CN117821497A - 一种西伯利亚杏遗传转化方法的建立 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及植物遗传转化技术领域，特别是涉及一种西伯利亚杏遗传转化方法的建立。本发明以西伯利亚杏茎段为外植体，通过对茎段增殖培养基的优化，建立了高效的再生体系，MS培养基添加吲哚‑3‑丁酸有利于腋芽的诱导和伸长。MS培养基添加6‑BA、TDZ和NAA最适合茎段的增殖。在再生体系的基础上，建立了高效的西伯利亚杏茎段遗传转化体系，并分别用两种不同的植物表达载体进行验证。将茎段用根癌农杆菌感染液(OD600＝0.6)侵染后共培养2d后，3～4个月成功获得西伯利亚杏转基因植株。西伯利亚杏遗传转化体系的建立，对于优良基因功能的鉴定，分子机制的研究及培育综合品质良好的西伯利亚杏种质具有重要意义。

Description

一种西伯利亚杏遗传转化方法的建立
技术领域
本发明涉及植物遗传转化技术领域，特别是涉及一种西伯利亚杏遗传转化方法的建立。
背景技术
西伯利亚杏(Prunussibirica)是一种落叶灌木，属蔷薇科李属。由于其抗旱、耐寒、耐瘠薄的生物学特性，在防风固沙、生态改善中发挥重要作用。同时西伯利亚杏具有很高的经济价值，苦杏仁含有丰富的蛋白质、脂肪、总糖、粗纤维和苦杏仁苷等多种营养成分，广泛应用于食品、医药和工业领域。苦杏仁中含有人体必需的8种氨基酸，脂肪酸中不饱和脂肪酸含量占95％左右，特别是苦杏仁苷，具有防癌抗癌功能，还有止咳、祛痰、定喘等作用，是重要的中药材。同时西伯利亚杏也是一种新型木本能源植物，杏仁含油量高达50％以上，是制备生物柴油的非传统原料。
然而，西伯利亚杏长期处于野生和半野生状态，群体经济性状普遍衰退，存在开花期冻害、坐果率低、自交不亲和、雄性不育、雌蕊败育等多方面的问题，而且大小年现象十分严重，西伯利亚杏杏仁产量低而不稳成为制约其产业发展的主要瓶颈，而传统育种难以解决这些问题。另一方面，西伯利亚杏作为早春开花树种，春季霜冻(倒春寒)是严重制约其生产的最重要问题之一。在遭遇低温胁迫的地区，低于细胞死亡点的温度强制限制了杏树的经济生长，这给种植户造成了很大的生产损失。分子生物学的不断进步和基因工程技术的出现，为加快西伯利亚杏品种改良提供了新的途径。
根癌农杆菌介导的遗传转化法具有重复性高、操作简单、实验成本低、效率高等优点，是一种广泛应用且成功的植物遗传转化方法。为了从根本上提高植物的遗传转化效率，必须建立高效的植物再生体系。植物再生过程中的外植体种类、再生方式和培养基配方等因素，都将对再生效率和最终的遗传转化效率造成影响。近年来，蔷薇科果树离体再生和遗传转化研究取得了较大进展，特别是在苹果、桃和梨上转基因成功的案例较多。而杏属植物的再生和遗传转化是相对困难的。在以往的研究报道中，‘Helena’是目前仅有的通过叶片再生途径获得的转基因的商业杏品种，但这种方法高度依赖于基因型。此外，也有研究者通过成熟种子下胚轴片段中获得了不定芽再生系统并进行了转基因研究。但对西伯利亚杏的遗传转化研究还未曾报道。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种西伯利亚杏遗传转化方法的建立，本发明以西伯利亚杏无菌苗茎段为外植体，通过优化生长调节剂、浓度组合和培养条件，建立了一套高效、稳定的再生体系。本发明通过优化根癌农杆菌用量(OD600)、侵染时间和预培养等关键因素，建立了高效的西伯利亚杏遗传转化体系。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了一种西伯利亚杏遗传转化方法的建立，包括以下步骤：
1)将一年生西伯利亚杏的无菌茎段置于腋芽诱导培养基上进行腋芽诱导培养，得到腋芽；
所述腋芽诱导培养基包括：MS培养基+0.2～0.4mg/L吲哚-3-丁酸；
