CN117825675A - 用于检测慢性荨麻疹严重程度和预后评估的标志物及应用 - Google Patents

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CN117825675A CN202311586003.3A CN202311586003A CN117825675A CN 117825675 A CN117825675 A CN 117825675A CN 202311586003 A CN202311586003 A CN 202311586003A CN 117825675 A CN117825675 A CN 117825675A
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Abstract

本发明提供了丙酮酸和马来酸作为用于检测慢性荨麻疹患者的疾病严重程度及预后评估和复发相关的标志物的用途，还提供了用于检测慢性荨麻疹患者的疾病严重程度及预后和复发相关的检测试剂，具体为检测并其中通过分析患者体内的丙酮酸和马来酸的代谢水平的检测，即血液样本中的相对丰度和浓度，可准确的评估相应的疾病的严重程度。

Description

用于检测慢性荨麻疹严重程度和预后评估的标志物及应用
技术领域
本发明涉及用于慢性荨麻疹相关的疾病严重程度和预后评估相关的标志物及应用，属于生物医药领域。
背景技术
慢性荨麻疹(CU)是一种常见的炎症性和复发性疾病，其主要的特征是持续6周以上的风团、血管性水肿，或两者均有，这通常会给CU患者的生活质量带来沉重负担，包括睡眠障碍、身心健康下降、及在学校和工作中表现不佳。根据病变产生的因素，慢性荨麻疹可分为慢性自发性荨麻疹(CSU)和慢性诱导性荨麻疹(CIndU)。CU的发病机制，包括CSU和CIndU，被认为是肥大细胞(MC)所驱动，发病机制的中心事件是由各种因素激活的皮肤肥大细胞(MC)发生脱颗粒，包括免疫球蛋白E(IgE)和IgE高亲和力受体(FcεRI)的交联，导致组胺、白细胞三烯和多种促炎细胞因子的释放。慢性荨麻疹的一线治疗用药是第二代H1抗组胺药(sgAHs)，但约35％～40％的患者治疗反应不佳，即使是高剂量用药。因此，有必要探索新颖的生物标志物来预测sgAHs的治疗效果；根据EAACI/GA2LEN/EuroGui Derm/APAAACI指南，需要为不同亚型的荨麻疹寻找更特异的生物标志物。
代谢组学可用于揭示在不同条件下生物系统内各种小分子代谢物的变化；基于显著变化的代谢物可探究其作为疾病诊断和治疗的生物标志物。基于人群的回顾性研究发现，慢性荨麻疹的发生与其先前已确诊代谢综合征(例如高血脂)、及血清中脂质和脂肪酸水平存在关联(Ye Y,Jin H,Hwang E,et al.Co-existence of Chronic Urticaria andMetabolic Syndrome:Clinical Implications.Acta Dermato Venereologica.2013；93(2):156-160.)。发明人早前基于血浆的脂质代谢组研究发现，磷脂酰乙醇胺和磷脂酰甘油在慢性荨麻疹换着样本中增加；而磷脂酰胆碱减少。另一项小样本量的血浆非靶向代谢组研究报道，与健康人相比，慢性荨麻疹样本中有显著更低的尿囊酸、匀浆酸、吲哚乙酸、脯氨酸和苯丙氨酸；而多种氨基酸显著更高，包括色氨酸、亚精胺、赖氨酸、缬氨酸、鸟氨酸、组氨酸、谷氨酸、亮氨酸和酪氨酸(Omer Faruk Kocak,Mehmet Atakay,Mehmet Emrah Yaman,etal.Chemometrics assisted untargeted metabolomic analysis to explore metabolicalterations in chronic urticaria via LC/Q-TOF/MS/MS.Scand J Clin LabInvest.2022:1-8.)。本课题组前期还发现慢性自发性荨麻疹患者血浆中的腺苷水平与其疾病的活跃程度和治疗响应均有显著的关联(Mao M,Liu H,Yan S,et al.Plasmaadenosine is linked to disease activity and response to treatment in patientswith chronic spontaneous urticaria.Allergy.2021；76(2):571-573.)。总之，慢性荨麻疹疾病的发生发展及其治疗响应均与患者的代谢存在关联；也提示我们有必要基于大样本量综合地研究慢性荨麻疹患者的代谢特征，探索慢性荨麻疹疾病发生发展及治疗响应相关的代谢标志物，如何高效便捷的识别适用人群，确定准确的治疗方案，提升药物治疗效率，这也是慢性荨麻疹临床治疗中急需解决的问题。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的是提供用于检测慢性荨麻疹严重程度及预后评估的标志物，可以用于区分慢性荨麻疹的患者的分型，慢性荨麻疹的一线治疗用药是第二代H1抗组胺药(sgAHs)的疗效及预后复发评估预测，克服临床中无法高效便捷的分型方法、和sgAHs适用人群以及疗效不达预期的缺点，从而提升药物治疗效率，因此具有良好的实际应用价值，尤其是临床治疗的价值。
