治疗。ADSCs疗法的出现为组织再生提供了新的手段。大量临床和临床前研究表明ADSCs在骨、软骨、心肌、肝脏、神经系统和皮肤等靶器官的重建和修复中发挥着重要作用。目前最是最重要的修复这些组织缺损的方法就是皮瓣移植。
皮瓣移植是临床上修复创伤、重建功能、恢复外观的常用治疗方法。皮瓣移植在整形外科中广泛用于修复皮肤缺损。尽管皮瓣移植技术已取得长足进步，但许多因素限制了皮瓣的成活率。血运障碍是最常见的术后并发症之一，临床上一些危险因素，包括缺血、再灌注损伤和重建手术后的细胞凋亡，会引起皮瓣远端部分坏死，造成美观差和重建失败等后果，严重者可导致大块皮肤组织坏死，常发生在远端，特别是当皮瓣设计不合理、长宽比设计过大时。
皮瓣部分坏死的病理生理机制包括白细胞阻塞静脉微血管产生的短暂低氧、静脉停滞引发的持续低氧以及远端灌注不良引起的部分缺血。缺血组织提供了不利的微环境，具有较高的氧化应激和较低的氧浓度，导致移植细胞损伤和死亡以及其血管生成能力下降。因此，皮瓣移植如何提高存活率，仍是一个迫切需要解决的问题。需要进一步的研究来评估相关机制并开发更好的治疗方法。尽管ADSC移植目前面临挑战，但该领域的显著进展表明基于ADSC的方法将在再生医学中发挥越来越重要的作用。
由于皮瓣缺血往往伴随着低氧的不利环境，但临床研究发现低氧条件下的ADSCs通过旁分泌释放更多的生长因子和抗凋亡因子等，抑制血管内皮细胞凋亡并增强血管生成。因此，在低氧皮瓣组织中寻找介导ADSCs促内皮细胞血管生成的因素可有助于提高基于ADSCs的皮肤或软组织重建的治疗效率。低氧可诱导ADSCs旁分泌的生长因子主要包括VEGF和FGF2，一般认为ADSCs旁分泌的VEGF是促进血管内皮细胞血管生成的重要原因。尽管目前对于ADSCs旁分泌FGF2能促进新血管生成、加快创面修复已有相关报道，且miRNA在ADSCs移植中的调控作用和潜力引人注目，而介导ADSCs旁分泌FGF2的上下游调控机制、miRNA是否能调控ADSCs旁分泌FGF2从而影响新血管生成仍需进一步深入探究。
发明内容
针对现有技术中的不足，本发明的主要目的在于研究低氧诱导ADSCs miR-103-3p/FGF2功能轴激活在促进内皮细胞血管生成的作用及其机制，为进一步探究miR-103-3p/FGF2在ADSCs中的作用机制、以及如何利用miR-103-3p调控来开发新的治疗方法和药物奠定基础。
为了解决上述技术问题，本发明是通过如下技术方案得以实现的。
本发明第一方面提供了miR-103-3p抑制剂在制备提高脂肪来源干细胞移植活性的药物的应用。
作为优选地，所述miR-103-3p抑制剂选自基于miR-103-3p基因设计的siRNA、shRNA、sgRNA中的一种或多种。
作为优选地，所述提高脂肪来源干细胞移植活性具体为提高低氧条件下脂肪来源干细胞移植活性。
作为优选地，所述低氧条件的氧浓度为1-5%。
本发明第二方面提供了miR-103-3p抑制剂在制备治疗与慢性难愈性创伤有关的疾病和/或改善与慢性难愈性有关的疾病症状的药物中的应用。
作为优选地，所述miR-103-3p抑制剂选自基于miR-103-3p基因设计的siRNA、shRNA、sgRNA中的一种或多种。
作为优选地，所述与慢性难愈性创伤有关的疾病选自机械外伤、组织溃疡、褥疮中的一种或多种。
作为优选地，所述与慢性难愈性创伤有关的疾病症状选自新生血管生成速度、内皮细胞成管数量、创面愈合速度、皮瓣存活面积中的一种或多种。
作为优选地，所述与慢性难愈性创伤有关的疾病具体为经脂肪来源干细胞移植治疗的与慢性难愈性创伤有关的疾病；所述与慢性难愈性有关的疾病症状具体为经脂肪来源干细胞移植治疗的与慢性难愈性创伤有关的疾病症状。
本发明第三方面提供了miR-103-3p抑制剂在制备促进脂肪来源干细胞促血管生成生长因子分泌的药物中的应用。
作为优选地，所述促血管生成生长因子选自VEGF、FGF中的一种或多种。
作为优选地，所述FGF选自FGF2。
