CN117795343A - 神经退行性病患的诊断指标 - Google Patents
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Abstract
一种评价患有某些神经退行性疾病(例如，帕金森氏病)的个体关于病因诊断、预后和对治疗的反应的方法，其涉及无创采集生物样品(例如，静脉血)，分离小的神经元来源的细胞外囊泡(例如，外泌体)，测定其外部和/或内部内容物的提供信息的生物标志物(例如，信号传导激酶、催化蛋白和miRNA物种)的量以构建临床实用的诊断/预后/反应算法。
Description
相关申请的引用
本申请与2021年6月15日提交的美国临时申请63/210,939相关，并且其内容全部并入本文。
背景技术
神经退行性疾病的特征在于脑中的退行性变化，包括神经元的功能丧失和死亡。神经退行性疾病包括但不限于帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、亨廷顿病、肌萎缩性侧索硬化和路易体痴呆。
多种信号传导激酶牵涉在神经退行性疾病中。参见例如Mehdi,S.J.等人,“Protein Kinases and Parkinson’s Disease,”Int J Mol Sci.2016 Sep；17(9):1585(doi:10.3390/ijms17091585)；Martin,L.等人,“Tau protein kinases:Involvement inAlzheimer's disease,”Ageing Research Reviews,第12卷,第1期,2013年1月,第289-309页(doi.org/10.1016/j.arr.2012.06.003)；和Bowles,K.R.等人,“Kinase Signaling inHuntington’s Disease,”Journal of Huntington’s Disease 3(2014)9–123(DOI10.3233/JHD-140106)。
许多神经退行性疾病的特征在于蛋白质的寡聚形式的异常积累。据信这些寡聚形式会导致神经元退行性病变和死亡。特别地，帕金森氏病的特征在于α突触核蛋白的寡聚形式的积累。还已发现α突触核蛋白可与其他蛋白质如tau和淀粉样蛋白β聚集形成共聚物。
发明内容
参考图1，激酶的测定包括以下操作：获得体液样品，如来自受试者的血液或唾液样品(100)。可以处理血液样品以提供血液级分，例如血浆样品(110)。对血液样品富集细胞外囊泡，例如外泌体。这可以是两步操作，首先涉及分离出总外泌体(111)，其次涉及富集神经元来源的外泌体(112)。神经元来源的外泌体可以是来自所有神经元的外泌体，通常是(120a)，或者具体地是来自一部分神经元的外泌体，如使用多巴胺作为其神经递质的外泌体(112b)。
分离出的外泌体可以以三种方式进行处理。在一种方法中，使用总外泌体裂解物。在另一种方法中，例如通过在使用前透化和洗涤来分离和富集内部外泌体内容物或核心。这可涉及擦洗以去除附着在其表面的蛋白质(121)。在另一种方法中，分离出细胞外囊泡的膜内容物。
然后对外泌体产物进行进一步的分析(122)。分析涉及测量样品中选自以下的生物标志物：(i)多种不同的信号传导激酶；和(ii)来自选自以下的至少两组的生物标志物：(1)选自信号传导激酶和/或催化酶的一种或多种酶，(2)单体或寡聚形式的一种或多种神经退行性病变相关蛋白，和(3)一种或多种miRNA。这些生物标志物的测量值可以用于诊断测试中以确定特定神经退行性病患(例如，突触核蛋白病性病患)的存在或不存在或发生风险或其累积严重性或当前进展速度，或者确定药物将本文描述的一种或多种生物标志物蛋白质的量或相对量朝向正常量改变的功效。可以使用蛋白质印迹法或Eliza方法进行测定。
本文尤其公开了神经退行性病患如突触核蛋白病性病患、淀粉样蛋白病性病患、tau蛋白病和亨廷顿病以及与其相关的神经退行性病变的生物标志物谱。在某些实施方案中，生物标志物谱包含一组生物标志物的测量值，该组生物标志物包括至少一种信号传导激酶并且可以选自(1)至少一种信号传导激酶和任选地神经退行性病变相关蛋白的至少一种寡聚形式，或(2)一种或多种不同的信号传导激酶中的每一种。生物标志物谱可以包含神经退行性病变相关蛋白如α-突触核蛋白、淀粉样蛋白β、tau或亨廷顿蛋白的一种或多种寡聚形式的测量值。
测量的信号传导激酶可以是一种或多种激酶。它们可以选自相同的信号传导通路，如AKT或mTOR通路，或选自不同的信号传导通路。
测量的神经退行性病变相关蛋白的寡聚形式可以是形式的集合，如总寡聚α突触核蛋白，或单独的寡聚形式，如α突触核蛋白的六聚体。替代地，可以测量多种形式，如五聚体至部分可溶性丝聚体(filaments-mer)的范围内的α突触核蛋白寡聚体。也可以测量神经退行性病变相关蛋白的单体形式。因此，例如，生物标志物谱可以包含选自以下的一种或多种神经退行性病变相关蛋白形式中的每一种的测量值：(I)至少一种寡聚形式；(II)多种(例如，模式)寡聚形式；(III)至少一种寡聚形式和至少一种单体形式；(IV)多种寡聚形式和至少一种单体形式；(V)至少一种寡聚形式和多种单体形式；和(VI)多种寡聚形式和多种单体形式。
本文还公开了开发用于治疗神经退行性病患如突触核蛋白病性病患、淀粉样蛋白病性病患、tau蛋白病性病患和亨廷顿病的药物的方法。这些方法涉及使用生物标志物谱来确定候选药物对病患的效果。生物标志物谱包括生物标志物组的测量值，所述生物标志物组包括选自(1)至少一种信号传导激酶和任选地神经退行性病变相关蛋白的至少一种寡聚形式或(2)一种或多种不同的信号传导激酶中的每一种的生物标志物。生物标志物蛋白质可以从例如来自受试者血液的神经元来源的细胞外囊泡(例如，外泌体)定量。
在某些实施方案中，从例如从血液、唾液或尿液分离出的神经元来源的细胞外囊泡(例如，外泌体)测量蛋白质物种。所检查的物种可以源自外泌体细胞外囊泡的内部区室，例如源自已去除表面蛋白质的外泌体细胞外囊泡。以这种方式测量的生物标志物谱代表一种相对简单且非侵入性的测量主要源自中枢神经系统的外泌体内容物的手段。
因此，本公开的测量神经退行性病患的生物标志物谱的方法可用于用于测试候选药物(在本文中有时称为推定的神经保护剂)的神经保护功效的药物开发中。例如，本文描述的方法可用于进一步了解激酶活性的下游效应，并通过比借助于目前可用的临床评价方法远更快地快速且可靠地提供定量治疗-反应信息而加速有效治疗策略的开发。生物测定方法也可用于鉴定入组临床试验的受试者以及确定突触核蛋白病性病患的诊断、预后、进展或发生风险。本文还提供了治疗通过本公开的方法确定患有或有风险患上与突触核蛋白病性病患相关的神经退行性变的受试者的新方法，特别是神经保护性治疗。
在阅读了以下说明书和权利要求书后，本公开的其他目的对于本领域技术人员来说可能是显而易见的。
附图说明
本公开的新颖特征在附随的权利要求书中具体阐述。将通过参考以下阐述利用本公开的原理的说明性实施方案的详细描述以及附图来获得对本公开的特征和优点的更好理解，在附图中：
图1示出了从细胞外囊泡检测激酶和任选地神经退行性病变相关蛋白形式的示例性方法的流程图。
图2示出了验证治疗性干预的功效的示例性规程的流程图。
图3示出了创建和验证用于诊断神经退行性病患的诊断模型的示例性流程图。
图4示出了通过对生物标志物谱执行诊断算法或模型来根据若干状态中的任一种对受试者分类的示例性流程图。
图5示出了帕金森氏病的发病机制中涉及的信号转导机制。
图6示出了显示AKT S473在帕金森氏病中上调并且MAPK T202在帕金森氏病中下调的图。
图7示出了神经退行性病患的示例性指标。
图8示出了示例性的计算机系统。
具体实施方式
I.神经退行性病患的生物标志物
本文公开的方法可用于多种神经退行性病患的诊断和药物开发。这些病患包括但不限于突触核蛋白病(例如，帕金森氏病、路易体痴呆、多系统萎缩症)、淀粉样蛋白病(例如，阿尔茨海默氏病)、tau蛋白病(例如，阿尔茨海默氏病、进行性核上性麻痹、皮质基底节变性)和亨廷顿病。
A.生物标志物和生物标志物谱
生物标志物是与特定的病患单独地或组合地正相关或负相关的分析物。可充当生物标志物的分析物包括在受试者或受试者样品中可检测到的任何生物分子或有机或无机分子。可用作生物标志物的生物分子包括但不限于多肽和多核苷酸，包括例如蛋白质和肽，以及核酸，如RNA和DNA。
如本文所用，术语“生物标志物”是指其测量值与特定生物类别相关的特征物。例如，生物标志物在某种神经退行性病症中可能上调或下调。这些特征物通常是生物分子，如蛋白质或核酸(例如，α-突触核蛋白、β-淀粉样蛋白、蛋白激酶、miRNA)，但它们也可以是非分子特征物如临床变量(例如，是否存在震颤或痴呆)或表型性状。如本文所用，术语“生物标志物谱”是指一种或多种生物标志物中的每一种的测量值。生物标志物谱包括多种生物标志物，它们可能比单独的单个生物标志物与特定生物类别(例如，神经退行性病患)更密切地相关。生物标志物谱可以包括一种或多种不同的信号传导激酶、催化酶、神经退行性病变相关蛋白和/或miRNA的活性的测量值。
取决于使用其的上下文，术语“生物标志物谱”也可以指与类别相关的特定生物标志物测量值模式，如神经退行性病患的诊断、阶段、进展、速率、预后、药物反应性和发生风险。这样的测量值可以被组合到该病患的单个指标中。
变量如激酶活性的测量值可以是数字和/或文字的任何组合。测量值可以是任何尺度，包括名义尺度(例如，名称或类别)、顺序尺度(例如，类别的等级顺序)、间距尺度(顺序的成员之间的距离)、比率尺度(与有意义的“0”相比的间距)或计数集合中事物的数量的基数度量。名义尺度上变量的度量指示名称或类别，如“健康”或“不健康”、“老”或“年轻”、“形式1”或“形式2”、“受试者1……受试者n”等。顺序尺度上变量的度量会产生排名，如“第一”、“第二”、“第三”；或“最年轻”到“最老”，或从最多到最少的顺序。比率尺度上的度量包括例如预定义尺度上的任何测量值，如质量、信号强度、浓度、年龄等，以及统计度量如频率、平均数、中位数、标准偏差或分位数。比率尺度上的度量可以是相对量或归一化测量值。例如，在一个实施方案中，生物标志物谱包含第一和第二信号传导激酶的相对量。在另一个实施方案中，生物标志物谱包含两种不同的生物标志物蛋白质的量的比率。
异常谱(例如，各种信号传导激酶的异常绝对或相对量)指示病理活动(或对致病过程的特征性身体反应)，并因此指示未来临床发作的时间和随后的临床进展速率。此外，生物标志物谱朝向正常的恢复(例如，信号传导激酶和/或神经退行性病变相关蛋白的寡聚形式的绝对或相对量的减少)反映了候选神经保护性干预的功效。因此，本文描述的生物标志物谱可用于确定候选药物的神经保护作用功效。作为一个实际问题，考虑到节省时间和成本以及针对致病过程而不是其临床表现定量功效的明确手段，它们可能被认为对于神经保护性药物试验的实际进行至关重要。
因此，生物标志物谱不仅用作现有病理状态的诊断，而且用作临床发作前的病理学前哨，例如，当受试者处于症状前或临床前时，例如，具有不足以诊断疾病的体征或症状时。这是有现实意义的，因为神经保护性治疗的相对成功看起来常常与其尽早的施用有关。此外，据信这些生物标志物谱指示神经退行性病患的阶段(例如，神经元损失的速率或累积量)。相应地，确定生物标志物谱对于确定治疗的有效性至关重要，例如在临床试验中，并且对于据信将有效于治疗个体神经退行性变(包括例如突触核蛋白病、淀粉样蛋白病、tau蛋白病或亨廷顿病)的治疗性干预来说至关重要。
此外，生物测定衍生的指标(indices/indexes)有助于推进对神经退行性疾病的发病机制的理解。更准确地理解在具有相似临床表型的患者之间可能存在差异的疾病机制，将有助于指导未来开发更特别并因此更有效的治疗性干预。
B.酶
神经退行性病患的特征在于特定酶(包括信号传导激酶和催化酶)活性的异常变化(增加或减少)。测量受试者中这些信号传导激酶的活性可以用于诊断、预后、患者进展、患者分层以及药物开发和测试。
信号传导激酶
激酶包括参与信号传导通路的任何激酶。
与帕金森氏病或影响帕金森氏病症状的药物(例如，普拉克索(6-丙基氨基-4,5,6,7-四氢-1,3-苯并噻唑-2-胺))的施用相关的激酶包括但不限于mTOR(雷帕霉素的机制靶标)、丝裂原激活蛋白激酶(MAPK或MEK)、细胞外信号调节激酶(ERK)、糖原合成酶激酶3β(GSK3B)、AKT激酶和beclin富亮氨酸重复激酶2(LRRK2)、c-Jun N-端激酶信号传导通路(JNK)的成员(MAPK丝氨酸-苏氨酸激酶)以及磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)诱导假定激酶1(PINK1)。
与阿尔茨海默氏病相关的激酶包括但不限于Tau蛋白激酶如脯氨酸定向蛋白激酶(PDPK)、非PDPK蛋白激酶和酪氨酸蛋白激酶(TPK)。
与亨廷顿病相关的激酶包括但不限于丝裂原激活蛋白激酶、MEK、ERK、JNK、IKK、细胞分裂蛋白激酶5(CDK5)、AKT、MKPl。
可用于本公开的方法中的激酶的示例性列表包括以下：AKT S473；AKT T308；ERKP44；GSK3B S6；GSK3B S9；GSK3 T216；GSK3A S21；MAPK T202；mTOR S2448；mTOR c1/2T246；mTOR c1/2 S638；JNK 1/2/3；JNK pY183；JNK pY185；MEK1/2S217；MEK S221；PI3Kp85；PI3K T458；PKB S473；PI3K p55-T199；PKB T308。
这些疾病的共同点还在于有毒寡聚多肽物种以及在一些情况下异常磷酸化的寡聚或单体形式的积累，以及在神经元来源的细胞外囊泡中检测此类形式的能力。
1.催化酶
催化酶可以充当如本文所公开的分类器中的生物标志物。参与神经退行性过程的催化酶可用于这里描述的方法中。例如，在帕金森氏病的情况下，参与L-DOPA产生的酶可以充当生物标志物。特别地，一种这样的酶为酪氨酸羟化酶(“TH”)。酪氨酸羟化酶(也称为酪氨酸3-单加氧酶)是负责催化氨基酸L-酪氨酸向L-3,4-二羟基苯丙氨酸(L-DOPA)的转化的酶。催化酶可以处于磷酸化或未磷酸化状态。
示例性的催化酶包括总TH和磷酸化形式TH S40、TH S19和TH S32。
C.神经退行性病变相关蛋白
如本文所用，术语“神经退行性病变相关蛋白”是指与神经退行性变相关的蛋白质，尤其是寡聚形式的蛋白质。神经退行性病变相关蛋白包括但不限于α-突触核蛋白、tau、淀粉样蛋白β和亨廷顿蛋白。此类蛋白质易于聚集成寡聚形式。
据信脑多肽的某些寡聚形式(和大小范围)或异常磷酸化形式是多种神经退行性病患的基础。这包括例如α-突触核蛋白在突触核蛋白病性病患中的作用、淀粉样蛋白β在淀粉样蛋白病性病患中的作用、tau在tau蛋白病性病患中的作用以及亨廷顿蛋白在亨廷顿病中的作用。特别地，目前的证据表明α-突触核蛋白寡聚体可以充当PD和其他突触核蛋白病中的有毒物种。在某些实施方案中，检测到的寡聚物种为异常磷酸化的物种。
神经退行性病变相关蛋白的形式包括但不限于(I)至少一种寡聚形式；(II)组合的多种寡聚形式(例如，一起测量的所有寡聚形式或一部分寡聚形式，例如，α突触核蛋白2-14或>4聚体)，(III)多种不同寡聚形式中的每一种；(IV)至少一种寡聚形式和至少一种单体形式；(V)多种寡聚形式和至少一种单体形式；和(VI)至少一种寡聚形式和多种单体形式。神经退行性病变相关蛋白的形式可以用于模型中以尤其推断神经退行性病患或朝向神经退行性病患的进展，通常在模型中包括指示疾病的存在和活动或朝向疾病的进展的一种或多种寡聚形式。这包括指示突触核蛋白病的存在和活动或朝向突触核蛋白病的进展的寡聚α-突触核蛋白形式增加的相对量；指示淀粉样蛋白病的存在和活动或朝向淀粉样蛋白病的进展的寡聚淀粉样蛋白β增加的相对量；指示tau蛋白病的存在和活动或朝向tau蛋白病的进展的寡聚或异常磷酸化tau增加的相对量；以及指示亨廷顿病的存在和活动或朝向亨廷顿病的进展的寡聚亨廷顿蛋白增加的相对量。相应地，异常的此类寡聚体谱指示神经退行性变过程。
神经退行性病变相关蛋白形式可以包括一种或多种寡聚形式和任选地一种或多种单体形式。这包括以下的物种的量：寡聚和任选地单体的α-突触核蛋白；寡聚和任选地单体的淀粉样蛋白β、寡聚和任选地过度磷酸化及任选地单体的tau；以及寡聚和任选地单体的亨廷顿蛋白。例如，生物标志物谱可以包括(I)至少一种寡聚形式；(II)多种寡聚形式；(III)至少一种寡聚形式和至少一种单体形式；(IV)多种寡聚形式和至少一种单体形式；(V)至少一种寡聚形式和多种单体形式；和(VI)多种寡聚形式和多种单体形式。
蛋白质形式可以指单独的蛋白质物种或物种的集合。例如，α-突触核蛋白的6聚体是α退格(backspace)-突触核蛋白的一种形式。另外，α-突触核蛋白的6聚体至18聚体的集合全体可以是α-突触核蛋白的一种形式。
生物标志物谱可以包括蛋白质的多种形式。在一个实施方案中，生物标志物谱可以包括神经退行性病变相关蛋白的多种寡聚形式和单体形式中的每一种的定量测量值。因此，例如，生物标志物谱可以包括二聚体、三聚体、四聚体、5聚体、6聚体、7聚体、8聚体、9聚体、10聚体、11聚体、12聚体、13聚体、14聚体、15聚体、16聚体、19聚体、20聚体、24聚体、50聚体等中的每一种的定量测量值。
如本文所用，“突触核蛋白生物标志物谱”是指包含寡聚和任选地单体的α-突触核蛋白的谱，术语“淀粉样蛋白生物标志物谱”是指包含寡聚和任选地单体的β-淀粉样蛋白的谱，术语“tau生物标志物谱”是指包含寡聚和任选地单体的tau的谱，术语“亨廷顿蛋白生物标志物谱”是指包含寡聚和任选地单体的亨廷顿蛋白的谱。
如本文所用，术语“单体蛋白质/多肽”是指单个、非聚集的蛋白质或多肽分子，包括其任何物种，如磷酸化物种。如本文所用，术语“寡聚蛋白质/多肽”是指单独的寡聚物种或包含多个寡聚物种(包括磷酸化物种)的聚集体。应理解，如本文所用，蛋白质的寡聚形式的度量可以指所有寡聚形式(总寡聚形式)或特定的寡聚形式的度量。特定的寡聚形式可以包括例如在特定尺寸范围或物理条件内的形式，例如可溶性原纤维。
在这些情况中的每一种中，据信本文描述的多肽的寡聚/聚集形式对神经元有毒，因为包含这些多肽的寡聚形式和任选地单体形式的生物标志物谱在模型中发挥功能以推断病理活动。特别地，寡聚形式与单体形式相比增加的相对量指示病理学。这些生物标志物的测量值可以用于跟踪受试者对现有或正在开发的疗法的反应，以及预测疾病的发展或现有疾病的状态或进展。
D.miRNA
MicroRNA(“miRNA”)为约22个核苷酸的短单链RNA分子。miRNA与mRNA分子杂交以使它们沉默。这可能是由于mRNA的裂解、mRNA通过其poly(A)尾的缩短而导致的失稳以及mRNA翻译效率的降低造成的。可以通过样品中RNA分子的分离和测序来鉴定miRNA。在本文描述的方法中可用作生物标志物的microRNA包括但不限于miR-15b-5p、miRNA-24以及miR-27a-3pm m204-5p、124-3p和22-3p。
可用于本公开的方法中的miRNA的示例性列表包括：7-5p；15b-5p；19b；22-3p；24；27a-3p 24；29a；30c-2-3p；494-3p；92b-3p；106b-3p；122-5p；124-3p；122-5p；132-3p；138-5p；142-3p；146a-5p；204-5p；220-3p；331-5p；338-3p；431-5p；584-5p；942-5p；1468-5p。
II.神经退行性病患和相关蛋白质
A.突触核蛋白病
1.病患
如本文所用，术语“突触核蛋白病”和“突触核蛋白病性病患”是指以异常的寡聚α-突触核蛋白谱为特征的病患，寡聚α-突触核蛋白是α-突触核蛋白的异常聚集形式。在某些实施方案中，突触核蛋白病表现为临床上明显的突触核蛋白病性疾病，例如PD、路易体痴呆、多系统萎缩症和一些形式的阿尔茨海默氏病，以及其他罕见的神经退行性病症如各种神经轴突营养不良。足以临床诊断突触核蛋白病性疾病的体征和任选地症状为通常足以让诊断此类病患的领域的技术人员做出这样的临床诊断的那些。