2)将所述步骤1)得到的腋芽处理成带有1个芽点的茎段，置于不定芽诱导培养基上进行不定芽诱导培养，得到不定芽；
所述不定芽诱导培养基包括：MS+0.1mg/L萘乙酸+0.8mg/L 6-苄氨基腺嘌呤+0.2mg/L噻苯隆；
3)将所述步骤2)得到的不定芽的单芽置于生根培养基上进行生根培养，得到再生植株；
4)将所述步骤3)得到的再生植株在生根培养基中培养3周后，将茎段在增殖分化培养基中进行预培养3d，得到预培养茎段；
5)将所述步骤4)得到的预培养茎段浸没在根癌农杆菌悬浮液中20min，得到侵染茎段；
所述根癌农杆菌悬浮液的OD600值为0.6；
所述根癌农杆菌悬浮液中根癌农杆菌含有pRI101-GFP质粒和pCAMBIA-1301-GUS质粒；
6)将所述步骤5)得到的侵染茎段置于增殖分化培养基上进行共培养2d，得到共培养物；
7)将所述步骤6)得到的共培养物置于含有300mg/L头孢和20mg/L卡那霉素的增殖分化培养基上培养，实现西伯利亚杏遗传转化。
优选的，所述步骤1)腋芽诱导培养的条件包括：温度为23～27℃，16h光照/8h黑暗，时间为15d，相对湿度为70％。
优选的，所述步骤2)不定芽诱导培养的条件包括：温度为23～27℃，16h光照/8h黑暗，时间为35d，相对湿度为70％。
优选的，所述步骤3)生根培养基包括：以QL+DKW培养基为基础培养基+1.5mg/L吲哚-3-丁酸；
所述生根培养的条件包括：温度为23～27℃，16h光照/8h黑暗，相对湿度为70％。
优选的，所述步骤4)增殖分化培养基包括：MS+0.1mg/L萘乙酸+0.8mg/L 6-苄氨基腺嘌呤+0.2mg/L噻苯隆；
所述预培养的条件包括：温度为23～27℃，16h光照/8h黑暗，相对湿度为70％。
优选的，所述步骤5)预培养茎段的长度为0.5cm。
优选的，所述步骤6)增殖分化培养基包括：MS+0.1mg/L萘乙酸+0.8mg/L 6-苄氨基腺嘌呤+0.2mg/L噻苯隆；
所述共培养的条件包括：在25℃下进行暗培养。
优选的，所述步骤7)增殖分化培养基包括：MS+0.1mg/L萘乙酸+0.8mg/L 6-苄氨基腺嘌呤+0.2mg/L噻苯隆；
所述培养的条件包括：先在温度为25℃下暗培养30d，再进行16h光照/8h黑暗培养。
本发明的有益效果为：
良好的再生体系是植物遗传转化成功的基础，本发明通过对西伯利亚杏再生体系的优化，最终确立了西伯利亚杏再生体系为选用一年生实生苗茎段为外植体，茎段腋芽的诱导培养基是MS+0.2mg/L IBA，西伯利亚杏茎段不定芽的诱导培养基为MS+0.8mg/L 6-BA+0.2mg/LTDZ+0.1mg/LNAA，西伯利亚杏的生根诱导是QL+DKW培养基添加1.5mg/L IBA。
本发明建立了一套简便、快捷、高效的农杆菌介导的西伯利亚杏遗传转化体系。该体系主要流程为将茎段在培养基上预培养3d，用农杆菌侵染液(OD600＝0.6)侵染20min。侵染后的茎段和农杆菌共培养2d后，转移到含有20mg/L Kan和300mg/L头孢的进行转基因植株的筛选，3～4个月后即可成功获得转基因植株。西伯利亚杏转化体系的建立将为后续开展基因工程的研究，分子机制的阐述及西伯利亚杏定向良种选育提供强有力的技术支撑。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为西伯利亚杏茎段外植体再生体系，(A)：西伯利亚杏1a实生苗及茎段外植体；(B)：西伯利亚杏茎段腋芽的诱导(MS+0.2mg/LIBA)；(C)：西伯利亚杏茎段不定芽的诱导(MS+0.8mg/L 6-BA+0.2mg/L TDZ+0.1mg/L NAA)；(D)西伯利亚杏的生根诱导；
图2为卡纳霉素浓度对西伯利亚杏茎段诱导不定芽的影响，(a-f)：0、5、10、20、40、50mg/L Kan处理下西伯利亚杏茎段不定芽的生长情况；
