CN117821240A - 一种基于超声波技术的细胞培养污染快速鉴定系统及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于超声波技术的细胞培养污染快速鉴定系统及方法，系统包括恒温存放单元、鉴定单元、观察单元及废弃物处理单元，恒温存放单元用于存放未经鉴定的原细胞培养皿，鉴定单元用于试样提取、生成超声波、试样与试剂反应，观察单元用于观察已经与检测试剂反应的试样状态，废弃物处理单元，用于处理经过观察后的试样及多余试样。方法包括提取若干试样、检测试剂滴入试样、进行超声波振荡、静置后观察试样并丢弃试样。本发明相较于传统的细胞培养污染鉴定方法，利用超声波技术实现对于样本的快速振荡，使得试剂与试样融合过程加快，虽然过程中可能会破坏细胞原有的结构，但能够减少鉴定等待时间，从而节约实验成本。
Description
技术领域
本发明涉及微生物污染鉴定系统及方法领域，具体涉及用于医学实验室或生物实验室的一种基于超声波技术的细胞培养污染快速鉴定系统及方法。
背景技术
细胞培养技术通常用于医学和生物实验室，用于进行微生物的生化研究，对现如今的生物及医学领域有着重大贡献，有助于科研人员研制出更多具有针对性的细胞类抗癌症、病毒、细菌的药物，但是，在细胞培养过程中，需要对环境有着严格的要求，稍有不慎便会使得细胞遭受污染，进而影响实验进度。
学术界将细胞污染定义为，凡是混入培养环境中，对细胞生存有害的成分和造成细胞不纯的异物，都应当视为污染，包括细菌、真菌、支原体、病毒、异种培养物和化学物质等，针对细胞污染，实验室内常用如酚红、荧光染色法等方法对细胞培养基内的细胞培养液进行滴定，之后通过静置或者离心操作，通过显微镜或者肉眼观察结果，进而判定细胞在培养过程中是否受到污染。
而超声波技术经常用于微生物培养过程中，现有技术公开了一种基于超声体波在毛细管中三维细胞培养的方法，该方法用毛细管作为细胞培养载体，将细胞悬液及各种溶液注入毛细管中，通过超声波使其聚集为细胞团块，进而进一步培养，但是在细胞污染检测领域内，极少有将超声波应用至此的案例，且传统的细胞污染检测方法耗费时间较长，通常需要静置48小时至72小时才能得到结果，静置时间较长，影响实验进度。
发明内容
本发明针对上述问题，提供一种基于超声波技术的细胞培养污染快速鉴定系统及方法，解决了传统细胞污染检测方法耗时较长，影响实验进度等问题。
本发明采用的技术方案为：一种基于超声波技术的细胞培养污染快速鉴定系统及方法，所述的基于超声波技术的细胞培养污染快速鉴定系统包括：
恒温存放单元，用于存放未经鉴定的原细胞培养皿；
鉴定单元，包括试样提取模块、反应模块及超声波生成模块；
所述试样提取模块用于从原细胞培养皿中提取若干相同规格的试样并制备可观察样本；
所述反应模块，用于将试样与检测试剂相混合，使检测试剂溶入试样的细胞悬液内，进而标注出试样内部受污染区域；
所述超声波生成模块可产生不同频率的超声波，用于加速检测试剂与细胞培养液的混合，同时能够破坏污染物的细胞壁，加速检测试剂进入污染物从而进行污染物标记；
观察单元，包括电学观察模块及光学观察模块，用于观察已与检测试剂反应的试样状态；
废弃物处理单元，用于处理经过观察后的试样及多余试样。
进一步地，所述恒温存放单元包括若干独立封闭的小型培养箱，培养箱通过恒温存放单元包括的温控模块控制培养箱内温度；
所述温控模块可对恒温存放单元整体进行温度控制，也可单独对各培养箱实现独立温度控制；
所述培养箱内环境参数为：温度为37℃，二氧化碳浓度为5％，氧气浓度95％，PH＝7.2-7.4，所述环境参数仅为大多种类的细胞适宜生存的温度，在实际情况中可根据培养细胞种类的不同进而做出变动。
更进一步地，所述试样提取模块中，提取若干相同规格的试样的目的在于进行多种不同污染源检测实验，以判断该原细胞株所受污染种类；
提取后的多余试样应立即丢弃至废弃物处理单元，避免对原细胞培养皿的二次污染。
更进一步地，所述反应模块可独立于超声波生成模块进行检测，但相较于超声波生成模块与反应模块相配合的实验，独立检测的反应模块效率下降、实验时间变长。
更进一步地，所述可观察样本载体为载玻片、所述试样载体为试管、烧杯及其他具有高透明度耐腐蚀的容器。