帕金森氏病(“PD”)是中枢神经系统(CNS)的进行性病症，在60岁以上的成年人群体中患病率为1％至2％。PD的特征在于运动症状，包括震颤、肌僵直、姿势不稳和随意运动缓慢。该病的特发性形式占PD总病例数的90％以上，其病因仍然难以捉摸，但现在认为涉及到环境因素和遗传因素两者。运动症状显然与黑质中产生多巴胺的神经元的进行性退行性变有关。最近以来，PD已被公认为是一组多系统病症中的一种，主要影响基底神经节(例如，PD)或大脑皮层(例如，路易体痴呆)或基底神经节、脑干和脊髓(例如，多系统萎缩症)，并且所有这些都与细胞内沉积物(路易体)的存在相关，该细胞内沉积物主要由一种称为α-突触核蛋白的脑蛋白组成。因此，这些病症以及Hallevorden-Spatz综合征、神经元轴突营养不良和创伤性脑损伤通常被称为“突触核蛋白病”。
PD的体征和症状可包括例如静止时震颤、肌僵直、运动迟缓、姿势不稳和帕金森慌张步态(gate)。PD的一个体征是这些运动功能障碍对卡比多巴-左旋多巴的正向反应。
临床上公认的帕金森氏病阶段包括以下阶段：阶段1-轻度；阶段2–中度；阶段3-中期；阶段4-严重；阶段5-晚期。
普拉克索(以商品名MirapexTM出售)是用于治疗特发性帕金森病的药物。普拉克索具有作为细胞外信号调节激酶(ERK)激动剂的活性。因此，确定普拉克索和其他激酶调节剂对激酶活性的影响可用于确定该药物对帕金森氏病的有效性。
目前，PD的诊断主要依赖于体检结果，该结果常通过使用改良Hoehn和Yahr分期量表(Hoehn和Yahr,1967,Neurology,17:5,427-442)和统一帕金森氏病评定量表(UPDRS)来量化。PD与其他形式的帕金森病(例如，进行性核上性麻痹(PSP))的鉴别诊断可能困难，因此高达25％的患者可能发生误诊。事实上，在做出初次临床诊断之前，PD通常多年未被发现。当这种情况发生时，黑质中多巴胺神经元的损失已经超过50％并且可能接近70％。尚未验证PD或任何相关突触核蛋白病的血液试验。虽然使用正电子发射断层扫描(PET)或MRI的成像研究已因提供关于神经退行性过程的位置和程度的信息而被用于PD的诊断中，但它们很少或不提供关于所观察到的退行性变的发病机制的信息并且不指导特定突触核蛋白病特异性干预的选择。
路易体痴呆(LBD)影响美国约130万人。症状包括例如痴呆、认知波动、帕金森病、睡眠障碍和幻觉。它是继阿尔茨海默氏病之后第二常见的痴呆形式，通常在50岁之后发病。与帕金森氏病一样，LBD的特征在于脑中α-突触核蛋白的异常沉积。
多系统萎缩症(MSA)分为两种类型：帕金森型和小脑型。帕金森型的特征在于例如PD的帕金森症状。小脑型的特征在于例如运动和协调受损、构音困难、视觉障碍和吞咽困难。MSA症状反映了脑受损区域(尤其是黑质、纹状体、下橄榄核和小脑)中的细胞损失和神经胶质增生或星形胶质细胞的增殖。异常的α-突触核蛋白沉积是特征性的。
PD和其他突触核蛋白病的诊断错误率可能相对较高，尤其是在其初始阶段，这种情况可能随着有效的疾病缓解疗法如神经保护性疗法的引入而变得重要。
2.α-突触核蛋白
α-突触核蛋白是在人脑中发现的一种蛋白质。人α-突触核蛋白由140个氨基酸组成并由SNCA基因(也称为PARK1)编码。(α-突触核蛋白：基因ID：6622；智人；细胞遗传学位置：4q22.1)。
如本文所用，术语“α-突触核蛋白”包括正常的(未经修饰的)物种以及经修饰的物种。α-突触核蛋白可以以单体形式或聚集形式存在。α-突触核蛋白单体可以异常聚集成寡聚体，而寡聚α-突触核蛋白可以聚集成原纤维。原纤维可以进一步聚集形成称为路易体的细胞内沉积物。据信单体α-突触核蛋白及其各种寡聚体以平衡状态存在。脑中的α-突触核蛋白加工还可以产生其他推定的异常物种，如在丝氨酸129处磷酸化的α-突触核蛋白(“p129α-突触核蛋白”)。
α-突触核蛋白在人中枢神经系统(CNS)中大量表达，而在各种其他器官中在较低的程度上表达。在脑中，α-突触核蛋白主要存在于神经元末端中，尤其是在大脑皮层、海马、黑质和小脑中，在这些地方其有助于调节神经递质的释放。在正常情况下，这种可溶性单体蛋白质往往会形成稳定折叠的四聚体，该四聚体会抵抗聚集。但是，在某些病理状况下，由于未知的原因，α-突触核蛋白会出现异常的β褶皱、错误折叠、寡聚化和聚集，最终形成原纤维，这是一种能够产生高度细胞毒性中间体的代谢途径。
如本文所用，术语“单体α-突触核蛋白”是指单个、非聚集的α-突触核蛋白分子，包括其任何物种。如本文所用，术语“寡聚α-突触核蛋白”是指包含多个α-突触核蛋白分子的聚集体。这包括总寡聚α-突触核蛋白及其形式或选定物种。寡聚α-突触核蛋白包括具有至少两个单体单元的形式一直到初原纤维形式。这包括具有例如2至约100个单体单元、例如4至16个单体单元或至少2、3、4或5打单体单元的寡聚形式。如本文所用，术语“相对低重量的突触核蛋白寡聚体”是指由至多30个单体单元组成的突触核蛋白寡聚体(30聚体)。通常，相对低重量的突触核蛋白寡聚体是可溶的。因此，α-突触核蛋白的“可溶性寡聚形式”包括尺寸范围为2聚体至30聚体、例如4聚体至18聚体的寡聚体。在某些实施方案中，α-突触核蛋白是指通过特定的检测方法检测到的一种或多种形式。例如，这些形式可以是可用针对α-突触核蛋白的特定单体或寡聚形式产生的抗体检测的形式。
现在认为异常加工成寡聚形式的α-突触核蛋白的神经毒性潜力会导致前述病理学病患的症状的发作和随后的进展，特别是PD、路易体痴呆、多系统萎缩症和若干其他病症。这些通常被定义为一组神经退行性病症，其部分特征在于异常α-突触核蛋白聚集体的细胞内积累，其中一些似乎有毒并且可能导致前述病症的发病机制。尽管已经提出氧化应激、线粒体损伤和孔隙形成等因素的作用，但α-突触核蛋白的某些寡聚形式如何导致神经退行性变尚不清楚。然而，许多人现在认为导致α-突触核蛋白寡聚和聚集的过程对这些病症中发生的细胞损伤和破坏极为重要。
一些研究表明，前原纤维突触核蛋白寡聚体和初原纤维尤其容易赋予神经毒性(Loov等人,“α-Synuclein in Extracellular Vesicles:Functional Implications andDiagnostic Opportunities”,M.Cell Mol Neurobiol.2016Apr；36(3):437-48.doi:10.1007/s10571-015-0317-0)。其他人认为低阶寡聚突触核蛋白物种可能是主要原因，并且目前还很难确切地弄清楚哪个突触核蛋白物种或哪个具有不同的β-折叠排列、通过单个或多个病理学机制单独或协同地作用的物种集合在PD中或任何相关的突触核蛋白病中最具神经毒性(Wong等人,“α-synuclein toxicity in neurodegeneration:mechanism andtherapeutic strategies”,Nat Med.2017 Feb 7；23(2):1-13.doi:10.1038/nm.4269)。
细胞内突触核蛋白的一部分与其某些代谢产物一起被包装在外泌体囊泡内并释放到脑中的细胞内液中，从那里它们进入到脑脊液(CSF)和外周血液循环中。α-突触核蛋白是在人脑中发现的一种蛋白质。人α-突触核蛋白由140个氨基酸组成并由SNCA基因(也称为PARK1)编码。(α-突触核蛋白：基因ID：6622；智人；细胞遗传学位置：4q22.1。)
B.淀粉样蛋白病
1.病患
如本文所用，术语“淀粉样蛋白病”是指以淀粉样蛋白聚合物在脑中的积累为特征的病患。淀粉样蛋白病包括但不限于阿尔茨海默氏病和某些其他神经退行性病症如晚期PD。阿尔茨海默氏病是痴呆症的最普遍形式。在解剖学水平上，其特征在于由β-淀粉样蛋白的聚集形式以及神经原纤维缠结构成的淀粉样蛋白斑块的积累。在症状上，特征在于进行性记忆丧失、认知衰退和神经行为改变。阿尔茨海默氏病是进行性的，目前还没有已知的方法可以阻止或逆转这种疾病。
2.淀粉样蛋白β
淀粉样蛋白β(也称为淀粉样蛋白-β、Aβ、A-β和β-淀粉样蛋白)是淀粉样蛋白前体蛋白的肽片段。淀粉样蛋白β通常具有36至43个氨基酸。淀粉样蛋白β聚集形成可以若干形式存在的可溶性寡聚体。据信，淀粉样蛋白β的错误折叠的寡聚体可以导致其他淀粉样蛋白β分子呈现错误折叠的寡聚形式。A-β1-42具有氨基酸序列：DAEFRHDSGY EVHHQKLVFFAEDVGSNKGA IIGLMVGGVV IA[SEQ ID NO:1]。
在阿尔茨海默氏病中，淀粉样蛋白-β和tau蛋白寡聚化并在脑组织中积累，在这里它们似乎引起神经元损伤和损失；事实上，一些人断言，这样的可溶性聚集中间体或寡聚体是介导毒性的关键物种并且构成疾病播种和传播的基础(The Amyloid-βOligomerHypothesis:Beginning of the Third Decade.Cline EN,Bicca MA,Viola KL,KleinWL.J Alzheimers Dis.2018；64(s1):S567-S610；"Crucial role of proteinoligomerization in the pathogenesis of Alzheimer's and Parkinson's diseases,”Choi ML,Gandhi S.FEBS J.2018年6月20日)。淀粉样蛋白β寡聚体对于AD的发作和进展至关重要，并且是一种流行的药物靶点，很可能是最直接的生物标志物。Tau蛋白也可能变得异常过度磷酸化。
目前用于定量A-β的单体和寡聚形式的方法包括酶联免疫吸附测定法(ELISA)、用于单一寡聚体检测的方法以及其他方法，这些方法主要是基于生物传感器的方法。("Methods for the Specific Detection and Quantitation of Amyloid-βOligomers inCerebrospinal Fluid”,Schuster J,Funke SA.J Alzheimers Dis.2016年5月7日；53(1):53-67)。
基于表面的荧光强度分布分析(sFIDA)的特征在于高度特异性且灵敏的寡聚体定量以及对单体的完全不灵敏性(“Advancements of the sFIDA method for oligomer-based diagnostics of neurodegenerative diseases”,Kulawik A.等人,FEBSLett.2018年2月；592(4):516-534)。
C.Tau蛋白病
1.病患
如本文所用，术语“tau蛋白病”是指特征在于与神经退行性变相关的tau蛋白的积累和聚集的病患。Tau蛋白病包括但不限于阿尔茨海默氏病(“AD”)、进行性核上性麻痹、皮质基底节变性、17号染色体相关的额颞叶痴呆合并帕金森综合征和皮克氏病。
AD的特征还在于第二病理学标志——神经原纤维缠结(NFT)。NFT在解剖学上与神经元损失相关，从而将NFT形成过程与神经元损伤和脑功能障碍联系起来。NFT的主要组分是tau的过度磷酸化形式，tau是一种微管相关蛋白。在NFT形成过程中，tau形成多种不同的聚集物种，包括tau寡聚体。越来越多的证据表明，tau寡聚体的形成先于神经原纤维缠结的出现并且对神经元损失有重要影响。(J Alzheimers Dis.2013；37(3):565-8“Tauopathiesand tau oligomers”,Takashima A)。
非原纤维、可溶性多聚体似乎比由丝状tau组成的神经原纤维缠结更具毒性。
在额颞叶痴呆中，全长TAR DNA结合蛋白(“TDP-43”)形成有毒的淀粉样蛋白寡聚体，该寡聚体在额叶脑区中积累。TDP-43蛋白病，其还包括肌萎缩性侧索硬化症(ALS)，特征在于由多泛素化和过度磷酸化的全长和截短TDP-43形成的包涵体。重组全长人TDP-43形成结构上稳定的球形寡聚体，其与抗淀粉样蛋白寡聚体特异性抗体具有共同的表位。已发现TDP-43寡聚体在体外和体内都是神经毒性的。(Nat Commun.2014年9月12日；5:4824。全长TDP-43形成存在于额颞叶痴呆-TDP患者中的有毒淀粉样蛋白寡聚体)。在FTLD-TDP的不同亚型中，可以使用称为TDP-O的特定TDP-43淀粉样蛋白寡聚体抗体来确定TDP-43寡聚体的存在和丰度("Detection of TDP-43oligomers in frontotemporal lobardegeneration-TDP”,Kao PF,Ann Neurol.2015年8月；78(2):211-21)。
2.Tau
Tau是一种磷蛋白，最长的tau同种型上有79个潜在的丝氨酸(Ser)和苏氨酸(Thr)磷酸化位点。Tau存在六种同种型，根据其结合结构域的数量进行区分。三种同种型具有三个结合结构域，另外三种具有四个结合结构域。这些同种型由tau基因的外显子2、3和10的选择性剪接产生。Tau由MAPT基因编码，其有11个外显子。单倍群H1似乎与某些痴呆症如阿尔茨海默氏病增加的概率相关。
各种tau寡聚物种，包括从6聚体到18聚体的那些，牵涉在与tau蛋白病性脑病症相关的神经毒性过程中并通过蛋白质印迹法和包括单分子荧光在内的其他技术测量。(参见例如Kjaergaard M.等人,“Oligomer Diversity during the Aggregation of theRepeat Region of Tau”ACS Chem Neurosci.2018年7月17日；Ghag G等人,“Soluble tauaggregates,not large fibrils,are the toxic species that display seeding andcross-seeding behavior”,Protein Sci.2018年8月20日.doi:10.1002/pro.3499；和Comerota MM等人,“Near Infrared Light Treatment Reduces Synaptic Levels ofToxic Tau Oligomers in Two Transgenic Mouse Models of Human Tauopathies”,MolNeurobiol.2018年8月17日)。
测量寡聚tau物种的方法包括免疫测定法。Tau可以通过常见的表达、随后层析(如亲和层析、尺寸排阻层析和阴离子交换层析)来分离。可以使用这种形式对动物进行免疫以生成抗体。使用花生四烯酸可以诱导tau的聚集。寡聚体可以通过蔗糖阶梯梯度离心来纯化。也可以使用Tau的寡聚形式来对动物进行免疫并生成抗体。利用tau寡聚体特异性TOC1抗体的夹心酶联免疫吸附测定法可以用于检测寡聚tau。Tau寡聚体复合物1(TOC1)抗体特异性地鉴定tris不溶性、肌氨酰可溶性级分中的寡聚tau物种(Shirafuji N.等人,“Homocysteine Increases Tau Phosphorylation,Truncation and Oligomerization”,Int J Mol Sci.2018Mar 17；19(3))。(参见例如Methods Cell Biol.2017；141:45-64.doi:10.1016/bs.mcb.2017.06.005.Epub 2017年7月14日.Production ofrecombinant tau oligomers in vitro.Combs B1,Tiernan CT1,Hamel C1,Kanaan NM)。
D.亨廷顿病
1.亨廷顿病
亨廷顿病是由亨廷顿蛋白基因中的常染色体显性突变引起的遗传性疾病。该突变的特征在于CAG三联体的复制。其特征在于进行性神经退行性变。症状包括运动障碍，如不自主运动、步态受损以及吞咽和言语困难。其特征还在于进行性认知衰退。
2.亨廷顿蛋白
亨廷顿蛋白由也称为HTT或HD的亨廷顿基因编码。正常的亨廷顿蛋白有约3144个氨基酸。该蛋白质通常为约300KdA。
在亨廷顿病(HD)中，全长突变亨廷顿蛋白(mHtt)裂解成更小、可溶性、易聚集的mHtt片段似乎是该病症的病理生理学中的关键过程。事实上，除了HD之外，含有大量多聚谷氨酰胺(polyQ)重复序列的突变蛋白的聚集和细胞毒性是若干疾病的标志。在细胞内，突变亨廷顿蛋白(mHtt)和其他多聚谷氨酰胺扩增突变蛋白以单体、可溶性寡聚体和不溶性包涵体存在。(J Huntingtons Dis.2012；1(1):119-32.Detection of Mutant HuntingtinAggregation Conformers and Modulation of SDS-Soluble Fibrillar Oligomers bySmall Molecules.Sontag EM等人,Brain Sci.2014年3月3日；4(1):91-122.Monomeric,oligomeric and polymeric proteins in Huntington disease and other diseases ofpolyglutamine expansion.Hoffner G.等人)。在某些实施方案中，寡聚体的高度为2-10nm，长宽比(最长距离与最短距离之比)小于2.5，表明是球状结构。
III.生物标志物的检测和测量
A.生物样品
如本文所用，术语“样品”是指包含分析物的组合物。样品可以是原始样品，其中分析物以其天然形式与其他材料混合(例如，源材料)，也可以是分级样品，其中分析物被至少部分地富集，或者可以是纯化样品，其中分析物是至少大体上纯净的。如本文所用，术语“生物样品”是指包含生物材料的样品，所述生物材料包括例如多肽、多核苷酸、多糖、脂质和这些材料的较高层次如细胞外囊泡、细胞、组织或器官。
如本文所用，术语“细胞外囊泡”是指膜结合颗粒，通常是脂质双层界定的，其从细胞天然释放并具有约50至约5000nm的流体力学直径。细胞外囊泡的一个实例为“外泌体”，其具有约50nm至约350nm的直径。
可以在来自受试者的体液样品的细胞外囊泡中检测到信号传导激酶以及神经退行性病变相关蛋白的形式，如α-突触核蛋白、淀粉样蛋白β、tau和亨廷顿蛋白。更特别地，神经元来源的细胞外囊泡的分离物是用于检测和分析突触核蛋白病性病患的优选细胞外囊泡子集。特别地，来自细胞外囊泡的内部区室的蛋白质是有用的。
细胞外囊泡可以从来自受试者的多种生物样品中分离出。在某些实施方案中，生物样品为体液。细胞外囊泡的体液来源包括例如血液(例如，全血或其级分如血清或血浆，例如外周静脉血液)、脑脊液、唾液、乳汁和尿液、或其级分。
由于医疗环境中常规静脉穿刺的安全性、可接受性和便利性，故使用静脉血作为细胞外囊泡的来源是用于成人和儿童的诊断测试的优选样品。因为目标分析物可能以小量存在于血液中，所以可能要采集大量样品。例如，样品可以具有至少5ml、至少10ml、至少20ml血液。可以通过让全血凝结并通过例如离心除去凝块来制备血清。可以通过例如用抗凝剂如EDTA处理全血并通过例如离心除去血细胞来制备血浆。可以通过从受试者采集样品或通过从已从受试者采集血液的人接收样品来提供血液样品。血液样品通常将冷藏保存，例如保存在冰上或冷冻在-80℃下。
B.测量生物标志物的方法
1.信号传导激酶
激酶在底物的磷酸化中将ATP转化为ADP。测量激酶活性的各种测定法类型是本领域已知的。
a)放射性闪烁
放射性闪烁测定法测量在激酶作用下32P向底物中的并入。
b)FRET(荧光共振能量转移)
这些测定法中的某些使用ATP或ADP的量作为激酶活性的指示物。在一种这样的测定法中，将测试激酶活性的样品、激酶的底物和ATP合并起来。如果存在激酶，则它将使用ATP使底物磷酸化。剩余的ADP可以通过各种测定法来检测。一种这样的测定法为FRET(荧光共振能量转移)测定法，其中反应后样品中的ADP用供体或受体荧光团中之一加标签。将与ADP结合并包含该对中的另一荧光团(即，受体或供体荧光团)的抗体添加到混合物中。该抗体与ADP结合。激发后，供体荧光团将能量转移到受体荧光团，受体荧光团发出荧光并可被检测到。
c)免疫检测
在另一种测定法中，可以使用对激酶特异性的抗体来免疫沉淀特定的激酶。沉淀的激酶被用于与激酶的底物的磷酸化反应中。激酶反应的产物可以通过蛋白质印迹法来检测。
d)可商购获得的激酶测定法