图3为头孢浓度对西伯利亚杏茎段诱导不定芽的影响，(g-l):0、100、200、300、400、500mg/L Cef处理下西伯利亚杏茎段不定芽的生长情况和农杆菌的污染情况；
图4为农杆菌介导转化条件的筛选，A：预培养时间对转化效率的影响；B：侵染时间对转化效率的影响；C：共培养时间对转化效率的影响；D：OD600浓度对转化效率的影响。通过单因素方差分析和Duncan's multiple range检验，不同的字母表示不同处理之间的显著差异(P<0.05)；
图5为转基因植株中的外源基因检测，A，GUS基因的PCR扩增。M：marker2000，CK+：阳性对照(pCAMBIA1301质粒，823bp)，CK-：阴性对照(非转基因植株)，1-11：从独立的pCAMBIA1301转基因植株中提取的西伯利亚杏基因组DNA；B，GFP基因的PCR扩增。M：marker2000,CK+：阳性对照(pRI101质粒，715bp)，CK-：阴性对照(非转基因植株)，1-11：从独立的pRI101转基因植株中提取的西伯利亚杏基因组DNA；
图6为GUS表达的组织化学染色检测，A，未转基因西伯利亚杏植株；B，pCAMBIA1301转基因西伯利亚杏植株。
具体实施方式
本发明提供了一种西伯利亚杏遗传转化方法的建立，包括以下步骤：
1)将一年生西伯利亚杏的无菌茎段置于腋芽诱导培养基上进行腋芽诱导培养，得到腋芽；
所述腋芽诱导培养基包括：MS培养基+0.2～0.4mg/L吲哚-3-丁酸；
2)将所述步骤1)得到的腋芽处理成带有1个芽点的茎段，置于不定芽诱导培养基上进行不定芽诱导培养，得到不定芽；
所述不定芽诱导培养基包括：MS+0.1mg/L萘乙酸+0.8mg/L 6-苄氨基腺嘌呤+0.2mg/L噻苯隆；
3)将所述步骤2)得到的不定芽的单芽置于生根培养基上进行生根培养，得到再生植株；
4)将所述步骤3)得到的再生植株在生根培养基中培养3周后，将茎段在增殖分化培养基中进行预培养3d，得到预培养茎段；
5)将所述步骤4)得到的预培养茎段浸没在根癌农杆菌悬浮液中20min，得到侵染茎段；
所述根癌农杆菌悬浮液的OD600值为0.6；
所述根癌农杆菌悬浮液中根癌农杆菌含有pRI101-GFP质粒和pCAMBIA-1301-GUS质粒；
6)将所述步骤5)得到的侵染茎段置于增殖分化培养基上进行共培养2d，得到共培养物；
7)将所述步骤6)得到的共培养物置于含有300mg/L头孢和20mg/L卡那霉素的增殖分化培养基上培养，实现西伯利亚杏遗传转化。
本发明将一年生西伯利亚杏的无菌茎段置于腋芽诱导培养基上进行腋芽诱导培养，得到腋芽；所述腋芽诱导培养基包括：MS培养基+0.2～0.4mg/L吲哚-3-丁酸。在本发明中，所述腋芽诱导培养的条件优选包括：温度为23～27℃，16h光照/8h黑暗，时间为15d，相对湿度为70％。
本发明将得到的腋芽处理成带有1个芽点的茎段，置于不定芽诱导培养基上进行不定芽诱导培养，得到不定芽；所述不定芽诱导培养基包括：MS+0.1mg/L萘乙酸+0.8mg/L6-苄氨基腺嘌呤+0.2mg/L噻苯隆。在本发明中，所述不定芽诱导培养的条件优选包括：温度为23～27℃，16h光照/8h黑暗，时间为35d，相对湿度为70％。
本发明将得到的不定芽的单芽置于生根培养基上进行生根培养，得到再生植株。在本发明中，所述生根培养基优选包括：以QL+DKW培养基为基础培养基+1.5mg/L吲哚-3-丁酸。在本发明中，所述生根培养的条件优选包括：温度为23～27℃，16h光照/8h黑暗，相对湿度为70％。
本发明将得到的再生植株在生根培养基中培养3周后，将茎段在增殖分化培养基中进行预培养3d，得到预培养茎段。在本发明中，所述增殖分化培养基优选包括：MS+0.1mg/L萘乙酸+0.8mg/L 6-苄氨基腺嘌呤+0.2mg/L噻苯隆。在本发明中，所述预培养的条件优选包括：温度为23～27℃，16h光照/8h黑暗，相对湿度为70％。
