CN117815451A - 双网络强韧弹性生物活性墨水、弹性组织制品及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及双网络强韧弹性生物活性墨水、弹性组织制品及制备方法,涉及3D打印生物墨水技术领域,所述的双网络强韧弹性生物活性墨水具有以下的成分:甲基丙烯酰明胶、邻硝基苄基接枝透明质酸和弹性蛋白。本发明的双网络强韧弹性生物活性墨水通过构成两层网络且互穿形成双交联双网络结构,且邻硝基苄基接枝透明质酸/弹性蛋白为席夫碱动态交联,高度卷曲的弹力蛋白,赋予了该生物活性墨水具有优异弹性和韧性的结构基础;与现有的水凝胶相比大幅度提升了韧性、弹性、刚性、粘弹性,及优异的生物活性,使负载于其内的细胞的生物学行为得到促进;体内、体外实验表明:该双网络强韧弹性生物活性墨水有效地促进了弹性软骨组织的再生。
Description
技术领域
本发明涉及3D打印生物墨水技术领域,具体涉及双网络强韧弹性生物活性墨水、弹性组织制品及制备方法。
背景技术
弹性组织,包括心脏、肺、耳廓、气管和血管,都含有丰富的细弹性纤维。外伤或疾病对这些组织的破坏对人体健康和生活质量有重大影响。例如,小耳畸形主要表现为外耳道弹性软骨组织部分或全部缺失。与其他先天性畸形相比,小耳症的发病率相对较高,全球每1万名新生儿中就有0.83-17.4人患有小耳症。为了克服自体移植物和异体移植物的局限性和并发症,组织工程成为一种潜在的替代策略,并在过去几十年中迅速发展。在所有以组织工程为导向的生物制造方法中,三维(3D)生物打印显示出独特的优势,通过精确定位细胞、生物材料和可能的生物信号分子,可再造出具有复杂结构的活体组织,从而模拟其解剖学特征并促进组织再生。
目前,含有细胞的三维基质(通常称为生物墨水)的开发取得了突飞猛进的发展。水凝胶具有广泛的可调物理和化学性质,可在制造过程中提供结构支持,并可根据相关应用定制以重塑原生细胞外基质,因此非常适合作为负载细胞的生物墨水。天然聚合物水凝胶因其固有的生物兼容性和最小的体内炎症反应,在生物打印中发挥着至关重要的作用。然而,由于单组分天然水凝胶的机械性能不足、可打印性能差和生物仿真性差,其使用一直受到了一定的限制。大多数含有细胞的天然水凝胶较为脆弱,断裂能约为10J·m-2。因此,用它们来生物打印承重结构是存在较大挑战。由于缺乏合适的生物材料来配制生物墨水,使用天然水凝胶进行三维生物打印,难以构建出既能再现原生组织解剖结构复杂性又具有优异生物功能的组织。为此,具有优异机械性能的、用于特定组织的三维生物打印的天然水凝胶体系仍有待开发。
天然强韧水凝胶体系设计为软骨、皮肤和心血管等弹性组织的生物打印提供了一种选择,与传统水凝胶相比,天然强韧水凝胶具有更优的机械性能。该设计需要在聚合物网络中引入能量耗散机制,使水凝胶能够吸收外加能量、变形而不断裂,并在变形过程中保持弹性。其中,双网络(DN)设计是构建强韧水凝胶最常用的策略之一。在DN水凝胶概念首次提出后,利用这一概念来增强水凝胶系统韧性的研究工作层出不断。由DN聚合物制成的水凝胶是由两种不同聚合物合成并交织在一起的互穿网络,其韧性明显高于传统水凝胶。随着应变的增加,一层分子链网络会在孤立点断裂,而另一个分子链网络则会有效地传递应力,保持宏观结构的稳定。然而,在不影响细胞行为的前提下提高负载细胞水凝胶的韧性具有较大难度。最近,虽然基于DN设计的生物强韧水凝胶体系逐渐被报道出来,填补在同时实现机械技能和生物学功能仿生方面的空白;但是很少有研究关注弹性的仿真。特别是复杂的弹性组织仿生物,不仅应该具有坚固的结构支撑,还应具备优异的弹性性能,以实现整体机械性能的仿生。
哺乳动物体内,弹性蛋白是特征性弹性蛋白质。弹性组织中的弹性纤维可以承受数十亿次的伸展和回缩循环;弹性蛋白的随机链模型表明,弹性蛋白的行为类似于经典橡胶,其中的聚合物链在动力学上是自由的。目前有利用重组的弹性蛋白制造工程血管导管、心脏和真皮组织的支架,成功地重建了原生动脉、心肌和皮肤的弹性特性和生物功能。然而,很少有报道称天然提取的弹性蛋白用于生物制造弹性组织。鉴于此,本发明提供双网络强韧弹性生物活性墨水、弹性组织制品及制备方法。鉴于此,本发明提供双网络强韧弹性生物活性墨水、弹性组织制品及制备方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供双网络强韧弹性生物活性墨水、弹性组织制品及制备方法。目的是提供一种可拉伸的含弹性蛋白的双网强韧水凝胶生物墨水,用于3D挤出生物打印工程化弹性组织中。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下:
第一方面提供一种双网络强韧弹性生物活性墨水,所述的双网络强韧弹性生物活性墨水具有以下的成分:甲基丙烯酰明胶(GelMA)、邻硝基苄基接枝透明质酸(HA-NB)和弹性蛋白。
在上述技术方案的基础上,本发明还可以做如下改进。
进一步,所述的双网络强韧弹性生物活性墨水具有以下重量份数的成分:甲基丙烯酰明胶2.5~10份、邻硝基苄基接枝透明质酸0.5~2份和弹性蛋白0.5~2份。
进一步,所述的双网络强韧弹性生物活性墨水具有以下重量份数的成分:甲基丙烯酰明胶5份、邻硝基苄基接枝透明质酸1份和弹性蛋白1份。
进一步,所述弹性蛋白直接提取于哺乳动物。
本发明第二方面提供一种弹性组织制品,所述的弹性组织制品由所述一种双网络强韧弹性生物活性墨水通过三维生物打印制得。
进一步,所述的弹性组织制品具有双交联双网络结构,所述双交联双网络结构通过第一层网络和第二层网络之间交联得到;甲基丙烯酰明胶通过自由基聚合形成所述第一层网络,弹性蛋白和邻硝基苄基接枝透明质酸通过动态希夫碱反应形成所述第二层网络,所述第一层网络和所述第二层网络之间通过稀疏的甲基丙烯酰明胶和邻硝基苄基接枝透明质酸中醛基的交联加固。
进一步,所述的弹性组织制品的平均孔径为196.51±72.56μm;应变为167±5%,韧性为45±3kJ·m-3,压缩模量为19±3kPa。
本发明第三方面提供一种弹性组织制品的三维生物打印方法,包括如下步骤:
(1)将甲基丙烯酰明胶、邻硝基苄基接枝透明质酸和弹性蛋白溶解,制备水凝胶前体;