更进一步地，所述电学观察模块包括电子显微镜及荧光显微镜，用于对细胞悬液的高倍数下的观察，以及对使用荧光标记法的细胞悬液进行观察；
所述光学观察模块包括光学显微镜，用于进行低倍数下对于细胞悬液的观察。
更进一步地，所述的基于超声波技术的细胞培养污染快速鉴定方法包括：
S1：对所述恒温单元、鉴定单元及观察单元均进行彻底消杀处理，将需进行鉴定的细胞培养皿放入恒温箱，根据该细胞株生长的适宜环境参数进行调整；
S2：选定需要鉴定是否被污染的细菌培养基，取出后通过滴管向若干试管或烧杯中滴入相同规格的试样，将全新的细胞悬液以相同规格滴入试样中，进行搅拌；
S3：将鉴定不同污染源的不同检测试剂依次滴入制备好的试样中，制备出待检测试样，将待检测试样放入反应模块中；
S4：开启超声波生成模块，并根据实际情况调整产生超声波的频率，对放入反应模块的待检测试样进行超声波振荡；
S5：待检测试样振荡30min-60min，将其放置于空置的培养箱中静置12h-24h；
S6：将静置后的待检测试样提取后置于载玻片上，上盖盖玻片并排出气泡，制备待检测样本，将待检测样本分别置于光学显微镜及电子显微镜下并进行污染源观察；
S7：观察后得出原细胞培养皿内的污染物种类，并将已检测的样本进行消杀处理后立即丢弃至废弃物处理单元。
更进一步地，当检测目标为被支原体污染的细胞培养基时，检测试剂为特异荧光染料，需要将电学观察模块中的电子显微镜替换为荧光显微镜。
本发明的优点：
本发明相较于传统的细胞培养污染鉴定方法，利用超声波技术实现对于样本的快速振荡，使得试剂与试样融合过程加快，虽然过程中可能会破坏培养细胞原有的结构，但是因为本发明的检测过程是在原培养皿中提取出少量试样进行检测的，故对原细胞培养皿的影响较少，本发明能够减少鉴定等待时间，从而节约实验成本。
除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将参照图，对本发明作进一步详细的说明。
附图说明
构成本申请的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1是依本发明的基于超声波技术的细胞培养污染快速鉴定系统结构示意图；
图2是依本发明的基于超声波技术的细胞培养污染快速鉴定方法流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
参考图1，所述的基于超声波技术的细胞培养污染快速鉴定系统包括：
恒温存放单元，用于存放未经鉴定的原细胞培养皿，在此需要说明的是，采用市售的恒温存放装置；
鉴定单元，包括试样提取模块、反应模块及超声波生成模块；
所述试样提取模块用于从原细胞培养皿中提取若干相同规格的试样并制备可观察样本，在此需要说明的是，提取相同规格的试样的目的在于，保证原细胞培养基不受污染，同时能够保证取样若干次，进行若干次相同或不同检测试剂的检验，减少试样误差的同时判断其他污染物是否存在；
所述反应模块，用于将试样与检测试剂相混合，使检测试剂溶入试样的细胞悬液内，进而标注出试样内部受污染区域；
所述超声波生成模块可产生不同频率的超声波，用于加速检测试剂与细胞培养液的混合，同时能够破坏污染物的细胞壁，加速检测试剂进入污染物从而进行污染物标记，需要说明的是，在此模块中，使用的仪器为型号为Sonics VCX150PB的超声波破碎仪，功率为150W，标配有3mm节级探头，输出频率为20KHZ，能够满足本申请中关于细胞培养污染快速鉴定系统中的超声波生成模块的要求，频率要求已经达到破坏污染物的细胞壁的频率；
观察单元，包括电学观察模块及光学观察模块，用于观察已与检测试剂反应的试样状态；
废弃物处理单元，用于处理经过观察后的试样及多余试样。
所述恒温存放单元包括若干独立封闭的小型培养箱，培养箱通过恒温存放单元包括的温控模块控制培养箱内温度；
所述温控模块可对恒温存放单元整体进行温度控制，也可单独对各培养箱实现独立温度控制；
所述培养箱内环境参数为：温度为37℃，二氧化碳浓度为5％，氧气浓度95％，PH＝7.2-7.4，所述环境参数仅为大多种类的细胞适宜生存的温度，在实际情况中可根据培养细胞种类的不同进而做出变动。