本发明将得到的预培养茎段浸没在根癌农杆菌悬浮液中20min，得到侵染茎段；所述根癌农杆菌悬浮液的OD600值为0.6；所述根癌农杆菌悬浮液中根癌农杆菌含有pRI101-GFP质粒和pCAMBIA-1301-GUS质粒。在本发明中，所述根癌农杆菌优选为根癌农杆菌GV3101，所述根癌农杆菌GV3101含有pRI101-GFP质粒和pCAMBIA-1301-GUS质粒，本发明优选通过冻融法将所述pRI101-GFP质粒和pCAMBIA-1301-GUS质粒转化到根癌农杆菌GV3101中。在本发明中，所述预培养茎段的长度优选为0.5cm。
本发明将得到的侵染茎段置于增殖分化培养基上进行共培养2d，得到共培养物。在本发明中，所述增殖分化培养基优选包括：MS+0.1mg/L萘乙酸+0.8mg/L6-苄氨基腺嘌呤+0.2mg/L噻苯隆。在本发明中，所述共培养的条件优选包括：在25℃下进行暗培养。
本发明将得到的共培养物置于含有300mg/L头孢和20mg/L卡那霉素的增殖分化培养基上培养，实现西伯利亚杏遗传转化。在本发明中，所述增殖分化培养基优选包括：MS+0.1mg/L萘乙酸+0.8mg/L 6-苄氨基腺嘌呤+0.2mg/L噻苯隆。在本发明中，所述培养的条件优选包括：先在温度为25℃下暗培养30d，再进行16h光照/8h黑暗培养。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明进行详细的描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1材料与方法
1.1试验材料
西伯利亚杏一年生茎段采自中国辽宁省沈阳市沈阳农业大学北山科研基地(41°49'55"N，123°34'6"E)。茎段在流水下冲洗1h后用75％(v/v)酒精灭菌30s，并用无菌水冲洗3次，然后浸入0.1％HgCL2中3min，随后在无菌水中冲洗三次，每次5分钟。最后，茎段被转移到Murashige and Skoog(MS)培养基上(Murashige and Skoog,1962)，培养基中含有3％的蔗糖，0.2mg/L吲哚-3-丁酸(IBA)和0.7％的琼脂。所有培养基均调节pH值至5.8，121℃灭菌20min，25±2℃，光照16h光照/8h黑暗，相对湿度70％。
1.2.西伯利亚杏植株再生
1.2.1腋芽诱导
幼嫩茎段消毒后，选择消毒成功的外植体接种到含有不同浓度IBA的MS启动培养基上，研究不同浓度的IBA对西伯利亚杏腋芽诱导的影响。IBA浓度分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8mg/L。试验共5个处理，每个处理接种30个茎段，每个处理重复3次。观察并记录腋芽生长状况，15d左右统计萌发率。
1.2.2茎段增殖培养
将诱导出的腋芽剪成0.5cm的带有1个芽点的茎段分别接种到8种增殖培养基中：MS+0.1mg/L 1-naphthlcetic acid(NAA)+0.5mg/L 6-benzylaminopurine(6-BA)、MS+0.2mg/L NAA+0.5mg/L 6-BA、MS+0.1mg/L NAA+1.0mg/L6-BA、MS+0.2mg/LNAA+0.5mg/L6-BA+0.2mg/Lthidiazuron(TDZ)、MS+0.1mg/LNAA+0.8mg/L 6-BA+0.2mg/LTDZ、WoodyPlantMedium(WPM)(Lloyd andMcCown,1980)+0.1mg/LNAA+1.0mg/L 6-BA、WPM+0.1mg/LNAA+0.5mg/L 6-BA和QL macronutrients(Quoirin and Lepoivre,1977)and DKWmicronutrients,vitamins andorganic compounds(DriverandKuniyuki,1984)+0.1mg/LNAA+0.8mg/L 6-BA+0.2mg/LTDZ。每个处理接种30个茎段，每个处理重复3次。培养35d后记录增殖倍数，并对最佳增殖培养基进行评价。