本发明的目的之一，是提供了丙酮酸和/或马来酸作为用于检测慢性荨麻疹严重程度和预后评估的标志物的用途。
本发明的目的之二，是提供一种用于检测慢性荨麻疹严重程度及预后评估的试剂，该试剂为检测丙酮酸和/或马来酸的检测试剂，在制备用于检测慢性荨麻疹的严重程度和预后评估的试剂中的用途；为慢性荨麻疹的严重程度和预后评估检测提供更加高效便捷的试剂。上述检测试剂，可以直接使用现有市售商品，也可以自行制备，本发明并不对其进行任何限制。
本发明的目的之三，是提供了丙酮酸和/或马来酸作为用于检测慢性荨麻疹的一线治疗用药是第二代H1抗组胺药药物疗效的标志物的用途。
本发明的目的之四，是提供了用于评估第二代H1抗组胺药治疗慢性荨麻疹疗效的检测试剂，该试剂为丙酮酸和/或马来酸的检测试剂，在制备用于评估第二代H1抗组胺药治疗慢性荨麻疹疗效的检测试剂中的用途；为慢性荨麻疹的治疗辨别更有针对性适用人群以及克服疗效不达预期的缺点，从而提升药物治疗效率。
优选地，上述用途中，所述丙酮酸检测试剂检测生物样本中丙酮酸的浓度和/或丰度；所述马来酸检测试剂检测生物样本中马来酸的浓度和/或丰度；。
优选地，上述用途中，所述生物样本为血清、血浆或血液。
优选地，上述用途中，当非靶向代谢组检测慢性荨麻疹患者血浆样本，丙酮酸和马来酸的阈值相对丰度分别为21400000和700000，丙酮酸和马来酸的相对丰度均小于阈值的患者筛为疾病严重且治疗不佳的CU患者。
优选地，上述用途中，当靶向代谢组检测慢性荨麻疹患者血浆样本，丙酮酸和马来酸的阈值浓度分别为215μM和1.55μM，丙酮酸和马来酸浓度均低于阈值的CU患者预后更差。
本发明的目的之五，是提供了一种慢性荨麻疹的复发风险评估方法，该方法包括如下步骤：
步骤a、分别检测患者的丙酮酸和马来酸的浓度；
步骤b、根据上述浓度，计算每个患者的复发风险评分，风险评分公式如下：
其中，i表示第i个特征，feature和Coef分别表示该个特征在拟合模型中的数值和系数。
优选地，上述步骤b中，利用R包survival(v.3.2-13)和survminer(v.0.4.9)构建多变量Cox比例风险回归模型。
本发明的有益技术效果如下：
本发明首创的发现并验证了慢性荨麻疹患者的疾病严重程度及预后和复发相关的标志物丙酮酸和马来酸，其中通过分析患者体内的丙酮酸和马来酸的代谢水平，即血液样本中的相对丰度和浓度，可准确的评估相应的疾病的严重程度，同时，以丙酮酸和马来酸的标志物组合可有效评估患者的抗组胺药物的治疗预后以及复发风险，其中：
当非靶向代谢组检测慢性荨麻疹患者血浆样本，丙酮酸和马来酸的阈值相对丰度分别为21400000和700000，丙酮酸和马来酸的相对丰度均小于阈值的患者筛为疾病严重且治疗不佳的CU患者。
当靶向代谢组检测慢性荨麻疹患者血浆样本，丙酮酸和马来酸的阈值浓度分别为215μM和1.55μM，丙酮酸和马来酸浓度均低于阈值的慢性荨麻疹患者预后更差。
上述丙酮酸和马来酸可作为检测靶标应用慢性荨麻疹患者诊断和治疗，因此具有良好的实际临床应用价值。
术语
代谢标志物：是指在受到干预或刺激后生物体内发生代谢过程发生改变后产生的一类小分子化合物，通过检测和分析这些标志物，可以了解生物体的代谢状态、疾病风险以及药物反应等信息。
靶向代谢检测：直接针对感兴趣的代谢物进行检测分析，是一种有偏向性的检测手段。主要目的是验证样品中是否存在目标代谢物，同时根据生物信息分析获取目标代谢物在不同样本中的绝对含量。
非靶向代谢检测：是对生物体内源性代谢物进行系统全面的分析，获取大量代谢物的数据，并对其处理，从而找出差异代谢物的研究方法，是一种无偏向的代谢组学分析。主要目的是检测出尽可能多的代谢物，最大程度上反映样品的总代谢物特征。
相对丰度：是指通过非靶向代谢检测方法获得的代谢物的峰面积。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述本发明或下述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
附图说明
图1为实施例研究队列中的慢性荨麻疹患者与健康对照的代谢组数据建模结果图；
图2为实施例研究队列中的慢性荨麻疹患者与健康对照的差异代谢物结果图；
图3为实施例研究队列中的慢性荨麻疹患者与健康对照的丙酮酸的随机森林分类模型图；
图4为实施例研究队列中的慢性荨麻疹患者与健康对照的马来酸的随机森林分类模型图；
图5为实施例研究队列中的慢性荨麻疹患者与健康对照的丙酮酸丰度与慢性荨麻疹患者的UAS7评分相关性分析图；
图6为实施例研究队列中的慢性荨麻疹患者与健康对照的丙酮酸丰度与慢性荨麻疹患者的UCT评分相关性分析图；
图7为实施例研究队列中的慢性荨麻疹患者与健康对照的马来酸丰度与慢性荨麻疹患者的UAS7评分相关性分析图；
图8为实施例研究队列中的慢性荨麻疹患者与健康对照的马来酸丰度与慢性荨麻疹患者的UCT评分相关性分析图；
图9为实施例研究队列中慢性荨麻疹患者的无监督非负矩阵分解聚类图；