作为优选地，所述miR-103-3p抑制剂选自基于miR-103-3p基因设计的siRNA、shRNA、sgRNA中的一种或多种。
本发明第四方面提供了一种提高脂肪来源干细胞移植活性的药物组合物，包括miR-103-3p抑制剂，以及药学上可接受的辅料。
作为优选地，所述miR-103-3p抑制剂选自基于miR-103-3p基因设计的siRNA、shRNA、sgRNA中的一种或多种。
作为优选地，所述提高脂肪来源干细胞移植活性具体为提高低氧条件下脂肪来源干细胞移植活性。
作为优选地，所述低氧条件的氧浓度为1-5%。
作为优选地，所述药学上可接受的辅料选自溶剂、增溶剂、润湿剂、抗氧剂、抑菌剂、螯合剂、表面活性剂中的一种或多种。
应理解的是，在无特别说明的情况下，本发明上下文中所列举的miR-103-3p等为本领域已知的microRNA类型，本领域技术人员有能力从常规的数据库中获取与miR-103-3p等相关的分子生物学信息，例如序列等，其中本发明所采用的miR-103-3p的GeneAccession为MIMAT0000101。所述miR-103-3p抑制剂是指能够特异性下调miR-103-3p表达水平和/或活性的物质，例如采用反义寡核苷酸、siRNA、shRNA、sgRNA、antagomiRs、miRNA海绵、miRNA Erasers、Target Masking和/或多靶点等方法以下调miR-103-3p表达水平和/活性，本领域技术人员有能力基于miR-103-3p的序列设计合成相应的抑制剂（例如siRNA等）或对相关活性成分进行筛选和验证，只要是能够实现miR-103-3p的水平和/或活性降低均可。同时，为了便于体内外实验的开展，本发明选择本领域常用的分子生物学工具miR-103-3p mimics来模拟生物体内源的miR-103-3p，以增强内源性miR-103-3p的功能。所述miR-103-3p mimic可根据实验需求自行通过市售途径购买，并按照产品说明书进行使用，也可以基于miR-103-3p的序列自行设计和合成。
虽然大多数细胞体外培养和扩增是在21％氧浓度下进行的，但在实际生理环境中许多组织的氧浓度要低于体外培养的环境。对于人类MSC分化而言，一些研究已经证实1.5％-3％低氧条件促进ADSCs分化。低氧已被证明可促进脂肪组织来源的干细胞增殖、维持它的多能性，促血管生成的潜能，并且1％氧浓度是ADSCs产生较好特性的最佳条件。
研究发现，ADSC移植到缺血模型中主要通过促血管生成和抗凋亡因子的旁分泌作用促进血管生成，而不是通过分化直接形成新血管。其治疗作用的机制是促进体内新血管的形成。在低氧条件下培养的ADSCs表现出了较强的分化能力。为了使ADSC更好地应用于患者，改善其血管生成至关重要。ADSCs产生许多血管生成和抗凋亡生长因子，并且它们在低氧时分泌显著增强。因此，在低氧皮瓣组织中寻找介导ADSC促进内皮细胞血管生成的因素可能有助于提高基于ADSC的皮肤或软组织重建的治疗效率。低氧是其中一种有前途的策略策略，可以使干细胞抵抗移植到受损组织后可能遇到的缺血环境。这种策略提高了移植细胞和宿主细胞在损伤部位的存活率。
微小RNA（microRNA，miRNA）是一类21-23核苷酸长度的非编码RNA分子，广泛存在于生物体内。它们的主要功能是通过靶向特定基因的mRNA，从而抑制或促进这些基因的翻译和降解，以调控蛋白质的表达水平。研究表明，miRNA也对脂肪代谢起着重要作用，例如miR-33家族（miR-33a和miR-33b）通过靶向脂质代谢关键因子ABCA1和ABCG1，抑制胆固醇和脂质的运出，促进胆固醇的堆积。与此相反，miR-122通过靶向肝脏中的抗氧化酶CAT-1，促进脂质氧化和热能生成。这些miRNA可以通过靶向信号通路上的关键因子，如PI3K、AKT、β-氨基丁酸激酶（GSK-3β）和Hedgehog信号通路成员来发挥调控作用。miRNA在干细胞的自我更新和多能性中也具有重要作用。例如miR-103-3p可调节骨髓增生异常综合征骨髓间充质干细胞的分化；可通过靶向MAP4调节成肌细胞的分化和自噬。在神经干细胞发面，miR-103-3p可靶向Ndel1调节神经干细胞增殖和分化。然而，miR-103-3p在ADSCs中的作用及具体机制尚未明确。