1.2.3生根培养
选择增殖培养获得的2cm左右不定芽生芽，剪取单芽接转移到混合QL常量营养素和DKW微量营养素，维生素和有机化合物培养基，添加1.5mg/LIBA诱导生根和2000倍木醋液，直到根长到3～5cm。驯化步骤参照Zare Khafri等人的报告进行(Zare Khafri et al.,2021)。
1.3外植体对抗生素的敏感性
未转化的茎段外植体在最佳培养基中培养，如第1.2.3节所述，并添加卡那霉素(Kan)(0、5、10、15、20和30mg/L)。用0、50、100、200、300和400mg/L的Cef单独培养感染农杆菌的叶外植体。每个处理包含30个外植体，重复3次。45d后，在不同的选择压力下记录不定芽数和根癌农杆菌感染情况。
1.4质粒载体和根癌农杆菌菌株
本研究中使用的质粒为pRI101-GFP和pCAMBIA-1301-GUS。pRI101含有一个绿色荧光蛋白(GFP)基因作为报告基因，而pCAMBIA1301含有一个β-galactosidase(GUS)报告基因。将质粒pRI101和pCAMBIA-1301分别通过冻融法转移到根癌杆菌GV3101中(Holsters etal.,1978)。
转化前，根癌农杆菌在含50mg/L卡那霉素和25mg/L利福平的YEP培养基(酵母提取物10g/L，蛋白胨10g/L,NaCl 5g/L，琼脂15g/L,pH 7.0)在28℃培养箱中倒置培养2d。将单个菌落接种在含有相同抗生素的50mL液体YEP培养基中，并在恒温振荡培养箱中28℃、200rpm培养一夜。细菌离心后重悬至OD600＝0.6左右，加入含乙酰丁香酮(100μM)的半浓度MS液体培养基。
1.5影响转化频率因素的评价
继代增殖培养3周的茎段用于转化。针对转化频率评价了以下4个因素：农杆菌浓度(OD 600＝0.4、0.6和0.8)、感染持续时间(10、20和30min)、共培养持续时间(1、2和3d)，以及在用于侵染茎段在增殖分化培养基中预培养时间(0、1、2和3d)。将切割成约0.5cm的茎段浸没在农杆菌悬浮液中，定期轻微摇动，然后用无菌滤纸吸干以除去过量的细菌悬浮液。然后将感染的茎段置于增殖分化培养基(T5)上进行共培养。在25℃的黑暗培养箱中共培养后，将外植体收集在无菌瓶中，用无菌水洗涤至液体澄清，然后用含有300mg/L Cef的无菌水浸泡7次，每次10min，以控制农杆菌的生长。然后将外植体转移到含有300mg/L Cef和20mg/L Kan的最佳增殖培养基(T5)中，以诱导Kan抗性芽的生长。在25℃的生长室中暗培养30d，记录根癌农杆菌污染情况和不定芽存活数量，然后进行16/8h光/暗循环培养。
1.6转基因植物的鉴定
将pCAMBIA-1301转化的转基因植株浸泡在含有10mM EDTA、2mM X-Gluc和0.1％Triton X100的磷酸盐缓冲液(50mM,pH 7.0)中，在37℃避光浸泡16h。非转基因植物作为对照。然后，这些组织在80％的乙醇中脱色。pRI101转化后的组织通过荧光体视显微镜进行观察。
遗传转化3周后，采集转基因和非转基因植物的叶片用于PCR分析。利用CTAB(cetyltrimethylammoniumbromide)法提取基因组DNA。使用西伯利亚杏基因组DNA作为模板，检测GFP基因(715bp)，引物为GFP-F(SEQ ID No.1):5’-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3′和GFP-R(SEQ ID No.2):5’-TGTACAGCTCGTCCATGCCG-3′，使用引物对(SEQ ID No.3：5’-ATACCGAAAGGTTGGGCAGG-3’和SEQ ID No.4：5’-TCACCACGATGCCATGTTCA-3’)扩增GUS基因片段(823bp)。