图10为实施例研究队列中慢性荨麻疹患者的无监督非负矩阵分解聚类的三个类的患者的临床特征UAS7评分分析图；
图11为实施例研究队列中慢性荨麻疹患者的无监督非负矩阵分解聚类的三个类的患者的临床特征DLQI评分分析图；
图12为实施例研究队列中慢性荨麻疹患者的无监督非负矩阵分解聚类的三个类的患者的临床特征UAS7UCT评分分析图；
图13为实施例研究队列中慢性荨麻疹患者中三个类的患者的丙酮酸的相对丰度结果图；
图14为实施例研究队列中慢性荨麻疹患者中三个类的患者的马来酸的相对丰度结果图；
图15为实施例验证队列中慢性荨麻疹患者的丙酮酸和马来酸相对丰度分组与UAS7评分分析图；
图16为实施例验证队列中慢性荨麻疹患者的丙酮酸和马来酸相对丰度分组与DLQI评分分析图；
图17为实施例验证队列中慢性荨麻疹患者的丙酮酸和马来酸相对丰度分组与UCT评分分析图；
图18为实施例验证队列中慢性荨麻疹患者的丙酮酸的浓度与UCT评分相关性分析图；
图19为实施例验证队列中慢性荨麻疹患者的马来酸的浓度与UCT评分相关性分析图；
图20为实施例验证队列中慢性荨麻疹患者的丙酮酸和马来酸的中高度浓度分组与UCT评分相关性分析图；
图21为实施例验证队列中慢性荨麻疹患者的复发情况分组与丙酮酸的浓度相关性分析图；
图22为实施例验证队列中慢性荨麻疹患者的复发情况分组与马来酸的浓度相关性分析图；
图23为实施例验证队列中慢性荨麻疹患者的复发风险评估分析图；
图24为实施例体外实验中MC细胞的β-己糖胺酶(β-hex)的释放率实验结果图；
图25为实施例动物实验中丙酮酸盐干预实验组小鼠体重结果图；
图26为实施例动物实验中丙酮酸盐干预实验组小鼠耳朵中的埃文斯蓝染料结果图；
图27为实施例动物实验中丙酮酸盐干预实验组小鼠的血管通透性结果图；
图28为实施例动物实验中丙酮酸盐干预实验组小鼠的IL-4的表达水平结果图；
图29为实施例动物实验中丙酮酸盐干预实验组小鼠的IL-10的表达水平结果图；
图30为实施例动物实验中丙酮酸盐干预实验组小鼠的IL-13的表达水平结果图；
图31为实施例动物实验中丙酮酸盐干预实验组小鼠的TNF-a的表达水平结果图；
图32为实施例动物实验中丙酮酸盐干预实验组小鼠的INF-γ的表达水平结果图；
图33为实施例动物实验中马来酸盐干预实验组小鼠体重结果图；
图34为实施例动物实验中马来酸盐干预实验组小鼠耳朵中的埃文斯蓝染料结果图；
图35为实施例动物实验中马来酸盐干预实验组小鼠的血管通透性结果图；
图36为实施例动物实验中马来酸盐干预实验组小鼠的IL-4的表达水平结果图；
图37为实施例动物实验中马来酸盐干预实验组小鼠的IL-10的表达水平结果图；
图38为实施例动物实验中马来酸盐干预实验组小鼠的IL-13的表达水平结果图；
图39为实施例动物实验中马来酸盐干预实验组小鼠的TNF-a的表达水平结果图；
图40为实施例动物实验中马来酸盐干预实验组小鼠的CCL3的表达水平结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提作进一步详细、完整地说明。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。
本发明实施例涉及的主要材料如下：
1.实验对象及动物
用于代谢组学检测的80例CU患者和82例年龄、性别和体重指数(BMI)值匹配的健康对照对照者(HC)分别来自湘雅医院皮肤科门诊和健康检查中心。本研究已通过湘雅医院伦理委员会的审查和批准(IRB-201904112)。所有研究对象均签署了关于临床信息和样本收集的知情同意书。
无特定病原体(SPF)级别BAL B/C雄性小鼠(6-8周龄)及C57雌性小鼠(4～6周龄)，体重20-25g,购于湖南省斯莱克景达实验动物有限责任公司，饲养于中南大学实验动物中心。本研究已通过中南大学实验动物福利伦理审查。在实验过程中谨遵“3R”原则，尽量减少动物的痛苦及不适。
2.实验试剂
逆转录酶(购于上海翌圣生物公司)，SYBR Green qPCR Master Mix(购于上海Bimake生物公司)，RT-qPCR引物(购于上海生工生物工程公司)，MEM培基(购于美国hyclone公司)，RPMI 1640培基(购于美国hyclone公司)，胎牛血清(购于依科赛生物科技有限公司)，PBS(购于博士德生物工程有限公司)，丙酮酸及马来酸(购于美国Sigma公司)，重组IL-3(购于美国Peprotech Inc公司)，重组SCF(购于美国Peprotech Inc公司),DNP-HSA(购于美国Biosearch公司),IgE(购于美国Sigma公司),抗CD117抗体(购于美国Biolengend公司),抗FcεR1α抗体(购于美国Biolengend公司),4-硝基苯基-N-乙酰-β-D-氨基半乳糖苷(购于美国Sigma公司)。
实施例
本发明收集了两个独立的慢性荨麻疹患者队列(研究队列和验证队列)及健康对照组(HC)的血浆样本，通过非靶向代谢组学和靶向代谢组学检测分析，以全面地揭示慢性荨麻疹疾病潜在的代谢组学特征，旨在确定与CU患者分型、患者疾病活跃程度、和sgAHs治疗疗效有关的代谢物。确定标志物后，本发明还通过体外实验和动物实验对标志物的相应作用机理进行研究。