本发明为了明确miR-103-3p是否参与共培养血管内皮细胞生物学活性，通过将miR-103-3p mimics导入ADSCs细胞并与血管内皮细胞共培养，观察到共培养的血管皮细胞的在迁移和成管被抑制。进一步通过拮抗实验明确了增加FGF2表达，激活HIF-1α可以挽救miR-103-3p对血管内皮细胞迁移和血管形成的抑制作用。同时，本发明利用动物模型明确了ADSCs可以促进皮瓣的修复，且在对miR-103-3p表达进行抑制后能够更进一步促进皮瓣血管生成。
总的来说，本发明在体外和体内证明miR-103-3p/FGF2功能轴通过增强HIF-1α的活性促进血管内皮细胞迁移和血管形成，在目前ADSCs移植尚未取得突破性进展的客观环境下，有望为临床高ADSCs移植的可行性及临床应用提供理论基础，且通过miRNA作为干预新生血管形成的手段是一种快捷有效、安全实用的方法，具有显著的临床应用前景。
本发明相对于现有技术具有如下有益效果：
本发明在体外和体内证明miR-103-3p/FGF2功能轴通过增强HIF-1α的活性促进血管内皮细胞迁移和血管形成。并深入探究了其作用机制，低氧诱导ADSCs旁分泌FGF2增加，FGF2通过增强HIF-1α的活性，改善共培养血管内皮细胞血管生成，miR-103-3p通过靶向抑制FGF2表达，降低HIF-1α活性，介导共培养血管内皮细胞迁移和血管生成功能受损；而在利用miR-103-3p抑制剂对细胞内miR-103-3p的表达进行抑制后，则能够显著增加FGF2表达，增强HIF-1α活性，改善缺血低氧皮瓣的修复。本发明在目前ADSCs移植尚未取得突破性进展的客观环境下，有望为临床高ADSCs移植的可行性及临床应用提供理论基础，且通过miRNA作为干预新生血管形成的手段是一种快捷有效、安全实用的方法，具有显著的临床应用前景。
附图说明
图1为使用qRT-PCR检测ADSCs中VEGF、FGF2、PDGF和TGF-β1的mRNA表达水平结果示意图。
图2为使用Western Blotting检测ADSCs中VEGF，FGF2和HIF-1α的蛋白表达水平结果示意图。
图3为使用ELISA检测低氧条件下ADSCs细胞上清分泌VEGF、FGF2、PDGF和TGF-β1的水平结果示意图。
图4为1%和5% O2的低氧条件下不同时间点ADSCs细胞的增殖分析结果示意图。
图5为细胞划痕实验检测各组血管内皮细胞创面愈合力结果示意图。
图6为Transwell迁移实验测定各组细胞迁移的能力结果示意图。
图7为体外成管实验检测低氧条件下ADSCs对血管内皮细胞血管生成的影响结果示意图。
图8为miR-129-5p与FGF2的非翻译区结合位点以及双荧光素酶报告基因检测实验柱状统计图结果示意图。
图9为Western Blotting检测miR-103-3p靶向抑制ADSCs内源性FGF2蛋白表达结果示意图。
图10为ADSCs过表达miR-103-3p对共培养血管内皮细胞迁移的影响结果示意图。
图11为ADSCs过表达miR-103-3p对共培养血管内皮细胞迁移的影响结果示意图。
图12为体外成管实验检测ADSCs过表达miR-103-3p对共培养血管内皮细胞血管生成的影响结果示意图。
图13为Western Blotting检测ADSCs中FGF2蛋白表达结果示意图。
图14为ADSCs过表达FGF2逆转miR-103-3p对共培养血管内皮细胞划痕实验结果示意图。
图15为ADSCs过表达FGF2逆转miR-103-3p对共培养血管内皮细胞Transwell实验结果示意图。
图16为ADSCs过表达miR-103-3p和FGF2影响共培养的HUVEC成管实验结果示意图。
图17为缺血低氧皮瓣造模示意图。