许多激酶测定法是可商购获得的。例如，这些包括可得自Promega(Promega.com)的测定法，该测定法对许多不同的激酶是特异性的。另一个实例为可得自Thermo FisherScientific(ThermoFisher.com)的通用激酶测定系统。PerkinElmerTM(PerkinElmer.com)将LANCE(R)激酶测定法商业化，该测定法使用荧光标记的底物和铕标记的抗磷抗体来识别磷酸化产物，该磷酸化产物可通过FRET来检测。Samdi Tech,Inc.(SamdiTech.com)将使用质谱法的无标记测定法商业化。
2.催化酶
催化酶如酪氨酸羟化酶可以通过本领域已知的任何方法来检测。例如，这包括活性测定法、ELISA和蛋白质印迹法。
3.microRNA
MicroRNA(“miRNA”)可以例如通过核酸测序方法来检测。这些可能涉及将RNA转化为DNA，并采用标准DNA测序技术。一种这样的方法为qRT-PCR。测定结果可以表示为不同miRNA的比率。
4.神经退行性病变相关蛋白
蛋白质的单体和寡聚形式可以通过本领域已知的任何方法来检测，包括但不限于免疫测定法(例如，ELISA)、质谱法、尺寸排阻层析法、蛋白质印迹法和基于荧光的方法(例如，荧光光谱法或FRET)以及邻近连接测定。
在蛋白质印迹法中，通过电泳来分离混合物中的蛋白质。通常通过电印迹法将分离的蛋白质转移到固体支持物如硝酸纤维素膜上形成印迹。印迹的蛋白质可以通过与针对α-突触核蛋白寡聚体的结合剂直接结合来检测，或者通过间接结合来检测，其中，例如，使印迹与针对α-突触核蛋白寡聚体的标记一抗接触，该标记一抗被允许与寡聚体结合。通常，洗涤印迹以除去未结合的抗体。然后，使用针对一抗或附着于一抗的标签的标记抗体(通常称为二抗)检测寡聚形式。
标记可以包括例如金纳米颗粒、胶乳珠、荧光分子、发光蛋白和从底物产生可检测产物的酶。标签可以包括例如生物素。
替代地，可以将混合物中的寡聚物种彼此分离并随后检测。混合物中的寡聚物种可以通过若干方法分离。在一种方法中，通过电泳分离各物种。这包括凝胶电泳。电泳方法包括聚丙烯酰胺凝胶电泳(“PAGE”)和琼脂糖凝胶电泳。在一种方法中，使用天然PAGE或蓝色天然PAGE。天然PAGE Bis-Tris凝胶可得自例如在一种称为填充-毛细管电泳或“pCE”的方法中，通过在毛细管中填充无孔胶体氧化硅来产生任意宽的孔隙。替代地，可以通过层析法分离物种，如尺寸排阻层析法、液相层析法或气相层析法。
一旦分离，就可以区分α-突触核蛋白的特定寡聚形式。这可以在不需要与特定寡聚形式特异性结合的结合剂的情况下完成，因为它们已经被分离并因此是可区分的。通常，可以使用与α-突触核蛋白寡聚体结合的结合剂来检测这些形式。它们在凝胶上的位置、时间或从柱中的洗脱可以用于指示检测到的特定形式。例如，较大的寡聚体通常比较小的寡聚体在凝胶中迁移得更慢。
a)α-突触核蛋白
单体α-突触核蛋白和寡聚α-突触核蛋白的量可以单独测定。替代地，可以测量样品中的总α-突触核蛋白以及单体α-突触核蛋白或寡聚α-突触核蛋白中的任一种并且可以基于差值来确定另一物种的量。
单体、寡聚和总α-突触核蛋白可以通过例如免疫测定法(例如，ELISA或蛋白质印迹法，例如用化学发光检测)、质谱法或尺寸排阻层析法来检测。针对α-突触核蛋白的抗体可从例如Abcam(Cambridge,MA)、ThermoFisher(Waltham,MA)和Santa CruzBiotechnology(Dallas,TX)商购获得。
以下参考文献描述了测量总α-突触核蛋白含量的方法。Mollenhauer等人(Movement Disorders,32:8p.1117(2017))描述了测量体液中总α-突触核蛋白的方法。Loov等人(Cell Mol.Neurobiol.,36:437-448(2016))描述了使用抗体来从血浆分离L1CAM阳性细胞外囊泡。Abd-Elhadi等人(Anal Bioanal Chem.(2016)Nov；408(27):7669-72016)描述了通过脂质-ELISA测定人血细胞、CSF和唾液中总α-突触核蛋白水平的方法。
总α-突触核蛋白可以在ELISA中使用例如用于捕获的抗人α-syn单克隆抗体211(Santa Cruz Biotechnology,USA)和用于检测的抗人α-syn多克隆抗体FL-140(SantaCruz Biotechnology,USA)通过与辣根过氧化物酶(HRP)联合化学发光测定法进行检测。这样的方法将避免单体α-突触核蛋白的检测，但不区分不同的多聚形式。
α-突触核蛋白的单体和寡聚形式可以通过例如免疫测定法使用对这些形式特异性的抗体来检测。参见例如Williams等人(“Oligomeric alpha-synuclein andβ-amyloidvariants as potential biomarkers for Parkinson's and Alzheimer's diseases”,Eur J Neurosci.(2016)Jan；43(1):3-16)和Majbour等人(“Oligomeric andphosphorylated alpha-synuclein as potential CSF biomarkers for Parkinson’sdisease”,Molecular Neurodegeneration(2016)11:7)。El-Agnaf O.等人(FASEB J.2016；20:419–425)描述了人血浆中作为PD的潜在生物标志物的α-突触核蛋白寡聚形式的检测。
针对α-突触核蛋白单体和寡聚体的抗体可以通过用α-突触核蛋白单体或寡聚体对动物进行免疫来产生。(参见例如美国公开2016/0199522(Lannfelt等人)、2012/0191652(El-Agnaf)。α-突触核蛋白寡聚体可以通过El Agnaf(U.S.2014/0241987)的方法制备，其中将新鲜制备的α-突触核蛋白溶液与多巴胺以1:7的摩尔比(α-突触核蛋白:多巴胺)混合并在37℃下温育。Emadi等人(“Isolation of a Human Single Chain Antibody FragmentAgainst Oligomericα-Synuclein that Inhibits Aggregation and Preventsα-Synuclein-induced Toxicity”,J Mol Biol.2007；368:1132–1144.[PubMed:17391701])(二聚体和四聚体)和Emadi等人(“Detecting Morphologically Distinct OligomericForms ofα-Synuclein”,J Biol Chem.2009；284:11048–11058.[PubMed:19141614])(三聚体和六聚体)中也描述了针对α-突触核蛋白的不同寡聚形式的抗体。初原纤维结合抗体见述于例如U.S.2013/0309251(Nordstrom等人)中。
单体α-突触核蛋白可以使用被突触核蛋白的寡聚形式唯一地识别的抗体通过免疫测定法来与聚合α-突触核蛋白区分开。另一种方法涉及检测质量差异，例如使用质谱法。可以使用荧光方法。(参见例如Sangeeta Nath等人,“Early Aggregation Steps inα-Synuclein as Measured by FCS and FRET:Evidence for a ContagiousConformational Change”Biophys J.2010年4月7日；98(7):1302–1311,doi:10.1016/j.bpj.2009.12.4290；和Laura Tosatto等人,“Single-molecule FRET studies onalpha-synuclein oligomerization of Parkinson’s disease genetically relatedmutants”,Scientific Reports 5,2015年12月)。另一种方法涉及测量总α突触核蛋白，然后是非病理性α突触核蛋白的蛋白质酶K消化和剩余α突触核蛋白的检测。另一种方法涉及α突触核蛋白邻近连接测定。蛋白质连接测定探针是由针对感兴趣的蛋白质产生的抗体生成的，推定的相互作用中涉及的每一种蛋白质一个探针，这些探针与短寡核苷酸缀合。如果探针结合相互作用的蛋白质，则寡核苷酸足够接近以引发扩增反应，该反应可以通过带标签的寡核苷酸检测并作为点状信号观察到，每个点代表一种相互作用。(Roberts RF等人,“Direct visualization of alpha-synuclein oligomers reveals previouslyundetected pathology in Parkinson’s disease brain.Brain”,2015；138:1642–1657.doi:10.1093/brain/awv040，和Nora Bengoa-Vergniory等人,“Alpha-synucleinoligomers:a new hope”,Acta Neuropathol.2017；134(6):819–838)。
α-突触核蛋白的寡聚形式对单体的相对量可以以比率表示。
数量或量可以表示为来自测定法的信号输出或表示为转化后的绝对量，例如来自标准曲线，例如用每体积的质量表示。
样品中的α-突触核蛋白物种可以被进一步分层。例如，寡聚体物种可以被分为低阶寡聚体，例如2至24个单体单元，高阶寡聚体，例如24至100个单体单元，或初原纤维等。
b)淀粉样蛋白β
可以使用酶联免疫吸附测定法(ELISA)来区分寡聚体和单体。该测定法类似于夹心ELISA。Aβ单体含有一个表位，而寡聚体含有多个这些表位。因此，如果使用针对上述独特表位的表位重叠抗体来捕获和检测抗体，则与特定且独特的表位的结合将在这两种抗体之间产生竞争。换句话说，单体将被捕获抗体或检测抗体占据，但不会被两者占据。("Oligomeric forms of amyloid-βprotein in plasma as a potential blood-basedbiomarker for Alzheimer's disease”,Wang MJ等人.Alzheimers Res Ther.2017年12月15日；9(1):98。“Potential fluid biomarkers for pathological brain changes inAlzheimer's disease:Implication for the screening of cognitive frailty”,RuanQ等人,Mol Med Rep.2016年10月；14(4):3184-98。"Methods for the SpecificDetection and Quantitation of Amyloid-βOligomers in Cerebrospinal Fluid,”Schuster J,Funke SA.JAlzheimers Dis.2016年5月7日；53(1):53-67)。
用于检测的淀粉样蛋白β的寡聚形式包括例如淀粉样蛋白β的4-24聚体。
c)Tau
生物体液(例如，CSF)中的tau寡聚体可以通过ELISA和蛋白质印迹分析使用抗-tau寡聚体抗体进行测量。(Sengupta U等人,“Tau oligomers in cerebrospinal fluidin Alzheimer's disease”,Ann Clin Transl Neurol.2017年4月；4(4):226–235。
用于检测的tau的寡聚体包括例如低分子量寡聚体，例如不超过20聚体，例如3-18聚体。脑脊液中可溶性寡聚体的存在可以用单克隆抗寡聚体抗体用蛋白质印迹法和夹心酶联免疫吸附测定法(sELISA)来检测。David,MA等人,“Detection of protein aggregatesin brain and cerebrospinal fluid derived from multiple sclerosis patients”,Front Neurol.2014Dec 2；5:251。Tau的寡聚形式包括寡聚tau的过度磷酸化形式。
d)亨廷顿蛋白
最近的定量研究已经利用了基于TR-FRET的免疫测定法。一种结合尺寸排阻层析法(SEC)和时间分辨荧光共振能量转移(TR-FRET)的检测方法允许脑中天然可溶性mHtt物种和不溶性聚集体的形成和聚集的分辨和明确。“Fragments of HdhQ150 mutanthuntingtin form a soluble oligomer pool that declines with aggregatedeposition upon aging”,Marcellin D.等人,PLoS One.2012；7(9):e44457。
多种公开的技术已被用于测定寡聚亨廷顿蛋白物种，包括例如琼脂糖凝胶电泳(AGE)分析(在天然或轻度变性、0.1％ SDS条件下或在天然条件下的蓝色-天然PAGE)，其提供许多免疫反应性寡聚体；抗-亨廷顿蛋白抗体将差异性地识别特定的亨廷顿蛋白寡聚体。
已经开发了一种基于TR-FRET的一步式免疫测定法来定量细胞和组织匀浆中的可溶性和聚集的mHtt(TR-FRET-based duplex immunoassay reveals an inversecorrelation of soluble and aggregated mutant huntingtin in Huntington'sdisease.Baldo B等人,chem Biol.2012年2月24日；19(2):264-75)。
基于时间分辨能量转移(TR-FRET)的测定法是广泛用于定量感兴趣的蛋白质的高通量、同质、灵敏的免疫测定法。TR-FRET对小距离极其灵敏并因此可以基于选择性抗体识别的靶蛋白上存在的表位的暴露和相对位置的检测来提供构象信息。我们之前报道过TR-FRET测定法以基于对不同氨基末端HTT表位特异性的抗体的使用来定量HTT蛋白(Fodale,V.等人,“Polyglutamine-and temperature-dependent conformationalrigidity in mutant huntingtin revealed by immunoassays and circular dichroismspectroscopy”,PLoS One.2014年12月2日；9(12):e112262.doi:10.1371/journal.pone.0112262.eCollection 2014。
C.细胞外囊泡的分离
细胞外囊泡是被认为在中间内吞区室多囊泡体(MVB)与质膜融合后从细胞释放的细胞外囊泡。
本领域已知许多分离细胞外囊泡的方法。这些方法包括例如免疫亲和力捕获方法、基于尺寸的分离方法、差速超速离心、细胞外囊泡沉淀和基于微流控的分离技术。(Loov等人,“α-Synuclein in Extracellular Vesicles:Functional Implications andDiagnostic Opportunities”,M.Cell Mol Neurobiol.2016年4月；36(3):437-48.doi:10.1007/s10571-015-0317-0)。
样品中细胞外囊泡的量可以通过多种方法中的任何一种来测定。这些方法包括例如(a)免疫亲和力捕获(IAC)、(b)不对称流场流分级分离(AF4)、(c)纳米颗粒跟踪分析(NTA)、(d)动态光散射(DLS)和(e)表面等离子共振(SPR)。经许可重印。免疫亲和力捕获(IAC)是使用间接分离方法经由免疫亲和力捕获细胞外囊泡的技术。IAC通过分析颜色、荧光或电化学信号来定量细胞外囊泡。不对称流场流分级分离(AF4)使用场流分级和扩散来分离和定量分子。纳米颗粒跟踪分析(NTA)根据颗粒的尺寸来分离和定量颗粒。NTA使用布朗运动速率来分析颗粒。该技术还使用光散射技术来跟踪细胞外囊泡的浓度和尺寸。动态光散射(DLS)通过表现出布朗运动的颗粒所散射的光来确定颗粒尺寸。表面等离子共振(SPR)是一种基于免疫亲和力的测定法，其利用SPR传感器表面上的受体捕获细胞外囊泡。结合将改变受体的光信号，然后可以通过光源定量它们的共振。在另一种方法中，可以通过电子显微镜法检查细胞外囊泡，例如通过在Zeiss LSM 200透射电子显微镜中于120kV下可视化。
1.免疫亲和力捕获
免疫亲和力捕获方法使用附着到提取部分的抗体来结合细胞外囊泡并将它们与样品中的其他材料分离开。固体支持物可以是例如可磁性吸引的细胞外囊泡。可以使用胶乳免疫珠。
Qiagen将其exoEasy Maxi试剂盒描述为使用膜亲和旋转柱从血清、血浆、细胞培养上清液和其他生物体液高效地分离细胞外囊泡和其他细胞外囊泡。
2.基于尺寸的方法
基于尺寸的分离方法包括例如尺寸排阻层析法和超滤。在尺寸排阻层析法中，使用多孔固定相来基于尺寸分离细胞外囊泡。在超滤中，使用多孔膜过滤器基于细胞外囊泡的尺寸或重量来分离细胞外囊泡。
3.差速超速离心
差速超速离心涉及一系列不同离心力和持续时间的离心循环以基于细胞外囊泡与样品中其他组分的密度和尺寸差异来分离细胞外囊泡。离心力可以为例如～100,000至120,000×g。可以使用蛋白酶抑制剂来防止蛋白质降解。可以使用先前的净化步骤来从样品去除其他大的材料。
4.密度梯度超速离心
密度梯度超速离心使用梯度介质如蔗糖、Nycodenz(iohexol)和碘克沙醇分选细胞外囊泡。经由超速离心将细胞外囊泡分离到其中梯度介质的密度等于细胞外囊泡的密度的层中。
5.基于聚合物的方法
可以通过改变细胞外囊泡的溶解度或分散性来从生物材料的溶液分离出细胞外囊泡。例如，可以使用例如分子量为8000Da的聚合物如聚乙二醇(PEG)的添加来从溶液沉淀细胞外囊泡。
6.基于微流控的方法
可以使用基于微流控的方法来分离细胞外囊泡。这些方法包括例如声学、电泳和电磁方法。例如，声学纳米过滤器使用超声驻波根据样品中细胞外囊泡的尺寸和密度来分离细胞外囊泡。
7.其他方法
分离神经元来源的细胞外囊泡的其他方法见述于例如Kanninnen,KM等人,“Exosomes as new diagnostic tools in CNS diseases”,Biochimica et BiophysicaActa,1862(2016)403-410中。
8.神经元来源的细胞外囊泡的富集
神经元来源的细胞外囊泡是由神经元产生的细胞外囊泡。优选地，研究对象为CNS来源的细胞外囊泡，即，与周围神经系统不同，在中枢神经系统中产生的细胞外囊泡。本文描述的方法富集包含细胞外囊泡的生物样品中的神经元来源的细胞外囊泡，乃至CNS来源的细胞外囊泡。与未富集的类似类型的样品(例如，血液样品)相比，富集了神经元来源的细胞外囊泡的样品具有更高的神经元来源的细胞外囊泡对非神经元来源的外泌体的比率。因此，例如，富集可以是未富集样品的至少两倍、至少5倍、至少10倍、至少50倍或至少100倍。在富集了神经元来源的细胞外囊泡的样品中，神经元来源的细胞外囊泡可构成所有细胞外囊泡的至少50％、至少75％、至少90％或至少98％。
免疫亲和力方法可用于使用脑特异性生物标志物(例如，神经和神经胶质标志物)来分离神经元来源的细胞外囊泡。一种这样的标志物为L1CAM。另一种标志物为KCAM。其他相对地脑特异性的蛋白质也可以发挥这种作用。神经元来源的细胞外囊泡的特征在于与脑相关的蛋白质标志物，包括例如KCAM、L1CAM和NCAM以及DAT(多巴胺转运体)。(参见例如US2017/0014450、US2017/0102397、US 9,958,460)。可以使用亲和力捕获方法来分离神经元来源的细胞外囊泡。这样的方法包括例如将顺磁性珠附着到针对特定标志物如L1 CAM的抗体上。(参见例如Shi等人,“Plasma exosomalα-alpha-synuclein is likely CNSderived and increased in Parkinson’s disease”,Acta Neuropathol.2014年11月；128(5):639–650)。
在另一种方法中，可以使用抗-CD 171来富集神经元来源的外泌体。
来自产生多巴胺的神经元的细胞外囊泡的特征在于存在酪氨酸羟化酶。可以通过靶向TH的免疫亲和力方法来富集样品中的此类细胞外囊泡。
D.细胞外囊泡内容物
