CN117797045A - 一种促牙体硬组织再矿化和牙周再生材料的制备及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种促牙体硬组织再矿化和牙周再生材料的制备及应用，包括如下步骤：将牛血清白蛋白与还原剂混合，随后依次滴加磷酸氢根离子和钙离子水溶液，静置后形成水凝胶材料。本发明有益效果：能够快速、可控地诱导牙体硬组织(牙釉质、牙本质)的再矿化和促进牙周组织再生；抑制口腔常见致病菌生物膜的形成；无毒、无刺激，具备优良的生物安全性，使用效果理想。
Description
技术领域
本发明属于生物材料技术领域，尤其是涉及一种促牙体硬组织再矿化和牙周再生材料的制备及应用。
背景技术
龋病是一个动态的疾病过程，口腔环境中脱矿和再矿化的平衡被打破，脱矿占据主导，若不及时加以干预将形成不可逆空洞。釉质进一步脱矿和缺损也将导致牙本质暴露，这也是牙本质敏感症形成的主要原因。目前，常见的再矿化材料主要是以钙及磷酸根等矿物离子为有效成分，并辅以氟离子或其他物质，或者以釉原蛋白衍生物、聚电解质、有机化合物等作为应用对象用于牙体硬组织表明再矿化的研究，从而达到矿物重建的目的。然而，传统的研究均存在一定的局限性，例如：矿化速度慢，矿化效果依赖环境中的钙磷浓度和残余晶体；氟制剂存在导致氟中毒的风险；再矿化层与牙齿表面结合能力差；原材料昂贵不易得；生物相容性差等。
牙周炎是一种口腔常见的慢性感染性疾病，最主要的特征是牙周支持组织的破坏，严重者可导致牙齿松动脱离。牙周治疗的目的是控制菌斑，消除炎症，实现缺损组织的再生修复，维持牙周健康。牙周膜干细胞是一类维持牙周组织动态平衡和缺损修复的关键细胞，已有研究证实牙周膜干细胞能够促进动物牙周组织，如牙骨质、牙槽骨和牙周膜的再生。因此，干细胞技术治疗牙周炎是目前的研究热点。然而，关于牙周膜干细胞治疗牙周病的相关方法仍存在诸多问题，如临床转化困难、疗效不确切、工艺复杂、成本高等诸多问题。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在提出一种促牙体硬组织再矿化和牙周再生材料的制备及应用，以克服现有治疗方法和相关材料的缺点，该材料合成简单、使用方便、性质稳定、廉价安全，能用于牙体硬组织快速再矿化及促进牙周组织再生。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种促牙体硬组织再矿化和牙周再生材料的制备方法，包括如下步骤：将牛血清白蛋白与还原剂混合，随后依次滴加磷酸氢根离子和钙离子水溶液，静置后形成水凝胶材料。牙体硬组织包括牙釉质、牙本质的一种或两种。进一步地，牛血清白蛋白为未接枝或接枝不同疏水基团的牛血清白蛋白；
还原剂包括三(2-羰基乙基)膦盐酸盐、还原型谷胱甘肽、二硫苏糖醇中的一种或两种及以上。
进一步地，疏水基团包括双键、苯酚中的一种或两种。
进一步地，牛血清白蛋白的溶液浓度为40-200mg/mL，还原剂的溶液浓度为10-100mM；
牛血清白蛋白的溶液与还原剂的溶液体积比为1：(1-1.2)。
进一步地，滴加完磷酸氢根离子水溶液后，混合溶液的磷酸氢根离子水溶液的终浓度为3-30mM；
滴加完钙离子水溶液后，混合溶液的钙离子的终浓度为5-50mM。
一种促牙体硬组织再矿化和牙周再生材料的制备，包括如下步骤：
1)在常温下，将未接枝或接枝疏水基团的牛血清白蛋白溶解于含10-100mM HEPES缓冲液的水溶液中，其终浓度为40-200mg/mL，配置成A液。
2)将还原剂溶解于含10-100mM HEPES缓冲液的水溶液中，其终浓度为10-100mM，配置成B液。
3)将A、B液以体积比1：(1-1.2)充分混合均匀。
4)向步骤3)中获得的混合溶液中逐滴加入磷酸氢根离子水溶液，使得磷酸氢根离子的终浓度为3-30mM。
5)向步骤4)中逐滴加入钙离子水溶液，使得钙离子的终浓度为5-50mM。
6)步骤5)混合溶液静置至形成水凝胶。