(2)将所述水凝胶前体放入三维生物打印中进行打印,后在紫外光下进行固化直至形成双交联双网络结构,得到弹性组织制品。
进一步,步骤(1)中具体为:将甲基丙烯酰明胶、邻硝基苄基接枝透明质酸和弹性蛋白溶解于DPBS或培养基中,37±3℃进行过夜,制备水凝胶前体。
进一步,在紫外光下进行固化的时间为0.5~1.5分钟。
与现有技术相比,本发明的有益效果是:
(1)本发明的双网络强韧弹性生物活性墨水中的HA-NB/弹性蛋白和GelMA分别构成的两层网络且互穿形成双交联双网络结构,HA-NB/弹性蛋白为席夫碱动态交联,在一定应力下表现出动态可逆性;且由于高度卷曲的弹力蛋白特性,进一步赋予了该生物活性墨水具有优异弹性和韧性的结构基础;
(2)本发明的双网络强韧弹性生物活性墨水制备的水凝胶(例如弹性组织制品),与现有的天然水凝胶相比大幅度提升了韧性、弹性、刚性及粘弹性;由于优异的粘弹性和弹力蛋白的协同作用,赋予了其优异的生物活性,使负载于其内的细胞的生物学行为(包括细胞伸展、表型维持和细胞增殖等)得到促进,体内、体外实验还表明:
该双网络强韧弹性生物活性墨水有效地促进了弹性软骨组织的再生;
(3)本发明的双网络强韧弹性生物活性墨水打印出的弹性组织制品同时具有高分辨率的外形结构、优异的机械性能和良好的生物活性,在打印具有生物功能的三维复杂弹性组织制品方面具有重要潜力;且打印的方法简单,墨水制备条件和打印条件温和,操作简单易行,易于工业化,因此可用于生物打印优异的弹性组织制品。
附图说明
图1为本发明的水凝胶的分子机制示意图和物理性质;其中,(A)为不同类型的水凝胶的结构示意图;(B)为DN水凝胶性能示意图;(C)为对交联前后不同生物墨水的大体观;(D)为不同类型的交联水凝胶的扫描电镜图像,100μm;(E)为不同类型的交联水凝胶的孔径分布;(F)为不同类型的交联水凝胶在溶胀24小时后的物理外观图,比例尺,1cm;(G)为溶胀24小时后不同类型的交联水凝胶的平均质量比;*P<0.1,****P<0.0001,(n=3);
图2为本发明的水凝胶的机械性能;其中,(A)为水凝胶分子链对拉伸和压缩应力的反应示意图;(B)水凝胶薄膜的拉伸试验照片;(C)为不同类型的水凝胶薄膜的拉伸应力-应变曲线;(D)为不同类型的水凝胶薄膜的循环拉伸试验(10个循环,施加应变70%);(E)为不同类型的水凝胶薄膜在不同最大应用应变(GHE为10%至150%,GH和G为10%至70%)下的连续加载-卸载应力-应变曲线;(F)为水凝胶圆片的抗压试验照片;(G)为不同类型的水凝胶圆片的压缩应力-应变曲线;(H)为不同类型的水凝胶圆片的循环压缩试验(10个循环,施加应变70%);(I)为不同类型的水凝胶薄膜在不同最大应变(各组均为10%至70%)下的连续加载-卸载应力-应变曲线;(J-L)为水凝胶圆片的应力松弛曲线;(M)为不同类型的水凝胶圆片的抗疲劳曲线;
图3为本发明水凝胶的生物墨水的可打印性;其中,(A)为不同类型的水凝胶的储能模量(实线)和损耗模量(虚线)与温度的函数关系;(B)为不同类型的水凝胶在37℃下的表观粘度与剪切速率的函数关系;(C)为使用不同生物墨水挤出的线材和打印的网状结构的照片,比例尺,1cm;(D)为打印的人鼻构建体的总视图和不同层视图照片,比例尺,1cm;(E)为打印人鼻的三维重建;(F)为打印出的人鼻形态偏差对比;(G)为打印的人耳廓构建体的总视图和不同层视图照片,比例尺,1cm;(H)为打印人耳廓的三维重建图;(I)为打印人耳廓的形态偏差比较;(J)为打印的人体气管构建体的总视图和不同层视图照片,比例尺,1cm;(K)为打印人体气管的三维重建图;(L)为打印人体气管的形态偏差对比;
图4为本发明不同类型的水凝胶负载的软骨细胞的生物学特性;其中,(A)为染色嵌入打印水凝胶圆片的细胞的过程示意图;(B)为不同类型的水凝胶中负载的软骨细胞在指定时间点的活/死染色荧光显微图像;(C)为在指定时间点量化软骨细胞的活力,比例尺,200μm;(D)为第1天不同类型的水凝胶负载的软骨细胞的F-肌动蛋白染色荧光显微图像,比例尺,200μm;(E)为第7天不同类型的水凝胶负载的软骨细胞的F-肌动蛋白染色荧光显微图像,比例尺,200μm;(F)为第1天不同类型的水凝胶负载的软骨细胞的COLII染色荧光显微图像,比例尺,200μm;(G)为第7天不同类型的水凝胶负载的软骨细胞的COL II染色荧光显微图像,比例尺,200μm;(H)为不同类型的水凝胶中表达的COL II在第7天的荧光强度曲线;
图5为本发明体内弹性软骨再生;其中,(A)为在裸鼠体内植入60天的充满细胞的水凝胶圆片的大体情况,比例尺,1cm;(B)为取出的水凝胶圆片大体情况,比例尺,1cm;(C)为取出的水凝胶圆片的组织学染色,比例尺,100μm;(D)为植入和取出生物打印的含有细胞的GHE组织工程耳软骨,比例尺,1cm;(E)为生物打印耳廓软骨植入前和切除后的湿重比较;(F)为生物打印GHE耳廓软骨的组织学染色,比例尺,1mm;(G)为生物打印GHE耳廓软骨的免疫组化染色,比例尺,1mm;(H)为原生软骨和外植弹性组织制品的总胶原和GAG含量定量;***P<0.001,****P<0.0001;(n=3);
图6为本发明不同类型水凝胶在紫外线(405nm,30mW·cm-2)照射下的胶凝性实验;
图7为本发明不同类型水凝胶的孔径;***P<0.001,***P<0.0001;
图8为本发明不同类型水凝胶的体外降解性;
图9为本发明不同类型水凝胶的拉伸模量、强度、破坏应变和韧性;(A)拉伸模量;(B)强度;(C)破坏应变;(D)韧性;**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001;
图10为本发明不同类型水凝胶的拉伸循环测试的能量耗散;(A)5次循环耗能统计数据,****P<0.0001;(B)G的10次循环测试;(C)GH的10次循环测试;(D)GHE的10次循环测试;
图11为本发明GHE水凝胶薄膜的连续加载卸载试验;(A)10%;(B)30%;(C)50%;(D)70%;(E)90%;(F)1100%;(G)130%;(H)150%;
图12为本发明GHE水凝胶薄膜(150%应变)的循环加卸载试验;