与人类神经退行性疾病的发病机制相关的许多蛋白质(包括激酶)在CNS外部以及脑内部产生，并且可以附着到细胞外囊泡的外表面，它们穿过血脑屏障进入到外周循环中。因此，在本文公开的方法的某些实施方案中，处理外泌体级分以除去结合到外泌体表面的分子。这可以例如通过严格的洗涤程序来完成，如使用磷酸盐缓冲溶液(PBS)。在这样的处理之后，可以对细胞外囊泡的内容物进行处理以便进行测定。
然后可以裂解经洗涤的细胞外囊泡，并释放其内部内容物用于分析。
IV.确定神经退行性病患的诊断、阶段、进展、预后和发生风险
包含生物样品中选自以下的生物标志物：(i)多种不同的信号传导激酶；或(ii)来自选自以下的至少两组的生物标志物：(1)选自磷酸化信号传导激酶和/或催化酶的一种或多种酶，(2)单体或寡聚形式的一种或多种神经退行性病变相关蛋白，和(3)一种或多种miRNA的量的生物标志物谱以及所述谱随时间的变化指示神经退行性类型的神经生成性病患的存在、严重性和方向。例如，本文公开的蛋白质生物标志物的异常比率，例如升高的量，指示神经退行性变的过程。如果不加控制，这个过程可能会导致突触核蛋白病性病患的明显症状。因此，本文提供了确定受试者(例如，有症状或无症状个体)中神经退行性病患的诊断、阶段、进展、速率、预后、药物反应性和发生风险的方法，所述神经退行性病患的特征在于一种或多种生物标志物蛋白质的异常量(各自在本文中称为“神经病性状态”，例如“突触核蛋白病性状态”、“淀粉样蛋白病性状态”、“tau蛋白病性状态”、“亨廷顿氏状态”)。
如本文所用，术语“诊断”是指将个体分类为患有或不患有特定致病病患，包括例如该病患的阶段。
如本文所用，术语“临床上相似但病因学上不同”是指具有共同的临床体征和/或症状但由不同的生物学原因引起的病患。
如本文所用，术语“阶段”是指病患的相对严重性程度，例如疑似疾病、早期、中期或晚期。可以基于病因学、病理生理学、严重性等使用分期对患者分组。
如本文所用，术语“进展”是指病患的阶段或严重性随时间的变化或其缺乏。这包括病患的严重性的增加、减轻或停滞。在某些实施方案中，测量进展速率，即随时间的变化。
如本文所用，术语“预后”是指病患的预测病程，例如进展的可能性。例如，预后可以包括预测病患的严重性可能在未来的某个时间点增加、减轻或保持不变。在本公开的上下文中，预后可以指个体发生以下情况的可能性：(1)将患上神经退行性病患，(2)将从病患的一个阶段进展到另一个更晚期的阶段，(3)将表现出病患的严重性的减轻，(4)将表现出一定速率的机能下降，(5)将带病生存一定的时间段(例如，存活率)或(6)将发生病患的复发。病患可以是突触核蛋白病性病患(例如，PD、路易体痴呆、多系统萎缩症或一些相关的突触核蛋白病)、淀粉样蛋白病性病患(例如，阿尔茨海默氏病)、tau蛋白病性病患(例如，阿尔茨海默氏病)和亨廷顿病。正如医学诊断领域的任何技术人员将理解的，这些术语并不旨在是绝对的。
如本文所用，术语“发展风险”是指无症状或临床前个体发生明确诊断的疾病的概率。确定概率包括精确概率和相对概率，如“很可能”、“极有可能”、“不太可能”或百分比机会，例如“90％”。可以基于年龄、性别、遗传风险和环境风险因素中的任一个与一般群体或与和受试者匹配的群体比较风险。在这样的情况下，可以确定受试者与群体的其他成员相比处于增加或减小的风险下。处于增加的发生神经退行性病患的风险下的受试者可能对针对神经退行性病患的治疗做出正向反应，例如，通过预防病患的发生、延迟病患的发作或降低与病患相关的症状严重性或发病率。
V.对激酶谱建模以推断神经退行性病患的诊断、阶段、进展、预后和发生风险
确定神经退行性病患的诊断、阶段、进展速率、预后和风险是将受试者分类为不同的病患或不同的类别或状态内情况的过程，如疾病/健康(诊断)、I期/II期/III期(阶段)、可能会缓和/可能会进展(预后)或在一定范围内赋分。使用生物标志物谱分类的方法可以涉及鉴定各种状态特征性的谱并将来自受试者的谱与类别或状态相关联。鉴定这样的谱可以涉及分析来自属于不同状态的受试者的生物标志物谱以及辨别模式或谱之间的差异。分析可以通过谱的目视检查或通过分析来完成。
A.分析
如本文所用，术语“分析”是指将输入变换为输出(例如，将输入映射到输出)的任何算法或函数。分析包括但不限于统计分析、机器学习分析和神经网络分析。
通常，分析涉及对足够大量的样本进行分析以提供有统计学意义的结果。本领域已知的任何统计方法都可以用于此目的。这样的方法或工具包括但不限于相关法、Pearson相关性、Spearman相关性、卡方、平均数比较(例如，配对T检验、独立T检验、ANOVA)回归分析(例如，简单回归、多元回归、线性回归、非线性回归、逻辑回归、多项式回归、逐步回归、岭回归、套索回归(lasso regression)、弹性网络回归(elasticnet regression))或非参数分析(例如，Wilcoxon秩和检验、Wilcoxon符号秩检验、符号检验)。这样的工具包含在市售统计软件包中，如MATLAB、JMP统计软件和SAS。这样的方法产生模型或分类器，其可用于将特定的生物标志物谱分类到特定的状态中。
分析可以由操作员实施或通过机器学习实施。
B.机器学习
在某些实施方案中，通过使用机器学习工具来增强分析。这样的工具采用学习算法，其中在不同的可能状态下测量相关的一个或多个变量，确定区分状态的模式并用于对测试受试者分类。因此，可以通过比较属于特定突触核蛋白病性状态内的各种情况的受试者中一个或多个变量的度量来开发本公开的任何分类方法。这包括例如在具有各种诊断或处于各种阶段、在各种时间下的受试者中确定包含选自以下的生物标志物的量的生物标志物谱：(i)多种不同的信号传导激酶；或(ii)来自选自以下的至少两组的生物标志物：(1)选自磷酸化信号传导激酶和/或催化酶的一种或多种酶，(2)单体或寡聚形式的一种或多种神经退行性病变相关蛋白，和(3)一种或多种miRNA，以允许预测诊断、阶段、进展、预后、药物反应性或风险。还可以包括其他变量，如家族史、生活方式、化学品暴露、各种表型性状等。
1.训练数据集
训练数据集为通常包含针对多名受试者(更一般地称为对象)中的每一个的多个特征中的每一个的测量值向量的数据集。特征之一可以是受试者的分类，例如基于量表的诊断或程度测量值。这可以用于受监督的学习方法中。其他特征可以是例如选自以下的生物标志物的测量量：(i)多种不同的信号传导激酶；或(ii)来自选自以下的至少两组的生物标志物：(1)选自磷酸化信号传导激酶和/或催化酶的一种或多种酶，(2)单体或寡聚形式的一种或多种神经退行性病变相关蛋白，和(3)一种或多种miRNA。因此，例如，个体受试者的向量可以包括神经退行性病患的诊断(例如，诊断为患有或未诊断为患有帕金森氏病)和如本文所述的多种生物标志物中的每一种的度量。在某些实施方案中，用于生成分类器的训练数据集包含来自至少100名、至少200名或至少400名不同受试者的数据。分类为患有该病患的受试者与不患有该病患的受试者的比率可以是至少2:1、至少1:1或至少1:2。替代地，被预先分类为患有该病患的受试者可以构成不超过66％、不超过50％、不超过33％或不超过20％的受试者。
2.学习算法
学习算法，也称为机器学习算法，是自动进行分析模型构建(例如，用于聚类、分类或谱识别)的计算机执行算法。学习算法对提供给算法的训练数据集进行分析。
学习算法将输出模型，该模型也称为分类器、分类算法或诊断算法。模型接收测试数据作为输入，并产生输入数据的推断结果或分类作为输出，所述推断结果或分类为属于一个或另一个类别、聚类组或量表上的位置，如诊断、阶段、预后、疾病进展、对药物的反应性等。
可以使用多种机器学习算法来推断受试者的病患或状态。机器学习算法可以是有监督的，也可以是无监督的。学习算法包括例如人工神经网络(例如，反向传播网络)、判别分析(例如，Bayesian分类器或Fischer分析)、支持向量机、决策树(例如，递归划分过程如CART-分类和回归树)、随机森林、线性分类器(例如，多元线性回归(MLR)、偏最小二乘(PLS)回归和主成分回归(PCR))、分层聚类和聚类分析。学习算法将生成可用于进行推断的模型或分类器，例如，关于受试者的疾病状态的推断。
3.验证
随后可以使用验证数据集来验证模型。验证数据集通常包含对与训练数据集相同的特征的数据。该模型在训练数据集上执行，并确定真阳性、真阴性、假阳性和假阴性的数量作为模型性能的衡量标准。
然后可以在验证数据集上测试模型以确定其有用性。通常，学习算法将生成多个模型。在某些实施方案中，可以基于对用于诊断所考虑的病患的标准临床测量值的保真度来验证模型。可以基于其性能特征来选择这些中的一种或多种。
C.模型执行和进行推断
所选择的模型可以产生于操作员执行的分析或机器学习。在任何情况下，模型都可以用于对测试受试者进行推断(例如，预测)。可以从取自测试受试者的样品生成生物标志物谱，例如包含例如向量的测试数据集的形式，其含有模型所使用的特征的值。测试数据集可以包括训练数据集中使用的所有相同特征，或这些特征中的一部分。然后将模型应用于测试数据集或在测试数据集上执行。将生物标志物谱与病患、疾病状态、预后、进展风险、药物反应的可能性等相关联是执行模型的一种形式。关联可以由人或由机器(例如，由可编程数字计算机)执行。该选择可以取决于关联操作的复杂性。这将产生推断结果，例如将受试者分类为属于某个类别或聚类组(如诊断)，或量表上的某处(如对治疗性干预做出反应的可能性)。
在某些实施方案中，分类器将包括神经退行性病变相关蛋白的多种寡聚蛋白形式，并且通常包括但不一定包括一种或多种单体形式。分类器可以是也可以不是线性模型，例如形式AX+BY+CZ＝N的模型，其中A、B和C为形式X、Y和Z的测量量。分类器可能需要例如支持向量机分析。例如，推断模型可以执行模式识别，其中生物标志物谱在量表上位于正常和异常之间，各种谱更倾向于正常或异常。因此，分类器可以指示该谱是正常还是异常的置信水平。异常的生物标志物谱可以是当通过分类算法分析时将受试者分类为非正常类别(如存在疾病或处于增加的疾病风险下)的谱。如果生物标志物的测量值位于被认为正常的范围之外，例如与正常范围的偏差具有统计学显著性，则该测量值可能是异常的。
分类器或模型可以从所测量的一种或多种形式生成充当模型的单个诊断数。对神经病理状态(例如，突触核蛋白病性状态)进行分类(例如，诊断、阶段、进展、预后和风险)可以涉及确定诊断数是高于还是低于阈值(“诊断水平”)。例如，诊断数可以是两种不同的信号传导激酶的相对量。该阈值可以例如基于诊断数高于没有任何神经退行性(例如，突触核蛋白病性)病患体征的正常个体的一定偏差来确定。可以在统计学显著性数量的正常和异常个体中确定诊断数的集中趋势度量指标，如平均数、中位数或众数。可以选择高于正常量的截止值作为神经退行性(例如，突触核蛋白病性)病患的诊断水平。该数字可以是例如与集中趋势度量指标一定程度的偏差，如方差或标准偏差。在一个实施方案中，偏差的量度指标为Z分数或与正常平均值的标准偏差数。
可以选择模型以提供所需水平的灵敏性、特异性或阳性预测能力。例如，诊断水平可以提供至少80％、90％、95％或98％中的任一个的灵敏性和/或至少80％、90％、95％或98％中的任一个的特异性和/或至少80％、90％、95％或98％中的任一个的阳性预测值。测试的灵敏性为实际阳性中测试阳性的百分比。测试的特异性为实际阴性中测试阴性的百分比。测试的阳性预测值为测试阳性的受试者为实际阳性的概率。
1.示例性指标
在一种方法中，指标或分类器是若干变量的函数。这些变量包括来自以下的两组或更多组的生物标志物：(1)选自信号传导激酶和/或催化酶的一种或多种酶，(2)单体或寡聚形式的一种或多种神经退行性病变相关蛋白，和(3)一种或多种miRNA。某些指标使用至少一种或多种信号传导激酶和一种或多种神经退行性病变相关蛋白，特别地，神经退行性病变相关蛋白的寡聚形式。其他指标使用来自所有三组的生物标志物。其他指标同时使用一种或多种信号传导激酶和一种或多种催化酶。其他指标使用一种或多种信号传导激酶、一种或多种催化酶和一种或多种神经退行性病变相关蛋白形式。其他指标使用一种或多种信号传导激酶、一种或多种催化酶、一种或多种神经退行性病变相关蛋白形式和一种或多种miRNA。
其他指标使用神经退行性病患的上调生物标志物对下调生物标志物的相对量(例如，比率)。例如，某些指标使用包含一种或多种上调信号传导激酶(例如，AKT)、一种或多种上调催化酶(例如，TH-S40)和一种或多种上调神经退行性病变相关蛋白形式(例如，α突触核蛋白寡聚体)的组与包含一种或多种下调信号传导激酶(例如，MAPK)、一种或多种下调催化酶(例如，TH(总蛋白))的组的相对量，或当以某些磷酸化形式(例如，TH S40(等))测量时的相对上调，或在施用多巴胺能药物治疗PD症状期间的相对下调。其他指标使用包含多种上调信号传导激酶(例如，AKT)、一种或多种突触核蛋白寡聚体和一种或多种miRNA的组与包含多种下调信号传导激酶(例如，MAPK)和一种或多种下调催化酶(例如，TH(例如，总蛋白))的组的相对量。
参考图7，该公开考虑了多种诊断指标。诊断指标可以使用(i)多种不同的信号传导激酶；或(ii)来自选自以下的至少两组的生物标志物：(1)选自磷酸化信号传导激酶和/或催化酶的一种或多种酶，(2)单体或寡聚形式的一种或多种神经退行性病变相关蛋白，和(3)一种或多种miRNA作为生物标志物组。
神经退行性疾病的诊断指标可以是一种或多种磷酸化信号传导激酶的函数。(图7，指标1)。例如，指标可以包括多种信号传导激酶。帕金森氏病的一种此类指标是AKT和MAPK3的相对量的函数。该指标的增加与帕金森氏病呈正相关。(图7，指标2)。
在另一指标(图7，指标3)中，诊断是一种或多种信号传导激酶、一种或多种催化酶、一种或多种神经退行性病变相关蛋白形式和一种或多种microRNA的函数。
在帕金森氏病的另一指标中，指标是AKT、磷酸化酪氨酸羟化酶、miRNA、MAPK3和总或非磷酸化酪氨酸羟化酶的函数；并且在一个版本中，指标是(AKT、磷酸化酪氨酸羟化酶、miRNA)对(MAPK3和总/非磷酸化酪氨酸羟化酶蛋白)的相对量的函数。(图7，指标4)。
在帕金森氏病的另一指标中，指标是AKT、磷酸化酪氨酸羟化酶、一种或多种神经退行性病变相关蛋白形式、MAPK3和非磷酸化酪氨酸羟化酶的函数；并且在一个版本中，指标是(AKT、磷酸化酪氨酸羟化酶、一种或多种神经退行性病变相关蛋白形式)对(MAPK3和非磷酸化酪氨酸羟化酶)的相对量的函数。(图7，指标5)。
在帕金森氏病的另一指标中，诊断是AKT、MAPK、任选的第二和第三信号传导激酶、一种或多种催化酶、一种或多种神经退行性病变相关蛋白形式和一种或多种microRNA的函数。在针对帕金森氏病的一个特定版本中，指标是AKT、第二信号传导激酶、一种或多种神经退行性病变相关蛋白、一种或多种miRNA、MAPK3、第四信号传导激酶和非磷酸化酪氨酸羟化酶的函数。在一个版本中，指标是(AKT、第二信号传导激酶、一种或多种神经退行性病变相关蛋白和一种或多种miRNA)对(MAPK3、第四信号传导激酶和非磷酸化酪氨酸羟化酶)的相对量的函数。(图7，指标6)。AKT可以以其磷酸化形式测量，如AKT S473。MAPK3可以以其磷酸化形式MAPK T202测量。
VI.治疗神经退行性病患的治疗性干预的开发
在另一个方面，本文提供了使得能够实际开发针对神经退行性病患例如突触核蛋白病性病患、淀粉样蛋白病性病患、tau蛋白病性病患和亨廷顿病的治疗性干预的方法。这些方法尤其涉及选择临床试验受试者并确定治疗性干预在一组受试者中的有效性。
包括监测神经退行性病变相关蛋白的生物标志物谱的方法可用于确定实验性治疗性干预是否有效于预防突触核蛋白病的临床发作或抑制突触核蛋白病的后续进展，或者某受试者是否应该进入临床试验来测试候选药物治疗此类病患的功效。神经退行性病变相关蛋白的生物标志物谱或生物标志物谱的变化使得能够直接确定对病患的治疗效果，包括例如基本疾病过程。
A.受试者入组
临床试验涉及受试者入组以测试潜在的治疗性干预如药物的功效和安全性。通常，虽然受试者是基于某些共同特征来选择的，但他们在一个状态的其他情况下也表现出重要的差异，例如，有或没有疾病诊断或处于疾病的不同阶段或疾病的不同亚型或不同的预后的受试者。临床试验受试者可以分层到不同的组中以接受相同或不同的治疗。分层可以基于任何数量的因素，包括疾病的阶段。疾病分期是一种分类系统，它使用诊断结果基于病因学、病理生理学和严重性等因素产生患者的聚类。它可以用作对临床同质患者进行聚类的基础以评估护理的质量、临床结局的分析、资源的利用和替代治疗的功效。
在另一种方法中，至少部分地根据生物标志物谱对潜在的临床试验受试者进行分层。因此，例如，具有不同的生物标志物谱(例如，较高和较低的相对量或随时间的变化率)的受试者可以被分配到不同的组。
临床试验中的受试者群体应当足以显示药物是否在结局上产生统计学显著性差异。根据该效能水平，试验中的个体数量可以是至少20名、至少100名或至少500名受试者。在这些中，必须有显著数量的个体表现出与患有神经退行性病患一致的生物标志物谱(例如，升高的生物标志物水平。例如，至少20％、至少35％、至少50％或至少66％的受试者可能最初具有这样的生物标志物谱(包含例如信号传导激酶的各种物种)。另外，显著数量的受试者将在类别状态之间进行划分。例如，至少20％、至少35％、至少50％、至少66％或100％的受试者可能最初被诊断为神经退行性病患(例如，突触核蛋白病性病患(例如，PD)、淀粉样蛋白病性病患、tau蛋白病性病患和亨廷顿病)。
B.药物开发
在临床试验开始后，可以将治疗性干预对不同分层组的有效性快速确定为对生物标志物谱的影响的函数，所述生物标志物谱包括选自以下的生物标志物：(i)多种不同的信号传导激酶；或(ii)来自选自以下的至少两组的生物标志物：(1)选自磷酸化信号传导激酶和/或催化酶的一种或多种酶，(2)单体或寡聚形式的一种或多种神经退行性病变相关蛋白，和(3)一种或多种miRNA。更具体地，生物标志物谱的变化可预测治疗性干预的临床有效性。方法通常涉及首先测试个体以确定包含信号传导激酶和任选地神经退行性病变相关蛋白的生物标志物谱。测量后，对至少一部分受试者施用治疗性干预，例如实验药物。通常，至少一部分受试者接受安慰剂或不接受治疗。在一些情况下，受试者充当其自身的对照，首先接受安慰剂，然后接受实验干预，或反过来，以进行比较。在某些情况下，这可以与施用已经认可的治疗形式相结合地进行。可以根据治疗性干预的施用剂量、时间和速率来划分群体。当测试受试者出现统计学显著性改善时，出于伦理考虑，可能需要停止研究。如本文所用，“实验药物”和“候选药物”是指具有治疗效果或正被测试治疗效果的药剂。“推定的神经保护剂”是指具有或正被测试具有神经保护性作用的药剂。
在施用治疗性干预后，再次测定生物标志物谱，并且可以将其进一步评价为变化率的函数。
治疗性干预可以是候选药物的施用。使用标准统计方法，可以确定治疗性干预对生物标志物谱是否具有有意义的影响，所述生物标志物谱包含选自以下的生物标志物：(i)多种不同的信号传导激酶；或(ii)来自选自以下的至少两组的生物标志物：(1)选自磷酸化信号传导激酶和/或催化酶的一种或多种酶，(2)单体或寡聚形式的一种或多种神经退行性病变相关蛋白，和(3)一种或多种miRNA。一般而言，与初始生物标志物谱相比，统计学显著性的变化(尤其是朝向更正常的谱的转变)表明治疗性干预是神经保护性的并因此将延迟临床发作，或者减缓或优选地逆转神经退行性病患(例如，突触核蛋白病性病患、淀粉样蛋白病性病患、tau蛋白病性病患、亨廷顿病)的进展。
相应地，可以为其测量包含选自(1)至少一种信号传导激酶和任选地神经退行性病变相关蛋白的至少一种寡聚形式或(2)一种或多种不同的信号传导激酶中的每一种的生物标志物的生物标志物谱的受试者包括例如：(1)无神经退行性病患(例如，突触核蛋白病性病患、淀粉样蛋白病性病患、tau蛋白病性病患、亨廷顿病)的症状的受试者；(2)具有极少的神经退行性疾病症状并且没有提示神经退行性病患的体征的受试者(例如，可能经诊断患有“疑似”或“临床前”神经退行性病患的受试者，尤其是当已鉴定了某些遗传和/或环境风险因素时)；(3)诊断为“可能的”神经退行性病患的受试者和诊断(“明确诊断”)患有神经退行性病患的受试者。这些受试者包括例如(1)无突触核蛋白病性病患的症状的受试者，(2)具有极少的帕金森病症状并且没有提示突触核蛋白病性病患的体征的受试者(例如，可能经诊断患有“疑似”或“临床前”PD或一些相关的突触核蛋白病的受试者，尤其是当已鉴定了某些遗传和/或环境风险因素时)；(3)诊断为“可能的”突触核蛋白病(例如，PD)的受试者和诊断(“明确诊断”)患有突触核蛋白病性病患的受试者。