图18为治疗后各组皮瓣存活面积结果示意图。
图19为Western Blot检测ADSCs中FGF2蛋白表达结果示意图。
图20为ADSCs和miR-103-3p inhibitor治疗后皮瓣组织病理学变化结果示意图。
图21为术后第14天具有代表性皮瓣的CD31和α-SMA免疫荧光成像结果示意图。
图22为α-SMA阳性血管数和CD31阳性血管数定量分析结果示意图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下参照实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
在无特别说明的情况下，本发明上下文中所列出的包括ADSCs等细胞来源于暨南大学附属第一医院，并与受试者签署知情同意书，ADSCs的分离及培养均根据本领域的常规方法进行。本发明所使用的试剂中，均通过市售获得。本发明所使用的实验方法，例如分子生物学实验、细胞生物学实验、动物实验、生物信息学分析等均为本领域的常规方法和技术。动物实验所使用的实验动物购于广东省实验动物中心，所有动物均于SPF环境按照本领域的常规方法和条件予以饲养，动物实验的所有程序均严格遵循暨南大学实验动物管理及使用委员会关于动物保护和使用的相关规范与准则。
生物学实验重复中选择具有代表性的结果呈现在上下文附图中，数据按照图示中规定的以mean±SD和mean±SEM展示。所有实验至少重复三次。数据采用GraphPad Prism8.0或SPSS 20.0软件进行分析。采用t检验、卡方检验、方差分析等常规医学统计学方法比较两组或两组以上的平均值差异。p＜0.05被认为是一个显著的差异。
实施例1
现有技术中已经明确了低氧诱导可上调多种生长因子的表达，对此，首先通过qRT-PCR检测检测了ADSCs细胞中几种常见生长因子的表达水平，结果如图1所示。结果显示，与常氧条件相比，低氧条件下ADSCs细胞VEGF和FGF2的mRNA表达水平显著升高（**p＜0.01，***p＜0.001），而且VEGF和FGF2 mRNA水平与氧浓度呈负相关。然而PDGF和TGF-β1的表达水平不受低氧应激的影响。
随后，通过Western Blotting检测了低氧条件下ADSCs细胞中FGF2的表达水平，与qRT-PCR结果一致，FGF2在低氧的ADSCs细胞呈低表达（**p＜0.01，***p＜0.001），且FGF2蛋白水平与氧浓度呈负相关（参见图2）。一般认为，FGF2可能通过激活HIF家族来增强ADSCs促血管生成的效果，因而进一步通过Western Blotting检测了低氧条件下ADSCs细胞HIF-1α的表达水平，发现在低氧诱导下ADSCs细胞HIF-1α表达显著上调，提示FGF2表达上调增加了HIF-1α活性（参见图2，*p＜0.05，###p＜0.001）。
为了明确低氧条件下所分泌的相关因子是否具有同样升高的趋势，通过ELISA实验检测低氧条件下ADSCs细胞培养上清中相关生长因子的表达水平，结果如图3所示。结果显示，低氧处理显著增加VEGF和FGF2的分泌（**p＜0.01，***p＜0.001），且这种增加与氧浓度呈负相关。同样地，低氧处理并没有显著增加PDGF和TGF-β1的分泌（p＞0.05），这提示低氧处理对内皮细胞生长的保护作用可能与VEGF和FGF2有关。
为了检测长时间的低氧环境对ADSCs可能的负面作用，通过建立1%和5%的低氧环境，分别于12h、24h和48h时利用CCK-8检测ADSCs细胞的增殖情况，结果如图4所述。结果显示，与常氧Control条件相比，1%和5% O2的低氧条件均表现出ADSCs细胞增殖水平的显著增高，且1% O2低氧环境下ADSCs的增殖能力更为优异。