所述试样提取模块中，提取若干相同规格的试样的目的在于进行多种不同污染源检测实验，以判断该原细胞株所受污染种类；
提取后的多余试样应立即丢弃废弃物处理单元，避免对原细胞培养皿的二次污染，需要说明的是，在丢弃至废弃物处理单元之前，需要对多余试样进行灭活处理，防止细菌滋生以污染其他正常的细胞培养皿。
所述反应模块可独立于超声波生成模块进行检测，但相较于超声波生成模块与反应模块相配合的实验，独立检测的反应模块效率下降、实验时间变长，即反应模块独立检测时，为传统的细胞培养污染检测过程。
所述可观察样本载体为载玻片、所述试样载体为试管、烧杯及其他具有高透明度耐腐蚀的容器，需要说明的是，在不同检测过程中，可能需要更换不同的可观察样本的载体，不仅仅为普通的载玻片。
所述电学观察模块包括电子显微镜及荧光显微镜，用于对细胞悬液的高倍数下的观察，以及对使用荧光标记法的细胞悬液进行观察；
所述光学观察模块包括光学显微镜，用于进行低倍数下对于细胞悬液的观察，需要在此说明的是，光学观察模块不仅仅包括光学显微镜，还包括相差显微镜。
参考图2，本发明还包括一种基于超声波技术的细胞培养污染快速鉴定方法，包括：
S1：对所述恒温单元、鉴定单元及观察单元均进行彻底消杀处理，将需进行鉴定的细胞培养皿放入恒温箱，根据该细胞株生长的适宜环境参数进行调整；
S2：选定需要鉴定是否被污染的细菌培养基，取出后通过滴管向若干试管或烧杯中滴入相同规格的试样，将全新的细胞悬液以相同规格滴入试样中，进行搅拌；
S3：将鉴定不同污染源的不同检测试剂依次滴入制备好的试样中，制备出待检测试样，将待检测试样放入反应模块中；
S4：开启超声波生成模块，并根据实际情况调整产生超声波的频率，对放入反应模块的待检测试样进行超声波振荡；
S5：待检测试样振荡30min-60min，将其放置于空置的培养箱中静置12h-24h；
S6：将静置后的待检测试样提取后置于载玻片上，上盖盖玻片并排出气泡，制备待检测样本，将待检测样本分别置于光学显微镜及电子显微镜下并进行污染源观察；
S7：观察后得出原细胞培养皿内的污染物种类，并将已检测的样本进行消杀处理后立即丢弃至废弃物处理单元。
当检测目标为被支原体污染的细胞培养基时，检测试剂为特异荧光染料，需要将电学观察模块中的电子显微镜替换为荧光显微镜。
本发明提供了一种基于超声波技术的细胞培养污染快速鉴定系统及方法，在需要进行细胞培养污染检测时，将检测试剂溶入细胞培养基后放置于反应模块，通过超声波对其进行振荡，使得检测试剂能够加速与被污染物相融合，从而使得被污染物显影更加快速，减少实验时间。
本发明的一实施例中，针对疑似被细菌污染的细胞培养基，可以通过目测的方式筛选，大多数细菌污染可以改变原有细胞培养液的PH，使得培养液变浑浊、变色，通过光学观察模块中的光学显微镜或者相差显微镜，能够观察到大量的点状细菌颗粒漂浮，培养背景模糊，细胞发生病理性改变、细胞内部颗粒增多，最后细胞脱落死亡，需要注意的是，如果细胞之间有丝状、管状、树枝状或者卵形的物质，常常为真菌感染；
当需要证实培养的细胞有细菌污染但是无法通过目测观察到时，取细胞悬液进行离心(现有技术，本发明在此不在叙述)，得到沉淀后，用PBS(中文名称为磷酸缓冲盐溶液，主要成分为氯化钾、氯化钠、磷酸二氢钾等，一般用于溶解保护试剂)漂洗2-3次，将无抗生素的培养液(一般为普通肉汤或者未加双抗药物的培养液)加入沉淀，之后进行冰浴超声波振荡(振荡时间15-20min，如果超声时出现黑色沉淀，说明超声功率太强，超声时间不应过长，时间过长易对蛋白活性产生影响)，如果培养的细胞受到污染，便会在一段时间后获得阳性结果。
本发明的第二实施例中，针对疑似被支原体污染的细胞培养基，可以通过荧光染色法进行检测，具体检测步骤为：
对细胞进行培养，等到待测的细胞培养至传代水平，将细胞消化后接种在含有玻片的细胞板中，当细胞汇合程度达到60％左右时，进行检测；
将细胞板中的培养液吸出，取出载玻片，用PBS漂洗2-3次；
对漂洗后的玻片加入适量固定液，室温放置10min；
再次用PBS漂洗2-3次；
加入适量荧光染料(常用荧光染料为Hoechst 33258，能够与DNA特异结合，可使得支原体内部的DNA着色)，在室温下放置10min；