一种促牙体硬组织再矿化和牙周再生材料的制备方法制备得到的材料能够稳定无定型磷酸钙纳米颗粒，无定型磷酸钙纳米颗粒的粒径为10-200nm。
一种促牙体硬组织再矿化和牙周再生材料的制备方法制备得到的材料应用于诱导脱矿牙体硬组织的再矿化，使用水凝胶材料处理脱矿牙釉质或牙本质后，然后使用0.5％-5.25％的次氯酸钠溶液处理，可应用于快速、可控地诱导牙体硬组织的再矿化。
一种促牙体硬组织再矿化和牙周再生材料的制备方法制备得到的材料注射到牙周病变部位，应用于促进牙周组织的再生。
一种促牙体硬组织再矿化和牙周再生材料的制备方法制备得到的材料能够负载多种抑菌成分，其特征在于：
抑菌成分包括表面活性剂、金属离子、金属氧化物、植物抑菌剂中的一种或两种及以上；
优选地，表面活性剂包括西吡氯铵、苯扎氯铵、奥替尼啶、氯己定中的一种或两种及以上；
金属离子包括银离子；
金属氧化物包括氧化锌、氧化铜；
植物抑菌剂包括茶多酚。
进一步地，一种促牙体硬组织再矿化和牙周再生材料的制备方法制备的材料在促进脱矿牙体硬组织再矿化及牙周组织再生中的应用，应用于制备口腔感染性疾病药物中的应用；
优选地，口腔感染性疾病包括龋病、牙周病。
相对于现有技术，本发明所述的一种促牙体硬组织再矿化和牙周再生材料的制备及应用具有以下优势：
本发明所述的水凝胶材料，其设计合理、制备简便、原料易得、便宜安全；能够较长时间稳定无定型磷酸钙；能负载多种抑菌活性成分，发挥抑菌效果；能够快速、可控地诱导牙体硬组织(牙釉质、牙本质)的再矿化和促进牙周组织再生；无毒、无刺激，具备优良的生物安全性，使用效果理想。
附图说明
构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为实验一中，对应正常牙釉质酸蚀60s后，其表面形态的低倍镜扫描电镜图；
图2为实验一中，对应正常牙釉质酸蚀60s后，其表面形态的高倍镜扫描电镜图；
图3为实验一中，对应正常牙本质酸蚀60s后，其表面形态的低倍镜扫描电镜图；
图4为实验一中，对应正常牙本质酸蚀60s后，其表面形态的高倍镜扫描电镜图；
图5为实验二中，使用临床常用再矿化产品氟保护漆后，脱矿牙釉质再矿化效果的低倍镜扫描电镜图；
图6为实验二中，使用临床常用再矿化产品氟保护漆后，脱矿牙釉质再矿化效果的的高倍镜扫描电镜图；
图7为实验二中，使用临床常用再矿化产品氟保护漆后，脱矿牙本质再矿化效果的的低倍镜扫描电镜图；
图8为实验二中，使用临床常用再矿化产品氟保护漆后，脱矿牙本质再矿化效果的的高倍镜扫描电镜图；
图9为实验三中，使用相转变牛血清白蛋白/无定形磷酸钙水凝胶后，应用1％次氯酸钠，诱导脱矿牙釉质再矿化的低倍镜扫描电镜图；
图10为实验三中，使用相转变牛血清白蛋白/无定形磷酸钙水凝胶后，应用1％次氯酸钠，诱导脱矿牙釉质再矿化的高倍镜扫描电镜图；
图11为实验三中，使用相转变牛血清白蛋白/无定形磷酸钙水凝胶后，应用1％次氯酸钠，诱导脱矿牙本质再矿化的低倍镜扫描电镜图；
图12为实验三中，使用相转变牛血清白蛋白/无定形磷酸钙可注射水凝胶后，应用1％次氯酸钠，诱导脱矿牙本质再矿化的高倍镜扫描电镜图；
图13为实验四中，使用接枝疏水基团的相转变牛血清白蛋白-双键/无定形磷酸钙水凝胶后，应用1％次氯酸钠，诱导脱矿牙釉质再矿化的低倍镜扫描电镜图；
图14为实验四中，使用接枝疏水基团的相转变牛血清白蛋白-双键/无定形磷酸钙水凝胶后，应用1％次氯酸钠，诱导脱矿牙釉质再矿化的高倍镜扫描电镜图；
图15为实验四中，使用接枝疏水基团的相转变牛血清白蛋白-双键/无定形磷酸钙水凝胶后，应用1％次氯酸钠，诱导脱矿牙本质再矿化的低倍镜扫描电镜图；
图16为实验四中，使用接枝疏水基团的相转变牛血清白蛋白-双键/无定形磷酸钙水凝胶后，应用1％次氯酸钠，诱导脱矿牙本质再矿化的高倍镜扫描电镜图；
图17为实验五中，使用相转变牛血清白蛋白/无定形磷酸钙可注射水凝胶或相转变牛血清白蛋白-双键/无定形磷酸钙可注射水凝胶促进牙周膜干细胞增殖的结果图。