由于低氧显着增加VEGF和FGF2的分泌，因此推测这些因素是低氧增强血管生成的原因。为了观察低氧和常氧对血管内皮细胞迁移的影响，通过制备血管内皮细胞创面模型，分别用5% O2和1% 02的低氧预处理细胞和常氧培养细胞与血管内皮细胞共培养进行实验，结果如图5-6所示。结果显示，与常氧条件相比，经5% O2和1% 02的低氧处理的ADSCs与血管内皮细胞共培养6h和12h后，血管内皮细胞的迁移能力显著增强，而1% 02低氧组显示出比5% O2低氧组更强的迁移能力（参见图5）。同时，在Transwell迁移实验中获得了相似的结果，即5% O2和1% 02的低氧预组显著促进血管内皮细胞的迁移，这种促进作用与02浓度呈负相关（参见图6）。因此，可以明确低氧条件下ADSCs分泌VEGF和FGF2增多可能在促进内皮细胞血管生成中发挥重要作用。
内皮细胞成管通常被认为是一种测量细胞在体外促进血管生成的能力的评价指标。为了明确低氧处理刺激ADSCs产生血管生长因子，检测低氧的条件培养基是否在体外促进HUVEC细胞血管样结构的形成，结果如图7所示。结果显示，Control组多形成为未封闭的多边形结构，5% O2和1% O2的低氧培养基处理组显示出更多的管样结构，且管样结构更加复杂。进一步统计结果显示，在成管数量和成管长度上，1% 02低氧组＞5% 02低氧组＞Control组（**p＜0.01，***p＜0.001），这说明ADSCs低氧处理可以显著促进HUVEC细胞成管，且成管的能力与氧气浓度呈负相关。
实施例2
前述结果中明确了ADSCs分泌的FGF2具有共培养促进内皮细胞增殖，迁移和血管生成的作用。接下来，通过miRNA目标预测数据库TargetScan（https：//www.targetscan.org/mamm_31/）和mirtarbase （https：//mirtarbase.cuhk.edu.cn/） 预测可能靶向FGF2的潜在miRNA。通过TargetScan数据库预测得到了29个潜在靶向FGF2的上游miRNA，mirtarbase数据库预测得到了91个潜在靶向FGF2的上游miRNA。二者共有的6个miRNA被认为较大概率与FGF2存在靶向关系。
一般认为miRNA与其靶基因存在负相关关系，因为低氧条件下FGF2表达是显著上调，那么低氧条件下潜在上游miRNA表达应该下调。因此，进行qRT-PCR实验寻找低氧（1% O2预处理）条件下上述6个miRNA中下调的miRNA。结果显示miR-103-3p在低氧条件下表达是下调的，所以初步认定miR-103-3p可能是FGF2的潜在上游靶点。
随后将miR-103-3p与WT-FGF2和Mut-FGF2共转染至239T细胞，48h后使用双荧光素酶报告基因测定系统测定荧光素酶报告基因活性。结果显示，miR-103-3p与WT-FGF2共转组荧光素酶表达显著降低，证实了miR-103-3p与FGF2存在靶向调控关系（参见图8）。而将miR-NC和miR-103-3p转染至ADSCs细胞利用Western Blotting验证发现，过表达miR-103-3p可显著下调FGF2的表达（参见图9，***p＜0.001），进一步在蛋白水平证实了ADSCs细胞中miR-103-3p与FGF2存在靶向关系。
在明确了miR-103-3p与ADSCs中FGF2表达的靶向抑制关系后，预计miR-103-3p可能通过靶向FGF2调控血管内皮细胞的生物学活性。为了明确ADSCs中miR-103-3p对血管内皮细胞迁移的影响，通过制备血管内皮细胞创面模型，分别用miR-NC和miR-103-3p转染的细胞与血管内皮细胞共培养48h，然后就行血管内皮细胞划痕实验，结果如图10所示。结果显示，与miR-NC组相比，miR-103-3p组血管内皮细胞迁移能力显著下降。同时，在Transwell迁移实验中获得了相似的结果，即过表达miR-103-3p组显著抑制血管内皮细胞的迁移（参见图11）。因此，可以明确ADSCs中miR-103-3p可能通过调控FGF2表达抑制血管内皮细胞的迁移。