再次用PBS漂洗2-3次；
待玻片晾干后，向玻片上滴加少量抗荧光猝灭剂，在电学观察模块中的荧光显微镜下进行观察，得出结论。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种基于超声波技术的细胞培养污染快速鉴定系统，其特征在于，所述的基于超声波技术的细胞培养污染快速鉴定系统包括：
恒温存放单元，用于存放未经鉴定的原细胞培养皿；
鉴定单元，包括试样提取模块、反应模块及超声波生成模块；
所述试样提取模块用于从原细胞培养皿中提取若干相同规格的试样并制备可观察样本；
所述反应模块，用于将试样与检测试剂相混合，使检测试剂溶入试样的细胞悬液内，进而标注出试样内部受污染区域；
所述超声波生成模块可产生不同频率的超声波，用于加速检测试剂与细胞培养液的混合，同时能够破坏污染物的细胞壁，加速检测试剂进入污染物从而进行污染物标记；
观察单元，包括电学观察模块及光学观察模块，用于观察已与检测试剂反应的试样状态；
废弃物处理单元，用于处理经过观察后的试样及多余试样。
2.根据权利要求1所述的基于超声波技术的细胞培养污染快速鉴定系统，其特征在于，所述恒温存放单元包括若干独立封闭的小型培养箱，培养箱通过恒温存放单元包括的温控模块控制培养箱内温度；
所述温控模块可对恒温存放单元整体进行温度控制，也可单独对各培养箱实现独立温度控制；
所述培养箱内环境参数为：温度为37℃，二氧化碳浓度为5％，氧气浓度95％，PH＝7.2-7.4，所述环境参数仅为大多种类的细胞适宜生存的温度，在实际情况中可根据培养细胞种类的不同进而做出变动。
3.根据权利要求1所述的基于超声波技术的细胞培养污染快速鉴定系统，其特征在于，所述试样提取模块中，提取若干相同规格的试样的目的在于进行多种不同污染源检测实验，以判断该原细胞株所受污染种类；
提取后的多余试样应立即丢弃废弃物处理单元，避免对原细胞培养皿的二次污染。
4.根据权利要求1所述的基于超声波技术的细胞培养污染快速鉴定系统，其特征在于，所述反应模块可独立于超声波生成模块进行检测，但相较于超声波生成模块与反应模块相配合的实验，独立检测的反应模块效率下降、实验时间变长。
5.根据权利要求1所述的基于超声波技术的细胞培养污染快速鉴定系统，其特征在于，所述可观察样本载体为载玻片、所述试样载体为试管、烧杯及其他具有高透明度耐腐蚀的容器。
6.根据权利要求1所述的基于超声波技术的细胞培养污染快速鉴定系统，其特征在于，所述电学观察模块包括电子显微镜及荧光显微镜，用于对细胞悬液的高倍数下的观察，以及对使用荧光标记法的细胞悬液进行观察；
所述光学观察模块包括光学显微镜，用于进行低倍数下对于细胞悬液的观察。
7.一种基于超声波技术的细胞培养污染快速鉴定方法，其特征在于，所述方法包括：
S1：对所述恒温单元、鉴定单元及观察单元均进行彻底消杀处理，将需进行鉴定的细胞培养皿放入恒温箱，根据该细胞株生长的适宜环境参数进行调整；
S2：选定需要鉴定是否被污染的细菌培养基，取出后通过滴管向若干试管或烧杯中滴入相同规格的试样，将全新的细胞悬液以相同规格滴入试样中，进行搅拌；
S3：将鉴定不同污染源的不同检测试剂依次滴入制备好的试样中，制备出待检测试样，将待检测试样放入反应模块中；
S4：开启超声波生成模块，并根据实际情况调整产生超声波的频率，对放入反应模块的待检测试样进行超声波振荡；
S5：待检测试样振荡30min-60min，将其放置于空置的培养箱中静置12h-24h；
S6：将静置后的待检测试样提取后置于载玻片上，上盖盖玻片并排出气泡，制备待检测样本，将待检测样本分别置于光学显微镜及电子显微镜下并进行污染源观察；
S7：观察后得出原细胞培养皿内的污染物种类，并将已检测的样本进行消杀处理后立即丢弃至废弃物处理单元。
8.根据权利要求7所述的基于超声波技术的细胞培养污染快速鉴定方法，其特征在于，当检测目标为被支原体污染的细胞培养基时，检测试剂为特异荧光染料，需要将电学观察模块中的电子显微镜替换为荧光显微镜。
Priority Applications (1)
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