图13为本发明不同类型水凝胶的压缩模量、强度、破坏应变和韧性;(A)压缩模量;(B)强度;(C)破坏应变;(D)韧性;*P<0.1,**P<0.01,***P<0.001,and****P<0.0001;
图14为本发明不同类型的水凝胶圆片的松弛模量;*P<0.1,***P<0.001;
图15为本发明使用G水凝胶在8℃下打印2层正方形;(A)第一层,比例尺,1cm;(B)第二层,比例尺,1厘米;
图16为本发明植入前和2个月后取出负载细胞水凝胶培养皿湿重比较;(A)GH负载细胞培养皿比较;(B)GHE负载细胞培养皿比较;Ns,无显著差异,****P<0.0001;
图17为本发明GH耳的H&E染色;比例尺,1mm;
图18为本发明GH耳部的橘红色O染色;比例尺,1mm;
图19为本发明GH耳的维多利亚蓝染色,比例尺,1mm;
图20为本发明GH耳部放大图和Von Kossa染色,比例尺,1cm;(A)和(B)GH耳植入三个月后在体情况;(B)GH耳植入三个月取材后大体观;(C);(D)GH耳植入三个月取材后VonKossa染色结果。
具体实施方式
以下对本发明的原理和特征进行描述,所举实例只用于解释本发明,并非用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者,按照本领域内的文献所描述的技术或条件,或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可通过正规渠道商购得的常规产品。
实施例
1、实验部分
1.1材料和动物
活/死细胞活力/细胞毒性试剂盒、透析膜[分子量(Mw)截止值:12,000-14,000Da)、牛血清白蛋白(BSA)、杜氏磷酸盐缓冲盐水(DPBS)、杜氏改良Eagle培养基(DMEM)、青霉素-链霉素-新霉素抗生素(PSN)、胰蛋白酶-EDTA、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、抗生素-抗霉素稳定溶液购自赛默飞。
小鼠抗弹性蛋白抗体、兔抗胶原蛋白II抗体、山羊多克隆小鼠IgG-H&L二抗(Alexa488)和DAB检测IHC试剂盒购自Abcam。
Safranine-O和维多利亚蓝染色试剂盒购自北京拉索生物科技有限公司。
TRITC-Phalloidin试剂盒购自苏州永沁泉智能设备有限公司。
巴马小型猪(雌性,6个月大)和裸鼠(雌雄,6周大)购自北京勃林格殷格翰维通生物技术有限公司。动物实验由中国医学科学院北京协和医学院整形外科医院(研究所)动物护理与实验委员会批准。
除非另有说明,所有其他材料均购自Sigma-Aldrich。
1.2GelMA和HA-NB的合成
GelMA是按照本发明之前介绍的方案合成的[D.Wang,S.Maharjan,X.Kuang,Z.Wang,L.S.Mille,M.Tao,P.Yu,X.Cao,L.Lian,L.Lv,J.J.He,G.Tang,H.Yuk,C.K.Ozaki,X.Zhao,Y.S .Zhang,Sci Adv 2022,8,eabq6900.]。具体是,将10.0克猪皮中的A型明胶加入100毫升DPBS溶液中,在磁力搅拌器下于50℃溶解30分钟。然后,向明胶溶液中滴加5.0毫升甲基丙烯酸酐,并在50℃下搅拌3小时。用100毫升温的DPBS(40℃)淬灭反应。然后,用透析膜将反应产物与蒸馏水在40℃下透析5天。最后,用0.2μm过滤器过滤溶液并冻干,得到白色多孔泡沫,储存在-20℃以备进一步使用。
根据已报道的方式制备HA-NB[a)Y.Hong,F.Zhou,Y.Hua,X.Zhang,C.Ni,D.Pan,Y.Zhang,D.Jiang, L.Yang ,Q.Lin,Y.Zou,D.Yu,D.E.Arnot,X.Zou,L.Zhu,S.Zhang,H.Ouyang,Nature communications 2019,10,2060;b)Y.Yang,J.Zhang,Z.Liu,Q . Lin,X.Liu,C.Bao,Y.Wang,L.Zhu,Advanced materials(Deerfield Beach,Fla.)2016,28,2724]。具体是,将透明质酸溶解在100ml的0.1M 2-吗啉乙磺酸溶液中,然后加入0.4克4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉氯化物,将60毫克NB(邻硝基苄基)溶于二甲亚砜,加入上述溶液中,并在室温下暗处搅拌24小时。然后,将溶液用去离子水透析4天,再冻干,得到微黄色固体泡沫,储存在-20℃以备进一步使用。
1.3提取弹性蛋白
用草酸提取法从猪主动脉中提取了弹性蛋白[S.M.Partridge,H.F.Davis,G.S.Adair,Biochem J 1955,61,11.]。采集的猪主动脉经过脱脂、煮沸、干燥和破碎,加入氯化钠以去除杂质。然后将样本在60℃下烘干并再次破碎。在100℃的蒸汽浴中用草酸消化后,将滤液冷却至室温,离心并用0.2μm滤膜过滤。通过透析膜透析后,用冻干法收集弹性蛋白并保存在-20℃温度下。经草酸消化的弹性蛋白分子量分布在130KD以上;1%(w/v)弹性蛋白的粘度为4.8mPa·s。
1.4水凝胶薄膜、圆片的制造
为了打印出具有良好机械性能和生物功能的弹性组织制品,本发明开发了一种适合3D挤出生物打印的细胞相容性生物墨水,利用成熟的耗散诱导增韧理论增强水凝胶韧性,该理论依赖于聚合物链之间的关联来耗散变形过程中的能量,制备出具有更优越的弹性、可拉伸性和韧性的水凝胶系统。本发明的水凝胶系统被命名为GHE(G:GelMA,H:HA-NB,E:弹性蛋白),GelMA通过自由基聚合形成相对紧密的第一层网络,而稀疏的第二层网络则通过紫外线触发的动态希夫碱反应在弹性蛋白和HA-NB之间生成。选择GelMA是因为它具有生物相容性、温度敏感性、可调流变性能和可打印性。HA-NB是邻硝基苄基(NB)接枝透明质酸。在紫外线照射下,邻硝基苯发生转化,邻亚硝基苯甲醛基团与分布在弹性蛋白生物大分子中的氨基发生交联反应。此外,在内部的交联反应后,GelMA还有与HA-NB的醛基发生进一步交联反应。即在第一层网络和第二层网络之间最终形成了双交联双网络结构,从而提高了水凝胶的机械性能,分子机制示意图如图1A所示。