随后，通过在ADSCs中过表达miR-103-3p以明确miR-103-3p对血管内皮细胞血管形成的影响。将Transwell上室过表达miR-103-3p的ADSCs细胞与下室的HUVEC共培养，然后进行进行HUVEC内皮细胞成管实验，检测ADSCs中过表达miR-103-3p后共培养HUVEC细胞血管样结构的形成，结果如图12所示。结果显示，与miR-NC对照组相比，ADSCs中过表达miR-103-3p显著降低的HUVEC成管数量（***p＜0.001）和成管长度（***p＜0.001），这说明ADSCs中的miR-103-3p可以抑制共培养血管内皮细胞血管的生成。
前述结果明确了miR-103-3p可以靶向抑制FGF2的表达进而抑制血管内皮细胞的增殖、迁移和成管。为了进一步明确miR-103-3p通过靶向FGF2，调控HIF-1α活性，介导血管内皮细胞的血管生成，将miR-103-3p mimics（基于miR-103-3p序列设计的双链寡核苷酸）+GFP-FGF2（FGF2过表达组）、miR-103-3p mimics+GFP（FGF2敲低组）和miR-NC（对照组）转染ADSCs细胞后通过Western blotting检测ADSCs细胞中FGF2蛋白的表达水平，结果如图13所示。结果显示，转染miR-103-3p mimics组FGF2和HIF-1α的蛋白表达显著下调，与miR-103-3p mimics组相比，miR-103-3p mimics+GFP-FGF2组FGF2和HIF-1α蛋白表达水平显著升高，FGF2和HIF-1α蛋白表达趋势相对一致，提示HIF-1α活性受FGF2调控。
随后设置共培养方案，Control，miR-NC，miR-103-3p mimics+GFP和miR-103-3pmimics+GFP-FGF2四组ADSCs细胞悬液置于Transwell小室的上室，血管内皮细胞置于Transwell小室的下室，两种细胞同时接种，共同培养48小时后血管内皮细胞进行划痕实验，结果如图14所示。结果显示，与miR-NC（对照组）相比，miR-103-3p mimics（FGF2敲低组）迁移能力显著降低（***p＜0.001）；与miR-103-3p mimics组相比，miR-103-3p mimics+GFP-FGF2组血管内皮细胞迁移能力显著增加（***p＜0.001）。
进一步地，利用Transwell迁移实验检测ADSCs过表达miR-103-3p mimics和FGF2对血管内皮细胞细胞迁移的影响，结果如图15所示。结果显示，与miR-NC组相比，miR-103-3p mimics+GFP组共培养血管内皮细胞迁移的数量显著降低。与miR-103-3p mimics+GFP组相比，转染miR-103-3p mimics+GFP-FGF2显著增加共培养血管内皮细胞迁移的数量。
最后，利用成管实验检测ADSCs细胞过表达miR-103-3p mimics和/或FGF2对共培养血管内皮细胞血管形成的影响，结果如图16所示。结果显示，miR-103-3p mimics+GFP组多形成为未封闭的多边形结构，miR-NC和miR-103-3p mimics+GFP-FGF2组显示出更多的管样结构，且管样结构更加复杂。进一步统计成管的数量和长度，发现与miR-103-3p mimics+GFP组相比，miR-NC和miR-103-3p mimics+GFP-FGF2组显著增加HUVEC成管数量（***p＜0.001）和成管长度（***p＜0.001）。上述结果共同表明，过表达FGF2可以逆转miR-103-3p对共培养血管内皮细胞迁移的抑制作用，减弱miR-103-3p抑制共培养HUVEC血管的形成。
实施例3
