CN117797315A - 一种促进损伤愈合的软骨修复材料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种促进损伤愈合的软骨修复材料及其制备方法，属于组织工程生物材料技术领域。本发明以聚乳酸作为骨架材料，负载特定比例的茶多酚、硫酸软骨素和柠檬酸镁，结合特定的静电纺丝工艺，成功制备得到了一种软骨修复材料，能够解决现有技术中软骨修复材料的促软骨组织愈合、促进干细胞成软骨分化的能力尚有待提升的问题。本发明提供的软骨修复材料不仅保留了原料的优异生物相容性，而且实现了各原料之间的协同作用，相互配合起到促进软骨组织愈合的效果。本发明提供的软骨修复材料能够有效促进间充质干细胞成软骨分化，实现优异的成软骨作用，在促损伤愈合产品开发领域中呈现出优良前景。
Description
技术领域
本发明涉及组织工程生物材料技术领域，尤其涉及一种促进损伤愈合的软骨修复材料及其制备方法。
背景技术
关节表面覆盖着一层透明软骨，其中95％以上是软骨基质成分，具有分散和缓冲垂直压力和剪切力的作用，仅有5％的软骨细胞分散在基质中，维持着基质成分平衡。由于关节表面透明软骨组织具有无神经、无血管的解剖结构特征以及缓冲承受人体压力的功能特征，所以其自我修复和再生能力很差。而关节软骨缺损是一类常见疾病，创伤、炎症、肿瘤、退变等原因导致的软骨损伤、缺失极为常见，常表现为顽固性疼痛、关节活动障碍，严重者可丧失关节功能，已成为导致肢体残疾和劳动能力丧失的主要原因之一。
目前临床应用的治疗方法主要包括软骨下骨骨髓刺激(一般多采用微骨折术)、自体软骨块移植、自体软骨细胞移植及自体基质诱导的软骨再生技术等。微骨折术是利用关节透镜将软骨受损部位清创，在暴露的软骨下骨上打孔，使骨髓间充质干细胞能够到达损伤部位并起修复损伤部位的作用。其效果迅速而显著，但有效持续时间短暂。自体软骨块移植需要取自身非负重部位健康软骨块，适用于软骨缺损面积较小(＜2cm2)的损伤治疗，但存在供区关节疼痛、退化、关节不稳等供区继发症。自1994年Brittberg等首次报道自体软骨细胞移植应用于临床以来，经过十多年的发展，自体软骨细胞移植技术已经经历了多次技术改进。自体软骨细胞第一代移植技术在将软骨细胞悬液移植到损伤部位后需要采用患者自体骨膜封闭缺损位置，技术相对复杂，手术时间较长，且存在骨膜增生、骨膜脱落、细胞流失等风险；第二代技术采用胶原/透明质酸膜代替自体骨膜封闭缺损表面，但仍无法避免细胞流失的风险；第三代技术是在胶原膜上直接种植软骨细胞，通过纤维蛋白胶固定在软骨缺损部位，但仍无法解决自体软骨细胞移植技术存在的以下问题：
1)、需二次手术，增加了患者承受的痛苦及负担；
2)、自体健康组织取材会造成供区疼痛、供区软骨退化等并发症；
3)、由于软骨细胞寿命短、采集的健康软骨组织有限，许多患者由于在体外培养过程没有达到移植所需的细胞数量而无法完成治疗。
中国专利CN111701075A公开了一种软骨修复材料、软骨重建生物支架及制备方法，软骨修复材料包括生物基质和固化液，其中，生物基质包括胶原蛋白、纤连蛋白和软骨形态发生蛋白，混合制成溶液或冻干粉形式进行使用；固化液包括DMEM培养基、血清和Hepes缓冲液；使用时，既可以将生物基质和固化液混合后直接填充到软骨缺损处，也可以在体外预先固化成型，做成软骨重建生物支架，再用于软骨贴补。使用时可以进一步添加软骨细胞或干细胞，提高软骨修复材料的分化能力。
但是现有技术中软骨修复材料的促软骨组织愈合、促进干细胞成软骨分化的能力尚有待提升。
发明内容
本发明的目的在于提供软骨修复材料，具有优异的促软骨组织愈合能力，能够有效促进干细胞成软骨分化。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种软骨修复材料，由包括以下重量份数的原料制备得到：
聚乳酸8000～12000份、茶多酚1.8～2.2份、硫酸软骨素0.8～1.2份和柠檬酸镁0.3～0.8份。
本发明还提供了上述软骨修复材料的制备方法，包括以下步骤：