1.7统计分析
所有数据均采用单因素方差分析(ANOVA)进行统计学分析。差异的显著性通过Duncan’s多重范围检验(p<0.05)和Student’s t检验(*表示p<0.05，**表示p<0.01)。
不定芽再生率＝接种外植体数和不定芽的叶片外植体数量/总外植体数量×100％。每个外植体的芽数＝外植体产生的芽数/产生芽的外植体总数。转化植株频率＝正转化植株总数/假设转化植株总数×100％。数据采用单因素方差分析进行统计分析。均数间的统计学差异采用Duncan's multiple range test,SPSS24.0软件进行分析。P<0.05，差异有统计学意义。
2结果与分析
2.1生长调节剂对茎段腋芽诱导的影响
将西伯利亚杏茎段外植体置于添加不同浓度IBA的MS培养基上，腋芽诱导情况如表1所示。腋芽诱导率在不同处理间有显著差异，诱导率在35.00％～85.83％，随着IBA浓度的升高呈现先增加后降低的趋势。其中，在0.2mg/L IBA处理下，腋芽诱导率最高(85.83％)且萌发早，接种6～9d芽点即开始萌动，第20天左右形成2～4cm小绿梢，叶片自然舒展，生长状况良好。IBA浓度过高(>0.2mg/L)会导致腋芽诱导率显著降低，腋芽长势较差，节间不易伸长。因此，西伯利亚杏茎段腋芽诱导的最佳IBA浓度为0.2mg/L。
表1 IBA对茎段腋芽诱导的影响。
符号表示 IBA/(mg/L) 诱导率(％)
Y1 0 51.67±1.44c
Y2 0.2 85.83±2.89a
Y3 0.4 73.33±2.89b
Y4 0.6 50.83±3.82c
Y5 0.8 35.00±2.50d
2.2不同基础培养基类型及生长调节剂浓度对腋芽增殖的影响
在本实施例中发现3种基本培养基(MS、WPM和QL+DKW)中西伯利亚杏茎段的增殖和不定芽的生长状况有着明显的差异。如表2显示，在WPM培养基(T6、T7)上不定芽容易出现玻璃化现象，特别是随着6-BA浓度提高，不定芽的玻璃化现象更加严重，并且茎段基部产生较多的不能分化的愈伤组织团，无法用于后续实验。同时，本发明发现QL+DKW培养基(T8)不适合茎段直接诱导不定芽，增殖系数低(1.51)，但更适合用于茎段诱导愈伤组织，因为本发明观察到在T8培养基中的茎段的基部产生较大的绿色愈伤组织，并且在持续30d的培养下愈伤组织出现分化不定芽的迹象。MS基础培养(T1-T5)相比于WPM和QL+DKW基本培养基基更适合西伯利亚杏茎段的增殖，不定芽叶片绿色且生长健壮。研究结果表明，不同浓度的激素配比(NAA、6-BA、TDZ)对西伯利亚杏茎段的增殖具有不同程度的促进作用。在含有0.8mg/L6-BA、0.2mg/LTDZ和0.1mg/LNAA的培养基上，茎段不定芽增殖系数最高(6.53)。6-BA和TDZ的联合作用显著提高了茎段的增殖系数。因此本发明选择MS+0.8mg/L6-BA+0.2mg/L TDZ+0.1mg/LNAA(T5)作为茎段增殖培养基进行下一步研究。
表2基础培养基类型和激素对西伯利亚杏茎段增殖的影响
良好的再生体系是植物遗传转化成功的基础，通过对西伯利亚杏再生体系的优化，最终确立了西伯利亚杏再生体系为选用一年生实生苗茎段为外植体(图1中A)，茎段腋芽的诱导培养基是MS+0.2mg/L IBA(图1中B)，西伯利亚杏茎段不定芽的诱导培养基为MS+0.8mg/L 6-BA+0.2mg/L TDZ+0.1mg/L NAA(图1中C)，西伯利亚杏的生根诱导是QL+DKW培养基添加1.5mg/L IBA(图1中D)。