前述实验在细胞中已经证实了ADSCs中miR-103-3P/FGF2功能轴参与调控血管内皮细胞的迁移和血管的形成，对此，在动物在体水平进一步明确miR-103-3P/FGF2功能轴对缺血低氧皮瓣模型的治疗效果，于皮下带蒂缺血皮瓣分别注射PBS，ADSCs，ADSCs+miR-NC和ADSCs+miR-103-3p inhibitor的ADSCs细胞，术后14天观察各组皮瓣状况；其中miR-103-3pinhibitor为化学修饰的单链寡核苷酸，具有二级结构，旨在特异性结合并抑制内源性miRNA，其序列为AGCAGCAUUGUACAGGGCUAUGA。结果显示，皮肤坏死主要发生在皮瓣的远端部分，与阴性对照组相比，ADSCs和ADSCs+miR-NC组显著降低了坏死区域的面积。与和ADSCs+miR-NC组比，ADSCs+miR-103-3p inhibitor处理进一步降低了坏死区域的面积（参见图17-18），可以明确利用miR-103-3p抑制剂降低细胞内miR-103-3p表达水平有助于挽救皮瓣坏死，提高皮瓣移植存活率和成功率。
通过Western blotting检测Control，ADSCs，ADSCs+miR-NC和ADSCs+miR-103-3pinhibitor各组处理后缺血低氧皮瓣组织相关蛋白FGF2及HIF-1α的表达水平，结果如图19所示。结果显示，与阴性对照组相比，ADSCs和ADSCs+miR-NC组FGF2和HIF-1α蛋白表达水平均显著上调（**p＜0.01）。与ADSCs+miR-NC组比，ADSCs+miR-103-3p inhibitor组进一步增加了FGF2和HIF-1α的蛋白表达水平（###p＜0.001）。
随后，通过HE染色和Masson染色对皮瓣远端区域组织坏死情况进行分析发现，ADSCs+miR-103-3p inhibitor组表现出最健康的组织结构，即相对正常的皮肤附属器和毛囊，厚的皮下脂肪层，没有大的油腔，以及丰富的血管。Control组，存在大量炎症细胞浸润。表皮因胶原蛋白而增厚，皮肤附属器紊乱。然后，统计HE染色切片血管的密度，发现与Control对照组相比，移植ADSCs显著增加皮瓣血管的生成（参见图20）。与ADSCs+miR-NC组相比，ADSCs+miR-103-3p inhibitor组皮瓣周围血管更为丰富，提示ADSCs经miR-103-3pinhibitor处理后，改善了皮瓣血管的生成。
进一步地，使用CD31和α-SMA染色对新形成血管和成熟血管进行表征，结果如图21-22所示。结果显示，与Control对照组相比，ADSCs组处理的皮瓣CD31+或α-SMA阳性细胞个数均显著增加。与ADSCs+miR-NC组相比，ADSCs+miR-103-3p inhibitor组显示出更多CD31+或α-SMA阳性细胞个数。这说明与Control PBS处理组相比，皮瓣下移植ADSCs细胞有助于皮瓣血管的生成，而miR-103-3p inhibitor处理的ADSCs细胞由于FGF2表达水平增加，显示出更强的促内皮细胞血管生成的功能。
本发明为了明确ADSCs对血管内皮细胞血管生成的影响，通过建立ADSCs与血管内皮细胞共培养模型，利用细胞划痕、Transwell迁移、血管内皮细胞成管和流式细胞凋亡实验显示低氧预处理的ADSCs促进血管内皮细胞的增殖、迁移和血管形成，但没有显著改善血管内皮细胞的凋亡水平。共培养方案明确了低氧诱导条件下，ADSCs促血管内皮细胞血管生成的作用，但低氧条件分泌多种生长因子，到底哪些生长因子发挥重要作用需要进一步深入研究。于是，首先通过qRT-PCR，WB和ELISA检测低氧诱导下ADSCs相关细胞因子的表达水平，显示在mRNA和蛋白水平低氧诱导促进脂肪源性干细胞表达和分泌VEGF和FGF2。进一步的研究发现ADSCs细胞FGF2表达水平的下调导致血管内皮细胞在迁移和血管内皮细胞成管的缺陷。因此，本发明通过分子生物学手段明确了ADSCs分泌的FGF2确实参与促进血管修复并保护血管免受损伤的重要细胞因子。
miRNA作为一类约21-23核苷酸长的RNA分子，广泛存在于生物体内。miRNA 通过靶向不同基因来发挥生物学功能，导致翻译抑制和mRNA衰减。为了明确调控ADSCs分泌的FGF2的上游分子机制，本发明通过miRNA靶基因在线数据库TargetScan 和mirtarbase 预测可能靶向FGF2潜在miRNA。然后通过qRT-PCR和荧光素酶报告基因实验筛选出既与FGF2表达呈负相关又与FGF2存在潜在靶向调控关系的潜在上游miRNA，即 miR-103-3p。