将生物聚合物溶解在DPBS或培养基中,37℃过夜,制备水凝胶前体;制备了以下三种不同类型的水凝胶:(1)G,5%(w/v)GelMA;(2)GH,5%(w/v)GelMA和1%(w/v)HA-NB;(3)GHE(具有双交联双网络结构的DN水凝胶),5%(w/v)GelMA、1%(w/v)HA-NB和1%(w/v)弹性蛋白。液态水凝胶前体被0.4mm的塑料垫片夹在两片玻璃之间,然后在紫外线下固化1分钟,切割得到的水凝胶薄膜用于进一步实验。在打印水凝胶圆片时,将前体倒入圆柱形PDMS模具中,并在紫外光下固化1分钟,得到凝胶圆片。
1.5水凝胶的形态特征、膨胀试验和降解分析
冻干后在15kV加速电压下使用扫描电子显微镜(SEM,Philips XL-30,荷兰阿姆斯特丹)观察水凝胶构建体断裂表面的形态。用ImageJ软件分析了水凝胶构建物的孔径和孔隙率(每组n=3)。
将打印的水凝胶圆片(直径=8mm,高=3mm)记录为初始湿重(W0)。将水凝胶完全浸入培养基中24小时直至达到溶胀平衡(n=4),最终湿重记为Wt。溶胀比按以下方法计算:
打印的水凝胶圆片进一步用于降解分析。对冻干水凝胶圆片称重(W0)并在PBS中培养。所有样品在摇床培养箱(120转/分)中分别放置1、2、3、4、5和6周,温度为37℃。每周更换一次液体。在确定的时间点,取出水凝胶圆片进行冻干(24小时)并称重(Wt)。降解率按以下公式计算:
1.6机械性能测试
水凝胶薄膜和圆片样品的拉伸和压缩试验是在通用拉伸机(Instron-5967,Canton,MA,USA)上进行的,拉伸机的传感器容量为100N。从薄膜样品上剪下厚度约为0.4mm、长度约为12mm、宽度约为4mm的矩形样品进行拉伸试验。恒定拉伸率固定为每分钟50%。在拉伸加载-卸载试验中,薄膜样品首先加载到70%的应变,然后以相同的拉伸速率卸载。还使用不断增加的最大拉伸应变(G、GH和GHE为10-30-50-70%,GHE为50-70-90-110-130-150%)进行了连续加载-卸载试验。在压缩试验中,使用了直径为8mm、高度为3mm的水凝胶圆片。单轴压缩试验的固定应变率为每分钟50%,直至试验失败。在压缩加载-卸载试验中,首先将圆片样品加载到70%的应变,然后以相同的拉伸速率卸载。此外,还进行了连续加载-卸载试验,施加的最大压缩应变不断增加(各组均为10-30-50-70%)。在松弛测试中,水凝胶圆片被压缩至应变达到50%,然后让样品松弛10分钟,同时保持应力。在抗疲劳测试中,圆片样品在20kPa的恒定压缩应力下进行100次斜坡力加载和卸载循环。加载和卸载速率为每分钟50%。标称应力定义为外加力除以未变形状态下的横截面积;应变定义为拉伸样品长度除以初始长度;模量根据10-20%应变范围内的应力-应变曲线斜率确定;韧性根据应力-应变曲线的积分面积计算;应力松弛模量根据最后100秒应力松弛曲线的线性斜率测量;弹性恢复按松弛能量与拉伸能量之比计算。
1.7流变学试验
流变学实验在带有平行板(P20TiL,直径20mm)的HAAKE MARS旋转流变仪上进行。在25℃恒温条件下,通过稳态流动扫描测量表观粘度与剪切速率(0.1至100s-1)的函数关系。振荡温度扫描在5-40℃范围内进行,加热速率为2℃分-1,振荡频率为1Hz,剪切应变为1%。动态流变实验在蓝光(405nm,30mW·cm2)下进行。在10%应变(CD模式)、1Hz频率和0.5mm间隙下进行了120秒的时间扫描振荡试验。凝胶点的确定是存储模量(G')超过损耗模量(G”)的时间。
1.8打印性能测试和打印制品形态分析
通过打印简单和复杂的弹性组织制品,来测试了水凝胶的可打印性。打印性能测试使用3D-Bioplotter打印机(Envision-Tec,德国)进行。在打印简单弹性组织制品时,各组之间的所有参数都是固定的,以比较不同类型的水凝胶的可打印性;而在双网络强韧弹性生物活性墨水打印复杂弹性组织制品物时,则要及时调整参数,以获得满意的结果。
形态分析是根据已公布的方法进行的。具体是通过Quantum GX微型计算机断层扫描成像系统(美国珀金埃尔默公司)采集和扫描打印的弹性组织制品,获得DICOM文件,然后将其导入Mimics Medical软件(21.0版,比利时Materialise公司)进行三维重建,生成STL数据。三维重建模型数据和初始数字模板数据均输入Geomagic Control软件(2015版),初始数字模板数据被设为参考,而三维重建模型数据被设为测试,拟合和对齐后,通过三维偏差对比分析两个模型的形态相似性,并以偏差色谱图的形式显示。
1.9耳廓软骨细胞的分离和培养
耳廓软骨取自巴马小型猪,剁成1mm3小块。软骨片用DPBS冲洗,并用0.2%的IV型胶原酶消化,在37℃下轻轻搅拌过夜,以分离软骨细胞。然后,收集软骨细胞,在含10% FBS和1% PSN的高糖DMEM中培养和扩增,温度为37℃,湿度为95% CO2。收获第二阶段的软骨细胞用于进一步实验。
1.10细胞活力检测、F-肌动蛋白染色和COL II免疫染色
根据说明书的记载,使用活/死细胞存活率/细胞毒性试剂盒评估细胞存活率。具体的,用DPBS冲洗挤出的水凝胶块,然后在DPBS中加入含4mM钙黄绿素乙酰氧甲基(Calcein-AM)和2mM乙脒均二聚体-1的活/死染色液。37℃孵育30分钟后,清洗样品并在共聚焦显微镜(Leica TCS SP8 CARS)下观察。使用ImageJ软件(美国马里兰州贝塞斯达,国立卫生研究院)测定存活细胞的百分比。
为了进行形态学分析,按照说明书的记载使用TRITC-Phalloidin试剂盒15分钟。具体的,挤出的水凝胶块被清洗并用4%(v/v)多聚甲醛固定30分钟。轻轻清洗三次后,用0.5%(v/v)Triton X-100在室温下渗透5分钟。然后加入TRITC-Phalloidin溶液覆盖样品,室温下孵育30分钟;再次清洗样品,然后用DAPI[1:1000(v/v)in DPBS]染色10分钟。最后,清洗样品并在共聚焦显微镜下观察。