2.3抗生素最佳浓度的确定
2.3.1Kan对西伯利亚杏再生速率的影响
在不含Kan的培养基上培养，茎段外植体健康，20天内产生不定芽。随着Kan浓度的增加，抑制作用更明显，茎段外植体不再产生不定芽，甚至导致外植体变白和死亡。Kan浓度为10mg/L时，茎段外植体再生受到明显抑制，但有部分外植体在该浓度下存活，因此不能作为抗性细胞筛选的Kan浓度。当浓度大于或等于20mg/L时，完全丧失分化能力，外植体分化率为零，4周后直接死亡，而带有Kan抗性的转基因植株将会存活。因此，Kan浓度为20mg/L时，是筛选西伯利亚杏转基因株系的最佳浓度(图2)。
2.3.2Cef对西伯利亚杏再生速率的影响
本实施例在选择培养过程中，添加不同浓度的Cef抑制根癌农杆菌的生长。结果表明，当Cef浓度小于或等于200mg/L时不能达到有效的抑菌效果，根癌农杆菌杆菌污染严重；当Cef浓度增加到300mg/L时，抗菌效果良好，茎段再生率高达86.67％。Cef浓度为400mg/L和500mg/L也有良好的抗菌效果，但西伯利亚杏茎段的再生会受到Cef明显抑制，不定芽数量随Cef浓度的增加而减少。300mg/L的Cef浓度对茎段再生无显著影响，抑菌效果良好。因此，300mg/L Cef被确定为诱导不定芽的最佳浓度(图3)。
2.4农杆菌介导遗传转化最佳条件的筛选
2.4.1预培养时间对转化效率的影响
本实施例选择了四个西伯利亚杏外植体预培养时间(0d、1d、2d和3d)。研究结果表明，随着与预培养时间的增加转化效率逐渐提高，预培养3d时外植体转化效率显著高于0d、1d和2d，达到68％(图4中A)。因此，在后续试验中选择3d作为最佳的预培养天数。
2.4.2侵染时间对转化效率的影响
根癌农杆菌对外植体的侵染时间直接影响着遗传转化的效率。本实施例结果表明(图4中B)，侵染时间为10min时，会产生较多的非抗性芽，这些非抗性芽在选择培养基中会逐渐死亡，导致转化效率较低。侵染时间为30min时，外植体染菌情况严重，农杆菌在共培养期间大量繁殖，导致外植体死亡。而农杆菌侵染20min的外植体能够在选择培养基中产生大量的具有抗性的再生芽。因此，最佳农杆菌侵染时间为20min。
2.4.3共培养时间的影响
在确定最佳侵染时间前提下，对共培养时间进行优化筛选，结果如图4中C所示。当外植体和农杆菌共培养3天后，外植体已经出现农杆菌的污染，转化效率较低(55.56％)。共培养2d后外植体转化效率最高(71.11％)，显著高于共培养1d和3d，并且在该时间内未出现明显的农杆菌污染，外植体生长良好。因此，共培养2d为最佳时间。
2.4.4OD600对转化效率的影响
农杆菌的OD600值对转化效率提高具有重要作用。当农杆菌OD600分别为0.4、0.6、0.8时，将茎段在最佳侵染时间(20min)下进行遗传转化。结果表明，不同农杆菌OD600对转化频率具有显著影响。当OD600值为0.6时，外植体转化效率最高，并且未出现农杆菌污染的情况。因此，选择OD600＝0.6的值进行后续遗传转化试验(图4中D)。
2.5转基因植株的鉴定
为了确认外源基因是否整合到转基因植物的基因组中，首先提取西伯利亚杏转基因植株基因组DNA，用PCR方法进行分析，非转基因植物作为对照。在所有GUS染色阳性的转基因植株上都出现了与GUS基因片段长度相对应的约823bp的电泳条带，而非转基因植株在相同位置没有出现条带(图5中A)。同样，在所有转化GFP基因的植株中均扩增出715bp的GFP片段，而在非转基因植株中未扩增出(图5中B)。结果表明，外源基因已成功转入整合到西伯利亚杏基因组中。
为了进一步验证外源基因的成功转化，使用GUS组织化学方法验证测试pCambia1301转化植株。用X-gluc试剂染色，在未转化的组织中未观察到GUS的蓝色染色(图6中A)，而在阳性转基因组织中观察到GUS的蓝色染色(图6中B)。