一、慢性荨麻疹分型、严重程度和预后评估的标志物筛选实验
本实验通过对比患者和健康人间的差异，初步筛选相关标志物
1、入组要求和样本收集
研究队列中包括患者和健康人，其中80名来自湘雅医院皮肤科的慢性荨麻疹患者，专家根据EAACI/GA2 LEN/EDF/WAO荨麻疹指南对患者进行慢性荨麻疹诊断，包括38名慢自发荨麻疹(CSU)患者、23名症状性皮肤病(SD)患者、和19名属于CSD(CSU与SD发生在同一患者时称为CSD)患者；同时收集这些慢性荨麻疹患者的人口统计学和临床特征数据，包括年龄、性别、体重指数(BMI)、腰围、每周荨麻疹活动评分(UAS7)、皮肤科生活质量指数(DLQI)评分、和荨麻疹控制测试(UCT)评分。此外，从湘雅医院健康检查中心招募82名健康对照(HC)受试者，他们在年龄、性别和BMI上与慢性荨麻疹患者没有显著性差异。上述研究队列的临床和基线特征列于表1和2中。
表1患者与健康人群临床特征表
注：#为双尾韦尔奇t检验；*为费舍尔精确检验。
表2三种患者临床特征对比表
注：#为双尾韦尔奇t检验；&为方差分析；*为费舍尔精确检验。
收集所有参与者在空腹状态的血样于EDTA管中，并以3000rpm的速度离心10min获得血浆样本。所有血浆样本在使用前均在-80℃冰箱储存。
2、样本检测及数据处理
2.1、非靶向代谢组学检测和数据处理
将50μL血浆样本加入到150μL预冷甲醇中，在-20℃下孵育过夜后离心10min。随后将含有极性代谢物的上清液转移到新的Eppendorf管中，在Savant真空浓缩器中干燥，并在乙腈：甲醇：水(1:1:1，v/v/v)中再溶解，用于LC-MS/MS分析。UPLC-QE(Thermo FisherScientific，San Jose，CA，USA)配备BEH C18柱(100×2.1mm，1.7μm；Waters，Milford，MA，USA)用于非靶向代谢组学检测。流动相为0.1％甲酸水溶液(A)和0.1％甲酸乙腈溶液(B)，流速为0.4ml/min，梯度条件如下：2％流动相B最初维持1分钟，然后在3分钟增加到20％，在8分钟增加到90％，最后维持3分钟。柱和自动进样器的温度分别为45℃和8℃，注射量为10μ。电喷雾电离在正离子和负离子模式下进行，用于数据相关采集。全MS扫描的分辨率为30000，而MS/MS扫描的分辨率则为17500。
对于代谢物的鉴定和定量，使用化合物Discovery 2.1(Thermo FisherScientific，San Jose，CA，USA)进行数据处理，并对照在线数据库(mzCloud)和用MS/MS光谱和保留时间信息注释的内部代谢物数据库进行搜索。
2.2、多反应监测的靶向代谢产物检测
本发明成功在UPLC-QTRAP6500 Plus系统(SCIEX，USA)上开发了一种针对生物标志物代谢产物丙酮酸和马来酸的靶向多反应监测(MRM)方法。简言之，用120μL含有内标物(丙酮酸和马来酸)的溶液沉淀20μL血浆和标准校准品，并在10℃下涡旋30分钟。离心后，将上清液转移到新的Eppendorf管中，并通过加入在50％乙腈/水中的3-硝基苯肼盐酸盐溶液和含有6％吡啶溶液的120mM 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC-HCl)而得到。在40℃下孵育60分钟并用50％甲醇稀释后，注入换着血清样本样品进行LC-MRM分析。定量后，使用内部HMQuant软件对所有原始数据进行分析，用于MRM数据处理，包括目标峰提取、校准曲线分析和浓度计算。
3、标志物的筛选与鉴定
3.1、标志物的筛选
研究队列中，来自80名慢性荨麻疹(CU)患者和82个健康对照(HC)在空腹状态下的血浆样本，被进行非靶向代谢组学检测，共有613个代谢产物被鉴定和定量。随后，基于该研究队列的代谢组数据，进行了偏最小二乘判别分析(PLS-DA)建模，并观察到CU样本与HC样本明显分离(结果见图1所示)，如图1所示，表明患者和健康人间存在显著的代谢组差异。本发明提供的PLS-DA模型通过置换检验验证可靠(R2＝0.631，Q2＝-0.184)；并且基于该模型评估所有代谢物的重要性(variable importance in projection，VIP)。
此外，还对研究队列中的患者样本与健康人样本的代谢物进行双尾Welch’s T检验和Benjamini-Hochberg校验，计算两组样本间的P值、倍数变化；并结合代谢物的VIP值，共筛选到33个差异代谢物(筛选条件：adjusted P<0.05&|log2(FoldChange)|>0.415&VIP>1)，其中19个在患者样本中是下调代谢物、14个是上调代谢物(见图2)。如图2所示，实心圆和空心圆分别代表VIP大于1和小于1的代谢物；红色或蓝色的实心圆圈分别代表那些上调或下调的代谢物。
将研究队列中的样本按照7：3分为训练集和测试集，并分别将33个差异代谢物作为特征，构建随机森林分类模型。其中丙酮酸和马来酸分类模型的AUC均在0.85以上(见图3和4)，这表明丙酮酸和马来酸均具有极好的区分CU患者和HC健康人的能力。