通过对ECM进行Col II标记的免疫染色,进一步证实了负载水凝胶块的软骨细胞的生物功能。具体的,挤出的水凝胶块用4%(v/v)多聚甲醛洗涤并固定30分钟。轻柔清洗三次后,用0.5%(v/v)Triton X-100使样品通透5分钟,并用5%(v/v)山羊血清在PBS中阻断2小时,室温下进行。然后用所需的一抗(1:200)在4℃孵育样品过夜。样品洗净后与相关的二抗(Alexa488)(1:200稀释)在封闭缓冲液中于4℃孵育过夜。最后,洗涤后用DAPI反染细胞核,并在共聚焦显微镜下观察。为了对Col II标记的表达进行半定量,根据已发表的方法,使用ImageJ对中央部分的荧光强度曲线进行了定性。
1.11生物打印和体内弹性软骨的再生
将含有细胞的水凝胶圆片和生物打印的耳廓形状构建物皮下植入小鼠体内。用氯胺酮和恶嗪(35-40毫克/千克,0.2毫克/千克)麻醉动物。切开所有皮肤层,通过钝性剥离在背筋膜和圆片状肌之间形成一些口袋,为植入物提供空间。然后将假体小心地放置在空间中。用5-0非吸收线逐层缝合切口。手术后,对实验动物进行镇痛和抗生素治疗。动物饲养至2或3个月后。然后,两只动物均被处死,以提取样本。
1.12对取出的组织进行组织学、免疫组化和生化分析
对整个工程耳廓软骨进行组织学分析,以评估再生组织的组织学结构、蛋白多糖和弹性软骨特异性ECM沉积。采集的标本在4%多聚甲醛中4℃固定过夜,包埋在石蜡中,并切成5μm间距的切片。根据标准方案对切片进行H&E、Safranin O和维多利亚蓝染色。用兔抗胶原蛋白II多克隆抗体、小鼠抗弹性蛋白单克隆抗体(1:200)和辣根过氧化物酶结合的抗小鼠抗体(1:200)检测工程软骨中II型胶原蛋白和弹性蛋白的表达,然后用DAB检测IHC试剂盒显色。
采集标本(n=3)并切碎,以进行软骨相关生化评估,检测糖胺聚糖(GAG)含量和总胶原蛋白含量。GAG含量采用二甲基亚甲基蓝检测法(GenMed Scientifics Inc,中国上海)测定,总胶原含量采用羟脯氨酸检测试剂盒(南京建成生物工程研究所,中国南京)检测。实验按照说明的记载进行。
1.13统计分析
从至少三次重复试验中收集定量数据,并以平均值±标准偏差表示。在确认数据呈正态分布后,使用GraphPad Prism 9.3.1软件进行学生t检验或单向方差分析(ANOVA)来确定统计学意义,P<0.05为具有统计学意义。
2、结果与讨论
2.1水凝胶的物理表征
由GelMA和HA-NB组成的水凝胶(GH组)和仅由GelMA组成的水凝胶(G组)作为对照组进行研究。如图6所示,所有组别在紫外线(405nm,30mW·cm-2)照射下均在5秒内迅速胶凝。在溶胶阶段,所有水凝胶前体都呈现为透明液体(图1C i-iii)。交联反应后,G组保持了较高的透明度,这可能是因为没有明显的光散射域(图1C iv)。GelMA水凝胶缺乏能量耗散机制,因此既软又脆弱。加入HA-NB和弹性蛋白后,固化的水凝胶变得不均匀且不透明(图1Cv-vi)。双交联双网络结构应该已经形成,这可能会进一步提高水凝胶的机械性能。
图1D i-vi显示了不同类型的水凝胶的扫描电子显微镜(SEM)图像。G水凝胶的平均孔径为56.67±11.39μm,GH水凝胶的平均孔径为为155.99±36.18μm,GHE水凝胶的平均孔径为为196.51±72.56μm)(图7),水凝胶的孔径分布见图1E。在GH和GHE水凝胶中席夫碱反应的存在可能会降低GelMA的交联度,由此产生的分子网络阻碍可能会增加交联水凝胶的孔径。水凝胶的微观结构,尤其是孔径大小,是细胞附着和生长的一个重要因素。据报道增加基质的互联孔径,尤其是在80-120μm范围内的孔径,有助于软骨细胞更好地生长和ECM合成,这是细胞、营养物质和代谢物在大孔支架中扩散的结果。GHE水凝胶的孔径分布在80-300μm之间,与G水凝胶相比,GHE水凝胶扩大了空间孔径,有利于细胞生物的行为。此外,在杜氏改良Eagle培养基(DMEM)中培养24小时后,GH和GHE水凝胶更好地保持其形态,膨胀比为1.16(GH)和1.08(GHE)(图1F、G),而G水凝胶的膨胀比为1.43。膨胀比也是生物墨水的重要参数,因为它会影响生物打印构建体的保真度、分辨率和细胞环境。混合生物墨水的膨胀率相对较低,生物打印后在液体条件下培养几天后,其构建体的变形较小。图8展示了不同类型的水凝胶的体外降解情况。与G和GH水凝胶相比,GHE水凝胶更耐降解,这可能是由于其具有双交联双网络结构。
2.2水凝胶的机械性能
通过拉伸和压缩试验研究了水凝胶的机械性能。如图2A、B所示,在单向拉伸应力下,GHE水凝胶薄膜被拉伸到很大的幅度,达到的平均破坏应变为167.93%,远高于G水凝胶薄膜(89.29%)和GH水凝胶薄膜(103.79%)(图9)。三组水凝胶薄膜在拉伸模量和强度方面也存在显著差异,GHE DN水凝胶薄膜的韧性高达45.39kJ·m-3(图2C和图9)。据报道,GH水凝胶也被认为是一种DN水凝胶,因为GelMA上的氨基会直接与HA-NB的醛基发生反应。与G水凝胶相比,DN设计无疑提高了GH水凝胶的机械性能。相比之下,GHE水凝胶的韧性、刚度、强度和延伸性都有了进一步的显著提高;这主要是由于弹性蛋白和HA-NB反应形成的独立第二层网络具有可逆性,对水凝胶的能量耗散起到了积极作用。
此外,弹性蛋白在强化水凝胶系统方面也发挥了关键作用。弹性蛋白在弱疏水作用基础上的随机卷曲使GHE水凝胶的分子链比G和GH组的水凝胶分子链更易拉伸;有了盘绕链,弹性蛋白就可以被归类为半柔性生物聚合物,它可以组装成丝状,生成具有应变加固响应的纤维状水凝胶(图2C);它在适度伸展时表现出近乎线性的机制,而在大应变时则表现出急剧的僵化效应,此时其结构发生急剧的重新排列。此外,动物源弹性蛋白的缠结长链也有助于提高刚度和韧性,因此其允许机械能在许多链和较长的长度上进行能量耗散。