受试者通常为人，但也包括非人动物，例如用作PD的模型的那些，如啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)、猫、狗、其他驯养的四足动物(如马、羊和猪)和非人灵长类动物(例如，猴)。动物模型包括遗传模型和基于神经毒素的施用的模型。此类模型中使用的神经毒素包括例如6-羟基多巴胺(6-OHDA)和1-甲基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)施用以及百草枯和鱼藤酮。遗传模型包括SNCA(α-syn、PARK1和4)、PRKN(parkin RBR E3泛素蛋白连接酶、PARK2)、PINK1(PTEN-诱导假定激酶1、PARK6)、DJ-1(PARK7)和LRRK2(富亮氨酸重复激酶2、PARK8)中的基因突变。
针对神经退行性病患如突触核蛋白病的神经保护性疗法的临床试验需要迅速指示潜在疗法的有效性的测量值。否则，基于非定量性质的临床观察的药物功效确定需要花费很多个月的时间。包含神经退行性病变相关蛋白寡聚体和任选地单体的生物标志物谱提供了这样的测量值，从而使得能够在罹患致命性脑病如PD的受试者中实际评价疾病缓解药物的功效。
C.验证
当受试者表现出临床症状的临床显著性改善时，就称受试者对治疗有反应。所测试药物的功效通常通过临床测量来验证，例如通过确定疾病症状、体征和阶段。此类临床测量包括本文描述的那些，如改良Hoehn和Yahr分期量表和统一帕金森氏病评定量表(UPDRS)。如本文所述的生物标志物谱还提供对治疗的反应的指示，并且可以在比其他形式的临床评价早得多的时间段做到这一点。使用传统方法，这通常将在验证了药物之后进行。然而，除了临床标志物外或代替临床标志物，可以使用生物标志物谱来确定药物在受试者或受试者群体中的功效。例如，通过传统手段仅可以在治疗开始后约18个月检测到的反应可以在治疗开始后短至12个月、六个月或三个月时在生物标志物谱中检测到。相应地，在一些实施方案中，确定对治疗的反应涉及到确定受试者在第一时间点的第一生物标志物谱，向受试者施用治疗性干预；在施用治疗性干预后，例如在治疗开始后约一个月、三个月、六个月、九个月、12个月、15个月或18个月中的任一个内，确定第二生物标志物谱；并比较第一和第二生物标志物谱以鉴定变化。生物标志物谱没有统计学显著性差异指示对治疗没有反应。朝向正常生物标志物谱的统计学显著性变化指示对治疗的正向反应，而远离正常谱的统计学显著性变化指示对治疗的负向反应或疾病的进展。当在开始治疗性干预之前已知正常谱时，可以省去第一生物标志物谱的测量并且可以依赖于第二生物标志物谱来进行确定。
可以使用基于生物标志物分析得到的治疗性干预缺乏功效的早期证据来中止治疗性干预的施用及其伴随的风险，从而提高试验参与者的安全性。
VII.治疗方法
根据基于如本文所述的生物标志物谱将受试者分类为的神经退行性病患(例如，突触核蛋白病性病患、淀粉样蛋白病性病患、tau蛋白病性病患、亨廷顿病)的阶段或类别，受试者可能需要治疗性干预。本文提供了用治疗性干预治疗通过本文公开的方法确定表现出神经退行性病患(例如，突触核蛋白病性病患、淀粉样蛋白病性病患、tau蛋白病性病患、亨廷顿病)的受试者的方法，其中所述治疗性干预有效于治疗所述病患。改变信号传导激酶和任选地神经退行性病变相关蛋白的水平的治疗性干预，尤其是恢复信号传导激酶和任选地神经退行性病变相关蛋白的水平的那些，反映了有效的治疗，例如通过本文的方法开发并经过临床验证的治疗性干预。
如本文所用，术语“治疗性干预”、“疗法”和“治疗”是指产生治疗效果或有益效果(例如，“治疗有效”)的干预。治疗有效的干预将预防疾病、减缓疾病的进展、延迟疾病的症状的发作、改善疾病的状况(例如，导致疾病的缓解)、改善疾病的症状、或改善疾病患者的生活质量、或延长疾病患者的生命、或治愈疾病，如突触核蛋白病性病患。治疗性干预可以包括例如施用治疗、以治疗性目的施用药物或者生物或营养物质。治疗性干预通常由医疗护理专业人员(例如，医师或护士)施用。对治疗性干预的反应可以是完全反应或部分反应。在一些方面，与例如施用前的个体或未接受治疗的对照个体相比，疾病的严重性降低至少10％。在一些方面，疾病的严重性降低至少25％、50％、75％、80％或90％，或者在一些情况下，使用标准诊断技术不再可检测到。认识到某些受试者亚组可能对治疗没有反应，故治疗有效性的一种衡量标准可以是对至少100名受试者中至少90％的接受干预的受试者有效。
如本文所用，修饰治疗性干预(“有效的治疗”或“有效于……的治疗”)或药物的量(“有效量”)的术语“有效”是指改善如上所述病症的治疗或量。例如，对于给定的参数，治疗有效量将显示出参数至少5％、10％、15％、20％、25％、40％、50％、60％、75％、80％、90％或至少100％的增大或减小。治疗功效也可以表示为“-倍”的增大或减小。例如，治疗有效量可以具有相比于对照至少1.2倍、1.5倍、2倍、5倍或更多的效果。目前，针对帕金森病受试者运动症状的严重性的临床功效可以使用UPDRS以及Hoehn和Yahr量表等标准化量表来度量；对于心理(metal)和认知症状，可以使用ADAS-cog或MMPI量表。(人们认识到，此类量表的效用不一定取决于基础疾病病患的类型或性质。)
因此，根据一些方法，首先测试受试者的生物标志物谱，所述生物标志物谱包含来自受试者的生物样品中的神经退行性病变相关蛋白的寡聚形式和/或单体形式。基于生物标志物谱确定受试者的分类，将受试者分类到适当的病患或类别中。基于该分类，可以做出关于向受试者施用最佳有效的治疗性干预的类型、量、途径和时间的决定。
A.突触核蛋白病性病患
在某些实施方案中，针对PD的症状缓解治疗性干预(即，对症治疗或姑息治疗)包括施用选自以下的药物：多巴胺激动剂(例如，普拉克索(例如，MirapexTM)、罗匹尼罗(例如，Requip)、罗替戈汀(例如，Neupro)、阿扑吗啡(例如，Apokyn))、左旋多巴、卡比多巴-左旋多巴(例如，Rytary、Sinemet)、MAO-B抑制剂(例如，司来吉兰(例如，Eldepryl、Zelapar)或雷沙吉兰(例如，Azilect))、邻苯二酚-O-甲基转移酶(COMT)抑制剂(例如，恩他卡朋(Comtan)或托卡朋(Tasmar))、抗胆碱能剂(例如，苯扎托品(例如，Cogentin)或苯海索)、金刚烷胺或胆碱酯酶抑制剂(例如，利斯的明(Exelon))或一些类似的药剂或药剂组。
在另一个实施方案中，药物为NK1-拮抗剂和6-丙基氨基-4,5,6,7-四氢-1,3-苯并噻唑-2-胺的组合。例如，NK1-拮抗剂可以是罗拉吡坦或阿瑞吡坦并且6-丙基氨基-4,5,6,7-四氢-1,3-苯并噻唑-2-胺为普拉克索二盐酸盐一水合物。例如，阿瑞吡坦的日剂量可以在10mg至250mg之间，普拉克索二盐酸盐一水合物的日剂量可以在1.5mg至45mg之间。(参见例如美国专利申请2020/0147097。在另一个实施方案中，药物为组合产品，其包含与治疗有效日剂量的6-丙基氨基-4,5,6,7-四氢-1,3-苯并噻唑-2-胺组合递送5HT3-拮抗剂，例如昂丹司琼盐酸盐二水合物和普拉克索二盐酸盐一水合物的组合。昂丹司琼盐酸盐二水合物的日剂量可以为4mg至32mg，普拉克索的日剂量可以为1.5mg至42mg。(参见例如美国专利10,799,484。)在某些实施方案中，针对PD的神经保护或疾病缓解治疗性干预包括施用如以下临时专利申请中任一项所述的推定疾病缓解药物：2017年3月27日提交的序列号62/477187；2017年4月10日提交的序列号62/483,555；2017年4月13日提交的序列号62/485,082；2017年5月26日提交的序列号62/511,424；2017年7月3日提交的序列号62/528,228；2017年4月24日提交的序列号62/489,016；2017年6月30日提交的序列号62/527,215，这些临时专利申请全文以引用方式并入本文。
B.淀粉样蛋白病性病患
在某些实施方案中，针对淀粉样蛋白病性病患的症状缓解治疗性干预(即，对症治疗或姑息治疗)包括施用药物如(加兰他敏)、/>(利斯的明)和(多奈哌齐)。
C.Tau蛋白病性病患
在某些实施方案中，针对tau蛋白病性病患的症状缓解治疗性干预(即，对症治疗或姑息治疗)包括施用药物如(加兰他敏)、/>(利斯的明)和(多奈哌齐)或本文述及的用于PD的对症治疗的那些。
D.亨廷顿病
在某些实施方案中，针对亨廷顿病的症状缓解治疗性干预(即，对症治疗或姑息治疗)包括施用药物如丁苯那嗪((氘代丁苯那嗪)、IONIS-HTTRx以及各种精神安定剂和苯二氮/>类药物。
VIII.评价对治疗性干预的反应性的方法
在罹患神经退行性病症(例如，突触核蛋白病性病患、淀粉样蛋白病性病患、tau蛋白病性病患、亨廷顿病)的受试者中，治疗性干预的有效性或受试者对治疗性干预的反应性可以通过评估治疗性干预对生物标志物谱的影响来确定。这包括在任何神经退行性状态中的有效性，例如诊断、阶段、进展、预后和风险。生物标志物谱朝向更正常的谱的变化指示治疗性干预的有效性。
包含选自以下的一组生物标志物：(i)多种不同的信号传导激酶；或(ii)来自选自以下的至少两组的生物标志物：(1)选自磷酸化信号传导激酶和/或催化酶的一种或多种酶，(2)单体或寡聚形式的一种或多种神经退行性病变相关蛋白，和(3)一种或多种miRNA的生物标志物谱的使用在判断此类情况下的治疗功效方面比常规手段(例如，症状学、功能量表或放射学扫描中的变化)具有优势。此类判断功效的常规手段不仅不灵敏、不精确、是半定量的，而且通常需要很长时间(例如，数年)才能达到准确衡量的足够量级。相应地，测试的潜在有用治疗的数量显著减少，并且临床试验的费用以及因此有用药物的最终成本大大增加。
在某些实施方案中，多次测量蛋白质生物标志物物种的生物标志物谱，通常在施用治疗性干预之前、期间和之后或者在治疗性干预之后的多个时间点测量。
IX.试剂盒
在另一个方面，本文提供了用于检测如本文所述的生物标志物的试剂盒。试剂盒可以包含容器以容留用于从体液分离细胞外囊泡的试剂、用于从所有细胞外囊泡优先分离神经元来源的细胞外囊泡(例如，多巴胺神经元)的试剂以及足以检测激酶和/或神经退行性病变相关蛋白的形式的试剂。
例如，用于检测和分期生物样品中神经退行性病患的生物标志物的试剂盒可以包含试剂、缓冲剂、酶、抗体和其他专用于此目的的组合物。例如，试剂盒可以包括容器，该容器含有对信号传导激酶、催化酶或神经退行性病变相关蛋白的一种形式具有特异性的抗体。试剂盒还可以含有用于分离核酸分子如miRNA的层析介质。试剂盒通常还可以包括使用说明书以及用于数据分析和解释的软件。试剂盒还可以包含用作规范标准的样品。每种溶液或组合物可以含在小瓶或瓶子中，并且所有小瓶都被严格限制在盒中以供商业销售。
X.计算机系统
如本文所提供的数据库和对它们的操作可以由可编程数字计算机执行。
图8示出了示例性的计算机系统。计算机系统9901包括中央处理单元(CPU，本文中也称为“处理器”和“计算机处理器”)9905，其可以是单核或多核处理器，或用于并行处理的多个处理器。计算机系统9901还包括存储器或存储器位置9910(例如，随机存取存储器、只读存储器、快闪存储器)、电子存储单元9915(例如，硬盘)、用于与一个或多个其他系统通信的通信接口9920(例如，网络适配器)以及外围设备9925如高速缓存、其他存储器、数据存储和/或电子显示适配器。计算机可读存储器9910、存储单元9915、接口9920和外围设备9925通过通信总线(实线)如主板与CPU 9905通信。存储单元9915可以是用于存储数据的数据存储单元(或数据储存库)。计算机系统9901可以借助于通信接口9920可操作地联接到计算机网络(“网络”)9930。网络9930可以是互联网、内联网和/或外联网或与互联网通信的内联网和/或外联网。网络9930在一些情况下为电信和/或数据网络。网络9930可包括一个或多个计算机服务器，其可实现分布式计算，如云计算。CPU 9905可执行一系列机器可读指令，这些指令可体现在程序或软件中。指令可以存储在存储器位置如计算机可读存储器9910中。指令可针对CPU 9905，其随后可编程或以其他方式配置CPU 9905以实施本公开的方法。
存储单元9915可存储文件，如驱动程序、库和保存的程序。存储单元9915可存储用户数据，例如，用户偏好和用户程序。在一些情况下，计算机系统9901可包括在计算机系统9901外部(如在通过内联网或互联网与计算机系统9901通信的远程服务器上)的一个或多个附加数据存储单元。
计算机系统9901可通过网络9930与一个或多个远程计算机系统通信。
如本文所述的方法可通过存储在计算机系统9901的电子存储位置上例如计算机可读存储器9910或电子存储单元9915上的机器(例如，计算机处理器)可执行代码来实施。机器可执行或机器可读代码可以软件的形式提供。在使用期间，代码可以由处理器9905使用计算机逻辑(例如，设计到数字电路中)来执行。代码可以体现函数或模型。在一些情况下，代码可从存储单元9915检索并存储在存储器9910上以供处理器9905立即访问。代码可以从存储器访问接收并存储的电子形式的数据。在一些情形下，可排除电子存储单元9915，并将机器可执行指令存储在存储器9910上。
机器可执行代码可存储在电子存储单元如存储器(例如，只读存储器、随机存取存储器、快闪存储器)或硬盘上。“存储”型介质可包括计算机、处理器等的有形存储器或其相关模块(如各种半导体存储器、磁带驱动器、磁盘驱动器等)中的任何或全部，其可以随时为软件编程提供非暂时性存储。所有或部分软件有时可以通过互联网或各种其他电信网络进行通信。
计算机系统9901可以包括电子显示器9935或与电子显示器9935通信，电子显示器9935包括用于提供例如用于本文描述的方法的输入参数的用户界面(UI)9940。UI的实例包括但不限于图形用户界面(GUI)和基于网络的用户界面。
这里描述的过程可以使用可以联网在一起的一个或多个计算机系统来执行。可以在云计算系统中执行计算，其中主计算机上的数据通过通信网络传送到执行计算并且通过通信网络向用户传送或输出结果的云计算机。例如，输出可以被传输到云计算系统，在这里，效用分数算法执行本文描述的方法的一个或多个操作。在任何一步，云计算系统都可以将计算结果传输回用户操作的计算机。
数据可以以电子方式传输，例如通过互联网。数据可以输出到用户可访问的设备。电子通信可以例如通过任何通信网络进行，包括例如高速传输网络，包括但不限于数字用户线路(DSL)、电缆调制解调器、光纤、无线、卫星和电力线宽带(BPL)。信息可以被传输到调制解调器以便传输(例如，无线或有线传输)到计算机如台式计算机。替代地，可以将报告传输到移动设备。可以通过订阅程序来访问报告，其中用户访问显示报告的网站。报告可以被传输到用户可访问的用户接口设备。用户接口设备可以是例如个人计算机、笔记本电脑、智能电话或可穿戴设备，例如佩戴在例如手腕上的手表。
实施例
以下实施例以说明的方式而不是限制的方式提供。
实施例1：生物标志物谱在突触核蛋白病性病患中发生变化
为研究对象的个体队列已经诊断患有突触核蛋白病性病患。受试者被给予活性(active)治疗性干预，并然后被给予不同的治疗性干预，其可能已知是非活性的(inactive)。替代地，可以按相反的顺序给予干预。或者包含已经诊断患有突触核蛋白病性病患的多名受试者中无突触核蛋白病性病患的症状的多名受试者的队列为研究对象。在任一情况下，在不同的时间通过静脉穿刺从每名受试者采集静脉血样，包括在基线或对照(例如，非活性干预治疗)条件下采集以及在施用潜在活性(例如，实验干预)治疗期间再次采集。使用本文描述的方法从血液分离出神经元来源的细胞外囊泡。测量分离出的细胞外囊泡(例如，外泌体)内所含的生物标志物的量，所述生物标志物包括(1)选自磷酸化信号传导激酶和/或催化酶的一种或多种酶，(2)单体或寡聚形式的一种或多种神经退行性病变相关蛋白，和(3)一种或多种miRNA。将这些数据合并成数据集。使用统计方法对数据集进行分析，在这种情况下，将数据集用于训练学习算法，例如支持向量机，以开发推断受试者是否应被分类为患有或不患有突触核蛋白病性病患的模型。结果显示，在经诊断患有突触核蛋白病性病患的受试者队列中，信号传导激酶的某些物种相对于其他信号传导激酶具有统计学显著性程度的不同活性。另外，神经退行性病变相关蛋白的寡聚形式也发生了统计学显著性程度的变化。被发现在该生物标志物测定的结果中有显著变化的那些受试者后来被发现在临床状态中也有成比例的变化。
实施例2：诊断的开发
对不患有PD和患有不同诊断阶段的PD的志愿受试者进行测试以确定包含以下生物标志物的生物标志物谱，所述生物标志物包括(1)选自磷酸化信号传导激酶和/或催化酶的一种或多种酶，(2)单体或寡聚形式的一种或多种神经退行性病变相关蛋白，和(3)一种或多种miRNA。基于所确定的生物标志物谱，将受试者分类为显示存在疾病或显示不存在疾病并任选地按疾病的阶段分类。使用计算机化学习算法对谱进行判定，其在数据分析之后生成推断诊断的分类算法。选择推断模型来产生具有所需灵敏性和特异性的测试。
实施例3：受试者分层/临床试验
对不患有PD和患有PD的志愿受试者进行测试以确定神经元来源的细胞外囊泡中包含以下生物标志物的生物标志物谱，所述生物标志物包括(1)选自磷酸化信号传导激酶和/或催化酶的一种或多种酶，(2)单体或寡聚形式的一种或多种神经退行性病变相关蛋白，和(3)一种或多种miRNA。基于所确定的生物标志物谱，并使用上一实施例中确定的分类器，将受试者聚类到若干测试组中。某些测试组被给予安慰剂。在临床试验中，其他测试组被施用不同的量的化合物。在施用期间以及任选地在施用之后，重复测试。分析收集的测量结果。确定治疗性干预产生了生物标志物谱朝向正常的统计学显著性变化。
实施例4：对突触核蛋白病具有神经保护作用的候选药物的临床试验
II期研究的目标在于评价与阿瑞吡坦一起并且与或不与以及任选地洛伐他汀或类似有效药物一起给予普拉克索在患有PD和相关病症的患者中的安全性、耐受性和初始功效。对多达30名患有PD(PD)、多系统萎缩症(MSA)、路易体痴呆(LBD)或相关突触核蛋白病性病症的患者进行序贯治疗、递增剂量、交叉、门诊试验。在进入研究前的3个月期间，不允许任何参与者接受多巴胺激动剂或其他中枢活性药物的治疗，但左旋多巴-卡比多巴(Sinemet)除外，该药物在整个试验过程中在被认为医学上可接受的程度上保持在稳定剂量下。按照基线临床和实验室评价，包括联合PD评定量表(UPDRS-第III部分)和包含以下生物标志物的生物标志物测定，所述生物标志物包括(1)选自磷酸化信号传导激酶和/或催化酶的一种或多种酶，(2)单体或寡聚形式的一种或多种神经退行性病变相关蛋白，和(3)一种或多种miRNA，将符合入院标准的同意个体从其研究前的PD治疗方案转变为包括普拉克索ER和阿瑞吡坦的方案。将普拉克索ER剂量滴定至最佳耐受剂量(或最大9mg/天)，然后稳定保持长达约12至16周。然后，如果临床上认为合适，则可以开始与以其最大批准剂量给予的另一种药物(例如，斯达汀(statin))的联合治疗，持续另外3个月，此时所有受试者都恢复到其入院前的治疗方案。在试验期间，定期重复基线功效和安全性测量，包括测定生物标志物水平。功效确定为生物标志物谱朝向正常的统计学显著性变化的函数。
实施例5：诊断
受试者表现出具有与PD一致的某些症状，但处于临床前水平，此时仍缺乏该病的许多区分性临床特征。通过静脉穿刺从受试者采集血液。从血液中神经元来源的细胞外囊泡测量生物标志物的量，所述生物标志物包括(1)选自磷酸化信号传导激酶和/或催化酶的一种或多种酶，(2)单体或寡聚形式的一种或多种神经退行性病变相关蛋白，和(3)一种或多种miRNA。确定生物标志物谱。诊断算法将谱分类为与PD的诊断相一致。受试者经诊断患有PD，并接受治疗方案，或者接受缓解症状的姑息性方案，或者接受针对疾病病因的治疗以达到神经保护的目的。
实施例6：分期
受试者被诊断为PD。医疗护理提供者(例如，医师)要求对受试者进行血液测试以确定包含以下生物标志物的生物标志物谱，所述生物标志物包括(1)选自磷酸化信号传导激酶和/或催化酶的一种或多种酶，(2)单体或寡聚形式的一种或多种神经退行性病变相关蛋白，和(3)一种或多种miRNA。基于生物标志物谱，医疗护理专业人员确定受试者处于PD的早期阶段并因此对特定的治疗性干预更有反应。