为了明确筛选得到的miR-103-3p是否参与共培养血管内皮细胞生物学活性，通过将miR-103-3p mimics导入ADSCs细胞并与血管内皮细胞共培养，观察到共培养的血管皮细胞的在迁移和成管被抑制。进一步通过拮抗实验明确了增加FGF2表达，激活HIF-1α可以挽救miR-103-3p对血管内皮细胞迁移和血管形成的抑制作用。
在细胞水平证明了ADSCs低氧诱导下miR-103-3p/FGF2功能轴通过增强HIF-1α活性在促血管内皮细胞血管生成中发挥重要作用后，接下来在动物水平明确ADSCs中miR-103-3p对皮瓣修复的影响。首先，通过制备裸鼠缺血低氧皮瓣模型，分别将PBS，ADSCs，ADSCs+miR-NC和ADSCs+miR-103-3p inhibitor四组接种于皮瓣下，进一步通过HE染色，masson染色和细胞免疫荧光实验评估miR-103-3p和ADSCs对皮瓣血管生成的效果。发现ADSCs可以促进皮瓣的修复，在对miR-103-3p表达进行抑制后能够更进一步促进皮瓣血管生成。
总的来说，本发明在体外和体内证明miR-103-3p/FGF2功能轴通过增强HIF-1α的活性促进血管内皮细胞迁移和血管形成，在目前ADSCs移植尚未取得突破性进展的客观环境下，有望为临床高ADSCs移植的可行性及临床应用提供理论基础，且通过miRNA作为干预新生血管形成的手段是一种快捷有效、安全实用的方法，具有显著的临床应用前景。
以上具体实施方式部分对本发明所涉及的分析方法进行了具体的介绍。应当注意的是，上述介绍仅是为了帮助本领域技术人员更好地理解本发明的方法及思路，而不是对相关内容的限制。在不脱离本发明原理的情况下，本领域技术人员还可以对本发明进行适当的调整或修改，上述调整和修改也应当属于本发明的保护范围。
Claims (5)
1. miR-103-3p抑制剂在制备治疗与慢性难愈性创伤有关的疾病和/或改善与慢性难愈性有关的疾病症状的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述miR-103-3p抑制剂选自基于miR-103-3p基因设计的siRNA、shRNA、sgRNA中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述与慢性难愈性创伤有关的疾病选自机械外伤、组织溃疡、褥疮中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述与慢性难愈性创伤有关的疾病症状选自新生血管生成速度、内皮细胞成管数量、创面愈合速度、皮瓣存活面积中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述与慢性难愈性创伤有关的疾病具体为经脂肪来源干细胞移植治疗的与慢性难愈性创伤有关的疾病；所述与慢性难愈性有关的疾病症状具体为经脂肪来源干细胞移植治疗的与慢性难愈性创伤有关的疾病症状。
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2024
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- 2024-05-13 CN CN202410590184.5A patent/CN118384279A/zh active Pending
Patent Citations (3)
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|---|---|
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