图18为实验六中，使用无菌PBS处理后，牙齿表面变形链球菌生物膜形成的激光共聚焦显微镜图；
图19为实验七，使用负载西吡氯铵的相转变牛血清白蛋白/无定形磷酸钙处理后，牙齿表面变形链球菌生物膜形成的激光共聚焦显微镜图。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
实施例一
一种用于牙体硬组织快速再矿化及促进牙周组织再生水凝胶材料，通过如下步骤制备而成，
(1)相转变牛血清白蛋白合成
在常温下，将1mL 50mg/mL的牛血清白蛋白水溶液或接枝疏水基团的的牛血清白蛋白分别与1mL三(2-羰基乙基)膦盐酸盐水溶液，充分混合均匀。
(2)相转变牛血清白蛋白(-疏水基团)/无定形磷酸钙水凝胶材料的形成；
在常温下，向步骤(1)中逐滴加入磷酸氢二钾水溶液，使得磷酸氢根离子的终浓度为3-30mM。随后逐滴加入氯化钙水溶液，使得钙离子的终浓度为5-50mM。混合溶液静置至形成水凝胶。
(3)负载西吡氯铵的水凝胶材料用于抑制细菌生物膜的形成
在步骤(1)加入三(2-羰基乙基)膦盐酸盐水溶液之前，先加入10μL1mg/mL的西吡氯铵混合均匀作用半小时。选择口腔最常见的致龋微生物变形链球菌为目标菌株，使用激光共聚焦显微镜探究负载西吡氯铵的水凝胶材料对变形链球菌生物膜的抑制作用。
实施例二
在实施例一(2)中的水凝胶材料用于牙体硬组织快速的再矿化
在常温下，该材料涂抹至目标样本后，使用1％次氯酸钠溶液作用1分钟，即可得到牙体硬组织快速再矿化的效果。
对比例一
在实施例二中，水凝胶材料用等体积的无菌PBS替换，其他步骤与实施例二相同。
对比例二
在实施例二中，水凝胶材料用临床常用再矿化产品氟保护漆替换，其他步骤与实施例二相同。
实施例三
在实施例一(2)中的水凝胶材料用于促进牙周膜干细胞的增殖
选择牙周膜干细胞作为实验对象，采用CCK-8法探究该可注射水凝胶材料于体外对牙周膜干细胞增殖的影响。
对比例四
在实施例三中，水凝胶材料用等体积的无菌PBS替换，替他步骤与实施例三相同。
实验一
收集因智齿阻生或正畸减数拔除的完整、无龋坏、无明显磨耗的新鲜离体牙25个，去离子水冲洗干净，用慢速砂轮在流水冷却下制备1.5mm厚的牙釉质/牙本质片，随后用砂纸抛光制备成3mm×4mm×1mm的牙釉质/牙本质样本，牙釉质/牙本质样本表面涂布35％的磷酸酸蚀剂作用60s，并随机选择5个进行SEM表征，牙釉质表征结果参见图1、图2，牙本质表征结果参见图3、图4，作为空白对照。
实验二
将临床常用再矿化产品氟保护漆涂布于用35％磷酸酸蚀剂酸蚀60s的牙釉质/牙本质表面上，自然晾干后，样品置于人工唾液中12h，随即进行SEM检测，证明脱矿釉质(图5、图6)/牙本质(图7、图8)仅有少量的不规则晶体生成。
实验三
将实施例一中步骤(2)的相转变牛血清白蛋白/无定形磷酸钙水凝胶材料涂布于用35％磷酸酸蚀剂酸蚀60s的牙釉质/牙本质表面上，自然晾干后，涂布1％-5.25％次氯酸钠溶液作用2min，去离子水冲洗后，自然晾干。上述步骤重复3次。样品置于人工唾液中12h，随即进行SEM检测，证明脱矿釉质(图9、图10)/牙本质(图11、图12)有致密晶体生成。
实验四
将实施例一中步骤(2)的相转变牛血清白蛋白-双键/无定形磷酸钙水凝胶材料涂布于用35％磷酸酸蚀剂酸蚀60s的牙釉质/牙本质表面上，自然晾干后，涂布1％-5.25％次氯酸钠溶液作用2min，去离子水冲洗后，自然晾干。上述步骤重复3次。样品置于人工唾液中12h，随即进行SEM检测，证明脱矿釉质(图13、图14)/牙本质(图15、图16)有致密晶体生成。
实验五
在96孔板中分别接种实施例一中步骤(2)的相转变牛血清白蛋白/无定形磷酸钙水凝胶材料或相转变牛血清白蛋白-双键/无定形磷酸钙水凝胶材料，将三代对数生长期的牙周膜干细胞接种其上，每孔加入5000个细胞，连续培养7天，每两天进行一次换液，分别在1天，3天，5天，7天使用CCK-8检测吸光度值并绘制柱状图(图17)，证实凝胶能够显著促进牙周膜干细胞的增殖。