3结论
综上所述，本文建立了一套简便、快捷、高效的农杆菌介导的西伯利亚杏遗传转化体系。该体系主要流程为将茎段在培养基上预培养3d，用农杆菌侵染液(OD600＝0.6)侵染20min。侵染后的茎段和农杆菌共培养2d后，转移到含有20mg/LKan和300mg/L Cef的培养基中进行转基因植株的筛选，3～4个月后即可成功获得转基因植株。西伯利亚杏转化体系的建立将为后续开展基因工程的研究，分子机制的阐述及西伯利亚杏定向良种选育提供强有力的技术支撑。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (8)

1.一种西伯利亚杏遗传转化方法的建立，其特征在于，包括以下步骤：
1)将一年生西伯利亚杏的无菌茎段置于腋芽诱导培养基上进行腋芽诱导培养，得到腋芽；
所述腋芽诱导培养基包括：MS培养基+0.2～0.4mg/L吲哚-3-丁酸；
2)将所述步骤1)得到的腋芽处理成带有1个芽点的茎段，置于不定芽诱导培养基上进行不定芽诱导培养，得到不定芽；
所述不定芽诱导培养基包括：MS+0.1mg/L萘乙酸+0.8mg/L 6-苄氨基腺嘌呤+0.2mg/L噻苯隆；
3)将所述步骤2)得到的不定芽的单芽置于生根培养基上进行生根培养，得到再生植株；
4)将所述步骤3)得到的再生植株在生根培养基中培养3周后，将茎段在增殖分化培养基中进行预培养3d，得到预培养茎段；
5)将所述步骤4)得到的预培养茎段浸没在根癌农杆菌悬浮液中20min，得到侵染茎段；
所述根癌农杆菌悬浮液的OD600值为0.6；
所述根癌农杆菌悬浮液中根癌农杆菌含有pRI101-GFP质粒和pCAMBIA-1301-GUS质粒；
6)将所述步骤5)得到的侵染茎段置于增殖分化培养基上进行共培养2d，得到共培养物；
7)将所述步骤6)得到的共培养物置于含有300mg/L头孢霉素(Cef)和20mg/L卡那霉素的增殖分化培养基上培养，实现西伯利亚杏遗传转化。
2.根据权利要求1所述的西伯利亚杏遗传转化方法的建立，其特征在于，所述步骤1)腋芽诱导培养的条件包括：温度为23～27℃，16h光照/8h黑暗，时间为15d，相对湿度为70％。
3.根据权利要求1所述的西伯利亚杏遗传转化方法的建立，其特征在于，所述步骤2)不定芽诱导培养的条件包括：温度为23～27℃，16h光照/8h黑暗，时间为35d，相对湿度为70％。
4.根据权利要求1所述的西伯利亚杏遗传转化方法的建立，其特征在于，所述步骤3)生根培养基包括：以QL+DKW培养基为基础培养基+1.5mg/L吲哚-3-丁酸；
所述生根培养的条件包括：温度为23～27℃，16h光照/8h黑暗，相对湿度为70％。
5.根据权利要求1所述的西伯利亚杏遗传转化方法的建立，其特征在于，所述步骤4)增殖分化培养基包括：MS+0.1mg/L萘乙酸+0.8mg/L 6-苄氨基腺嘌呤+0.2mg/L噻苯隆；
所述预培养的条件包括：温度为23～27℃，16h光照/8h黑暗，相对湿度为70％。
6.根据权利要求1所述的西伯利亚杏遗传转化方法的建立，其特征在于，所述步骤5)预培养茎段的长度为0.5cm。
7.根据权利要求1所述的西伯利亚杏遗传转化方法的建立，其特征在于，所述步骤6)增殖分化培养基包括：MS+0.1mg/L萘乙酸+0.8mg/L 6-苄氨基腺嘌呤+0.2mg/L噻苯隆；
所述共培养的条件包括：在25℃下进行暗培养。
8.根据权利要求1所述的西伯利亚杏遗传转化方法的建立，其特征在于，所述步骤7)增殖分化培养基包括：MS+0.1mg/L萘乙酸+0.8mg/L 6-苄氨基腺嘌呤+0.2mg/L噻苯隆；
所述培养的条件包括：先在温度为25℃下暗培养30d，再进行16h光照/8h黑暗培养。
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