实施例7：预后/进展
受试者被诊断为PD。医疗护理专业人员要求相隔几个月对受试者进行第一次和第二次血液测试以确定包含以下生物标志物的生物标志物谱，所述生物标志物包括(1)选自磷酸化信号传导激酶和/或催化酶的一种或多种酶，(2)单体或寡聚形式的一种或多种神经退行性病变相关蛋白，和(3)一种或多种miRNA。基于生物标志物谱，医疗护理专业人员确定受试者的疾病进展缓慢，并且即使没有冒险的治疗性干预，受试者预计也会有多年的生命。
实施例8：风险评估
受试者的体检结果没有发现突触核蛋白病性疾病的症状。在这种情况下，该个体意识到遗传或环境风险因素。医疗护理专业人员要求对受试者进行血液测试以确定包含以下生物标志物的生物标志物谱，所述生物标志物包括(1)选自磷酸化信号传导激酶和/或催化酶的一种或多种酶，(2)单体或寡聚形式的一种或多种神经退行性病变相关蛋白，和(3)一种或多种miRNA。基于一些或所有可测量的生物标志物物种与健康对照个体相比相对异常的生物标志物谱，医疗护理专业人员确定受试者发生PD的概率较低。
实施例9：对治疗的反应
受试者被诊断为PD。医疗护理专业人员要求在治疗开始之前对受试者进行初始血液测试以确定包含以下生物标志物的生物标志物谱，所述生物标志物包括(1)选自磷酸化信号传导激酶和/或催化酶的一种或多种酶，(2)单体或寡聚形式的一种或多种神经退行性病变相关蛋白，和(3)一种或多种miRNA。在一轮治疗之后，但在临床症状发生变化之前，医疗护理专业人员要求进行第二次血液检查。基于朝向正常的变化，医疗护理专业人员确定治疗是有效的或是否需要改变或重复剂量。
示例性实施方案
1.一种创建神经退行性病患的诊断指标的方法，其包括：
a)富集生物样品集合中的每个生物样品的神经元来源的细胞外囊泡，例如微囊泡或外泌体，其中所述生物样品集合来自受试者队列中的受试者，其中所述队列包含的受试者包括：
(i)经诊断患有处于一个或多个不同疾病阶段中的每一个阶段的神经退行性病患的多名受试者，其中每名经诊断的受试者已经接受推定的神经保护剂，和/或
(ii)未经诊断患有神经退行性病患的多名对照受试者，
其中在治疗之前收集生物样品并在治疗过程期间一次或多次再次收集生物样品，以及任选地在用推定的神经保护剂治疗的过程之后收集生物样品；
b)从来自每个样品的整个细胞外囊泡、细胞外囊泡的内部区室或细胞外囊泡膜分离蛋白质内容物以产生多个生物标志物样品；
c)在每个生物标志物样品中测量一组生物标志物以创建数据集，其中该组生物标志物包括：
(i)多种不同的信号传导激酶；或
(ii)来自选自以下的至少两组的生物标志物：
(1)选自磷酸化信号传导激酶和/或催化酶的一种或多种酶，
(2)单体或寡聚形式的一种或多种神经退行性病变相关蛋白，和
(3)一种或多种miRNA；和
d)对数据集进行分析以比较：
(i)个体受试者中生物标志物组随时间的差异以确定诊断算法，该诊断算法预测疾病进展的速率或对推定的神经保护剂的反应程度；或者
(ii)不同受试者之间生物标志物组的差异以确定诊断算法，该诊断算法(1)做出致病性诊断，(2)区分临床上相似但病因上不同的神经退行性病症亚组，或(3)预测受试者是否可能对推定的神经保护剂做出反应或受试者可能对推定的神经保护剂做出反应的程度。
2.前述实施方案中任一项的方法，其在富集之前还包括：
I)提供受试者的队列，其中该队列包含的受试者包括：(i)经诊断患有处于多个不同疾病阶段中的每一个阶段的神经退行性病患的多名受试者，和/或(ii)多名对照受试者；
II)向每名经诊断的受试者施用推定的神经保护剂；
III)在施用推定的神经保护剂之前、在施用推定的神经保护剂期间一次或多次再次以及任选地在施用推定的神经保护剂之后从队列中的每名受试者收集生物样品。
3.前述实施方案中任一项的方法，其还包括：
e)依据标准临床测量值验证一种或多种诊断算法。
4.前述实施方案中任一项的方法，其中所述生物标志物包括(1)一种或多种磷酸化信号传导激酶和/或催化酶，一种或多种(2)单体或寡聚形式的一种或多种神经退行性病变相关蛋白，和(3)一种或多种miRNA。
5.前述实施方案中任一项的方法，其中所述酶包括一种或多种信号传导激酶。
6.实施方案5的方法，其中所述信号传导激酶中的至少一种为PI3K-Akt-mTOR信号传导通路的激酶。
7.实施方案5的方法，其中所述信号传导激酶中的至少一种选自丝裂原激活蛋白激酶(MAPK或MEK)、细胞外信号调节激酶(ERK)、糖原合成酶激酶3β(GSK3B)、AKT激酶和beclin。
8.实施方案5的方法，其中所述至少一种信号传导激酶为多种信号传导激酶。
9.实施方案8的方法，其中所述多种信号传导激酶选自AKT、MAPK3、MEK、mTOR、GSK3B、JNK、MEK 1/2和PI3K。
10.实施方案8的方法，其中所述多种信号传导激酶包括磷酸化AKT(例如，AKTS473或AKT T308)和磷酸化MAPK3(例如，MAPK T202)。
11.实施方案5的方法，其中所述信号传导激酶中的至少一种选自AKT S473；AKTT308；ERK P44；GSK3B S6；GSK3B S9；GSK3 T216；GSK3A S21；MAPK T202；mTOR S2448；mTORc1/2 T246；mTOR c1/2 S638；JNK 1/2/3；JNK pY183；JNK pY185；MEK1/2S217；MEK S221；PI3K p85；PI3K T458；PKB S473；PI3K p55-T199；和PKB T308。
12.实施方案8的方法，其中所述诊断算法确定AKT:MAPK的相对量。
13.实施方案1的方法，其中至少一种催化酶选自总TH(酪氨酸羟化酶)和磷酸化形式TH S40、TH S19和TH S32。
14.前述实施方案中任一项的方法，其中所述诊断算法为一种或多种信号传导激酶、一种或多种催化酶、一种或多种神经退行性病变相关蛋白形式和一种或多种microRNA的测量值的函数。
15.前述实施方案中任一项的方法，其中所述诊断算法为AKT、磷酸化酪氨酸羟化酶、miRNA、MAPK3和非磷酸化酪氨酸羟化酶的测量值的函数。
16.前述实施方案中任一项的方法，其中所述诊断算法为(AKT、磷酸化酪氨酸羟化酶、miRNA)对(MAPK3和非磷酸化酪氨酸羟化酶)的测量值的函数。
17.前述实施方案中任一项的方法，其中所述诊断算法为至少一种神经退行性病变相关蛋白形式的函数。
18.实施方案17的方法，其中确定其定量测量值的神经退行性病变相关蛋白形式选自：
(I)至少一种寡聚形式；
(II)多种寡聚形式；
(III)至少一种寡聚形式和至少一种单体形式；
(IV)多种寡聚形式和至少一种单体形式；
(V)至少一种寡聚形式和多种单体形式；和
(VI)多种寡聚形式和多种单体形式。
19.前述实施方案中任一项的方法，其中所述诊断算法为(AKT的磷酸化形式、第二信号传导激酶的磷酸化形式、α-突触核蛋白的寡聚形式、miRNA)对(MAPK3的磷酸化形式、第四信号传导激酶的磷酸化形式、酪氨酸羟化酶的非磷酸化形式)的相对测量值的函数。
20.前述实施方案中任一项的方法，其中所述诊断算法为AKT、磷酸化酪氨酸羟化酶、神经退行性病变相关蛋白形式、MAPK3和非磷酸化酪氨酸羟化酶的测量值的函数。
21.前述实施方案中任一项的方法，其中所述诊断算法为(AKT、磷酸化酪氨酸羟化酶、神经退行性病变相关蛋白形式)对(MAPK3和肺磷酸化酪氨酸羟化酶)的相对测量值的函数。
22.前述实施方案中任一项的方法，其中所述诊断算法为一种或多种神经退行性病变相关蛋白形式和一种或多种miRNA的函数。
23.前述实施方案中任一项的方法，其中所述生物标志物包含(i)选自信号传导激酶和催化酶的酶，和(ii)选自单体和寡聚体的神经退行性病变相关蛋白。
24.前述实施方案中任一项的方法，其中所述生物标志物包含(i)选自信号传导激酶和催化酶的酶，和(iii)miRNA。
25.前述实施方案中任一项的方法，其中所述神经退行性病变相关蛋白选自α突触核蛋白、淀粉样蛋白β、tau或亨廷顿蛋白。
26.前述实施方案中任一项的方法，其中所述神经退行性病变相关蛋白的寡聚形式为寡聚形式例如α突触核蛋白的寡聚体的集合，例如α突触核蛋白2-50，例如α突触核蛋白4-30，例如α突触核蛋白4-20。
27.前述实施方案中任一项的方法，其中所述生物标志物包含选自以下的一种或多种miRNA：7-5p；15b-5p；19b；22-3p；24；27a-3p 24；29a；30c-2-3p；494-3p；92b-3p；106b-3p；122-5p；124-3p；122-5p；132-3p；138-5p；142-3p；146a-5p；204-5p；220-3p；331-5p；338-3p；431-5p；584-5p；942-5p；和1468-5p。
28.前述实施方案中任一项的方法，其中所述神经退行性病患包括突触核蛋白病性病症，例如帕金森氏病或路易体痴呆。
29.前述实施方案中任一项的方法，其中所述神经退行性病患包括淀粉样蛋白病，例如阿尔茨海默氏病、tau蛋白病，例如阿尔茨海默氏病或亨廷顿病。
30.前述实施方案中任一项的方法，其中从微粒体的内部区室分离出蛋白质内容物。
31.实施方案3的方法，其中所述标准临床测量值选自UPDRS分数、CGI分数和放射学结果。
32.前述实施方案中任一项的方法，其中所述分析包括：相关法、Pearson相关性、Spearman相关性、卡方、平均数比较(例如，配对T检验、独立T检验、ANOVA)回归分析(例如，简单回归、多元回归、线性回归、非线性回归、逻辑回归、多项式回归、逐步回归、岭回归、套索回归(lasso regression)、弹性网络回归(elasticnet regression))或非参数分析(例如，Wilcoxon秩和检验、Wilcoxon符号秩检验、符号检验)。
33.前述实施方案中任一项的方法，其中所述分析由计算机执行。
34.实施方案33的方法，其中所述分析包括机器学习。
35.前述实施方案中任一项的方法，其中所述生物样品包括静脉血样品。
36.前述实施方案中任一项的方法，其中所述不同的疾病阶段包括疑似、早期、中期和临床晚期中的一个或多个。
37.前述实施方案中任一项的方法，其中施用期间或施用后的时间选自治疗后1、2、3个月或更多个月。
38.前述实施方案中任一项的方法，其中进一步富集样品中来自产生多巴胺的神经元的细胞外囊泡。
39.前述实施方案中任一项的方法，其中富集包括使用一种或多种脑特异性蛋白质标志物。
40.实施方案39的方法，其中所述脑特异性标志物中的至少一种包含K1cam。
41.前述实施方案中任一项的方法，其中分离包括洗涤每个富集样品中的细胞外囊泡以除去表面膜结合蛋白。
42.实施方案41的方法，其中用PBS洗涤细胞外囊泡。
43.前述实施方案中任一项的方法，其中通过凝胶电泳、蛋白质印迹法或荧光技术测量神经退行性病变相关蛋白的形式。
44.前述实施方案中任一项的方法，其中所述受试者为人类。
45.前述实施方案中任一项的方法，其中所述受试者已暴露于怀疑涉及在神经退行性疾病的病因学中(例如，引起神经退行性疾病)的环境条件(例如，暴露于百草枯、怀疑引起帕金森氏病)。
46.前述实施方案中任一项的方法，其中所述生物样品集合包含至少25、50、100、200、500或1000个样品中的任一数量的样品。
47.一种开发推断个体中神经退行性病患的状态的诊断指标的方法，其包括：
a)提供数据集，所述数据集包含针对多名受试者中的每一个的值，所述值指示(1)神经退行性病患的状态，和(2)一组生物标志物的测量值，其中该组生物标志物包括：
(i)多种不同的信号传导激酶；或
(ii)来自选自以下的至少两组的生物标志物：
(1)选自磷酸化信号传导激酶和/或催化酶的一种或多种酶，
(2)单体或寡聚形式的一种或多种神经退行性病变相关蛋白，和
(3)一种或多种miRNA；和
b)对数据集进行分析以开发推断个体中神经退行性病患的状态的模型。
48.实施方案47的方法，其中所述分析由计算机进行。
49.实施方案47的方法，其中所述分析不由计算机进行。
50.实施方案47的方法，其中所述分析包括：相关法、Pearson相关性、Spearman相关性、卡方、平均数比较(例如，配对T检验、独立T检验、ANOVA)回归分析(例如，简单回归、多元回归、线性回归、非线性回归、逻辑回归、多项式回归、逐步回归、岭回归、套索回归(lassoregression)、弹性网络回归(elasticnet regression))或非参数分析(例如，Wilcoxon秩和检验、Wilcoxon符号秩检验、符号检验)。
51.实施方案47的方法，其中所述分析包括将所述数据集接收到计算机存储器中，以及用计算机处理器在所述数据集上训练机器学习算法。
52.实施方案51的方法，其中所述机器学习算法选自：人工神经网络(例如，反向传播网络)、决策树(例如，递归划分过程，CART)、随机森林、判别分析(例如，Bayesian分类器或Fischer分析)、线性分类器(例如，多元线性回归(MLR)、偏最小二乘(PLS)回归、主成分回归(PCR))、混合或随机效应模型、非参数分类器(例如，k-最近邻)、支持向量机和集成方法(例如，袋装法、提升法)。
53.实施方案47的方法，其中所述状态选自神经退行性病患的诊断、阶段、预后或进展。
54.实施方案47的方法，其中所述状态以类别变量(例如，二元状态或多个类别状态之一)度量。
55.实施方案54的方法，其中所述类别包括与患有神经退行性病患一致(例如，阳性或诊断为患有)和与患有神经退行性病患不一致(例如，阴性或诊断为不患有)的诊断。
56.实施方案54的方法，其中所述类别包括神经退行性病患的不同阶段。
57.实施方案47的方法，其中所述状态以连续变量(例如，在量表上)度量。
58.实施方案57的方法，其中所述连续变量为神经退行性病患的范围或程度。
59.实施方案47的方法，其中所述受试者为动物，例如鱼、禽类、两栖动物、爬行动物或哺乳动物，例如啮齿类动物、灵长类动物或人类。
60.实施方案47的方法，其中所述多名受试者为至少10、25、50、100、200、400或800名中的任一数量的受试者。
61.实施方案47的方法，其中对于每名受试者，在第一时间点采集对其确定定量测量值的样品并在后来的第二时间点确定神经退行性病患的状态。
62.实施方案47的方法，其中所述生物样品包括血液或血液级分(例如，血浆或血清)。
63.实施方案47的方法，其中所述神经退行性病患为突触核蛋白病，例如帕金森氏病或路易体痴呆。
64.实施方案47的方法，其中所述神经退行性病患为淀粉样蛋白病，例如阿尔茨海默氏病、tau蛋白病，例如阿尔茨海默氏病或亨廷顿病。
65.实施方案47-64中任一项的方法，其中所述多名受试者为至少25、50、100、200、500或1000名受试者中的任一数量的受试者。
66.一种推断以神经退行性病变相关蛋白为特征的神经退行性病患的发生风险、诊断、阶段、预后或进展的方法，其中所述方法包括：
a)从来自受试者的富集了神经元来源的细胞外囊泡(例如，微囊泡或外泌体)的生物样品测量一组生物标志物以创建数据集，其中该组生物标志物包括：
(i)多种不同的信号传导激酶；或
(ii)来自选自以下的至少两组的生物标志物：
(1)选自磷酸化信号传导激酶和/或催化酶的一种或多种酶，
(2)单体或寡聚形式的一种或多种神经退行性病变相关蛋白，和
(3)一种或多种miRNA；和
b)在所述数据集上执行模型，例如实施方案47的模型，以推断神经退行性病患的发生风险、诊断、阶段、预后或进展。
67.实施方案66的方法，其中所述信号传导激酶中的至少一种为PI3K-Akt-mTOR信号传导通路的激酶。
68.实施方案66的方法，其中所述信号传导激酶中的至少一种选自丝裂原激活蛋白激酶(MAPK或MEK)、细胞外信号调节激酶(ERK)、糖原合成酶激酶3β(GSK3B)、AKT激酶和beclin。
69.实施方案66的方法，其中所述神经退行性病变相关蛋白选自α突触核蛋白、淀粉样蛋白β、tau或亨廷顿蛋白。
70.实施方案66的方法，其中所述神经退行性病变相关蛋白的寡聚形式为寡聚形式例如α突触核蛋白的寡聚体的集合，例如α突触核蛋白2-50，例如α突触核蛋白4-30，例如α突触核蛋白4-20。
71.实施方案66的方法，其中所述寡聚形式中的至少一种包含神经退行性病变相关蛋白的物种的集合。
72.实施方案66的方法，其中所述模型包括将神经退行性病变相关蛋白的寡聚形式对单体形式的相对量与统计学显著性数量的对照个体中的相对量进行比较。
73.实施方案66的方法，其中所述模型包括检测多种寡聚形式的相对量的模式，从该模型进行所述推断。
74.实施方案66的方法，其中所述受试者无神经退行性病患的症状或处于临床前神经退行性病患阶段。
75.实施方案66的方法，其中所述受试者在例行办公室就诊期间或作为医疗护理专业人员的普通医学实践的一部分出现在医疗保健提供者如医疗护理专业人员面前。
76.实施方案66的方法，其中所述模型由计算机执行。
77.实施方案66的方法，其中所述模型不由计算机执行。
78.一种用于确定治疗性干预在治疗神经退行性病患中的有效性的方法，其中所述方法包括：
(a)通过以下做法推断包含多名受试者的群体中的每名受试者中神经退行性病患的初始状态：
(1)从来自受试者的富集了神经元来源的细胞外囊泡(例如，微囊泡或外泌体)的生物样品测量一组生物标志物以创建数据集，其中该组生物标志物包括：
(i)多种不同的信号传导激酶；或
(ii)来自选自以下的至少两组的生物标志物：
(A)选自磷酸化信号传导激酶和/或催化酶的一种或多种酶，
(B)单体或寡聚形式的一种或多种神经退行性病变相关蛋白，和
(C)一种或多种miRNA；和
(2)使用模型推断初始状态，例如实施方案47的模型；
(b)推断后，向受试者施用治疗性干预；
(c)施用后，通过以下做法推断群体中的每名受试者个体中神经退行性病患的后续状态：
(1)从来自受试者的富集了神经元来源的细胞外囊泡(例如，微囊泡或外泌体)的生物样品测量一组生物标志物以创建数据集，其中该组生物标志物包括：
(i)多种不同的信号传导激酶；或
(ii)来自选自以下的至少两组的生物标志物：
(1)选自磷酸化信号传导激酶和/或催化酶的一种或多种酶，
(2)单体或寡聚形式的一种或多种神经退行性病变相关蛋白，和
(3)一种或多种miRNA；和
(2)使用模型推断后续状态；和
(d)基于群体中的初始和后续推断结果，如果后续推断结果与初始推断结果相比表现出朝向正常状态的统计学显著性变化，则确定该治疗性干预是有效的，或者如果后续推断结果与初始推断结果相比没有表现出朝向正常状态的统计学显著性变化，则确定该治疗性干预是无效的。
79.实施方案78的方法，其中所述治疗性干预包括施用药物或药物的组合。
80.实施方案78的方法，其中所述群体包含至少20、至少50、至少100、至少200、至少500或至少1000名受试者，其中至少20％、至少35％、至少50％或至少75％的受试者最初具有相对于蛋白质的单体形式的量升高的蛋白质的寡聚形式的量。
81.实施方案78的方法，其中至少20％、至少25％、至少30％、或至少35％、至少50％、至少66％、至少80％、或100％的受试者最初被诊断为神经退行性病患。
82.实施方案78的方法，其中所述推断由计算机做出。
83.实施方案78的方法，其中所述推断不由计算机做出。
84.一种使受试者有资格参加用于治疗或预防神经退行性病患的治疗性干预的临床试验的方法，其包括：
a)通过以下做法确定受试者在神经退行性病患方面存在异常：
(1)从来自受试者的富集了神经元来源的细胞外囊泡(例如，微囊泡或外泌体)的生物样品测量一组生物标志物以创建数据集，其中该组生物标志物包括：
(i)多种不同的信号传导激酶；或
(ii)来自选自以下的至少两组的生物标志物：
(A)选自磷酸化信号传导激酶和/或催化酶的一种或多种酶，
(B)单体或寡聚形式的一种或多种神经退行性病变相关蛋白，和
(C)一种或多种miRNA；和
(2)对所述谱执行模型，例如实施方案47的模型，以推断受试者在神经退行性病患方面存在异常；和
b)将受试者入组到针对所述神经退行性病患的潜在治疗性干预的临床试验中。
85.实施方案84的方法，其中所述模型由计算机执行。