实验六
将无菌PBS涂抹于无菌的牙釉质样本表面，自然晾干后，置于无菌24孔板中，每个孔中加入密度为107CFU/mL的变形链球菌悬液，置于培养箱中孵育24h。无菌PBS轻轻冲洗样品3次后，置于新的24孔板中，使用LIVE/DEAD BaclightTM试剂盒避光染色样本15min，再次使用无菌PBS轻轻冲洗掉残余的染液。随后，利用激光共聚焦显微镜，对每个样本进行拍摄。生物膜形成结果参见图18，作为空白对照。
实验七
将实施例一中步骤(3)的相转变牛血清白蛋白@西吡氯铵/无定形磷酸钙水凝胶材料涂布于牙釉质样本表面上，自然晾干后，置于无菌24孔板中，每个孔中加入密度为107CFU/mL的变形链球菌悬液，置于培养箱中孵育24h。无菌PBS轻轻冲洗样品3次后，置于新的24孔板中，使用LIVE/DEAD BaclightTM试剂盒避光染色样本15min，再次使用无菌PBS轻轻冲洗掉残余的染液。随后，利用激光共聚焦显微镜，对每个样本进行拍摄。结果证实该负载西吡氯铵的凝胶材料能够显著抑制变形链球菌生物膜的形成(图19)。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种促牙体硬组织再矿化和牙周再生材料的制备，其特征在于：包括如下步骤：将牛血清白蛋白与还原剂混合，随后依次滴加磷酸氢根离子和钙离子水溶液，静置后形成水凝胶材料。
2.根据权利要求1所述的一种促牙体硬组织再矿化和牙周再生材料的制备，其特征在于：牛血清白蛋白为未接枝或接枝不同疏水基团的牛血清白蛋白；
还原剂包括三(2-羰基乙基)膦盐酸盐、还原型谷胱甘肽、二硫苏糖醇中的一种或两种及以上。
3.根据权利要求2所述的一种促牙体硬组织再矿化和牙周再生材料的制备，其特征在于：疏水基团包括双键、苯酚中的一种或两种。
4.根据权利要求1所述的一种促牙体硬组织再矿化和牙周再生材料的制备，其特征在于：牛血清白蛋白的溶液浓度为40-200mg/mL，还原剂的溶液浓度为10-100mM；
牛血清白蛋白的溶液与还原剂的溶液体积比为1：(1-1.2)。
磷酸氢根离子为磷酸氢二钾水溶液；
钙离子水溶液为氯化钙水溶液。
5.根据权利要求1所述的一种促牙体硬组织再矿化和牙周再生材料的制备，其特征在于：滴加完磷酸氢根离子水溶液后，混合溶液的磷酸氢根离子水溶液的终浓度为3-30mM；
滴加完钙离子水溶液后，混合溶液的钙离子的终浓度为5-50mM。
6.权利要求1-5任一项所述的一种促牙体硬组织再矿化和牙周再生材料的制备方法制备得到的材料能够稳定无定型磷酸钙纳米颗粒，其特征在于：无定型磷酸钙纳米颗粒的粒径为10-200nm。
7.权利要求1-5任一项所述的一种促牙体硬组织再矿化和牙周再生材料的制备方法制备得到的材料应用于诱导脱矿牙釉质的再矿化，其特征在于：使用水凝胶材料处理脱矿牙釉质或牙本质后，然后使用0.5％-5.25％的次氯酸钠溶液处理，应用于快速、可控地诱导牙体硬组织的再矿化。
8.权利要求1-5任一项所述的一种促牙体硬组织再矿化和牙周再生材料的制备方法制备得到的材料注射到牙周病变部位，应用于促进牙周组织的再生。
9.权利要求1-5任一项所述的一种促牙体硬组织再矿化和牙周再生材料的制备方法制备得到的材料能够负载多种抑菌成分，其特征在于：
抑菌成分包括表面活性剂、金属离子、金属氧化物、植物抑菌剂中的一种或两种及以上；
优选地，表面活性剂包括西吡氯铵、苯扎氯铵、奥替尼啶、氯己定中的一种或两种及以上；
金属离子包括银离子；
金属氧化物包括氧化锌、氧化铜；
植物抑菌剂包括茶多酚。
10.权利要求1-6任一项所述的一种促牙体硬组织再矿化和牙周再生材料的制备方法制备的材料在促进脱矿牙体硬组织再矿化及牙周组织再生中的应用，应用于制备口腔感染性疾病药物中的应用；
优选地，口腔感染性疾病包括龋病、牙周病。
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