将原料溶解在溶剂中，得到静电纺丝共混液；
利用所述静电纺丝共混液进行静电纺丝，得到软骨修复材料。
优选的，所述溶剂中包含丙酮和二氯甲烷。
优选的，所述丙酮和二氯甲烷的体积比为1:3～5。
优选的，所述静电纺丝共混液中聚乳酸的终浓度为8～12g/L。
优选的，所述静电纺丝采用的推注速度为0.3～0.8mL/h；
所述静电纺丝采用的电压为10～30kV。
优选的，所述静电纺丝采用的温度为20～25℃；
所述静电纺丝采用的湿度为40～50％。
优选的，所述原料溶解在溶剂中伴随磁力搅拌；
所述磁力搅拌的时间为4～16h。
本发明还提供了通过上述制备方法得到的软骨修复材料。
本发明还提供了上述软骨修复材料在制备促损伤愈合产品中的应用。
本发明的技术效果和优点：
本发明以聚乳酸作为骨架材料，负载特定比例的茶多酚、硫酸软骨素和柠檬酸镁，结合特定的静电纺丝工艺，成功制备得到了一种软骨修复材料，不仅保留了原料的优异生物相容性，而且实现了各原料之间的协同作用，相互配合起到促进软骨组织愈合的效果。本发明提供的软骨修复材料能够有效促进间充质干细胞成软骨分化，实现优异的成软骨作用，在促损伤愈合产品开发领域中呈现出优良前景。
具体实施方式
本发明提供了一种软骨修复材料，由包括以下重量份数的原料制备得到：聚乳酸8000～12000份、茶多酚1.8～2.2份、硫酸软骨素0.8～1.2份和柠檬酸镁0.3～0.8份。
在本发明中，所述软骨修复材料的原料包括聚乳酸8000～12000份，进一步优选为9000～11000份；所述软骨修复材料的原料包括茶多酚1.8～2.2份，进一步优选为1.9～2.1份；所述软骨修复材料的原料包括硫酸软骨素0.8～1.2份，进一步优选为0.9～1.1份；所述软骨修复材料的原料包括柠檬酸镁0.3～0.8份，进一步优选为0.4～0.6份。
本发明还提供了上述软骨修复材料的制备方法，包括以下步骤：将原料溶解在溶剂中，得到静电纺丝共混液；利用所述静电纺丝共混液进行静电纺丝，得到软骨修复材料。
在本发明中，所述溶剂中优选包含丙酮和二氯甲烷，所述丙酮和二氯甲烷的体积比优选为1:3～5；所述静电纺丝共混液中聚乳酸的终浓度优选为8～12g/L；所述静电纺丝采用的推注速度优选为0.3～0.8mL/h；所述静电纺丝采用的电压优选为10～30kV；所述静电纺丝采用的温度优选为20～25℃；所述静电纺丝采用的湿度优选为40～50％；所述原料溶解在溶剂中优选伴随磁力搅拌；所述磁力搅拌的时间优选为4～16h。
本发明还提供了通过上述制备方法得到的软骨修复材料。
本发明还提供了上述软骨修复材料在制备促损伤愈合产品中的应用，所述促损伤愈合产品可以以本发明软骨修复材料作为主体，添加其他辅料，或是以其他修复材料为主体，结合本发明提供的软骨修复材料；本发明所述促损伤愈合产品优选与其他修复材料配合使用，所述修复材料包括自体软骨组织、合成材料、生物活性物质、支架材料和生物支架。
其中，所述自体软骨组织是指从患者自身身体其他部位获取的软骨组织。由于自体软骨与患者的身体兼容性好，不会引发免疫反应，因此被广泛应用于关节软骨修复中。医生会从患者的露骨、侧半月板或膝关节等部位取出软骨组织，经过处理后植入到受损的关节中，促使软骨再生；所述合成材料优选为聚乳酸酯或聚乳酸羟基灰石复合材料，这些合成材料具有良好的生物相容性和可降解性，在适当的条件下可以于本发明提供的软骨修复材料共同促进软骨细胞再生和组织修复；所述生物活性物质是指能够促进软骨细胞增殖和分化的物质。在关节软骨修复中，常用的生物活性物质包括生长因子、细胞因子和基质蛋白。这些物质可以通过注射、植入或载体释放的方式应用于关节软骨修复，促进软骨细胞的增殖和分化，加速软骨再生过程；所述支架材料是指用于支撑和定位修复组织的材料。在关节软骨修复中，支架材料可以帮助修复组织的定位和固定，促进软骨再生，具有良好的生物相容性和机械性能，可以促进软骨细胞的附着和生长；生物支架是指由天然或合成材料构成的二维结构，可以模拟关节软骨的微环境，提供细胞生长和组织再生所需的支持和刺激。常见的生物支架材料包括胶原蛋白、明胶和海藻酸钠等。这些生物支架具有良好的生物相容性和生物活性，可以作为软骨细胞的载体，促进软骨再生。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例中用到的主要试剂来源：