进一步相关性分析发现，丙酮酸和马来酸的丰度与CU患者的UAS7评分呈正相关、与UCT评分呈负相关(见图5-8)，如图5-6(丙酮酸Pyruvic acid与UAS7 score的Pearson相关性R＝－0.26，p＝0.047；丙酮酸Pyruvic acid与UCT score的Pearson相关性R＝0.24，p＝0.04)和图7-8(马来酸Maleic acid与UAS7 score的Pearson相关性R＝－0.24，p＝0.078；马来酸Maleic acid与UCT score的Pearson相关性R＝0.21，p＝0.063)所示，提示丙酮酸和马来酸与CU患者的疾病严重程度正相关、与CU患者的治疗疗效负相关。
3.2、疾病严重程度相关的标志物鉴定
为评估慢性荨麻疹CU患者是否可划分为具有不同代谢特征的亚型，进一步对研究队列中的CU患者进行了无监督非负矩阵分解(nonnegative matrix factorization，NMF)聚类，在生成三个类表现较好，即Cluster1、Cluster2、Cluster3(见图9)。比较这三个类的CU患者间的临床特征(UAS7、DLQI、UCT)，如图10-12所示，与Cluster2、Cluster3相比，Cluster1的CU患者显示更高的UAS7评分(Cluster1：33.95±10.83；Cluster2：22.90±12.97；Cluster3：21.39±14.94)、更高的DLQI评分(Cluster1：6.36±7.12；Cluster2：
4.53±2.94；Cluster3：3.28±2.30和更低的UCT评分(Cluster1：11.00±4.05；Cluster2：13.24±4.00；Cluster3：13.24±3.79(见图10-12)，这表明Cluster1的CU患者具有更严重的疾病活跃程度、对sgAHs的治疗响应效果不佳。同时，我们还观察到Cluster1的CU患者的丙酮酸和马来酸丰度显著更低(图13-14)，如图13-14所示，(log10(Pyruvicacid)：Cluster1＝7.19±0.16；Cluster2＝7.31±0.16；Cluster3＝7.36±0.20)；(log10(Maleic acid)：Cluster1＝5.87±0.14；Cluster2＝5.98±0.18；Cluster3＝5.97±0.21)可推测低水平的丙酮酸和马来酸可用于识别病情验证和sgAHs治疗效果不佳的CU患者。
3.3预后相关的代谢物验证
根据非靶向代谢检测的CU患者血浆样本的丙酮酸和马来酸的相对丰度分布，将丙酮酸和马来酸的阈值相对丰度(MS1峰面积)分别设置为21400000和700000，相应的将CU患者重新分为三组：两个代谢物的相对丰度均大于阈值被定义为高丰度CU患者(High)；两个代谢物的丰度均低于阈值被定义为低相对丰度CU患者(Low)；剩下的CU患者被定义为中等相对丰度(Middle)。将丰度分组与USA7评分、DLQI和UCT进行比较，结果见图15-17，如图15-17所示，与高相对丰度患者相比，低相对丰度的CU患者表现出更高的UAS7评分(High：21.70±13.91；Middle：26.41±14.55；Low：31.53±11.72)、更高的DLQI评分(High：3.66±3.12；Middle：3.88±3.26；Low：7.95±7.12)、和更低的UCT评分(High：13.64±3.07；Middle：12.87±3.93；Low：10.35±4.86)。换言之，本发明提供的相应的丙酮酸和马来酸的阈值相对丰度，可筛选出疾病严重且治疗不佳的CU患者，即丙酮酸和马来酸的相对丰度均小于阈值的患者。
二、慢性荨麻疹分型、严重程度和预后评估的标志物验证实验
1、入组要求和样本收集
验证队列中，招募了144名湘雅医院皮肤科的慢性荨麻疹患者，包括97名CSU、19名SD和28名CSD(见表3)。所有入选的慢性荨麻疹患者均在许可剂量下采用sgAHs单药治疗。
表3三类患者的临床特征对比表
注：&为方差分析；*为费舍尔精确检验。
收集所有参与者在空腹状态的血样于EDTA管中，并以3000rpm的速度离心10min获得血浆样本。所有血浆样本在使用前均在-80℃冰箱储存。
2、数据检测
收集CU患者的空腹状态下的血浆样本，靶向检测丙酮酸和马来酸的浓度(检测方法见上述2.2内容)。
3、随访信息
独立验证队列中的144名慢性荨麻疹患者被随访了两年，其中115名患者有随访数据，29名患者失访。随访患者在停用sgAHs后，仍需要常规药物治疗的有38名，本发明定义为常规用药(Regular)；有47名患者完全缓解且至少6个月未复发的患者被定义为无复发(Relapse-free)；有16名偶尔复发的患者，即指风团和/或血管性水肿在一个月内复发不到三次被定义为偶尔复发(Occasional)；可将常规用药和偶尔复发合并看作复发后服药可控制(Medication)；此外还有14名慢性荨麻疹患者在sgAHs治疗下仍无法控制病情被定义为未控制(Uncontrolled)。
4、丙酮酸和马来酸作为CU的预后靶点的验证实验结果