86.实施方案84的方法，其中所述模型不由计算机执行。
87.一种监测接受针对神经退行性病患的治疗性干预的受试者的进展的方法，其包括：
(a)通过以下做法推断受试者中神经退行性病患的初始状态：
(1)从来自受试者的富集了神经元来源的细胞外囊泡(例如，微囊泡或外泌体)的生物样品确定一组生物标志物的测量值，其中该组生物标志物包括：
(i)多种不同的信号传导激酶；或
(ii)来自选自以下的至少两组的生物标志物：
(A)选自磷酸化信号传导激酶和/或催化酶的一种或多种酶，
(B)单体或寡聚形式的一种或多种神经退行性病变相关蛋白，和
(C)一种或多种miRNA；和
(2)执行模型，例如实施方案47的模型，以推断神经退行性病患的初始状态；
(b)推断后，向受试者施用治疗性干预；
(c)施用后，通过以下做法推断受试者中神经退行性病患的后续状态：
(1)从来自受试者的富集了神经元来源的微粒体颗粒的生物样品确定包含多种不同的信号传导激酶中的每一种的量的生物标志物谱以创建数据集；和
(2)执行模型，例如实施方案47的模型，以推断神经退行性病患的后续状态；和
(d)基于初始和后续状态推断结果，如果后续推断结果与初始推断结果相比表现出朝向正常状态的变化，则确定受试者对该治疗性干预做出正向反应，或者如果后续推断结果与初始推断结果相比没有表现出朝向正常状态的变化，则确定该治疗性干预是无效的。
88.实施方案87的方法，其中所述模型由计算机执行。
89.实施方案87的方法，其中所述模型不由计算机执行。
90.一种方法，所述方法包括：
(a)通过实施方案66的方法确定受试者患有神经退行性病患，和
(b)向受试者施用有效于治疗所述病患的姑息性或神经保护性治疗性干预。
91.实施方案90的方法，其中所述治疗性干预将受试者的生物标志物谱朝向正常移动，其中朝向正常的移动指示神经保护。
92.一种方法，其包括向通过实施方案66的方法确定具有异常生物标志物模式的受试者施用有效于治疗所述病患的姑息性或神经保护性治疗性干预。
93.实施方案92的方法，其中所述受试者无神经退行性病患的症状或处于临床前神经退行性病患阶段。
94.一种试剂盒，其包含足以检测以下中的任一者的试剂：
(1)至少一种信号传导激酶和神经退行性病变相关蛋白的至少一种寡聚形式；或
(2)多种不同的信号传导激酶。
95.实施方案94的试剂盒，其中所述试剂包含抗体。
96.一种推断神经退行性病患的发生风险、诊断、阶段、预后或进展的方法，其中所述方法包括：
a)从来自受试者的富集了神经元来源的细胞外囊泡(例如，微囊泡或外泌体)的生物样品测量一组生物标志物以创建数据集，其中该组生物标志物包括：
(i)多种不同的信号传导激酶；或
(ii)来自选自以下的至少两组的生物标志物：
(A)选自磷酸化信号传导激酶和/或催化酶的一种或多种酶，
(B)单体或寡聚形式的一种或多种神经退行性病变相关蛋白，和
(C)一种或多种miRNA；和
b)将所述数据集与神经退行性病患的发生风险、诊断、阶段、预后或进展相关联。
97.一种方法，所述方法包括：
(a)鉴定患有神经退行性病患或可能对针对神经退行性病患的治疗做出正向反应的受试者，其中鉴定包括：
(1)在来自受试者的富集了神经元来源的细胞外囊泡(例如，来自细胞外囊泡的内部内容物)的样品中测量一组生物标志物以创建生物标志物谱，其中该组生物标志物包括：
(i)多种不同的信号传导激酶；或
(ii)来自选自以下的至少两组的生物标志物：
(A)选自磷酸化信号传导激酶和/或催化酶的一种或多种酶，
(B)单体或寡聚形式的一种或多种神经退行性病变相关蛋白，和
(C)一种或多种miRNA；和
(2)基于异常的生物标志物谱确定受试者罹患神经退行性病患；和
(b)向所鉴定的受试者施用有效量的药物组合物以治疗神经退行性病患。
98.实施方案97的方法，其中所述神经退行性病患为突触核蛋白病性病患，并且药物组合物包含多巴胺激动剂(例如，普拉克索(例如，MirapexTM)、罗匹尼罗(例如，Requip)、罗替戈汀(例如，Neupro)、阿扑吗啡(例如，Apokyn))、左旋多巴、卡比多巴-左旋多巴(例如，Rytary、Sinemet)、MAO-B抑制剂(例如，司来吉兰(例如，Eldepryl、Zelapar)或雷沙吉兰(例如，Azilect))、邻苯二酚-O-甲基转移酶(COMT)抑制剂(例如，恩他卡朋(Comtan)或托卡朋(Tasmar))、抗胆碱能剂(例如，苯扎托品(例如，Cogentin)或苯海索)、金刚烷胺或胆碱酯酶抑制剂(例如，利斯的明(Exelon))。
99.实施方案97的方法，其中所述突触核蛋白病性病患为帕金森氏病。
100.实施方案99的方法，其中所述药物组合物包含多巴胺激动剂。
101.实施方案100的方法，其中所述药物组合物还包含NK1-拮抗剂。
102.实施方案101的方法，其中所述多巴胺激动剂为6-丙基氨基-4,5,6,7-四氢-1,3-苯并噻唑-2-胺并且所述NK1-拮抗剂为阿瑞吡坦或罗拉吡坦。
103.实施方案100的方法，其中所述药物组合物还包含5HT3-拮抗剂。
104.实施方案103的方法，其中所述多巴胺激动剂为6-丙基氨基-4,5,6,7-四氢-1,3-苯并噻唑-2-胺并且所述5HT3拮抗剂为昂丹司琼盐酸盐二水合物。
105.一种方法，其包括向特征在于具有指示神经退行性病患或可能对针对神经退行性病患的治疗做出正向反应的生物标志物谱的受试者施用有效量的药物组合物来治疗神经退行性病患；其中所述生物标志物组包含一组生物标志物，该组生物标志物包括从来自受试者的富集了神经元来源的细胞外囊泡(例如，来自细胞外囊泡的内部内容物)的样品测量的一种或多种信号传导激酶和任选地神经退行性病变相关蛋白的至少一种寡聚形式。
106.实施方案105的方法，其中所述神经退行性病患为帕金森氏病，并且其中所述药物组合物包含多巴胺激动剂。
107.一种试剂盒，其包含足以检测以下中的任一者的试剂：
(1)至少一种信号传导激酶，
(2)至少一种催化酶，
(3)神经退行性病变相关蛋白的至少一种寡聚形式，和
(4)至少一种miRNA。
108.一种方法，所述方法包括：
在包含至少一个处理器和储存至少一个由所述至少一个处理器执行的程序的存储器的计算机系统处：
a)从来自至少25、50、100、200、500或1000名受试者中的每一个的生物样品获得多个生物标志物的电子形式的生物标志物数据，其中：
(i)所述受试者包括(i)经诊断患有处于一个或多个不同疾病阶段中的每一个阶段的神经退行性病患的多名受试者，其中每名经诊断的受试者已经接受推定的神经保护剂，和(ii)未经诊断患有神经退行性病患的多名对照受试者；
(ii)对样品富集神经元来源的外泌体；和
(iii)生物标志物数据包括以下的测量值：
(i)多种不同的信号传导激酶；或
(ii)来自选自以下的至少两组的生物标志物：
(1)选自磷酸化信号传导激酶和/或催化酶的一种或多种酶，
(2)单体或寡聚形式的一种或多种神经退行性病变相关蛋白，和
(3)一种或多种miRNA；
b)使用计算机逻辑执行学习算法以产生模型，所述模型：
(i)预测个体受试者中随着时间的疾病进展速率或对推定的神经保护剂的反应程度；或者
(ii)在不同的受试者之间(1)做出致病性诊断，(2)区分临床上相似但病因上不同的神经退行性病症亚组，或(3)预测受试者是否可能对推定的神经保护剂做出反应或受试者可能对推定的神经保护剂做出反应的程度。
109.一种方法，所述方法包括：
在包含至少一个处理器和储存至少一个由所述至少一个处理器执行的程序的存储器的计算机系统处：
a)从来自受试者的生物样品获得多个生物标志物的电子形式的生物标志物数据，其中：
(i)对样品富集神经元来源的外泌体；和
(ii)生物标志物数据包括以下的测量值：
(i)多种不同的信号传导激酶；或
(ii)来自选自以下的至少两组的生物标志物：
(1)选自磷酸化信号传导激酶和/或催化酶的一种或多种酶，
(2)单体或寡聚形式的一种或多种神经退行性病变相关蛋白，和
(3)一种或多种miRNA；
b)使用计算机逻辑执行模型，所述模型：
(i)预测个体受试者中随着时间的疾病进展速率或对推定的神经保护剂的反应程度；或者
(ii)在不同的受试者之间(1)做出致病性诊断，(2)区分临床上相似但病因上不同的神经退行性病症亚组，或(3)预测受试者是否可能对推定的神经保护剂做出反应或受试者可能对推定的神经保护剂做出反应的程度；和
c)将所述预测输出到受试者可访问的电子设备。
如本文所用，除非另有说明，否则适用以下含义。词语“可以”和“可”是在允许的意义上(即，意味着有可能)使用，而不是在强制的意义上(即，意味着必须)使用。词语“包括(include/including/includes)”等意味着包括但不限于。单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指称。因此，例如，对“一个要素”的提及包括两个或更多个要素的组合，尽管使用其他术语和表述来表示一个或多个要素，如“一个或多个”。表述“至少一个”包括“一个”、“一个或多个”、“一个或复数个”，并因此涵盖术语“复数个”的使用。除非另有说明，否则术语“或”是非排他性的，即涵盖“和”和“或”两者。修饰语和序列之间的术语“……中的任一个(any of)”意味着该修饰语修饰序列的每个成员。因此，例如，表述“至少1、2或3中的任一个”表示“至少1、至少2或至少3”。术语“约”是指在特定用途的上下文中所陈述的数值加减5％的范围。术语“基本上由……组成”是指包括所记述的要素和不会实质性地影响所要求保护的组合的基本和新颖特征的其他要素。
应理解，说明书和附图并不旨在将本发明限制于所公开的特定形式，相反，意图在于覆盖落入如所附权利要求所限定的本发明的精神和范围内的所有修改、等同物和替代物。鉴于本说明书，本发明的各种方面的进一步修改和替代实施方案对于本领域技术人员将是显而易见的。相应地，本说明书和附图仅被解释为说明性的并且用于教导本领域技术人员实现本发明的一般方式的目的。应理解，本文示出和描述的本发明的形式应被视为实施方案的实例。要素和材料可以替代本文示意和描述的那些，部件和过程可以颠倒或省略，并且本发明的某些特征可以独立地利用，在得益于本发明的描述之后，所有这些对于本领域技术人员来说都将是显而易见的。在不脱离如所附权利要求中所描述的本发明的精神和范围的情况下，可以对本文描述的要素进行改变。
本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请都通过引用并入本文，其引用的程度犹如每个个别出版物、专利或专利申请被具体地和单独地指出通过引用并入。
Claims (109)
1.一种创建神经退行性病患的诊断指标的方法，所述方法包括：
a)富集生物样品集合中的每个生物样品的神经元来源的细胞外囊泡，例如微囊泡或外泌体，其中所述生物样品集合来自受试者队列中的受试者，其中所述队列包含的受试者包括：
(i)经诊断患有处于一个或多个不同疾病阶段中的每一个阶段的神经退行性病患的多名受试者，其中每名经诊断的受试者已经接受推定的神经保护剂，和/或
(ii)未经诊断患有神经退行性病患的多名对照受试者，
其中在治疗之前收集所述生物样品并在治疗过程期间一次或多次再次收集所述生物样品，以及任选地在用推定的神经保护剂治疗的过程之后收集所述生物样品；
b)从来自每个样品的整个细胞外囊泡、细胞外囊泡的内部区室或细胞外囊泡膜分离蛋白质内容物以产生多个生物标志物样品；
c)在每个生物标志物样品中测量一组生物标志物以创建数据集，其中该组生物标志物包括：
(i)多种不同的信号传导激酶；或
(ii)来自选自以下的至少两组的生物标志物：
(1)选自磷酸化信号传导激酶和/或催化酶的一种或多种酶，
(2)单体或寡聚形式的一种或多种神经退行性病变相关蛋白，和
(3)一种或多种miRNA；和
d)对所述数据集进行分析以比较：
(i)个体受试者中所述生物标志物组随时间的差异以确定诊断算法，所述诊断算法预测疾病进展的速率或对所述推定的神经保护剂的反应程度；或者
(ii)不同受试者之间所述生物标志物组的差异以确定诊断算法，所述诊断算法(1)做出致病性诊断，(2)区分临床上相似但病因上不同的神经退行性病症亚组，或(3)预测受试者是否可能对所述推定的神经保护剂做出反应或受试者可能对所述推定的神经保护剂做出反应的程度。
2.权利要求1所述的方法，所述方法在富集之前还包括：
I)提供受试者的队列，其中所述队列包含的受试者包括：(i)经诊断患有处于多个不同疾病阶段中的每一个阶段的神经退行性病患的多名受试者，和/或(ii)多名对照受试者；
II)向每名经诊断的受试者施用推定的神经保护剂；
III)在施用所述推定的神经保护剂之前、在施用所述推定的神经保护剂期间一次或多次再次以及任选地在施用所述推定的神经保护剂之后从所述队列中的每名受试者收集生物样品。
3.前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括：
e)针对标准临床测量值验证一种或多种所述诊断算法。
4.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述生物标志物包括(1)一种或多种磷酸化信号传导激酶和/或催化酶，一种或多种(2)单体或寡聚形式的一种或多种神经退行性病变相关蛋白，和(3)一种或多种miRNA。
5.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述酶包括一种或多种信号传导激酶。
6.权利要求5所述的方法，其中所述信号传导激酶中的至少一种为PI3K-Akt-mTOR信号传导通路的激酶。
7.权利要求5所述的方法，其中所述信号传导激酶中的至少一种选自丝裂原激活蛋白激酶(MAPK或MEK)、细胞外信号调节激酶(ERK)、糖原合成酶激酶3β(GSK3B)、AKT激酶和beclin。
8.权利要求5所述的方法，其中所述至少一种信号传导激酶为多种信号传导激酶。
9.权利要求8所述的方法，其中所述多种信号传导激酶选自AKT、MAPK3、MEK、mTOR、GSK3B、JNK、MEK 1/2和PI3K。
10.权利要求8所述的方法，其中所述多种信号传导激酶包括磷酸化AKT(例如，AKTS473或AKT T308)和磷酸化MAPK3(例如，MAPK T202)。
11.权利要求5所述的方法，其中所述信号传导激酶中的至少一种选自AKT S473；AKTT308；ERK P44；GSK3B S6；GSK3B S9；GSK3T216；GSK3A S21；MAPK T202；mTOR S2448；mTORc1/2T246；mTOR c1/2S638；JNK 1/2/3；JNK pY183；JNK pY185；MEK 1/2 S217；MEK S221；PI3K p85；PI3K T458；PKB S473；PI3K p55-T199；和PKB T308。
12.权利要求8所述的方法，其中所述诊断算法确定AKT:MAPK的相对量。
13.权利要求1所述的方法，其中至少一种催化酶选自总TH(酪氨酸羟化酶)和磷酸化形式，TH S40、TH S19和TH S32。
14.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述诊断算法为一种或多种信号传导激酶、一种或多种催化酶、一种或多种神经退行性病变相关蛋白形式和一种或多种microRNA的测量值的函数。
15.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述诊断算法为AKT、磷酸化酪氨酸羟化酶、miRNA、MAPK3和非磷酸化酪氨酸羟化酶的测量值的函数。
16.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述诊断算法为(AKT、磷酸化酪氨酸羟化酶、miRNA)对(MAPK3和非磷酸化酪氨酸羟化酶)的测量值的函数。
17.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述诊断算法为至少一种神经退行性病变相关蛋白形式的函数。
18.权利要求17所述的方法，其中确定其定量测量值的神经退行性病变相关蛋白形式选自：
(I)至少一种寡聚形式；
(II)多种寡聚形式；
(III)至少一种寡聚形式和至少一种单体形式；
(IV)多种寡聚形式和至少一种单体形式；
(V)至少一种寡聚形式和多种单体形式；和
(VI)多种寡聚形式和多种单体形式。
19.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述诊断算法为(AKT的磷酸化形式、第二信号传导激酶的磷酸化形式、α-突触核蛋白的寡聚形式、miRNA)对(MAPK3的磷酸化形式、第四信号传导激酶的磷酸化形式、酪氨酸羟化酶的非磷酸化形式)的相对测量值的函数。
20.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述诊断算法为AKT、磷酸化酪氨酸羟化酶、神经退行性病变相关蛋白形式、MAPK3和非磷酸化酪氨酸羟化酶的测量值的函数。
21.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述诊断算法为(AKT、磷酸化酪氨酸羟化酶、神经退行性病变相关蛋白形式)对(MAPK3和肺磷酸化酪氨酸羟化酶)的相对测量值的函数。
22.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述诊断算法为一种或多种神经退行性病变相关蛋白形式和一种或多种miRNA的函数。
23.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述生物标志物包含(i)选自信号传导激酶和催化酶的酶，和(ii)选自单体和寡聚体的神经退行性病变相关蛋白。
24.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述生物标志物包含(i)选自信号传导激酶和催化酶的酶，和(iii)miRNA。
25.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述神经退行性病变相关蛋白选自α突触核蛋白、淀粉样蛋白β、tau或亨廷顿蛋白。
26.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述神经退行性病变相关蛋白的寡聚形式为寡聚形式的集合，所述寡聚形式例如α突触核蛋白的寡聚体，例如α突触核蛋白2-50，例如α突触核蛋白4-30，例如α突触核蛋白4-20。
27.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述生物标志物包含选自以下的一种或多种miRNA：7-5p；15b-5p；19b；22-3p；24；27a-3p24；29a；30c-2-3p；494-3p；92b-3p；106b-3p；122-5p；124-3p；122-5p；132-3p；138-5p；142-3p；146a-5p；204-5p；220-3p；331-5p；338-3p；431-5p；584-5p；942-5p；和1468-5p。
28.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述神经退行性病患包括突触核蛋白病性病症，例如帕金森氏病或路易体痴呆。
29.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述神经退行性病患包括淀粉样蛋白病，例如阿尔茨海默氏病、tau蛋白病，例如阿尔茨海默氏病或亨廷顿病。
30.前述权利要求中任一项所述的方法，其中从所述微粒体的内部区室分离出蛋白质内容物。
31.权利要求3所述的方法，其中所述标准临床测量值选自UPDRS分数、CGI分数和放射学结果。
32.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述分析包括：相关法、Pearson相关性、Spearman相关性、卡方、平均数比较(例如，配对T检验、独立T检验、ANOVA)回归分析(例如，简单回归、多元回归、线性回归、非线性回归、逻辑回归、多项式回归、逐步回归、岭回归、套索回归(lasso regression)、弹性网络回归(elasticnet regression))或非参数分析(例如，Wilcoxon秩和检验、Wilcoxon符号秩检验、符号检验)。