为了进一步确定水凝胶的弹性和能量耗散能力,本发明进行了循环拉伸试验。本发明首先将水凝胶薄膜拉伸至70%的应变,每分钟应变速率为50%,持续10个循环,以清楚显示其弹性。根据单轴拉伸试验的结果,选择70%的应变是为了保持在最弱水凝胶(G)的拉伸极限范围内。图2D显示了三种不同类型的水凝胶的加载-卸载应力-应变曲线。循环测试表明,GHE和GH水凝胶的滞后都可以忽略不计(图10A-D),这意味着在拉伸变形的前70%,它们可以恢复到原来的形状。由于缺乏可逆键和高度盘绕结构,G组在拉伸到70%的应变时出现了轻微的滞后(但不明显),链开始断裂(图S5)。这种现象也可能是由于GelMA网络(浓度为5%(w/v))的交联度不高,链条没有被完全拉伸到足以断裂。然后,本发明连续进行了加载-卸载试验,对G和GH组使用的最大应变从10%到70%,对GHE组使用的最大应变从10%到150%(图2E和图11A-H)。结果显示,当应变达到110%时,GHE水凝胶开始出现明显的滞后(图S6)。为了研究具有双交联双网络结构的DN水凝胶在大应变下的表现,本发明随后将GHE水凝胶拉伸到150%的应变,循环10次(图12)。由于打结和缠结的聚合物链解开,交联的GelMA链断裂,造成永久性损伤,因此在第一个循环中观察到较高的滞后。水凝胶在最初几个循环中的应力软化表明其结构发生了永久性变化,这种变化随着反复变形而逐渐减弱。然而,在第一个循环之后,没有发现明显的滞后,这可能是由于弹性蛋白的反复卷绕和松开以及第二个网络的动态共价交联导致了链的重组。在拉伸之前,弹性蛋白处于高熵状态,链的展开会降低聚合物的熵。拉伸使链定向,限制了系统的整体熵,从而节省了用于重新折叠的恢复力。此外,在拉伸过程中,弹性蛋白链发生变形,暴露出疏水侧域,增加了系统能量,然后通过重新卷曲释放能量。这些结果表明,虽然第一个网络(GelMA)在变形过程中可能会受损,但具有伸展性的第二个网络可以保持材料的完整性。
压缩试验在某些定量特征方面也显示了同样的趋势(图2A、F、G和图13A-D)。在释放70%的高压缩应变后,GHE水凝胶体积恢复到初始状态(图2F)。在三组水凝胶中,GHE水凝胶具有最高的压缩模量(19.85kPa)、强度(204.78kPa)和韧性(24.58kJ·m-3)。GHE水凝胶圆片不仅刚度显著提高,还能承受约80%的压缩变形而不破裂。为了研究水凝胶在压缩条件下的弹性,本发明对它们进行了循环压缩试验(图2H)。本发明以每分钟50%的应变率将水凝胶圆片压缩至70%的应变,循环10次。值得注意的是,结果似乎与拉伸条件下的测试不同。与其他两种水凝胶圆片相比,GHE水凝胶圆片在整个10个循环过程中都有明显的滞后。并没有出现明显的塑性变形迹象。相反,压缩后的GHE圆片完全恢复到静止长度,并立即恢复到原来的形状(图2H)。重新压缩后的应力曲线几乎与之前的延伸曲线一致,反映出没有(或很少)刚度损失。因此,GHE水凝胶具有最大的滞后和最高的极限应力,表明在加载-卸载过程中水凝胶中储存了大量能量。在加载-卸载的10个循环中,极限应力仅略有下降趋势。而在G组和GH组中,在第一个压缩循环后,如果立即进行接下来的测试,水凝胶会变弱(应力软化)。如图2I所示,对所有组进行了连续加载-卸载压缩试验,最大应变从10%增加到70%。GHE的每条加载曲线都与前一条加载曲线完全吻合,并覆盖了前一条加载曲线,回到了原点。本发明推测,在有限的压缩应变下,卷曲的弹性蛋白没有进一步变形的空间,而动态共价键主导了DN水凝胶的能量耗散。应力消除后,GHE水凝胶的弹性网络有助于快速恢复。
为了研究水凝胶的粘弹性,本发明还在50%的恒定压缩应变下进行了应力松弛实验。除了能量耗散,应力松弛也是表明材料粘弹性响应的一个主要特征。快速粘弹性应力松弛可明显促进水凝胶中负载细胞的多种生物学行为,包括细胞增殖、扩散和分化。如图2J至L和图14所示,GHE圆片的松弛模量最高,达到96.36kPa,超过GH的56.96kPa和G的26.7kPa。得益于具有双交联双网络结构的DN水凝胶设计和弹性蛋白的加入,GHE水凝胶的应力松弛率显著提高。
接下来,本发明利用20kPa的恒定加载应力进行100次不间断循环,通过蠕变模型探讨了水凝胶的抗疲劳性能。加载应力由最弱的水凝胶决定,并在所有组中保持恒定。如图2M所示,即使重复100次机械加载循环,GHE圆片也很容易恢复到原来的形状。然而,在其他两种水凝胶中都观察到了不可逆的形状变化,即施加的循环次数越多,压应力越小。这表明GHE DN水凝胶具有良好的抗疲劳特性。
力学性能表征结果表明,生物GHE DN水凝胶的刚度、拉伸性、韧性、弹性、抗疲劳性和粘弹性都有明显改善,可用于弹性组织再生。
2.3使用水凝胶进行三维弹性复合结构的生物打印
为了测试打印性能和设置打印参数,对作为生物墨水的三种前体的流变特性进行了测量。由于GelMA成分具有热致伸缩性,所有水凝胶都具有随温度变化的粘弹性(图3A)。温度从4℃升高到40℃会导致G'逐渐减小,并在临界凝胶化温度下与G"交叉,这表明凝胶-溶胶的转变。其中,GHE前体的转变温度最高,约为24℃。从18℃左右开始,GHE前体的复合粘度下降了两个数量级。在10℃等低温条件下,粘度急剧上升,需要更高的压力才能挤出生物墨水,这可能会损害封装细胞的活力。生物墨水要想成功打印,必须具备足够的粘度和剪切稀化特性,使生物墨水在挤出过程中流动顺畅。在这项研究中,本发明使用从低到高剪切速率的稳定剪切流扫描流变学方法来观察剪切稀化行为(图3B)。在剪切速率为0.1s-1时,GHE前体的表观粘度很高(47770.1mPa·s),是GH(9686.7mPa·s)的5倍,是G(111.8mPa·s)的400多倍。在所有测试组中,随着剪切率的增加,粘度下降了约两个数量级。结果表明,水凝胶可以在打印喷嘴中的高剪切率下流动,但随后会随时间恢复其初始特性。剪切稀化和细胞良性热致伸缩特性确保了GHE生物墨水可用于3D挤出生物打印。
经过多次打印尝试,本发明确定了大部分打印参数。本发明选择了内径为23G的钝针作为挤出喷嘴。根据流变测试结果,生物墨水载体的温度降低并保持在20℃,接收平台的温度设定为18℃。挤出微纤维的情况调整挤出压力(0.6-1Pa)和打印头移动速度(13-15mm·s-1)。然后本发明通过评估喷嘴尖端的挤出丝状态和打印结构前两层的完整性,比较了G和GHE生物墨水的打印性能(图3C)。在20℃和0.7Pa压力下打印纯度为5%(w/v)的GelMA生物墨水时,喷嘴尖端会出现液滴形态。1st和2nd层的挤出丝融合成正方形(图3C i-iii)。这与所报道的结果一致,即粘度不足的凝胶气相二氧化物前驱体在针尖处形成小球,导致最终结构在基底上下垂。生物打印机配备了5%的GelMA生物墨水和内径为0.34mm的23G针头,在0.6Pa的压力下,以14mm/s的喷嘴移动速度挤出2.3mm的长丝。压力从0.7Pa逐渐增加到1.0Pa,丝的直径也相应地从2.7mm增加到5.7mm,这与预期的分辨率相去甚远(图3C iv)。随后,本发明尝试使用更低的温度,只有当GelMA的生物墨水冷却到8℃以下时,才能取得良好的效果。然而,方形结构中挤出的纤维在一些交叉点上融合,或在不交叉点上塌陷,因此无法制造完整的三维结构(图15A-B)。而GHE的生物墨水光滑均匀的细丝被连续挤出,形成了层次分明的标准网格结构(图3C v-vii)。图3C viii显示,在相同的移动速度和喷嘴尺寸(23G)下,直径随压力(0.6-1.0Pa)的变化而变化(0.4-1.2mm)。