聚乳酸(PLA)，购自美国Natureworks；
茶多酚，购自合肥博美生物科技有限责任公司；
硫酸软骨素(99％)，购自陕西森朗生物化工有限公司；
柠檬酸镁，购自上海阿拉丁生物科技有限公司；
丙酮，购自上海阿拉丁生物科技有限公司；
二氯甲烷(DCM)，购自上海阿拉丁生物科技有限公司。
实施例1
配制丙酮:二氯甲烷体积比为2:8的混合溶剂，准确称取10g聚乳酸溶解到1L混合溶剂中，磁力搅拌过夜消泡；
准确称取2mg茶多酚、1mg硫酸软骨素和0.5mg柠檬酸镁，加入到上述溶液中，在37℃条件下继续磁力搅拌4h，得到静电纺丝共混液；
将上述共混液转入注射器，设置推注速度为0.5mL/h、电压为20kV，在温度23℃、湿度45％的条件下进行静电纺丝，制备得到纤维材料。
实施例2
配制丙酮:二氯甲烷体积比为2.2:8.1的混合溶剂，准确称取10.5g聚乳酸溶解到1L混合溶剂中，磁力搅拌过夜消泡；
准确称取2.2mg茶多酚、0.8mg硫酸软骨素和0.4mg柠檬酸镁，加入到上述溶液中，在37℃条件下继续磁力搅拌2h，得到静电纺丝共混液；
将上述共混液转入注射器，设置推注速度为0.5mL/h、电压为15kV，在温度23℃、湿度50％的条件下进行静电纺丝，制备得到纤维材料。
实施例3
配制丙酮:二氯甲烷体积比为1.8:7.8的混合溶剂，准确称取10g聚乳酸溶解到1L混合溶剂中，磁力搅拌过夜消泡；
准确称取1.8mg茶多酚、1.2mg硫酸软骨素和0.5mg柠檬酸镁，加入到上述溶液中，在37℃条件下继续磁力搅拌4.5h，得到静电纺丝共混液；
将上述共混液转入注射器，设置推注速度为0.5mL/h、电压为25kV，在温度23℃、湿度40％的条件下进行静电纺丝，制备得到纤维材料。
对比例1
配制丙酮:二氯甲烷体积比为1:1的混合溶剂，准确称取10g聚乳酸溶解到1L混合溶剂中，磁力搅拌过夜消泡；
准确称取2mg茶多酚、1mg硫酸软骨素和0.5mg柠檬酸镁，加入到上述溶液中，在37℃条件下继续磁力搅拌4h，得到静电纺丝共混液；
将上述共混液转入注射器，设置推注速度为0.5mL/h、电压为20kV，在温度23℃、湿度45％的条件下进行静电纺丝，制备得到纤维材料。
对比例2
配制丙酮:二氯甲烷体积比为2:8的混合溶剂，准确称取30g聚乳酸溶解到1L混合溶剂中，磁力搅拌过夜消泡；
准确称取2mg茶多酚、1mg硫酸软骨素和0.5mg柠檬酸镁，加入到上述溶液中，在37℃条件下继续磁力搅拌4h，得到静电纺丝共混液；
将上述共混液转入注射器，设置推注速度为0.5mL/h、电压为20kV，在温度23℃、湿度45％的条件下进行静电纺丝，制备得到纤维材料。
对比例3
配制丙酮:二氯甲烷体积比为2:8的混合溶剂，准确称取10g聚乳酸溶解到1L混合溶剂中，磁力搅拌过夜消泡；
准确称取1mg茶多酚、2mg硫酸软骨素和0.1mg柠檬酸镁，加入到上述溶液中，在37℃条件下继续磁力搅拌4h，得到静电纺丝共混液；
将上述共混液转入注射器，设置推注速度为0.5mL/h、电压为20kV，在温度23℃、湿度45％的条件下进行静电纺丝，制备得到纤维材料。
对比例4
配制丙酮:二氯甲烷体积比为2:8的混合溶剂，准确称取10g聚乳酸溶解到1L混合溶剂中，磁力搅拌过夜消泡；
准确称取1mg茶多酚、0.5mg硫酸软骨素和1mg柠檬酸镁，加入到上述溶液中，在37℃条件下继续磁力搅拌4h，得到静电纺丝共混液；
将上述共混液转入注射器，设置推注速度为0.5mL/h、电压为20kV，在温度23℃、湿度45％的条件下进行静电纺丝，制备得到纤维材料。
实验例1不同材料影响软骨组织愈合
按照实施例1和对比例1～4的方法制备得到不同的纤维材料，分别记为实验组A、B、C、D、E。