检测结果见图18-19，如图18-19所示(丙酮酸Pyruvic acid与UCT score的Pearson相关性R＝0.2，p＝0.015；马来酸Maleic acid与UCT score的Pearson相关性R＝0.14，p＝0.088)，丙酮酸和马来酸的浓度与患者的UCT评分呈正相关。如上实验结果，基于丙酮酸和马来酸的浓度分布，将丙酮酸和马来酸的阈值浓度分别设定为215μM和1.55μM，将验证队列中的CU患者分为高浓度(High)、低浓度(Low)、中浓度(Middle)三个组；评估各组的UCT评分，结果见图20，如图20所示(High：13.25±2.65；Middle：12.79±3.17；Low：10.48±3.40)，与相对丰度阈值实验分析结果一致，丙酮酸和马来酸浓度均低于阈值的CU患者(低浓度组的)UCT评分明显低于其他两组，预后更差。
根据CU患者的随访信息，可将验证队列中的CU患者分为三组：复发后服药可控制(Medication)、无复发(Relapse-free)和无控制(Uncontrolled)。结果见图21-22，如图21-22所示(Pyruvic.acid：Relapse-free＝250.74±61.98；Medication＝229.17±61.19；Uncontrolled＝206.60±42.68)；(Maleic.acid：Relapse-free＝1.70±0.53；Medication＝1.67±0.53；Uncontrolled＝1.40±0.48)，无复发患者的丙酮酸和马来酸均显示更高的浓度。
另外，将丙酮酸和马来酸的浓度作为特征，对无复发的CU患者进行多变量无复发生存分析，计算每个患者的复发风险评分。具体为：利用R包survival(v.3.2-13)和survminer(v.0.4.9)构建多变量Cox比例风险回归模型，对无复发的患者进行多变量无复发生存分析。其中每个特征的系数(权重)反映了特征的重要性，风险评分公式如下：
其中，i表示第i个特征，feature和Coef分别表示该特征在拟合模型中的数值和系数。该评分旨在反映每位患者的复发风险，并使用中位评分将患者分为高风险组和低风险组。对高低风险组进行Kaplan–Meier分析，并通过log-rank检验确定其显著性。结果见图23，如图23所示，复发风险评分与CU患者的无复发时间显著相关(log-rank,p＝0.0093)，根据中位评分将患者分为两个组，低风险患者的无复发时间更长。结果表明丙酮酸和马来酸的组合可用于预测CU患者的复发风险。
三、体外实验
由于肥大细胞(MC)是CU发病机制的中心事件，设计体外实验来检验丙酮酸和马来酸对IgE诱导激活的MC的作用。
1、骨髓单核细胞培养
从4～6周龄C57雌性小鼠的股骨骨髓中分离出骨髓单核细胞(Bone marrowmononuclear cells，BMMCs)；BMMC在添加有胎牛血清(FBS，10％)、青霉素(100U/mL)、链霉素(100mg/mL)、L-谷氨酰胺(2mM)、丙酮酸钠(1mM)、HEPES(10mM)、鼠重组IL-3(20ng/mL；Peprotech Inc，USA)和SCF(20ng/mL；Peprotech Inc，USA)的RPMI 1640(BiologicalIndustries,Israel)培养基中培养，恒温箱内保持在37℃且包含5％ CO2。通过离心(300g，室温下5分钟)收集BMMC，并以3-4天的间隔用新鲜培养基替代。在BMMC孵育约4周后，使用流式细胞术分析APC结合的抗小鼠CD117(Biolegend，股份有限公司USA)和PE/Cy7-结合的抗鼠FcεR1α抗体(Biolegend，股份有限公司USA)。成熟BMMC的特征是CD117和FcεR1α双重阳性。大约90％的双阳性细胞用于随后的实验(FlowJo 10.8.1)。
2、肥大细胞脱颗粒的检测
β-己糖胺酶(β-hexosaminidase)的释放是MC脱颗粒的标志物，可以通过荧光测定法进行测量。将BMMC接种到12孔板中(每孔约9×104个细胞)。用0.1μg/ml无血清培养基稀释的IgE(Sigma，USA)刺激每个孔12小时，同时用丙酮酸钠(5mM)处理实验组6小时或12小时。随后离心，丢弃培养基，并用磷酸盐缓冲液(D-PBS)洗涤细胞两次。用D-PBS稀释的10μg/mL DNP-HSA(二硝基苯化人血清白蛋白，Biosearch Technologies，USA)刺激BMMC 30分钟。将上清液加入96孔板的相应孔中(每孔50μl)。用NP-40(3mM)裂解细胞30分钟，然后将细胞裂解物加入96孔板的相应孔中(每孔50μl)。将上清液和细胞裂解物与反应缓冲液(3mM，pH4.4，对硝基苯正乙酰基-β-D-葡糖氨基糖苷，Sigma，USA)在37℃下孵育90分钟。通过添加150μl Na2CO3/NaHCO3溶液(pH 10.6)终止反应，并在微孔板读取器(BIO-RADLaboratories，USA)中在405nm处测量吸光度。β-hex的效率计算如下：
其中a和b分别表示上清液和细胞沉淀的光学吸光度。
3、结果分析