33.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述分析由计算机执行。
34.权利要求33所述的方法，其中所述分析包括机器学习。
35.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述生物样品包括静脉血样品。
36.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述不同的疾病阶段包括疑似、早期、中期和临床晚期中的一个或多个。
37.前述权利要求中任一项所述的方法，其中施用期间或施用后的所述时间选自治疗后1、2、3个月或更多个月。
38.前述权利要求中任一项所述的方法，其中进一步富集样品中来自产生多巴胺的神经元的细胞外囊泡。
39.前述权利要求中任一项所述的方法，其中富集包括使用一种或多种脑特异性蛋白质标志物。
40.权利要求39所述的方法，其中所述脑特异性标志物中的至少一种包含K1cam。
41.前述权利要求中任一项所述的方法，其中分离包括洗涤每个富集样品中的所述细胞外囊泡以除去表面膜结合蛋白。
42.权利要求41所述的方法，其中用PBS洗涤所述细胞外囊泡。
43.前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过凝胶电泳、蛋白质印迹法或荧光技术测量所述神经退行性病变相关蛋白的形式。
44.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述受试者为人类。
45.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述受试者已暴露于怀疑涉及在神经退行性疾病的病因学中(例如，引起神经退行性疾病)的环境条件(例如，暴露于百草枯、怀疑引起帕金森氏病)。
46.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述生物样品集合包含至少25、50、100、200、500或1000个样品中的任一数量的样品。
47.一种开发推断个体中神经退行性病患的状态的诊断指标的方法，所述方法包括：
a)提供数据集，所述数据集包含针对多名受试者中的每一个的值，所述值指示(1)神经退行性病患的状态，和(2)一组生物标志物的测量值，其中该组生物标志物包括：
(i)多种不同的信号传导激酶；或
(ii)来自选自以下的至少两组的生物标志物：
(1)选自磷酸化信号传导激酶和/或催化酶的一种或多种酶，
(2)单体或寡聚形式的一种或多种神经退行性病变相关蛋白，和
(3)一种或多种miRNA；和
b)对所述数据集进行分析以开发推断个体中神经退行性病患的状态的模型。
48.权利要求47所述的方法，其中所述分析由计算机进行。
49.权利要求47所述的方法，其中所述分析不由计算机进行。
50.权利要求47所述的方法，其中所述分析包括：相关法、Pearson相关性、Spearman相关性、卡方、平均数比较(例如，配对T检验、独立T检验、ANOVA)回归分析(例如，简单回归、多元回归、线性回归、非线性回归、逻辑回归、多项式回归、逐步回归、岭回归、套索回归(lassoregression)、弹性网络回归(elasticnet regression))或非参数分析(例如，Wilcoxon秩和检验、Wilcoxon符号秩检验、符号检验)。
51.权利要求47所述的方法，其中所述分析包括将所述数据集接收到计算机存储器中，以及用计算机处理器在所述数据集上训练机器学习算法。
52.权利要求51所述的方法，其中所述机器学习算法选自：人工神经网络(例如，反向传播网络)、决策树(例如，递归划分过程，CART)、随机森林、判别分析(例如，Bayesian分类器或Fischer分析)、线性分类器(例如，多元线性回归(MLR)、偏最小二乘(PLS)回归、主成分回归(PCR))、混合或随机效应模型、非参数分类器(例如，k-最近邻)、支持向量机和集成方法(例如，袋装法、提升法)。
53.权利要求47所述的方法，其中所述状态选自所述神经退行性病患的诊断、阶段、预后或进展。
54.权利要求47所述的方法，其中所述状态以类别变量(例如，二元状态或多个类别状态之一)度量。
55.权利要求54所述的方法，其中所述类别包括与患有所述神经退行性病患一致(例如，阳性或诊断为患有)和与患有所述神经退行性病患不一致(例如，阴性或诊断为不患有)的诊断。
56.权利要求54所述的方法，其中所述类别包括所述神经退行性病患的不同阶段。
57.权利要求47所述的方法，其中所述状态以连续变量(例如，在量表上)度量。
58.权利要求57所述的方法，其中所述连续变量为所述神经退行性病患的范围或程度。
59.权利要求47所述的方法，其中所述受试者为动物，例如鱼、禽类、两栖动物、爬行动物或哺乳动物，例如啮齿类动物、灵长类动物或人类。
60.权利要求47所述的方法，其中所述多名受试者为至少10、25、50、100、200、400或800名中的任一数量的受试者。
61.权利要求47所述的方法，其中对于每名受试者，在第一时间点采集对其确定定量测量值的样品并在后来的第二时间点确定所述神经退行性病患的状态。
62.权利要求47所述的方法，其中所述生物样品包括血液或血液级分(例如，血浆或血清)。
63.权利要求47所述的方法，其中所述神经退行性病患为突触核蛋白病，例如帕金森氏病或路易体痴呆。
64.权利要求47所述的方法，其中所述神经退行性病患为淀粉样蛋白病，例如阿尔茨海默氏病、tau蛋白病，例如阿尔茨海默氏病或亨廷顿病。
65.权利要求47-64中任一项所述的方法，其中所述多名受试者为至少25、50、100、200、500或1000名受试者中的任一数量的受试者。
66.一种推断以神经退行性病变相关蛋白为特征的神经退行性病患的发展风险、诊断、阶段、预后或进展的方法，其中所述方法包括：
a)从来自受试者的富集了神经元来源的细胞外囊泡(例如，微囊泡或外泌体)的生物样品测量一组生物标志物以创建数据集，其中该组生物标志物包括：
(i)多种不同的信号传导激酶；或
(ii)来自选自以下的至少两组的生物标志物：
(1)选自磷酸化信号传导激酶和/或催化酶的一种或多种酶，
(2)单体或寡聚形式的一种或多种神经退行性病变相关蛋白，和
(3)一种或多种miRNA；和
b)在所述数据集上执行模型，例如权利要求47所述的模型，以推断所述神经退行性病患的发展风险、诊断、阶段、预后或进展。
67.权利要求66所述的方法，其中所述信号传导激酶中的至少一种为PI3K-Akt-mTOR信号传导通路的激酶。
68.权利要求66所述的方法，其中所述信号传导激酶中的至少一种选自丝裂原激活蛋白激酶(MAPK或MEK)、细胞外信号调节激酶(ERK)、糖原合成酶激酶3β(GSK3B)、AKT激酶和beclin。
69.权利要求66所述的方法，其中所述神经退行性病变相关蛋白选自α突触核蛋白、淀粉样蛋白β、tau或亨廷顿蛋白。
70.权利要求66所述的方法，其中所述神经退行性病变相关蛋白的寡聚形式为寡聚形式的集合，例如α突触核蛋白的寡聚体，例如α突触核蛋白2-50，例如α突触核蛋白4-30，例如α突触核蛋白4-20。
71.权利要求66所述的方法，其中所述寡聚形式中的至少一种包含所述神经退行性病变相关蛋白的物种的集合。
72.权利要求66所述的方法，其中所述模型包括将所述神经退行性病变相关蛋白的寡聚形式对单体形式的相对量与统计学显著性数量的对照个体中的相对量进行比较。
73.权利要求66所述的方法，其中所述模型包括检测多种所述寡聚形式的相对量的模式，从所述模型进行所述推断。
74.权利要求66所述的方法，其中所述受试者无神经退行性病患的症状或处于临床前神经退行性病患阶段。
75.权利要求66所述的方法，其中所述受试者在例行办公室就诊期间或作为医疗护理专业人员的普通医学实践的一部分出现在医疗保健提供者如医疗护理专业人员面前。
76.权利要求66所述的方法，其中所述模型由计算机执行。
77.权利要求66所述的方法，其中所述模型不由计算机执行。
78.一种用于确定治疗性干预在治疗神经退行性病患中的有效性的方法，其中所述方法包括：
(a)通过以下做法推断包含多名受试者的群体中的每名受试者中神经退行性病患的初始状态：
(1)从来自受试者的富集了神经元来源的细胞外囊泡(例如，微囊泡或外泌体)的生物样品测量一组生物标志物以创建数据集，其中该组生物标志物包括：
(i)多种不同的信号传导激酶；或
(ii)来自选自以下的至少两组的生物标志物：
(A)选自磷酸化信号传导激酶和/或催化酶的一种或多种酶，
(B)单体或寡聚形式的一种或多种神经退行性病变相关蛋白，和
(C)一种或多种miRNA；和
(2)使用模型，例如权利要求47所述的模型，推断所述初始状态；
(b)推断后，向所述受试者施用所述治疗性干预；
(c)施用后，通过以下做法推断所述群体中的每名受试者个体中所述神经退行性病患的后续状态：
(1)从来自受试者的富集了神经元来源的细胞外囊泡(例如，微囊泡或外泌体)的生物样品测量一组生物标志物以创建数据集，其中该组生物标志物包括：
(i)多种不同的信号传导激酶；或
(ii)来自选自以下的至少两组的生物标志物：
(1)选自磷酸化信号传导激酶和/或催化酶的一种或多种酶，
(2)单体或寡聚形式的一种或多种神经退行性病变相关蛋白，和
(3)一种或多种miRNA；和
(2)使用所述模型推断所述后续状态；和
(d)基于所述群体中的所述初始和后续推断结果，如果所述后续推断结果与所述初始推断结果相比表现出朝向正常状态的统计学显著性变化，则确定所述治疗性干预是有效的，或者如果所述后续推断结果与所述初始推断结果相比没有表现出朝向正常状态的统计学显著性变化，则确定所述治疗性干预是无效的。
79.权利要求78所述的方法，其中所述治疗性干预包括施用药物或药物的组合。
80.权利要求78所述的方法，其中所述群体包含至少20、至少50、至少100、至少200、至少500或至少1000名受试者，其中至少20％、至少35％、至少50％或至少75％的所述受试者最初具有相对于所述蛋白质的单体形式的量升高的所述蛋白质的寡聚形式的量。
81.权利要求78所述的方法，其中至少20％、至少25％、至少30％、或至少35％、至少50％、至少66％、至少80％、或100％的所述受试者最初被诊断为神经退行性病患。
82.权利要求78所述的方法，其中所述推断由计算机做出。
83.权利要求78所述的方法，其中所述推断不由计算机做出。
84.一种使受试者有资格参加用于治疗或预防神经退行性病患的治疗性干预的临床试验的方法，所述方法包括：
a)通过以下做法确定受试者在神经退行性病患方面存在异常：
(1)从来自受试者的富集了神经元来源的细胞外囊泡(例如，微囊泡或外泌体)的生物样品测量一组生物标志物以创建数据集，其中该组生物标志物包括：
(i)多种不同的信号传导激酶；或
(ii)来自选自以下的至少两组的生物标志物：
(A)选自磷酸化信号传导激酶和/或催化酶的一种或多种酶，
(B)单体或寡聚形式的一种或多种神经退行性病变相关蛋白，和
(C)一种或多种miRNA；和
(2)对谱(profile)执行模型，例如权利要求47所述的模型，以推断所述受试者在所述神经退行性病患方面存在异常；和
b)将所述受试者入组到针对所述神经退行性病患的潜在治疗性干预的临床试验中。
85.权利要求84所述的方法，其中所述模型由计算机执行。
86.权利要求84所述的方法，其中所述模型不由计算机执行。
87.一种监测接受针对神经退行性病患的治疗性干预的受试者的进展的方法，所述方法包括：
(a)通过以下做法推断所述受试者中神经退行性病患的初始状态：
(1)从来自受试者的富集了神经元来源的细胞外囊泡(例如，微囊泡或外泌体)的生物样品确定一组生物标志物的测量值，其中该组生物标志物包括：
(i)多种不同的信号传导激酶；或
(ii)来自选自以下的至少两组的生物标志物：
(A)选自磷酸化信号传导激酶和/或催化酶的一种或多种酶，
(B)单体或寡聚形式的一种或多种神经退行性病变相关蛋白，和
(C)一种或多种miRNA；和
(2)执行模型，例如权利要求47所述的模型，以推断所述神经退行性病患的初始状态；
(b)推断后，向所述受试者施用所述治疗性干预；
(c)施用后，通过以下做法推断所述受试者中所述神经退行性病患的后续状态：
(1)从来自受试者的富集了神经元来源的微粒体颗粒的生物样品确定包含多种不同的信号传导激酶中的每一种的量的生物标志物谱(profile)以创建数据集；和
(2)执行模型，例如权利要求47所述的模型，以推断所述神经退行性病患的后续状态；和
(d)基于所述初始和后续状态推断结果，如果所述后续推断结果与所述初始推断结果相比表现出朝向正常状态的变化，则确定所述受试者对所述治疗性干预做出正向反应，或者如果所述后续推断结果与所述初始推断结果相比没有表现出朝向正常状态的变化，则确定所述治疗性干预是无效的。
88.权利要求87所述的方法，其中所述模型由计算机执行。
89.权利要求87所述的方法，其中所述模型不由计算机执行。
90.一种方法，所述方法包括：
(a)通过权利要求66所述的方法确定受试者患有神经退行性病患，和
(b)向所述受试者施用有效于治疗所述病患的姑息性或神经保护性治疗性干预。
91.权利要求90所述的方法，其中所述治疗性干预将所述受试者的生物标志物谱朝向正常移动，其中朝向正常的移动指示神经保护。
92.一种方法，所述方法包括向通过权利要求66所述的方法确定具有异常生物标志物模式的受试者施用有效于治疗所述病患的姑息性或神经保护性治疗性干预。
93.权利要求92所述的方法，其中所述受试者无所述神经退行性病患的症状或处于临床前神经退行性病患阶段。
94.一种试剂盒，所述试剂盒包含足以检测以下中的任一者的试剂：
(1)至少一种信号传导激酶和神经退行性病变相关蛋白的至少一种寡聚形式；或
(2)多种不同的信号传导激酶。
95.权利要求94所述的试剂盒，其中所述试剂包含抗体。
96.一种推断神经退行性病患的发展风险、诊断、阶段、预后或进展的方法，其中所述方法包括：
a)从来自受试者的富集了神经元来源的细胞外囊泡(例如，微囊泡或外泌体)的生物样品测量一组生物标志物以创建数据集，其中该组生物标志物包括：
(i)多种不同的信号传导激酶；或
(ii)来自选自以下的至少两组的生物标志物：
(A)选自磷酸化信号传导激酶和/或催化酶的一种或多种酶，
(B)单体或寡聚形式的一种或多种神经退行性病变相关蛋白，和
(C)一种或多种miRNA；和
b)将所述数据集与所述神经退行性病患的发展风险、诊断、阶段、预后或进展相关联。
97.一种方法，所述方法包括：
(a)鉴定患有神经退行性病患或可能对针对神经退行性病患的治疗做出正向反应的受试者，其中鉴定包括：
(1)在来自所述受试者的富集了神经元来源的细胞外囊泡(例如，来自细胞外囊泡的内部内容物)的样品中测量一组生物标志物以创建生物标志物谱(profile)，其中该组生物标志物包括：
(i)多种不同的信号传导激酶；或
(ii)来自选自以下的至少两组的生物标志物：
(A)选自磷酸化信号传导激酶和/或催化酶的一种或多种酶，
(B)单体或寡聚形式的一种或多种神经退行性病变相关蛋白，和
(C)一种或多种miRNA；和
(2)基于异常的生物标志物谱确定所述受试者罹患所述神经退行性病患；和
(b)向所述经鉴定的受试者施用有效量的药物组合物以治疗所述神经退行性病患。
98.权利要求97所述的方法，其中所述神经退行性病患为突触核蛋白病性病患，并且所述药物组合物包含多巴胺激动剂(例如，普拉克索(例如，MirapexTM)、罗匹尼罗(例如，Requip)、罗替戈汀(例如，Neupro)、阿扑吗啡(例如，Apokyn))、左旋多巴、卡比多巴-左旋多巴(例如，Rytary、Sinemet)、MAO-B抑制剂(例如，司来吉兰(例如，Eldepryl、Zelapar)或雷沙吉兰(例如，Azilect))、邻苯二酚-O-甲基转移酶(COMT)抑制剂(例如，恩他卡朋(Comtan)或托卡朋(Tasmar))、抗胆碱能剂(例如，苯扎托品(例如，Cogentin)或苯海索)、金刚烷胺或胆碱酯酶抑制剂(例如，利斯的明(Exelon))。
99.权利要求97所述的方法，其中所述突触核蛋白病性病患为帕金森氏病。
100.权利要求99所述的方法，其中所述药物组合物包含多巴胺激动剂。
101.权利要求100所述的方法，其中所述药物组合物还包含NK1-拮抗剂。
102.权利要求101所述的方法，其中所述多巴胺激动剂为6-丙基氨基-4,5,6,7-四氢-1,3-苯并噻唑-2-胺并且所述NK1-拮抗剂为阿瑞吡坦或罗拉吡坦。
103.权利要求100所述的方法，其中所述药物组合物还包含5HT3-拮抗剂。
104.权利要求103所述的方法，其中所述多巴胺激动剂为6-丙基氨基-4,5,6,7-四氢-1,3-苯并噻唑-2-胺并且所述5HT3拮抗剂为昂丹司琼盐酸盐二水合物。
105.一种方法，所述方法包括向特征在于具有指示神经退行性病患或可能对针对神经退行性病患的治疗做出正向反应的生物标志物谱的受试者施用有效量的药物组合物来治疗所述神经退行性病患；其中所述生物标志物组包含一组生物标志物，该组生物标志物包括从来自所述受试者的富集了神经元来源的细胞外囊泡(例如，来自所述细胞外囊泡的内部内容物)的样品测量的一种或多种信号传导激酶和任选地神经退行性病变相关蛋白的至少一种寡聚形式。
106.权利要求105所述的方法，其中所述神经退行性病患为帕金森氏病，并且其中所述药物组合物包含多巴胺激动剂。
107.一种试剂盒，所述试剂盒包含足以检测以下中的任一者的试剂：
(1)至少一种信号传导激酶，
(2)至少一种催化酶，
(3)神经退行性病变相关蛋白的至少一种寡聚形式，和
(4)至少一种miRNA。
108.一种方法，所述方法包括：
在包含至少一个处理器和储存至少一个由所述至少一个处理器执行的程序的存储器的计算机系统处：
a)从来自至少25、50、100、200、500或1000名受试者中的每一个的生物样品获得多个生物标志物的电子形式的生物标志物数据，其中：
(i)所述受试者包括(i)经诊断患有处于一个或多个不同疾病阶段中的每一个阶段的神经退行性病患的多名受试者，其中每名经诊断的受试者已经接受推定的神经保护剂，和(ii)未经诊断患有神经退行性病患的多名对照受试者；
(ii)对所述样品富集神经元来源的外泌体；和
(iii)所述生物标志物数据包括以下的测量值：
(i)多种不同的信号传导激酶；或
(ii)来自选自以下的至少两组的生物标志物：
(1)选自磷酸化信号传导激酶和/或催化酶的一种或多种酶，
(2)单体或寡聚形式的一种或多种神经退行性病变相关蛋白，和
(3)一种或多种miRNA；
b)使用计算机逻辑执行学习算法以产生模型，所述模型：
(i)预测个体受试者中随着时间的疾病进展速率或对所述推定的神经保护剂的反应程度；或者
(ii)在不同的受试者之间(1)做出致病性诊断，(2)区分临床上相似但病因上不同的神经退行性病症亚组，或(3)预测受试者是否可能对所述推定的神经保护剂做出反应或受试者可能对所述推定的神经保护剂做出反应的程度。
109.一种方法，所述方法包括：
在包含至少一个处理器和储存至少一个由所述至少一个处理器执行的程序的存储器的计算机系统处：
a)从来自受试者的生物样品获得多个生物标志物的电子形式的生物标志物数据，其中：
(i)对所述样品富集神经元来源的外泌体；和
(ii)所述生物标志物数据包括以下的测量值：
(i)多种不同的信号传导激酶；或
(ii)来自选自以下的至少两组的生物标志物：
(1)选自磷酸化信号传导激酶和/或催化酶的一种或多种酶，
(2)单体或寡聚形式的一种或多种神经退行性病变相关蛋白，和
(3)一种或多种miRNA；
b)使用计算机逻辑执行模型，所述模型：
(i)预测个体受试者中随着时间的疾病进展速率或对所述推定的神经保护剂的反应程度；或者
(ii)在不同的受试者之间(1)做出致病性诊断，(2)区分临床上相似但病因上不同的神经退行性病症亚组，或(3)预测受试者是否可能对所述推定的神经保护剂做出反应或受试者可能对所述推定的神经保护剂做出反应的程度；和
c)将所述预测输出到所述受试者可访问的电子设备。
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