除粘度外,生物墨水还应具有足够的粘弹性,以支持层沉积,尤其是复杂弹性组织制品。对于大多数软水凝胶来说,存储模量不足的生物墨水在打印后会塌陷,因为它们无法保持自身重量。得益于GHE水凝胶优异的机械性能,所有生物打印构建体都表现出卓越的外观。本发明利用GHE生物墨水,尝试打印了三种不同的复杂弹性组织制品,并通过三维偏差比较量化了打印构建物的三维形态保持情况。由于人的鼻子看起来像一个圆锥形结构,因此可以说它是最简单的打印对象,因为在打印过程中几乎不需要考虑悬空部分。图3D展示了打印出的34层鼻子的不同视图和结构的不同层。打印的超细纤维逐层整齐排列,一个完整的结构被顺利打印出来,没有塌陷或缺损。偏差色谱显示了形态的相似性,两毫米以内的偏差为93.87%(图3F),表明鼻子形态基本完成重建。与打印鼻子的"小对大"层相比,颅耳角的存在使得打印人耳的细节单元变得更加复杂。在层上打印方法中,通常需要支撑结构来帮助临时提供机械支撑,并在打印过程中支撑起悬挂的结构。如图3G所示,本发明打印了23层颅耳夹角为120°的人耳廓。未构建支撑结构。每层挤出的水凝胶前体在紫外光下照射约3秒钟,交联后的水凝胶在打印完成后紫外光照射前保持位置不变。打印出的耳廓偏差在±2mm以内的比例达到94.75%(图3H,I)。人体气管由甲状软骨、环状软骨和气管软骨组成,其形状并非规则的管状结构。本发明尝试使用GHE生物墨水打印40层环状软骨和气管软骨的一体化结构(图3J)。虽然遇到了与打印人耳类似的问题,但最终还是获得了满意的软骨和气管软骨的一体化结构制品,偏差为96.50%(±2mm)(图3K,L)。
2.4负载在DN水凝胶中的软骨细胞的生物学特征
关于真实结构的复杂性和出色的生物学特征,本发明在下文中对耳廓软骨进行了生物打印和再生,以作示范。弹性软骨含有弹性纤维网,主要存在于耳廓、喉和咽鼓管中。通常情况下,这种组织不能承受较高的机械负荷,但能以适度的弹性和柔韧性提供支撑。由于缺乏血液供应,与其他结缔组织相比,弹性软骨的再生或修复能力非常有限。
为了鉴定含弹性蛋白DN水凝胶生物打印构建体的生物功能和组织再生能力,从巴马小型猪身上采集了耳软骨细胞。为了直接生物打印含有细胞的构建体以进行细胞染色表征,将生物墨水储备液与5*106ml-1的软骨细胞悬浮液混合,然后装入20℃的载体并以液滴形式挤出,形成块状水凝胶(图4A)。细胞良性水凝胶可在生物打印过程中保护细胞,减少剪切应力和随后的细胞膜损伤,提高生物打印构建体的细胞存活率。首先使用块状水凝胶测试生物墨水的细胞相容性。活/死染色表明,3种水凝胶在第1天和第7天的细胞存活率没有明显差异,分别超过85%和89%(图4B、C)。虽然打印水凝胶需要更高的剪切力,但在生物打印过程中并没有损坏负载在GHE生物墨水中的细胞,这与其他报道一致。活/死染色也表明GHE生物墨水具有良好的细胞相容性。
软骨细胞的体积和形态深刻影响软骨细胞表型的稳定性。细胞形状、细胞骨架构组织和调控已被证实在软骨形成过程中发挥重要作用。通过对F-肌动蛋白进行免疫荧光染色,观察了水凝胶中的细胞增殖、形态和细胞骨架组织。结果显示,G和GH水凝胶中的大多数软骨细胞在第1天的培养过程中保持球形形态,没有扩散,但GHE水凝胶中的细胞在同一时间点开始扩散(图4D)。第7天,所有水凝胶中的软骨细胞都出现了明显的扩散(图4E)。其中,GHE水凝胶显示出最大的细胞体积和细胞聚集趋势。细胞活动对细胞包被基质的硬度非常敏感,这一点已经得到证实,因为它能调节细胞的扩散、迁移、增殖、基因表达和分化。
基于GelMA的生物墨水的浓度高于7%(w/v),但由于其杨氏模量高、交联度高,会抑制细胞的扩散和迁移,并导致F-肌动蛋白丝网络的形成变得脆弱,因此其使用受到限制。值得注意的是,虽然GHE水凝胶的模量比5%(w/v)GelMA高得多,但软骨细胞却能在其中广泛扩散。原因之一可能是GHE水凝胶中的孔径增大,这为细胞提供了更多的伸长空间,使它们免于像在其他硬水凝胶(如模量为~20kPa的10%(w/v)GelMA)中那样发生稠密的交联。据报道,除刚度外,粘弹性也会对细胞行为产生深远影响,在应力快速松弛的生理性细胞外基质中也能观察到良好的铺展性。与其他组相比,GHE水凝胶的松弛模量最高(图14)。因此,GHE的应力松弛可能会增加细胞的扩散和增殖。
软骨细胞表型的稳定性至关重要,因为软骨细胞通常合成的基质主要由II型胶原蛋白(COL II)和凝集素(aggrecan)组成。经过1周的体外软骨培养后,三组中的大多数细胞都有II型胶原表达(图4F、G)。在细胞负载密度和显微镜捕获参数相同的情况下,与其他样本相比,GHE组II型胶原的免疫荧光标记最为强烈(图4H)。据推测,生物打印构建体中的弹性蛋白能立即与软骨细胞相互作用,为细胞附着、增殖和分化提供更好的环境,从而促进ECM的生成。已发表的一项研究报道了这一现象,作者使用含有低浓度κ-弹性蛋白的水凝胶进行弹性软骨的生物工程。他们发现,与负载不含κ-弹性蛋白的水凝胶中的软骨细胞相比,悬浮在含有κ-弹性蛋白的水凝胶中的软骨细胞能产生更多的细胞外基质。这些结果进一步揭示了含生物弹性蛋白的DN水凝胶有助于维持软骨细胞表型的稳定性和软骨形成过程。
2.5负载细胞构建体的体内弹性软骨再生