MC细胞的β-己糖胺酶(β-hex)的释放率的实验结果见图24，如图24所示，丙酮酸处理6小时后的MC的β-hex释放率显著下调(p<0.05)，但在12小时后恢复。该结果表明丙酮酸体外可减弱IgE诱导的MCs的激活，但仅在有限的时间内有效。由于在BMMC培养基中加入马来酸后会产生颜色，因此无法准确评估马来酸处理对MCs激活的作用。
四、动物实验
由于肥大细胞(MC)是CU发病机制的中心事件，设计动物实验作为体内实验来检验丙酮酸和马来酸对IgE诱导激活的MC的作用。
1、实验方法
BALB/c小鼠(雄性，6～8周龄)购自湖南SLAC实验动物有限公司，饲养在中南大学动物实验系(SPF级)。在开始实验前，所有小鼠都需要被驯化至少1周。
在本实验中，丙酮酸盐干预实验包括四组：
1)对照组PBS；
2)IgE+DNP组(将IgE和DNP同时注射到实验小鼠体内)；
3)IgE+DNP+Pyr(0.5g/kg)组；
4)IgE+DNP+Pyr(1g/kg)组。
马来酸盐干预实验有三组：
1)对照组；
2)IgE+DNP组(同上)；
3)IgE+DNP+Mal(1mg/kg)组。
将丙酮酸盐(P2256，Sigma-Aldrich，USA)或马来酸盐(M0375，Sigma-Aldrich，USA)溶于PBS(P2256、Sigma-Al德里ch，USA，USA)对实验小鼠腹膜内注射到体内3天(丙酮酸盐，每天两次；马来酸盐，每天一次；体积取决于每只小鼠的重量，每20g注射100ul)，而IgE+DNP组则注射相同体积的PBS。本发明实验使用的丙酮酸盐和马来酸盐的浓度参考了文献报道Zhao YY,Zhang LJ,Liang XY,et al.Pyruvate Upregulates HepaticFGF21Expression by Activating PDE and Inhibiting cAMP-Epac-CREB SignalingPathway.Int J Mol Sci.2022；23(10)。
在实验的第4天，用胰岛素针在实验小鼠的两只耳朵中皮下注射DNP特异性IgE(25μL，10μg/mL)。16小时后，将含有4％(wt/vol)Evans蓝染料的DNP-HSA(100μL，1mg/mL)静脉注射到小鼠的内眼角。然后，在30分钟后，对实验小鼠的耳朵进行拍照。一只耳朵用于伊文思蓝的甲酰胺提取，另一只耳朵置于2毫升匀浆管中，在液氮中冷冻，并储存在0℃冰箱中，用于随后的qPCR检测。麻醉后，收集实验小鼠的眼球血并放置30分钟。然后，以3000rpm离心全血10分钟，分离血浆并储存在-80℃下以备后用。
将动物实验小鼠的一只耳朵浸入600μl甲酰胺溶液中16小时，并在65℃恒温水浴中孵育。将溶液以3000rpm离心10分钟后，将100μl上清液置于96孔板上，并使用酶标记在610nm处检测每个孔的吸光度值。然后，通过耳朵的重量来标准化吸光度，以量化每只耳朵的伊文思蓝。
2、实验结果
被动皮肤过敏反应(passive cutaneous anaphylaxis，PCA)小鼠模型是测试IgE诱导的MC反应的典型动物，其血管高渗透性是过敏反应的主要诱因。在动物实验过程中，采用两种浓度的丙酮酸(0.5g/kg、1.0g/kg)处理PCA小鼠。
图25为丙酮酸盐干预实验组小鼠体重结果图，如图25所示，丙酮酸盐处理不会影响实验小鼠的体重。图26和27分别为丙酮酸盐干预实验组小鼠的耳朵中的埃文斯蓝染料结果照和血管通透性结果图；如图26和27所示，丙酮酸盐处理显著减轻了小鼠的伊文思蓝染料和血管通透性(Control：2.852±0.07777，IgE+DNP：4.133±0.1814，IgE+DNP+Pyr0.5g/kg：3.344±0.1712，IgE+DNP+Pyr 1g/kg：3.297±0.1663)，且两种不同浓度的丙酮酸盐处理的小鼠间没有显著差异(IgE+DNP+Pyr 0.5g/kg：3.344±0.1712vs IgE+DNP+Pyr 1g/kg：3.297±0.1663，双侧T检验：P＝0.8487)。
图28-32为丙酮酸盐干预实验组小鼠的耳朵组织中IL-4、IL-10、IL-13、TNF-a和INF-γ的表达水平结果图，数据以平均值±SEM表示，并使用双尾T检验评估其显著性，如图19所示，丙酮酸盐处理后实验小鼠耳朵组织中的IL-4、IL-10、IL-13、TNF-a和INF-γ的表达水平见表4，如图28-32和表4所示，实验小鼠耳朵组织中的IL-4、IL-10、IL-13、TNF-a和INF-γ的表达水平显著降低，表明丙酮酸盐可以抑制PCA小鼠皮肤组织中细胞因子的产生。
表4
Control IgE+DNP IgE+DNP+Pyr 0.5g/kg IgE+DNP+Pyr 1g/kg
IL-4 0.9049±0.2762 6.868±0.7358 3.031±0.5855 2.082±0.9065
IL-10 0.8107±0.09186 1.422±0.1575 0.6617±0.1046 0.5755±0.1316
IL-13 0.8947±0.2559 3.443±0.4750 1.677±0.3223 1.651±0.4581