准备18只雄性C57小鼠，随机平均分为6组，对应上述实验组和对照组，进行半月板损伤手术：麻醉后切开小鼠右膝膝关节皮肤、皮下筋膜及关节囊，剪断内侧半月板胫韧带，同时植入等量上述纤维材料并进行缝合(对照组直接进行缝合)，术后保持小鼠自由活动以及正常饮食。
4周后对小鼠关节软骨组织愈合情况进行观察，按照以下表1所示的评分标准进行打分记录(下文评分标准参照现有的关节软骨组织愈合标准制定)：
表1关节软骨组织愈合评分标准
评分结果如下表2所示：
表2各组小鼠关节软骨组织愈合结果
| 实验组 | 分值 |
| A | 90.48±0.40 |
| B | 89.17±2.75 |
| C | 77.28±1.08 |
| D | 65.45±0.64 |
| E | 60.21±3.15 |
| 对照组 | 30.07±0.64 |
结果显示，通过本发明实施例1提供的纤维材料在植入半月板损伤小鼠模型后能够起到促进软骨组织愈合的效果。
实验例2不同材料影响成软骨相关基因表达
分组同实验例1，将不同实验组得到的纤维材料分别放入24孔板，对照组为空白，以1×105个/孔的细胞数量将hMSCs细胞种植到上述纤维材料(或空白孔)上，每组做3个平行孔，培养至细胞充分贴壁生长，每两天更换不完全成软骨诱导培养基。
诱导3d后提取细胞总RNA，逆转录为cDNA后采用荧光定量PCR法对SOX9、Aggrecan和GAPDH这三种成软骨相关基因进行表达量检测。
结果如表3所示：
表3成软骨相关基因表达量检测结果
| 实验组 | 基因表达量 |
| A | 4.80±0.04* |
| B | 4.22±0.15* |
| C | 2.78±0.19 |
| D | 2.71±0.06 |
| E | 2.55±0.35 |
| 对照组 | 1.53±0.14 |
注：“*”表示组间比较具有显著差异。
结果显示，本发明实施例1提供的纤维材料与hMSCs细胞共培养能够有效促进间充质干细胞成软骨分化，与对比例相比实现了更优的成软骨作用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种软骨修复材料，其特征在于，由包括以下重量份数的原料制备得到：
聚乳酸8000～12000份、茶多酚1.8～2.2份、硫酸软骨素0.8～1.2份和柠檬酸镁0.3～0.8份。
2.权利要求1所述的软骨修复材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将原料溶解在溶剂中，得到静电纺丝共混液；
利用所述静电纺丝共混液进行静电纺丝，得到软骨修复材料。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述溶剂中包含丙酮和二氯甲烷。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述丙酮和二氯甲烷的体积比为1:3～5。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述静电纺丝共混液中聚乳酸的终浓度为8～12g/L。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述静电纺丝采用的推注速度为0.3～0.8mL/h；
所述静电纺丝采用的电压为10～30kV。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述静电纺丝采用的温度为20～25℃；
所述静电纺丝采用的湿度为40～50％。
8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述原料溶解在溶剂中伴随磁力搅拌；
所述磁力搅拌的时间为4～16h。
9.通过权利要求1～8任一项所述的制备方法得到的软骨修复材料。
10.权利要求1或9所述的软骨修复材料在制备促损伤愈合产品中的应用。
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