研究人员在裸鼠身上评估了含有耳软骨细胞的GHE水凝胶的再生潜力。使用聚二甲基硅氧烷(PDMS)模型铸造了由三种水凝胶制成的载细胞圆片。将水凝胶圆片植入皮下,2个月后取出,比较三组软骨的形成情况。如图5A所示,纯GelMA制成的圆片太软,无法承受皮肤张力,植入后立即聚集并失去了原来的圆形。在接下来的2个月中,GelMA椎间圆片在没有软骨生成的情况下发生降解。虽然GH椎间圆片保持了基本形状,但由于软骨样组织形成不理想,其重量减少了约24%(图5B和图16A)。相比之下,GHE组没有观察到明显的重量变化(图16B)。显然,GHE水凝胶中产生的白色组织被认为是乳白色软骨样组织的形成。血红素-伊红(H&E)和黄红素O染色显示,GHE水凝胶中的细胞形成了经典的软骨细胞腔隙结构,并有软骨特异性ECM沉积,但在GH组中观察到的细胞较少(图5C)。
最后,如图5D所示,本发明使用含有细胞的GHE水凝胶打印了人耳形状的弹性组织制品(长约2cm),并将其移植到裸鼠体内(n=5)。作为对照组,也使用GH水凝胶生物打印了满意度较低的耳形弹性组织制品(n=3)。在体内培养3个月后,大多数植入的GHE构建物的外观略有扁平。它们的变形可能是由于硬度不足(约20kPa)和皮肤张力的长期压力造成的。不过,它们仍然保持了完整性和基本的耳廓形状,这要归功于GHE水凝胶优越的韧性。取出的整个构建体呈乳白色软骨样组织。相比之下,GH工程耳变成了二维结构,完全失去了原来的形状。由于GH水凝胶的韧性不足,一个GH植入物甚至在培养过程中破裂。在体内3个月后,使用GHE水凝胶的工程耳的质量仍然没有显著变化,这主要是由于新软骨组织再生和天然生物材料降解之间的平衡所致(图5E i)。而GH工程耳的初始重量减少了约55%,这是因为大部分水凝胶降解了,但新软骨组织却没有很好地再生(图5E ii)。组织学染色显示,整个GHE耳廓构建体形成了初步成熟的软骨样组织,维多利亚蓝对弹性纤维的阳性染色进一步证实了其弹性软骨的特征(图5F)。相反,GH耳廓构建体未能形成弹性软骨样组织(图17-20)。在GH耳廓构建体中甚至观察到了成骨分化。在组织学染色图像上观察到细胞和水凝胶的分离区域。这种现象可能是细胞悬浮液的不均匀混合和略高粘度的生物墨水造成的。然后,本发明对COL II和弹性蛋白进行了免疫组化染色,以验证弹性软骨样组织的形成,结果显示这两种弹性软骨特异性蛋白均有高表达(图5G)。如图5H所示,第3个月末取出的生物打印耳廓形构建体的胶原蛋白含量达到了原生软骨的约80%,明显高于在体内培养2个月的含有细胞的GHE椎间圆片。相比之下,细胞负载的GH圆片在2个月后取出时,胶原蛋白的表达明显偏低。GAG含量也呈现出同样的趋势。虽然生物打印的耳廓形状构建体的GAG含量没有达到原生软骨的水平,但在体内培养一个月后,其GAG含量比培养2个月的GHE椎间圆片高出一倍。定量分析显示,与GH水凝胶相比,GHE显著促进了软骨细胞ECM的分泌和沉积。
3、结论
总之,本发明开发出了由GelMA、HA-NB和动物源性弹性蛋白组成的具有双交联双网络结构的DN水凝胶生物活性生物墨水,具有合适的流变特性和细胞生物性良性交联,可用于3D挤出生物打印工程化复杂弹性组织。GHE水凝胶表现出卓越的机械性能,包括韧性、伸展性、弹性、抗疲劳能力、粘弹性以及对形变反应的高弹性。利用GHE水凝胶作为生物墨水,以令人满意的保真度对复杂的弹性组织进行了生物打印,并在体内保持了长期的完整性和总体形状。此外,本发明的生物活性生物墨水还被证明有利于生物打印组织的细胞行为和生物功能。具体来说,它们有利于细胞扩散和表型维持,并促进了弹性软骨特异性ECM沉积和弹性软骨样组织的形成。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例,可以理解的是,上述实施例是示例性的,不能理解为对本发明的限制,本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (10)
1.一种双网络强韧弹性生物活性墨水,其特征在于,所述的双网络强韧弹性生物活性墨水具有以下的成分:甲基丙烯酰明胶、邻硝基苄基接枝透明质酸和弹性蛋白。
2.根据权利要求1所述一种双网络强韧弹性生物活性墨水,其特征在于,所述的双网络强韧弹性生物活性墨水具有以下重量份数的成分:甲基丙烯酰明胶2.5~10份、邻硝基苄基接枝透明质酸0.5~2份和弹性蛋白0.5~2份。
3.根据权利要求1所述一种双网络强韧弹性生物活性墨水,其特征在于,所述的双网络强韧弹性生物活性墨水具有以下重量份数的成分:甲基丙烯酰明胶5份、邻硝基苄基接枝透明质酸1份和弹性蛋白1份。
4.根据权利要求1至3任一项所述一种双网络强韧弹性生物活性墨水,其特征在于,所述弹性蛋白直接提取于哺乳动物。
5.一种弹性组织制品,其特征在于,所述的弹性组织制品由权利要求1至4任一项所述一种双网络强韧弹性生物活性墨水通过三维生物打印制得。
6.根据权利要求5所述的一种弹性组织制品,其特征在于,所述的弹性组织制品具有双交联双网络结构,所述双交联双网络结构通过第一层网络和第二层网络之间交联得到;甲基丙烯酰明胶通过自由基聚合形成所述第一层网络,弹性蛋白和邻硝基苄基接枝透明质酸通过动态希夫碱反应形成所述第二层网络,所述第一层网络和所述第二层网络之间通过稀疏的甲基丙烯酰明胶和邻硝基苄基接枝透明质酸中醛基的交联加固。
7.根据权利要求5或6所述一种弹性组织制品,其特征在于,所述的弹性组织制品的平均孔径为196.51±72.56μm;应变为167±5%,韧性为45±3kJ·m-3,压缩模量为19±3kPa。
8.基于权利要求5至7任一项所述一种弹性组织制品的三维生物打印方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)将甲基丙烯酰明胶、邻硝基苄基接枝透明质酸和弹性蛋白溶解,制备水凝胶前体溶液;
(2)将负载细胞的水凝胶前体溶液导入三维生物打印机中进行打印,后在近紫外光下进行固化直至形成双交联双网络结构,得到弹性组织制品。
9.根据权利要求8所述一种弹性组织制品的三维生物打印方法,其特征在于,步骤(1)中具体为:将甲基丙烯酰明胶、邻硝基苄基接枝透明质酸和弹性蛋白溶解于DPBS或培养基中,37±3℃进行过夜,制备水凝胶前体溶液。
10.根据权利要求8所述一种弹性组织制品的三维生物打印方法,其特征在于,在紫外光下进行固化的时间为0.5~1.5分钟。
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