TNF-a 0.5350±0.08889 1.104±0.08348 0.7305±0.05651 0.5848±0.05355
INF-γ 0.6803±0.1562 1.261±0.1456 0.8812±0.09775 0.7338±0.1031
图33为马来酸盐干预实验组小鼠体重结果图，如图20所示，实验小鼠的体重同样没有变化。图34和35分别为马来酸盐干预实验组小鼠的耳朵中的埃文斯蓝染料结果照和血管通透性结果图；如图34和35所示，马来酸盐治疗后耳部埃文斯蓝染料颜色明显变浅和血管通透性降低(Control：1.406±0.1160，IgE+DNP：2.136±0.1099，IgE+DNP+Mal：1.474±0.06029。
图36-40为马来酸盐干预实验组小鼠的耳朵组织中IL-4、IL-10、IL-13、TNF-a和CCL3的表达水平结果图，数据以平均值±SEM表示，并使用双尾T检验评估其显著性，马来酸盐处理后PCA小鼠耳朵组织中IL-4、IL-10、IL-13、TNF-a和CCL3的表达水平结果数据见表5，如表5和图36-40所示，马来酸盐处理后PCA小鼠耳朵组织中IL-4、IL-10、IL-13、TNF-a和CCL3的表达水平同样下调，表明马来酸盐也可抑制PCA小鼠皮肤组织中细胞因子的产生。
表5
Control IgE+DNP IgE+DNP+Mal
IL-4 0.7028±0.2187 2.472±0.7904 0.9265±0.06205
IL-10 0.9740±0.1928 2.592±0.2838 1.547±0.2274
IL-13 0.8898±0.1558 2.376±0.3081 0.9326±0.2020
TNF-a 1.183±0.1382 2.507±0.1854 1.483±0.2517
CCL3 1.080±0.2313 4.237±0.7877 0.6265±0.2487
综上述，本发明首创的发现并验证了慢性荨麻疹患者的疾病严重程度及预后和复发相关的标志物丙酮酸和马来酸，其中通过分析患者体内的丙酮酸和马来酸的代谢水平，即血液样本中的相对丰度和浓度，可准确的评估相应的疾病的严重程度，同时，以丙酮酸和马来酸的标志物组合可有效评估患者的抗组胺药物的治疗预后以及复发风险，其中：
当非靶向代谢组检测CU患者血浆样本，丙酮酸和马来酸的阈值相对丰度分别为21400000和700000，丙酮酸和马来酸的相对丰度均小于阈值的患者筛为疾病严重且治疗不佳的CU患者。
当靶向代谢组检测CU患者血浆样本，丙酮酸和马来酸的阈值浓度分别为215μM和1.55μM，丙酮酸和马来酸浓度均低于阈值的CU患者预后更差。
最后有必要在此说明的是：以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细地说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的改变、修饰、替代、组合、简化均应为等效置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (11)

1.一种用于检测慢性荨麻疹严重程度及预后评估的标志物，其特征在于，所述标志物为丙酮酸和/或马来酸。
2.丙酮酸和/或马来酸作为用于检测慢性荨麻疹严重程度和/或预后评估的标志物的用途。
3.丙酮酸和/或马来酸作为用于检测慢性荨麻疹的一线治疗用药是第二代H1抗组胺药药物疗效的标志物的用途。
4.检测丙酮酸和/或马来酸的检测试剂，在制备用于检测慢性荨麻疹的严重程度和预后评估的试剂中的用途。
5.检测丙酮酸和/或马来酸的检测试剂，在制备用于评估第二代H1抗组胺药治疗慢性荨麻疹疗效的检测试剂中的用途。
6.权利要求4或5所述的用途，其特征在于，所述丙酮酸检测试剂检测生物样本中丙酮酸的浓度和/或丰度；所述马来酸检测试剂检测生物样本中马来酸的浓度和/或丰度。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，丙酮酸和马来酸的阈值相对丰度分别为21400000和700000。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，丙酮酸和马来酸的相对丰度均小于阈值的患者筛为疾病严重且治疗不佳的慢性荨麻疹患者。
9.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，丙酮酸和马来酸的阈值浓度分别为215μM和1.55μM。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，丙酮酸和马来酸浓度均低于阈值的慢性荨麻疹患者预后差。
11.一种慢性荨麻疹的复发风险评估方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤a、分别检测患者的丙酮酸和马来酸的浓度；
步骤b、根据上述浓度，计算每个患者的复发风险评分，风险评分公式如下：
其中，i表示第i个特征，feature和Coef分别表示第i个特征在拟合模型中的数值和系数。
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